ES2346184T3 - Antagonistas de cd30 o cd30l para usar en el tratamiento de enfermedades antiinflamatorias cronicas y autoinmunes. - Google Patents

Abstract

Uso de un agente que es capaz de inhibir la unión de CD30 a CD30L, en que el agente es seleccionado del grupo que consiste en: (a) un anticuerpo que es específico para CD30L; (b) un anticuerpo no agonista que es específico para CD30; y (c) un polipéptido CD30 soluble que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: (i) los aminoácidos 19-390 del polipéptido CD30 humano de la ID. SEC. nº 6; (ii) un fragmento de la secuencia de (i), en que dicho fragmento es capaz de unirse a CD30L; y (iii) un polipéptido ligante de CD30, que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a los aminoácidos 19-390 de la ID. SEC. nº 6, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la artritis, la esclerosis múltiple o el lupus eritematoso sistémico en un paciente.

Description

Antagonistas de CD30 o CD30L para usar en el tratamiento de enfermedades antiinflamatorias crónicas y autoinmunes.

Campo del invento

Este invento se refiere a usos de agentes que bloquean la interacción entre CD30 y CD30L, en la preparación de medicamentos para tratar la artritis, la esclerosis múltiple o el lupus eritematoso sistémico.

Fundamento del invento

CD30 y su ligando, CD30L, son proteínas de membrana de las superfamilias de TNFR y ligandos de TNF, respectivamente, y se expresan en diversas células linfoides y mieloides. CD30 fue descrito por vez primera como un antígeno en células de pacientes con enfermedad de Hodgkin y, actualmente, se utiliza mucho como un marcador clínico para un número de malignidades hematológicas [para una revisión, véase Horie y Watanabe, Immunol. 10: 457-470 (1998)]. En el suero humano se encuentra una forma soluble y naturalmente presente de la proteína CD30, y los niveles de esta proteína están elevados en diversos estados patológicos que incluyen infecciones víricas, estados alérgicos y autoinmunes y enfermedades neoplásicas.

CD30 y CD30L se expresan en células T y parece que están implicados en la regulación del sistema inmune. Su expresión en células T depende de una activación. Se ha comunicado que CD30 es un marcador específico de células T de tipo T_{H}2 [Romagnani, J. Leukocyte Biol. 57: 726 (1995); Romagnani, J. Clin. Immunol. 15: 121-129 (1995)]. Los subconjuntos T_{H}1 y T_{H}2 de células T CD4^{+} se pueden distinguir basándose en qué citocinas expresan predominantemente. Aunque, en realidad, las células T individuales pueden secretar mezclas de estos dos grupos de citocinas, las reacciones inmunes crónicas están a menudo dominadas por un tipo u otro de células T CD4^{+}. Se considera generalmente que las células T que producen citocinas T_{H}2, que incluyen IL-4, son mediadores de reacciones alérgicas. Se ha sugerido que la detección de células T CD30^{+} circulantes podría servir como un marcador para estados alérgicos dominados por T_{H}2, tal como la dermatitis atópica [Yamamoto et al., Allergy 55: 1011-18 (2000)]; sin embargo, la correlación entre la expresión de CD30 y el fenotipo T_{H}2 no se ha mantenido en pie a lo largo del tiempo [véanse, por ejemplo, Bengtsson et al., J. Leukocyte Biol. 58: 683 (1996); y Hamann et al., J. Immunol. 156: 1387-91 (1996)]. Basándose en experimentos en que se utiliza un modelo de diabetes en ratón, se ha propuesto también que la señalización mediada por CD30 puede proteger frente a la enfermedad autoinmune [Kurts et al., Nature 398: 341-344 (1999)]. Otros han comunicado que IL-4 suprarregula, mientras que IFN-\gamma infrarregula, la expresión de CD30 en células T activadas [Nakamura et al., J. Immunol. 158: 2090-98 (1997); Gilfillan et al., J. Immunol. 160: 2180-87 (1998)].

El ligando naturalmente presente de CD30, CD30L, es una glicoproteína de membrana de tipo II que se une específicamente con CD30, lo que desencadena que CD30 transmita una señal a través de su dominio citoplásmico. En el Documento U.S. 5.480.981 se describe el aislamiento de cDNAs de ratón y ser humano que codifican CD30L. Además de expresarse en células T activadas, CD30L se expresa en monocitos/macrófagos, granulocitos y un subconjunto de células B (véase, por ejemplo, el Documento U.S. 5.480.981). Se ha comunicado que CD30L induce la diferenciación de células B murinas y la proliferación de células T activadas, en presencia de un coestímulo anti-CD3 [véase, por ejemplo, Smith et al., Cell 7: 1349-1360 (1993)]. Además, se ha comunicado que CD30L presenta una "señalización inversa"; es decir, el CD30L de la superficie celular que se expresa en neutrófilos y células T de sangre periférica puede ser activado por entrecruzamiento para estimular actividades metabólicas en esas células [Wiley et al., J. Immunol. 157: 3235-39 (1996)]. En el Documento WO 99/40187 se describe el uso de ácidos nucleicos, derivados de los mismos y sustancias ligantes secuencialmente específicas que inhiben la expresión del antígeno CD30.

Existe la necesidad de comprender mejor las actividades biológicas de CD30 y CD30L y de explotar este conocimiento en el tratamiento de enfermedades humanas.

Sumario del invento

De acuerdo con este invento, se proporciona un agente como el definido en las reivindicaciones, capaz de inhibir la unión de CD30 a CD30L, para uso en el tratamiento de la artritis, la esclerosis múltiple o el lupus eritematoso sistémico. El agente puede ser administrado al paciente de acuerdo con un régimen de dosis y frecuencia de administración que sea adecuado para provocar una mejora continua en al menos un indicador que refleja la gravedad del estado del paciente. Se considera que la mejora es continua si el paciente presenta la mejora en al menos dos ocasiones separadas por al menos un día. El agente puede ser formulado en una preparación farmacéutica fisiológicamente aceptable, que puede ser envasada con un material escrito que describa el uso precedente. Además, se puede administrar un inhibidor de la interacción CD30/CD30L de acuerdo con este invento concurrentemente con otros tratamientos que se utilizan para tratar el mismo trastorno. En una realización preferida, el paciente es un ser humano.

En el invento, los agentes para uso en el tratamiento de la artritis, la esclerosis múltiple o el lupus eritematoso sistémico incluyen un anticuerpo que es específico para CD30L, un anticuerpo no agonista que es específico para CD30, y un polipéptido CD30 soluble que comprende toda, o parte de, la región extracelular de CD30 humano. En la ID. SEC. nº 6 se muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos del CD30 humano. Los polipéptidos CD30 adecuados para uso como agentes terapéuticos incluyen proteínas que comprenden los aminoácidos 19-390 de la ID. SEC. nº 6, o un fragmento de los mismos que conserva la capacidad para unirse a CD30L, incluyendo polipéptidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 90%, al menos 95%, al menos 97,5%, o al menos 99%, y muy preferiblemente al menos 99,5%, con respecto a los aminoácidos 19-390 de la ID. SEC. nº 6. Se espera que dichos polipéptidos, si se administran in vivo, se unan con el CD30L endógeno, interfiriendo por ello en la interacción entre el CD30 endógeno y el CD30L endógeno. Si se desea, dichos polipéptidos pueden ser conjugados con otro componente, normalmente otra proteína, que promueve la oligomerización. Un componente adecuado para este fin es la región Fc de una molécula inmunoglobulínica. Los agentes que antagonizan la interacción CD30/CD30L pueden ser utilizados para preparar una preparación farmacéutica para ser administrada de acuerdo con el invento, ya sea sola o ya sea concurrentemente con otros tratamientos. Dichas preparaciones farmacéuticas pueden ser envasadas con un material escrito que describa los usos anteriormente descritos.

Los agentes terapéuticos aquí descritos que inhiben la interacción CD30/CD30L pueden ser utilizados para tratar diversas enfermedades, como se define en las reivindicaciones, incluyendo diversos estados artríticos. Por ejemplo, se puede tratar la artritis reumatoide con los antagonistas de CD30/CD30L que se describieron anteriormente.

En un aspecto del invento, el agente capaz de inhibir la interacción de CD30 y CD30L, como se define en las reivindicaciones, es utilizado concurrentemente con un segundo agente que es capaz de antagonizar a TNF-\alpha, IL-1\alpha, IL-1\beta o IL-4, para tratar la esclerosis múltiple, el lupus eritematoso sistémico o la artritis.

Como un ejemplo, los trastornos médicos precedentes pueden ser tratados con un anticuerpo específico para CD30L, utilizado junto con un antagonista de IL-4. El anticuerpo anti-CD30L y el antagonista de IL-4 se usan para formular preparaciones farmacéuticas con este fin y pueden ser envasados separada o conjuntamente en un envase con un material escrito que describa este uso. Los antagonistas de IL-4 adecuados para uso en este método de tratamiento incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo específico para IL-4, un anticuerpo específico para IL-4R y un receptor soluble de IL-4 que comprende los aminoácidos 1-207 ó 2-207 de la ID. SEC. nº 16. En una de las realizaciones preferidas del invento, un paciente aquejado de lupus eritematoso sistémico es tratado concurrentemente con un inhibidor de la interacción CD30/CD30L y un anticuerpo específico para IL-4, un anticuerpo específico para IL-4R o un receptor soluble de IL-4, en que el receptor comprende los aminoácidos1-207 o los aminoácidos 2-207 de la ID. SEC. nº 16.

Descripción detallada del invento

El presente invento describe compuestos para uso en el tratamiento o la prevención de enfermedades inflamatorias crónicas y enfermedades autoinmunes, como se define en las reivindicaciones. Los pacientes tratados de acuerdo con el invento incluyen aquellos cuyo estado es continuo o intermitente. Las enfermedades tratables de acuerdo con el invento son la artritis, el lupus eritematoso sistémico y la esclerosis múltiple.

Preferiblemente, el paciente que experimenta el tratamiento es un mamífero y, más preferiblemente, es un ser humano. El invento objetivo es aplicable a animales domésticos, incluyendo animales de compañía y animales de granja. Además, se proporcionan usos que implican tratar las enfermedades inflamatorias crónicas o enfermedades autoinmunes aquí descritas, concurrentemente con dos o más inhibidores seleccionados entre un inhibidor de IL-4, un inhibidor de TNF-\alpha y un inhibidor de la interacción CD30/CD30L. Para los fines de esta descripción, se utilizan indistintamente los términos y expresiones "enfermedad", "afección", "estado médico", "estado anormal", "dolencia", "trastorno médico", "trastorno" y similares.

Los estados autoinmunes se caracterizan por la producción de anticuerpos o células T efectoras que reaccionan con moléculas nativas del huésped. La mayoría de las respuestas de las células B dependen de células T auxiliares; de este modo, la presencia de autoanticuerpos implica generalmente cierta desregulación de la función de las células T. Sin embargo, en ciertos casos, surgen autoanticuerpos a partir de las respuestas de células T y B normales hacia proteínas extrañas que comparten epítopos antigénicos con los propios tejidos del huésped. Por ejemplo, unas bacterias patógenas que expresan un antígeno que se parece a una molécula del huésped pueden provocar autoanticuerpos. En algunos casos, se pueden originar síndromes artríticos en una mujer a causa de su exposición a células fetales que han escapado a su circulación durante el embarazo. La frase "estado inflamatorio crónico", como aquí se utiliza, se refiere a trastornos crónicos cuyos síntomas en curso no parecen ser causados por una infección vírica o bacteriana, aun cuando estas enfermedades pueden haber sido desencadenadas, en ciertos casos, por una infección que ya no está presente. Dichas enfermedades son "inflamatorias" porque se caracterizan por la liberación de citocinas inflamatorias tales como el factor de necrosis tumoral (TNF-\alpha), la linfotoxina \alpha y/o la interleucina 1 (IL-1), y también pueden implicar autoinmunidad. En algunos casos, las predisposiciones genéticas desempeñan un papel en las enfermedades inflamatorias crónicas o enfermedades autoinmunes que son tratables mediante los métodos objetivos. Para dichos pacientes, si se desea, se pueden administrar profilácticamente las terapias objetivas.

En un aspecto del invento, se tratan enfermedades inflamatorias crónicas y enfermedades autoinmunes administrando un agente que inhibe la transducción de señales por CD30. La capacidad de un agente para inhibir la transducción de señales de CD30 puede ser demostrada utilizando un ensayo biológico, tal como un ensayo que implique determinar que el agente interfiere en una actividad biológica manifestada por células CD30^{+} que, de lo contrario, tendría lugar cuando las células entran en contacto con CD30L. Alternativamente, se puede identificar un antagonista de CD30 determinando su capacidad para evitar que CD30L se una con el CD30 que se expresa en la superficie de células cultivadas. Los agentes terapéuticos del invento incluyen, pero no se limitan a, agentes que antagonizan la unión específica de CD30 a CD30L. Los términos "antagonista" e "inhibidor" se usan aquí indistintamente.

La expresión "ligando de CD30" (CD30L) se refiere a una proteína humana o murina ligante de CD30 como se describe en Smith et al. (1993) y la Patente de EE.UU. nº 5.480.981, incluyendo muteínas ligantes de CD30 de las mismas. En las ID. SEC. números 1 y 2 se muestran las secuencias de nucleótidos y aminoácidos para CD30L humana, y en las ID. SEC. números 3 y 4 se muestran aquéllas para CD30L de ratón. La región extracelular del CD30L humano corresponde a los aminoácidos 1-215 de la ID. SEC. nº 2. Para formar moléculas de CD30L humanas solubles que se puedan unir a CD30, se pueden utilizar polipéptidos que comprendan del aminoácido 44, 45, 46 ó 47 al aminoácido 215 de la ID. SEC. nº 2. La región extracelular del CD30L murino corresponde a los aminoácidos 1-220 de la ID. SEC. nº 4. Para formar moléculas de CD30L murinas solubles que se puedan unir a CD30, se pueden utilizar polipéptidos que comprendan los aminoácidos 49-220 de la ID. SEC. nº 4.

Como aquí se utiliza, la frase "fragmento de CD30L" se refiere a una porción de un polipéptido CD30L de longitud completa que conserva la capacidad para unirse a CD30 o que es capaz de generar un anticuerpo que se une específicamente con un polipéptido CD30L de ID. SEC. nº 2 ó 4 o una subporción del mismo. Dichos fragmentos contendrán preferiblemente al menos una porción de la región extracelular de CD30L.

Como aquí se utiliza, el término "CD30" se refiere al polipéptido CD30 humano de 595 aminoácidos codificado por la secuencia de nucleótidos de la ID. SEC. nº 5, y cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la ID. SEC. nº 6. La clonación de CD30 es descrita por Durkop et al. [Cell 68: 421 (1992)]. La porción extracelular del CD30 humano corresponde a los aminoácidos 1-390 de la ID. SEC. nº 6 o, si se separa el péptido señal, a los aminoácidos 19-390 de la ID. SEC. nº 6. La frase "CD30 soluble" (sCD30) se refiere a moléculas solubles que comprenden todo, o parte de, el dominio extracelular de la proteína CD30 y que conservan la capacidad para unirse específicamente con CD30L. Los polipéptidos CD30 solubles del invento abarcan proteínas sCD30 recombinantes y sCD30 presentes en la naturaleza, en forma muy purificada. Si se desea, se puede unir la sCD30 a polietilenglicol (es decir, se puede pegilar) para prolongar su semivida en el cuerpo del paciente o se puede unir a otro componente proteico que promueva la oligomerización.

Como aquí se utiliza, la frase "fragmento de CD30" se refiere a una porción de un polipéptido CD30 de longitud completa que conserva la capacidad para unirse a CD30L, o que es capaz de provocar un anticuerpo que se une específicamente con un polipéptido CD30 que tiene la secuencia de aminoácidos de la ID. SEC. nº 6 o una subporción del mismo o a una porción de CD30 de longitud completa que es capaz de transmitir una señal biológica tal como la activación de NF-\kappaB.

Los polipéptidos CD30 solubles de acuerdo con el invento también incluyen polipéptidos que tienen al menos el 60%, o al menos el 70%, o al menos el 80%, y muy preferiblemente al menos el 90%, de la longitud de la región extracelular de la molécula de CD30 humana, como se muestra en los aminoácidos 1-390 de la ID. SEC. nº 6. Como agentes terapéuticos también se incluyen proteínas que comprenden un polipéptido CD30 soluble que tiene una identidad de secuencia de al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, al menos 97,5%, o al menos 99%, y muy preferiblemente al menos 99,5%, con respecto a los aminoácidos 1-390 de la ID. SEC. nº 6, identidad de secuencias que se determina comparando las secuencias de aminoácidos de los dos polipéptidos cuando son alineados para maximizar el solapamiento y la identidad mientras se minimizan los huecos de las secuencias. El valor del porcentaje de identidad en dichas comparaciones puede ser determinado por inspección visual y cálculo matemático. Alternativamente, el porcentaje de identidad de las dos secuencias de aminoácidos puede ser determinado comparando información sobre las secuencias mediante el programa informático GAP, versión 6.0, descrito por Devereux et al. (Nucl. Acids, Res. 12: 387, 1984) y disponible en el University of Winconsin Genetics Computer Group (UWGCG). Los parámetros por omisión preferidos que se van a utilizar en el programa GAP para hacer estas comparaciones incluyen: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para las identidades y de 0 para las faltas de identidad) para los nucleótidos, y la matriz de comparación ponderada de Gribskov y Burgess, Nucl. Acids Res. 14: 6745, 1986, como describen Schwartz y Dayhoff (redactores), Atlas of Polypeptide Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, páginas 353-358, 1979; (2) una penalización de 3,0 para cada hueco y una penalización adicional de 0,10 para cada símbolo de cada hueco; y (3) sin penalización para los huecos finales. También se pueden utilizar otros programas usados por los expertos en la técnica de comparación de secuencias, tales como, por ejemplo, el programa BLASTN, versión 2.0.9, disponible para uso a través de la página web del National Library of Medicine, o el algoritmo UW-BLAST 2.0, utilizando los ajustes de los parámetros estándares por omisión que se describen en la página web "blast-wustI". Además, el algoritmo BLAST utiliza la matriz de calificación de aminoácidos BLOSUM62, y los parámetros opcionales que se pueden utilizar son los siguientes: (A) inclusión de un filtro para enmascarar los segmentos de la secuencia en cuestión que tienen una composición de baja complejidad [según se determina mediante el programa SEG de Wootton y Federhen (Computers and Chemistry, 1993); véase también J. C. Wootton y S. Federhen, 1996, "Analysis of compositionally biased regions in sequence databases", Methods Enzymol. 266: 554-71] o los segmentos que consisten en repeticiones internas de corta periodicidad [según se determina mediante el programa XNU de Claverie y States (Computers and Chemistry, 1993)], y (B) un umbral de significación estadística para presentar apareamientos frente a secuencias de una base de datos, o calificación E [la probabilidad esperada de apareamientos que se encuentran meramente por casualidad, de acuerdo con el modelo estocástico de Karlin y Altschul (1990); si la significación estadística atribuida a un apareamiento es superior a este umbral de calificación E, no se presentará el apareamiento]; los valores del umbral de calificación E preferidos son 0,5, o, en orden de preferencia creciente, 0,25, 0,1, 0,05, 0,01, 0,001, 0,0001, 1e-5, 1e-10, 1e-15, 1e-20, 1e-25, 1e-30, 1e-40, 1e-50, 1e-75 o 1e-100.

Como aquí se utiliza, la frase "interacción CD30/CD30L" se refiere a la unión específica de CD30 a CD30L, que da lugar a una transducción de señales por CD30. Esto incluye los casos en que al menos una pareja ligante es un fragmento de CD30 o CD30L; es decir, la expresión puede referirse a la interacción ligante de un fragmento de CD30 a CD30L, de CD30 a un fragmento de CD30L, o de un fragmento de CD30 a un fragmento de CD30L. Además, una interacción CD30/CD30L puede implicar un compuesto análogo de CD30 (tal como una variante alélica o una muteína) que es capaz de unirse específicamente a CD30L, o puede implicar un compuesto análogo de CD30L (tal como una variante alélica o una muteína) que se puede unir específicamente con CD30. Además, una interacción CD30/CD30L puede implicar proteínas CD30 o CD30L endógenas o puede implicar CD30 o CD30L recombinantes expresados por una célula transfectada con un ácido nucleico que codifica la proteína recombinante. Similarmente, la frase "interacción IL-1/IL-1R" se refiere a la unión específica entre IL-1 e IL-1R, incluyendo los casos en que al menos una de las parejas ligantes es un fragmento del polipéptido de longitud completa e incluyendo los casos en que una de las parejas ligantes es una variante alélica o muteína que conserva la capacidad para unirse específicamente con su pareja ligante.

Como aquí se utiliza, el término "IL-1" incluye tanto IL-1\alpha como IL-1\beta. IL-1\alpha e IL-1\beta son dos proteínas distintas que contribuyen a la inflamación y que se unen a los mismos dos receptores de la superficie celular. Los receptores de la superficie celular a los que se unen tanto IL-1\alpha como IL-1\beta son conocidos como receptores de IL-1 de los tipos I y II, o "IL-1R1" e "IL-1R2". La transducción de señales por IL-1 es mediada esencialmente por IL-1R1, mientras que se considera que IL-1R2 es un receptor "señuelo" cuya función es infrarregular la actividad biológica de IL-1. En la Patente de EE.UU. nº 5.350.683 se describe el IL-1R2 humano. En la ID. SEC. nº 7 se muestra una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína IL-1R2, y en la ID. SEC. nº 8 se muestra la secuencia de aminoácidos.

Agentes terapéuticos

El agente fisiológicamente aceptable capaz de bloquear la transducción de señales por CD30, usado como agente terapéutico en el invento descrito, es seleccionado del grupo que consiste en: anticuerpos que se unen específicamente a CD30L e inhiben por ello su unión a CD30; anticuerpos no agonistas que se unen específicamente a CD30 e inhiben su capacidad para transmitir una señal biológica; y moléculas de sCD30 que contienen el dominio extracelular de CD30 o una porción del mismo que es capaz de unirse a CD30L, como se define en las reivindicaciones.

Las moléculas de CD30 solubles utilizadas como agentes terapéuticos, como aquí se describe, comprenden la región extracelular de CD30 de la ID. SEC. nº 6, en que los aminoácidos 1-390 de la ID. SEC. nº 6 corresponden a la región extracelular. Si se utiliza menos del dominio extracelular completo, el fragmento debe conservar la capacidad para unirse a CD30L, capacidad que puede ser determinada utilizando cualquier formato de ensayo de unión conveniente. La presencia del péptido señal en el sCD30 es opcional. Los ensayos adecuados incluyen examinar la capacidad del sCD30 para bloquear competitivamente la unión de CD30L marcado a células que expresan CD30 superficial o para bloquear la unión de CD30L aislado o de células que expresan CD30L superficial a CD30 de la superficie celular o CD30 que está anclado a un soporte sólido, tal como una placa para ELISA, o una matriz para cromatografía, tal como glóbulos de agarosa. Cuando se utilizan terapéuticamente, estos sCD30s bloquean la unión células que expresan CD30L al CD30 unido a la membrana.

Los sCD30s útiles como antagonistas de CD30 para los métodos terapéuticos descritos incluyen polipéptidos sCD30 oligómeros (tales como dímeros o trímeros), así como monómeros. Los oligómeros pueden estar unidos por enlaces disulfuro formados entre restos de cisteína de polipéptidos sCD30 diferentes. En una realización del invento, el agente terapéutico es un sCD30 que se ha creado al fusionar el dominio extracelular de CD30 (o una porción ligante de CD30L del mismo) con la región Fc de un anticuerpo, preferiblemente un anticuerpo humano, de una manera que no interfiere en la unión del componente CD30 a CD30L. La proteína de fusión resultante es un CD30:Fc que se dimerizará mediante la formación espontánea de enlaces disulfuro entre los componentes Fc de dos de las cadenas de la proteína de fusión. Para preparar estas construcciones se pueden emplear polipéptidos de regiones Fc nativas o muteínas de los mismos. Los CD30:Fcs adecuados reducirán o anularán la capacidad de los anticuerpos agonistas anti-CD30 para estimular a CD30, o inhibirán competitivamente la unión de CD30L al CD30 unido a la membrana. Un ejemplo de una proteína CD30:Fc adecuada que se puede utilizar en los métodos objetivos es una que se construye del modo descrito en el Documento U.S. 5.677.430.

Se pueden preparar otros polipéptidos sCD30 oligómeros adecuados al fusionar el dominio extracelular de CD30 (o un fragmento del mismo) con una "cremallera de leucina", que es un péptido que promueve la oligomerización de las proteínas en que está presente. Las cremalleras de leucina son motivos hallados en diversas proteínas ligantes de DNA [véase, por ejemplo, Landschulz et al., Science 240: 1759 (1988)], y los péptidos de cremalleras de leucina presentes en la naturaleza y sus derivados pueden promover la formación de dímeros o trímeros de las cadenas proteicas en que están presentes. En el Documento WO 94/10308, se describen ejemplos de dominios de cremalleras de leucina útiles para producir proteínas oligómeras solubles.

Otro método para enlazar múltiples copias de polipéptidos CD30 solubles es fusionar monómeros junto con conectores peptídicos adecuados. Mediante la tecnología de DNA recombinante se puede producir una proteína de fusión que comprenda dos o más copias de sCD30 separadas por conectores peptídicos. Dichos conectores peptídicos tienen óptimamente una longitud de 5 a 100 aminoácidos, comprendiendo preferiblemente aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en glicocola, asparagina, serina, treonina y alanina. En el Documento U.S. 5.073.627 se ilustra la producción de proteínas de fusión recombinantes que comprenden conectores peptídicos.

En otra realización, se tratan pacientes con un inhibidor de la interacción CD30/CD30L, administrado concurrentemente con un antagonista de IL-4. IL-4 es una citocina con una gran variedad de actividades, y es expresada por células T CD30^{+}. A los receptores de la superficie celular a los que se une IL-4 se hace referencia como "receptor de IL-4" o "IL-4R" (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 5.599.905). La interacción entre IL-4 y su receptor puede ser inhibida al administrar un receptor soluble de IL-4 (sIL-4R), tal como los sIL-4Rs descritos en la Patente de EE.UU. nº 5.599.905. La prevención de esta interacción dificultará o evitará las actividades biológicas mediadas por IL-4. La IL-4 puede inducir un efecto inflamatorio crónico en ciertas enfermedades y puede exacerbar ciertos trastornos autoinmunes. En dichas enfermedades, la infiltración y proliferación de células T_{H}2 son alimentadas por la transducción de señales de IL-4 y CD-30. Estas células causan la sobreproducción de IL-4. En consecuencia, las enfermedades en que ocurre esto, incluyendo la dermatitis atópica, el asma, el lupus eritematoso sistémico, la esclerodermia y el pénfigo vulgar, son eficazmente tratadas al administrar un agente que inhibe IL-4, concurrentemente con un agente que inhibe la interacción entre CD30 y CD30L. El último es preferiblemente un anticuerpo que es específico para CD30L.

En, por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 5.767.065, se ilustran métodos para utilizar inhibidores de IL-4 para tratar respuestas inmunes o inflamatorias. Los antagonistas de IL-4 que pueden ser administrados en combinación con inhibidores de la interacción CD30/CD30L incluyen, pero no se limitan a, receptores de IL-4 (IL-4R) y otras moléculas ligantes de IL-4, muteínas de IL-4 y anticuerpos que se unen específicamente con IL-4 o receptores de IL-4 para bloquear por ello la transducción de señales, así como oligonucleótidos antisentido y ribozimas dirigidas a IL-4 o IL-4R. Usando procedimientos estándares, se pueden preparar anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para IL-4 o el receptor de IL-4. Entre los receptores de IL-4 adecuados para un uso como el aquí descrito están los fragmentos solubles de IL-4R humano que conservan la capacidad para unirse a IL-4. Dichos fragmentos conservan toda, o parte de, la región extracelular de IL-4R y son capaces de unirse a IL-4. En una realización preferida del invento, el paciente es tratado concurrentemente con sIL-4R y un anticuerpo específico para CD30L.

En la Patente de EE.UU. nº 5.599.905; Idzerda et al., J. Exp. Med. 171: 861-873, Marzo de 1990 (IL-4R humano); y Mosley et al., Cell 59: 335-348, 1989 (IL-4R murino), se describen receptores de IL-4. A la proteína descrita en esas tres referencias se hace a veces referencia como IL-4R\alpha en la bibliografía científica. A menos que se especifique otra cosa, el término "IL-4R" y la expresión "receptor de IL-4", como aquí se utilizan, abarcan esta proteína en diversas formas que son capaces de actuar como antagonistas de IL-4, incluyendo, pero sin limitarse a, fragmentos solubles, proteínas de fusión, oligómeros, y variantes que son capaces de unirse a IL-4. Los IL-4Rs adecuados incluyen variantes en que una valina sustituye a una isoleucina en la posición 50 (véase Idzerda et al., 1990), e incluyen formulaciones de liberación lenta, y se contemplan derivados PEGilados (modificados con polietilenglicol), así como proteínas de fusión recombinantes que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados con el extremo N o el extremo C de un polipéptido IL-4R, incluyendo péptidos señal, regiones Fc de inmunoglobulinas, etiquetas de poli-His y el polipéptido FLAG® descrito por Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988, y la Patente de EE.UU. nº 5.011.912, así como fusiones de receptores de IL-4 con componentes de cremalleras de leucina promotoras de oligómeros. En, por ejemplo, el Documento EP 464.533, se describen proteínas de fusión recombinantes solubles que comprenden un IL-4R y regiones constantes de inmunoglobulina. En la ID. SEC. nº 15 se muestra una secuencia de nucleótidos que codifica el receptor de IL-4 humano y, en la ID. SEC. nº 16, se muestra la secuencia de aminoácidos para el receptor de IL-4 humano. En una realización preferida, el antagonista de IL-4 que se va a utilizar en combinación con un inhibidor de la interacción CD30/CD30L es un receptor soluble de IL-4 humano que comprende los aminoácidos 1 a 207 de la ID. SEC. nº 16 y, en otra realización preferida, el antagonista de IL-4 comprende los aminoácidos 2 a 207 de la ID. SEC. nº 16. Los antagonistas de IL-4 útiles para los métodos de tratamiento aquí descritos también incluyen moléculas que bloquean selectivamente la síntesis de IL-4 o IL-4R endógenos, tales como ácidos nucleicos antisentido o ribozimas dirigidas contra cualquiera de estas dos moléculas.

Los diferentes antagonistas de IL-4 que que pueden ser utilizados para el tratamiento aquí descrito pueden ser identificados, por ejemplo, por su capacidad para inhibir la incorporación de ^{3}H-timidina por células que proliferan normalmente en respuesta a IL-4, o por su capacidad para inhibir la unión de IL-4 a células que expresan IL-4R. En un ensayo para detectar antagonistas de IL-4, se mide la capacidad de un supuesto antagonista para bloquear la potenciación, inducida por IL-4, de la expresión de CD23 en las superficies de células B humanas. Por ejemplo, células B aisladas de sangre periférica humana son incubadas en pocillos para microtitulación en presencia de IL-4 y el supuesto antagonista. Después de la incubación, las células lavadas son incubadas con un anticuerpo marcado monoclonal contra CD23 (asequible de Pharmingen) para determinar el nivel de expresión de CD23. Como un testigo positivo para la neutralización de la inducción de CD23 por IL-4, se puede usar un mAb murino anti-huIL-4R (R&D Systems) del que se ha mostrado previamente que bloquea la unión y la función tanto de hIL-4 como de hIL-13. Alternativamente, se pueden identificar antagonistas de IL-4 adecuados determinando su capacidad para prevenir o reducir la deteriorada función de barrera del epitelio que resulta cuando se incuba IL-4 con el epitelio. Para este fin, se pueden utilizar monocapas confluentes de líneas celulares epiteliales humanas tales como Calu-3 (pulmón) y T84 (epitelio intestinal). La incubación de dichas monocapas con IL-4 causa un daño significativo a su función de barrera en aproximadamente 48 horas. Para ensayar antagonistas de IL-4, se puede examinar la permeabilidad de las monocapas, por ejemplo, añadiendo manitol radiomarcado a células incubadas con IL-4 en presencia o ausencia de un antagonista. Alternativamente, se puede determinar la resistencia transepitelial (que indica una barrera intacta) utilizando un voltímetro.

En otras realizaciones del invento, se administran antagonistas de la interacción CD30/CD30L concurrentemente con un antagonista de IL-1. Los agentes adecuados para inhibir la transducción de señales por IL-1 incluyen anticuerpos específicos para IL-1 o IL-1R1, particularmente anticuerpos humanizados. Otros antagonistas de IL-1 adecuados incluyen: el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1ra); fragmentos de IL-1, ligantes del receptor, que bloquean la unión de IL-1 nativa con IL-1R1; anticuerpos dirigidos contra IL-1 o IL-1R1; y proteínas recombinantes que comprenden todo, o parte de, un receptor para IL-1 o variantes modificadas de las mismas, incluyendo muteínas genéticamente modificadas, formas multímeras y formulaciones de liberación continua. IL-1ra es un antagonista endógeno de IL-1, presente en la naturaleza, y se une tanto a IL-1R1 como a IL-1Rs. Los antagonistas de IL-1 preferidos incluyen moléculas de IL-1R2 solubles que son capaces de unirse a IL-1 y que comprenden todo, o parte de, el dominio extracelular de IL-1R2. Estas moléculas de IL-1R2 solubles bloquean la interacción de IL-1 con el IL-1R1 unido a la membrana. Otros antagonistas de IL-1 útiles incluyen formas solubles de IL-1R1 que son capaces de inhibir competitivamente la interacción de IL-1 con IL-1R1 e incluyen además inhibidores de la enzima conversiva de IL-1\beta (ICE; del inglés, IL-1\beta converting enzyme), que son generalmente pequeñas moléculas orgánicas. Un antagonista de IL-1 preferido es un fragmento soluble de IL-1R2 que incluye los aminoácidos 1-333 de la ID. SEC. nº 8, o una subporción del mismo que es capaz de unirse específicamente con IL-1\alpha o IL-1\beta. Los IL-1R2s solubles que se van a utilizar de acuerdo con el invento incluyen, por ejemplo, compuestos análogos o fragmentos de IL-1R2 nativo que tienen al menos 20 aminoácidos, que carecen de la región transmembranal de la molécula nativa y que son capaces de unirse a IL-1. La capacidad de IL-1R2 soluble para unirse a IL-1 (incluyendo la unión a fragmentos de IL-1\alpha o IL-1\beta) puede ser ensayada utilizando un ELISA o cualquier otro ensayo conveniente.

Otros antagonistas de IL-1 adecuados son proteínas quiméricas en las que uno de los antagonistas de IL-1 anteriormente descritos está fusionado con otro polipéptido que promueve la formación espontánea de un dímero, un trímero o un multímero de orden superior. Un componente polipeptídico adecuado para promover la dimerización es la región Fc de una inmunoglobulina humana. Por ejemplo, se pueden fusionar polipéptidos IL-1R2 solubles o fragmentos de los mismos con la región Fc de una inmunoglobulina para formar una proteína quimérica que es capaz de dimerizarse. Cualquiera de los antagonistas de IL-1 precedentes, salvo los inhibidores de ICE, puede ser covalentemente enlazado a polietilenglicol (pegilado) para prolongar su semivida en el organismo.

Se entiende que, aunque IL-1\alpha e IL-1\beta son las IL-1s más comúnmente asociadas con la inflamación, existen otras formas de IL-1.

Los agentes preferidos para uso en los tratamientos objetivos incluyen anticuerpos que bloquean las interacciones CD30/CD30L, IL-1/IL-1R o IL-4/IL-4R. Dichos anticuerpos son específicamente inmunorreactivos con su diana; es decir, se unen a la proteína diana a través del sitio ligante de antígeno de los anticuerpos y no se unen en grado significativo a proteínas no relacionadas. Los anticuerpos específicos para CD30L se unirán al CD30L endógeno, reduciendo por ello la cantidad de CD30L endógeno disponible para unirse al CD30 de la superficie celular. Los fragmentos biológicamente activos de anticuerpos son también adecuados para uso como agentes terapéuticos del invento objetivo. Por ejemplo, un fragmento biológicamente activo de un anticuerpo anti-CD30L es una proteína anticuerpo que está truncada con respecto al anticuerpo intacto pero que conserva la capacidad para unirse específicamente a CD30L y bloquear su interacción con CD30. Los fragmentos de anticuerpo que se unen a antígenos incluyen, pero no se limitan a, los fragmentos Fab y F(ab')_{2} y se pueden producir mediante procedimientos convencionales.

Los anticuerpos que antagonizan la transducción de señales de CD30, IL-1 o IL-4 pueden ser identificados en cualquier ensayo adecuado, incluyendo ensayos basados en la función biológica y ensayos basados en la detección de la unión física. En, por ejemplo, el Documento U.S. 5.677.430 se describen ejemplos de dichos ensayos. En un ensayo preferido se examina la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de CD30L de la superficie celular a CD30 de la superficie celular. Las líneas celulares adecuadas para dichos ensayos incluyen las líneas celulares CD30^{+} HDLM-2 y L540, o se pueden usar células T activadas que expresen CD30. Por ejemplo, un ensayo basado en la función biológica podría acarrear la determinación de si un anticuerpo puede antagonizar la capacidad del CD30L unido a la membrana para estimular la proliferación de células CD30^{+} que son sensibles a dicha estimulación. En aún otro ensayo se emplea la línea celular humana CD30^{+} K299. Se ha observado que la proliferación de estas células es inhibida por contacto con células transfectadas con CD30L. Un anticuerpo específico para CD30L (u otro antagonista que bloqueara CD30L) podría suprimir este efecto de CD30L y potenciar por ello la proliferación de estas células en este ensayo. En otros casos, el anticuerpo es ensayado en cuanto a su capacidad para bloquear la unión de CD30L marcado recombinante a CD30 de la superficie celular. En otros casos, en los ensayos se emplean células transfectadas con DNA que codifica CD30L, IL-1R1, IL-1R2 o IL-4R humanos. Por ejemplo, se puede evaluar la capacidad de un anticuerpo monoclonal contra CD30L humano para bloquear interacciones CD30/CD30L determinando si puede bloquear la unión de CD30 humano:Fc a cualquiera de las células transfectadas con CD30L humano o a blastos T humanos activados, según se valora mediante un análisis por FACS. Similarmente, la especificidad de un anticuerpo para IL-4R podría ser ensayada determinando si el anticuerpo bloquea la unión de IL-4 marcado a IL-4R.

En otros ensayos adecuados se usan formas solubles de ambas parejas ligantes, por ejemplo, sCD30 y sCD30L. Por ejemplo, se puede unir sCD30 a una fase sólida, tal como una matriz para cromatografía en columna o una placa para ELISA. Para un ensayo ELISA en que se utilizan sCD30 y sCD30L, se fija un sCD30, tal como CD30:Fc, a una placa para ELISA y se ensaya un anticuerpo generado contra CD30L para ver si es un antagonista comprobando su capacidad para inhibir la unión de una construcción soluble de CD30L-cremallera de leucina al sCD30 anclado. En este ensayo, se mide la unión de la construcción de cremallera de leucina u otro CD30L soluble a la placa para ELISA utilizando un anticuerpo monoclonal anti-CD30L biotinilado y no neutralizante o, alternativamente, utilizando un anticuerpo contra el extremo de cremallera de leucina de la construcción de CD30L. En otros ensayos se examina la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de IL-1 a IL-1R1 de la superficie celular.

Los agentes terapéuticos adecuados para uso en los tratamientos objetivos incluyen anticuerpos no agonistas contra CD30 humano. Dichos anticuerpos pueden bloquear la interacción CD30/CD30L. Se pueden preparar anticuerpos monoclonales contra CD30 humano del modo descrito, por ejemplo, en el Documento U.S. 5.677.430, y se pueden examinar luego para determinar si son agonistas o no agonistas. Se puede distinguir un anticuerpo no agonista contra CD30 de un anticuerpo agonista ensayando su efecto sobre CD30 en un ensayo biológico adecuado, tal como uno de los ensayos descritos en el Documento U.S. 5.677.430. En uno de dichos ensayos, se examina un anticuerpo específico para CD30 para determinar si puede provocar la proliferación de células T activadas, preparadas a partir de sangre periférica, o si puede provocar la proliferación de la línea celular HDLM-2 o L-540 derivada de la enfermedad de Hodgkin. Un anticuerpo agonista provocará dicha proliferación. Por contraste, un anticuerpo no agonista contra CD30 se unirá específicamente con CD30 pero no provocará la proliferación de las células diana en estos ni otros ensayos que se basan en la transducción de señales por CD30.

Los agentes terapéuticos usados de acuerdo con el invento pueden ser administrados concurrentemente con una o más moléculas terapéuticas adicionales.

Como aquí se utiliza, "concurrentemente" incluye los casos en que los fármacos de un tratamiento de combinación se administran durante el mismo periodo de tiempo o se alternan. Esto incluye las administraciones simultánea y secuencial, y los diferentes fármacos pueden estar presentes en las mismas composiciones farmacéuticas o en composiciones separadas. La frecuencia y la vía de administración para los diferentes fármacos de dichas combinaciones pueden ser iguales o diferentes. Los agentes terapéuticos que se pueden utilizar en dichas combinaciones incluyen, por ejemplo, antagonistas de CD30, IL-1 o IL-4 como los anteriormente descritos, y también incluyen fármacos antiinflamatorios no esteroides (NSAIDs; del inglés, non-steroidal anti-inflammatory drugs), corticosteroides, analgésicos, fármacos supresores de citocinas, fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad (DMARDs; del inglés, disease-modifying anti-rheumatic drugs), metotrexato, etc. Como un ejemplo, se pueden combinar antagonistas de CD30 o IL-1 entre sí o con antagonistas de TNF-\alpha, IL-2, IL-6, RANK u otras citocinas que pueden contribuir a la autoinmunidad o la inflamación crónica. En ciertas realizaciones preferidas, los agentes terapéuticos adicionales se dirigen a una citocina. Un antagonista que se dirige a una citocina puede comprender un receptor soluble contra la citocina e incluye normalmente parte de, o todo, el dominio extracelular de un receptor para la citocina. El receptor citocínico soluble puede ser utilizado como un monómero, o como un dímero o un multímero superior (por ejemplo, como una molécula de fusión en que el receptor soluble está fijado a la porción Fc de inmunoglobulina humana que promueve el dímero). En otras realizaciones, el receptor citocínico soluble está pegilado para aumentar su semivida sérica. En ciertas realizaciones, el antagonista citocínico soluble comprende un receptor soluble de TNF (de tipo I o II). También se pueden utilizar pequeñas moléculas orgánicas que inhiben a citocinas inflamatorias, en combinación con los agentes terapéuticos objetivos. Se puede administrar concurrentemente más de un antagonista de la transducción de señales de CD30 para el tratamiento de enfermedades autoinmunes o enfermedades inflamatorias crónicas, y se pueden administrar solos o junto con otros fármacos que son eficaces contra el mismo estado autoinmune o estado inflamatorio crónico o que se están administrando para tratar un estado diferente en el mismo paciente.

Las combinaciones utilizadas para tratar la esclerosis múltiple incluyen inhibidores de CD30 administrados junto con otros fármacos utilizados para tratar este estado, incluyendo, pero sin limitarse a, mitoxantrona (NOVANTRONE®, Immunex Corporation), interferón \beta-1a (AVONEX®, Ares-Sorono Group), interferón \beta-1b (BETASERON®, Berlex Laboratories, Inc.) y/o acetato de glatirámero (COPAXONE®, Teva Pharmaceuticals). Se pueden añadir antagonistas de IL-4 a cualquiera de las combinaciones precedentes.

Para tratar los diversos estados reumáticos, incluyendo la artritis reumatoide, se puede administrar un agente capaz de inhibir la transducción de señales de CD30, solo o concurrentemente con inhibidores de TNF-\alpha, tales como anticuerpos contra TNF-\alpha [por ejemplo, anticuerpos humanizados tales como REMICADE® (Centocor), D2E7 (BASF Pharma) y HUMICADE® (Celltecx)]; formas solubles del receptor de TNF [tales como ENBREL® (Immunex Corporation) y LENERCEPT® (Roche)] o receptores de TNF solubles pegilados.

Preparación de anticuerpos terapéuticos

Los polipéptidos CD30L adecuados para uso como inmunógenos en la producción de anticuerpos terapéuticos anti-CD30L incluyen, pero no se limitan a, CD30L de longitud completa (recombinante o preparado a partir de una fuente presente en la naturaleza) y fragmentos inmunogénicos del mismo, particularmente fragmentos que contienen todo, o parte de, el dominio extracelular de CD30L. No es necesario que un fragmento de CD30L, para que sea eficaz como inmunógeno, conserve la capacidad para unirse a CD30, pero debe tener el tamaño suficiente para ser antigénico. Para que sea antigénico, un péptido debe contener generalmente al menos 20 aminoácidos. La secuencia de aminoácidos del CD30L humano de longitud completa se muestra en la ID. SEC. nº 2 y la del CD30L de ratón en la ID. SEC. nº 4; para preparar agentes terapéuticos para un uso como el aquí descrito, se pueden usar péptidos que correspondan a al menos 20 aminoácidos contiguos de cualquiera de estas proteínas, como inmunógenos.

Los polipéptidos CD30 adecuados para uso como inmunógenos en la producción de anticuerpos anti-CD30 no agonistas incluyen, pero no se limitan a, proteínas CD30 de longitud completa (recombinantes o preparadas a partir de una fuente presente en la naturaleza) y fragmentos inmunogénicos de las mismas, particularmente fragmentos que comprenden todo, o parte de, el dominio extracelular como el definido por los aminoácidos 1-390 de la ID. SEC. nº 6. Los inmunógenos para generar anticuerpos anti-CD30 contienen preferiblemente al menos 20 aminoácidos contiguos de la proteína mostrada en la ID. SEC. nº 6.

Los polipéptidos IL-1 o IL-1R adecuados para uso como inmunógenos en la producción de anticuerpos antagonistas incluyen, pero no se limitan a, proteínas de longitud completa (recombinantes o preparadas a partir de una fuente presente en la naturaleza) y fragmentos inmunogénicos de las mismas, particularmente fragmentos que comprenden todo, o parte de, el dominio extracelular de IL-1R2 humano como el mostrado por los aminoácidos 1-333 de la ID. SEC. nº 8. Los inmunógenos preferidos contienen al menos 20 aminoácidos contiguos de la proteína mostrada en la ID. SEC. nº 8.

Los inmunógenos para generar anticuerpos terapéuticos contra TNF-\alpha, TNFR, IL-4 o IL-4R consistirán en un segmento de al menos 20 aminoácidos de la proteína diana. Los antígenos adecuados para generar anticuerpos terapéuticos también incluyen cualesquiera de los inmunógenos anteriormente mencionados, fusionados con otra proteína, incluyendo proteínas fusionadas con una "bandera" N-terminal [véanse, por ejemplo, Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204 (1988); y la Patente de EE.UU. nº 5.011.912] y fusionadas con la porción Fc de una molécula inmunoglobulínica, preferiblemente una inmunoglobulina humana. Los agentes terapéuticos preferidos incluyen anticuerpos tanto policlonales como monoclonales (mAbs; del inglés, monoclonal antibodies), cualesquiera de los cuales pueden ser generados usando como inmunógenos los polipéptidos anteriormente descritos.

Se pueden generar anticuerpos policlonales de acuerdo con protocolos estándares utilizando una diversidad de animales de sangre caliente, tales como caballos, vacas, conejos, ratones, ratas y diversas especies de aves de corral. En general, el animal es inmunizado con CD30L, CD30, IL-1, IL-1R1, TNF-\alpha, TNFR1 o TNFR2, o un inmunógeno derivado de los mismos, por medio de inyecciones intraperitoneales, intramusculares o subcutáneas. Normalmente se aumenta la inmunogenicidad de un polipéptido inmunogénico por medio de la coadministración de un adyuvante tal como RIBI® (Corixa) o adyuvante completo o incompleto de Freund, u otro adyuvante adecuado. Después de varias inmunizaciones de refuerzo, se recogen muestras de suero y se examinan en cuanto a su reactividad específica hacia el polipéptido diana mediante cualquier método adecuado, tal como ELISA, ensayos de captura con anticuerpos (ABC; del inglés, antibody-capture) o de ABC modificada, o un ensayo de transferencia en forma de punto. Una vez que el título del anticuerpo ha alcanzado una meseta en términos de reactividad hacia la diana, se recoge el antisuero policlonal.

Para un ensayo de ABC, se reviste una placa de plástico, tal como una placa para ELISA, con un anticuerpo que es específicamente reactivo hacia la porción Fc de una inmunoglobulina de la misma especie de animal que se utilizó para generar el anticuerpo contra el polipéptido diana. Por ejemplo, si se inyectó una proteína diana a un conejo y se va a evaluar la especificidad de un resultante anticuerpo policlonal anti-diana, se revisten las placas con un anticuerpo específicamente reactivo hacia la porción Fc de IgG de conejo. En la siguiente operación, una muestra del anticuerpo del conejo inmunizado es incubada en la placa bajo unas condiciones que promueven la unión entre la IgG de conejo y el anticuerpo anclado anti-conejo. A continuación, se añade la proteína diana marcada y se incuba la placa bajo unas condiciones que promueven la unión del anticuerpo. Si la muestra de anticuerpo que se ensaya es específica para la proteína diana, la proteína diana marcada llegará entonces a unirse al anticuerpo capturado de conejo y, más tarde, podrá ser detectada una vez que la placa haya sido lavada. Por ejemplo, si la proteína diana está marcada con biotina, la proteína diana que ha llegado a unirse podrá ser detectada utilizando una enzima, etiquetada con estreptavidina, que es capaz de generar un producto coloreado.

Los procedimientos adecuados para generar anticuerpos monoclonales incluyen diversos métodos descritos en la técnica [véanse por ejemplo, la Patente de EE.UU. nº 4.411.993; Kennett et al. (redactores), Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, New York (1980); y Harlow y Lane (redactores), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988)]. Se utilizan generalmente ratones o ratas para las inmunizaciones iniciales, las cuales se llevan a cabo del modo anteriormente descrito para generar anticuerpos policlonales. Después de la inmunización, se recogen células esplénicas del animal inmunizado y se fusionan, de acuerdo con procedimientos estándares, con una línea celular de mieloma para obtener células de hibridoma inmortalizadas que producen anticuerpos monoclonales. Se conocen muchas líneas de mieloma adecuadas para hibridomas, incluyendo muchas que están disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, EE.UU. (véase el Catalog of Cell Lines & Hybridomas, ATCC). Las células de hibridoma individuales son aisladas después de la operación de fusión para ser exploradas con objeto de identificar aquéllas que producen anticuerpos monoclonales que tienen la inmunorreactividad específica deseada. Para uso terapéutico, se prefieren los anticuerpos de alta afinidad. Los hibridomas con la especificación deseada son identificados mediante ensayos tales como ELISA, ABC, ABC modificada y ensayos de transferencia en forma de punto, y son luego aislados y propagados. Los anticuerpos monoclonales son recogidos y purificados utilizando métodos estándares.

Se pueden generar anticuerpos monoclonales contra CD30L y se pueden explorar sus reactividades específicas de acuerdo con los métodos descritos en el Documento U.S. 5.677.430 o mediante cualquiera de los diversos métodos conocidos en la técnica para generar anticuerpos monoclonales. La exploración puede implicar la determinación de la capacidad de los anticuerpos monoclonales para antagonizar la unión de CD30L de la superficie celular a CD30 de la superficie celular o para antagonizar la transducción de señales por CD30 de la superficie celular.

Los anticuerpos útiles para los métodos terapéuticos objetivos también incluyen anticuerpos quiméricos y anticuerpos producidos o modificados por medio de ingeniería proteica o tecnología de DNA recombinante [véase, por ejemplo, Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3: 1 (Enero de 1990)]. La producción de anticuerpos quiméricos y, en cualquier caso, diseñados se describe en la técnica anterior [véanse, por ejemplo, Reichmann et al., Nature 332: 323 (1988); Liu et al., PNAS 84: 3439 (1987); Larrick et al., Bio/Technology 7: 934 (1989); y Winter y Harris, TIPS 14: 139 (1993)].

Cuando se va a administrar un anticuerpo como agente terapéutico a un paciente humano de acuerdo con los métodos objetivos, se prefiere un anticuerpo humanizado. Aún más preferidos son los anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanizados comprenden un dominio ligante de antígenos derivado de un anticuerpo no humano (por ejemplo, de una rata o un ratón), y pueden contener la región variable completa del anticuerpo no humano o pueden contener sólo la porción de la región variable no humana que incluye el sitio ligante de antígenos. En una realización preferida del invento, la única porción no humana del anticuerpo humanizado es la región hipervariable. Los procedimientos para preparar anticuerpos humanizados son conocidos e incluyen técnicas que implican la tecnología de DNA recombinante. La producción de anticuerpos humanizados es descrita, por ejemplo, por Winter y Harris, 1993. Para crear un anticuerpo humanizado, se puede aislar el DNA que codifica los sitios ligantes de antígeno de un anticuerpo monoclonal dirigido contra la diana y se puede insertar directamente en el genoma de una célula que está produciendo anticuerpos humanos [véase Reichmann et al. (1988)]. Este método podría ser usado, por ejemplo, para anticuerpos contra CD30, CD30L, IL-1, IL-1R1, TNF-\alpha, TNFR-1 o TNFR-2, IL-4 o IL-4R.

En un procedimiento para preparar anticuerpos humanizados, se prepara cDNA sobre un molde de mRNA derivado de una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal no humano que tiene la especificidad deseada. En esencia, se aísla un fragmento del cDNA que codifica la región variable del anticuerpo monoclonal (o un fragmento de la misma que contiene el sitio ligante de antígenos) y se fusiona este fragmento de cDNA con DNA que codifica el equivalente humano del resto de la molécula de anticuerpo humana, reconstruyéndose por ello una molécula de anticuerpo funcional. Se transfectan células huésped con un vector de expresión que contiene el gen fusionado y se cultivan para producir la proteína de fusión recombinante deseada. Para aislar el DNA que codifica la región variable de una cadena inmunoglobulínica, se puede emplear, por ejemplo, el método de Larrick et al. (1989), que implica la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction), utilizando una mezcla de cebadores cadena arriba que corresponden a la secuencia líder, y un cebador cadena abajo basado en la secuencia conservada de la región constante. Los cebadores de PCR para multiplicar la región variable a partir de mRNA de inmunoglobulina de célula de hibridoma de ratón o ser humano son comercialmente asequibles (por ejemplo, de Stratacyte, La Jolla, California). Se pueden utilizar cebadores de PCR para multiplicar el DNA de la región variable de la cadena pesada o ligera y se puede insertar el DNA multiplicado resultante en vectores tales como ImmunoZAP* H o ImmunoZAP* L (Stratacyte), respectivamente, para su expresión en E. coli.

Para producir un anticuerpo humanizado para uso como agente terapéutico de acuerdo con el invento, se aísla el DNA de región variable de una célula de hibridoma murina o de rata que expresa un anticuerpo con la especificidad deseada y se fusiona este DNA con un DNA de región constante multiplicado a partir de un cDNA que codifica un anticuerpo humano. Se pueden utilizar estas técnicas o técnica similares para, por ejemplo, producir una proteína ligante de antígenos, de cadena única, que contenga un dominio V_{L} fusionado con un dominio V_{H} por medio de un conector peptídico [véase Bird et al., Science 242: 423 (1988)]. Se pueden llevar a cabo otras manipulaciones genéticas para sustituir todo el anticuerpo, salvo las regiones hipervariables, por secuencias humanas.

Se pueden generar anticuerpos humanos utilizando métodos que implican animales no humanos. Por ejemplo, el DNA que codifica una o más cadenas inmunoglobulínicas humanas enteras puede ser introducido en un ratón para producir un animal transgénico, y luego se aísla el anticuerpo de las células cultivadas derivadas de los ratones. Se pueden inactivar los genes inmunoglobulínicos endógenos del ratón receptor por diversos medios y se pueden introducir genes inmunoglobulínicos humanos en el ratón para sustituir a los genes inactivados. Estas manipulaciones genéticas darán lugar a cadenas polipeptídicas inmunoglobulínicas humanas que sustituirán a las cadenas inmunoglobulínicas endógenas en al menos algunos casos, y, en dicho ratones, algunos o la mayoría de los anticuerpos producidos tras la inmunización serán anticuerpos humanos. En las Patentes de EE.UU. números 5.814.318, 5.569.825 y 5.545.806 se describen ejemplos de técnicas para la producción y el uso de dichos animales transgénicos.

Métodos terapéuticos

Se describen aquí agentes para uso en el tratamiento de la artritis, la esclerosis múltiple o el lupus eritematoso sistémico administrando a un paciente que lo necesite una cantidad eficaz de uno de los agentes anteriormente descritos. Se utilizan bloqueadores de la transducción de señales de CD30 para tratar cualquiera de los trastornos médicos enumerados más adelante.

En algunos casos, una enfermedad es generalmente sensible al tratamiento con un inhibidor de TNF-\alpha pero, en ciertos pacientes, es insensible. Un ejemplo de dicha enfermedad es la artritis reumatoide. Los pacientes con artritis reumatoide que responden poco o nada a los inhibidores de TNF-\alpha se beneficiarán particularmente del tratamiento con un antagonista de la interacción CD30/CD30L o IL-1/IL-1R.

Preferiblemente, el paciente es un ser humano, y puede ser un niño o un adulto.

Para el invento objetivo, los agentes terapéuticos van a ser preferiblemente administrados en forma de una composición fisiológicamente aceptable que comprende una proteína purificada recombinante junto con vehículos, excipientes y/o diluyentes fisiológicamente aceptables. Dichos vehículos son atóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. Se pueden formular composiciones adecuadas para administración in vivo de acuerdo con métodos bien conocidos en la técnica. Los componentes que se emplean comúnmente en dichas formulaciones incluyen los descritos en Remington's Pharmaceutical Sciences, edición 16ª, Mack Publishing Company. Normalmente, la preparación de dichas composiciones acarrea combinar el agente terapéutico con tampones, antioxidantes tales como el ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (tales como aquellos que tienen menos de 10 aminoácidos), proteínas, aminoácidos, hidratos de carbono tales como glucosa, sacarosa y dextrinas, agentes quelantes tales como el EDTA, glutatión y otros estabilizantes y excipientes. La disolución salina tamponada neutra y la disolución salina mezclada con albúmina sérica inespecífica son apropiados diluyentes ejemplares. Si se desea, el agente terapéutico puede ser formulado como un producto liofilizado utilizando apropiadas disoluciones de excipientes, tal como sacarosa, como diluyente. Las dosificaciones apropiadas se pueden determinar en pruebas de dosificación estándares y se pueden variar de acuerdo con la vía de administración escogida. De acuerdo con las normas industriales apropiadas, también se pueden añadir conservantes, tal como alcohol bencílico.

La cantidad y la frecuencia de administración pueden variar dependiendo de factores tales como la naturaleza y la gravedad del proceso que se trata, la respuesta deseada, la duración del tratamiento, la edad, el peso y el estado del paciente, etc. Se puede ajustar la dosis de un agente terapéutico para adaptar diversas vías de administración o de acuerdo con las necesidades de pacientes individuales, según determine el médico del paciente.

Se puede tratar la artritis mediante los métodos y composiciones aquí descritos. Como aquí se utiliza, el término "artritis" se refiere a estados inflamatorios crónicos que afectan esencialmente a las articulaciones, o al tejido conjuntivo que rodea las articulaciones, aunque también pueden resultar afectados diversos órganos del cuerpo. La artritis puede ser de origen autoinmune o traumático o puede ser desencadenada por la exposición a un antígeno extraño, lo que más tarde conduce a un estado crónico que ya no depende de la presencia continuada del antígeno desencadenante. Como aquí se usa, el término "artritis" incluyen: artritis deformante; osteoartritis; artritis reumatoide (adulta y juvenil); artritis de la enfermedad de Lyme; artritis reactiva, incluyendo la enfermedad de Reiter; artritis psoriásica; artritis nodosa; y espondiloartropatías seronegativas, incluyendo, pero sin limitarse a, la espondilitis anquilosante. La eficacia del tratamiento con anti-CD30L en la enfermedad artrítica se ilustra en los Ejemplos 2 y 4.

Los inhibidores, composiciones y combinaciones objetivos son útiles en el tratamiento de una diversidad de trastornos reumáticos, que se definen aquí como todo trastorno crónico que acarrea inflamaciones localizadas dolorosas y, a menudo, múltiples de las articulaciones, los músculos, los nervios, los tendones, la piel, los ojos, los tejidos conjuntivos u otros diversos sistemas orgánicos. Aquellos incluyen la artritis y el lupus eritematoso sistémico.

El lupus eritematoso sistémico puede causar inflamación de las articulaciones, la piel, los riñones, el corazón, los pulmones, los vasos sanguíneos y el cerebro. En sus formas avanzadas, el lupus eritematoso sistémico puede originar insuficiencia renal. Pareció que el tratamiento con un anticuerpo contra CD30L retrasaba el progreso de la insuficiencia renal en un modelo de esta enfermedad en ratón (véase el Ejemplo 6).

La esclerosis múltiple es tratada con un antagonista de la interacción CD30/CD30L como se define en las reivindicaciones (muy preferiblemente, un anticuerpo contra CD30L), solo o concurrentemente con un inhibidor de TNF-\alpha o un inhibidor de IL-4 (muy preferiblemente, sIL-4R). La esclerosis múltiple es representativa de una enfermedad degenerativa crónica del sistema nervioso central. La eficacia de un anticuerpo anti-CD30L en cuanto a mejorar una enfermedad de tipo esclerosis múltiple se ilustra en el Ejemplo 5.

Para tratar un trastorno médico utilizando los compuestos y composiciones aquí proporcionados, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico de acuerdo con el invento a un mamífero que lo necesita. El agente va a ser administrado de acuerdo con un régimen de dosis y frecuencia de administración que es adecuado para provocar una mejoría continua en al menos un indicador que refleja la gravedad del trastorno. Una mejoría es considerada "continua" si el paciente presenta la mejoría en al menos dos ocasiones separadas por al menos un día, pero que preferiblemente están separadas por una semana, dos semanas, tres semanas o cuatro o más semanas. La gravedad del trastorno se determina basándose en signos o síntomas o se puede determinar mediante cuestionarios que son administrados al paciente, tales como los cuestionarios sobre calidad de vida a menudo usados por los médicos para valorar el estatus de estados morbosos crónicos.

Se pueden evaluar uno o más indicadores que reflejen la gravedad de la enfermedad de un paciente, para determinar si la frecuencia y la duración del tratamiento farmacológico son suficientes. El valor de línea de base para un indicador escogido se establece mediante el examen del paciente antes de la administración de la primera dosis del agente terapéutico. Preferiblemente, el examen de la línea de base se realiza a aproximadamente los 60 días de la administración de la primera dosis.

Por ejemplo, si el estado que se trata es un estado artrítico, tal como artritis reumatoide, artritis psoriásica u osteoartritis, se pueden escoger uno o más indicadores para determinar la suficiencia del tratamiento, de entre los siguientes: número de articulaciones sensibles, doloridas o hinchadas; grado de dolor, sensibilidad o hinchazón de las articulaciones; autoevaluación del paciente (por ejemplo, cuestionarios sobre calidad de vida); y evaluación del médico. Para muchas enfermedades artríticas, la autoevaluación del paciente es un indicador satisfactorio. Los cuestionarios de autoevaluación típicos reflejarán la capacidad de un paciente para realizar sus actividades diarias, su percepción de bienestar, su nivel de dolor, etc. La duración del tratamiento requerida para provocar una mejoría mensurable en una enfermedad artrítica o cualquier otro tipo de enfermedad tratable del modo aquí descrito es típicamente de una a varias semanas.

Si el estado que se trata es la esclerosis múltiple. Los indicadores adecuados para determinar la suficiencia del tratamiento incluyen observar una mejoría en uno o más de los puntos siguientes: control de la vejiga y el intestino; fatiga; espasticidad; temblores en el cuerpo o las manos; debilidad muscular; capacidad para andar; entumecimiento de los miembros; capacidad para concentrarse (por ejemplo, realización de un simple test de memoria); y nivel subjetivo de dolor. Alternativamente el indicador puede consistir en la calificación del paciente en un cuestionario sobre calidad de vida como el anteriormente descrito.

Si el estado que se trata es el lupus eritematoso sistémico, el indicador para determinar la suficiencia del tratamiento puede consistir en una mejoría observada en uno de los puntos siguientes: fatiga; fiebre; úlceras en la boca y la nariz; sarpullido facial ("sarpullido en forma de mariposa"); fotosensibilidad (a menudo rebrota el lupus tras la exposición a la luz del sol); pleuritis; pericarditis; fenómeno de Raynaud (circulación reducida en los dedos de la mano y del pie tras la exposición al frío); función renal; y recuento de glóbulos blancos (los pacientes con lupus a menudo presentan números disminuidos de glóbulos blancos).

Se provoca una mejoría en el estado de un paciente al administrar repetidamente una dosis de un agente terapéutico de acuerdo con el invento hasta que el paciente manifiesta una mejoría con respecto a la línea de base para el indicador o los indicadores escogidos. En el tratamiento de estados crónicos, se obtiene normalmente un grado satisfactorio de mejoría después de administrar repetidamente el agente o los agentes durante un periodo de al menos un mes o más, por ejemplo, durante uno, dos o tres meses o más. En algunos casos, se puede producir una mejoría antes de un mes, por ejemplo, después de tres semanas, dos semanas, una semana o incluso después de una sola dosis. Un tratamiento con una duración de una a seis semanas, o incluso de una sola dosis, puede ser suficiente para tratar rebrotes ocasionales en pacientes que padecen estados crónicos que tienden a remitir entre rebrotes. Para estados persistentes, se puede continuar el tratamiento indefinidamente si se desea. Incluso después de un estado que ha mostrado mejoría, se puede continuar indefinidamente una terapia de mantenimiento al mismo nivel o con una dosis o frecuencia de administración reducida. Si se ha reducido la dosis o la frecuencia de administración, se puede volver al nivel previo si empeora el estado del paciente. Además, el tratamiento con inhibidores del invento objetivo puede ser administrado profilácticamente a pacientes que están predispuestos a un estado autoinmune o un estado inflamatorio crónico.

Para administrar terapéuticamente los agentes terapéuticos, las combinaciones y las composiciones objetivas, se puede usar cualquier vía eficaz de administración. Si se inyectan, los agentes pueden ser administrados, por ejemplo, por la vía intraarticular, intravenosa, intramuscular, intralesional, intraperitoneal o subcutánea. Se puede utilizar la inyección en forma de bolo o la infusión continua. Otros medios de administración adecuados incluyen la liberación continua a partir de micropartículas, implantes o similares, inhalación de aerosoles, gotas oculares, preparaciones orales, incluyendo píldoras, jarabes, pastillas y chicles, y preparaciones tópicas tales como lociones, geles, composiciones pulverizables, ungüentos y otras técnicas adecuadas.

Independientemente de la vía de administración que se elija, se entiende que se pueden ajustar los regímenes de tratamiento dependiendo de las necesidades del paciente, de acuerdo con los principios generales de la Medicina.

Cuando el agente terapéutico es un anticuerpo, tal como, por ejemplo, un anticuerpo contra CD30, CD30L, IL-1, IL-1R1, TNF-\alpha, IL-4 o IL-4R, los intervalos de dosis preferidos con fines terapéuticos o profilácticos en seres humanos incluyen de 0,1 a 20 mg/kg o, más preferiblemente, 0,5-10 mg/kg. Otro intervalo de dosis preferido es de 0,75 a 7,5 mg/kg, como se ejemplifica en los experimentos del Ejemplo 2 [ajustado para el peso corporal humano de acuerdo con DeVita et al. (redactores), Cancer-Principles & Practice of Oncology, 4ª edición, J. B. Lippincott, 1993]. Se puede utilizar una cantidad mayor o menor de anticuerpo por dosis para adaptarse a las diferencias de afinidad del anticuerpo por el antígeno. Un intervalo de dosis adecuado para CD30:Fc es 0,01-20 mg/kg de peso corporal o, más preferiblemente, 0,1-10 mg/kg de peso corporal. Para otras proteínas solubles utilizadas como inhibidores de acuerdo con el invento, los intervalos de dosis adecuados incluyen 2-500 \mug/kg, 0,5-10 mg/kg y de 10 a 50 mg/kg de peso corporal. Se entiende que el médico experto ajustará la dosis y la frecuencia de administración de acuerdo con las necesidades del paciente y la naturaleza de la enfermedad que se trata.

Los ejemplos siguientes se presentan a modo de ilustración y no a modo de limitación.

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Ejemplo 1 Anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD30L

Se produjo un anticuerpo monoclonal dirigido contra CD30L murino en ratas del modo siguiente. Se inmunizaron repetidamente ratas Lewis por vía intraperitoneal con 10-20 x 10^{6} células CHO transfectadas que expresaban CD30L murino de longitud completa. Cuando se hubieron detectado títulos séricos en las ratas, se les administró un refuerzo intravenoso de 10 x 10^{6} células CHO transfectadas. Después de tres días, se fusionaron células de mieloma de ratón AG8.653 con células esplénicas de las ratas inmunizadas. Cuando los hibridomas estuvieron bien establecidos en placas de 96 pocillos, se exploró el sobrenadante de cada pocillo mediante un ensayo ELISA en que se emplearon células CHO que habían sido transfectadas con DNA que codifica CD30L (CELISA). Para el CELISA, se adhirieron células CHO que expresaban el CD30L recombinante a las placas para ELISA y se exploró cada sobrenadante en cuanto a su capacidad para reaccionar con el CD30L expresado en las células CHO. Las células de hibridoma de los pocillos positivos fueron multiplicadas en placas de 48 pocillos y fueron exploradas por CELISA y también por separación celular activada por fluorescencia (FACS; del inglés, fluorescence-activated cell sorting) usando células CHO transfectadas y no transfectadas. Las células de hibridoma que se unían a células CHO transfectadas pero no a las no transfectadas fueron seleccionadas y fueron adicionalmente exploradas por FACS frente a células de linfoma de ratón que expresan naturalmente CD30L (células EL4). Los productos aislados de hibridoma que reconocían tanto el CD30L recombinante como el naturalmente expresado fueron clonados dos veces mediante clonación por dilución limitante, tiempo durante el cual se siguió la actividad de los sobrenadantes en cada operación mediante ensayos CELISA y/o FACS. Uno de estos clones, el clon M15, fue escogido para una propagación ulterior. En experimentos adicionales, se determinó que el anticuerpo M15 bloqueaba específicamente la interacción ligante entre CD30 y CD30L murinos.

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Ejemplo 2 Tratamiento de la artritis provocada con colágeno en ratones

Los tratamientos de la artritis que son eficaces para tratar la artritis provocada con colágeno (CIA; del inglés, collagen-induced arthritis) son también eficaces para tratar la artritis en seres humanos [véase, por ejemplo, Anthony y Haqqi, Clin. Exp. Rheumatol. 17: 240-244 (1999)]; por lo tanto, se ensayaron los efectos de antagonizar la interacción CD30/CD30L en ratones con CIA. Se generó una artritis provocada con colágeno (CIA) en machos de ratón DBA/1 (Harlan, Reino Unido) inyectándoles colágeno de tipo II de gallina (Sigma). Los ratones recibieron una inyección de 100 \mug del colágeno en adyuvante completo de Freund el día 0 y una dosis de refuerzo de 200 \mug en adyuvante incompleto de Freund el día 21. Las inyecciones de colágeno se administraron intradérmicamente en la base de la cola. En este modelo, generalmente el 75-100% de los ratones resultan afectados; es decir, el 75-100% de los ratones presentan síntomas de artritis después de la inyección de colágeno. En estos experimentos, el día 23 aparecían normalmente indicios de CIA en los ratones afectados.

A los ratones a los que se había inyectado colágeno de la manera anteriormente descrita se les inyectaron intraperitonealmente dosis del anticuerpo monoclonal M15, cuya preparación se describe en el Ejemplo 1, que variaban de 0,15 a 150 \mug. Se llevaron a cabo cuatro experimentos, cada uno de los cuales requería 13-15 ratones por grupo de ensayo. En cada uno de los cuatro experimentos, los ratones testigo positivo recibieron 150 \mug de etanercept (ENBREL®, Immunex Corporation), que es conocido por ser eficaz contra la CIA, y los ratones testigo negativo recibieron esta misma cantidad de IgG humana (huIgG) o IgG de rata. Las inyecciones diarias de M15, etanercept o IgG se iniciaron el día 21, es decir, el día de la segunda inyección de colágeno, y se continuaron hasta el día 33.

Durante estos experimentos, los ratones fueron valorados tres veces por semana en cuanto a signos clínicos de artritis por un observador independiente cegado en cuanto a los grupos de tratamiento. Se evaluó la enfermedad utilizando un sistema de índice de artritis que ha sido establecido para este sistema modelo. Para la calificación, a cada pata se le asignó una calificación clínica basada en el índice. Se combinaron las calificaciones de las patas de cada animal para determinar una calificación clínica para ese animal. El índice utilizado fue el siguiente:

0 =

aspecto normal

1 =

eritema/edema en 1-2 dedos

2 =

eritema/edema en > 2 dedos, o hinchazón poco grave en la articulación del tobillo/codillo

3 =

eritema/edema en toda la pata

4 =

eritema/edema masivos en toda la pata que se extienden a las articulaciones proximales; anquilosis; pérdida de función.

En todos los grupos que recibieron M15 resultaron evidentes unas calificaciones clínicas medias mejoradas al quinto día de administración de M15, y, en un experimento, al tercer día de la administración. Los resultados finales de los cuatro experimentos se resumen en las Tablas 1-4, mostradas más adelante. Para cada grupo de ratones, se calcularon las calificaciones clínicas medias, el porcentaje de incidencia de la enfermedad (número de ratones que presentan CIA, dividido por el número total de ratones en el grupo) y el porcentaje de ratones afectados que presentaban una enfermedad grave. Los ratones considerados con "enfermedad grave" son aquellos que tuvieron una calificación clínica superior a dos en cualquier momento del experimento. Se determinó la significación estadística para las diferencias en la calificación clínica media entre el grupo testigo negativo y los demás grupos de ratones, basándose en las calificaciones del último día del experimento. Se determinó la significación estadística utilizando un análisis de la varianza (ANOVA; del inglés, analysis of variance) de una vía con el método de Dunnet (H. J. Motuisky, Analyzing Data with GraphPad Prism, 1999, GraphPad Software, Inc., San Diego, California, EE.UU.). El ANOVA de una vía permite comparar tres o más grupos cuando los datos se categorizan en una vía. El método de Dunnett permite comparar los grupos testigo con los grupos de tratamiento.

En el primer experimento se ensayaron los efectos de administrar una dosis de 150 \mug/día del anticuerpo M15 a ratones con CIA. El día 4 ó 5 de este experimento, comenzaron a aparecer diferencias en la calificación clínica media entre los animales testigo negativo y aquellos que habían recibido M15 o etanercept. Los resultados de este primer experimento se resumen en la Tabla 1. Como se esperaba, los ratones que habían recibido etanercept (grupo testigo positivo) presentaban una menor incidencia de enfermedad y una reducida incidencia de enfermedad grave cuando se comparaban con los ratones testigo negativo que habían recibido HuIgG. Los ratones que habían recibido M15 también presentaban una menor incidencia de enfermedad y un reducido porcentaje de ratones con enfermedad grave (véase la Tabla 1) en comparación con los testigos negativos. Además, el grupo de M15 tenía una menor calificación clínica media que los testigos negativos el último día del experimento (día 33). Se halló que, tanto para el grupo de etanercept como para el de M15, las diferencias del último día en la calificación clínica media con respecto a los testigos negativos eran estadísticamente significativas (p = 0,05 o menor).

TABLA 1

1

En un segundo experimento se empleó un protocolo similar para comparar las dosis de 50 \mug y 150 \mug de M15. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Para este experimento, se vio la mejoría estadísticamente significativa en la calificación clínica media al final del experimento tanto en el grupo del etanercept como en los grupos de ambas dosis de M15.

TABLA 2

2

En un tercer experimento, se compararon las dosis de 15, 50 y 150 \mug de M15, y los resultados se resumen en la Tabla 3. De nuevo, los ratones que habían recibido M15 experimentaron una menor incidencia de enfermedad así como una menor incidencia de enfermedad grave en comparación con los testigos negativos. En este experimento, con las tres dosis de M15 se observó una mejoría estadísticamente significativa en la calificación clínica media con respecto a los testigos.

TABLA 3

3

En un cuarto experimento, se ensayaron las dosis de 0,15, 1,5, 15 y 150 \mug de M15 usando IgG de rata como testigo negativo. Los resultados de este experimento se muestran en la Tabla 4. Como se ve en la Tabla 4, la mejoría en la calificación clínica media presentaba una dependencia de la dosis para las dosis mayores. Para las dosis de 15 y 150 \mug, la mejoría en la calificación clínica era estadísticamente significativa.

TABLA 4

4

Ejemplo 3 Modelo de artritis murina provocada con colágeno, independiente de TNF

Se generó un nuevo ratón al mover mutaciones nulas específicas, previamente descritas, en ambos receptores de TNF-\alpha, p55 y p75 (Peschon et al., J. Immunol. 160: 943-952, 1998), de la base genética C57BL/6 insensible a la CIA a la base genética DBA/1 sensible a la CIA.

Se generaron ratones DBA/1 doblemente deficientes en los receptores p55 y p75 (DBA/1 p55^{-/-} p75^{-/-}) al cruzar ratones C57BL/6 p55^{-/-} p75^{-/-} (Peschon et al., 1998) con ratones DBA1 obtenidos de Jackson Laboratories. Los heterocigotos dobles resultantes fueron cruzados de nuevo con ratones DBA/1. La progenie resultante, que era heterocigota para ambas mutaciones, fue adicionalmente ensayada en cuanto a homocigosidad en el complejo MHC de DBA/1 (necesario para la sensibilidad a la CIA) mediante un análisis por FACS, utilizando anticuerpos específicos para los alelos del MHC de C57BL/6 y DBA/1. Los anticuerpos contra los alelos del MHC de C57BL/6 y DBA/1 fueron adquiridos a BD Pharmingen.

Aquellas progenies que eran homocigotas para el MHC de DBA/1 fueron cruzadas con DBA/1 durante otras tres generaciones para generar ratones DBA/1 heterocigotos para ambas mutaciones de los receptores p55 y p75 de TNF (DBA/1 N5 p55^{+/-} p75^{+/-}; "N5" se refiere a la quinta generación de retrocruce). Los ratones DBA/1 N5 p55^{+/-} p75^{+/-} fueron intercruzados para establecer una colonia de ratones DBA/1 doblemente deficientes en los receptores p55 y p75 de TNF (DBA/1 N5 p55^{-/-} p75^{-/-}). Con objeto de identificar los ratones que eran homocigotos para cada una de las mutaciones nulas, se analizó el DNA de la progenie de los últimos cruces usando ensayos de PCR específicos para los genes murinos de los TNFR p55 y p75, usando DNA extraído de punciones en las orejas.

Para seguir las mutaciones en el gen p55, se usaron los cebadores de PCR siguientes:

p60-B:	5'-GGATTGTCAC GGTGCCGTTG AAG-3'	(ID. SEC. nº 9)
p60-E:	5'-CCGGTGGATG TGGAATGTGT G-3'	(ID. SEC. nº 10)
p60-spe:	5'-TGCTGATGGG GATACATCCA TC-3'	(ID. SEC. nº 11)
pgk5'-66:	5'-CCGGTGGATGTGGAATGTGTG-3'	(ID. SEC. nº 12)

Se añadieron veinticinco picomoles de cada uno de los cuatro cebadores anteriormente enumerados al DNA de las punciones en las orejas y se sometió la mezcla a 32 ciclos de PCR durante 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 65ºC y 30 segundos a 72ºC. Los productos de PCR fueron resueltos y visualizados en geles de agarosa de resolución fina USB al 3% (nº 73422 del catálogo) desarrollados en tampón TAE y teñidos en bromuro de etidio. Los esperados productos de PCR al usar los cebadores anteriores eran 120 pares de bases (bp; del inglés, base pairs) para p55^{+/+} y 155 bp para p55^{-/-}. Se esperaba que los ratones heterocigotos generasen ambos productos. En ratones p55^{-/-} se veían de vez en cuando productos inespecíficos adicionales que migraban a aproximadamente 300-500 bp.

Se usaron los siguientes cebadores para seguir las mutaciones de p75:

p80-Kas:	5'-AGAGCTCCAGGCACAAGGGC-3'	(ID. SEC. nº 13)
p80i-1:	5'-AACGGGCCAGACCTCGGGT-3'	(ID. SEC. nº 14)
pgk5'-66:	5'-CCGGTGGATGTGGAATGTGTG-3'	(ID. SEC. nº 12)

En estas reacciones PCR se utilizaron 50 picomoles de p80-Kas, 100 picomoles de p80i-1 y 20 picomoles de pgk5'-66 para 32-34 ciclos durante 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 65ºC y 30 segundos a 72ºC. Los productos de PCR fueron resueltos y visualizados en geles de agarosa de resolución fina USB al 3% desarrollados en tampón TAE y teñidos en bromuro de etidio. Se esperaba que los ratones p75^{+/+} generaran un producto de 275 bp y que los ratones p75^{-/-} generaran un producto de 160 bp. Se esperaba que los heterocigotos generasen ambos productos. De vez en cuando se veían productos inespecíficos adicionales que migraban a aproximadamente 50-100 bp.

Los ratones DBA/1 homocigotos p55^{-/-} p75^{-/-} fueron así identificados utilizando la PCR y fueron más tarde cruzados.

Ejemplo 4 Artritis provocada con colágeno en ratones DBA/1 p55^{-/-} p75^{-/-}

Los experimentos siguientes en que se usaron los ratones DBA/1 p55^{-/-} p75^{-/-} del Ejemplo 3 demuestran que la CIA independiente de TNF-\alpha puede ser eficazmente tratada al administrar un agente de ensayo que inhibe la transducción de señales por CD30 o IL-1.

Se provocó CIA en ratones DBA/1 p55^{-/-} p75^{-/-} al administrar colágeno heterólogo de tipo II de acuerdo con el protocolo anteriormente descrito en el Ejemplo 2. Se llevaron a cabo dos experimentos, en cada uno de los cuales se utilizaron 15 ratones por grupo de ensayo. Estos experimentos fueron diseñados para determinar si los inhibidores que se ensayaban podían evitar el desarrollo de CIA en estos ratones. Los ratones fueron aleatoriamente divididos en grupos (n = 15) en el momento del refuerzo, y se les inyectó diariamente el agente de ensayo o la proteína testigo durante 14 días.

En comparación con los ratones DBA/1 de tipo silvestre, los ratones DBA/1 p55^{-/-} p75^{-/-} a los que se había inyectado colágeno presentaban un inicio retrasado y un curso más lento de la enfermedad. Sin embargo, aparecieron síntomas clínicos significativos en los ratones mutantes a los 15-60 días después de la segunda inyección de colágeno. Como se esperaba, no se observó disminución alguna de síntomas de artritis en los ratones DBA/1 p55^{-/-} p75^{-/-} cuando fueron tratados con TNFR p75.Fc (ENBREL®, Immunex Corporation). Por contraste, ENBREL® es muy eficaz en cuanto a reducir los síntomas de artritis en los ratones DBA/1 de tipo silvestre con CIA (véase el Ejemplo 2 anterior). De este modo, la artritis observada en los ratones DBA/1 p55^{-/-} p75^{-/-} no está mediada por TNF-\alpha.

Se llevaron a cabo experimentos para determinar si moléculas distintas del TNF-\alpha desempeñaban un papel en la CIA en los ratones DBA/1 p55^{-/-} p75^{-/-}. En estos experimentos, se ensayaron agentes que inhiben la interacción CD30/CD30L o IL-1/IL-1R1 para ver si afectaban a la CIA en este modelo animal. Se administraron anticuerpos monoclonales contra IL-1R1 (M147; Immunex Corporation) o CD30L MURINO (M15; preparación descrita en el Ejemplo 1) a estos ratones mediante inyección intraperitoneal, mientras que los ratones testigo recibieron IgG de rata. Cada grupo experimental consistía en 15 ratones. Se inició el tratamiento con anticuerpo el día 21 (en el momento del refuerzo de colágeno) y se administró durante 21 días en el experimento nº 1 y durante 28 días en el experimento nº 2. Para el anticuerpo M15, se administró una dosis de 50 \mug por día y, para el anticuerpo M147, se administró una dosis de 50 \mug cada dos días. Se determinó la calificación clínica tres veces por semana utilizando el sistema de calificación clínica descrito en el Ejemplo 2.

Como se ilustra en la Tabla 5 (experimento nº 1) y la Tabla 6 (experimento nº 2), la administración de M147 o M15 redujo significativamente la artritis en los ratones DBA/1 p55^{-/-} p75^{-/-}, dando lugar M147 a una mejoría casi completa de la enfermedad.

TABLA 5

5

TABLA 6

6

Los resultados de estos dos experimentos muestran que se puede establecer artritis provocada con colágeno de un modo independiente de TNF-\alpha y que la inhibición de las interacciones IL-1/IL-1R1 o CD30/CD30L reduce eficazmente la enfermedad en estos ratones.

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Ejemplo 5 Modelo de encefalomielitis alérgica experimental en ratón

Este ejemplo demuestra la eficacia de los antagonistas de la interacción CD30/CD30L para tratar la esclerosis múltiple. Con este fin se empleó un modelo de esclerosis múltiple en ratón. Se provocó una encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) crónica, que es un modelo experimental bien aceptado para esta enfermedad, en hembras de ratón C57BL/6 (Taconic Farms Inc., Germantown, New York, EE.UU.) utilizando una modificación del protocolo descrito por Mendel et al. (Eur. J. Immunol. 25: 1951-59, 1995). En resumen, la provocación de la enfermedad implicaba la inmunización de los ratones con el péptido MOG35-55 derivado de glicoproteína oligodendrocítica de mielina de rata (Mendel et al., 1995). Las modificaciones al protocolo de Mendel et al. para la provocación de la enfermedad incluían el uso de una dosis menor de MOG35-55 para la inmunización (véase más adelante), ninguna inmunización de refuerzo, y el uso de adyuvante RIBI® en lugar de adyuvante completo de Freund.

Para provocar la EAE, se administró una dosis de 100 \mug de MOG35-55 de rata a grupos de ratones con edad y peso equivalentes (11-13 ratones por grupo). Se emulsionó MOG35-55 en 0,2 ml de adyuvante RIBI (Corixa Corporation) y se inyectó subcutáneamente en tres sitios distribuidos a lo largo del ijar afeitado. Para provocar la EAE con inicio acelerado, los ratones de un segundo experimento (Experimento 2) recibieron una inyección intravenosa de 500 ng de toxina pertúsica (List Biological Laboratory Inc, Campbell, California, EE.UU.) que se administró 48 horas después de que hubieron recibido su dosis de MOG35-55. Los ratones del Experimento 1 no recibieron toxina pertúsica; de este modo, el inicio de la enfermedad en el Experimento 2 resultó acelerado en comparación con el Experimento 1.

La administración de anticuerpo o placebo se inició el día después de la administración de MOG35-55 (día 1) y se continuó hasta el día 11. A cada ratón se inyectaron intraperitonealmente, un día sí y otro no, 0,2 ml de disolución salina tamponada con fosfato (PBS; del inglés, phosphate-buffered saline) y exenta de pirógenos o 0,2 ml de PBS que contenía uno de los siguientes: (i) 100 \mug de M15 (anti-CD30L), (ii) 100 \mug de IgG de rata (Sigma) o (iii) 75 \mug de M147 (anti-IL-1R1). Los niveles de endotoxinas eran < 10 UE/mg de proteína para todos los reactivos. Los ratones fueron controlados diariamente durante 35 días (Experimento 1) o 30 días (Experimento 2) en cuanto a pérdida de peso, inicio de la enfermedad y gravedad de los signos clínicos de EAE por un observador independiente cegado con respecto a los grupos de tratamiento.

La gravedad de la EAE fue valorada utilizando un sistema de índice de EAE estándar en que se utiliza "0" para indicar un ratón asintomático y se utilizan unas calificaciones clínicas que varían de 0,5 a 4 para indicar grados variables de parálisis creciente. La gravedad de la EAE fue evaluada utilizando una versión ligeramente modificada de un sistema de calificación de EAE comúnmente utilizado. En este sistema, se usó "0" para indicar un ratón sin evidencia de enfermedad y se usaron unas calificaciones de 1-5 para indicar grados variables de parálisis creciente del modo siguiente: 1, parálisis de la cola; 2, debilidad de los miembros traseros; 3, parálisis parcial de los miembros traseros; 4, parálisis completa de los miembros traseros; 5, moribundo o muerto. El protocolo morboso anteriormente descrito provoca un episodio agudo de enfermedad en ratones testigo (calificación máxima de 2-4), del cual la mayoría se recupera al menos parcialmente. De este modo, el episodio agudo de enfermedad no es letal y los ratones no alcanzan una calificación de 5. La escala anteriormente descrita fue modificada para incluir una calificación de "0,5", que se dio a los ratones que mostraron los signos más precoces de EAE pero que no presentaron parálisis completa de la cola. Los ratones que recibieron una calificación de 0,5 presentaban algunos de, o todos, los síntomas siguientes: pérdida de peso noc-
turna de 1-2 gramos; temblor evidente cuando se les levantaba por la cola; y debilidad en la punta distal de la cola.

El día mediano de inicio de la EAE fue determinado mediante un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier. Se valoraron las diferencias significativas en el inicio entre los grupos usando una comparación Log-Rank. Se utilizó la prueba exacta de Fischer para analizar la significación estadística de las diferencias en la incidencia de EAE entre los grupos de ratones.

Los resultados de estos dos experimentos demostraron los efectos de mejoría de cualquiera de los anticuerpos ensayados sobre el inicio, la incidencia y la gravedad del curso clínico de la EAE. Como se muestra a continuación en la Tabla 7, la administración de anti-CD30L (M15) o anti-IL-1R1 (M147) daba lugar a un inicio retrasado de la enfermedad y una incidencia reducida de la enfermedad en los dos experimentos.

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TABLA 7

7

En la Tabla 7, para los resultados combinados de los ratones que recibieron M15 o M147, cuando se comparan con los del grupo de IgG de rata, p < 0,05 para la incidencia de enfermedad. En el Experimento 1, para el día mediano de inicio para los ratones M15, p = 0,067 frente a IgG de rata y p < 0,05 frente a PBS. En el Experimento 2 de la Tabla 5, para el día mediano de inicio, p < 0,005 frente a IgG de rata tanto para el grupo de M15 como para el de M147.

Para estos dos mismos experimentos, en la Tabla 8 se muestra el porcentaje medio de cambio de los pesos corporales dentro de cada grupo a lo largo del curso agudo de la enfermedad. Como se muestra en la Tabla 8, los ratones que habían recibido anticuerpos anti-CD30L o anti-IL-1R1 perdían menos peso durante este período que los ratones que habían recibido IgG de rata o PBS.

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TABLA 8

8

Para calcular los datos de peso de la Tabla 8, se definió el peso de línea de base para cada ratón como su peso el día 12 (Experimento 1) o el día 10 (Experimento 2) con respecto a la inmunización. Se escogieron estos días como puntos de referencia porque todos los ratones de cada experimento tenían un peso equivalente el día 0 y el peso medio de todos los grupos aumentó de un forma similar entre los días 0-12 (Experimento 1) o los días 0-10 (Experimento 2). Los pesos medios de los diversos grupos divergían después de estos puntos temporales a causa de la pérdida de peso asociada con el inicio de la EAE. La columna de la izquierda de la Tabla 8 muestra el porcentaje medio de cambio de peso corporal calculado para todos los ratones de cada grupo de tratamiento; es decir, para este cálculo se incluyeron tanto los ratones clínicamente afectados (calificación clínica de al menos 0,5) como los no afectados. La columna de la derecha de la Tabla 8 muestra el cambio medio de peso corporal durante la fase aguda de la enfermedad sólo para los ratones que estaban clínicamente afectados. El cambio de peso corporal de los ratones afectados fue calculado basándose en la diferencia entre el peso de línea de base de cada ratón individual y el peso mínimo observado para ese ratón después del inicio de la enfermedad. Para los ratones que nunca mostraron evidencia clínica de enfermedad, el porcentaje de cambio de peso corporal de la Tabla 8 fue calculado comparando el peso de línea de base de cada ratón no afectado con su peso el día 25 del experimento.

Los datos de la Tabla 8 ilustran que anti-CD30L o anti-IL-1R1 es eficaz para lentificar la pérdida de peso que se observa, en ausencia de ellos, en los ratones a los que se ha inyectado MOG35-55. Se utilizó la prueba t de Student para determinar la significación estadística de estas diferencias en los pesos corporales. En la Tabla 8, los números hallados estadísticamente significativos son marcados con asteriscos, y los valores de p fueron los siguientes: * p < 0,05 frente a los testigos de IgG de rata; ** p < 0,01 frente a los testigos de IgG de rata; *** p < 0,001 frente a los testigos de IgG de rata.

La Tabla 9 presenta los resultados de calificación clínica para los Experimentos 1 y 2. Los valores medios y los SEM de los grupos se calcularon basándose en la calificación clínica máxima para cada ratón (0 para los ratones no afectados; de 0,5 a 4 para los ratones afectados). Se comparó la calificación clínica máxima media de cada grupo tratado con anticuerpo, con la del grupo tratado con IgG de rata utilizando la prueba t de Student, y los valores de p se muestran en la última columna de la Tabla 9.

TABLA 9

9

Como se muestra en la Tabla 9, se observaron diferencias significativas en la calificación clínica entre los grupos de los ratones tratados con M15 o M147, en comparación con los ratones testigo. Las diferencias que se determinaron como estadísticamente significativas (p < 0,05) están marcadas con un asterisco en la Tabla 9.

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Ejemplo 6 El bloqueo de CD30L retrasa la insuficiencia renal en un modelo murino de lupus eritematoso sistémico

Hembras de ratón híbrido (NZB x NZW)_{F1} (al que más adelante se hace referencia como "ratón NZB/W") desarrollan espontáneamente una enfermedad de tipo lupus caracterizada por la presencia de autoanticuerpos séricos hacia DNA de doble cadena (dsDNA; del inglés, double-stranded DNA). Estos ratones, que finalmente experimentan una insuficiencia renal total, se utilizan a menudo como modelo para una experimentación dirigida a conocer y tratar mejor el lupus en seres humanos. A lo largo del tiempo, en los ratones NZB/W este estado progresa hasta una disfunción renal que se manifiesta por la aparición de proteinuria. En un experimento de prueba para estudiar el inicio y el progreso de la enfermedad en estos ratones, aproximadamente la mitad tenía títulos anti-dsDNA séricos y aproximadamente el 10% tenía proteinuria a las 26 semanas de edad. A las 38 semanas de edad, el 20% de los ratones habían muerto y, de los ratones restantes, el 52% eran positivos para proteinuria y el 98% tenían títulos anti-dsDNA séricos.

Se utilizaron hembras de ratón NZB/W de 32 semanas de edad en un experimento para determinar si anti-CD30L podía retrasar el desarrollo de la enfermedad de tipo lupus. En un grupo de ratones de 32 semanas de edad, el 98% eran séricamente positivos para anticuerpos contra dsDNA (detectados por ELISA) pero sólo el 40% había progresado hasta la enfermedad renal según se evaluaba por proteinuria (detectada utilizando CHEMSTRIP®, Roche). En el siguiente experimento se usaron ratones de este grupo que eran negativos en cuanto a proteinuria.

Se dividieron ratones NZ/B de treinta y dos semanas de edad que no tenían proteinuria en dos grupos, y cada grupo fue tratado un día sí y otro no con 150 \mug de anti-CD30L (M15) (grupo de 10 ratones) o IgG de rata (grupo de 9 ratones) como testigo, administrados por inyección intraperitoneal. Se continuaron los tratamientos durante cinco semanas y se evaluaron semanalmente los ratones en cuanto a la presencia de proteinuria. En la Tabla 10 siguiente se resumen los valores aproximados para los porcentajes calculados a partir de los resultados de este experimento.

TABLA 10

10

Los datos de la Tabla 10 muestran una tendencia hacia una incidencia disminuida de proteinuria en los ratones tratados con anti-CD30L en comparación con los ratones testigo. Se utilizó una escala de 1 a 5 para evaluar el grado de proteinuria entre estos ratones. A las cinco semanas, el índice de proteinuria medio para los ratones testigo de este experimento era 1,7, mientras que los ratones tratados con M15 tenían un índice de proteinuria medio de 0,6. Este resultado sugiere que los seres humanos aquejados de lupus eritematoso sistémico podrían beneficiarse del tratamiento con anticuerpos contra CD30L o con otros antagonistas de la interacción CD30/CD30L.

Para confirmar el resultado anteriormente presentado, se asigna aleatoriamente un segundo grupo de hembras de ratón NZB/W a grupos de tratamiento cuando aparecen por vez primera anticuerpos contra dsDNA en su suero. Se diseña este experimento para examinar los efectos del tratamiento sobre el progreso de los títulos anti-dsDNA y sobre el progreso de la proteinuria. Un grupo de ratones es tratado con 150 \mug de anti-CD30L (M15) y el otro grupo es tratado con IgG de rata como testigo. Los tratamientos se administran tres veces por semana mediante inyección intraperitoneal, durante un periodo de tres semanas. Los ratones son semanalmente controlados en cuanto a los títulos de anticuerpos séricos hacia dsDNA y en cuanto a la aparición de proteinuria.

En otros experimentos, se ensayará la eficacia del tratamiento con anti-CD30L en un modelo de lupus químicamente inducido. En este modelo, la administración de pristano (2,6,10,14-tetrametilpentadecano), un alcano isoprenoide, provoca la producción de autoanticuerpos y una glomerulonefritis mediada por complejos inmunes. Una ventaja de este modelo es que no se limita a una raza de ratón particular. Están en curso experimentos iniciales en razas BALB/c y C57BL/6 normales de ratón.

<110> IMMUNEX CORPORATION

\hskip1cm

Mohler, Kendall M.

\hskip1cm

Barone, Dauphine S.

\hskip1cm

Peschon, Jacques J.

\hskip1cm

Kennedy, Mary K.

\hskip1cm

Pluenneke, John D.

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<120> MÉTODOS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES INFLAMATORIAS CRÓNICAS Y AUTOINMUNES USANDO ANTAGONISTAS DE CD30 O CD30L

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<130> 2959-WO

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<140> - - pendiente de asignar - -

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<141> 06-08-2001

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<150> 60/224.079

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<151> 08-08-2000

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<160> 16

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 705

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(705)

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<223>

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<400> 1

\hskip1cm

100

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<210> 2

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<211> 234

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

\hskip1cm

11

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<210> 3

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<211> 720

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<212> DNA

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<213> Mus sp.

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(720)

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<223>

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<400> 3

\hskip1cm

13

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<210> 4

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<211> 239

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<212> PRT

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<213> Mus sp.

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<400> 4

\hskip1cm

15

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<210> 5

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<211> 1788

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)..(1788)

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<223>

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<400> 5

\hskip1cm

16

\hskip1cm

17

\hskip1cm

18

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<210> 6

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<211> 595

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\hskip1cm

19

\hskip1cm

20

\hskip1cm

21

\hskip1cm

22

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<210> 7

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<211> 1357

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<212> DNA

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> péptido_maduro

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<222> (193)..()

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<223>

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<220>

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<221> CDS

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<222> (154)..(1347)

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<223>

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> péptido_señal

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<222> (154)..(192)

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<223>

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\hskip1cm

23

\hskip1cm

24

\hskip1cm

25

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<210> 8

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<211> 398

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

\hskip1cm

26

\hskip1cm

27

\hskip1cm

28

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Cebador sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\hskip-.1em\dddseqskip

ggattgtcac ggtgccgttg aag

\hfill

23

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Cebador sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccggtggatg tggaatgtgt g

\hfill

21

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

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<211> 22

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<223> Cebador sintético

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<400> 11

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgctgatggg gatacatcca tc

\hfill

22

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<210> 12

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<211> 21

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador sintético

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<400> 12

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccggtggatg tggaatgtgt g

\hfill

21

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cebador sintético

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

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\hskip-.1em\dddseqskip

agagctccag gcacaagggc

\hfill

20

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<210> 14

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<211> 19

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<212> DNA

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cebador sintético

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<400> 14

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aacgggccag acctcgggt

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

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<211> 2478

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

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<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)..(2475)

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<223>

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<220>

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<221> péptido_maduro

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<222> (76).. ()

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<223>

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<400> 15

\hskip1cm

29

\hskip1cm

30

\hskip1cm

31

\hskip1cm

32

\hskip1cm

33

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<210> 16

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<211> 825

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\hskip1cm

34

\hskip1cm

35

\hskip1cm

36

\hskip1cm

37

Claims (18)

1. Uso de un agente que es capaz de inhibir la unión de CD30 a CD30L, en que el agente es seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un anticuerpo que es específico para CD30L;

(b) un anticuerpo no agonista que es específico para CD30; y

(c) un polipéptido CD30 soluble que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i)

los aminoácidos 19-390 del polipéptido CD30 humano de la ID. SEC. nº 6;

(ii)

un fragmento de la secuencia de (i), en que dicho fragmento es capaz de unirse a CD30L; y

(iii)

un polipéptido ligante de CD30, que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a los aminoácidos 19-390 de la ID. SEC. nº 6,

en la preparación de un medicamento para el tratamiento de la artritis, la esclerosis múltiple o el lupus eritematoso sistémico en un paciente.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en que el paciente es un ser humano.

3. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 2, en que el agente es un polipéptido CD30 soluble humano que comprende los aminoácidos 19-390 de la ID. SEC. nº 6 o un fragmento del mismo que se une a CD30L, polipéptido que comprende además una región Fc de una inmunoglobulina humana.

4. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 2, en que el estado es artritis.

5. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 4, en que la artritis es artritis reumatoide.

6. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 1, en que el agente es administrado concurrentemente con un segundo agente que es un antagonista de TNF-\alpha, IL-1\alpha, IL-1\beta o IL-4.

7. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 2, en que el estado del paciente es lupus eritematoso sistémico.

8. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 6, en que el agente capaz de bloquear la interacción CD30/CD30L es un anticuerpo específico para CD30L, y el segundo agente es un antagonista de IL-4.

9. Un uso de acuerdo con la Reivindicación 8, en que el antagonista de IL-4 es seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo específico para IL-4, un anticuerpo específico para IL-4R y un receptor soluble de IL-4 que comprende los aminoácidos 1-207 ó 2-207 de la ID. SEC. nº 16.

10. Un agente que es capaz de inhibir la unión de CD30 a CD30L, en que el agente es seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un anticuerpo que es específico para CD30L;

(b) un anticuerpo no agonista que es específico para CD30; y

(c) un polipéptido CD30 soluble que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

(i)

los aminoácidos 19-390 del polipéptido CD30 humano de la ID. SEC. nº 6;

(ii)

un fragmento de la secuencia de (i), en que dicho fragmento es capaz de unirse a CD30L; y

(iii)

un polipéptido ligante de CD30, que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a los aminoácidos 19-390 de la ID. SEC. nº 6,

para uso en el tratamiento de la artritis, la esclerosis múltiple o el lupus eritematoso sistémico en un paciente.

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11. Un agente para uso de acuerdo con la Reivindicación 10, en que el paciente es un ser humano.

12. Un agente para uso de acuerdo con la Reivindicación 11, en que el agente es un polipéptido CD30 soluble humano que comprende los aminoácidos 19-390 de la ID. SEC. nº 6 o un fragmento del mismo que se une a CD30L, polipéptido que comprende además una región Fc de una inmunoglobulina humana.

13. Un agente para uso de acuerdo con la Reivindicación 11, en que el estado es artritis.

14. Un agente para uso de acuerdo con la Reivindicación 13, en que la artritis es artritis reumatoide.

15. Un agente para uso de acuerdo con la Reivindicación 10, en que el agente es administrado concurrentemente con un segundo agente que es un antagonista de TNF-\alpha, IL-1\alpha, IL-1\beta o IL-4.

16. Un agente para uso de acuerdo con la Reivindicación 11, en que el estado del paciente es lupus eritematoso sistémico.

17. Un agente para uso de acuerdo con la Reivindicación 15, en que el agente capaz de bloquear la interacción CD30/CD30L es un anticuerpo específico para CD30L, y el segundo agente es un antagonista de IL-4.

18. Un agente para uso de acuerdo con la Reivindicación 17, en que el antagonista de IL-4 es seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo específico para IL-4, un anticuerpo específico para IL-4R y un receptor soluble de IL-4 que comprende los aminoácidos 1-207 ó 2-207 de la ID. SEC. nº 16.