MXPA04006490A

MXPA04006490A - Anticuerpos monoclonales humanos contra cd30.

Info

Publication number: MXPA04006490A
Application number: MXPA04006490A
Authority: MX
Inventors: Keller Tibor
Original assignee: Medarex Inc
Priority date: 2002-01-09
Filing date: 2003-01-07
Publication date: 2005-06-08
Also published as: KR20060108775A; JP2005534281A; CN1638800A; AU2003205055C1; KR100829283B1; IL200604A0; US20100322920A1; AU2003205055B2; IL162835A0; WO2003059282A3; JP4562395B2; IL162835A; AU2003205055A1; US20040006215A1; KR20040075069A; CA2471702C; EP1471938A4; US8088377B2; CN1638800B; KR100668538B1

Abstract

Se describen los anticuerpos monoclonales humanos aislados, los cuales se unen a CD30 (por ejemplo CD30 humano). Los anticuerpos humanos pueden producirse en un animal transgenico no humano, como puede ser un raton transgenico, capaz de producir multiples isotipos de los anticuerpos monoclonales humanos al sufrir recombinacion V-D-J e intercambio del isotipo. Tambien se describen los derivados de los anticuerpos humanos (por ejemplo los anticuerpos biespecificos o inmunoconjugados), las composiciones farmaceuticas que contienen los anticuerpos humanos, los animales transgenicos no humanos e hibridomas que produzcan los anticuerpos humanos, y los metodos terapeuticos y de diagnostico para utilizar los anticuerpos humanos.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES HUMANOS CONTRA CD30 SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama prioridad ante la serie US No. 60/347,649 presentada el 9 de enero de 2002, la serie US No. 60/404,427 presentada el 19 de agosto de 2002 y la Serie US No. 960/431684 presentada el 6 de diciembre de 2002, el contenido de las cuales se incorpora en la presente como referencia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La molécula de superficie celular CD30 es un miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral (TNF-R) . Esta familia de moléculas tiene homología variable entre sus miembros e incluye el receptor del factor del crecimiento del nervio (NGFR) , CD120(a), CD120(b), CD27, CD40 y CD95. Estas moléculas por lo regular se caracterizan por la presencia de múltiples repeticiones ricas en cisterna en la región extracitoplásmica (de Bruin, P. C, y col. Leukemia. 9: 1620-1627 (1995)). Los miembros de esta familia son considerados importantes para regular la proliferación y diferenciación de los linfocitos.

CD30 es una glucoproteína transmembranal tipo I con seis repeticiones (humano) o tres repeticiones (murino y rata) ricas en cisteína con una secuencia de bisagra central. CD30 existe como .una molécula de membrana de 120 kDa que se desarrolla a partir de una proteína precursora intercelular de 90 kDa. Se vierte de la superficie celular como una proteína soluble (sCD30) de aproximadamente 90 kDa. El derrame de las sCD30 ocurre como un proceso activo de las células CD30 viables y no es solo causado por la liberación de las células moribundas o muertas. Los cDNAs que codifican la proteína CD30 han sido clonados a partir de bibliotecas de expresión de la línea de células T humanas HLTV-1, HUT-102 por inmunocribado con anticuerpos monoclonales Ki-1 y Ber-H2 (Schwab, U.( y col., Nature 299: 65 (1982)). Se ha encontrado que el cDNA para CD30 de ratón y rata codifica 498 y 493 aminoácidos, respectivamente. El cDNA para CD30 humano codifica otros 90 aminoácidos, parcialmente duplicados a partir de uno de los dominios ricos en cisteína. El gen de CD30 ha sido mapeado a lp36 en humanos y 5q36.2 en ratas.

CD30 se expresa preferentemente por las células linfoides activadas. Específicamente, se ha demostrado que la estimulación de CD30 en las células linfoides induce efectos biológicos pleiotrópicos , incluida la proliferación, activación, diferenciación y muerte celular, dependiendo del tipo de célula, la etapa de la diferenciación y la presencia de otros estímulos (Gruss, H. J. y col., Blood 83: 2045-2056 (1994)). La CD30 originalmente se identificó mediante el anticuerpo monoclonal Ki-1, que es reactivo con los antígenos expresados en células de Hodgkin y Reed-Sternberg de la enfermedad de Hodgkin (Schwab y col., Nafcure 299: 65 (1982)). Por consiguiente, la CD30 se utiliza extensamente como marcador clínico para el linfoma de Hodgkin y malignidades hematológicas relacionadas (Froese y col., J. I rnunol. 139:' 2081 (1987); Carde y col., Eur. J. Cáncer 26: 474 (1990)) . ' Después se demostró que CD30 es expresada en una subserie de linfomas de no Hodgkin (NHL) , incluido el linfoma de Burkitt, linfomas anaplásicos de células grandes (ALCL) , linfomas de células T cutáneas, linfomas de células segmentadas pequeñas, nodulares, linfomas linfocíticos , linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfomas inmunoblásticos , leucemia/linfornas de células T (ATLL) , leucemia de células T del adulto (T-ALL) y linfomas foliculares entroblásticas [sic] /centrocíticas (cb/cc) (Stein y col., Blood 66: 848 (1985); Miettinen, Arch. Pathol. Lab. Med. 116: 1197 (1992); Piris y col., Histopathology 17: 211 (1990); Burns y col., Am. J. Clin. Pathol. 93: 327 (1990); y Eckert y col., Am. J. Der atopathol . 11: 345 (1989)), así como diversas líneas transformadas por virus como pueden ser las células T transformadas por el virus linfotrópico de células T humanas I ó II, y las células B transformadas por el virus de Epstein-Barr (Stein y col., Blood 66: 848 (1985); Andreesen y col., Blood 63: 1299 (1984)). Adem s, se ha documentado la expresión de CD30 en carcinomas embrionarios, carcinomas no embrionarios, melanomas malignos, tumores mesenquimales y líneas de células míeloides y macrofagos en las etapas tardías de la diferenciación (Schwarting y col., Blood 74: 1678 (1989); Pallesen y col., Am J. Pathol. 133: 446 (1988); Mechtersheimer y col., Cáncer 66: 1732 (1990); Andreesen y col., Am. J. Pathol. 134: 187 (1989)).

En vista de que es muy pequeño el porcentaje de células CD30 positivas en individuos normales, la expresión de CD30 en células tumorales las hace un blanco importante en la terapia mediada por anticuerpos para dirigir específicamente los agentes terapéuticos contra células neoplásicas CD30 positivas (Chaiarle, R., y col., Clin. Immunol. 90(2): 157-164 (1999)). No obstante, aunque los resultados obtenidos a la fecha establecen claramente la CD30 como un blanco útil para la inmunoterapia, también muestran que los anticuerpos murinos actualmente disponibles no constituyen agentes terapéuticos ideales.

Por consiguiente, existe la necesidad de anticuerpos terapéuticos mejorados contra CD30 que sean eficaces en el tratamiento y/o prevención de enfermedades mediadas por CD30.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona los anticuerpos monoclonales humanos, aislados, que se unen a CD30 humana, así como los derivados (por ejemplo los inmunoconjugados y moléculas biespecíficas) y otras composiciones terapéuticas que contienen estos anticuerpos, solos o en combinación con otros agentes terapéuticos. También se proporcionan los métodos para el tratamiento de una variedad de enfermedades mediadas por CD30 utilizando los anticuerpos y las composiciones de la invención.

Los anticuerpos humanos de la presente invención se unen a CD30 e inhiben la función de la CD30 (y los efectos mediados por CD30) y/o inhiben el crecimiento (por ejemplo son mediadores de la muerte) de células que expresan CD30, como pueden ser las células tumorales y células que participan en enfermedades inmunitarias . Estas células incluyen, por ejemplo, células de la médula ósea, células hepáticas, células de ganglios linfáticos, células de la piel, células esplénicas, células¡del timo, células de las amígdalas, células desiduales, células endometriales , células de Hodgkin, células de Reed-Sternberg, células del linfoma anaplásico de células grandes (ALCL) , células del linfoma pleomórfico e inmunoblástico, células T, células B, células NK y monocitos. En una modalidad particular, los anticuerpos humanos se utilizan para inhibir el crecimiento/mediar la muerte de células de Hodgkin en el tratamiento de linfoma.

En una modalidad de la invención, los anticuerpos humanos inhiben el crecimiento/median la muerte de células tumorales induciendo la citotoxicidad celular dependiente de los anticuerpos (ADCC) en presencia de células efectoras humanas (como los monocitos o células mononucleares) . En otra modalidad, los anticuerpos humanos inducen la fagocitosis de las células tumorales que expresan CD30 en presencia de macrofagos. Por consiguiente, los anticuerpos de la presente invención proporcionan un medio mejorado para tratar y prevenir alteraciones . mediadas por la actividad de CD30 que puede atribuirse en parte a su especificidad única (por ejemplo especificidad para el epítope y ausencia de reactividad cruzada con los antigenos de superficie celular relacionados) , afinidad, estructura, actividad funcional y el hecho de que son completamente humanas, haciéndolas mucho menos inmunogénicas y más eficaces desde el punto de vista terapéutico y útiles cuando se administran a pacientes humanos, si se comparan con otros anticuerpos para CD30 antes producidos (por ejemplo los anticuerpos murinos y humanizados) .

Los anticuerpos humanos aislados de la invención incluyen una variedad de isotipos de anticuerpos, como IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl , IgA2 , IgAsec, IgD e IgE. Por lo regular incluyen los isotipos IgGl (como la igGlk) , lgG3 e IgM. Los anticuerpos pueden ser de longitud completa (como un anticuerpo IgGl ó IgG3) o pueden incluir una porción que se una al antígeno (como un fragmento Fab, F(ab')2, Fv ó un fragmento Fv monocatenario) .

Un anticuerpo terapéutico específico de la presente invención consiste en el anticuerpo monoclonal humano (HuMab) 17G1 y los anticuerpos con funcionalidad equivalente, los cuales: (a) son codificados por los ácidos nucleicos de la cadena pesada humana y la cadena ligera humana que comprenden las secuencias -de nucleótidos en sus regiones variables, como se establece en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO : 3, respectivamente, y las modificaciones de la secuencia conservativa de éstas, o (b) incluyen las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera las cuales comprenden las secuencias de aminoácidos que se muestran en la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4·, respectivamente, ' y modificaciones de la secuencia conservativa de éstas.

Otro anticuerpo terapéutico específico de la presente invención consiste en el anticuerpo monoclonal humano (HuMab) 17G1 y los anticuerpos con funcionalidad equivalente los cuales: (a) son codificados por los ácidos nucleicos de la cadena pesada humana y la cadena ligera humana que comprenden las secuencias de nucleótidos en sus regiones variables como se establece en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO : 3, respectivamente, y las modificaciones de la secuencia conservativa de éstas, o (b) incluyen las regiones variables de la cadena pesada y de la cadena ligera las cuales comprenden las secuencias de aminoácidos que se muestran en la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente, y modificaciones de la secuencia conservativa de éstas.

Todavía otro anticuerpo terapéutico específico de la presente invención consiste en el anticuerpo monoclonal humano 5F11 y los anticuerpos con funcionalidad equivalente, los cuales (a) son codificados por los ácidos nucleicos de la cadena pesada humana y la cadena ligera humana que comprenden las secuencias de nucleótidos en sus regiones variables como se establece en la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 11, respectivamente, y las modificaciones de la secuencia conservativa de éstas, o (b) incluyen las regiones variables de la cadena pesada y la cadena que comprenden las secuencias de aminoácidos que se muestran en la SEQ ID NO: 10 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente, y las modificaciones a la secuencia conservativa de éstas .

También se incluyen dentro de la presente invención los anticuerpos que se unen a un epítope sobre la CD30 humana definidos por el anticuerpo 17G1, 2H9 ó 5F11, y/o que compiten para unirse a CD30 con el anticuerpo 17G1, 2H9 ó 5F11, o que tienen otras características de unión funcional mostradas por el anticuerpo 17G1, 2H9 ó 5F11. Anticuerpos como estos incluyen aquellos que se unen a CD30 con una constante de equilibrio de disociación (Kd) de aproximadamente 10"11 M y/o con una constante de equilibrio dé asociación (Ka) de al menos aproximadamente 7 -1 10 M . Estos anticuerpos también incluyen aquellos que no muestran reacción cruzada con los antígenos de la superficie celular relacionados y de este modo no inhiben su función. Todavía otros anticuerpos humanos particulares de la invención incluyen aquellos que comprenden un dominio CDR, que tienen una región CDR1 de la cadena pesada y ligera humanas, una región CDR2 de la cadena pesada y ligera humanas, y una región CDR3 de la cadena pesada y ligera humanas, en donde: (a) la CDR1, CDR2 y CDR3 de las regiones de la cadena pesada humana comprenden, una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de las regiones CDR1, CDR2 y CD 3 que se muestran en la Figura 7 (SEQ ID NO: 16, 17 y 18, respectivamente), la Figura 9 (SEQ ID NO: 28, 29 y 30, respectivamente) y la Figura 11 (SEQ ID NO: 40, 41 y 42, respectivamente) y las modificaciones a las secuencias conservativas de éstas, y (b) la CDR1, CDR2 y CDR3 de las regiones de la cadena ligera humana comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos de las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 que se muestran en la Figura 8 (SEQ ID NO: 22, 23 y 24, respectivamente), la Figura 10 (SEQ ID NO: 34, 35 y 36, respectivamente) y la Figura 12 (SEQ ID NO: 46, 47 y 48, respectivamente) y las modificaciones a las secuencias conservativas de éstas. De otro modo, los anticuerpos humanos particulares de la invención consisten en aquellos que contienen un dominio CDR con una región CDRl de cadena pesada y ligera humana, una región CDR2 de la cadena pesada y ligera humana y una región CDR3 de la cadena pesada y ligera humana, que comprenden una secuencia de aminoácidos al menos 80% homologa, de preferencia 85% homologa, más preferentemente 90%, 95%, 98% y 99% homologa para la secuencia de aminoácidos de las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 mostradas en las Figuras 7-12 (SEQ ID NO: 16, 17, 18, 22, 23, 24, 28, 29, 30, 34, 35, 36, 40, 41, 42, 46, 47 y 48) .

En otra modalidad, un anticuerpo humano de la presente invención se une a CD30 e inhibe la función CD30 (por ejemplo, los efectos mediados por CD30) bloqueando parcial o completamente la unión del ligando de CD30 a CD30. Los ejemplos de los ligandos de CD30 incluyen CD153, TRAF1, TRAF2 , TRAF3 y TRAF5.

En todavía otra modalidad, los anticuerpos humanos de la presente invención pueden caracterizarse por una o más de las siguientes propiedades: a) especificidad para la CD30; b) una afinidad para unirse a CD30 con una constante de afinidad de al menos aproximadamente 107 M"1, de preferencia alrededor de 108 Nf1 y con mayor preferencia alrededor de 109 "1 a 1010 M"1 o mayor; c) una constante de asociación (Kagoc) con CD30 de al menos aproximadamente 103, con mayor preferencia aproximadamente 104 y con mayor preferencia . alrededor de 5 - 1 - 1 10 M S ; d) una constante de disociación (KdiS) de CD30 de - 3 - 1 - 4 aproximadamente 10 s , de preferencia alrededor de 10 s"1, más preferentemente 10"5 s"1, y con mayor preferencia e) la habilidad para opsonizar una célula que exprese CD30; ó f) la habilidad para inhibir el ¦ crecimiento y/o mediar la fagocitosis y muerte de las células que expresan CD30 (por ejemplo una célula de tumor) en presencia de las células efectoras humanas en una concentración de aproximadamente 10 o menos (por ejemplo in vitro) .

Los anticuerpos anti-CD30 humanos de la invención pueden producirse en forma recombinante en una célula hospedera (por ejemplo en una célula CHO o una célula linfocítica) o pueden . obtenerse directamente de un hibridoma que exprese el anticuerpo (es decir, que incluya una célula B obtenida de un animal transgénico, no humano, por ejemplo un ratón transgénico, que tenga un genoma que contenga un transgen de la cadena pesada humana y un transgen de la cadena ligera humana que codifiquen el anticuerpo, fusionados a una célula inmortalizada) . En una modalidad particular, los anticuerpos se producen por un hibridoma que se menciona en la presente como 17G1 (SEQ ID NOS : 1-4), 2H9 (SEQ ID NOS: 5-8) y 5F11 (SEQ ID NOS: 9-12) .

En todavía otro aspecto, la invención proporciona un animal transgénico no humano, como puede ser un ratón transgénico (también mencionado en la presente como un "ratón HuMAb" ) , que exprese los anticuerpos monoclonales humanos que se unan a CD30. En una modalidad particular, el animal transgénico no humano es un ratón transgénico que tiene un genoma que contiene un transgen de la cadena pesada humana y un transgen de la cadena ligera humana que codifica todo o una parte de un anticuerpo de la invención. El animal transgénico humano puede ser inmunizado con una preparación purificada o enriquecida de antígeno CD30 y/o células que expresen CD30. De preferencia, el animal transgénico no humano, como puede ser el ratón transgénico, es capaz de producir múltiples isotipos de los anticuerpos monoclonales humanos para CD30 (como la IgG, IgA y/o IgM) al ser sometido a recombinación V-D-J y conmutar (switching) los isotipos. La conmutación (switching) de los isotipos puede ocurrir, por ejemplo, por conmutación de isotipos tradicional o no tradicional.

Por consiguiente, en todavía otro aspecto, la invención proporciona las células B aisladas a partir de un animal transgénico no humano como ya se describió, por ejemplo, un ratón transgénico, las cuales expresan los* anticuerpos anti-CD30 humanos. Las células B aisladas pueden entonces- ser inmortalizadas por fusión a una célula inmortalizada para obtener una fuente (como un hibridoma) de los anticuerpos anti-CD30 humanos. Estos hibridomas (es decir, que producen los anticuerpos anti-CD30 humanos) también están incluidos dentro del alcance de la invención.

Como se ejemplifica en la presente, los anticuerpos humanos de la invención pueden obtenerse directamente de los hibridomas que expresan el anticuerpo, o pueden ser clonados y expresados en forma recombinante en una célula hospedera (como una célula CHO o una célula linfocitica) . Por consiguiente, en otro aspecto, la presente invención proporciona los métodos para producir anticuerpos monoclonales humanos que se unan a la CD30 humana. En una modalidad, el método consiste en inmunizar un animal transgénico no humano, como puede ser un ratón transgénico, como ya se describió (por ejemplo que tenga un genoma que comprenda un transgén de la cadena pesada, humana y un transgen de la cadena ligera humana que codifiquen todo o una parte de un anticuerpo anti-CD30) , con una preparación purificada o enriquecida del antígeno CD30 humano y/o células que expresen la CD30 humana. Las células B (como las células B esplénicas) del animal entonces se obtienen y se fusionan con células de mieloma para formar células inmortales de hibridoma que ' secretan los anticuerpos monoclonales humanos contra CD30.

En todavía otro aspecto, los anticuerpos anti-CD30 humanos de la invención se derivan, ligan a, o coexpresan con otra molécula funcional, como sería otro péptido o proteína (por ejemplo un fragmento Fab' ) . Por ejemplo, un anticuerpo, o porción que se una al antígeno, de la invención, puede ligarse funcionalmente (por ejemplo por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más entidades moleculares, como sería a otro anticuerpo (para producir tal vez un anticuerpo biespecífico o uno multiespecífico) , una citotoxina, ligando celular o antígeno (para producir un inmunoconjugado, como una inmunotoxina) . Por consiguiente, la presente invención comprende una gran variedad de conjugados de anticuerpos, moléculas biespecíficas y multiespecíficas y proteínas de fusión, todos los cuales se unen a las células que. expresan CD30 y que pueden utilizarse para orientar otras moléculas a estas células.

En una modalidad particular, la invención proporciona una molécula biespecífica o multiespecífica que comprende al menos una primera especificidad de unión para C30 (por ejemplo el anticuerpo anti-CD30 humano o fragmento o mimético de éste) , y una segunda especificidad de unión para una célula efectora humana, como la especificidad de unión para un receptor Fe (por ejemplo un receptor Fcy humano, como el FcyRI , o un receptor Fea humano) . Por lo regular, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención consisten en al menos un anticuerpo, o un fragmento de éste (por ejemplo un fragmento Fab, Fab' , F(ab')2/ Fv ó un Fv monocatenario) , de preferencia un anticuerpo humano o una parte de éste, o un anticuerpo "quimérico" o uno "humanizado" o una parte de éste (como puede ser una región variable o región determinante de la complementariedad (CDR) proveniente de un anticuerpo no humano (por ejemplo murino) siendo la(s) parte (s) restante (s) de origen humano).

Por consiguiente, la presente invención consiste en las moléculas biespecíficas y multiespecíficas que se: unen a CD30 humana y a un receptor Fe, por ejemplo un receptor de IgG humana, como puede ser un receptor Fc-gama (FcyR) , como el FcyRI (CD64) , FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) . Otros receptores de Fe, como los receptores de IgA humana (por ejemplo FcocRI) , también pueden ser. considerados como blancos. El receptor Fe preferentemente se ubica sobre la superficie de una célula efectora, como un monocito, macrofago o una célula mononuclear activada. En una modalidad preferida, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas se unen a un receptor Fe en un sitio distinto del sitio de unión de Fe de la inmunoglobulina (por ejemplo, IgG ó IgA) del receptor. Por tanto, la unión de las moléculas biespecíficas y multiespecíficas no se bloquea por las concentraciones fisiológicas de las inmunoglobulinas .

En todavía otro aspecto, la presente invención propone los métodos para inhibir el crecimiento de las células que expresan CD30 poniendo en contacto las células con una cantidad eficaz de un anticuerpo, derivado de anticuerpo u otra composición terapéutica de la invención, de modo que se inhiba el crecimiento de las células. En una modalidad, el método consiste en matar las células que expresan CD30 en presencia de las células efectoras, por ejemplo por ADCC. En todavía otra modalidad, el método comprende la muerte de las células, que expresan CD30 por fagocitosis. De preferencia, las células se mueren o son inhibidas sin matar o inhibir la actividad de las células que no expresan CD30 pero que pueden, por ejemplo, expresar un antígeno de superficie celular estructuralmente relacionado (es decir, sin. reactividad cruzada para los antígenos de superficie celular relacionados, pero funcionalmente distintos). Las células que expresan CD30 que pueden ser inhibidas o aniquiladas utilizando los anticuerpos humanos de la invención incluyen, por ejemplo, células de tumor, células de médula ósea, células hepáticas, células de ganglios linfáticos, células de la piel, células esplénicas, células del timo, células de las amígdalas, células deciduales, células endometriales , células de Hodgkin, células de Reed-Sternberg, células del linfoma anaplásico de células grandes (ALCL) , células de linfoma pleomórfico e inmunoblástico, células T, células ?,· células N y monocitos.

Por consiguiente, los anticuerpos humanos de la presente invención pueden utilizarse para tratar y/o prevenir una variedad de enfermedades mediadas por CD30 al administrar los anticuerpos a partir de que sufran de éstas enfermedades. Las enfermedades ejemplares que puedan ser tratadas (por ejemplo mejoradas) o prevenidas incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a, enfermedades tumorigénicas y enfermedades autoinmunes. Los ejemplos de las enfermedades tumorigénicas que pueden ser tratadas y/o prevenidas incluyen la enfermedad de Hodgkin, el linfoma- anaplásico de células grandes (ALCL) , el linfoma, de células T del adulto (ATL) , el linfoma de células * T tipo linfadenopatía angioinmunoblástica (AILD) , linfomas basados en la cavidad corporal asociados con VIH, carcinomas embrionarios, carcinomas no diferenciados de la rinofaringe (por ejemplo el tumor de Schminke) , la enfermedad de Castleman, el Sarcoma de Kaposi y otros linfomas de células T ó células B. Los ejemplos de las enfermedades autoinmunes que pueden ser tratadas y/o prevenidas incluyen artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica, dermatitis atópica, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, granulomatosis de Wegner, síndrome de Ornen, falla renal crónica, mononucleosis infecciosa aguda, VIH y enfermedades asociadas con virus de herpes.

En una modalidad particular de la invención, el individuo al que se administra el anticuerpo además es tratado con un agente quimioterapéutico, radiación o un agente que module, por ejemplo, mejore o inhiba, la expresión o actividad de un receptor Fe, por ejemplo un receptor Fea o un receptor Fcy, como puede ser una citosina. Las citocinas comunes para la administración durante el tratamiento incluyen el factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) , el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrofagos (GM-CSF) , el interferón ? (IFN-?) y el factor de necrosis tumoral (TNF) . Los agentes terapéuticos comunes incluyen, entre otros, los agentes antineoplásicos como doxorubicina (adriamicina) , cisplatino, sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucil y ciclofosfamida hidroxiurea.

Para aumentar la eficacia terapéutica de los anticuerpos anti-CD30 humanos de la invención contra células de cáncer que no expresan altamente CD30, los anticuerpos pueden ser co-administrados con un agente que regule en forma ascendente, o de otro modo, efectúe la expresión de CD30, como puede ser una preparación de linfocina la cual provoca la expresión activada o regulada en forma ascendente y más homogénea de CD30 sobre las células tumorales . Las preparaciones de linfocina convenientes para la administración incluyen interferón gama, el factor de necrosis tumoral y combinaciones de éstos. Estos pueden administrarse por vía intravenosa. Las dosis convenientes de linfocina por lo regular abarcan desde 10,000 hasta 1,000,000 de unidades/paciente .

En todavía otro aspecto, la presente invención propone un método para detectar in vi tro ó in vivo la presencia de la CD30 en una muestra, por ejemplo para; diagnosticar una enfermedad relacionada con CD30. En una modalidad, esto se lleva a cabo' poniendo en contacto la muestra que va a ser probada, como una opción, junto con una muestra testigo, con un anticuerpo monoclonal humano de la invención (o una parte de éste que se una al antígeno) en condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y la CD30. La formación del complejo entonces se detecta (utilizando ELISA) . Cuando se utiliza una muestra testigo junto con la muestra a prueba, el complejo se detecta en ambas muestras y cualquier diferencia estadísticamente importante en la formación 'de los complejos entre las muestras es indicio de la presencia de la CD30 en la muestra a prueba.

En todavía otro aspecto, la invención proporciona las moléculas de ácido nucleico que codifican para los anticuerpos anti-CD30 humanos y partes de éstos (por e emplo, las regiones variables de éstos) , así como los vectores de expresión recombinantes que incluyen los ácidos nucleicos de la invención, y las células; hospederas transíectadas con estos vectores. Los métodos para producir los anticuerpos cultivando estas células hospederas también están comprendidos por la invención.

Los ácidos nucleicos éspecíficos proporcionados por la invención consisten en las secuencias de nucleótidos que se muestran en la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, que codifican para las cadenas pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo anti-CD30 humano (HuMab) 17G1, las secuencias de nucleótidos que se muestran en la SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 7, que codifican para las cadenas pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo anti-CD30 humano (HuMab) 2H9, y las secuencias de nucleótidos que se muestran en la SEQ ID NO: 9 y la SEQ ID NO: 11, que codifican para las cadenas pesada y ligera, respectivamente, del anticuerpo anti-CD30 humano (HuMab) 5F11.

En otro aspecto, la presente invención proporciona ' las composiciones terapéuticas y diagnósticas que contienen uno o más (es decir, una combinación de) anticuerpos anti-CD30 humanos junto con un portador. En una modalidad específica, . la composición además incluye uno o más de otros agentes terapéuticos, como agentes, citotóxicos o radiotóxicos , o agentes que activen la expresión de CD30 o la expresión de moléculas expresadas en las células efectoras, como puede ser GM-CSF que activa la expresión de los receptores Fe.

Para utilizarlos en el tratamiento y prevención in vivo de las enfermedades mediadas por CD30, los anticuerpos humanos de la presente invención se administran a pacientes (por ejemplo, individuos humanos) , en dosis terapéuticas eficaces utilizando cualquier vía de administración conveniente, como inyección y otras vías de administración conocidas en la técnica para los productos químicos basados en anticuerpos .

En otro aspecto, la presente invención proporciona un inmunoconjugado, por ejemplo, una inmunotoxina, el cual incluye un anticuerpo anti-CD30 completamente humano de la invención conjugado a un agente terapéutico, como puede ser un agente citotóxico, un agente radiotóxico, un fármaco quimioterapéutico, un agente inmunosupresor o un agente anti-inflamatorio, por ejemplo un compuesto esteroide y un anti-inflamatorio no esteroide.

De otro modo, los anticuerpos humanos de la invención pueden coadministrarse con agentes terapéuticos y citotóxicos como éstos, pero no ligarse a éstos. Pueden ser coadministrados al mismo tiempo con estos agentes (por ejemplo en una sola composición o por separado) o pueden administrarse antes o después de la administración de éstos agentes. Como ya se describió, agentes como estos pueden incluir agentes citotóxicos, agentes radiotóxicos o agentes quimioterapéuticos , como doxorubicina (adriamicina) , cisplatino, sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucil, ciclofosfamida hidroxiurea y combinaciones de éstos .

Otras peculiaridades y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y los ejemplos, los cuales no deben ser considerados como limitantes. El contenido de todas las referencias, patentes y solicitudes de patentes publicadas mencionadas a lo largo de esta solicitud se incorporan expresamente en la presente como referencia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es una gráfica que compara la unión dependiente de la dosis de los HuMabs anti-CD30, 17G1, 5F11, 2H9, y un isotipo testigo para CD30 recombinante .

La Figura 2 es una gráfica que compara la unión dependiente de la dosis de los HuMabs anti-CD30, 17G1, 5F11, 2H9 y, un isotipo testigo para la linea de células, de linfoma de Hodgkin, L540.

La Figura 3 es una gráfica que compara la citotoxicidad celular dependiente -de los anticuerpos, mediada por células mononucleares de las células de tumor de Hodgkin L540 mediante los HuMabs anti-CD30 17G1, 5F11, 2H9 y un isotipo' testigo.

La Figura 4 es una gráfica que compara la citotoxidad celular dependiente de anticuerpos, mediada por monocitos, de las células tumorales de Hodgkin, L540 mediante los HumAbs anti-CD30, 17G1, 5F11, 2H9 y un isotipo testigo.

La Figura 5A y B son gráficas que muestran la inhibición del crecimiento celular utilizando el HuMab 5F11.

La Figura 6 es una gráfica que muestra la inhibición del crecimiento de las células de tumor que expresan CD3Q mediante el HuMab 5F11, in vivo, utilizando un modelo de ratón xenoinj ertado .

La Figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) y que corresponde a la secuencia de aminoácidos: (SEQ ID NO: 2) de la región VH del HuMab 17G1. Se indican las regiones CDR.

La Figura 8 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) y que corresponde con la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de la región VL del HuMab 17G1. Se indican las regiones CDR.

La Figura 9 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 5) y que corresponde con la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de la región VH del HuMab 2H9. Se indican las regiones CDR.

La Figura 10 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 7) y que corresponde con la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) de la región VL del HuMab 2H9. Se indican las regiones CDR.

La Figura 11 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 9) y que corresponde con la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) de la región VH del HuMab 5F11. Se indican las regiones CDR.

La Figura 12 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 11) y que corresponde con la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) de la región VL del HuMab 5F11. Se indican las regiones CDR.

La Figura 13 muestra las secuencias de nucleótidos (SEQ ID NOS: 49, 50, 51, 52 y 53) de las secuencias de la línea germinativa VH4-34, L15, VH3-ll, A27 y L6 , respectivamente .

La Figura 14 es una gráfica que muestra que los anticuerpos para el cúmulo icluster) A pudieron inhibir la unión del HuMab 5F11, etiquetado con FITC, a las células L540, mientras que los anticuerpos para los cúmulos B ó C no pudieron hacerlo, indicando que 5F11 se une en, o cerca del epitope del cúmulo A.

La Figrura 15 es una gráfica que muestra los efectos del tratamiento con el HuMab 5F11 sobre la supervivencia de ratones SCID desafiados con células HL humanas L540CY en un modelo diseminado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona mejores terapias basadas en anticuerpos para tratar y diagnosticar una variedad de alteraciones mediadas por CD30 y/o células que expresan CD30 (por ejemplo alteraciones causadas por los efectos proliferativos de CD30) . Las terapias de la invención emplean anticuerpos monoclonales humanos, aislados, o partes de éstos, que se unen al antígeno, los cuales se unen a e inhiben tales funciones de la CD30 o células que expresan CD30, en particular en terapia humana .

En una modalidad, los anticuerpos humanos se producen en un animal transgénico no humano, como puede ser un ratón transgénico, capaz de producir múltiples isotipos de los anticuerpos monoclonales humanos para CD30 (por ejemplo IgG, IgA y/o IgE) al ser sometido a la recombinación V-D-J y la conmutación de los isotipos. Por consiguiente. Los aspectos específicos de la invención incluyen no solo los anticuerpos, fragmentos de anticuerpos y composiciones farmacéuticas de éstos, sino también a los animales transgénicos no humanos, células B e hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales. Los métodos para utilizar los anticuerpos de la invención con el fin de detectar una célula que exprese CD30, in vi tro ó in vivo, también están, comprendidos por la invención. Los métodos para utilizar los anticuerpos de la invención para bloquear o inhibir las actividades inducidas por CD30, por ejemplo las actividades de proliferación, también se proporcionan y son útiles en el tratamiento de las alteraciones asociadas con CD30, como las enfermedades tumorigénicas (como la enfermedad de Hodgkin) y las enfermedades autoinmunes (como el VIH) .

Para que la presente invención pueda comprenderse más fácilmente primero se definen algunos términos. Otras definiciones se establecen a lo largo de la descripción detallada.

Los términos "CD30" y "antigeno CD30" se utilizan en la presente en forma indistinta, e incluyen cualquier variante, isoforma y homólogos de especie de CD30 humana que sean expresados en forma natural por las células. En una modalidad preferida, la unión de un anticuerpo de la invención al antigeno CD30 inhibe el crecimiento de las células que expresan CD30 (por ejemplo una célula de tumor) inhibiendo o bloqueando la unión del ligando de CD30 a CD30. El término "ligando de CD30" comprende todos los ligandos (como los fisiológicos) para CD30. En una. modalidad preferida, el ligando para CD30 L, CD153, TRAF1, TRAF2, TRAF3 ó TRAF5. En otra modalidad preferida, la unión de anticuerpo de la invención al antigeno CD30 media la fagocitosis de las células efectoras y/o la muerte de las células que expresan CD30. En todav a otra, modalidad preferida, la unión de un anticuerpo de la invención al antígeno CD30 media el ADCC de las células efectoras de las células que expresan CD30.

Cuando se utiliza en la presente "inhibe el crecimiento" (por ejemplo refiriéndose a las células) se entiende que incluye cualquier enfermedad que pueda medirse con el crecimiento de una célula cuando se pone en contacto con un anticuerpo anti-CD30 en comparación con el crecimiento de la misma célula sin el contacto con un anticuerpo anti-CD30, por ejemplo, la inhibición del crecimiento de una célula en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ó 100%.

El término "anticuerpo" como se menciona en la presente incluye anticuerpos completos en cualquier fragmento que se una al antígeno (es decir, "parte que se una al antigeno") o cadena individual de este. Un "anticuerpo" se refiere a una glucoproteína que contiene al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras. (L) interconectadas por enlace disulfuro, o una parte que se une al antígeno de este. Cada cadena pesada está compuesta de una región variable de la cadena pesada (se abrevia en la presente como VH) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada está compuesta de tres dominios, CHi, CH2 y CH3. Cada cadena ligera esta compuesta de una región variable de la cadena ligera (se abrevia en la presente como VL) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta de un dominio, CL. Las regiones VH y VL además pueden subdividirse en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR) , intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de entramado o estructura (FR) . Cada VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR, ordenados de amino terminal a carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1 , CDR1, FR2 , CDR2, FR3 , CDR3 , FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interacciona con un antigeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a los tejidos hospederos o factores, incluidas las diferentes células del sistema inmunitario (como las células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento tradicional.

El término "porción que se une al antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción del anticuerpo"), cuando se utiliza en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la habilidad para unirse a un antígeno (por ejemplo a CD30) . Se ha demostrado que la función de unión al antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de unió comprendidos dentro del término "porción que se une al antígeno" de un anticuerpo incluyen: (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente consistente en los dominios VL, VH, CL y ¾; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende los fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región de bisagra; (iii) un fragmento Fd consistente en los dominios VH y CHi; (iv) un fragmento Fv consistente en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y col., (1989) Nature 341: 544-546) , que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Además, aunque los dos dominios del fragmento FV VL y VH, esté codificado por genes apartados, pueden unirse utilizando los métodos recombinantes mediante un ligador sintético que les permita formarse como una sola cadena proteínica en la que las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocaterio (scFv) ; véase, por ejemplo, Bird y col. (1988) Science 242: 423-426; y Huston y col. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883) . Anticuerpos monocatenarios como estos también se proponen para estar comprendidos dentro del término "porción que se une al antigeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen utilizando las técnicas tradicionales conocidas para los trabajadores expertos en la técnica, y los fragmentos se criban para su utilidad en la misma forma que para los anticuerpos intactos.

El término "epítope" significa un determinante proteína capaz de la unión específica a un anticuerpo.

Los epítopes por lo regular consisten en agrupamientos superficiales de moléculas químicamente activas, como los aminoácidos o las cadenas laterales azúcar, y por lo regular tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Los epítopes conformacionales y no conformacionales se distinguen en que la unión a los primeros, pero no a los últimos, se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes.

Cuando se utiliza en la presente, los términos "inhibe la unión" y "bloquea la unión" (en relación con la inhibición/bloqueo de la unión del ligando para CD30 a CD30. Inhibición/bloqueo se utiliza de manera indistinta y comprende la inhibición/bloqueo parcial y completo. La inhibición/bloqueo de CD30 de preferencia reduce o altera el nivel o tipo normal de actividad que ocurre cuando se lleva a cabo la unión de CD30 sin inhibición ni bloqueo, como en la inhibición de la proliferación inducida por CD30. La inhibición y bloqueo también están propuestas para incluir cualquier disminución que pueda medirse en la afinidad de unión de CD30 cuando se pone en contacto con un anticuerpo anti-CD30 en comparación con CD30 sin el contacto con un anticuerpo anti-CD30, por ejemplo, el bloqueo de CD30 a su receptor en al menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ó 100%.

El término "molécula biespecífica" se propone para que incluya cualquier agente, por ejemplo una proteína, péptido o complejo proteínico o peptídico, que tenga dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, la molécula puede unirse a, o interaccionar con, (a) un antígeno de la superficie celular, y (b) un receptor Fe sobre la superficie de una célula efectora. El término "molécula multiespecífica" o "molécula heteroespecífica" se propone para incluir cualquier agente, por ejemplo una proteína, péptido o complejo de proteína o péptido, que tenga más de dos especificidades de unión diferentes. Por ejemplo, la molécula puede unirse a, o interaccionar con, (a) un antígeno de la superficie celular, (b) un receptor Fe sobre la superficie de una célula efectora, y (c) al menos otro componente. Por consiguiente, la invención incluye, pero no se limita a, moléculas biespecíficas , triespecíficas , tetraespecíficas y otras multiespecíficas que se dirijan a los antígenos de la superficie celular, como CD30, y a otros blancos o dianas, como pueden ser los receptores Fe sobre las células efectoras .

El término "anticuerpos biespecíficos" también incluye los diacuerpos . Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos, en los que los dominios VH y VL se expresan sobre una cadena polipéptido individual, pero utilizando un ligador que ^ sea demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena, obligando de este modo a que los dominios se apareen con los dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión al antígeno (véase por ejemplo Holliger, P., y col. (1993) Proc. Nati. Acad. Scí. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., y col. (1994) Structure 2: 1121-1123) . Cuando se utiliza en la presente el término "heteroanticuerpos" se refiere a dos o más anticuerpos, fragmentos que se unen a los anticuerpos (por ejemplo el Fab) , derivados de éstos o regiones de unión al antígeno ligadas entre sí, al menos- dos de las cuales tienen diferentes especificidades. Estas especificidades diferentes incluyen una especificidad de unión por un receptor Fe sobre una célula efectora, y una especificidad de unión para un antígeno o epítúpe sobre una célula blanco, por ejemplo una célula de tumor.

El término "anticuerpo humano" , cuando se utiliza en la presente, se propone para incluir los anticuerpos que tienen regiones variables y constantes procedentes de las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinativa humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinativa humana (por ejemplo las mutaciones introducidas al azar o mutagénesis específicas del sitio in vitro o por mutación somática in vivo). No obstante, el término "anticuerpo humano" cuando se utiliza en la presente, no se propone para incluir a los anticuerpos en los que las secuencias CDR procedentes de la línea germinativa de otras especies de mamífero, como ratón, han sido injertadas sobre las secuencias humanas del entramado.

Los términos "anticuerpo monoclonal" ó "composición del anticuerpo monoclonal" cuando se utiliza en la presente se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra especificidad de unión y afinidad únicas para un epítope específico. Por consiguiente, el término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a los anticuerpos que muestran una sola especificidad de unión que tiene regiones variable y constante procedentes de las secuencias , de las inmunoglobulinas de la línea germinativa humana. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos se producen por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal transgénico no humano, por ejemplo un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgen de la cadena pesada humana y un transgen de la cadena ligera fusionados a una célula inmortalizada.

El término "anticuerpo humano recombinante" , cuando se utiliza en la presente, se propone para incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean, o aislan por medios recombinantes , como puede ser (a) los anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo un ratón) que es transgénico para los genes de inmunoglobulina humanos (que se describen más adelante e la Sección I, siguiente) , (b) los anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en' una célula hospedera, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos recombinante, combinatoria y (c) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el empalme de las secuencias de los genes para inmunoglobulinas humanas a otras secuencias de DNA. Estos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes procedentes de las secuencias de las inmunoglobulinas variables y constantes procedentes de las secuencias de las inmuno-globulinas de la línea germinativa humana. En ciertas modalidades, no obstante, estos anticuerpos humanos recombinantes pueden ser sometidos a mutagénesis ín vitro (o, cuando se utiliza un animal transgénico para las secuencias Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y de este modo las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque procedentes de y relacionadas con las secuencias VH y VL de la línea germinativa humana, pueden no existir en la naturaleza dentro del repertorio de la línea germinativa de anticuerpos humanos ín vivo.

Cuando se utiliza en la presente un "anticuerpo heterólogo" se define en relación con el organismo transgénico no humano que produce un anticuerpo comó este. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia codificadora de ácido nucleico correspondiente a la que se encuentra en un organismo que no consiste en el animal transgénico no humano, y por lo regular de una especie diferente a la del animal transgénico no humano.

Cuando se utiliza en la presente, "anticuerpo heterohíbrido" se refiere a un anticuerpo que tiene cadenas ligera y pesada de orígenes de diferentes organismos. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una cadena pesada humana asociada con una cadena ligera murina es un anticuerpo heterohíbrido . Los ejemplos de los anticuerpos heterohíbridos incluyen anticuerpos quiméricos y humanizados, discutidos supra.

Un "anticuerpo aislado", cuando se utiliza en la presente, se propone para referirse a un anticuerpo que está prácticamente libre de otros anticuerpos que tengan especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo un anticuerpo aislado que se una a CD30 está considerablemente libre de anticuerpos que se unan antígenos diferentes de CD30) . Un anticuerpo aislado que se une a un epítope, isoforma o variante de CD30 humana puede, no obstante, tener reactividad cruzada para otros antígenos relacionados, por ejemplo de otras especies (por ejemplo CD30 de especies homologas) . Más aún, un anticuerpo aislado puede estar considerablemente libre de otro material celular y/o químico. En una modalidad de la invención, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" que tienen especificidades diferentes se combina en una composición bien definida.

Cuando se utiliza en la presente "unión específica" se refiere al anticuerpo que se une a un antígeno predeterminado. Por lo regular, el anticuerpo se une con 7 - 1 una afinidad de al menos aproximadamente 1 x 10 M , y se une al antígeno predeterminado con una afinidad que es al menos dos veces mayor que su afinidad para unirse a un antígeno no específico (por ejemplo BSA, caseína) que no sea el antígeno predeterminado o un antígeno estrechamente relacionado. Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se utilizan de manera indistinta en la presente con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno" .

Cuando se utiliza en la presente, el término "alta afinidad" para un anticuerpo IgG se refiere a una 7 - 1 afinidad de unión de al menos . aproximadamente 10 , de 8 - X preferencia al menos aproximadamente 10 M , con mayor 9 -1 10 -1 preferencia al menos aproximadamente 10 M , 10 M , lO^IVf1 o mayor, por ejemplo hasta 1013M_1 o mayor. No obstante, unión de "alta afinidad" puede varar para otros isotipos de anticuerpos. Por ejemplo unión con "alta afinidad" para un isotipo de IgM se refiere a una 7 - 1 afinidad de unión de al menos aproximadamente 1 x 10 M .

El término "Kasoc" ó " a" cuando se utiliza en la presente, está destinado para referirse a la constante de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno especific .

El término "KaS" ó "K¿" cuando se utiliza en la presente, está destinado para referirse a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno específica .

Cuando se utiliza en la presente "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (IgM ó IgGl) que es codificada por genes de la región constante de la cadena pesada.

Cuando se utiliza en la presente, "conmutación del isotipo" se refiere al fenómeno mediante el cual la clase, o isotipo, de un anticuerpo cambia de una clase de Ig a otra de las demás clases de Ig.

Cuando se utiliza en la presente "isotipo no conmutado" se refiere a la clase isotípica de la cadena pesada que se produce cuando no toma lugar ninguna conmutación de isotipos; el gen de la CH que codifica el isotipo no intercambiado por lo regular es el primer gen de CH inmediatamente corriente abajo a partir del gen VDJ funcionalmente reordenado. La conmutación de isotipos se ha clasificado como conmutación (switching) de isotipos tradicional o no tradicional. La conmutación de isotipos tradicional ocurre por sucesos de recombinación que incluyen al menos una conmutación de la región de la secuencia en el transgen. Intercambios de isotipo no tradicionales pueden ocurrir, por ejemplo, por recombinación homologa entre sµ humana y ?µ humana (deleción asociada con d) . Otros mecanismos de conmutación no tradicionales, como la recombinación intertransgen y/o intercromosómica , entre otras, pueden ocurrir y efectuar conmutación de isotipos.

Cuando se utiliza en la presente, el término "secuencia switch" se refiere a aquellas secuencias de DNA responsables de la recombinación switch (conmutación). Una secuencia "donadora switch", por lo regular una región switch µ, será 5' (es decir, corriente arriba) de la región de la ¦ construcción que va a ser delecionada durante la recombinación switch. La región "aceptora switch" estará entre la región a construir que va a ser delecionada y la región constante de sustitución (por ejemplo ?, e, etc.) . En vista de que no hay un sitio especifico donde ocurra siempre la recombinación, la secuencia génica final por lo regular no será predecible a partir de la construcción.

Cuando se utiliza en la presente "modelo de glucosilación" se define como el modelo de las unidades carbohidrato que se unen en forma covalente a una proteína, más específicamente, a una proteína inmunoglobulina . Un modelo de glucosilación de un anticuerpo heterólogo puede caracterizarse como considerablemente semejante a los modelos de glucosilación que ocurre en forma natural en los anticuerpos producidos por las especies de los animales transgénicos no humanos , cuando un experto en la técnica se dará cuenta que el modelo de glucosilación del anticuerpo heterólogo es muy similar al modelo de glucosilación en las especies del animal transgénico no humano comparado con las especies de las cuales se obtienen los genes CH del transgen.

El término "que ocurre en forma natural" cuando se utiliza en la presente, aplicado a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la-naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que esté presente en un organismo (incluidos los virus) que puede ser aislado de una fuente en la naturaleza y que no haya sido modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio ocurre en forma natural .

El término "reordenado" cuando se utiliza en la presente se refiere a una configuración de un locus de la cadena pesada o la cadena ligera de la inmunoglobulina, en donde un segmento V se coloca inmediatamente junto a un segmento D-J ó J en una conformación que codifica prácticamente un dominio VH ó VL completo, respectivamente. Un locus génico reordenado de inmunoglobulina puede identificarse por comparación con el DNA de la línea germinativa; un locus reordenado tendrá al menos un elemento de homología heptámero/nonámero recombinado.

El término "no reordenado" ó "configuración de la línea germinativa" cuando se utilizan en la presente en relación con un segmento V se refiere a la configuración en donde el segmento V no está recombinado para estar inmediatamente junto a un segmento D ó J.

El término "molécula de ácido nucleico" , cuando se utiliza en la presente, se propone para incluir moléculas de DNA y moléculas de RNA. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero de preferencia es DNA bicatenario.

El término "molécula de ácido nucleico aislada", cuando se utiliza en la presente en relación con los ácidos nucleicos que codifican anticuerpos o partes de anticuerpos (por ejemplo VH, VL, CDR3) que se unen a CD30, se proponen para referirse a una molécula de ácido nucleico en la que las secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo, o la parte del anticuerpo, están libres de otras secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos o partes de anticuerpos que se unen a antígenos diferentes de CD30, estas otras secuencias pueden flanquear en forma natural el ácido nucleico en el DNA genómico humano. En una modalidad, el anticuerpo anti-CD30 humano, o parte de éste, incluye un nucleótido o secuencia de aminoácidos de 17G1, 2H9 ó 5F11, y las regiones variables de la cadena pesada (VH) que tengan la secuencia que se muestra en las SEQ ID NOS: 1 y 2, 5 y 6 y 9 y 10, respectivamente, y las regiones variables de la cadena ligera (VL) que tengan las secuencias que se muestran en las SEQ ID NOS: 3 y 4, 7 y 8, y 11 y 12, respectivamente .

Como se describe y reclama en la presente, las secuencias establecidas en las SEQ ID NOS: 1-12 incluyen las "modificaciones a las secuencias conservativas" , es decir, modificaciones a la secuencia de nucleótidos y aminoácidos que no afecten significativamente o alteren las características de unión del anticuerpo codificado por la secuencia de nucleótidos o que contienen la secuencia de aminoácidos. Modificaciones de la secuencia conservativa como éstas incluyen: sustituciones, adiciones y deleciones de nucleótidos y aminoácidos. Las modificaciones pueden ser introducidas en las SEQ ID NOS r 1-12 mediante las técnicas normales conocidas, como puede ser la mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de los aminoácidos conservativos incluyen aquellas en las que el residuo de aminoácido es sustituido con un residuo aminoácido que tenga una cadena lateral similar. Las familias de los residuos aminoácidos que tienen cadenas laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (como lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (como el ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin carga (por ejemplo glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano) , cadenas laterales no polares (como alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina) , cadenas laterales con ramificaciones beta (como treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (como tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina) . Asi pues, un residuo aminoácido no esencial pronosticado en un anticuerpo anti-CD30 humano preferentemente se sustituye con otro residuo aminoácido de la misma familia de cadenas laterales.

De otro modo, en otra modalidad, es posible introducir mutaciones al azar a lo largo de toda o una parte de la secuencia codificadora del anticuerpo anti-CD30, como puede ser por mutagénesis de saturación, y los anticuerpos anti-CD30 modificados, resultantes, pueden ser sometidos a escrutinio para la actividad de unión.

Por consiguiente, los anticuerpos codificados por las secuencias de nucleótidos (la región variable de la cadena pesada y ligera) que se describen en la presente y/o que contienen las secuencias de aminoácidos (de la región variable de la cadena pesada y ligera) descritas en la presente (es decir, las SEQ ID NOS: 1-12) incluyen anticuerpos considerablemente similares codificados por o que contienen secuencias similares que han sido modificadas en forma conservativa. Otra discusión sobre cómo pueden generarse los anticuerpos substancialmente similares a estos, basados en las secuencias parciales (las regiones variables de la cadena pesada y ligera) descritas en la presente como SEQ ID NOS: 1-12 se proporciona más adelante.

Para los ácidos nucleicos, el término "homología substancial" indica que dos ácidos nucleicos, o las secuencias designadas de éstos, cuando se alinean en forma óptima y se comparan son idénticos, como las inserciones o deleciones de nucleótidos adecuadas, en al menos aproximadamente 80% de los nucleótidos, por lo regular al menos aproximadamente 90% a 95%, y más preferentemente al menos aproximadamente 98% a 99.5% de los nucleótidos. De otro modo, existe homología substancial cuando los segmentos hibridarán en las condiciones de hibridación selectivas, al complemento de la hebra.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % homología = # de posiciones idénticas/total # de posiciones x .100) tomando en cuenta el número de hendiduras, y la longitud de cada hendidura, que necesitan ser introducidos para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de las secuencias y determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden lograrse utilizando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes siguientes.

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse utilizando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com) utilizando una matriz (N Sgapdna . CMMP y un peso de las hendiduras de 40, 50, 70 u 80 y un peso de la longitud de l, 2, 3, 4, 5 ó 6. El porcentaje de identidad entre dos nucleótidos o secuencias de aminoácidos también puede determinarse utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Millar {Comput. Appl. Biosci. 4: 11-17 (1988)) el cual se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso y una penalización de longitud de hendidura de 12 y una penalización de hendidura de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando el algoritmo de Needleman y unsch {J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)) que ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hendiduras de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6.

Las secuencias del ácido nucleico y proteínas de la presente invención además pueden utilizarse como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda contra las bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Estas búsquedas pueden realizarse utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul y col. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Las búsquedas de los nucleótidos BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, registro = 100, longitud de palabra = 12 para obtener las secuencias de nucleótidos homologas para las moléculas de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, registros = 50, longitud de palabra = 3 para obtener las secuencias de aminoácidos homologas para las moléculas de proteína de la invención. Para obtener alineamientos con los espacios para propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como está descrito en Altschul y col., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST es posible utilizar los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo XBLAST y NBLAST) . Véase http: //www.ncbi .nlm.nih.gov.

Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado de células o en una forma parcialmente purificada o substancialmente pura. Un ácido nucleico está "aislado" o "se volvió considerablemente puro" cuando se purifica de otros componentes celulares o de otros contaminantes, por ejemplo otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, por las técnicas convencionales, incluido el tratamiento alcálino/SDS , el bandeo con CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa u otras bien conocidas (véase, F. Ausubel y col. Current Protocols in Molecular Bioloqy,-Greene Publishing and Wiley Interscience , New York. (1987) .

Las composiciones de los ácidos nucleicos de la presente invención, aunque con frecuencia en una secuencia nativa (excepto para los sitios de restricción modificados y similares) , procedentes de cDNA, genómico o mezclas pueden ser mutadas de éstas [sic] de acuerdo con las técnicas normales para obtener secuencias génicas . Para secuencias codificadoras estas mutaciones pueden afectar la secuencia de aminoácidos según se desee. En particular las secuencias de DNA considerablemente homologas para o procedentes de las secuencias V, D, J; constantes, nativas, conmutadas (switches) y otras de éstas descritas en la presente están contempladas (donde "procedentes de" indica que una secuencia es idéntica o se modifica a partir de otras secuencias) .

Un ácido nucleico está "ligado de manera operante"-cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o potenciador está ligado de manera operante a una-secuencia codificadora si afecta a transcripción de la secuencia. Con respecto a las secuencias reguladoras de la transcripción, ligado de manera operante significa que. las secuencias de DNA que van a ligarse están adyacentes», y, cuando es necesario unir dos regiones codificadoras de proteínas, adyacentes y en el marco de lectura. Para secuencias "switch", ligado de manera operante indica que las secuencias son capaces de efectuar recombinación "swicht" .

El término "vector" cuando se utiliza en la presente está destinado para referirse a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual ha sido ligado. Un tipo de vector es un "plásmido" , lo cual se refiere a una asa de DNA bicatenaria, circular, en la que pueden ligarse otros segmentos de DNA. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los segmentos de DNA adicionales pueden ser ligados en el genoma viral. Algunos vectores pueden tener replicación autónoma en una célula hospedera en la que estos se introducen (por ejemplo los vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores mamíferos episomales) . Otros vectores (por ejemplo, ' los vectores mamífero no. episomales) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedera tras la introducción en la célula hospedera, y por este medio se replican junto con el genoma hospedero. Además, algunos vectores pueden, dirigir la expresión de los genes a los cuales están, ligados de manera operante. Estos vectores se conocen en la presente como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente "vectores de expresión") . En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de DNA recombinante suelen estar en forma de plásmidos . En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden utilizarse de manera indistinta, en vista de que el plásmido es la forma de vector que se utiliza con mayor frecuencia. No obstante, la invención está destinada a incluir estas otras formas de vectores. de expresión, como los vectores virales (por ejemplo los retrovirus, adenovirus y virus adenoasociados) , que tienen funciones equivalentes.

El término "célula hospedera recombinante" (o simplemente "célula hospedera"), cuando ' se utiliza en la presente se propone para referirse a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Debe entenderse que estos términos están propuestos para referirse no solo a la célula específica sino a la progenie de esta célula. Debido a que pueden ocurrir algunas modificaciones en las generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, la progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula precursora, pero todavía se incluye dentro del alcance el término "célula hospedera" cuando se utiliza en la presente.

Las células hospederas recombinantes incluyen, por ejemplo, las células CHO y células linfocíticas .

El término "transfectoma" , cuando se utiliza en la presente incluye células hospederas eucarióticas recombinantes que expresan el anticuerpo, como la célula CHO o las células NS/0.

Cuando se utiliza en la presente, el término "individuo" incluye cualquier animal humano o no humano. El término "animal no humano" abarca todos los vertebrados, por ejemplo mamíferos y no mamíferos, como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etcétera.

Los términos "animal transgénico, no humano" se refieren a un animal no humano que tiene un genoma con uno o más transgenes o transcromosomas de la cadena pesada y/o ligera humana (integrados o no integrados en el DNA genómico natural del animal) y que puede expresar completamente los anticuerpos humanos. Por ejemplo, un ratón transgénico puede tener un transgen de la cadena ligera humana y un transgen de la cadena pesada humana o transcromosoma de la cadena pesada humana, para que el ratón produzca anticuerpos anti-CD64 humanos cuando se inmuniza con el antígeno CD64 y/o células que expresen CD64. El transgen de la cadena pesada humana puede estar integrado en el DNA cromosómico del ratón, como es el caso para los transgénicos, por ejemplo ratones HuMAb, o el transgen de la cadena pesada humana puede mantenerse en forma extracromosómica, como es el caso para ratones transcromosómicos (por ejemplo KM), como está descrito en WO 02/43478. Los ratones transgénicos y transcromosómicos como estos pueden producir isotipos múltiples de anticuerpos monoclonales humanos para CD64 (como IgG, IgA y/o igE) cuando se les somete a recombinación V-D-J y conmutación (switching) del isotipo.

Algunos aspectos de la invención se describen con mayor detalle en las siguientes subsecciones.

I . Producción de anticuerpos humanos para CD30 Los anticuerpos monoclonales (MAbs) de la invención pueden producirse por una variedad de técnicas que incluyen la metodología de los anticuerpos monoclonales tradicional, por ejemplo la técnica de hibridación de células somáticas normal de Kohler y Milstein (1975) Nature 256: 495. Aunque se prefieren procedimientos de hibridación de células somáticas, en principio, es posible emplear otras técnicas para producir el anticuerpo monoclonal, por ejemplo la transformación viral u oncogénica de los linfocitos B.

El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y las técnicas de inmunización para aislar esplenocitos inmunizadas para fusión son conocidos en la técnica. Las contrapartes para la fusión (como las células de mieloma murino) y los procedimientos de fusión también son conocidos .

En una modalidad preferida, los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra CD30 pueden generarse utilizando ratones transgénicos que porten partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos, que se conocen en la presente como ratones "HuMAb" contienen un miniloci del gen de inmunoglobulina humana que codifica secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (µ y ?) y la cadena ligera ?, humanas, no reordenadas, junto con mutaciones dirigidas que inactivan los loci de las cadenas µ y ? endógenas . (Lonberg y col. (1994) Nature 368 (6474) : 856-859) . Por consiguiente, los ratones muestran expresión reducida de la IgM ó ? de ratón, y eri respuesta a la inmunización, los transgenes introducidos de las cadenas pesada y ligera humanas sufren conmutación (switching) de clase y mutación somática para generar IgG ? monoclonal humana de elevada afinidad (Lonberg, N. y col. (1994), supra; revisado en Lonberg, N. y Huszar, D. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immnol. Vol . 13: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764: 536-546) . La preparación de ratones HuMAb se describe con detalle en la sección II siguiente y en Taylor, L. y col. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J. y col. (1993) Internacional I munology 5: 647-656; Tuaillon y col. (1993) Proc. líati. Acad. Sci USA 90: 3720-3724; Choi y col. (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. y col. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon y col. (1994) J. Immunol . 152: 2912-2920; Lonberg y col. (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Taylor, L. y col. (1994) Jnternational Immunology 6: 579-591; Lonberg, N . y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol . 13: 65-93 ; Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci. 764: 536-546; Fishwild, D. y col. (1996) iVature Biotechnology 14: 845-851, los contenidos de todas las cuales se incorporan en la presente como referencia en sus enterezas. Véase además las Patentes US Nos: 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 6,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299 y 5,770,429; todas para Lonberg y Kay, y la GenPharm International; Patente US No. 5,545,807 para Surani y col.; las publicaciones internacionales Nos. WO 98/24884, publicada el 11 de junio de 1998; WO 94/25585 publicada el 10.de noviembre-de 1994; WO 93/1227 publicada el 24 de junio de 1993; WO 92/22645 publicada el 23 de diciembre de 1992; WO 92/03918 publicada el 19 de marzo de 1992, las descripciones de todas las cuales se incorporan en la presente como referencia en sus enterezas. De otro modo, los ratones transgénicos HC012 descritos en el Ejemplo 2 pueden utilizarse para generar anticuerpos anti-CD30 humanos .

Inmunizaciones mediante HuMAb Para generar anticuerpos monoclonales completamente humanos para CD30, los ratones HuMAb pueden ser inmunizados con una preparación purificada o enriquecida del antígeno CD30 y/o células que expresen CD30, como lo. describen Lonberg, N. y col. (1994) Natur'e 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. y col. (1996) ATature Biotechnology 14: 845-851 y WO. 98/24884. De preferencia, los ratones serán de 6-16 semanas de nacidos para la primera infusión. Por ejemplo, puede utilizarse una preparación purificada o enriquecida (5-20 ^ig) del antígeno CD30 (por ejemplo purificado de células L CaP que expresen CD30) para inmunizar los ratones HuMAb por vía intraperitoneal . En el caso de que las inmunizaciones utilizando la preparación purificada o enriquecida del antígeno CD30 no produzcan anticuerpos, los ratones también pueden ser inmunizados con células que expresen CD30, por ejemplo una línea de células de tumor, para favorecer las respuestas inmunitarias .

La experiencia acumulada con diversos antígenos ha demostrado que los ratones transgénicos HuMAb responden mejor cuando inicialmente se inmuniza por vía intraperitoneal (ip) con el antígeno en adyuvante completo de Freund, seguido por inmunizaciones ip cada dos semanas (hasta un total de 6) con el antígeno en el adyuvante incompleto de Freund. La respuesta inmunitaria puede supervisarse durante el transcurso del protocolo de inmunizaciones con muestras de plasma obtenidas por sangrados retroorbitales . El plasma puede ser tamizado por ELISA (como se describe más adelante) y los ratones con suficientes títulos de inmunoglobulina humana anti-CD30 pueden utilizarse para las fusiones. Los ratones pueden ser reforzados por vía intravenosa con antígeno tres días antes del sacrificio y la separación del bazo. Se considera que puede ser necesario realizar de dos a tres fusiones para cada antígeno. Se inmunizarán varios ratones para cada antígeno. Por ejemplo, pueden inmunizarse un total de 12 ratones HuMAb de las cepas HC07 y HC012 [sic] .

Creación de hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos para CD30 Los esplenocitos de ratón pueden ser aislados y fusionados con PEG para una línea de células de mieloma de ratón basándose en los protocolos normales. Los hibridomas resultantes entonces se criban para la producción de anticuerpos específicos del antígeno. Por ejemplo, las suspensiones de células individuales de los linfocitos esplénicos de ratones inmunizados se fusionan a una sexta parte del número de las células de mieloma de ratón no secretoras P3X63 -Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con PEG al 50%. Las células se plaquean a aproximadamente 2 x 105 en placas de microtitulación de fondo plano, seguido por incubación durante dos semanas en medio selectivo que contenga 20% de suero de clon fetal, 18% de medio acondicionado "653", 5% de origen (IG), L-glutamina 4 mM; L-glutamina 1 mM, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 5 mM, 2-mercapto etanol 0.055 mM, 50 unidades/mL de penicilina, 50 mg/mL de estreptomicina, 50 mg/mL de gentamicina y 1 X HAT (SIGMA; la HAT se adiciona 24 horas después de la fusión) . Después de dos semanas se cultivan las células en medio en el que la HAT se sustituye con AT. Luego se tamizan los pozos individuales por ELISA para los anticuerpos IgM e IgG monoclonales anti-CD30 humanos. Una vez que ocurre crecimiento extenso del hibridoma,. se.. observa el medio por lo regular después de 10-14 días. Se vuelven a plaquear los hibridomas secretores de anticuerpos, se tamizan de nuevo y si todavía son positivos para anticuerpos monoclonales anti-CD30, IgG humanos, pueden ser subclonados al menos dos veces por dilución limitante. Los subclones estables entonces se cultivan in vi tro para crear cantidades pequeñas de anticuerpo en el medio de cultivo de tejido para su caracterización.

Creación de transfectomas productores de anticuerpos monoclonales humanos para CD30 Los anticuerpos humanos de la invención también pueden producirse en un transfectoma de células hospederas utilizando, por ejemplo, una combinación de técnicas de DNA recombinante y métodos de transfección génica como es bien conocido en la técnica (por ejemplo Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpos de éstos, los DNAs que codifican las cadenas ligera y pesada de longitud parcial o completa pueden obtenerse por las técnicas de la biología molecular normales (por ejemplo la amplificación de la PCR, mutagénesis dirigida al sitio) y pueden insertarse en vectores de expresión de modo que los genes estén ligados de manera operante a las secuencias de control transcripcional y traduccionales . En este contexto, el término "ligado de manera operante" se propone para explicar que un gen de anticuerpo se liga en un vector de modo que las secuencias de control transcripcional y traduccional dentro del vector sirvan para su función propuesta de regular la transcripción y traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias para el control de la expresión se eligen para que sean compatibles con la célula hospedera de expresión utilizada. El gen para la cadena ligera del anticuerpo y el gen para la cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en vectores independientes o, más comúnmente, ambos genes se insertan en el mismo vector de. expresión. Los genes para los anticuerpos sé insertan en el vector de expresión por los métodos tradicionales (por ejemplo la ligación de sitios de restricción complementarios en el fragmento y vector del gen del anticuerpo, o ligación de extremos romos si no están presentes sitios de restricción) . Las regiones variables de la cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos en la presente pueden utilizarse para crear genes para anticuerpos de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo insertándolos en vectores de expresión que ya. codifiquen las regiones constante de la cadena pesada y constante de la cadena ligera del isotipo deseado de modo que el segmento VH esté ligado de manera operante al (los) segmento (s) CH dentro del vector y el segmento VL esté ligado de manera operante al segmento CL dentro del vector. Además, o de otro modo, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido señal que facilite la secreción de la cadena del anticuerpo a partir de una célula hospedera. El gen de la cadena del anticuerpo puede ser clonado en el vector de modo que el. péptido señal esté ligado en marco al amino terminal del gen de la cadena del anticuerpo. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal procedente-de una proteína no inmunoglobulina) .

Además de los genes para las cadenas del anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención llevan secuencias reguladoras que regulan la expresión de los genes para las cadenas del anticuerpo en una célula hospedera. El término "secuencia reguladora" se propone para incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo las señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes para las cadenas del anticuerpo.

Estas secuencias reguladoras están descritas, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academia Press, San Diego, CA (1990) . Los expertos en la técnica se darán cuenta que el diseño del vector de expresión, incluida la selección de las secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedera que va a ser transformada, el nivel al que se desee expresar la proteína, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión de células hospederas de mamífero incluyen, elementos virales que dirigen elevados niveles de-expresión de proteínas en células de mamífero, como pueden ser los promotores y/o potenciadores procedentes de citomegalovirus (C V) , virus de simio 40 (SV40) , adenovirus (por ejemplo el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP) ) y polioma. De otro modo', pueden utilizarse secuencias reguladoras no virales como el promotor ubiquitina o el promotor ß-globina.

Además de los genes para las cadenas de los anticuerpos y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden llevar otras secuencias, como las secuencias que regulan la replicación del vector en las células hospederas (por ejemplo los orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionados. El gen marcador seleccionado facilita la selección de las células hospederas en las que se ha introducido el vector (véase, por ejemplo, las Patente US Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todas de Axel y col.). Por ejemplo, comúnmente el gen marcador seleccionado confiere resistencia a medicamentos, como puede ser G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedera en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionados, preferidos, incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para utilizarlo en células hospederas dhfr- con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para la selección de G418) .

Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, el (los) vector (es) de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera se transfectan en una célula hospedera por las técnicas tradicionales. Las diferentes formas del término "transfección" se proponen para comprender una amplia variedad de técnicas comúnmente utilizadas para la introducción de DNA exógeno en una célula hospedera procariótica o eucariótica, por ejemplo la electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares. Aunque en teoría es posible expresar los anticuerpos de la invención en células hospederas procarióticas o eucarióticas , la expresión de los anticuerpos en células eucarióticas , y con mayor preferencia células hospederas de mamífero, es la más preferida porque estas células eucarióticas, y en particular las células de mamífero, con mucho mayor probabilidad en comparación con las . células procarióticas, se ensamblan y secretan un anticuerpo adecuadamente plegado y con actividad inmunológica .

La expresión procariótica de los genes del anticuerpo se ha reportado como ineficaz para la producción de elevados rendimientos del anticuerpo activo (Boss, M. A. y Word, C. R. (1985) Immunology Today 6: 12-13) .

Las células hospederas de mamífero preferidas para la expresión de los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen las células de Ovario de Hámster Chino (células CHO) (que incluyen células CHO dhfr- , descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc . Nati. Acad. Sci. USA 77: 4216-4220, que se utilizan con un marcador seleccionado DHFR, por ejemplo como está descrito en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Biol . 159.: 601-621), células de mieloma NSO, células COS y células SP2. En particular, para utilizarlo con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión del gen GS descrito en WO 87/04462, O 89/01036 y EP 338,841. Cuando los vectores de expresión recombinante que codifican los genes para anticuerpos se introducen en células hospederas de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospederas durante un tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospederas o, con mayor preferencia, la secreción del anticuerpo hacia el medio de cultivo en el que se hacen crecer las células hospederas. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo utilizando los métodos para la purificación de proteínas normalizados.

Uso de las secuencias parciales de anticuerpos para' expresar anticuerpos intactos Los anticuerpos interaccionan con antígenos blanco principalmente a través de residuos aminoácidos que se ubican en las seis regiones determinantes de la complementariedad (las CDR) de la cadena pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDR son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de la CDR. Debido a que las secuencias CDR son responsables de la mayor parte de las interacciones antígeno-anticuerpo, es posible expresar. anticuerpos recombinantes que mimeticen las propiedades de los anticuerpos específicos que ocurren en la naturaleza construyendo vectores de expresión que incluyen secuencias CD procedentes del anticuerpo específico que ocurre en la naturaleza injertadas sobre secuencias de entramado procedentes de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (véase, pro ejemplo Riechmann, L. y col. 1998, Nature 332: 323-327; Jones, P. y col., 1986, Nature 321: 522-525; y Queen, C. y col., 1989, Proc. Nati. Acad. See. E. U. A. 86: 100.29-10033). Estas secuencias del entramado pueden obtenerse de las bases de datos de DNA públicas que incluyen secuencias génicas de anticuerpos de la línea germinativa. Estas secuencias de la línea germinativa diferirán de las secuencias maduras de los genes para anticuerpos porque, no incluirán los genes variables completamente ensamblados, los cuales se forman por unión V(D)J durante la maduración de las células B. Las secuencias génicas de la línea germinativa también diferirán de las secuencias de un anticuerpo de repertorio secundario de alta afinidad en el individuo uniformemente a través de la región variable. Por ejemplo, las mutaciones somáticas son muy poco frecuentes en la porción amino terminal de la región del entramado. Por ejemplo, las mutaciones somáticas son relativamente poco frecuentes en la porción. amino terminal de la región de entramado 1 y en la porción carboxilo terminal de la región del entramado 4. Además, múltiples mutaciones somáticas no alteran de manera importante las propiedades de unión del anticuerpo. Por esta razón, no es necesario obtener toda la secuencia del DNA en un anticuerpo especifico para recrear un anticuerpo recombinante intacto que tenga propiedades de unión similares a las del anticuerpo original (véase PCT/US99/05535 presentada el 12 de marzo de 1999, la cual se incorpora en la presente como, referencia para todos los propósitos) . La secuencia parcial de la cadena pesada y ligera que abarca las regiones CDR por lo regular es suficiente para este propósito. La secuencia parcial se utiliza para determinar qué segmentos génicos variables y de bisagra de la línea germinativa contribuyeron a los genes variables del anticuerpo recombinado. La secuencia de la línea germinativa entonces se utiliza para llenar porciones faltantes de las regiones variables. Las secuencias líder o guía de la cadena pesada y ligera se disocian durante la maduración de la proteína y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Por esta razón es necesario utilizar la secuencia líder correspondiente de la línea germinativa para construcciones de expresión. Para adicionar secuencias faltantes, las secuencias de cDNA clonadas pueden combinarse con oligonucleótidos sintéticos mediante ligación o amplificación por PCR. De otro 'modo, la región variable completa puede sintetizarse como una serie de oligonucleótidos cortos, traslapantes y combinarse por amplificación por PCR para crear un clon de la región variable completamente sintético. Este proceso tiene ciertas ventajas como la eliminación o inclusión de sitios de restricción particulares o la optimización de , codones específicos. Las secuencias de nucleótidos de los transcritos para la cadena pesada y ligera procedentes de un hibridoma se utilizan para diseñar una serie traslapante de oligonucleótidos sintéticos para crear secuencias V sintéticas con capacidades codificadoras de aminoácidos idénticas a las secuencias naturales. Las secuencias sintéticas para las cadenas pesada y kappa pueden diferir de las secuencias naturales en tres sentidos: las sartas de bases de nucleótidos repetidas sé interrumpen para facilitar la síntesis de oligonucleótidos y la amplificación PCR; se incorporan los sitios de inicio de la traducción óptimos de acuerdo con las reglas de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol . Chem. 266: 19867-19870); y se manipulan los sitios Hindi corriente arriba de los sitios de inicio de la traducción.

Para las regiones variables de la cadena pesada y ligera las secuencias de la hebra codificadora optimizada y no codificadora correspondiente se rompen en 30-50 nucleótidos aproximadamente en el punto medio del oligonucleótido no codificador -correspondiente. Así pues, para cada cadena los oligonucleótidos pueden ensamblarse en series bicatenarias traslapantes que abarquen los segmentos de 150-400 nucleótidos. Luego se utilizan los reservorios como plantillas o modelos para producir los productos de la amplificación de la PCR de 150-400 nucleótidos. Por lo regular, se romperá una sola serie de oligonucleótidos de la región variable en dos reservorios que se amplifican por separado para generar dos productos de la PCR traslapantes. Estos productos traslapantes luego se combinan por amplificación por PCR para formar la región variable completa. También puede desearse incluir un fragmento traslapante de la región constante de la cadena pesada o ligera (incluido el sitio Bbsl de la cadena ligera kappa, o el sitio Agel de la cadena pesada gama) en la amplificación por PCR para generar fragmentos que puedan ser fácilmente clonados en las construcciones de los vectores de expresión.

Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera reconstruidas entonces se combinan con las secuencias promotora clonada, de inicio de la traducción, de la región constante, 3' no ' traducida, de poliadenilación y de terminación de la transcripción para formar construcciones del vector de expresión. Las construcciones de expresión de la cadena pesada y ligera pueden combinarse en un solo vector, co- transfectado, transfectado en serie o transfectado por separado en las células hospederas que luego se fusionan para formar una célula hospedera que exprese ambas cadenas .

Los plásmidos que se utilizan en la construcción de los vectores de expresión para IgGK humana se describen a continuación. Los plásmidos fueron construidos para que las secuencias de cDNA para la cadena pesada V y ligera kappa V amplificadas por PCR puedan utilizarse para reconstruir minigenes para la cadena pesada y ligera completa. Estos plásmidos pueden utilizarse para expresar anticuerpos IgGiK ó IgG4K completamente humanos o quiméricos. Plásmidos semejantes pueden construirse para la expresión de otros isotipos de cadenas pesadas o para la expresión de anticuerpos que comprendan las cadenas ligeras lambda.

Asi pues, en otro aspecto de la invención, las características estructurales de un anticuerpo anti-CD30 humano de la invención, por ejemplo el 17G1, 2H9 ó 5F11, se utilizan para crear anticuerpos anti-CD30 humanos estructuralmente relacionados que conserven al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, como puede ser la unión a CD30. Más específicamente, una o más de las CDR de 17G1, 2H9 ó 5F11 pueden combinarse en forma recombinante con las regiones de entramado humano conocidas y las CDR para crear otros anticuerpos manipulados en forma recombinante, humanos, anti-CD30 de la invención.

Por consiguiente, en otra modalidad, la invención proporciona un método para preparar un anticuerpo anti-CD30, que consiste en: preparar un anticuerpo que contenga: (1) regiones de entramado de la cadena pesada humana y las CDR de la cadena pesada humana, en donde al menos una CDR de la cadena pesada humana comprende una secuencia de aminoácidos elegida de las secuencias de aminoácidos de las CDR mostradas en las Figuras 7, 9 u 11 (SEQ ID NOS: 16, 17, 18, 28, 29, 30, 40, 41 y 42); y (2) las regiones de entramado de la cadena ligera humana y las CDR de la cadena ligera humana, en donde al menos una de las CDR de. la cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos « seleccionada de las secuencias de aminoácidos de las CDR que se muestran en las Figuras 7, 10 ó 12 (SEQ ID NOS: 22, 23, 24, 34, 35, 36, 46, 47 y 48); en donde el anticuerpo conserva la capacidad para unirse a CD30. La habilidad del anticuerpo para unirse a CD30 puede determinarse utilizando los ensayos de unión normalizados, como los que se establecen en los ejemplos (por ejemplo un ELISA) .

Puesto que es bien sabido en la técnica que los dominios CDR3 de la cadena pesada y ligera del anticuerpo desempeñan una función particularmente importante en la especificidad/afinidad para la unión de un anticuerpo para un antigeno, los anticuerpos recombinantes de la invención preparados, como ya se mencionó, de preferencia contienen las CDR3 de la cadena pesada y ligera de 10 F8. Los anticuerpos además comprenden las CDR2 de 17G1, 2H9 ó 5F11. Los anticuerpos además comprenden las CDRl de 17G1, 2H9 ó 5F11. Los anticuerpos además pueden comprender cualquier combinación de las CDR.

Por consiguiente, en otra modalidad, la invención además proporciona los anticuerpos anti-CD30 que comprende: (1) las regiones del entramado de la cadena,: pesada humana, una región -CDRl de la cadena pesada humana, una región CDR2 de la cadena pesada humana y una región CDR3 de la cadena pesada humana, en donde la región CDR3 de la cadena pesada humana es la CDR3 de la cadena pesada de 17G1, 2H9 ó 5F11 como se muestra en las Figuras 7, 9 u 11 (SEQ ID NOS: 18, 30 ó 42); y (2) las regiones del entramado de la cadena ligera humana, una región CDRl de la cadena ligera humana, una región CDR2 de la cadena ligera humana y una región CDR3 de la cadena ligera humana, en donde la región CDR3 de la cadena, ligera humana es la CDR3 de la cadena ligera de 17G1, 2H9 ó 5F11 como se muestra en las Figuras 8, 10 ó 12 (SEQ ID NOS: 24, 36 ó 48), en donde el anticuerpo se une a CD30. El anticuerpo además puede comprender la CDR2 de la cadena pesada y/o la CDR2 de la cadena ligera de 17G1, 2H9 ó 5F11. El anticuerpo además puede comprender la CDRl de la cadena pesada y/o la CDRl de la cadena ligera de 17G1, 2H9 ó 5F11.

Las regiones CDRl, 2 y/o 3 de los anticuerpos manipulados descritos en lo anterior pueden comprender la(s) secuencia (s) de aminoácidos exacta (s) como las de 17G1, 2H9 ó 5F11 descritas en la presente. No obstante, el trabajador con conocimientos ordinarios en la técnica se dará cuenta que puede ser posible alguna. desviación de las secuencias CDR exactas de 17G1, 2H9 ó 5F11 conservando todavía la habilidad del anticuerpo para unirse eficazmente a CD30. Por consiguiente, en otra modalidad, el anticuerpo manipulado puede estar compuesto de una o más CDR que sea, por ejemplo, 95%, 98% ó 99.5% idénticas a una o más CDR de 17G1, 2H9 ó 5F11.

Además, o como alternativa, para la simple unión a CD30, los anticuerpos manipulados como los antes descritos pueden ser elegidos para que conserven otras propiedades funcionales de los anticuerpos de la invención, como pueden ser: (1) la unión a CD30 humano e inhibición del crecimiento de las células tumorales que expresan CD30? (2) la inhibición de la unión del ligando para CD30 humano que se une a CD30 humano; (3) la inducción de ADCC de las células tumorales que expresan CD30 en presencia de células efectoras; (4) la inducción de fagocitosis de las células de tumor que expresan CD30 en presencia de macrofagos; y/o (5) la unión de CD30 humano con una constante de equilibrio (Ka) de al menos 10 8M~ 1.

Caracterización de la unión de los anticuerpos monoclonales humanos a CD30 Para caracterizar la unión de los anticuerpos monoclonales humanos para CD30 de la invención, pueden probarse los sueros de ratones inmunizados, por ejemplo por ELISA. En un ejemplo común, pero no limitante (de un protocolo ELISA, las placas de microtitulación se recubren con CD30 purificado a una concentración de 0.25 Hg/mL en PBS, y luego se bloquean con 5% de albúmina de suero bovino en PBS. Las diluciones del plasma procedente de ratones inmunizados con CD30 se adicionan a cada pozo y se incuban durante 1-2 horas a 37 °C. Las placas se lavan con PBS/Tween y luego se incuban con un reactivo policlonal especifico del Fe de IgG antihumana de cabra conjugado con fosfatasa alcalina durante una hora a 37°C. Después del lavado, las placas se revelan con sustrato NPP (1 mg/mL) y se analizan a una DO de 405-650. De preferencia, los ratones que mostraron títulos más altos se utilizarán para las fusiones.

También es posible utilizar un ensayo ELISA como el antes descrito para detectar hibridomas que muestren reactividad positiva con el inmunógeno CD30. Los hibridomas que se unen con elevada avidez a CD30 serán subclonados y además caracterizados. Puede elegirse un clon de cada hibridoma que conserve la reactividad de las células precursoras (por ELISA) para preparar un banco de células en 5-10 viales almacenados a -140°C y para purificación del anticuerpo.

Para purificar los anticuerpos anti-CD30 humanos, los hibridomas elegidos pueden hacerse crecer en matraces de centrífuga, de dos litros para la purificación de los anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes pueden filtrarse y concentrarse antes de la cromatografía por afinidad con sepharose proteína A (Pharmacia, Piscataway, NJ) . La IgG eluida puede comprobarse por electroforesis en gel y cromatografía de líquidos de elevada resolución para garantizar la pureza. Pueden intercambiarse las' soluciones amortiguadoras en PBS, y puede determinarse la concentración por D02so utilizando coeficiente de extinción 1.43. Los anticuerpos monoclonales pueden ser tomados en alícuotas y almacenados a -80 °C.

Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-CD30 humanos, elegidos, se unen a epítopes únicos, cada anticuerpo puede ser biotinilado utilizando los reactivos disponibles en el comercio (Pierce, Rockford, IL) . Es posible efectuar estudios de competición utilizando los anticuerpos monoclonales no etiquetados y anticuerpos monoclonales biotinilados utilizando las placas ELISA recubiertas con CD30 como ya se describió. Puede detectarse la unión de MAb biotinilado con una sonda de estreptavidina-fosfatasa alcalina.

Para determinar el isotipo de los anticuerpos purificados, pueden realizarse los ensayos ELISA de los isotipos. Por ejemplo, los pozos de las placas de microtitulación pueden ser recubiertos con 10 µg/mL de Ig anti-humana durante la noche a 4°C. Después de bloquear con 5% de BSA, las placas reaccionan con 10 µg/mL de anticuerpos monoclonales o los controles purificados de los isotipos, a temperatura ambiente durante 2 horas. Después se somete a reacción los pozos con sondas conjugadas con fosfatasa alcalina, específicas de IgGl humana ó IgM humana. Las placas se desarrollan o revelan y se analizan como ya se describió.

Para demostrar la unión de los anticuerpos monoclonales a las células vivas que expresan CD30 puede utilizarse citometría de flujo. En un ejemplo común (pero no limitante) de un protocolo de citometría de flujo, las líneas de células que expresan CD30 (crecidas en condiciones de crecimiento normales) se mezclan con diversas concentraciones de los anticuerpos monoclonales en PBS con un contenido de 0.1% de BSA y 20% de suero de ratón, y se incuban a 37°C durante una hora. Después de lavar, las células reaccionan con anticuerpo IgG antihumano etiquetado con fluoresceína en las mismas condiciones que la tinción del anticuerpo primario. Las muestras pueden analizarse por. el instrumento FACScan utilizando las propiedades de dispersión de luz y lateral sobre las células individuales. Un ensayo alternativo utilizando microscopía de fluorescencia puede utilizarse además de (o en lugar de) el ensayo de citometría de flujo. Las células pueden ser teñidas exactamente como ya se describió y examinadas por microscopía de fluorescencia. Este método permite la visualización de células individuales, pero puede tener sensibilidad disminuida dependiendo de la densidad del antígeno.

Además se puede probar la reactividad de las IgG humanas anti-CD30 con el antígeno CD30 mediante el análisis Western blot . Por ejemplo, los extractos de células procedentes de células que expresan CD30 pueden prepararse y someterse a electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS) . Después de la electroforesis los antígenos separados serán transferidos a membranas de nitrocelulosa bloqueadas con suero de ratón al 20% y como sondas los anticuerpos monoclonales que van a ser probados. La unión de IgG humana puede detectarse utilizando la fosfatasa alcalina anti-IgG humana y revelarse con tabletas de sustrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co . , St . Louis, O) .

Actividades fagocíticas y de muerte celular de los anticuerpos monoclonales humanos para CD30 Además de unirse específicamente a CD30, los anticuerpos monoclonales humanos anti-CD30 pueden probarse para su habilidad para mediar fagocitosis y la muerte de células que expresan CD30. Las pruebas de la actividad de los anticuerpos monoclonales in vi tro proporcionará un tamizaje inicial antes de probar los modelos in vivo. En resumen, las células polimorfonucleares (PM ) , u otras células, efectoras, procedentes de donadores sanos pueden purificarse por la centrifugación por densidad Fycoll Hypaque seguido por lisis de los eritrocitos contaminantes. Las PMN lavadas pueden ser suspendidas en RMPI suplementado con suero bovino fetal inactivado con calor, a 10%, y mezclados con células etiquetadas con 51Cr que expresen CD30, en diferentes proporciones de las células efectoras a las células tumorales (células efectoras: células tumorales) . Las IgG anti-CD30 humanas, purificadas entonces pueden adicionarse en diversas concentraciones. La IgG humana. irrelevante puede utilizarse como control negativo. Los ensayos pueden llevarse a cabo durante 4-18 horas a 37°C. Las muestras pueden ensayarse para citólisis midiendo la liberación de 51Cr en el sobrenadante del cultivo. El anticuerpo monoclonal anti-CD30 también puede probarse en combinaciones entre sí para determinar si se favorece la citólisis con múltiples anticuerpos monoclonales.

Los anticuerpos monoclonales humanos que se unen a CD30 también pueden ser probados en un modelo in vivo (por ejemplo en ratones) para determinar su eficacia al mediar fagocitosis y la muerte de células que expresan CD30, por ejemplo las células tumorales. Estos anticuerpos pueden ser seleccionados, por ejemplo, basándose en los siguientes criterios, los cuales no se pretende que sean exclusivos:. 1.) que se unan a las células vivas que expresan CD30; 2.) elevada afinidad de unión para CD30; 3.) que se unan a un epítope único sobre CD30 (para eliminar la posibilidad que los anticuerpos monoclonales con actividades complementarias, cuando se utilizan en combinación, compitan para unirse al mismo epítope) ; 4.) opsonización de células que expresan CD30; 5.) mediación de la inhibición del crecimiento, fagocitosis y/o muerte de células que expresan CD30 en presencia de células efectoras humanas.

Los anticuerpos monoclonales humanos preferidos de la invención cumplen uno o más, y de preferencia todos, estos criterios. En una modalidad particular, los anticuerpos monoclonales humanos se utilizan en combinación, por ejemplo, como una composición farmacéutica que contenga dos o más anticuerpos monoclonales anti-CD30 o fragmentos de éstos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-CD30 humanos que tengan diferentes actividades, pero complementarias, pueden combinarse en una terapia individual para obtener un efecto terapéutico o diagnóstico deseado. Un ejemplo de esto sería una composición que contenga un anticuerpo monoclonal humano anti-CD30 que medie la muerte altamente eficaz de las células blanco en presencia de células efectoras, en combinación con otro anticuerpo monoclonal anti-CD30 humano que inhiba el crecimiento de células que expresen CD30.

II . Producción de animales transgénicos no humanos que generan los anticuerpos monoclonales humanos anti-CD30 En todavía otro aspecto, la invención proporciona los animales transgénicos y transcromosómicos no humanos,.: como pueden ser los ratones transgénicos o transcromosómicos, que son capaces de expresar anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a CD30. En una modalidad específica, la invención proporciona un 'ratón transgénico o transcromosómico que tiene un genoma que comprende un transgen de la cadena pesada humana de modo que el ratón produce los anticuerpos humanos anti-CD30 cuando se inmuniza con el antígeno CD30 y/o células que expresan CD30. El transgen de la cadena pesada humana puede integrarse en el DNA cromosómico del ratón, como es el caso para los ratones transgénicos, por ejemplo HuMAb, como se describe con detalle en la presente y se ejemplifica. De otro modo, el transgen para la cadena pesada humana puede mantenerse en forma extracromosómica, como es el caso para los ratones transcromosómicos (por ejemplo KM) como está descrito en O 02/43478. Animales transgénicos y transcromosómicos como estos pueden producir múltiples isotipos de los anticuerpos monoclonales humanos para CD30 (por ejemplo IgG, IgA y/o IgE) al ser sometidos a recombinación V-D-J e intercambio (switching) del isotipo. El intercambio del isotipo puede ocurrir, por ejemplo por el intercambio tradicional o no tradicional de los isotipos.

El diseño de un animal transgénico o transcromosómico no humano que responde a la estimulación de antígenos extraños con un repertorio de anticuerpos heterólogos, necesita que los transgenes para la inmunoglobulina heteróloga contenidos dentro del animal transgénico funcionen correctamente a lo largo de la vía del desarrollo de las células B. Esto incluye, por ejemplo, el switching o intercambio de isotipos del transgen para la cadena pesada heteróloga. Por consiguiente, los transgenes se construyen para producir el intercambio de los isotipos y uno o más de lo siguiente de los anticuerpos: (1) expresión de alto nivel y específica del tipo de célula, (2) reordenamíento del gen funcional, (3) activación de y respuesta a la exclusión alélica, (4) expresión de un repertorio primario suficiente, (5) transducción de señales, (6) hipermutación somática y (7) dominación del locüs del anticuerpo del transgen durante la respuesta inmunitaria.

No es necesario que se cumplan todos los criterios antes mencionados. Por ejemplo, en aquellas modalidades en donde los loci de inmunoglobulina endógena del animal transgénico se rompen funcionalmente , el transgen no necesita activar la exclusión alélica. Además, en aquellas modalidades en donde el transgen consiste en un gen de inmunoglobulina para la cadena pesada y/o ligera funcionalmente reordenada, es innecesario el segundo criterio del reordenamiento del gel funcional, al menos para este transgen que ya está reordenado. Para antecedentes sobre inmunología molecular, véase Fundamental Immunology, 2a edición (1989) , Paul William E. , ed. Raven Press, N. Y.

En algunas modalidades, los animales transgénicos o transcromosómicos no humanos que se utilizan para generar los anticuerpos monoclonales humanos de la invención contienen transgenes para la cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina heteróloga, reordenados, no reordenados o una combinación de reordenados y no reordenados en la línea germinativa del animal transgénico. Cada uno de los transgenes de la cadena pesada comprende al menos un gen CH. Además, el transgen para la cadena pesada puede contener secuencias funcionales para el intercambio de isotipos, las cuales son capaces de soportar el intercambio de isotipos de un transgen heterólogo que codifique para los genes CH múltiples en las células B del animal transgénico. Estas secuencias "switch" pueden ser aquellas que ocurren en forma natural en el locus de la inmunoglobulina de la línea germinativa procedente de especies que sirven como la fuente de los genes CH del transgen, o secuencias "switch" como estas pueden proceder de aquellas que ocurren en las especies que van a recibir la construcción del transgen (el animal transgénico) . Por ejemplo, una construcción de transgen humano que se utiliza para producir un ratón transgénico puede producir una mayor frecuencia de sucesos de intercambio de isotipos si incorpora secuencias "switch" similares a aquellas que ocurren en la naturaleza en el locus de la cadena pesada de ratón, en vista de que presumiblemente las secuencias switc de ratón se optimizan para funcionar con el sistema enzimático switch recombinasa de ratón, mientras que no es así con las secuencias switch humanas. Las secuencias switch pueden ser aisladas y clonadas por los métodos de clonación tradicionales, o pueden sintetizarse de novo a partir de oligonucleótidos sintéticos traslapantes diseñados con base en la información de secuencias publicada en relación con las secuencias de la región switch de la inmunoglobulina (Mills y col., Nucí. Acids . Res. 15: 7305-7316 (1991); Sideras y col . , Intl. Immunol. 1: 631-642 (1989)) . Para cada uno de los animales transgénicos antes mencionados, los transgenes de inmunoglobulina para la cadena pesada y ligera heterólogos, funcionalmente reordenados se encuentran en una fracción significativa de las células B del animal transgénico (al menos 10%) .

Los transgenes que se utilizan para generar los animales transgénicos no humanos utilizados para producir los anticuerpo monoclonales humanos de la invención incluyen un transgen para la cadena pesada que comprende DNA que codifica al menos un segmento de gen variable, un segmento de gen de diversidad, un segmento de gen de unión y al menos un segmento de gen de la región constante. El transgen para la cadena ligera de la inmunoglobulina consiste en DNA que codifica para al menos un segmento de gen variable, un segmento de gen de unión y al menos un segmento del gen de la región constante. Los segmentos génicos que codifican para los segmentos de los genes para la cadena ligera y pesada son heterólogos para el animal transgénico en cuanto a que proceden de, o corresponden con, -el DNA que codifica para los segmentos génicos para la cadena pesada y ligera de la inmunoglobulina procedentes de una especie que no consiste en el animal transgénico no humano. En un aspecto de la invención, el transgen se construye de modo que los segmentos génicos individuales estén no reordenados, es decir, no reordenados para codificar una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina funcional. Estos transgenes no reordenados soportan la recombinación de los segmentos génicos V, D y J (reordenamiento funcional) y de preferencia soportan la incorporación de todo o una parte de un segmento génico de la región D en la cadena pesada de la inmunoglobulina reordenada resultante dentro del animal transgénico cuando se expone al antígeno CD30.

En otra modalidad, los transgenes consisten en un "minilocus" no reordenado. Estos transgenes por lo regular contienen una parte sustancial de los segmentos C, D y J así como una subserie de los segmentos génicos V. En construcciones de transgenes como estas las diferentes secuencias reguladoras, por ejemplo, los promotores, potenciadores , regiones de intercambio de clase, secuencias donadoras del empalme y secuencias aceptoras del empalme para el procesamiento del R A, señales de recombinación y similares, comprenden las secuencias correspondientes procedentes del DNA heterólogo. Secuencias reguladoras como estas pueden incorporarse en el transgen de la misma especie - o una especie relacionada del animal no humano utilizado en la invención. Por ejemplo, los segmentos génicos de inmunoglobulina humana pueden combinarse en un transgen con una secuencia potenciadora de inmunoglobulina de roedor para utilizarlo en un ratón transgénico. De otro modo, las secuencias reguladoras sintéticas pueden incorporarse en el transgen, en donde secuencias reguladoras sintéticas como estas no son homologas para una secuencia de DNA funcional que sea conocida como presente en forma natural en los genomas de los mamíferos. Las secuencias reguladoras sintéticas están diseñadas de acuerdo con las reglas del consenso como pueden ser, por ejemplo, aquellas que especifican las secuencias permitidas de un sitio aceptor del empalme o un motivo promotor/potenciador . Por ejemplo un minilocus consiste en una porción de un locus de inmunoglobulina genómica que tiene al menos una deleción interna (es decir, no en un término de la porción) de una porción de DNA no esencial (por ejemplo una secuencia intervinente , intrón o parte de este) en comparación con el locus de la Ig de la línea germinativa que se encuentra en > la naturaleza.

En una modalidad preferida de la invención, el animal transgénico o transcromosómico que se utiliza para crear anticuerpos humanos para CD30 contiene al menos un, por lo regular 2-10, y en ocasiones 25-50 o más copias del transgen descrito en el Ejemplo 12 de WO 98/24884 (por ejemplo pHCl ó pHC2) reproducido con un animal que contenga una sola copia de un transgen de cadena ligera descrito en los Ejemplos 5, 6, 8 ó 14 de WO 98/24884, y la progenie reproducida con el animal JH delecionado descrito en el Ejemplo 10 de WO 98/24884. Los animales se reproducen para homocigosidad para cada uno de éstos tres rasgos. Animales como estos tienen el siguiente genotipo: una sola copia (por serie haploide de cromosomas) de un minilocus no reordenado de la cadena pesada humana (descrito en el Ejemplo 12 de WO 98/24884) , una sola copia (por serie haploide de cromosomas) de una construcción reordenada de la cadena ligera K humana (descrita en el Ejemplo 14 de WO 98/24884) y una deleción en cada locus de cadena pesada de ratón endógeno que elimina todos los segmentos JH funcionales (descrito en el Ejemplo 10 de WO 98/24884) . Estos animales se reproducen con ratones que sean homocigotos para la deleción de los segmentos JH (Ejemplo 10 de WO 98/24884) para producir progenie que sea homocigoto para la deleción JH y hemicigoto para las construcciones de la cadena pesada y ligera humana. Los animales resultantes se inyectan con antígenos y se utilizan para la producción de anticuerpos monoclonales contra estos antígenos .

Las células B aisladas de un animal como este son monoespecíficas con respecto a las cadenas pesada y ligera humanas porque contienen solo una copia de cada gen. Además, serán monoespecíficas con respecto a las cadenas pesadas humanas o de ratón porque las copias del gen endógeno de las cadenas pesadas de ratón son monof ncionales en virtud de la deleción que abarca la región JH introducida como está descrito en los Ejemplos 9 y 12 de WO 98/24884. Más aún, una fracción considerable de las células B será monoespecífica con respecto a las cadenas ligeras humanas o de ratón porque la expresión de la única copia del gen de la cadena ligera ? humana, reordenado excluirá en forma alélica e isotópica el reordenamiento de los genes de la cadena ? y lambda de ratón endógenos en una fracción importante de células B.

Los animales no humanos transgénicos y transcromosómicos preferidos, por ejemplo, los ratones, mostrarán producción de inmunoglobulina con un repertorio significativo, en teoría muy similar al de un ratón nativo. Así pues, por ejemplo, en modalidades donde los genes de Ig endógenos han sido inactivados, los niveles totales de inmunoglobulina abarcarán desde aproximadamente 0.1 hasta 10 mg/mL de suero, de preferencia 0.5 a 5 mg/mL, en teoría al menos aproximadamente 1.0 mg/mL. Cuando un transgen capaz de efectuar un intercambio a IgG a partir de IgM se ha introducido en el ratón transgénico, la relación en el ratón adulto de IgG a IgM en el suero de preferencia será aproximadamente 10:1. La relación IgG a IgM será mucho menor en el ratón inmaduro. En general, más de aproximadamente 10%, de preferencia de 40 a 80% de las células B de bazo y ganglio linfático expresará exclusivamente la proteína IgG humana.

En teoría, el repertorio se aproximará al mostrado en un ratón nativo, por lo regular al menos aproximadamente 10% tan alto, de preferencia de 25 a 50% o más. En general, se producirá al menos aproximadamente 1000 diferentes inmunoglobulinas (en teoría IgG) , de preferencia de 10 4 a 106 , dependiendo principalmente del número de las diferentes regiones V, J y D introducidas en el genoma del ratón. Estas inmunoglobulinas por lo regular reconocerán aproximadamente un medio o más de las proteínas altamente antigénicas, por ejemplo, la proteína A del estafilococo. Por lo regular, las inmunoglobulinas presentarán una afinidad (KD) para los antígenos preseleccionados de por debajo de 10 M, como puede ser de por debajo de 10"8 , 10"9 M ó 10"10 M o incluso menor. En algunas modalidades puede preferirse para crear animales no humanos con repertorios predeterminados limitar la selección de los genes V representados en la respuesta del anticuerpo a un tipo de antígeno predeterminado . Un transgen de cadena pesada que tenga un repertorio predeterminado puede contener, por ejemplo, genes VH humanos que preferentemente se utilicen en respuestas de anticuerpos para el tipo de antígeno predeterminado en humanos. De otro modo, algunos genes VH pueden ser excluidos de un repertorio definido por diversas razones (por ejemplo tener una probabilidad baja de codificar regiones V de alta afinidad para el antígeno predeterminado; tener una baja tendencia a sufrir mutación somática e intensificar la afinidad; o son inmunogénicos para ciertos humanos). Así pues, antes del rearreglo de un transgen que contenga diferentes segmentos de gen de cadena pesada o ligera, estos segmentos génicos pueden identificarse fácilmente, por ejemplo, por hibridación o secuenciación del DNA, conforme procede de una especie de organismo diferente del animal transgénico.

Los animales transgénicos y transcromosómicos no humanos, por ejemplo, los ratones, como ya se describió, pueden ser inmunizados, por ejemplo, con una preparación purificada o recombinante del antígeno CD30 y/o células que expresen CD30. Los animales entonces producirán células B que sufran intercambio de clase a través de recombinación "switch" intratransgenes (cis-switching) y expresen inmunoglobulinas reactivas con CD30. Las inmunoglobulinas pueden ser anticuerpos humanos (también conocidos como "anticuerpos de secuencia humana"), en donde los polipéptidos de la cadena pesada y ligera son codificados por secuencias de transgenes humanos, que pueden incluir secuencias obtenidas por mutación somática y uniones recombinatorias de la región V, así como secuencias codificadas de la línea germinativa; estos anticuerpos humanos pueden ser mencionados como substancialmente idénticos a una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento de gen VL ó VH humano y un segmento JL humano ó DH y JH, aunque pueden estar presentes otras secuencias no de la línea germinativa como resultado de mutación somática y uniones por recombinación diferencial V-J y V-D-J. Las regiones variables de cada cadena de anticuerpo por lo regular son al menos 80% codificadas por segmentos de gen V, J y, en el caso de las cadenas pesadas, D, de la línea germinativa humana; con frecuencia al menos 85% de las regiones variables son codificadas por secuencias de la línea germinativa humana presentes en el transgen; con frecuencia 90 ó 95% o más de las secuencias de la región variable son codificadas por secuencias de la línea germinativa humana presentes en el transgen. No obstante, dado que las secuencias no de la línea germinativa se introducen por mutación somática y unión VJ y VDJ, los anticuerpos de la secuencia humana con frecuencia tendrán algunas secuencias de la región variable (y con menos frecuencia secuencias de la región constante) que no sean codificadas por los segmentos génicos V, D ó J humanos como se encuentran en el (los) transgen(es) humano (s) en la línea germinativa de los ratones. Por lo regular, estas secuencias no de la línea germinativa (o porciones de nucleótidos individuales) formarán agrupamientos en o cerca de las CDR, o en regiones donde se sabe que se agrupan mutaciones somáticas.

Los anticuerpos humanos que se unen al antígeno predeterminado pueden resultar del intercambio de isotipos, de modo que se producen anticuerpos humanos que > comprenden una cadena de secuencia ? humana (como puede ser ??, y2a, y2b ó ?3) y una cadena ligera de secuencia humana (como puede ser kappa) . Estos anticuerpos humanos intercambiados en el isotipo suelen contener una o más mutaciones somáticas, por lo regular en la región variable y con frecuencia en o dentro de aproximadamente 10 residuos de una CDR) como resultado de la maduración de la afinidad y selección de las células B por el antígeno, en particular después de un desafío secundario del antígeno (o subsiguiente) . Estos anticuerpos humanos de elevada afinidad pueden tener afinidades de unión (KD) por debajo de 10"7 M, como puede ser por debajo de 10"8 M, 10"9 M ó 10"10 M, o incluso menor.

Otro aspecto de la invención consiste en células B procedentes de animales transgénicos o transcromosómicos no humanos como se describe en la presente. Las células B pueden utilizarse para crear hibridomás que expresen los anticuerpos monoclonales humanos que se Unan con elevada afinidad (por ejemplo menor que 10"7 M) a CD30 humano. Así pues, en otra modalidad, la invención proporciona un hibridoma que produce un anticuerpo humano con una afinidad (KD) por debajo de 10 M, como puede ser de por debajo de 10"8 M, 10"9 ó 10~10 M, o incluso menor cuando se determina por la tecnología de la resonancia del plasmon [sic] superficial (SPR) en un instrumento BIACORE 3000 utilizando el CD30 humano recombinante como el analito y el anticuerpo como ligando para la unión a CD30 humano, en donde el anticuerpo consiste en: Una cadena ligera de secuencia humana compuesta de: (1) una región variable de la cadena ligera que tiene una secuencia de polipéptidos que es considerablemente idéntica a una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento génico VL humano y un segmento JL humano, y (2) una región constante de la cadena ligera que tiene una secuencia de polipéptidos considerablemente idéntica a una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento génico CL humano; y Una cadena pesada de secuencia humana compuesta de: (1) una región variable de la cadena pesada que tiene una secuencia de polipéptidos considerablemente idéntica a una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento génico VH humano, como una opción una región D, y un segmento JH humano, y (2) una región constante que -tiene.-una secuencia de polipéptidos considerablemente idéntica a una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento génico GH humano.

El desarrollo de los anticuerpos monoclonales humanos de alta afinidad contra CD30 puede facilitarse por un método para extender el repertorio de los segmentos génicos de la región variable humanos en un animal transgénico no humano que tenga un genoma que contenga un transgen de inmunoglobulina humana integrada, el método consiste en introducir en el genoma un transgen del gen V que comprenda segmentos génicos de la región V que no estén presentes en el transgen de inmunoglobulina humana integrado. Con frecuencia, el transgen de la región V es un cromosoma artificial de levadura que contiene una porción de un arreglo de segmentos génicos VH ó vL (VK) humanos, como puede encontrarse en la naturaleza en un genoma humano o como pueden empalmarse entre sí por separado por métodos recombinantes , que pueden incluir segmentos génicos V fuera de orden u omitidos. Con frecuencia al menos 5 o más segmentos génicos V funcionales están contenidos en el YAC. En esta variación es posible crear un animal transgénico producido por el método de expansión del repertorio V, en donde el animal exprese una cadena de inmunoglobulina que contenga una secuencia de la región variable codificada por un segmento génico de la región V presente en él transgen de la región V y una región C codificada sobre el transgen de Ig humana. Por medio del método de expansión del repertorio V, pueden crearse animales transgénicos que tengan al menos cinco genes V distintos; como los animales que contienen al menos aproximadamente 24 genes V ó más. Algunos segmentos génicos V pueden ser no funcionales (por ejemplo los seudogenes y similares) ; estos segmentos pueden ser retenidos o pueden ser delecionados a elección por los métodos recombinantes disponibles para el trabajador experto, si lo desea.

Una vez que se ha manipulado la línea germinativa del ratón para contener un YAC funcional que tenga un repertorio de segmentos V extendidos, considerablemente no presentes en el transgen de Ig humana que contenga los segmentos génicos J y C, el rasgo puede ser propagado y reproducido en otros fondos genéticos, incluidos los fondos donde el YAC funcional que tiene un repertorio de segmentos V extendido se reproduce en una línea germinativa de animal no humano que tenga un transgen de Ig humana diferente. Múltiples YAC funcionales que tengan un repertorio de segmentos. V extendido pueden ser reproducidos en una línea germinativa para funcionar con un transgen de Ig humana (o múltiples transgenes de Ig humana) . Aunque se mencionan en la presente como transgenes YAC, estos transgenes cuando se integran en el genoma pueden carecer considerablemente de secuencias de levadura, como pueden ser las secuencias necesarias para la replicación autónoma en levadura; estas secuencias pueden opcionalmente ser eliminadas por manipulación genética (por ejemplo digestión por restricción y electroforesis en gel de campo pulsado u otro método conveniente) después de que la replicación en levadura ya no sea necesaria (es decir, antes de la introducción en una célula ES de ratón o procigoto de ratón) . Los métodos de propagación del rasgo de la expresión de inmunoglobulina de secuencia humana incluyen la reproducción de un animal transgénico que tenga el (los) transgen (es) de Ig humana y, como una opción, también que tenga un YAC funcional que tenga un repertorio de segmentos V extendido. Los segmentos génicos VH y VL pueden estar presentes en la YAC. El animal transgénico puede ser reproducido en cualquier fondo deseado por el practicante, incluidos los fondos que albergan otros transgenes humanos, incluidos los transgenes de Ig humana y/o transgenes que codifican para otras proteínas de linfocitos humanos. La invención también proporciona una inmunoglobulina de secuencia humana con alta afinidad producida por un ratón transgénico que tiene un transgen YAC de repertorio de la región V extendida. Aunque lo anterior describe una modalidad preferida del - animal transgénico que se utiliza para producir los anticuerpos monoclonales humanos de la invención, se contemplan otras modalidades que han sido clasificadas en cuatro categorías: I. Animales transgénicos que contienen un transgen de inmunoglobulina pesada [sic] , no reordenado y ligera reordenado ; II. Animales transgénicos que contienen un transgen de inmunoglobulina pesada [sic] , no reordenado, y ligera, no reordenado; III. Animales transgénicos que contienen un transgen de inmunoglobulina pesada [sic] , reordenado y ligera, no reordenado; y IV. Animales transgénicos que contienen un transgen de inmunoglobulina pesada [sic] , reordenado, y ligera, reordenado.

De éstas categorías del animal transgénico, el orden de preferencia es como sigue II > I > III > IV, donde los genes endógenos -de la cadena ligera (o al menos el gen K) ha sido noqueado por recombinación homologa (u otro método) y I > II > III > IV, donde los genes endógenos de la cadena ligera han sido noqueados y deben ser dominados por exclusión alélica.

III. Moléculas biespecíficas/multiespecíficas que se unen a CD30 En todavía otra modalidad de la invención, los anticuerpos monoclonales humanos para CD30, o partés que se unan al antígeno de éstos, pueden ser derivados o ligados a otra molécula funcional, por ejemplo otro péptido o proteína (por ejemplo un fragmento Fab' ) para crear una molécula biespecífica o multiespecífica que se una a múltiples sitios de unión o epítopes blanco. Por ejemplo, un anticuerpo o porción que se une al antígeno de la invención puede ligarse funcionalmente (por ejemplo por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro modo) a una o más moléculas de unión diferentes, como pueden ser otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión.

Por consiguiente, la presente invención incluye moléculas biespecíficas y multiespecíficas que contienen al menos una primera especificidad de unión para CD30 y una segunda especificidad de unión para un segundo epítope blanco. En una modalidad particular de la invención, el segundo epítope blanco es un receptor Fe, por ejemplo el Fc.RI humano (CD64) o un receptor Fea humano (CD89) . Por tanto, la invención incluye moléculas biespecíficas y multiespecíficas capaces de unirse a Fc.R, FcaR ó Fc.R que expresan células efectoras (por ejemplo los monocitos, macrofagos o células polimorfonucleares (las PM ) ) , y a células blanco que expresen CD30. Estas moléculas biespecíficas y multiespecíficas dirigen a las células que expresan CD30 a las células efectoras y, al igual que los anticuerpos monoclonales humanos de la invención, activan las actividades de la célula efectora mediadas por el receptor Fe, como puede ser la fagocitosis de las células que expresan CD30, la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) , la liberación de citocinas ó la producción del anión superóxido.

Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención además pueden incluir una tercera especificidad de unión, además de una especificidad de unión anti-Fc y una especificidad de unión anti-CD30. En una modalidad, la tercera especificidad de unión es una parte anti-factor de estimulación (EF) , por ejemplo una molécula que se una a una proteína superficial involucrada en la actividad citotóxica y por este medio aumente la respuesta inmunitaria contra la célula blanco. La "parte anti-factor de estimulación" puede ser un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo funcional o un ligando que se una a una molécula determinada, por ejemplo un antígeno o un receptor, y por este medio conduzca a una estimulación del efecto de los determinantes de unión para el receptor Fe o el antígeno de la célula blanco. La "parte anti-factor de estimulación" puede unirse a un receptor Fe o un antígeno de célula blanco. De otro modo, la parte anti-factor de estimulación puede unirse a una entidad que sea diferente de la entidad a la cual se une la primera y segunda especificidades de unión. Por ejemplo, la parte anti-factor de estimulación puede unirse a una célula T citotóxica (por ejemplo a través de CD2 , CD3 , CD8, CD28, CD4 , CD40, ICAM-1 u otra célula inmunitaria que de origen a una respuesta inmunitaria aumentada contra la célula blanco) .

En una modalidad, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención compenden como una especificidad de unión al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo que incluye, por ejemplo, un Fab, Fab' , F(ab')2, Fv ó un Fv monocatenario . El anticuerpo también puede ser un dímero de la cadena ligera o la cadena pesada, o algún fragmento mínimo de éste como puede ser un Fv o una construcción monocatenaria como se describe en Ladner y col., Patente US No. 4,946,778, presentada el 7 de agosto de 1990, el contenido de la cual se incorpora expresamente como referencia.

En una modalidad, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención comprenden una especificidad de unión para un Fc.R ó un FcaR presente en la superficie de una célula efectora, y una segunda especificidad de unión para un antígeno de célula blanco, por ejemplo CD30.

En una modalidad, la especificidad de unión para un receptor Fe se proporciona mediante un anticuerpo monoclonal humano, la unión del cual no se bloquea por la inmunoglobulina G humana (IgG) . Cuando se utiliza en la presente, el término "receptor.de IgG" se refiere a alguno de los 8 genes de la cadena . en el cromosoma 1. Estos genes codifican un total de 12 isoformas del receptor transmembrana o solubles que se agrupan en tres clases de receptores Fe.: Fc.RI (CD64) , Fc.RII (CD32) y Fe.RUI (CD16) . En una modalidad preferida, el receptor Fe. es un Fc.RI de alta afinidad, humano. El Fc.RI humano es una molécula de 72 kDa que muestra elevada- afinidad para la IgG monomérica (108 - 109?_1) .

La producción y caracterización de éstos anticuerpos monoclonales preferidos están descritas por Fanger y col. en la solicitud del PCT WO 88/00052 y en la Patente US-No. 4,954,617, las enseñanzas de las cuales se incorporan por completo como referencia en la presente. Estos anticuerpos se unen a un epítope de Fc.RI, Fc.RII ó Fe.RUI en un sitio distinto del sitio de unión a Fe. del receptor y, de este modo, su unión no se bloque considerab emente por las concentraciones fisiológicas de la IgG. Los anticuerpos anti-Fc.RI específicos, útiles en esta invención, son MAb 22, MAb 32, Ab44, MAb 62 y MAb 197; El hibridoma que produce MAb 32 está a la disposición de American Type Culture Collection, ATCC No. de acceso HB9469. El Ab 22 anti-Fc.RI, los fragmentos F(ab')2 de MAb 22 y pueden obtenerse de Medarex Inc.

(Annandale, N. J.). En otras modalidades, el anticuerpo receptor anti-Fc.R es una forma humanizada de anticuerpo monoclonal 22 (H22) . La producción y caracterización del anticuerpo H22 se describen en Graciano, R. F. y col. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 y PCT/US93/10384. La línea de células que producen el anticuerpo H22 se depositó en la American Type Culture Collection el 4 de noviembre de 1992 con la denominación HA022CL1 y tiene el-número de acceso CRL 11177.

En todavía otras modalidades preferidas, la especificidad de unión para ün receptor Fe se proporciona mediante un anticuerpo que se une a un receptor IgA humano, por ejemplo, un receptor Fc-alfa (FcccRI (CD89) ) , la unión del cual preferentemente no se bloquea por inmunoglobulina A humana (IgA) . El término "receptor IgA" se propone para incluir el producto génico de un gen a (FcccRI) ubicado en el cromosoma 19. Este gen es conocido por codificar diversas isoformas transmembrana de otro modo empalmadas de 55 a 110 kDa. El FcaRI (CD89) se expresa de modo constitutivo sobre monocitos/macrofagos , granulocitos eosinófilos y neutrófilos, pero no sobre poblaciones de células no efectoras. El FcaRI tiene afinidad media (.5 x 107 IVf1 ) para la IgAl y la IgA2, la cual se aumenta tras la exposición a citocinas como G-CSF ó GM-CSF (Morton, H. C. y col., Critcial Reviews in Immunology 16: 423-440) . Cuatro anticuerpos monoclonales específicos de FcaRI, identificados como A3 , A59, A62 y A77, que se unen a FcaRI fuera del dominio de unión del ligando de IgA, han sido descritos (Monteiro, R. C. y col., 1992, J. I munol. 148: 1764) .

FcaRI y FcyRI son receptores activadores preferidos para utilizarlos en la invención porque: (1) se expresan principalmente en células efectoras inmunitarias , por ejemplo los monocitos, los PM , macrofagos y células dendríticas ; (2) se expresan en concentraciones altas (por ejemplo 5,000-100,000 por célula); (3) son., mediadores de las actividades citotóxicas (por ejemplo ADCC, fagocitosis) ; (4) median la presentación de antígeno estimulada de los antígenos, incluidos los auto-antígenos, dirigida a estos.

En otras modalidades, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención además comprenden una especificidad de unión que reconoce, por ejemplo, se une a, un antígeno celular blanco, .por ejemplo CD30. En una modalidad preferida, la especificidad de unión se proporciona mediante un anticuerpo monoclonal humano de la presente invención.

Un "anticuerpo específico de las células efectoras" cuando se utiliza en la presente se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo funcional que se une al receptor Fe de las células efectoras. Los anticuerpos preferidos para utilizarlos en la presente invención se unen al receptor Fe de las células efectoras en un sitio en el que no está unida la inmunoglobulina endógena.

Cuando se utiliza en la presente, el término "célula efectora" se refiere a una célula inmunitaria que está involucrada en la fase efectora de una respuesta inmunitaria, contrario a las fases cognitiva y de activación de una respuesta inmunitaria. Las células inmunitarias ejemplares incluyen una célula de origen mieloide o linfoide, como puede ser los linfocitos (por ejemplo células B y células T que incluyen las células T citolíticas (las CTL) ) , células asesinas, células asesinas naturales, macrofagos, monocitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares , granulocitos , mastocitos y basófilos. Algunas células efectoras expresan receptores Fe específicos y realizan funciones inmunitarias específicas. En las modalidades preferidas, una célula efectora es capaz de. inducir citotoxicidad mediada por células, dependiente de anticuerpos (ADCC) , por ejemplo, un neutrófilo capaz de inducir ADCC. Por ejemplo, los monocitos, macrofagos, que expresan FcR están involucrados en la muerte específica de células blanco y' presentar antígenos a otros . componentes del sistema inmunitario, o la unió a células que presentan antígenos. En otras modalidades, una célula efectora puede fagocitar un antígeno blanco, una célula blanco o microorganismo. La expresión de un FcR específico sobre una célula efectora puede regularse mediante factores humorales como las citocinas. Por ejemplo, se ha encontrado que la expresión de Fc.Rl es regulada en forma ascendente por el interferón gama (IFN-.) . Esta expresión intensificada aumenta, la actividad citotóxica de las células portadoras de Fc.Rl contra blancos. Una célula efectora puede fagocitar o lisar un antígeno blanco o una célula blanco.

"Célula blanco" debe significar cualquier célula no deseada en un individuo (por ejemplo un humano o animal) que puede ser elegida por una composición (por ejemplo un anticuerpo monoclonal humano, una molécula biespecífica o una multiespec'í fica) de la invención. En modalidades preferidas, la célula blanco es una célula que expresa o sobreexpresa CD30. Las células que expresan CD30 por lo regular incluyen células de tumor, como células de vejiga, mama, colon, riñon, ovario, próstata, renales, células escamosas, células de pulmón (no pequeñas) y células de tumor de cabeza y cuello. Otras células blanco incluyen células fibroblastos sinoviales.

Aunque se prefieren anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos que pueden emplearse en las moléculas biespecíficas o multiespecificas de la invención son anticuerpos monoclonales murinos, quiméricos y humanizados.

Los anticuerpos monoclonales quiméricos de ratón-humano (es decir, anticuerpos quiméricos) pueden-, producirse mediante las técnicas del DNA recombinante conocidas. Por ejemplo, un gen que codifica la región constante Fe de una molécula de anticuerpo monoclonal murino (o de otra especia) se digiere con enzimas de restricción para separar la región que codifica el Fe murino, y se sustituye una porción equivalente de un gen que codifica una región constante Fe humana. (Véase Robinson y col., Publicación de la Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira, y col., Solicitud de Patente Europea 184,187; Taniguchi, M. , Solicitud de Patenté Europea 171,496; Morrison y col., Solicitud de Patente Europea 173,4994; Neuberger y col., Solicitud Internacional WO 86/01533; Cabilly y col. Patente US No/ 4,816,567; Cabilly y col., Solicitud de Patente Europea 125,023; Better y col., (1988 Science 240: 1041-1043); Liu y col. (1987) PNAS 84: 3439-3443; Liu y col. 1987, J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun y col. (1987) PNAS 84: 214-218; Nishimura y col., 1987, Canc . Res. 47: 999-1005; Word y col. (1985) Nature 314: 446-449; y Shaw y col. 1988, J. Nati. Cáncer Inst . 80: 1553-1559) .

Además el anticuerpo quimérico puede ser humanizado sustituyendo las secuencias de la región variable Fv que no están directamente involucradas en la unión al antígeno con secuencias equivalentes procedentes de las regiones variables Fv humanas. Revisiones generales de los anticuerpos quiméricos humanizados se proporcionan por Morrison, S. L. , 1985, Science 229: 1202-1207 y por Oi y col.,' 1986, BioTechniques 4:214. Estos métodos incluyen el aislamiento, manipulación y expresión de las secuencias del ácido nucleico que codifican toda o parte de las regiones variables Fv de inmunoglobulina procedentes de al menos la cadena pesada o ligera. Las fuentes del ácido nucleico son bien conocidas para los expertos en la técnica y, por ejemplo, pueden obtenerse a partir de 7E3 , un hibridoma productor del anticuerpo anti-GPIIbIIIa. El DNA recombinante que codifica el anticuerpo quimérico, o fragmento de este, entonces puede ser clonado en un vector de expresión adecuado. Los anticuerpos humanizados convenientes pueden de otro modo producirse por sustitución CDR, Patente US 5,225,539; Jones y col. 1986 Nature 321: 552-525; Verhoeyan y col. 1988 Science 239: 1534; y Beidler y col. 1988 J. Immunol . 141: 4053-4060.

Todas las CDR de un anticuerpo humano específico pueden ser sustituidas con al menos una porción de una CDR no humana o solo algunas de las CDR pueden ser sustituidas con CDR no humanas. Solo es necesario sustituir el número de CDR necesario para la unión del anticuerpo humanizado al receptor Fe.

Un anticuerpo puede ser humanizado por cualquier método que sea capaz de sustituir al menos una porción de una CDR de un anticuerpo humano con una CDR procedente de un anticuerpo no humano. Winter describe un método que puede utilizarse para preparar los anticuerpos humanizados de la presente invención (Solicitud de Patente del Reino Unido GB 2188638A, presentada el 26 de marzo de 1987) , el contenido de la cual se incorpora expresamente como referencia. Las CDR humanas pueden ser sustituidas con CDR no humanas utilizando mutagénesis dirigida al sitio oligonucleótido como se describe en la Solicitud Internacional WO 94/10332 titulada Anticuerpos humanizados para receptores Fe para i'nmunoglobulina G sobre fagocitos mononucleares humanos.

También dentro del alcance de la invención están los anticuerpos quiméricos y humanizados en los cuales se han sustituido, delecionado o _ adicionado aminoácidos;, específicos. En particular, los anticuerpos humanizados preferidos tienen sustituciones de aminoácidos en la región de la estructura, como puede ser para mejorar la unión al ántígeno. Por ejemplo, en un anticuerpo humanizado que tenga CDR de ratón, los aminoácidos ubicados en la región de la estructura humana pueden ser sustituidos con los aminoácidos ubicados en las posiciones correspondientes en el anticuerpo de ratón. Estas sustituciones son conocidas para mejorar la unión de los anticuerpos humanizados al antígeno en algunos casos. Los anticuerpos en los cuales se ha adicionado, delecionado o sustituido los aminoácidos se conocen en la presente como anticuerpos modificados, o anticuerpos alterados .

El término anticuerpo modificado también se propone para incluir anticuerpos, como los anticuerpos monoclonales , anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados, que hayan sido modificados por ejemplo por deleción, adición o sustitución de ¦ porciones del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser modificado mediante la deleción de la región constante y sustituyéndola con una región constante para aumentar la vida media, por ejemplo la vida media en suero, la estabilidad o afinidad del anticuerpo. Cualquier modificación está dentro del alcance de la invención siempre que la -molécula biespecífica y multiespecífica tenga al menos una región de unión al antígeno específica para un FcyR y active al menos una función efectora.

Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la presente invención pueden prepararse utilizando técnicas químicas (por ejemplo véase D. M. Kranz y col. (1981) Proc. Nati. Acad. Sci USA 78: 5807), técnicas de "polidoma" (Véase la Patente US 4,474,893 para Reading) o las técnicas del DNA recombinante .

En particular, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la presente invención pueden prepararse conjugando las especificidades de unión constituyentes, por ejemplo, las especificidades de unión anti-FcR y anti CD30, utilizando los métodos conocidos en la técnica y descritos en los ejemplos que se proporcionan en la presente. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica y multiespecífica puede generarse por separado y luego conjugarse entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, para la conjugación covalente puede utilizarse una variedad de agentes de acoplamiento o entrecruzamiento . Los ejemplos de los agentes para el. entrecruzamiento incluyen la proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-dioacetato (SATA), 5,5'-ditiobis (ácido 2 -nitrobenzóico) (DTNB) , o-fenilendimaleimida (oPDM) , N-succinimidil-3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) y sulfosuccinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohexan-l-carboxilato (sulfa-S CC) (véase, por ejemplo Karpovsky y col. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, A y col. (1985) Proc . Nati. Acad. Sci . USA 82: 8648) . Otros métodos incluyen aquellos descritos por Paulus (Behring Inst. Mitt. (1985) No. 78, 118-132); Brennan y col. (Science (1985) 229: 81-83), y Glennie y col. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfa-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) .

Cuando las especificidades de unión son anticuerpos (por ejemplo dos anticuerpos humanizados) , estos pueden ser conjugados por unión sulfhidrilo de las regiones bisagra C terminales de las dos cadenas pesadas . En una modalidad particularmente preferida, la región bisagra se modifica para contener un número impar de residuos sulfhidrilo, de preferencia uno, antes de la conjugación.

De otro modo, ambas especificidades de unión pueden ser codificadas en el mismo vector y expresadas y ensambladas en la misma célula hospedera. Este método es particularmente útil donde la molécula biespecífica y multiespecífica es una proteína de fusión MAb x MAb, MAb x Fab, Fab x F(ab')2 ° ligando x Fab. Una molécula biespecífica y multiespecífica de la invención, por ejemplo una molécula biespecífica puede ser una molécula monocatenaria, como puede ser un anticuerpo biespecífico monocatenario, una molécula biespecífica monocatenaria que contenga un anticuerpo monocatenario y una determinante de unión, o una molécula biespecífica monocatenaria que comprenda dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas también pueden ser moléculas monocatenarias o pueden comprender al menos dos moléculas monocatenarias. Los métodos para preparar moléculas bi y multiespecíficas están descritos por ejemplo en la Patente US No. 5,260,203; Patente US No. 5,455,030; Patente US No .4 , 881 , 175 ; Patente US No.5, 132,405; Patente US No .5 , 091 , 513 ; Patente US No.5, 476, 786; Patente US No .5 , 013 , 653 ; Patente US No.5, 258, 498; 5,482,858.

La unión de las moléculas biespecíficas y multiespecíficas a sus blancos específicos puede confirmarse mediante el ensayo inmunoabsorbente de enzimas ligadas (ELISA) , un radioinmunoensayo (RIA) , análisis FACS, un bioensayo (por ejemplo inhibición del crecimiento) o un ensayo Western blot . Cada uno de éstos ensayos por lo regular detecta la presencia de complejos proteína-anticuerpo de interés específico empleando un reactivo etiquetado (por ejemplo un anticuerpo) específico para el complejo que interese. Por ejemplo, pueden detectarse complejos FcR-anticuerpo utilizando, por ejemplo, un anticuerpo de enzimas ligadas o fragmento de anticuerpo que reconozca y se una específicamente a los complejos anticuerpo-FcR . De otro modo, pueden detectarse los complejos utilizando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos . Por ejemplo, el anticuerpo puede ser etiquetado en forma radioactiva y utilizarse en un radioinmunoensayo (RIA) (véase, por ejempo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays , Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Marzo 1986, la cual se incorpora como referencia en la presente) . El isótopo radioactivo puede detectarse por medios tales como el uso de un contador . o un contador de centelleo o por auto-radiografía.

IV. Inmunoconjugados En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-CD30 humano, o un fragmento de este, conjugado a una porción terapéutica, como puede ser una citotoxina, un fármaco (por ejemplo un inmunosupresor) o una radiotoxina. Conjugados como estos se conocen en la presente como "inmunoconjugados" . Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se conocen como "inmunotoxinas" . Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para (por ejemplo matar) células. Los ejemplos incluyen taxol, citochalasina b, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, l-dehidrotestosterona, glucocorticoides , procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina, y análogos u homólogos de éstos.

Los agentes terapéuticos convenientes para formar inmunoconjugados de la invención incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5- fluorouracilo dacarbazina) , agentes de alquilación (por ejemplo mecloretamina, tioepa clorambucil melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol , estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino) , antraciclinas (por ejemplo daunorubicina (antes, daunomicina) y doxorubicina) , antibióticos (como dactinomicina (antes actinomicina) , bleomicina, mitramicina y antramicina. (AMC) ) , y agentes anti-mitóticos (por ejemplo vincristina y vinblastina) . En una modalidad preferida, el agente terapéutico es un agente citotóxico o un agente radiotóxico. En otra modalidad, el agente terapéutico es un inmunosupresor. En todavía otra modalidad, el agente terapéutico es GM-CSF. En una modalidad preferida, el agente terapéutico es doxorubicina (adriamicina) , cisplatino sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucil, ciclofosfamida hidroxiurea ó ricin A.

Los anticuerpos de la presente invención también pueden conjugarse a una radiotoxina, por ejemplo yodo radioactivo, para crear radiofarmacéuticos citotóxicos para tratar una alteración relacionada con CD30, como puede ser un cáncer. Los conjugados de anticuerpos de la invención pueden utilizarse para modificar una respuesta biológica determinada, y la porción medicinal no debe considerarse como limitada a los agentes terapéuticos químicos tradicionales. Por ejemplo, la porción medicinal puede ser una proteína o polipéptido que posea una actividad biológica deseada. Estas proteínas pueden incluir, por ejemplo una toxina enzimáticaménte activa, o fragmento activo de esta, como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas ó toxina diftérica; una proteína como el factor de necrosis tumoral o interferón ?; o modificadores de la respuesta biológica como puede ser, por ejemplo, linfocinas, interleucina- 1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrofagos ("GM-CSF"), el factor estimulador de colonias de granulocitos ("G-CSF") u otros factores de crecimiento.

Las técnicas para conjugar porciones terapéuticas como estas a los anticuerpos son bien conocidas, por ejemplo, Arnon y col., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy" , en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld y col., (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y col., "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a edición), Robinson y col. (eds.), pp. 623-53 .(Marcel Deckker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carries Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review" , en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y col. (eds.), pp . 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin y col. (eds.), pp . 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe y col. "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. , 62: 119-58 (1982).

V. Composiciones farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contenga uno o una combinación de anticuerpos monoclonales humanos, o la(s) porción (es) que se une al antígeno de éstos, de la presente invención, formulados junto con un portador aceptable para uso farmacéutico. En una modalidad preferida, las composiciones contienen una combinación de múltiples anticuerpos humanos aislados (por ejemplo dos o más) o porciones de unión al antígéno de éstos de la invención. De preferencia, cada uno de los anticuerpos o porciones de unión al antígeno de éstos de la composición se unen a un epítope distinto, preelegido de CD30.

Las composiciones f rmacéuticas de la invención también pueden administrarse en una terapia en combinación, es decir, combinados con otros agentes. Por ejemplo, la terapia en combinación puede incluir una composición de la presente invención con al menos un agente anti- inflamatorio o al menos un agente inmunosupresor . Estos agentes terapéuticos consisten, entre otros, en los fármacos anti- inflamatorios esteroides y no esteroides (NSAIDS) , por ejemplo aspirina y otros salicilatos como ibuprofeno (Motrin, Advil) , naproxeno (Naprosyn) , sulindaco (Clinoril) , diclofenaco (Voltaren) , piroxicam (Feldene) , ketoprofeno (Orudis) , diflunisal (Dolobid) , nabumetona (Relafen) , etodolaco (Lodine) , oxaprozina (Daypro) , indometacina (Indocin) y aspirina en dosis elevadas.

Cuando se utiliza en la presente, "portador aceptable para uso farmacéutico" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antimicrobianos y antimicóticos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, que sean compatibles en el medio fisiológico. De preferencia, el portador es conveniente para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo por inyección o infusión) . Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir', el anticuerpo, la molécula biespecífica o multiespecíf ca, pueden estar recubiertos en un material para proteger al compuesto de la acción de ácidos u otros estados naturales que pueden inactivar el compuesto.

Una "sal aceptable para uso farmacéutico" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto precursor y no confiere ninguno de los efectos toxicológicos no deseados (véase, por ejemplo Berge, S. M. y col. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19) . Los ejemplos de sales como estas incluyen las sales de adición acida y sales de adición básica. Las sales de adición ácida pueden ser aquellas derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos como el ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos como los ácidos mono- y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanóicos sustituidos con fenilo, ácidos hidroxialcanoicos , ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Las sales de adición básica incluyen aquellas obtenidas de metales alcalinotérreos como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas como ?,?' -dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

Una composición de la presente invención puede administrarse por una variedad de métodos conocidos en la técnica. El trabajador experto apreciará que la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Los compuestos activos pueden prepararse con portadores que protegerán al compuesto contra liberación rápida, como puede ser una formulación de liberación controlada, incluidos implantes, parches transdérmicos y sistemas dé suministro microencapsulados . Pueden utilizarse polímeros biodegradables , biocompatibles como etileno acetato de vinilo, polianhídridos , ácido poliglucólico, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de estas formulaciones están patentados o son generalmente conocidos para los trabajadores expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J . R. Robinson, ed. , Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Para administrar un compuesto de la invención por ciertas vías de administración, puede ser necesario recubrir el compuesto con, ó co-administrar el compuesto, con un material para prevenir su inactivación. Por ejemplo, el compuesto puede ser administrado a un individuo en un portador adecuado, por ejemplo en liposomas, o un diluyente. Los diluyentes aceptables para uso farmacéutico incluyen salina y soluciones amortiguadoras acuosas. Los liposomas incluyen emulsiones CGF agua en aceite en agua [sic] así como los liposomas tradicionales (Strejan y col. (1984) J. Neuroinmuno1. 7: 27) .

Los portadores aceptables para uso farmacéutico incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables. El uso de éstos medios y agentes para las sustancias farmacéuticas activas es conocido en la técnica. Salvo para los medios o agentes convencionales que sean incompatibles con el compuesto activo, el uso de éstos en las composiciones farmacéuticas de la invención está contemplado. Los compuestos activos suplementarios pueden también incorporarse en las composiciones.

Las composiciones terapéuticas por lo regular deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada conveniente para la concentración elevada del medicamento. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilen glicol y polietilen glicol líquido, y similares) y las mezclas convenientes de éstos. Puede mantenerse la fluidez" adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes . En muchos casos se , preferirá incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede obtenerse incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, las sales monoestearato y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo en la cantidad necesaria en un disolvente adecuado con uno o una combinación de los ingredientes antes mencionados, según sea necesario, seguido por la esterilización por microfiltración. En general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un- vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de los antes enumerados. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado en vacío y secado por congelación (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente filtrada estéril de este.

Los esquemas de dosificación se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, puede administrarse un solo bolo, pueden administrarse varias dosis divididas durante algún tiempo, o la dosis puede reducirse o aumentarse en proporción según sea necesario por la exigencia de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosis. La forma unitaria de dosificación cuando se utiliza en la presente se refiere a unidades físicamente diminutas adecuadas como dosis unitarias para los. individuos que van a ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico necesario. La especificación para las formas unitarias de dosificación de la invención están dictadas por y dependen directamente de: (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico específico que se desea lograr, y (b) las limitaciones propias en la técnica de la composición como un compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.

Los ejemplos de los antioxidantes farmacéuticos aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, como el ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina, propil galato, alfa-tocoferol , y similares; y (3) agentes quelantes metálicos como el ácido cítrico, el ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.

Para las composiciones terapéuticas, las formulaciones de la presente invención incluyen aquellas convenientes para administración oral, nasal, tópica (incluida la bucal y sublingual) , rectal, vaginal y/o parenteral . Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en formas de dosificación unitaria y pueden prepararse por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica de la farmacia. La cantidad del ingrediente activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificación individual variará dependiendo del individuo de que se trate y el modo de administración específico. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material portador para producir una forma de dosificación individual por lo regular será aquella cantidad de la composición que produzca el efecto terapéutico. En general, de un 100%, esta cantidad abarcará desde aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 99% del ingrediente activo, de preferencia desde aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 70%, con mayor preferencia desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 30%.

Las formulaciones de la presente invención que son convenientes para administración vaginal también incluyen pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en aerosol que contengan portadores como los ya conocidos en la técnica por ser adecuados. Las formas de dosificación para, la administración tópica y transdérmica de las composiciones de esta invención incluyen polvos, rocíos, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches é inhalantes. El compuesto activo puede mezclarse en condiciones estériles con un portador farmacéutico aceptable y con preservadores , amortiguadores o propelentes que puedan ser necesarios .

Las frases "administración parenteral" y "administrado por vía parenteral" cuando se utiliza en la presente significa los modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, por lo regular por inyección, e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial , intratecal, intracapsular, intraorbital , intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal , transtraqueal , subcutánea, subcuticula , intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal .

Los ejemplos de los portadores acuosos y no acuosos convenientes que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (como glicerol, propilen glicol, polietilen glicol, y similares) y las mezclas convenientes de éstos, aceites vegetales como el aceite de oliva, y esteres orgánicos inyectables como oleato de etilo. Es posible mantener la fluidez adecuada, por ejemplo mediante el uso de materiales de recubrimiento como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersiones y mediante el uso de agentes tensoactivos .

Estas composiciones también pueden contener adyuvantes como preservadores , agentes humectantes, agentes emulsificadores y agentes dispersantes. Puede asegurarse la prevención de la presencia de microorganismos por procedimientos de esterilización, supra, y por la inclusión de diferentes ' agentes antibacterianos y antimicóticos , por ejemplo parabenos , clorobutanol, ácido fenolsórbico y similares. También puede desearse incluir agentes isotónicos como azúcares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada- de la forma farmacéutica inyectable puede lograrse mediante la inclusión de agentes que retarden la absorción como monoestearato de aluminio y gelatina.

Cuando los compuestos de la presente invención se administran como farmacéuticos a humanos y animales, estos pueden darse solos o como composición farmacéutica que contenga, por ejemplo, 0.01 hasta 99.5% (con mayor preferencia, 0.1 a 90%) del ingrediente activo en combinación con un portador farmacéutico aceptable.

Sin importar la vía de administración elegida, los compuestos de la presente invención, que pueden utilizarse en una forma hidratada conveniente, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en las formas de dosificación aceptables para uso farmacéutico por los métodos tradicionales conocidos para los expertos en la técnica.

Los niveles reales de dosificación de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse para obtener una cantidad del ingrediente activo que sea eficaz para obtener la respuesta terapéutica deseada para un paciente específico, composición y modo de administración, sin que sea tóxica para el paciente. El nivel de dosificación elegido dependerá de una variedad de factores farmacocinéticas que incluyen la actividad de las composiciones específicas de la presente invención que se empleen, o el éster, la sal o la amida de éstas, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto específico que se emplee, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales que se utilicen en combinación con las composiciones específicas empleadas, la edad, sexo, peso, estado, salud general y antecedentes médicos del paciente que esté siendo tratado, y factores semejantes bien conocidos en la técnica médica.

El médico o veterinario que tiene las habilidades ordinarias en la técnica pede determinar fácilmente y prescribir la cantidad efectiva de la composición farmacéutica necesaria. Por ejemplo, el médico o veterinario puede comenzar las dosis de los compuestos de la invención empleados en la composición farmacéutica en niveles menores que los necesarios para obtener el efecto terapéutico deseado y aumentar progresivamente la dosis hasta obtiene el efecto deseado. En general, una dosis diaria conveniente de las composiciones de la invención será aquella cantidad del compuesto que sea la dosis más baja efectiva para producir un efecto terapéutico. Una dosis efectiva como esta por lo regular dependerá de los factores antes descritos. Se prefiere que la administración sea intravenosa, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea, de preferencia que se administre próxima al sitio del blanco. Si se desea, la dosis diaria efectiva de una composición terapéutica puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas por separado en intervalos adecuados a lo largo del día, como una opción, en formas de dosificación unitarias. Aunque es posible que un compuesto de la presente invención sea administrado solo, se prefiere administrar el compuesto como una formulación farmacéutica (composición) .

Las composiciones terapéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad preferida, una composición terapéutica de la invención puede administrarse con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, como los dispositivos descritos en las Patentes US Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413, 4,941,880; 4,790,824 ó 5,596,556. Los ejemplos de los implantes bien conocidos y módulos útiles en la presente invención incluyen: Patente US No. 4,487,603, la cual describe una bomba de microinfusión que puede implantarse para dosificar la medicación a una velocidad controlada; la Patente US No. 4,486,194, que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; la Patente US No. 4,447,233, que describe una bomba de infusión de medicamentos para suministrar medicamentos a una velocidad de infusión precisa; la Patente US No. 4,447,224 que describe un aparato de infusión de flujo variable que puede ser implantado para el suministro continuo de medicamentos; la Patente US No. 4,439,196 que describe un sistema de suministro de medicamentos osmótico que tiene compartimientos multicamerales , y la Patente US No. 4,475,196 que describe un sistema de suministro de medicamentos osmótico. Estas patentes se incorporan en la presente como referencia . Muchos otros implantes como estos, sistemas de suministro y módulos-son conocidos para el trabaj ador- experto en la técnica.

En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden formularse para garantizar distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye múltiples compuestos altamente hidrófilos. Para garantizar que los compuestos terapéuticos de la invención atraviesan la BBB (si se desea) , estos pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para los métodos de fabricación de lipósomas véase, por ejemplo, las Patentes US 4,522,811; 5,374,548; y 5,399,331. Los liposomas pueden contener una o más porciones que sean transportadas selectivamente hacia células u órganos específicos, mejorando así el suministro del medicamento dirigido (véase, por ejemplo, V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685) . Las porciones que reconocen el blanco ejemplares incluyen folato ó biotina (véase, por ejemplo, la Patente US 5,416,016 para Low y col.); los manósidos (Umezawa y col., (1989) Biochem. Biophys . Res. Común. 153: 1038); anticuerpos (P. G. Bloeman y col. (1995) FEBS Lett. 357-140; M. Owais y col. (19-95) Antiinicroj . Agents Chemother. 39: 180); el receptor de la proteína A surfactante (Briscoe y col. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134), diferentes especies de las cuales pueden comprender las. formulaciones de las invenciones, así como componentes de las moléculas inventadas; pl20 (Schreier y col. (1994) J". Biol. Che . 269: 9090); véase también K. Keinanén; . L. Luakkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123 ; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4: 273. En una modalidad de la invención, los compuestos terapéuticos de la invención se formulan en liposomas; en una modalidad preferida, los liposomas incluyen una porción reconocederoa del blanco. En una modalidad más preferida,. los compuestos terapéuticos en los liposomas se suministran por inyección en bolo a un sitio próximo al área deseada, por ejemplo el sitio de inflamación o infección, o el sitio de un tumor. La composición debe ser fluida hasta el grado que facilite el suministro por jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe conservarse contra acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos .

Una "dosis terapéutica eficaz" de preferencia inhibe ¦» el crecimiento de células o crecimiento de tumor por al menos aproximadamente 20%, con mayor preferencia al menos aproximadamente 40%, e incluso con mayor preferencia por al menos aproximadamente 60%, y todavía con mayor preferencia por al menos aproximadamente 80% en relación, con los individuos no tratados. La habilidad de un compuesto para inhibir cáncer puede evaluarse en un sistema de modelo animal en el que se pueda predecir la eficacia en tumores humanos. De otro modo, esta propiedad de una composición puede evaluarse examinando la habilidad del compuesto para inhibir, como la inhibición in vitro por ensayos conocidos para el practicante experto. Una cantidad terapéutica eficaz de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor, o de otro modo aminorar los síntomas en un individuo. Un trabajador con los conocimientos ordinarios en la técnica podrá determinar estas cantidades basándose en factores como la talla del individuo, la gravedad de los síntomas del individuo y la composición específica o vía de administración elegida.

La composición debe ser estéril y fluida hasta el grado en que la composición pueda ser suministrada por jeringa. Además de agua, el portador puede ser una solución salina amortiguada, isotónica, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol y polietilen glicol líquido, y similares) , y mezclas convenientes de éstos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo mediante el uso de recubrimiento como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de dispersión y por el uso de agentes tensoactivos . En muchos casos se prefiere incluir agentes isotónicos, por ejemplo azúcares, polialcoholes, como manitol o sorbitol, y cloruro de sodio en la composición. La absorción durante largo tiempo de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio o gelatina .

Cuando el compuesto activo se protege adecuadamente, como ya se describió, el compuesto puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un portador comestible que pueda ser asimilado.

VI . Usos y métodos de la invención Los anticuerpos humanos, las composiciones de los anticuerpos y los métodos de la presente invención tienen numerosas utilidades diagnósticas y terapéuticas in vi tro e in vivo, que incluyen el diagnóstico y tratamiento dealteraciones mediadas por CD30. Por ejemplo, estas: moléculas pueden administrarse a las células en cultivo, por ejemplo in vitro ó ex vivo, o a individuos humanos, por ejemplo in vivo, para tratar, prevenir y diagnosticar diversos trastornos. Cuando se utiliza en la presente, el., término "individuo" se propone para incluir animales humanos y no humanos. Los individuos preferidos incluyen pacientes humanos que tengan trastornos mediados por la actividad CD30.

Por ejemplo, los anticuerpos humanos, las composiciones de anticuerpos y los métodos de la presente invención pueden utilizarse para tratar a un individuo con una alteración tumorigénica, por ejemplo un trastorno caracterizado por la presencia de células tumorales que expresen CD30 que incluyen, por ejemplo, la enfermedad de Hodgkin, el linfoma anaplásico de células grandes (ALCL) , linfoma de células T del adulto (AÍL) , linfoma de células T tipo linfadenopatía angioinmunoblástica (AILD) , linfomas basados en la cavidad corporal asociados con el VIH, carcinomas embrionarios, carcinomas no diferenciados de la rinofaringe (por ejemplo tumor de Schmincke) , enfermedad de Castleman, Sarcoma de Kaposi u otros linfomas de células T o células B. Los anticuerpos humanos, las composiciones de los anticuerpos y los métodos de la presente invención pueden también utilizarse para tratar a un individuo con otros trastornos, por ejemplo las enfermedades autoinmunes que incluyen, por ejemplo, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica, dermatitis^ atópica, enfermedad de Graves, tiroiditis de Háshimoto, granulomatosis de Wegner, síndrome de Ornen, falla renal crónica, mononucleosis infecciosa aguda, enfermedades asociadas con el VIH y virus de herpes .

En una modalidad, los anticuerpos (por ejemplo los anticuerpos monoclonales humanos, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas y las composiciones) de la invención pueden utilizarse para detectar los niveles de CD30, o los niveles de las células que contienen CD30T sobre su superficie de membrana, cuyos niveles entonces pueden ser vinculados con ciertos síntomas de enfermedad. De otro modo, los anticuerpos pueden utilizarse para inhibir o bloquear la función CD30 que, a su vez, puede vincularse con la prevención o mejoría de ciertos síntomas de enfermedades, implicando por este medio a CD30 como mediador de la enfermedad. Esto se puede lograr poniendo en contacto una muestra y una muestra testigo con un anticuerpo anti-CD30 en las condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticue pos, y CD30. Cualquiera de los complejos formados entre el anticuerpo y CD30 se detectan y comparan en la muestra y el testigo.

En otra modalidad, los anticuerpos (por ejemplo los:-, anticuerpos humanos, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas y las composiciones) de la invención inicialmente pueden probarse para la actividad de unión asociada con el uso terapéutico o diagnóstico in vitro. Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden probarse el ELISA y los ensayos de citometría de flujo descritos en los Ejemplos siguientes. Además se puede valorar la actividad de éstas moléculas desatando al menos una actividad de la célula efectora mediada por efector, que incluye inhibir el crecimiento de y/o la muerte de células que expresen CD30. En los ejemplos siguientes se describen los protocolos para evaluar la ADCC mediada por células efectoras o fagocitosis.

Los anticuerpos (por ejemplo los anticuerpos humanos, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas y las composiciones) de la invención tienen utilidad adicional en terapia y diagnosis de enfermedades relacionadas con CD30. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas y los inmunoconjugados pueden utilizarse para indagar in vivo ó in vitro una o más de las siguientes actividades biológicas: para inhibir el crecimiento de y/o muerte de una célula que exprese CD30; para mediar fagocitosis ó ADCC de una célula que exprese.-CD30 en presencia de células efectoras humanas; para inhibir la efusión de CD30 soluble, para bloquear la unión del ligando de CD30 a CD30, para inhibir la expresión de IL-4 ó para mediar la expresión del fenotipo Th2, por ejemplo en dosis bajas.

En otra modalidad, los anticuerpos (por ejemplo los anticuerpos humanos, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas y las composiciones) de la presente invención son incapaces de inducir lisis de células mediadas por complemento y, por tanto, tienen menores efectos colaterales en la activación de afecciones activadas por complemento, como el acné. La causa principal del acné es una alteración en el patrón de queratinización dentro del folículo que produce sebo. Dado que los queratinocitos expresan CD30, la interferencia con los procesos de señalización de CD30 en la piel pueden alterar el crecimiento y la diferenciación de los queratinocitos en los folículos lo cual da origen a la formación de acné. Los estudios inmunofluorescentes» directos han demostrado que en lesiones de acné tempranas inflamadas y no inflamadas hay activación de las vías tradicionales y alternas del complemento.

En una modalidad particular, los anticuerpos (por: ejemplo, los anticuerpos humanos, moléculas biespecíficas y multiespecíficas y las composiciones) se utilizan in vivo para tratar, prevenir o diagnosticar una variedad de enfermedades relacionadas con CD30. Los ejemplos de las enfermedades relacionadas con CD30 incluyen, entre otras, cáncer, enfermedad de Hodgkin, linfoma de no Hodgkin, linfoma anaplásico de células grandes (ALCL) , linfoma de células T del adulto (ATL) , linfoma de células T tipo linfadenopatía angioinmunoblástica (AILD) , linfomas basados en la cavidad corporal asociados con VIH, carcinomas embrionarios, carcinomas no diferenciados de la rinofaringe (por ejemplo el tumor de Schmincke) , enfermedad de Castleman,. Sarcoma de Kaposi y otros linfornas de células T o células B. Otras enfermedades mediadas por CD30 incluyen entre otras enfermedades autoinmunes, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica, dermatitis atópica, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, granulomatosis de Wegner, síndrome de. Ornen, falla renal crónica, mononucleosis infecciosa aguda, enfermedades? asociadas con el VIH y virus de herpes.

En una modalidad particular, los anticuerpos (anticuerpos monoclonales humanos, moléculas biespecíficas y multiespecíficas y composiciones) de la. invención se utilizan para tratar o prevenir la enfermedad de Hodgkin (HD) , en vista de que los anticuerpos limitan la función que desempeña la CD30 en el progreso de HD y otras enfermedades tumorigénicas . La. enfermedad de Hodgkin es un tipo de linforna. Los linfornas son cánceres que se desarrollan en el sistema linfático, parte del sistema inmunitario corporal. Debido a que hay tejido linfático en muchas partes del cuerpo, la HD puede iniciar en casi cualquier parte del cuerpo. El cáncer puede dispersarse a casi cualquier órgano o tejido en el cuerpo, incluido el hígado, médula ósea (el tejido esponjoso dentro de los huesos largos del cuerpo que fabrican las células sanguíneas) y el bazo. La expresión elevada de CD30 en las células de Hodgkin y de Reed-Sternberg se ha reportado correlacionada con el diagnóstico diferencial de HD. Por consiguiente, los anticuerpos que inhiben CD30 de la invención pueden utilizarse para prevenir o bloquear los efectos de CD30 que conducen a HD y, de este modo, pueden utilizarse para prevenir o tratar esta enfermedad.

Los anticuerpos humanos (por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas) de la presente invención también pueden utilizarse para bloquear o inhibir otros efectos de CD30. Por ejemplo, se sabe que CD30 también se expresa regularmente por una variedad de subtipos de linfomas no Hodgkin. Por consiguiente, todavía otro uso para los anticuerpos de la invención. incluye la prevención o tratamiento de enfermedades que involucran los linfomas de no Hodgkin. Estas enfermedades incluyen el linfoma de Burkitt, linfomas anaplásico de células grandes (ALCL) , linfomas de células T cutáneas, linfomas de células disociadas, pequeñas, nodulares, linfomas linfocíticos, linfomas de células T periféricas,. linfornas de Lennert, linfornas inmunoblásticos , leucemia/linfornas de células T (ATLL) , leucemia de células T de adulto (T-ALL) y cánceres de linfornas foliculares enteroblásticos/centrocíticos (cb/cc).

En otra modalidad particular, los anticuerpos humanos (por ejemplo los anticuerpos monoclonales humanos, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas y las composiciones) de la presente invención pueden utilizarse para bloquear o inhibir todavía otros efectos, de CD30. Por ejemplo, también se sabe que la CD30 soluble es secretada o derramada regularmente desde la superficie de las células que expresan CD30. Se han reportado concentraciones elevadas de sCD30 en suero de pacientes con una. variedad de alteraciones tumorigénicas y autoinmunes . Por consiguiente, todavía otro uso para los anticuerpos de la invención incluye la prevención o tratamiento de enfermedades que involucran el bloqueo o inhibición de la efusión o secreción de sCD30. Enfermedades como estas incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica, dermatitis atópica, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, granulomatosis de wegner y síndrome de Ornen.

Las vías de administración convenientes para las composiciones de los anticuerpos (por ejemplo los anticuerpos monoclonales humanos, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas y los inmunoconjugados) de la invención in vivo e in vi tro son bien conocidas en la técnica y pueden ser seleccionadas por el trabajador con los conocimientos ordinarios. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpos pueden administrarse por inyección (por ejemplo intravenosa o subcutánea) . Las dosis convenientes de las moléculas utilizadas dependerán, de la edad y peso del individuo y la concentración y/o formulación de la composición de los anticuerpos.

Como ya se describió, los anticuerpos anti-CD30 humanos de la invención pueden ser co-administrados con. uno más agentes terapéuticos diferentes, por ejemplo, un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente inmunosupresor . El anticuerpo puede estar ligado a agente (como un inmunocomple o) o puede administrarse separado del agente. En este último caso (administración separada) , el anticuerpo puede administrarse antes, después o al mismo tiempo con el agente y puede se coadministrado con otras terapias conocidas, por ejemplo una terapia anti-cáncer, como radiación. Agentes terapéuticos como estos incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos como doxorubicina (adriamicina) , cisplatino sulfato de bleomicina, carmustina, clorambucil, y ciclofosfamida hidroxiurea que, por sí mismos, solo son eficaces en concentraciones tóxicas o subtóxicas para el paciente. El cisplatino se administra por vía intravenosa como una dosis de 100 mg/m una vez cada cuatro semanas, y adriamicina se administra por vía intravenosa como una dosis de 60-75 mg/m una vez cada 21 días. L co-administración de los anticuerpos anti-CD30 humanos, o fragmentos que se unen al antígeno de éstos,¡ de la presente invención con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes anti-cáncer que operan por mecanismos diferentes que producen un efecto citotóxico para las células de tumor humano. Co-administración como-ésta puéde solucionar problemas debidos a¾r desarrollo de-resistencia a los fármacos o un cambio en la antigenicidad de las células tumorales que las volvería no reactivas con el anticuerpo.

Las células efectoras específicas del blanco, por ejemplo, las células efectoras ligadas a las composiciones (por ejemplo los anticuerpos humanos, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas) de la invención también pueden utilizarse como agentes terapéuticos. Las células efectoras para buscar blancos pueden ser leucocitos humanos como macrofagos, neutrófilos o monocitos. Otras células incluyen eosinófilos, células asesinas naturales y otras células ¦ portadoras de receptores para IgG ó IgA. Si se desea, las células efectoras pueden obtenerse del individuo que va a ser tratado. Las células efectoras específicas del blanco pueden ser administradas como una suspensión de células en una suspensión fisiológica aceptable. El número de células administradas puede se en el orden de 108-109 pero variará dependiendo del propósito terapéutico. En general, la cantidad será suficiente para lograr la localización de la célula blanco, por ejemplo una célula de tumor que exprese CD30, y para efectuar muerte celular por, por ejemplo, fagocitosis. También pueden variar las vías de administración.

La terapia con células efectoras específicas del blanco puede realizarse junto con otras técnicas para la eliminación de las células elegidas. Por ejemplo, la terapia anti-tumor utilizando las composiciones (por ejemplo los anticuerpos humanos, las moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención y/o las células efectoras armadas con estas composiciones puede utilizarse junto con quimioterapia. Además, puede utilizarse inmunoterapia en combinación para dirigir dos poblaciones efectoras, citotóxicas, distintas hacia el rechazo de células de tumor. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD30 ligados a anti-Fc gama RI ó anti-CD3 [sic] pueden utilizarse junto con agentes de unión específicos del receptor de IgG ó IgA.

Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas también pueden utilizarse para modular las concentraciones de Fc.R ó FcaR sobre las células efectoras, como puede ser por coronación y eliminación de los receptores sobre la superficie celular. Para este propósito también pueden utilizarse mezclas de antireceptores Fe.

Las composiciones (por ejemplo los anticuerpos humanos, las ' moléculas biespecíficas y multiespecíficas y los inmunoconjugados) de la invención que tienen sitios de unión al complemento, como pueden ser porciones procedentes de IgGl, IgG2 ó IgG3 ó Ig que se unen al complemento, también pueden utilizarse en presencia del complemento. En una modalidad, el tratamiento ex vivo de una población de células que comprende células blanco con un agente de unión de la invención y las células efectoras adecuadas puede suplementarse mediante la adición de complemento o suero que contenga complemento.

La fagocitosis de células blanco recubiertas con ún agente de unión de la invención puede mejorarse mediante la unión de las proteínas del complemento. En otra modalidad las células blancos recubiertas con las composiciones (por ejemplo . los anticuerpos humanos, moléculas biespecíficas y multiespecíficas) de la invención también pueden ser lisadas por el complemento. En todavía otra modalidad, las composiciones de la invención no activan el complemento.

Las composiciones (por ejemplo los anticuerpos humanos, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas y los' inmunoconjugados) de la invención también pueden administrarse junto con -el complemento. Por consiguiente, dentro del alcance de la invención están las composiciones que comprenden los anticuerpos humanos, las moléculas biespecíficas ó multiespecíficas y suero o complemento. Estas composiciones son ventajosas en cuanto a que el complemento se ubica en proximidad cercana a los anticuerpos humanos, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas . Como alternativa, los anticuerpos humanos, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención y el complemento o suero pueden administrarse por separado.

También dentro del alcance de la presente invención están los kits que contienen las composiciones de anticuerpos de la invención (como los anticuerpos humanos e inmunoconjugados) e instrucciones para su uso. El kit además puede contener uno o más reactivos adicionales, como puede ser un reactivo inmunsupresor, un agente citotóxico o un agente radiotóxico, o uno o más anticuerpos humanos adicionales de la invención (por ejemplo un anticuerpo humano que tenga una actividad complementaria que se una a un epítope en el antígeno CD30 distinto del primer anticuerpo humano) .

Por consiguiente, los pacientes tratados con las composiciones de los anticuerpos de la invención además - pueden ser 'administrados- '"(antes, al mismo tiempo con, o-..H. después de la administración de un anticuerpo humano de la invención) con otro agente terapéutico, como puede ser un agente citotóxico o radiotóxico, que intensifique o aumente el efecto terapéutico de los anticuerpos humanos.

En otras modalidades, el individuo además puede ser tratado con un agente que module, por ejemplo que intensifique o inhiba, la expresión o actividad de los receptores Fe. ó Fea, por ejemplo, tratando al individuo con una .citocina. Las citocinas preferidas para administración durante el tratamiento con la molécula multiespecífica incluyen el factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) , el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrofagos (GM-CSF) , el interferón ? (IFN-?) y el factor de necrosis de tumor (TNF) .

En otra modalidad, el individuo además puede ser tratado con una preparación de linfocinas. Las células de cáncer que no expresan en gran medida CD30 pueden ser inducidas para hacerlo utilizando preparaciones de linfocina. Las preparaciones de linfocina pueden provocar una expresión más homogénea de CD30s entre células de tumor lo cual puede conducir a una terapia más eficaz. Las preparaciones de linfocinas convenientes para administración incluyen interferón gama, el factor de necrosis tumoral, y combinaciones de éstos. Estos pueden administrarse por vía intravenosa. Las dosis convenientes de linfocina son 10,000 a 1,000,000 de unidades/paciente .

Las composiciones (por ejemplo los anticuerpos humanos, las moléculas biespecíficas y multiespecíficas ) de la invención también pueden utilizarse par elegir células que expresan FcyR ó CD30, por ejemplo para etiquetar estas células. Para tal uso, el agente de unión puede ligarse a una molécula que pueda ser detectada. Así pues, la invención propone los métodos para localizar ex vivo ó in vi tro células que expresen receptores Fe, como pueden ser Fc.R ó CD30. La etiqueta detectable puede ser, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor de enzima.

En una modalidad particular, la invención proporciona los métodos para detectar la presencia del antígeno CD30 en una muestra, para medir la cantidad del antígeno CD30, que consiste en poner en contacto la muestra, y una muestra testigo, con un anticuerpo monoclonal humano, o una porción que se una al antígeno de éste, que se una específicamente a CD30, en las condiciones ' que- ·- permitañ" lá. formación de un cómalej-o'i entre el anticuerpo o porción de este y CD30. Luego se detecta la formación de un complejo, en donde una diferencia en la formación del complejo entre la muestra comparada con la muestra testigo es indicio de la presencia del ant geno CD30 en la muestra.

En otras modalidades, la invención proporciona los métodos para tratar un trastorno mediado por CD30 en un individuo, por ejemplo la enfermedad de Hodgkin, el linfoma de células T del adulto, mononucleosis infecciosa, y lupus eritematoso sistémico, mediante la administración al individuo de los anticuerpos humanos antes descritos. Estos anticuerpos y los derivados de éstos se utilizan para inhibir actividades inducidas por CD30 asociadas con algunas alteraciones, por ejemplo proliferación y diferenciación. Otras actividades inducidas por CD30 que pueden inhibirse mediante los anticuerpos de la presente invención incluyen la producción aumentada de sCD30, expresión aumentada de IL-4 y producción aumentada del fenotipo Th2. Al poner en contacto el anticuerpo con CD30 (por ejemplo mediante la administración del anticuerpo a un individuo) , se inhibe la actividad de CD30 para inducir tales actividades y, de este modo, se trata la alteración asociada. Los anticuerpos preferidos se unen a los epítopes que son específicos para CD30 y, de este modo, inhiben ventajosamente las actividades inducidas por CD30, pero no interfieren con la actividad de los antígenos de superficie estructuralmente relacionados como NGFR, CD27 y CD40.

Por consiguiente, en otra modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir alteraciones tumorigénicas mediadas por CD30 humana, por ejemplo, la enfermedad de Hodgkin, el linfoma de no Hodgkin, linfoma anaplásico de células grandes (ALCL) , el linfoma de células T del adulto (ATL) , linfoma de células T tipo linfadenopatía angioinmunoblástica (AILD) , linfomas basados en la cavidad corporal asociados con VIH, carcinomas embrionarios, carcinomas no diferenciados de la rinofaringe (por ejemplo el tumor de Schmincke) , la enfermedad de Castleman, Sarcoma de Kaposi y otros linfomas de células T ó células B. El método consiste en administrar a un individuo una composición de anticuerpo de la presente invención en una cantidad eficaz para, tratar o prevenir la alteración. La composición de anticuerpos puede administrarse sola o junto con otro agente terapéutico, como puede ser un agente citotóxico o radiotóxico que actúe junto con o en forma sinérgica con la composición de anticuerpos para" tratar o prevenir lá; enfermedad mediada por CD30. En una modalidad particularmente preferida, la presente invención proporciona un método para tratar la enfermedad de Hodgkin. En todavía otra modalidad particularmente preferida, la presente invención proporciona un método para tratar ALCL.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para tratar o prevenir una alteración autoinmune mediada por CD30 humana, por ejemplo artritis reumatoide, lupus eriteraatoso sistémico, esclerosis sistémica, dermatitis atópica, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimoto, granulomatosis de Wegner, síndrome de Ornen, falla renal crónica, mononúcleosis infecciosa aguda, enfermedades asociadas con VIH y virus de herpes. El método consiste en administrar a un individuo una composición de anticuerpos de la presente invención en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la alteración. La composición de anticuerpos puede administrarse sola o junto con otro agente terapéutico, como pueden ser un inmunosupresor que actúe junto con o en forma sinérgica con la composición del anticuerpo para tratar o prevenir la enfermedad mediada por CD30.

En todavía otra modalidad, los inmunoconjugados déla invención pueden utilizarse para dirigir los compuestos (por ejemplo los agentes terapéuticos, etiquetas, citotoxinas, radiotoxinas , inmunosupresores , etc.) a las células que tengan CD30 unida a su superficie (por ejemplo unida a la membrana o unida al receptor de CD30) ligando estos compuestos al anticuerpo. Así pues, la invención también proporciona los métodos para localizar ex vivo ó in vitro células que expresen CD30 y el receptor de CD30, como pueden ser las células de Hodgkin o células de Reed-Sternberg (por ejemplo con una etiqueta detectable, como puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un co- factor de la enzima) . De otro modo, los inmunoconjugados pueden utilizarse para matar células que tengan CD30 unida a su superficie (por ejemplo unida a la membrana o unida al receptor de CD30) orientando las citotoxinas o radiotoxinas a CD30.

La presente invención además se ilustra mediante los siguientes ejemplos que no deben ser considerados como limitantes .

EJEMPLOS Ejemplo 1 Creación de anticuerpos monoclonales humanos específicos de CD30 (HuMAbs) I . Creación de ratones trans énicos (con Cmu como blanco) para la producción de los anticuerpos monoclonales completamente humanos para CD30 Construcción de un vector orientador CMD El plásmido plCEmu contiene un fragmento EcoRl/Xhol del locus- de la cadena pesada de Ig murina, abarcando el gen mu, que se obtuvo a partir de una biblioteca genómica de fagos lambda Balb/C (Marcu y col. Cell 22: 187, 1980). Este fragmento genómico fue subclonado en los sitios Xhol/EcoRI del plásmido pICEMI9H (Marsh y col. Gene 32, 481-485, 1984) . Las secuencias de la cadena pesada incluidas en pICEmu se extiende corriente abajo del sitio EcoRI ubicado justo 3' del potenciador intrónico mu, hasta el sitio Xhol ubicado aproximadamente 1 kb corriente abajo del último exón transmembrana del gen mu; no obstante, una buena parte de la región repetida switch mu ha sido delecionada por el pasaje en E. coli. El vector orientador fue construido como sigue. Un fragmento HindIII/Sma de 1.3 kb fue escindido de pICEmu y subclonado en pBluescript digerido con HindIIl/Smal (Stratagene, La Jolla, CA) . Este fragmento pICEmu se extiende desde el sitio HindIII ubicado^aproximadamente 1 kb 5 ' de Cmul hasta el sitió Smal ubicado dentro de Cmul. El plásmido resultante fue digerido con Smal/Spel y se insertó el fragmento Smal/Xbal de aproximadamente 4 kb procedente de ' pICEmu, extendiéndose desde el sitio Smal en Cmul 3' para el sitio Xbal ubicado justo corriente abajo del último exón Cmu. El plásmido resultante, pTARl, fue linealizado en el sitio Smal, y se insertó un cásete de expresión neo. Este cásete consiste en el gen neo bajo el control transcripcional del promotor fosfoglicerato cinasa de ratón (pgk) (fragmento Xbal/Taql; Adra y col. (1987) Gene 60: 65-74) y que contiene el sitio de poliadenilación pgk (fragmento Pvull/HindIII ; Boer y col. 1990) Biochemical Genetics 28: 299-308) . Este cásete fue obtenido del plásmido p Jl (descrito por Tybulewicz y col. (1991) Cell 65: 1153-1163) desde el cual fue escindido el cásete neo como un fragmento EcoRI/HindIII y subclonado en pGEM-7Zf (+) digerido con EcoRI/HindIII para crear pGEM-7 (KJl) . El cásete neo fue escindido de pGEM-7 (KJl) por digestión con EcoRI/SalI, los extremos se hicieron romos y se subclonó en el sitio Smal del plásmido pTARl, en la orientación contraria de las secuencias Cmu genómicas . El plásmido resultante fue linealizado con Notl, y se insertó un cásete de timidina cinasa (tk) de virus de herpes simple para permitir el enriquecimiento de los clones ES portadores de los- ' recombinántes ¡ '^homólogos , , como . está : descrito por Mansour y col. (1988) Nature 336: 348-352. Este cásete consiste en las secuencias codificadoras del gen tk limitado o encorchetado por el promotor pgk de ratón y el sitio de poliadenilación, como está descrito por Tybulewicz y col. (1991) Cell 65: 1153-1163. El vector orientador CMD resultante contiene un total de aproximadamente 5.3 kb de homología para el locus de la cadena pesada y está diseñado para generar un gen mu mutante en el que se ha insertado un cásete de expresión neo en el sitio Smal único del primer exón Cmu. El vector orientador fue linéalizado con Pvul, que corta dentro de las secuencias del plásmido, antes de la electroporación en las células ES .

Creación y análisis de células ES elegidas como blanco Células ES AB-1 (McMahon, A. P. y Bradley, A., (1990) Cell 62: 1073-1085) fueron crecidas en capas alimentadoras de células SNL76/7 mitóticamente inactivas (ibid.) prácticamente como está descrito (Robertson, E. J. (1987) en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a' Practical Approach (E . J. Robertson, ed. ) Oxford: IRL Press, p. 71-112) . El vector orientador CMD linéalizado fue electroporado en células AB-1 por los métodos descritos en Hasty y col. (Hasty, P. R. y col. (1991) ' * Nature 350 : '"' 243-246) . Las'* células' electro oradas "'fueron''.' plaqueadas en cajas de 100 mm a una densidad de 1-2 x lo6 células/caja. Después de 24 horas se adicionó al medio G418 (200 microorganismos/mL del componente activo) y FIAU (5 x 10"7 M) y los clones resistentes al fármaco se dejaron desarrollar durante 8-9 días. Los clones fueron recogidos, tripsinizados , divididos en dos porciones y además extendidos . La mitad de las células obtenidas de cada clon fueron luego congeladas y la otra mitad se analizó para recombinación homologa entre las secuencias vector y blanco.

El análisis del DNA se llevó a cabo por hibridación Southern blot . Se aisló el DNA de los clones como se describe en Laird y col. (Laird, P. W.. y col. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4293). El DNA genómico aislado fue digerido con Spel y como sonda se utilizó un fragmento SacI de 915 pb, sonda A (véase la Figura 1) , la cual híbrida a una secuencia entre el potenciador intrónico mu y la región switch mu. La sonda A detecta un fragmento Spel de 9.9 kb procedente del locus tipo nativo, y una banda diagnóstica de 7.6 kb procedente de un locus mu que sea recombinado en forma homologa con el ' vector orientador CMD (el cásete de expresión neo contiene un sitio Spel) . De los 1132 clones resistentes a G418 y FIAU detectados por el análisis Southern blot, 3 mostraron la banca ' Spel ¾ d : 7.6 -kb índicativar -'de " l"a¦* recombinlálsion'* homologa en el locus mu. Estos tres clones fueron además digeridos con las enzimas Bgll, BstXI y EcoRI para comprobar que el vector se integró en forma homologa en el gen mu. Cuando se hibridaron con la sonda A, los análisis Southern blot del DNA tipo nativo digerido con Bgll, BstXI ó EcoRI produce fragmentos de 15.7, 7.3 y 12.5 kb, respectivamente, mientras que la presencia del alelo mu elegido es indicada por los fragmentos de 7.7, 6.6 y 14.3 kb, respectivamente. Todos los tres clones positivos detectados por la digestión con Spel mostró los fragmentos de restricción Bgll, BstXI y EcoRI esperados, diagnósticos de la inserción del cásete neo en el exón Cmul .

Creación de ratones portadores de gen mu mutado Los tres clones ES elegidos como blanco, número designado 264, 272 y 408, fueron descongelados e inyectados en blastocistos C57BL/6J como se describe por Bradley (Bradley, A. (1987) en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach. (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 113-151). Los blastocistos inyectados fueron transferidos en los úteros de hembras seudopreñadas para generar ratones quiméricos representando una mezcla de células procedentes de las células ES de entrada y el blastocisto hospedero. El grado: de la contribución de las células ES a la quimera puede estimarse visualmente por la cantidad de coloración de la capa agouti, procedente de la línea de células ES, sobre el fondo C57BL/6J negro. Los clones 272 y 408 produjeron solo bajos porcentajes de quimeras (es decir, bajo porcentaje de pigmentación agouti) pero el clon 264 produjo elevado porcentaje de quimeras macho. Estas quimeras fueron reproducidas con hembras C57BL/6J y se creó progenie agouti, indicativa de la transmisión de la línea germinativa del genoma de células ES. El cribado para el gen mu elegido se llevó a cabo por el análisis Southern blot del DNA digerido con Bgll obtenido dé biopsias de la cola (como se describe antes para el análisis del DNA de células ES) . Aproximadamente 50% de la progenie agouti mostró una banda Bgll hibridante de 7.7 kb además de la banda tipo nativa de 15.7 kb, demostrando una transmisión de la línea germinativa del gen mu elegido.

Análisis de ratones transgénicos para inactivación funcional del gen mu Para determinar si la inserción del cásete neo en Cmul ha inactivado el gen de cadena pesada Ig se reprodujo un clon 264 quimera con un ratón homocigoto para la mutación JHD, el cual inactiva la expresión de la cadena pesada como resultado de la deleción de los-segmentos génicos JH (Chen y col. (1993) Immunol . 5: 647-656). Se crearon cuatro descendientes agouti. Se obtuvo suero de éstos animales a la edad de un mes y se ensayó por ELISA para la presencia de IgM murina. Dos de los cuatro descendientes fueron completamente carentes de IgM (véase la Tabla 1) . La determinación del genotipo de los cuatro animales por análisis Southern blot del DNA obtenido de biopsia de la cola por digestión Bgll e hibridación con la sonda A (véase la Figura 1) y por digestión Stul e hibridación con el fragmento EcoRI/StuI de 475 pb (ibid.) demostró que los animales que no expresan IgM de suero son aquellos en los que un alelo del locus de cadena pesada lleva la mutación JHD, el otro alelo la mutación Cmul . Los ratones heterocigotos para la mutación JHD muestran niveles tipo nativo de Ig de suero. Estos datos demuestran que la mutación Cmul inactiva la expresión del gen mu.

TABLA 1 La Tabla 1 muestra los niveles de IgM en suero, detectados por ELISA, para ratones que llevan las mutaciones CMD y JHD (CMD/JHD) , para ratones heterocigotos para la mutación JHD (+/JHD) , para ratones tipo nativo (129Sv x C57BL/6J)F1 (+/+) , y para ratones ho ocigotos deficientes de células B para la mutación JHD (JHD/JHD) .

II . Generación de ratones transg-énicos HCQ12 El transgen pesada humana HC012 se generó por coinyección de la inserción de 80 kb de pHC2 (Taylor y col. 1994, Int. Immunol., 6: 579-591) y la inserción de 25 kb de pVx6. El plásmido pVx6 se construyó como se describe a continuación.

Un fragmento de DNA HindIII/SalI de 8.5 kb, que comprende el gen VHi-18 (DP-14) humano de la línea germinativa junto con aproximadamente 2.5 kb de la secuencia genómica flanqueadora 5' y 5 kb de la secuencia genómica flanqueadora 3' se subclonó en el vector plásmido pSP72 (Promega, adison, WI) para generar el plásmido p343.7.16. Un fragmento de DNA BamHl/HindIII de 7.0 kb, que contenía . el gen VH5-51 (DP-73) humano de la línea germinativa junto con aproximadamente 5 kb de la secuencia genómica flanqueadora 5' y 1 kb de la secuencia genómica flanqueadora 3' se clonó en el vector pGPlf (Taylor y col., 1992, Nucleic Acids Res. 20: 6287-6295), de clonación plásmido basado en pBR322 para generar el plásmido p251f. Un nuevo vector de clonación procedente de pGPlf, pGPlk, se digirió con EcoRV/BamHI y se ligó a un fragmento de DNA EcoRV/BamHI de 10 kb, que comprendía el gen VH3-23 (DP47) humano de la línea germinativa junto con aproximadamente 4 kb de la secuencia genómica flanqueadora 5' y 5 kb de la secuencia genómica flanqueadora 3' . El plásmido resultante, pll2.2RR.7, se digirió con BamHI/SalI y se ligó con la inserción BamHl/SalI purificada de 7 kb del p251f. El plásmido resultante, pVx4, se digirió con Xhol y se ligó con la-inserción Xhol/Sall de 8.5 kb de p343.7.16.

Se obtuvo un clon con el gen VHi-18 en la misma orientación que los otros dos genes V. Este clon, denominado pVx6, entonces se digirió con Notl y la inserción de 26 kb purificada se co- inyectó con la inserción Notl de 80 kb purificada de pHC2 en una relación molar 1:1 en los pronúcleos de embriones de medio día (C57BL/6J x DBA/2J) F2 como se describe por Hogan y col. (B. Hogan y col. Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, 2a edición, 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview NY) . Tres líneas independientes de ratones transgénicos que comprendían las secuencias de Vx6 y HC2 fueron establecidas de los ratones que se desarrollaron a partir de los embriones inyectados. Estas líneas se denominan (HC012) 14881, (HC012) 15083 y (HC012) 15087. Cada una dé las tres líneas luego se reprodujo con ratones que contenían la mutación CMD descrita en el Ejemplo 1, la mutación JKD (Chen y col. 1993, EMBO J. 12: 811-820) y el transgen (KCo5)9272 (Fishwild y col. 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851). Los ratones resultantes expresan los transgenes de la cadena pesada y ligera kappa de inmunoglobulina humana en un fondo homocigoto para la disrupción de los loci de la cadena pesada y ligera kappa endógenos de ratón.

II . Producción de HuMAbs contra CD30 Los anticuerpos monoclonales humanos contra CD30 humana se produjeron como sigue en ratones transgénicos generados como ya se describió.

Antígeno: La CD30 soluble se mezcló con adyuvante de Freund completo (Sigma F5881) para la primera inmunización. Después, el antígeno se mezcló con Freund incompleto (Sigma F5506) . 25 microgramos de CD30 en 100 . L de PBS se mezclaron 1:1 con el adyuvante utilizando una aguja emulsificadora . Los ratones fueron inyectados en la cavidad intraperitoneal con 0.2 ce de antígeno preparado .

Ratones transgénicos: Los ratones fueron alojados en jaulas de filtro y fueron evaluados en cuanto a su condición física en las fechas de la inmunización, los sangrados y el día de la fusión.

Procedimiento de la inmunización: Los ratones fueron inmunizados con una combinación de una inyección IP de células L540 en el adyuvante completo de Freund e inyecciones IP ulteriores de un CD30 recombinante, soluble en adyuvante incompleto de Freund cada 14 días. Los animales que desarrollaron títulos anti-CD30 contra la línea de células que expresan CD30, L540, recibieron una inyección IV de CD30 recombinante, soluble, 72 horas antes de la fusión. Se cosecharon, purificaron y fusionaron los esplenpcitos de ratón. Preparación del hibridoma: para las fusiones se utilizó la línea de células de mieloma murino P3 X63 ag8.653 (ATCC CRL 1580m, lote F-15183) . El vial ATCC original se descongeló y se extendió en el cultivo. Se preparó un stock semilla de viales congelados a partir de esta extensión. Se mantuvo a las células en cultivo durante 3-6 meses, se pasaron dos veces por semana. P388D1 (ATCC TIB-63 FL) se expandió- hasta 200 mL y se agotó. El sobrenadante se centrifugó y se filtró y se utilizó como adición de medio conocido como medio acondicionado. Esta línea de células se pasó durante 3-6 meses y luego se descongeló un vial nuevo.

Para cultivar el mieloma y las células P388D1 se utilizó DME con elevado contenido de glucosa (Mediatech, Cellgro #10013245) con un contenido de 5% FBS y penicilina-strepatientomicina [sic] (Cellgro # 30004030) . Se adicionaron otros suplementos del medio al medio de crecimiento del hibridoma, los cuales incluyeron: 3% de factor de clonación Origen-Hybridoma Cloning Factor (Igen, 36335), 10% de medio acondicionado para P388D1 (8/10/99 DH) , 10% de FBS (Hyclone, SH30071 lote #AGH6843), L-glutamina (Gibco #1016483), 0.1% de gentamicina (Gibco #1020070), 2-mercapatientanol [sic] (Gibco #1019091) , HAT (Sigma H0262) , 1.0 x 104 M de hipoxantina, 4.0 x 10"7 M aminopatienterina [sic] , 1.6 x 10"5 M de timidina) ó HT ((Sigma, H0137) 1.0 x 10~4 M de hipoxantina, 1.6 x 10"5 M de timidina) .

Los hibridomas se dejaron crecer durante una semana hasta que se establecieron colonias visibles, se cosechó el sobrenadante y se utilizó para el tamizaje inicial para IgG humana por ELISA utilizando una captura específica de la cadena kappa humana y una detección específica de Fe humano. Los sobrenadantes positivos para IgG fueron luego ensayados para la especificidad de CD30 por citometría de flujo utilizando células L540 y un ELISA de CD30.

Los hibridomas productores de IgG HuMab específico fueron subclonados y extendidos. Los HuMabs fueron luego purificados por cromatografía en columna de la proteína A utilizando el siguiente procedimiento: (1) Condiciones de la carga: el sobrenadante fue cargado en una columna de proteína A de 5 mL que se equilibró con salina amortiguada con fosfato (PBS) ; (2) Lavado: búfer PBS; (3) Elución: Glicina 0.1 M con NaCl 150 mM, pH 2.9. El eluato se neutralizó con búfer tris 1 M (30 uL para cada fracción de 2 mL) . Cada fracción eluida se corrió sobre gel antes de se combinada. Una vez que se comprobó la pureza por tinción de coomassie, las fracciones fueron combinadas y dializadas contra búfer de fosfato de sodio 10 mM con NaCl2 150 mM, pH 7.2. Este protocolo condujo al aislamiento de tres anticuerpos interesantes: 17G1-1; 5F11 y 2H9.

Las regiones VH y VL del HuMab 17G1-1, 5F11 y 2H9 fueron aisladas del RNA de los hibridomas, se sometieron a la transcripción inversa para cDNA y las regiones V fueron amplificadas por PCR y se secuenció el producto de la PCR.

Ejemplo 2 Sitios de unión I . Determinación de las constantes de afinidad y velocidad del HuMab 5F11 Materiales (1) Dos muestras de las formas de IgG del clon HuMab 5F11 (Medarex, Inc., Annandale, N. J.) (2) Antígeno CD30 humano (Medarex, Inc., Annandale, N. J.) (3) Anticuerpo policlonal anti-CD30 humano/TNFRSF8 (R&D Systems; catálogo No. AF229) . (4) Chip CM5 , búfer de acoplamiento: búfer de acetatos 10 mM, pH 6.0 (acoplamiento de CD30) y pH 3.5 (acoplamiento de proteína A) , búfer de regeneración: HC1 10 mL. (5) Biacore 3000, software de BiaEval v.3.0.1.

Acoplamiento de la proteína A La proteína A (Fc2, 2367 Rus, tiempo de inyección 10 min, flujo: 5 .L/min, pH 3.5) se copuló en un chip CH5 utilizando la química de amino-copulación .

Estudio de unión Se capturó el HuMab 5F11 (1 .L/mL) sobre una superficie de proteína A durante 2.5 minutos. (No se capturó ninguna cantidad importante de anticuerpo en un chip de proteína G, en un experimento independiente) . Se hicieron dos experimentos con diferentes intervalos de concentración de CD30 pasados sobre el anticuerpo capturado. El intervalo de concentraciones del experimento 1 incluyó: 10, 6.67, 5, 3.33 y 1.67 .L/mL; el experimento 1 incluyó: 5, 4, 2, 1 y 0.5 .L/mL. La fase dé asociación duró 10 minutos seguida por una ' fase de disociación de 10 minutos. Los datos se ajustaron a un modelo de asociación de Langmuir 1:1 para determinar los diferentes parámetros, como se muestra en la siguiente tabla: Tabla 2 Estabilidad de la superficie del anticuerpo capturado El HuMab 5F11 (1 .L/mL) se capturó sobre una superficie de proteína A durante 2.5 minutos. El búfer se dejó fluir durante 1.5 horas para mimetizar la fase de asociación y disociación del antígeno CD30 para comprobar si la superficie del anticuerpo capturado es estable. El experimento mostró una superficie estable con niveles de superficie sin cambio (<0.1%) para 5F11 sobre el tiempo total del experimento. Por consiguiente, la muestra de 5F11 mostró constantes de afinidad semejantes hacia el antígeno CD30 y la superficie del anticuerpo capturado fue estable para realizar otros estudios de unión.

II. Unión dependiente de la dosis de los HuMab para CD30 recombinante La .habilidad de los HuMabs seleccionados para unirse a CD30 recombinante se investigó por un ELISA de captura utilizando un anticuerpo anti-CD30 murino disponible en el comercio, BER-H2 (DAKO Corp. Carpenteria, CA) como sigue.

Los pozos de microtitulación fueron recubiertos con BerH2. Después de bloquear los pozos con solución de BSA al 5%, el sobrenadante de las células transíectadas que expresan CD30 recombinante se dejó reaccionar con los pozos recubiertos con BER-H2. Se retiró el sobrenadante y los HuMAbs 5F11, 2H9, 17G1 purificados de la proteína A, y un isotipo control fueron incubados en diferentes concentraciones con los pozos con CD30 unido a 37°C.

Después de una hora, los pozos fueron lavados con PBS-Tween y los anticuerpos unidos fueron detectados incubando las células con una sonda específica de Fe de d anti-IgG humana de cabra etiquetada con fosfatasa alcalina, a 37°C. El exceso de sonda se lavó de los pozos y se reveló la placa con el revelador pNPP. Se determinó la densidad óptica a 405 nm utilizando un lector de placas de microtitulación.

Como se muestra en la Figura 1, los HuMabs anti-CD30, y no el isotipo control, demostraron unión dependiente de la dosis. Esto indica que los HuMabs anti-CD30 reconocieron específicamente la CD30 recombinante . La diferencia cuantitativa en la unión a CD30 entre los HuMabs anti-CD30 indica -que 5F11, 2H9 y 17G1 son anticuerpos únicos porque la diferencia cuantitativa en la unión probablemente se deba a las diferencias en la afinidad o las diferencias en el reconocimiento de la forma recombinante de CD30.

III. Unión dependiente de la dosis de los HuMabs a L540 La habilidad de los HuMabs anti-CD30 para unirse a CD30 en células de tumor de Hodgkin se investigó por citometría de flujo como sigue.

Los anticuerpos fueron probados para unión a L540, una línea de células de linfoma de Hodgkin que expresa elevados niveles de CD30. Los HuMabs, 5F11, 2H9, 17G1 y un isotipo control purificados de la proteína A fueron incubados en diferentes concentraciones con la línea de células L540 a 4°C. Después de una hora, las células fueron lavadas con PBS, y los anticuerpos unidos fueron detectados incubando las células con una sonda específica de Fe anti-IgG humana de cabra etiquetada con FITC, a 4°C Se lavó el exceso de sonda de las células con PBS y se determinó la fluorescencia asociada a las células por análisis utilizando un instrumento FACScalibur.

Como se muestra en la Figura 2, los HuMabs 5F11, 2H9 y 17G1 demostraron elevado nivel de unión a las células L540, con saturación en concentraciones por debajo de 1 ug/mL. Estos datos demuestran que estos anticuerpos se unen eficiente y específicamente a CD30 nativo expresado en células de tumor hepático.

IV. Mapeo del epítope Se ha demostrado que CD30 contiene al menos tres agrupamientos serológicamente definidos, denominados A, B y C. Para determinar el cluster que se unió al HuMab 5F11, se investigó la habilidad de los anticuerpos murinos específicos para el agrupamiento (cluster) A (Ki 4 y BerH2), el agrupamiento B (Ki-1) ó el agrupamiento C (AC10) para inhibir la unión de 5F11 etiquetado con FITC a las células L540. En resumen, las células L540 fueron incubadas simultáneamente con FITC-5F11 junto con un exceso de 10-20 veces de anticuerpos no etiquetados durante 60 minutos sobre hielo. Las células fueron lavadas y analizadas por FACS . Todos los anticuerpos bloqueadores fueron de origen murino y se utilizaron en un exceso de 10 veces de su concentración de saturación. El HuMab 5F11 (l .g/mL) fue etiquetado con isotiocianato-de fluoresce na (FITC) y la unión a CD30 se determinó utilizando un citómetro de flujo clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) (FACScan, Becton Dickinson., He de-l-berg-; Alemania) . Los anticuerpos primarios fueron diluidos en salina amortiguada con fosfatos y enfriada en hielo (PBS) con un contenido de 0.2% de albúmina de suero bovino y 0.02% de azida de sodio (búfer de tinción) , se incubaron con 1 x 105 células L540 y el mAb 5F11-FITC durante 60 minutos en hielo .

Como se muestra en la Figura 14, los anticuerpos qué se unen al agrupamiento A fueron capaces de inhibir la unión de FITC-5F11 a las células L540, mientras que los anticuerpos que se unen a los agrupamientos B ó C no pudieron, indicando que 5F11 se une a o cerca del epítope del agrupamiento A.

Ejemplo 3 Estudios de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) I . Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos, mediada por monocitos, de células de tumor de Hodgkin L540 con los HuMabs La capacidad de los HuMabs anti-CD30 para mediar la lisis de las células de tumor que expresan CD30 se investigó utilizando un ensayo de liberación de 51Cr con monocitos _humanos- -sanos-.—-Los- mono_cit¾s~"humanos sanos fueron activados en cultivo con IFN-. para activar o la regulación ascendente de los receptores Fe y la actividad citol tica. Se utilizaron células L540 como blancos para la lisis por los monocitos activados por IFN-., Los monocitos purificados de leukopacs normales de origen adulto (Biological Specialty Corp., PA) , fueron cultivados en medio libre de suero para macrofagos (M-SFM, Gibco, Grand Islad, NY) suplementado con 10% de FBS y IFN-. (1000 u/mL; R & D Systems, Minneapolies , MÑ) durante 2 días. Las células blanco fueron etiquetadas con 100 .Ci de 51Cr durante 1-2 horas antes de la combinación con células efectoras (E:T = 50:1) y los HuMabs en una placa de microtitulación de fondo en U. Después de la incubación durante 16 horas a 37 °C los sobrenadantes 5 fueron recolectados y analizados para la radioactividad. Se calculó la citotoxicidad por la fórmula: % de lisis = (CPM experimental - CPM filtración (leak) blanco) / (CPM de lisis con detergente - CPM filtración (leak) blanco) por 100%. Lisis específica = % de lisis con HuMab - % de 10 lisis sin HuMab. Los ensayos se realizaron por triplicado.

Como se muestra en la Figura 3, los HuMabs 5F11, 2H9 y 17G1 mediaron lisis específica de las células L540 obtenidas de tumor de Hodgkin, en comparación con un J5_ isot_ipo__control Los—resultados "demuestran ~ 'qué''-estos HuMabs son capaces de dirigir las células de tumor que expresan CD30 a las células efectoras para lisis mediada por el receptor Fe. 20 II. Citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mediada por células mononucleares de células de tumor de Hodgkin L540 con los HuMabs Se investigó la capacidad de los HuMabs anti-CD30 25 para mediar lisis de las células de tumor que expresan CD30 utilizando un ensayo de liberación de 51Cr con células mononucleares humanas frescas.

Se utilizaron células L540 como blancos para la lisis mediante células mononucleares humanas frescas. Las células mononucleares fueron purificadas a partir de sangre entera heparinizada por centrifugación de densidad Ficoll hypaque . Las células blanco fueron etiquetadas con 100 .Ci de 51Cr durante 1-2 horas antes de combinarlas con las células efectoras en diferentes proporciones efector: blanco y las HuMabs (5 ug/mL) den una placa de microtitulación de fondo en U. Después de incubación durante 4 horas a 37 °C se recolectaron los sobrenadantes y se analizaron para radioactividad. La citotoxicidad se __ calculó _por_la- fórmula:—% de lisis -= " ("CPM "e^xperimentaT~- CPM filtración (leak) blanco) /(CPM lisis con detergente - CPM filtración (leak) blanco) X 100%. Lisis específica = % lisis con HuMab - % lisis sin HuMab. El ensayo se realizó por triplicado.

Como se muestra en la Figura 4, los HuMabs 5F11 y 17G1 mediaron lisis específica de las células L540 obtenidas de tumor de Hodgkin en comparación con un isotipo control. Los resultados demuestran que estos HuMabs son capaces de dirigir las células de tumor que expresan CD30 a las células efectoras inactivadas, muy probablemente las células asesinas naturales (NK) para lisis mediada por receptor Fe.

Ejemplo 4 Inhibición del crecimiento del HuMab 5F11 El anticuerpo HuMab 5F11 soluble (0.1, 1 y 10 .g/mL) formó un enlace cruzado por un anticuerpo anti IgG humana de cabra (GAH-IgG) (en un exceso de 1000%) en una placa de 96 pozos con 2 x 104 células por pozo (L540, L1236, Karpas 299, L428, BL38) . La inhibición del crecimiento se determinó utilizando XTT, la sal cromogénica de tetrazolio (sodio 3 ' - [1- [ (fenilamino) -carbonil] -3 , 4- tetrazolio] -bis (4-metoxi-6-nitro) bencensulfónico ácido _ hidrato)_,_s.e..ensayó—después -de—incubación ~¾ 3~7°"( "y~ 5% "de C02 durante 96 horas. En resumen, algunas diluciones del HuMab 5F11, con o sin el exceso de 1000% de GAH-IgG, fueron distribuidas en alícuotas de 100 .L en placas de 96 pozos. Las células blanco en una concentración de 2-4 x 104 (L540, L1236, Karpas 299) en alícuotas de 100 .L del medio completo fueron adicionadas y las placas se incubaron durante 48 horas a 37°C en una atmósfera con 5% de C02. Los cultivos celulares luego fueron pulsados con 100 .L de medio de cultivo fresco suplementado con XTT y N-metil dibenzopirazin metil sulfato (concentraciones finales de 1.49 mM y 0.025 m , respectivamente) durante 4 horas. Se midió la absorbancia espectrofotométrica de las muestras a 450 nm y 650 nm (longitud de onda de referencia) con un lector ELISA (M G Biotech, Ebersberg, Alemania) . Se midieron controles negativos utilizando solo GAH-IgG junto con las células blanco antes mencionadas, y utilizando la combinación del HuMab 5F11 y el anticuerpo formador del enlace cruzado, GAH-IgG, sobre una línea de células CD30 negativas (BL38) . La viabilidad celular en relación con los cultivos control no tratados se calculó utilizando la fórmula valor de prueba/no tratado * 100. Todas las mediciones se hicieron por triplicado y se repitieron dos veces. En particular, se utilizaron los siguientes controles: (1) sin anticuerpo formador___del_enlace—cruzado- -secundaricT; "~C2l ~s~olo el anticuerpo de enlace cruzado secundario; (3) células sin anticuerpo; y (4) solo XTT.

Se demuestra un efecto claro, dependiente de la dosis sobre e metabolismo celular para las células HD L540 y las células Karpas 299 tipo células T, pero no para las células HD tipo células B L428 y L1236. La IC50 se alcanzó a la concentración más alta en 10 .g/mL, sugiriendo que e efecto citotóxico es moderado (véase la Figura 5) . Este no fue un artefacto, puesto que ni el GAH-IgG ni el anticuerpo 5F11 solo mostraron ningún efecto y la actividad fue restringida para las células L540 y Karpas 299.

Ejemplo 5 Actividad in vivo del HuMab 5F11 Modelo de tumor localizado Se examinó in vivo la habilidad del HuMab 5F11 para inhibir el crecimiento de células de tumor que expresan CD30 utilizando un modelo de ratón xenoinj ertado . Tumores L540CY sólidos, subcutáneos, fueron establecidos por inyección de células L540CY (1 x 107) resuspendidas en 200 .L de PBS en el costado derecho de los ratones SCID. Se midió el desarrollo del tumor cada tres días y se _ ^determinó. _.el— volumen—dei—tumor - utilizando "Ta'~ "fórmula (longitud * peso * altura) /2. Los animales con tumores establecidos de 4 a 6 mm en el diámetro más grande fueron divididos en forma aleatoria en los diferentes grupos y recibieron 100 .g de 5F11 (en 200 .L de PBS i.p.) cada 4 días para un total de 4 inyecciones. Los ratones testigo o control recibieron solo PBS. Los experimentos se interrumpieron y los ratones se sacrificaron cuando el diámetro promedio del tumor en el grupo testigo fue superior a 20 mm (día 107) . El grupo de tratamiento y control consistió en 5 animales cada uno y los resultados í ! fueron confirmados mediante una segunda serie de experimentos .

El HuMab 5F11 se dio por vía intraperitoneal 4 veces cada 4 días. Se proporcionaron linfocitos de sangre periférica (PBL) una vez por vía intravenosa en el día de tratamiento 1. Los resultados fueron expresados como volumen de tumor graficado contra tiempo en días (Figura 6) . Los PBL administrados solos tuvieron un impacto sobre el crecimiento del tumor, pero la adición del anticuerpo intensifica este efecto. El anticuerpo solo mostró una actividad anti-tumor comparable (Figura 6) . Estos resultados demuestran que el HuMab 5F11 puede inhibir el crecimiento de células de tumor que expresen CD30 en un modelo animal, administrado solo, o en combinación con-PBL humanos .

Modelo de tumor diseminado Ratones C.B-17/lcr SCID hembras, libres de patógenos (FOX CHASE SCID®, M&B A/S, Ry, Dinamarca) se mantuvieron en condiciones libres de patógenos y se alimentaron con comida normal y agua sometidas a autoclave. Se utilizó un modelo diseminado para evaluar los efectos del tratamiento con HuMab 5F11 sobre la supervivencia de ratones SCID desafiados con células HL humanas L54OCY.

Para el modelo diseminado, 1 x 107 células L540CY con crecimiento exponencial fueron inyectadas por la vena de la cola (iv) en los ratones SCID con 3-4 semanas de nacidos. Un día después de la inyección de las células L540CY, los ratones recibieron 100 .g de 5F11 por vía intraperitoneal (ip) diluidos en 200 .L de PBS cada 4 días para un total de 4 inyecciones . Los grupos control incluyeron solo PBS, 5F11 + un exceso de 1000% de GAH-IgG mAb y GAH-IgG mAb solo utilizando el mismo programa de tratamiento. Los ratones con signos de enfermedad, progresiva (pelo erizado, inactividad, deformación del cráneo) fueron sacrificados. Después de examen somero, los órganos que fueron infiltrados macroscópicamente con células L540CY se fijaron en formalína. Lós animales que sobrevivieron hasta. 200 días fueron sacrificados en ese momento y los órganos principales fueron fijados en formalina para otros exámenes .

Como se documenta en el análisis de Kaplan-Meier (Figura 15) , el tiempo de supervivencia promedio del grupo control tratado con PBS fue de 43 días (intervalo 40-46 días) y 39 días en el grupo tratado con GAH-IgG (intervalo 15-51 días) . En el grupo de tratamiento con 5F11, 3/5 ratones fueron supervivientes de largo tiempo (139 días) y no mostraron signos de enfermedad con la autopsia. Un animal murió durante el día 17 sin desarrollar ningún signo macroscópico de enfermedad, sugiriendo que la causa de muerte fue no relacionada con el tumor. Un segundo ratón murió 'durante el día 57 a partir de la enfermedad progresiva. Tras el enlace cruzado con el GAH-IgG mAb, 4/4 ratones no desarrollaron ningún signo de tumor y fueron sacrificados en el día 200 Así pues, el tratamiento con el HuMab 5F11 fue curativo para una elevada proporción de animales en este modelo de xenoinjerto de HL (p = 0.01 y p = 0.046 para los grupos, de tratamiento 5F11 + GAH-IgG y 5F11, respectivamente) .

Ejemplo 6 Reactividad cruzada de HuMab 5F11 fluoresceinado en tejido humano normal Para evaluar la reactividad cruzada potencial de una forma fluoresceinaza de HuMab 5F11 con criosecciones de tejidos humanos normales, se utilizó un método indirecto de inmunoperoxidasa . No se observó reactividad cruzada no anticipada.

El estudio se realizó de acuerdo con las Reglas de Buenas Prácticas de Laboratorio de la FDA (21 CFR Parte 58) . El panel de tejido humano incluyó los tejidos de la "lista sugerida de tejidos humanos que pueden utilizarse para investigaciones inmunohistoquímicas de reactividad cruzada" en el Anexo II del EC CP P Lineamiento ÍII/5271/94, "Producción y control de calidad de anticuerpos monoclonales" y los tejidos recomendados en la 1997 US FDA/CBER "Puntos a considerar en la fabricación y pruebas de productos anticuerpos monoclonales para uso humano" .

Los tejidos obtenidos anteriormente por autopsia o biopsia quirúrgica fueron injertados en medio Tissue-Tek®! O.C.T. y congelados en hielo seco. Los tejidos fueron seccionados a aproximadamente 5 .m y fijados durante 10 minutos en acetona a temperatura ambiente. El artículo a prueba se aplicó a los cubreobjetos en dos concentraciones (2 y 10 .g/mL) y para detectar la unión se utilizó un método de inmunoperoxidasa indirecto (Dako EnVision Kit) .

Los resultados indicaron que el artículo a prueba HuMab 5F11-FITC tiñó específicamente la membrana de las í células L540 que expresan CD30, control positivo, una línea de [células obtenida de la enfermedad de Hodgkin, así comojla membrana de los linfocitos que expresan CD30 controles positivos en amígdala humana. La reactividad con las criosecciones del control positivo fue de fuerte a intensa en ambas concentraciones examinadas (10 .g/mL y 2 .g/mL) . En la amígdala humana, las células CD30 positivas fueron localizadas en la periferia de los folículos así como en las regiones interfoliculares contiguas, y representaron menos de 1-2% de las células de la amígdala. El examen del panel de tejidos de prueba humanos indicó que la reactividad cruzada no se observó en ningún tejido excepto la amígdala humana. En los tres donadores examinados, la reactividad se observó con células de linfocitos/mononucleares ubicadas en la periferia de los folículos así como en las regiones interfoliculares contiguas. Menos de 1% de células de amígdala fueron teñidas. Se esperaba esta reactividad basándose en informes anteriores de la expresión de CD3Ó en amígdala (Hecht y col. 1985) .

Ejemplo 7 Secuenciación del anticuerpo Como se describe antes en el Ejemplo 1, los HuMab dé hibridomas productores de HuMab IgG específico fueron purificadosj por cromatografía en columna de proteína A que condujo al aislamiento de tres anticuerpos interesantes: 17G1, 5F11 y 2H9. Las regiones VH y VL de los HuMab 17G1, 5F11 y 2H9 posteriormente se aislaron del RNA del hibridoma, se sometieron a transcripción inversa para el cDNA, las regiones V fueron amplificadas por PCR y se secuenció el producto de la PCR. Las siguientes son las secuencias de los ácidos nucleicos y aminoácidos de las regiones VH y VL de los HuMab.

Secuencia del ácido nucleico VH de 17G1: GAGGTGCAGTTGGTGGAGTCTGGGGGAGGC'ÍTGGTCCAGCCTG GGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTAGCCTCTGGATTCACCTTT AGTAACTC1TGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAAG GGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAACGAAGATGGAAGTGAGA AATTCTATGTGGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCTTCTCCAG AGACAACGCCGAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCT GAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGGGTTCAT TGGTACTTCCATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTC CTCA (SEQ ID NO:!) Secuencia del ácido nucleico VH de 17G1: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFSNSWMSWVRQAPGK GLEWVANINEDGSEKFYVDSVKGRFTFSRDNAENSLYLQMNSLR AEDTAVYYCARVHWYFHLWGRGTLVTVSS (SEQ ID N0:2) Secuencia del ácido nucleico VH de 17G1: GAAATTGTG'ITGACGCAGTCTCCAGGCACCCTGTCTTTGTCTCC AGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGT TAGCAGCAGCTACrrAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAG GCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTG GCATCCCAGACAGGTTCAGTÜGCAGTGGGTCTGGGACAGACTT CACTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTG TATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCÍ'CACCGTGGACGTTCGGCC AAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA (SEQ ID NO:3) Secuencia del ácido nucleico VH de 17G1: EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPR I I YGAS SRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTI S SLEPEDFAV YYCQQ YG SSPWTFGQGTf VEIK (SEQ ID NO:4) Secuencia del ácido nucleico VH de 2H9: CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTT CGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTC AGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAG GGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCATAGTGGAAGCACC AAGTACACCCCGTCCCTCAAGAGCCGAGTCACCATATCAGTAG ACACGTCCAAGCACCAATTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGAC CGCCGCGGACACGGCTGTGTAI ACTGTGCGAGAGAGACTGTC TACTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACTGTCTC CTCA (SEQ ID NO:5) Secuencia del ácido nucleico VH de 2H9 : QVQLQQWGAGLLKPSETLSXTCAVYGGSFSGYYWSWIRQPPGKG LEWIGE1NHSGSTKYTPSLKSRVTISVDTSKHQFSLKLSSVTAADT A V YYC ARETVYYFDL WGRGTL VTVS S (SEQ ID NO:6) Secuencia del ácido nucleico VH de 2H9 : GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCC AGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGT AAGCAGCAACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGC TCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCA CCAACAGGGCCACTGGC ATCCCAGCCAGGCTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCA CTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTTA TTACTGTCAACAGCGTAGCAACTGGCCGTGGACGITCGGCCAA GGGACCAAGGTGGAAATCAAA (SEQ ID NO:7) Secuencia del ácido nucleico VH de 2H9: EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPR LLIYDASNRATGIPARLSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRS NWPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO :8) Secuencia del ácido nucleico VH de 5F11: CAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTT CGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTC AGTGCTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGG GGCTGGAGTGGATTGGGGACATCAATCATGGTGGAGGCACCA ACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGA CACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAACTCTGTAACC GCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGCCTAACTGCCT ACTGGGGCCAGGGAAGCCTGGTCÁCCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:9) Secuencia del ácido nucleico VH de 5F11: DlQIvn-QSPATffi^fSLSASVGD VnTCRASQGISSWLTWYQQKPE K-APKSLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTT.,TISSLQPEDFATYYC QQYDSYPITFGQGTRLEIK (SEQ 1D N0:32) Ejemplo 8 Tratamiento de la enfermedad de Hodgkin ( mediado por CD30, en humanos La enfermedad de Hodgkin (HD) se ha vuelto una enfermedad curable debido a la introducción de sistemas de-poliquimioterapia tipo MOPO ó ABVD y técnicas de radiación mejoradas (Devita VT, Jr. y col., Ann Intern Med 73: 881 (1970); Bonadonna G y col. Cáncer Treta Rep 66: 881 (1982); Kaplan H. S. Cáncer 45: 2439 (1980)). En fechas recientes, pacientes con la enfermedad en etapa avanzada han mostrado: respuestas y tasas de supervivencia mejoradas utilizando el esquema BEACOPP establecido por el Grupo de Estudio Alemán del Linfoma de Hodgkin (Dile V y col. J". Clin Oncol 16: 3810(1998)). No obstante, aunque muchos pacientes pueden ser curados por los métodos normales, menos de 30% de aquellos que recaen logran remisiones libres de enfermedad, durables, después del segundo tratamiento de línea (Carella A. M. y col. Leuk Lymphoma 7 supl : 21 (1992)) . El efecto es incluso peor para aquellos con enfermedad refractaria primaria (Linch D. C. y col. Lancet 341: 1051 (1993)).

Los datos obtenidos de la enfermedad de Hodgkin así como de otras enfermedades malignas incluido el cáncer colo-rectal, leucemia mieloide o linfoma de no Hodgkin (NHL) , sugieren que pequeños números de células de tumor residuales que permanecen después del primer tratamiento de línea pueden dar origen a recidivas tardías (Kanzler H y col. Blood 87: 3429 (1996); Wolf J y col. Blood 87: 3418 (1996); Riethmuller G y col. Lancet 343: 1177 (1994) ; Roy D. C. Blood 77: 2404 (1991); Gribben J.' G. y col. N Engl. J Med 325: 1525 (1991) . De este modo, l eliminación de células Hodgkin/Reed Sternber (H-RS) residuales después del primer tratamiento de línea podría además mejorar el efecto -en la HD. Se ha evaluado un número de diferentes anticuerpos · monoclonales para el tratamiento de pacientes HD, incluyendo las-construcciones de anticuerpo-toxina ( inmunotoxinas) , radioinmunoconjugados y anticuerpos monoclonales no modificados (Herpts J .. M. y col. J Clin Oncol 13: 2394 (1995) ; Schnell R., y col., Leuk Lymphoma 30: 525 (1998);-Engert A., y col., Blood 89: 403 (1997); Shnell R. y col., sujbmítted (2001) . Como una alternativa posible, los anticuerpos biespecífieos han atraído interés como in unorreactivos en HD. En general, se ha demostrado que los anticuerpos biespecíficos son bien tolerados. No obstante, efectos colaterales y potencial citotóxico de estas construcciones dependen de manera muy importante de las células efectoras elegidas como blanco.

Hasta ahora la mayor parte de los anticuerpos biespecíficos involucraron diferentes . subseries de linfocitos o células NK, las cuales son menos efectivas en pacientes con enfermedad maligna y en particular HD (Hartmann F. , y col. Blood 89: 2042 (1997)). Así pues, se construyó una molécula biespecífica novedosa (la molécula biespecífica) basada en el receptor Fc.RI de alta-afinidad (CD64) que se expresa sobre enutrófilos, monocitos y macrofagos activados (Ravetch J. V. y col. Annu Rev Innunol 9: 457 (1991)). La CD64 sirve como una molécula activadora sobre células efectoras citotóxicas que expresan Fc.RI. La IgG monomérica así como Ios-complejos IgG antígeno se unen a Fc.RI. La unión de solo los complejos IgG-antígeno a Fc.RI da origen a una acti.vi.dad ci.tjíotoxica aumentada, incluyendo la citolisis, estallido respiratorio y producción de enzimas oxidativas-(Fanger M. W. y col. Immunol Today 10: 92 (1989); van de inkel J. G. y col. J Leukoc Biol 49: 511 (1991)) . t El anticuerpo monoclonal murino M22, se une al Fc.RI > en un epítope fuera del dominio de unión Fe normal, pasando por alto, por este medio, la competición con la I IgG de suero (Guyre P. M. y col. J. Immunol 143: 1650 (1989)). La unidad de unión utilizada para la construcción de la molécula biespecífica novedosa descrita en la presente invención se basa en la versión humanizada del anticuerpo monoclonal anti-CD64, M22, denominado H22 (Graziano R. F. y col. J Immunol 155: 4996 (1995)). Los fragmentos F(ab') de H22 fueron ligados químicamente a los fragmentos F(ab') obtenidos del anticuerpo monoclonal anti-CD30, Ki-4. La molécula biespecífica resultante, H22xKi-4, tiene un peso-molecular de 104 kDa y de este modo permite mejor penetración al tumor en comparación con un anticuerpo completo. Además, este tipo de construcción no activa el complemento ni se une a células no citotóxicas que expresen receptores Fe, dando " origen a - efectos-colaterales mínimos (Fanger M. W. y col. Crít Rev Immunol 12 : 101 (1992) ) .

Las pruebas preclínicas in vitro de H22xKi-4 demostraron que esta molécula biespecífica media la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) junto con los monocitos, así como la fagocitosis junto con macrofagos obtenidos de monocitos (MDM) (Sundarapandiyan K. y col. J Immunol Methods 248: 113 (2001)). Así pues, CD64 es un blanco promisorio para el reclutamiento de células efectoras inmunocompetentes en HD. El siguiente estudio clínico en fase I se realizó para demostrar la eficacia de esta molécula biespecífica, terapéutica, novedosa, en pacientes con HD.

I . Pacientes y métodos Pacientes Los pacientes elegibles tenían HD refractaria, medible y activa, avanzada, no manejable con. quimioterapia tradicional . Se tuvo que documentar la presencia del antígeno CD30 por reactividad con los anticuerpos anti-CD30 en -30% de las células H-RS obtenidas de biopsia del tumor realizada en el transcurso de un año antes del tratamiento con H22xKi-4; La. quimioterapia o radioterapia previas tuvieron que ser completadas cuatro semanas antes de la administración del fármaco en estudio. Además, se tuvieron que cumplir las siguientes condiciones: presencia de sitios de enfermedad. que pudieran ser medidos objetivamente, condición de desempeño de la Organización Mundial de la Salud (OMS) de 2 o menos, edad entre 18 y 70 años, expectativa de vida de al menos 3 meses, creatinina en suero de menos de 2 mg/100 mL, albúmina en suero de más de 75% del límite inferior, función cardiaca medida por ecocardiografía con una fracción de expulsión del ventrículo izquierdo en la línea base (LVEF) mayor de 35%, y sin otros problemas médicos importantes . El tratamiento concomitante con corticosteroides no fue un criterio de exclusión puesto que los pacientes con HD progresiva suelen necesitar terapia de corticosteroides. El protocolo fue aprobado por el comité de ética institucional y los pacientes tuvieron que dar el consentimiento informado por escrito de acuerdo con la naturaleza investigacional del tratamiento.

Diseño del estudio Este estudio clínico fue un estudio de etiqueta abierta, no asignado al azar, con escala de la dosis, fase I. El principal objetivo fue determinar la dosis, máxima tolerada (MTD) de H22xKi-4 en humanos por administración^ por infusión intravenosa. Los objetivos-secundarios consistieron en la farmacocinética, la toxicidad limitadora de la dosis (DLT) , la dosis óptima,. biológica y cualquier actividad anti-tumoral . Los pacientes recibieron al menos dos ciclos de tratamiento consistentes en cuatro infusiones cada uno. Se administró el H22xKi-4 durante el día 1, 3, 5 y 7, respectivamente. Se efectuaron otros ciclos de acuerdo con el juicio de cada investigador en pacientes respondentes.

Reglas de escalamiento de la dosis y toxicidad máxima La dosis máxima tolerada (MTD) se definió como la concentración más alta de la dosis inmediatamente por debajo de la dosis limitada por la toxicidad. Esta dosis fue definida por la presencia de una DLT en al menos dos de tres o seis pacientes. Seis pacientes tuvieron que ser tratados en la MTD. La MTD fue evaluada utilizando el diseño de titulación acelerada como sigue: escalación de la dosis al doble (100%) con un paciente por cohorte en la fase acelerada hasta que se observara el primer caso de DLT en cualquier ciclo o el segundo caso de toxicidad grado II en cualquier ciclo (Simón R y col., J" Nati Cáncer Inst 89: 1138 (1997)). Después, el cohorte del nivel de dosis actual tuvo que ser extendido a al menos tres pacientes y se utilizó el esquema de escalamiento de la dosis de Fibonacci modificado, normal (con incrementos de dosis de 50%) para todos los siguientes niveles de dosis. Los episodios adversos no considerados como relacionados con el fármaco en estudio no fueron considerados como toxicidad en términos de estas reglas de escalamiento de la dosis y las reglas para la determinación de la MTD. Los grupos de dosis fueron como sigue: 1.0 mg/m2/d, 2.5 mg/m2/d, 5 mg/m2/d, 10 mg/m2/d y 20 mg/m2/d. Se enroló a un total de 6 pacientes en el nivel de dosis de 20 mg/m2/d independiente de la falta de toxicidades. La DLT fue definida como cualquier toxicidad no hematológica grado III ó IV (de acuerdo con los criterios del NCI) o toxicidad hematológica grado IV excluyendo linfopenia, monoci openia o neutropenia. Los pacientes podían comenzar con el siguiente nivel de la dosis si la tercera administración de H22xKi-4 en el nivel de dosis anterior había sido completo sin DLT. Los signos vitales fueron supervisados cada hora durante la infusión y hasta 6 horas después. Los pacientes fueron supervisados cada semana con cuenta de células sanguíneas completas, bioquímica, estado de la orina, estado de desempeño y evaluación de la toxicidad de acuerdo con los criterios de la OMS. Durante el día 28 de cada ciclo se repitieron las evaluaciones de la línea base que incluían electrocardiografía, rayos X de tórax, ecocardiografía, prueba de la función hepática, creatinina en suero y la evaluación de la respuesta del tumor.

Formulación del medicamento y administración El H22xKi-4 se produjo utilizando el método de Glennie como está descrito en lo anterior (Glennie M. J. y col. J Immunol 139: 2367 (1987)). El fármaco fue suministrado en viales estériles de 10 mL que contenían 1 mg/mL de H22xKi-4 y tuvieron que ser almacenados a 4°C.

Antes de cada infusión los pacientes recibieron una dosis de prueba inicial de 10% de la dosis total o 0.2 mg, la que fuera más pequeña, de H22xKi-4, disuelto en 50 mL de salina normal y administrados por vía intravenosa .durante 10 minutos. Los pacientes luego fueron premeditados con 1000 mg de acetaminofen por vía oral y 1 mg de clemastina pro vía oral 30 minutos antes de recibir la dosis final de H22xKi-4. Si esta dosis de prueba era tolerada sin toxicidad significativa después de 30 minutos, el H22xKi-4 se diluía en 500 mL de salina normal y se administrába-por vía intravenosa comenzando con 3 mg/h. Si no se observaban reacciones adversas después de 60 minutos, la velocidad de infusión se aumentaba a 6 mg/h y luego a 9 mg/h, respectivamente.

Farmacocinética Durante el primer día de la administración de H22xKi-4 se extrajeron muestras de sangre en tubos heparinizados en los siguientes puntos del tiempo: antes de la infusión, inmediatamente después de la infusión, a las 2, 4, 8, 12, 24 y 48 horas después de cada infusión. Se separó el plasma de las células sanguíneas por centrifugación a 1200 g durante 10 minutos y posteriormente se almacenó a -20°C hasta el análisis de la farmacocinética. El límite de detección del ensayo de H22xKi-4 fue 0.125 µ /p??_ para los primeros tres pacientes y 0.04 µ9/p? para los demás pacientes. Los datos para la concentración de H22xKi-4 en plasma durante el tiempo fueron inspeccionados en una gráfica semilogarítmica de concentración de H22xKi-4 contra tiempo para cada individuo. Los valores para Cm x y Tmáx fueron los valores observados 'a partir de los datos farmacocinéticos sin procesar. Los demás' parámetros farmacocinéticos normales fueron estimados utilizando el programa Win onlin Pro pharmacokinetic. (Pharsight Corporation, ountain View, CA) . Los datos de ¦ concentración-tiempo fueron analizados utilizando un método abierto sin compartimientos (WinNonlin modelo 202). La constante de velocidad de eliminación terminal (ke) se determinó por el análisis no compartimental utilizando una regresión lineal de los 3-6 puntos terminales de la gráfica de concentración de H22xKi-4 en plasma contra tiempo, utilizando un paradigma nó ponderado. La vida media de eliminación terminal (??/2) se estimó a partir de 0.693/ke. La AUC (área bajo la curva) para el punto del último dato fue estimada utilizando la regla lineal-trapezoidal, y se extrapoló al infinito mediante la adición de la corrección de Wagner-Nelson (Cüitimo/ke) · El aclaramiento corporal total (CL) se calculó dividiendo la dosis/AUC (0-infinito) .

El volumen de distribución aparente (Vdz) se estimó a partir de CL/ke. El tiempo de estancia promedio (MRT) se estimó a partir de AUMC/AUC. El volumen de distribución aparente en el estado estacionario (Vdss) se estimó a partir de la ecuación Vdss = CL x MRT. El factor de acumulación R se estimó a partir de la ecuación Treat x AUC(o-) /Treat 1 AUC(0-) [sic] . En este Treat x AUC(0-) la AUC fue desde 0 hasta el intervalo de dosificación en cualquier ocasión de tratamiento y AUC(0-) fue la AÜC desde 0-infinito en el día 1.

Evaluación de la actividad biológica Puesto que era muy poco probable que ocurriera DLT con la molécula biespecífica de la presente invención, se investigaron los parámetros sustitutos para la actividad biológica. Las cuentas de monocitos en la sangre periférica se midieron inmediatamente antes y después de la infusión de H22xKi-4 y a las 2, 4, 8 y 24 horas después de la infusión. Se determinó la expresión de CD64 por análisis FACS y se correlacionó con un isotipo control, utilizando un anticuerpo adecuado (FACS-Calibur, Becton-Dickinson) . En los mismos puntos del tiempo, se determinaron los niveles en suero de IL-6, IL-15, G-CSF y TNFa utilizando los kits para ensayos inmunoabsorbentes de enzimas ligadas (ELISA) comerciales. Después se relacionó el nivel de citocinas antes del tratamiento con los de después del tratamiento con la molécula biespecífica y se probó para significancia utilizando la prueba de Wilcoxcon. La correlación con el nivel de la molécula biespecífica se probó utilizando el coeficiente de Pearson.

Con respecto al tumor se midieron las concentraciones de sCD30 por ELISA (DA O) antes y después de cada día de administración de la molécula biespecífica. Dos pacientes dieron consentimiento informado para una biopsia diagnóstica de los ganglios linfáticos periféricos aumentados 24 horas después de la última infusión de H22xKi-4. Este material fue dividido en dos partes, una de las cuales fue inmediatamente congelada fresca y almacenada a -80 °C, y la otra fue incrustada en parafina. Para la investigación inmunohistoquímica el tejido fue desparafinado , cortado en secciones de 5 µt? y bloqueado con suero porcino durante 10 minutos para reducir la tinción no específica. Después el anticuerpo monoclonal primario, un Ab anti-ratón de conejo, policlonal (DAKO) diluido 1:50 en PBS, se aplicó e incubó a 4°C durante la noche, seguido por un anticuerpo anti-conejo de ratón biotinilado (1:200) durante 45 minutos a temperatura ambiente, E 431 DAKO) y un kit de biotina estreptavidina (DAKO) normal. Por último, los cortes fueron teñidos con rojo naftiónico (DAKO) . Como un primer control negativo (libre de moléculas biespecificas) una muestra de un paciente HD que había sido tratado en este estudio, se tiñó durante el mismo procedimiento. Un segundo control negativo (para excluir reactividad cruzada inespecífica de los demás anticuerpos utilizados para el procedimiento de tinción) fue el material obtenido en este' estudio y se. tiñó sin anticuerpo primario.

HABA/Respuesta HAMA Se determinó la respuesta del anti-anticuerpo biespecifico humano utilizando un método como está descrito anteriormente (Pullarkat V., y col. Cáncer Inmunol Immunother 48: 9 (1999)) . En resumen, las placas de microtitulación recubiertas con las moléculas biespecificas fueron incubadas con diluciones de muestras de plasma y anticuerpos anti-molécula biespecífica detectados con una sonda específica para anti-Fc (IgG humana) de cabra conjugada con fosfatasa alcalina. Los niveles de HABA fueron expresados como aumento x % sobre el valor de la línea base antes de la infusión.

Evaluación de la respuesta La inmigración de los datos se realizó de acuerdo con el sistema de clasificación Ann-Arbor. La remisión completa (CR) se definió como la ausencia de cualquier evidencia clínica o radiológica de la enfermedad activa durante un periodo de al menos 4 semanas. Se definió a la remisión parcial (PR) como 50% o más de disminución en el producto de los dos diámetros perpendiculares más grandes de todas las lesiones medióles, según se determina por dos observaciones consecutivas a no menos de 4 semanas dediferencia. Menos de 25% de disminución o aumento en la masa total del tumor, de nuevo persistente durante al menos 4 semanas, se definió como sin cambio (NC) . La enfermedad progresiva fue definida como la aparición de nuevas lesiones o aumento de más de 25% en el tamaño del tumor .

II . Resultados Características de los pacientes Se incluyó un total de 10 pacientes HD con recidivas múltiples pretratadas, tratados en 5 niveles de dosis diferentes y pueden ser evaluados, de los cuales" 2 eran mujeres. La edad promedio fue de 34.6 años abarcando desde 21 hasta 53 años. La histología incluyó 3 pacientes con celularidad mixta de la enfermedad de Hodgkin y 7 pacientes con el subtipo de esclerosis nodular o aterosclerosis . El número medio de recidivas fue 3 (intervalo 1 a 7) . Una mediana de 4 ' antes de las quimioterapias había sido administrado (intervalo 2 a 6) , incluida la quimioterapia con dosis altas con soporte de células primordiales autólogas en 9 de 10 pacientes. Además, todos los pacientes habían sido pretratados con radioterapia. Del grupo de pacientes, 7 pacientes tenía enfermedad en etapa IV, 3 pacientes tenían enfermedad en etapa III, 5 pacientes tuvieron síntomas B cuando entraron al estudio y 8 pacientes fueron tratados con 2 ciclos de H22xKi-4, un paciente recibió 3 y un paciente recibió 4 ciclos (consistentes en 4 infusiones por cada ciclo) de tratamiento, respectivamente.

Toxicidad Todos los efectos colaterales fueron transitorios, ocurriendo durante y hasta 6 horas después del final de la infusión (véase la Tabla 2) . En los 10 pacientes se observó fatiga moderada. Otras toxicidades incluyeron hipotensión moderada (4 en grado I) , taquicardia (6 grado I), hipertermia (2 grado I, 3 grado II), escalofríos (4 grado I) y mialgia (3 grado I) . Todos estos efectos colaterales se resolvieron en el transcurso de 24 horas . No se observaron toxicidades hematológicas ni de órganos.

Farmacocinética Las concentraciones de la molécula biespecífica fueron detectables solo en aquellos pacientes que recibieron más de 5 mg/m2/d. La Tmáx ocurrió en o después del término de la infusión en todos los individuos durante todos los días de tratamiento. La declinación de la concentración en plasma con el tiempo fue monoexponencial para todos los pacientes. Hubo una tendencia para la Cmáx y AUC para aumentar con el tiempo. Por tanto, se realizó un análisis con medidas repetidas, de un solo factor, univariado de la varianza para Cmáx, i22, AUC, Cl y Vdz durante el periodo de tratamiento de una semana. Este análisis reveló un efecto significativo del tiempo sobre Cmáx (F = 5.885 ;" p = 0.006) y AUC (F = 5.976; p = 0.005). Esto sugiere una acumulación de H22xKi-4 con dosificación repetida (véase las Figuras 1 y 2) . Para todos los pacientes estudiados, el valor medio del factor de acumulación R es 1.36 (intervalo 0.98-3.90) por la cuarta , dosis . La vida media terminal de H22xKi-4 fue 7.9 h en la dosis de 10 mg/m2/d (n = 1) y tuvo un valor de 11.1 h (promedio en el nivel de la dosis de 20 mg/m2/d (mediana 11.1 h; intervalo de 5.3 - 18.2 h) (véase la Tabla 3). El volumen de distribución abarcó desde 20.26 hasta 183.20 L/m2. El valor, promedio de la distribución del volumen (Vdz) en el grupo de 20 mg/m2 fue de 53.17 L/m2. El aclaramiento corporal total de H22xKi-4 durante el día 1 tuvo una variación de 1.02 a 14.06 L/m2 con un valor promedio para el grupo de pacientes que recibieron 20 mg/m2 de 3.91 L/h/m2 (DE 5.04 L/h/m2) . Niveles bajos de HABA fueron detectablés después del término del segundo ciclo en todos los pacientes con niveles medibles de la molécula biespecífica, ninguno resultando en niveles disminuidos en suero de la molécula biespecífica ni en reacciones alérgicas (véase la Tabla 2). El paciente tratado con cuatro ciclos de la molécula biespecífica desarrolló elevados niveles de HABA.

Actividad biológica Hubo una liberación de IL-6, IL-15, TNFa, y G-CSF con el máximo a las 2 a 4 horas después del término de la infusión de H22xKi-4. La liberación de citocinas no fue significativa, tal vez debido al número limitado de pacientes evaluables (n = 6) y la elevada variabilidad de los niveles de citosina entre pacientes. No obstante, hubo una tendencia clara para la liberación de citocina como se muestra en la Figura 3 y . Parece ser que la liberación de citocinas aminora con administración repetida de la molécula biespecífica y fue más intensa para G-CSF, TNF-a e IL-6 en comparación con IL-15. Como coincidencia, hubo una disminución importante de la expresión de CD64 en los monocitos de sangre periférica (p ' = 0.018) así como una declinación de sus cuentas en sangre (véase la Figura 5) . El nivel de SCD30 en suero fue notablemente elevado en pacientes con una elevada carga de tumor, pero ya no fue detectable después de la primera , infusión de la molécula biespecífica y permaneció en un nivel muy bajo hasta el término del tratamiento en todos los pacientes (no se muestran los datos) .

Inmunohistoquímica El fragmento murino de la molécula biespecífica pudo ser detectado en la muestra de ganglio linfático de ambos pacientes utilizando el método antes descrito (véase la Figura 6) . Hubo una tinción clara de las células HRS, que se localizó a lo largo del citoplasma. Además, los macrofagos en este tejido mostraron un modelo de tinción idéntico. Así pues, hubo clara evidencia de penetración de la molécula biespecífica en los ganglios linfáticos malignos.

Respuesta del tumor En general, hubo cuatro pacientes con respuestas objetivas a la molécula biespecífica H22xKi-4. Se observo CR en un paciente con nodulos pulmonares difusos hasta un máximo de 10 m . Esta respuesta duró 3 meses, después los nodulos pulmonares pudieron ser medidos otra vez por CT- scan y se inició quimioterapia de rescate. Se documentó PR en 3 pacientes con una duración de 4 semanas hasta 5 meses. Un paciente (número 4) tuvo quimioterapia adicional después de 4 semanas . En este paciente el único, sitio de la enfermedad fue una infiltración de la vértebra torácica. El tratamiento con la molécula biespecífica condujo a una resolución completa de los defectos neurológicos y a una respuesta parcial que pudo ser medida. Puesto que no hubo mejoramiento adicional de • la respuesta después de otros dos ciclos de H22xKi-4, se dio quimioterapia para llevar al mínimo el riesgo de progreso de la enfermedad y una posible fractura fatal de la vértebra.

Dos pacientes tratados en los dos niveles más bajos de la dosis tuvieron enfermedad progresiva, y 4 pacientes mostraron enfermedad estable. De estos, un paciente (No. 6) con carga tumoral masiva (infiltración del pulmón superior derecho con infiltración pleural y de la pared torácica) , que había experimentado toxicidades que pusieron en riesgo su vida (sepsis, falla renal aguda, ventilación mecánica durante dos meses) con quimioterapia precedente logró un mejoramiento notable de sus síntomas (tos, sudoraciones nocturnas). La estabilización y normalización de la enfermedad de estas condiciones generales duró 12 meses .

III . Conclusión El estudio antes descrito demuestra lo siguiente: 1)- H22xKi-4 es bien tolerado en dosis de hasta 80 mg/m2 (dado durante el día 1, 3, 5 y 7) con solo efectos colaterales de leves a moderados y transitorios. No hubo toxicidades limitadoras de la dosis y no se llegó a la dosis máxima tolerada de esta construcción; 2) la vida media de H22xKi-4 en la dosis máxima dada es de 11.1 horas, dando origen a una acumulación significativa del fármaco según se determina por CmáX y AUC durante el periodo de tratamiento; 3) hubo una liberación de citocinas de IL-6, IL-15, TNFa y G-CSF, así como una disminución de los monocitos y expresión de CD64, sugiriendo una dosis biológica eficaz y el programa; 4) H22xKi-4 induce respuesta de tumor en pacientes con HD avanzada y refractaria, pretratada. H22xKi-4 es una molécula biespecífica novedosa consistente en dos fragmentos F(ab') químicamente ligados provenientes del anticuerpo monoclonal anti-CD30 murió Ki-4 y el anticuerpo monoclonal anti-CD64 humanizado H22. Esta construcción había mostrado actividad contra líneas de células H-RS in vitro (Sundarapandiyan K. y col. J Immunol Methods 248: 113 (2001)).

En el presente y primer estudio clínico de H22xKi-4, el efecto colateral más común fue fatiga que ocurrió en todos los 10 pacientes tratados. Otros efectos colaterales consistieron en taquicardia, hipotensión, escalofríos, hipertermia y mialgia. El perfil de toxicidad de H22xKi-4 se asemeja al "síndrome de liberación de citocinas" como está descrito para diversos anticuerpos monoclonales contra células de linfoma incluido Rituximab, Campath-1H u 0KT3 (Winkler U. , y col. Blood 94: 2217 (1999); Wing NI. G. y col., J Clin Invest 98: 2819 (1996); Norman D. J. y col., Transplant Proc 25: 89 (1993)). Estos síntomas ocurrieron en todos los niveles de dosis, sugiriendo actividad biológica incluso en dosis menores. Solo la hipertermia grado II y mialgia leve fueron restringidas para el nivel más alto de la dosis. El inicio de los síntomas fue variable pero duró no más de 6 horas después de terminar la infusión. No se observó correlación directa entre los efectos colaterales y los niveles en suero de H22xKi-4 o las citocinas determinadas en este estudio.

A pesar del hecho de que se utilizaron dosis comparablemente altas de la molécula biespecífica, no se pudo encontrar la MTD de H22xKi-4. Seis pacientes fueron tratados con 80 mg/m2 por ciclo y la cantidad más alta total de la molécula biespecifica administrada a un paciente fue de 740 mg. Dado que no hubo efectos colaterales mayores a este nivel de dosis, 80 mg/m2 por ciclo dada en los días 1, 3, 5 y 7 es una dosis segura. Hallazgos muy similares se conocen de otros anticuerpos monoclonales específicos como Rituximab (Maloney D. G. y col. Clin Oncol 15: 3266 (1997)). Así pues, 80 mg/m2 por ciclo es una dosis biológica activa, en particular dado que se ha observado una saturación de los monocitos de sangre periférica semejante a los estudios anteriores que utilizaron moléculas biespecíficas anti-CD64 comparables (Pullarkat V. y col., Caner Immunol Immunother 48: 9 (1999) ) .

La vida media calculada de 11.1 horas también está dentro del intervalo informado para otras moléculas biespecíficas basadas en anti-CD64 (Curnow R. T. , Cáncer Immunol Immunother 45: 210 (1997)). Esta vida media es más corta en comparación con los anticuerpos a base de IgG humanizada como rituximab, donde se ha descrito una vida media de más de 400' horas. No obstante, la vida media más corta de H22xKi-4 no es sorprendente puesto que esta nueva molécula es más pequeña en comparación con un anticuerpo intacto a base de IgG (104 kDa contra 180 kDa) y carece de la porción Fe (Tobinai K. y col. Ann Oncol 9: 527 (1998)). Además, en comparación con anticuerpos intactos, el tamaño de la molécula de H22xKi-4 podría permitir más fácilmente su penetración en los ganglios, linfáticos malignos (Jain R. K. , Cáncer Res. 50 (Supl) : 814s (1990) ..

El programa utilizado en este estudio fue diseñado para saturar todos los monocitos de sangre periférica y sCD30 con la molécula biespecífica dando origen a un exceso de molécula biespecífica no unida .que entonces pudiera penetrar en el tejido para unirse a las células HRS . La unión a sCD30 podría tener un impacto superior sobre la distribución de H22xKi-4. Se observó una acumulación significativa de H22xKi-4 medida como un nivel pico y la AUC, sugiriendo la saturación de este compartimiento. Además, la sCD30 permaneció en concentraciones muy bajas después de la primera infusión de H22xKi-4 durante todo el periodo de tratamiento, probablemente en parte debido al bloqueo de la secreción de CD30 por el anticuerpo Ki-4 (Horn-Lohrens O., y col., Intl J Cáncer 60: 539 (1995)). Además, se observó unión de H22xKi-4 a las células HRS por inmunohistoquímica . Por último, se observó liberación de citocinas derivadas de monocitos, es decir, G-CSF, IL-6, IL-15 y TNFa combinados con la unión profunda de la molécula biespecífica a CD64 sobre las células efectoras.

La respuesta promisoria a H22xKi-4 corrobora los datos reportados de tumores sólidos utilizando el anticuerpo monoclonal anti-FcyRI H22. La inducción de ADCC por la unión a CD64 se demostró en pacientes con carcinoma de mama avanzado (van Ojik H. H. y col. Cáncer Immunol Immunother 45: 207 (1997)). En carcinoma de próstata refractario a hormona la molécula biespecífica anti-CD64x anti-HER2 mostró actividad incluso en dosis menores que las utilizadas en el estudio presente (James N. D. y col. Br J Cáncer 85: 152 (2001)).

En general, el estudio anterior demuestra que las moléculas biespecíficas de la presente invención, por ejemplo, H22xKi-4, muestra un excelente perfil de toxicidad y una eficacia prometedora en pacientes con HD pretratada, avanzada o refractaria.

Equivalentes Los expertos en la técnica se darán cuenta, o podrán averiguar utilizando no más que experimentación habitual, múltiples equivalentes de las modalidades especificas de la invención descritas en la presente. Equivalentes como estos están propuestos para estar comprendidos por las reivindicaciones siguientes .

Incorporación como referencia Todas las patentes, solicitudes dé patentes pendientes y otras publicaciones mencionadas en la presente se incorporan por este medio como referencia en sus enterezas.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Medarex, Inc. et al. <120> ANTICUERPOS MONOCLO ALES HUMANOS CONTRA CD30 <130> MXI-180PC <150> US 60/347649 <151> 2002-01-09 <150> US 60/404427 <151> 2002-08-19 <150> US 60/431684 <151> 2002-12-06 <160> 53 <170> FastSEQ for Windows Versión 4.0 <210> 1 <211> 348 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) ... 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(321) <400> 7 gaa att gtg ttg acá cag tct cea gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg 48 Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 gaa aga gcc ace ctc tcc tgc agg gcc agt cag agt gta age age aac 96 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 . 25 30 tta gcc tgg tac caá cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc ate 144 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg-Leu Leu lie 35 4C ' 45 tat gat gca tcc aac agg gcc act ggc ate cca gcc agg ctc agt ggc Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Leu Ser Gly 50 55 60 agt ggg tct ggg acá gac ttc act ctc acc ate age age cta gag cct 240 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca gtt tat tac tgt caá cag cgt age aac tgg ceg tgg 288 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp 85 90 95 acg ttc ggc caá ggg acc aag gtg gaa ate aaa 321 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 <210> 8 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400>,8 Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn 20 25. 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 .45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Leu Ser Gly 50 ' 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105, <210> 9 <211> 336 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) . - - (336) <400> 9 cag gtg cag cta cag cag tgg ggc gca gga ctg ttg aag cct tcg gag Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 acc ctg tcc ctc acc tgc gct gtc tat ggt ggg tcc ttc agt gct tac Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ala Tyr 20 25 30 tac tgg age tgg ate cgc cag ecc cea ggg aag ggg ctg gag tgg att Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 ' 45 ggg gac ate aat cat ggt gga ggc acc aac tac aac ceg tcc ctc aag 192 Gly Asp lie Asn His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 - 55 60 agt cga gtc acc ata tea gta gac acg tcc aag aac cag ttc tcc ctg 240 Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 aag ctg aac tet gta acc gee gcg gac acg gct gtg tat tac tgt gcg 288 Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 age cta act gee tac tgg ggc cag gga age ctg gtc acc gtc tcc tea Ser Leu Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Ala Tyr 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp lie Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45 Gly Asp lie Asn .His Gly Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Val Thr lie Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ser Leu Thr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Ser Leu Val Thr Val Ser Ser 100 105 110 <210> 11 <211> 321 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) . 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Arg Ala Ser Gln Gly lie Ser Ser Trp Leu Thr "1 5 1° <210> 45 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 45 gctgcatcca gtttgcaaag <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Ala Ala Ser Ser Leu 1 5 <210> 47 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 47 caacagtatg atagttaccc tatcacc 27 <210> 48 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro lie Thr 1 5 <210> 49 <211> 291 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 49 caggtgcagc tacagcagtg gggcgcagga ctgttgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctatggtgg gtccttcagt ggttactact ggagctggat ccgccagccc 120 ccagggaagg ggctggagtg gattggggaa atcaatcata gtggaagcac caactacaac 180 ccgtccctca agagtcgagt caccatatca gtagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240 aagctgagct ctgtgaccgc cgcggacacg gctgtgtatt actgtgcgag a 291 <210> 50 <211> 285 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 50' gacatccaga tgacccagtc tccatcctca ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc . gggcgagtca gggtattagc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120 gagaaagccc ctaagtccct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt accct 285 <210> 51 <211>.294 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 51 gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttagt agctattgga tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaaag ggctggagtg ggtggccaac ataaagcaag atggaagtga gaaatactat 180 gtggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gaga 294 <210> 52 <211> 288 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 52 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacct 288 <210> 53 <211> 285 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 53 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggcct 285

Claims

R E I V I N D I C A C I O N E S 1. Un anticuerpo monoclon al humano aislado que se une a CD30 humana. 2. El anticuerpo humano de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo inhibe el crecimiento de las células tumorales que expresan CD30. 3. El anticuerpo humano de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo induce citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) de las células tumorales que expresan CD30 en presencia de células efectoras. . El anticuerpo humano de la reivindicación 3, en donde la ADCC es mediada por monocitos. 5. El anticuerpo humano de la reivindicación 3, en donde la ADCC es mediada por células mononucleares . 6. El anticuerpo humano de la reivindicación 2, en donde la célula tumoral se elige del grupo que consiste en células de médula ósea, células hepáticas, células, de ganglios linfáticos, células de la piel, células de bazo, células de timo, células de amígdalas, células deciduales, células endometriales, células de Hodgkin, células de Reed-Sternberg, células del linfoma anáplásico de células grandes (ALCL) , células de linfoma pleomórfico e inmunoblástico, células T, células B, células NK o monocitcs. 7. El anticuerpo humano de la reivindicación 2, en donde la célula de tumor es una célula de Hodgkin o una célula Reed-Sternberg. 8. El anticuerpo humano de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo se une a CD30 humana con una constante de afinidad de al menos 107 M"1. 9. El anticuerpo humano de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que consta de una cadena pesada de IgG humana y una cadena ligera kappa humana. 10. El anticuerpo humano de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una cadena pesada de IgGl ó IgG3. 11. Un anticuerpo monoclonal humano aislado que comprende una región variable de cadena pesada humana que comprende las secuencias FRl, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4 y una región variable de cadena ligera humana que comprende las secuencias FR1 , CDR1, FR2 , CDR2 , FR3, CDR3 y FR4, en donde: (a) la secuencia CDR3 de la región variable de la cadena pesada humana se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 18, 30 y 42 y las modificaciones conservativas de estas; (b) la secuencia CDR3 de la región variable de la cadena ligera humana se selecciona -del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 24, 36 y 48, y las modificaciones conservativas de estas; el anticuerpo humano se une a CD30 humana con una constante de afinidad de al menos 107 M"1; el anticuerpo humano media la lisis de células de tumor CD30+ en un ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) ; y (c) el anticuerpo humano inhibe el crecimiento de las células de tumor CD30+ in vivo. 12. El anticuerpo humano aislado de la reivindicación 11, en donde la secuencia CDR2 de la región variable de la cadena pesada humana se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 17, 29 y 41, y las modificaciones conservativas de estas; y la secuencia CDR2 de la región variable de la cadena ligera humana se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 23, 35 y 47 y modificaciones conservativas de estas. 13. El anticuerpo humano aislado de la reivindicación 12, en donde la secuencia CDR1 de la región variable de la cadena pesada humana se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 16, 28 y 40, y las modificaciones conservativas de estas; y la secuencia CDR1 de la región variable de la cadena ligera humana se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 22, 34 y 46 y modificaciones conservativas de estas. 14. El anticuerpo humano aislado de la reivindicación 11, el cual se une a CD30 humana con una constante de afinidad de al menos 108 M"1. 15. El anticuerpo humano aislado de la reivindicación 11, el cual se une a CD30 humana con una constante de afinidad de al menos 109 M_1. 16. El anticuerpo humano aislado de la reivindicación 11, en donde las secuencias FR1, FR2 , FR3 y FR4 de la región variable de la cadena pesada humana procedentes de la secuencia -de la linea germinativa VH4-3 ó VH3-11 de la cadena pesada humana. 17. El anticuerpo humano aislado de la reivindicación 11, en donde las secuencias FR1, FR2, FR3 y FR4 de la región variable de la cadena ligera humana proceden de la secuencia de la linea germinativa L15, A27 ó L6 de la cadena ligera humana . 18. Un anticuerpo monoclonal humano asilado que comprende una región variable de la cadena pesada humana y una región variable de la cadena ligera humana, en donde: (a) la región variable de la cadena pesada humana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 2, 6, 10 y las secuencias que sean al menos 80% homologas para las SEQ ID NOS: 2, 6 y 10; (b) la región variable de la cadena ligera humana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NOS: 4, 8, 12 y las secuencias que sean al menos 80% homologas para las SEQ ID NOS: 4, 8 y 12; (c) el anticuerpo humano se une a CD30 humana con una constante de afinidad de al menos 107 _1; (d) el anticuerpo humano media la lisis de células de tumor CD30+ en un ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) ; y (e) el anticuerpo humano inhibe el crecimiento de las células de tumor CD30+ in vivo. 19. El anticuerpo humano aislado de la reivindicación 18, en donde el anticuerpo se une a CD30 humana con una constante de afinidad de al menos 108 M"1. 20. El anticuerpo humano aislado de la reivindicación 18, en donde el anticuerpo se une a CD30 humana con una constante de afinidad de al menos 109 M"1. 21. Un anticuerpo monoclonal humano, aislado, que comprende una región variable de la cadena pesada humana procedente de la secuencia de la linea germinativa VH4-34 de la cadena pesada humana y una región variable de la cadena ligera humana procedente de la secuencia de la linea germinativa L15 de la cadena ligera humana, en donde: (a) la región variable de la cadena pesada humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10 o una secuencia que sea al menos 80% homologa para la SEQ ID NOS: 10; (b) la región variable de la cadena ligera humana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12 o una secuencia que sea al menos 80% homologa para la SEQ ID NOS: 12; (c) el anticuerpo humano se une a CD30 humana con una constante de afinidad de al menos 107 M_1; (d) el anticuerpo humano media la lisis de las células de tumor CD30+ en un ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) ; y (e) el anticuerpo humano inhibe el crecimiento de las células de tumor CD30+ in vivó. 22. Un anticuerpo monoclonal humano, aislado que comprende las regiones variables de la cadena pesada humana y la cadena ligera humana que comprende las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 4, respectivamente . 23. Un anticuerpo monoclonal humano, aislado que compite para la unión a CD30 con el anticuerpo monoclonal humano de la reivindicación 22. 24. Un anticuerpo monoclonal humano, aislado que comprende las regiones variables de la cadena pesada humana y la cadena ligera humana que comprende la secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 6 y la SEQ ID NO: 8, respectivamente . 25. Un anticuerpo monoclonal humano, aislado que compite para la unión a CD30 con el anticuerpo monoclonal humano de la reivindicación 24. 26. Un anticuerpo monoclonal humano, aislado que comprende las regiones variables de la cadena pesada humana y la cadena ligera humana que comprende la secuencias de aminoácidos mostradas en la SEQ ID NO: 10 y la SEQ ID NO: 12, respectivamente . 27. Un anticuerpo monoclonal humano, aislado que compite para la unión a CD30 con el anticuerpo monoclonal humano de la reivindicación 26. 28. El anticuerpo monoclonal humano aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-27 producido por un hibridoma, en donde el hibridoma se prepara de una célula B obtenida de un animal transgénico no humano que tenga un genoma que comprenda un transgen o .transcromosoma de la cadena pesada humana y un transgen o transcromosoma de la cadena ligera humana, fusionados a una. célula inmortalizada. 29. Una composición farmacéutica que contiene el anticuerpo humano de cualquiera de las reivindicaciones 1-27 y un portador farmacéutico aceptable. 30. Un inmunoconj ugado que consta del anticuerpo humano de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-27 ligado a un agente terapéutico. inmunoconj ugado de la reivindicación caracterizado porque el agente terapéutico es una citotoxina. 32. El inmunoconj ugado de la reivindicación caracterizado porque el agente terapéutico es radioisótopo. 33. Una composición farmacéutica que contiene el inmunoconjugado de cualquiera de las reivindicaciones 30-32 y un portador farmacéutico aceptable. 34. Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica el anticuerpo humano de cualquiera de las rei indicaciones 1-27. 35. La molécula de ácido nucleico aislado de la reivindicación 34, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico se incorpora en un vector de expresión. 36. Un trasfectoma que comprende el vector de expresión de la reivindicación 35. 37. Un animal transgénico no humano que expresa el anticuerpo humano de cualquiera de las reivindicaciones 1-27, en donde el animal transgénico no humano tiene un genoma que comprende un transgen o transcromosoma de la cadena pesada humana y un transgen o transcromosoma de- la cadena ligera humana. 38. Un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa CD30, que consiste en poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-27 de modo que se inhiba el crecimiento de la célula. 39. Un método para tratar o prevenir una enfermedad caracterizada por crecimiento de células de tumor que expresen CD30, el cual consiste en administrar a un individuo el anticuerpo humano de cualquiera de las reivindicaciones 1-27 en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la enfermedad. 40. El método de la reivindicación 39, caracterizado porque la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Hodgkin, linfoma anaplásico de células grandes (ALCL) , linfoma de células T del adulto (ATL) , linfoma de células T tipo linfadenopatía angioinmunoblástica (AILD) , linfomas basados en la cavidad corporal asociados con VIH, carcinomas embrionarios, carcinomas no diferenciados de la rinofaringe (por ejemplo el tumor de Schmincke) , enfermedad de Castleman, Sarcoma de Kaposi u otros linfomas de células T ó células B. 41. El método de la reivindicación 39, caracterizado porque la enfermedad es enfermedad de Hodgkin. 42. El método de la reivindicación 39, caracterizado porque la enfermedad es linfoma no Hodgkin. 43. El método de la reivindicación 39, caracterizado porque el linfoma no Hodgkin es linfoma anaplásico de células grandes (ALCL) . 44. Un método para tratar o prevenir una enfermedad autoinmune que involucra células inmunes que expresan CD30 y que consiste en administrar a un individuo el anticuerpo humano de cualquiera de las reivindicaciones 1-27 en una cantidad eficaz para tratar o prevenir la enfermedad autoinmune . 45. El método de la reivindicación 44, caracterizado porque la enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica, dermatitis atópica, enfermedad de Graves, tiroiditis de Hashimot , granülomatosis de Wegner, síndrome de Ornen, falla renal crónica, mononucleosis infecciosa aguda, enfermedades asociadas con el VIH y virus de herpes. 46. El método de cualquiera de las reivindicaciones 38-45, caracterizado porque el anticuerpo humano se conjuga a un agente terapéutico. 47. El método de. la reivindicación 46, caracterizado porque el agente terapéutico es una citotoxina. 48. El método de la reivindicación 46, caracterizado porque el agente terapéutico es un radioisótopo.