KR100668538B1 - Ｃｄ３０에 대한 인간 모노클로날 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 CD30 (예컨대 인간 CD30)에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체를 개시한다. 상기 인간 항체는 V-D-J 재조합 및 이소형 전환을 통해 인간 모노클로날 항체의 많은 이소형을 생산할 수 있는 비-인간 트랜스제닉 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스에서 생성할 수 있다. 또한, 인간 항체의 유도체 (예컨대 이중 특이적 항체 및 면역접합체), 상기 인간 항체를 포함하는 제약 조성물, 비-인간 트랜스제닉 동물 및 인간 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 및 상기한 인간 항체를 사용한 치료 및 진단 방법도 개시한다.
모노클로날 항체, 트랜스제닉 동물, 면역접합체, 하이브리도마, 제약 조성물

Description

ＣＤ３０에 대한 인간 모노클로날 항체 {Human Monoclonal Antibodies against CD30}
본 출원은 2002년 1월 9일자로 출원한 미국 출원 제60/347649호, 2002년 8월 19일자로 출원한 미국 출원 제60/404427호 및 2002년 12월 6일자로 출원한 미국 출원 제60/431684호를 우선권 주장하며, 상기 문헌은 본원에 참고로 도입된다.
CD30 세포 표면 분자는 종양 괴사 인자 수용체 (TNF-R) 거대족의 구성원이다. 이 족에 속하는 분자들은 그 구성원들 사이의 상동성이 다양하며 신경 성장 인자 수용체 (NGFR), CD120(a), CD120(b), CD27, CD40 및 CD95를 포함한다. 전형적으로, 이들 분자는 세포질외 영역에 다수의 시스테인-풍부 반복부가 존재함을 특징으로 한다 [de Bruin, P. C., et al. Leukemia 9:1620-1627 (1995)]. 이 족의 구성원은 림프구의 증식 및 분화 조절에 중요하다고 여겨진다.
CD30은 중앙에 힌지 서열이 있고 6개 (인간) 또는 3개 (뮤린 및 래트)의 시스테인-풍부 반복부가 있는 제I형 막횡단 당단백질이다. CD30은 세포내 90 kDa 전구체 단백질로부터 발생하는 120 kDa 막 분자로서 존재한다. 이는 세포 표면에서 대략 90 kDa의 가용성 단백질 (sCD30)로서 쉐딩 (shedding)된다. sCD30의 쉐딩은 살아있는 CD30 세포의 능동적인 과정이며, 사멸되고 있거나 이미 사멸한 세포에서 방출되는 것에 불과한 것이 아니다. CD30 단백질을 코딩하는 cDNA는 모노클로날 항체 Ki-1 및 Ber-H2를 사용한 면역스크리닝을 이용하여 HLTV-1 인간 T-세포주 HUT-102의 발현 라이브러리로부터 클로닝된 바 있다 [Schwab, U., et al. Nature 299:65 (1982)]. 마우스와 래트의 CD30 cDNA는 각각 498개 아미노산과 493개 아미노산을 코딩하는 것으로 밝혀졌다. 인간 CD30 cDNA는 시스테인 풍부 도메인 중 하나가 부분적으로 중복되어 추가의 90개 아미노산을 코딩한다. CD30 유전자는 인간에서는 lp36에, 래트에서는 5q36.2에 맵핑된 바 있다.
CD30은 활성화된 림프양 세포에 의해 우선적으로 발현된다. 구체적으로, 림프양 세포에서의 CD30 자극은 세포 유형, 분화 단계 및 다른 자극의 존재 여부에 따라 증식, 활성화, 분화 및 세포 사멸 등을 비롯한 다면성의 생물학적 효과를 유도하는 것으로 나타난 바 있다 [Gruss, H. J. et al., Blood 83:2045-2056 (1994)]. CD30은 호지킨병의 호지킨 및 리드-스턴버그 (Reed-Sternberg) 세포에서 발현되는 항원에 반응성인 모노클로날 항체 Ki-1에 의해 최초로 확인되었다 [Schwab et al., Nature 299:65 (1982)]. 따라서, CD30은 호지킨 림프종 및 관련된 혈액계 악성종양에 대한 임상적 마커로서 널리 사용된다 ([Froese et al., J. Immunol. 139:2081 (1987)], [Carde et al., Eur. J. Cancer 26:474 (1990)]).
이후, CD30은 버키트 림프종, 미분화 대세포 림프종 (Anaplastic Large-Cell Lymphomas; ALCL), 피부 T-세포 림프종, 결절성 소형 분획 세포 림프종, 림프구성 림프종, 말초 T-세포 림프종, 레너트 림프종, 면역아세포성 림프종, T-세포 백혈병/림프종 (ATLL), 성인 T-세포 백혈병 (T-ALL) 및 중심모세포/중심세포 (cb/cc) 여 포성 림프종 ([Stein et al., Blood 66:848 (1985)], [Miettinen, Arch. Pathol. Lab. Med. 116:1197 (1992)], [Piris et al., Histopathology 17:211 (1990)], [Burns et al., Am. J Clin. Pathol. 93:327 (1990)] 및 [Eckert et al., Am. J. Dermatopathol. 11:345 (1989)]) 등을 비롯한 비-호지킨 림프종 (NHL)의 서브세트 뿐 아니라 여러가지 바이러스로 형질전환된 세포주, 예를 들어 인간 T-세포 림프친화성 바이러스 I 또는 II로 형질전환된 T-세포 및 엡스테인-바르 바이러스로 형질전환된 B-세포 ([Stein et al., Blood 66:848 (1985)], [Andreesen et al., Blood 63:1299 (1984)])에서도 발현되는 것으로 나타났다. 또한, CD30 발현은 태생기암, 비-태생기암, 악성 흑색종, 간엽 종양 및 골수 세포주 및 후기 분화 단계의 대식세포에서도 입증된 바 있다 ([Schwarting et al., Blood 74:1678 (1989)], [Pallesen et al., Am J. Pathol. 133:446 (1988)], [Mechtersheimer et al., Cancer 66:1732 (1990)], [Andreesen et al., Am. J. Pathol. 134:187 (1989)]).
정상적인 개체에서는 CD30-양성 세포의 비율(％)이 매우 적기 때문에, 종양 세포에서의 CD30 발현은 치료를 CD30-양성 신생물 세포에 특이적으로 표적화하는 항체 매개 요법에서의 중요한 표적이다 [Chaiarle, R., et al. Clin. Immunol. 90 (2):157-164 (1999)]. 그러나, 현재까지 얻은 결과는 CD30이 면역요법에 유용한 표적임을 명백하게 수립하긴 했지만, 현재 이용가능한 뮤린 항체는 이상적인 치료를 구성하지 못하고 있는 것으로 나타나고 있다.
따라서, CD30에 의해 매개되는 질환의 치료 및(또는) 예방에 효과적인, CD30에 대한 개선된 치료 항체가 요구된다.
발명의 요약
본 발명은 인간 CD30에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 및 유도체 (예컨대 면역접합체 및 이중특이적 분자)를 제공하며, 이러한 항체를 단독으로 함유하거나 추가의 치료제와 함께 함유하는 기타 치료 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 항체 및 조성물을 사용하여 CD30에 의해 매개되는 각종 질환을 치료하는 방법도 제공한다.
본 발명의 인간 항체는 CD30에 결합하여 CD30의 기능 (및 CD30에 의해 매개되는 효과)을 억제하고(하거나) CD30-발현 세포, 예를 들어 종양 세포 및 면역 질환에 관여하는 세포의 성장을 억제 (예를 들어 이들 세포의 사멸을 매개함)한다. 이러한 세포의 예로는 골수 세포, 간 세포, 림프절 세포, 피부 세포, 비장 세포, 흉선 세포, 편도 세포, 탈락막 세포, 자궁내막 세포, 호지킨 세포, 리드-스턴버그 세포, 미분화 대세포 림프종 (ALCL) 세포, 다형성 면역아세포성 림프종 세포, T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 등이 있다. 특별한 실시양태에서, 상기 인간 항체는 림프종 치료시에 호지킨 세포의 성장 억제/사멸 매개에 이용된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 인간 항체는 인간 이펙터 (effector) 세포 (예를 들어 단핵구 또는 단핵 세포)의 존재하에 종양 세포의 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity; ADCC)을 유도함으로써 종양 세포의 성장을 억제하고 그의 사멸을 매개한다. 또다른 실시양태에서, 상기 인간 항체는 대식세포의 존재하에 CD30-발현 종양 세포의 식작용을 유도한다. 따라서, 본 발명의 항체는 CD30 활성에 의해 매개되는 장애를 치료하고 예방하는 개 선된 수단을 제공하는데, 이는 부분적으로는 이들의 독특한 특이성 (예를 들어 에피토프 특이성 및 관련된 세포 표면 항원과의 교차반응성), 친화도, 구조, 기능적 활성 및 이들이 완전히 인간의 것이어서 인간 환자에게의 투여시에 기존에 생성되었던 다른 CD30 항체 (예컨대 뮤린 및 인간화 항체)보다 유의하게 덜 면역원성이면서 더욱 치료 효과적이고 유용하다는 사실로 인한 것이다.
본 발명의 단리된 인간 항체는 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE 등과 같은 다양한 항체 이소형 (isotype)을 포함한다. 전형적으로, 이들은 IgG1 (예컨대 IgG1κ), IgG3 및 IgM 이소형을 포함한다. 상기 항체는 전장일 수도 있고 (예컨대 IgG1 또는 IgG4 항체) 또는 오직 항원 결합 부분 (예컨대 Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv 단편)만을 포함할 수도 있다.
본 발명의 특별한 치료 항체는 (a) 가변 영역이 서열 1 및 서열 3 각각에 기재된 뉴클레오티드 서열 및 그의 보존적 서열 변형체를 포함하는 인간 중쇄 및 인간 경쇄 핵산에 의해 코딩되거나 (b) 서열 2 및 서열 4 각각에 나타낸 아미노산 서열 및 그의 보존적 서열 변형체를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 모노클로날 항체 (HuMab) 17G1 및 기능적 등가 항체를 포함한다.
본 발명의 또다른 특별한 치료 항체는 (a) 가변 영역이 서열 5 및 서열 7 각각에 기재된 뉴클레오티드 서열 및 그의 보존적 서열 변형체를 포함하는 인간 중쇄 및 인간 경쇄 핵산에 의해 코딩되거나 (b) 서열 6 및 서열 8 각각에 나타낸 아미노산 서열 및 그의 보존적 서열 변형체를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하 는 인간 모노클로날 항체 2H9 및 기능적 등가 항체를 포함한다.
본 발명의 또다른 특별한 치료 항체는 (a) 가변 영역이 서열 9 및 서열 11 각각에 기재된 뉴클레오티드 서열 및 그의 보존적 서열 변형체를 포함하는 인간 중쇄 및 인간 경쇄 핵산에 의해 코딩되거나 (b) 서열 10 및 서열 12 각각에 나타낸 아미노산 서열 및 그의 보존적 서열 변형체를 포함하는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 모노클로날 항체 5F11 및 기능적 등가 항체를 포함한다.
또한, 인간 CD30상에서 항체 17G1, 2H9 또는 5F11에 의해 한정되는 에피토프에 결합하는 항체 및(또는) CD30에 대한 결합에 대하여 항체 17G1, 2H9 또는 5F11과 경쟁하거나 항체 17G1, 2H9 또는 5F11에 의해 발휘되는 기타 기능적 결합 특성을 보유하는 항체도 본 발명에 포함된다. 이러한 항체는 CD30에 해리 평형 상수 (Kd) 대략 10-11 M 및(또는) 결합 평형 상수 (Ka) 약 107 M-1 이상으로 결합하는 항체를 포함한다. 또한, 이러한 항체는 관련된 세포-표면 항원과 교차 반응하지 않아서 그들의 기능을 억제하지 않는 항체도 포함한다.
본 발명의 다른 특별한 인간 항체는 인간 중쇄 및 경쇄 CDR1 영역, 인간 중쇄 및 경쇄 CDR2 영역 및 인간 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역을 보유하는 CDR 도메인을 포함하며, 이때 (a) 인간 중쇄 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 도 7 (각각 서열 16, 서열 17 및 서열 18), 도 9 (각각 서열 28, 서열 29 및 서열 30) 및 도 11 (각각 서열 40, 서열 41 및 서열 42)에 나타낸 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열 및 그의 보존적 서열 변형체로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, (b) 인간 경쇄 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 도 8 (각각 서열 22, 서열 23 및 서열 24), 도 10 (각각 서열 34, 서열 35 및 서열 36) 및 도 12 (각각 서열 46, 서열 47 및 서열 48)에 나타낸 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열 및 그의 보존적 서열 변형체로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 항체를 포함한다. 별법으로, 본 발명의 특별한 인간 항체는 도 7 내지 도 12 (서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 46, 서열 47 및 서열 48)에 나타낸 CDR1, CDR2 및 CDR3 영역의 아미노산 서열과의 상동성이 80％ 이상, 바람직하게는 85％ 이상, 더욱 바람직하게는 90％, 95％, 98％ 및 99％ 이상인 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 및 경쇄 CDR1 영역, 인간 중쇄 및 경쇄 CDR2 영역 및 인간 중쇄 및 경쇄 CDR3 영역을 보유하는 CDR 도메인을 포함하는 항체를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 CD30에 결합하여 CD30에 대한 CD30 리간드의 결합을 부분적으로 또는 완전히 차단함으로써 CD30의 기능 (예를 들어 CD30에 의해 매개되는 효과)을 억제한다. CD30 리간드의 예로는 CD153, TRAF1, TRAF2, TRAF3 및 TRAF5 등이 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체는 하나 이상의 하기 성질을 특징으로 할 수 있다:
a) CD30에 대한 특이성;
b) CD30에 대하여 친화도 상수 약 107 M-1 이상, 바람직하게는 약 108 M -1 이 상, 더욱 바람직하게는 약 109 M-1 내지 1010 M-1 이상의 결합 친화도;
c) CD30과의 결합 상수 (Kassoc)가 약 103 M-1S-1 이상, 더욱 바람직하게는 약 104 M-1S-1 이상, 가장 바람직하게는 약 105 M-1S -1 이상;
d) CD30으로부터의 해리 상수 (Kdis)가 약 10-3 s-1, 바람직하게는 약 10 -4 s-1, 더욱 바람직하게는 10-5 s-1, 가장 바람직하게는 10-6 s-1;
e) CD30-발현 세포를 옵소닌화 (opsonize)하는 능력 또는
f) 약 10 ㎍/㎖ 이하 농도의 인간 이펙터 세포 존재하에 CD30-발현 세포 (예컨대 종양 세포)의 성장을 억제하고(하거나) 그의 식작용 및 사멸을 매개하는 능력 (예컨대 시험관내).
본 발명의 인간 항-CD30 항체는 숙주 세포 (예컨대 CHO 세포 또는 림프구성 세포)에서 재조합적으로 생산할 수도 있고 또는 상기 항체를 발현하는 하이브리도마 (즉, 상기 항체를 코딩하는 인간 중쇄 트랜스진 (transgene) 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 보유하는 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득하여 불멸화 세포에 융합시킨 B 세포를 포함함)로부터 직접 수득할 수 있다. 특별한 실시양태에서, 본원에서 17G1 (서열 1 내지 서열 4), 2H9 (서열 5 내지 서열 8) 및 5F11 (서열 9 내지 서열 12)로 지칭되는 항체는 하이브리도마에 의해 생성된다.
또다른 측면에서, 본 발명은 CD30에 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 트랜스제닉 마우스 (본원에서는 "HuMAb 마우스"라고도 지칭하기도 함)와 같은 트랜스제닉 비-인간 동물을 제공한다. 특별한 실시양태에서, 상기 트랜스제닉 비-인간 동물은 본 발명에 따른 항체의 전체 또는 일부를 코딩하는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 보유하는 트랜스제닉 마우스이다. 상기 트랜스제닉 비-인간 동물은 CD30 항원 및(또는) CD30-발현 세포가 정제되어 있거나 풍부한 제제로 면역화시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스는 V-D-J 재조합 및 이소형 전환을 통해 CD30에 대한 인간 모노클로날 항체의 많은 이소형 (예를 들어 IgG, IgA 및(또는) IgM)을 생산할 수 있다. 이소형 전환은 예를 들어 고전적 이소형 전환 또는 비-고전적 이소형 전환에 의해 일어날 수 있다.
따라서, 본 발명은 또다른 측면에서 상기한 바와 같이 인간 항-CD30 항체를 발현하는 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 단리한 B-세포를 제공한다. 이어서, 상기 단리된 B-세포를 불멸화 세포와의 융합으로 불멸화시켜 인간 항-CD30 항체의 공급원 (예컨대 하이브리도마)을 제공할 수 있다. 이러한 하이브리도마 (즉, 인간 항-CD30 항체를 생산함)도 본 발명의 범위에 속한다.
본원에서 예시한 바와 같이, 본 발명의 인간 항체는 상기 항체를 발현하는 하이브리도마로부터 직접 수득할 수도 있고 또는 클로닝하여 숙주 세포 (예컨대 CHO 세포 또는 림프구성 세포)에서 재조합적으로 발현시킬 수도 있다. 따라서, 본 발명은 또다른 측면에서 인간 CD30에 결합하는 인간 모노클로날 항체의 생산 방법 을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 상기한 바와 같은 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스 (예를 들어 항-CD30 항체의 전체 또는 일부를 코딩하는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 보유함)를 인간 CD30 항원 및(또는) 인간 CD30-발현 세포가 정제되어 있거나 풍부한 제제로 면역화시키는 단계를 포함한다. 이어서, 상기 동물의 B 세포 (예컨대 비장 B 세포)를 수득하여 골수종 세포와 융합시킴으로써 CD30에 대한 인간 모노클로날 항체를 분비하는 불멸 하이브리도마 세포를 형성한다.
또다른 측면에서, 본 발명의 인간 항-CD30 항체를 유도체화시키거나 또다른 기능성 분자, 예를 들어 또다른 펩티드 또는 단백질 (예컨대 Fab' 단편)에 결합시키거나 그와 동시발현시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 그의 항원 결합 부분은 하나 이상의 다른 분자, 예를 들어 또다른 항체 (예컨대 이중특이적 또는 다중특이적 항체), 세포독소, 세포내 리간드 또는 항원 (예를 들어 면역독소 등과 같은 면역접합체 생산을 위함)에 기능적으로 결합될 수 있다 (예를 들어 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 결합 또는 다른 방식으로 결합될 수 있음). 따라서, 본 발명은 CD30-발현 세포에 결합하고, 다른 분자를 CD30-발현 세포에 표적화시키는데 이용될 수 있는 매우 다양한 항체 접합체, 이중특이적 및 다중특이적 분자 및 융합 단백질을 포함한다.
특별한 실시양태에서, 본 발명은 CD30에 대한 하나 이상의 제1 결합 특이성 부위 (예컨대 인간 항-CD30 항체 또는 그의 단편 또는 모방체) 및 인간 이펙터 세포에 대한 제2 결합 특이성 부위, 예를 들어 Fc 수용체에 대한 결합 특이성 부위 ( 예를 들어 인간 Fcγ수용체, 예컨대 FcγRI 또는 인간 Fcα수용체)를 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 제공한다. 전형적으로, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 바람직하게는 인간 항체 또는 그의 일부인 하나 이상의 항체 또는 그의 단편 (예컨대 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv) 또는 "키메라" 또는 "인간화" 항체 또는 그의 일부 (예를 들어 가변 영역 또는 상보성 결정 영역 (CDR)은 비-인간 항체 (예컨대 뮤린)로부터 유래되고 나머지 부분(들)은 인간 기원인 항체)를 포함한다.
따라서, 본 발명은 인간 CD30 및 인간 IgG 수용체 등의 Fc 수용체, 예를 들어 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16) 등과 같은 Fc-감마 수용체 (FcγR) 둘다에 결합하는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다. 다른 Fc 수용체, 예를 들어 인간 IgA 수용체 (예컨대 FcαRI)도 표적화될 수 있다. Fc 수용체는 이펙터 세포, 예를 들어 단핵구, 대식세포 또는 활성화된 단핵 세포의 표면 상에 위치하는 것이 바람직하다. 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 Fc 수용체의 이뮤노글로불린 Fc (예컨대 IgG 또는 IgA) 결합 부위와는 별개인 부위에서 Fc 수용체에 결합한다. 따라서, 이중특이적 및 다중특이적 분자의 결합은 생리적 수준의 이뮤노글로불린에 의해서는 차단되지 않는다.
또다른 측면에서, 본 발명은 CD30-발현 세포를 유효량의 본 발명의 항체, 항체 유도체 또는 다른 치료 조성물과 접촉시켜 상기 세포의 성장이 억제되게 함으로써 CD30-발현 세포의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 이펙터 세포의 존재하에 CD3-발현 세포를 예를 들어 ADCC에 의해 사멸시키는 단계를 포함한다. 또다른 실시양태에서, 상기 방법은 CD3-발현 세포를 식작용에 의해 사멸시키는 단계를 포함한다. CD30을 발현하지는 않지만 예를 들어 구조적으로 관련된 세포-표면 항원을 발현할 수 있는 세포를 사멸시키거나 그의 활성을 억제하지 않으면서 (즉, 관련되어 있으나 기능적으로는 별개인 세포 표면 항원과 교차반응하지 않음) CD3-발현 세포를 사멸시키거나 억제하는 것이 바람직하다. 본 발명의 인간 항체를 사용하여 억제하거나 사멸시킬 수 있는 CD30-발현 세포의 예로는 종양 세포, 골수 세포, 간 세포, 림프절 세포, 피부 세포, 비장 세포, 흉선 세포, 편도 세포, 탈락막 세포, 자궁내막 세포, 호지킨 세포, 리드-스턴버그 세포, 미분화 대세포 림프종 (ALCL) 세포, 다형성 면역아세포성 림프종 세포, T 세포, B 세포, NK 세포 및 단핵구 등이 있다.
따라서, 본 발명의 인간 항체를 CD30에 의해 매개되는 각종 질환을 앓고 있는 환자에게 투여함으로써, 본 발명의 인간 항체를 사용하여 CD30에 의해 매개되는 각종 질환을 치료 및(또는) 예방할 수 있다. 치료 (예컨대 경감) 또는 예방할 수 있는 질환의 예로는 종양형성 질환 및 자가면역 질환 등이 있으나 이에 제한되지 않는다. 치료 및(또는) 예방할 수 있는 종양형성 질환의 예로는 호지킨병, 미분화 대세포 림프종 (ALCL), 성인 T-세포 림프종 (Adult T-cell Lymphoma; ATL), 혈관면역아세포성 림프절증 (AngioImmunoblastic LymphaDenopathy; AILD)-유사 T 세포 림프종, HIV 관련 체강 기재 림프종, 태생기암, 비인강(鼻咽腔)의 미분화 암종 (예컨대 쉬민케 종양), 캐슬맨병, 카포시 육종 및 기타 T-세포 또는 B-세포 림프종 등이 있다. 치료 및(또는) 예방할 수 있는 자가면역 질환의 예로는 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 전신성 경화증, 아토피성 피부염, 그레브스병, 하시모토 갑상선염, 베게너 육아종증, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 전염성 단핵구증, HIV 및 헤르페스 바이러스 관련 질환 등이 있다.
본 발명의 특별한 실시양태에서, 상기 항체를 투여한 대상체는 화학요법제, 방사선 또는 Fcα수용체 또는 Fcγ수용체 등과 같은 Fc 수용체의 발현 또는 활성을 조정하는 (예를 들어 상승시키거나 억제하는) 작용제, 예를 들어 사이토카인을 사용하여 추가로 치료할 수 있다. 치료 동안에 투여하는 전형적인 사이토카인으로는 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 인터페론-γ (IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 (TNF) 등이 있다. 전형적인 치료는 무엇보다도 항-신생물제, 예를 들어 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 술페이트, 카르무스틴, 클로르암부실 및 시클로포스프아미드 히드록시우레아를 포함한다.
CD30을 고도로 발현하지 않는 암 세포에 대한 본 발명의 인간 항-CD30 항체의 치료 효능을 증가시키기 위해서, 상기 항체를 CD30의 발현을 상향 조절하거나 달리 영향을 미치는 작용제, 예를 들어 종양 세포상에서 CD30을 상향 조절하고 CD30이 더욱 균일하게 발현되도록 하게 하는 림포킨 (lymphokine) 제제와 함께 공동 투여할 수 있다. 투여에 적합한 림포킨 제제로는 인터페론-감마, 종양 괴사 인자 및 이들의 배합물 등이 있다. 이들은 정맥내 투여될 수 있다. 림포킨의 적합한 투여량은 전형적으로 환자 1인 당 10,000 내지 1,000,000 유닛의 범위이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 샘플 중의 CD30 존재 여부를 시험관내 또는 생체내 검출하는 방법, 예를 들어 CD30-관련 질환의 진단 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 이는 시험할 샘플 및 또한 경우에 따라서는 대조구 샘플과 본 발명의 인간 모노클로날 항체 (또는 그의 항원 결합 부분)를 상기 항체와 CD30 사이에 복합체가 형성되도록 하는 조건하에서 접촉시켜 수행된다. 이어서, 복합체 형성을 검출한다 (예를 들어 ELISA를 이용함). 대조군 샘플을 시험 샘플과 함께 사용하는 경우에는 이들 샘플 둘다에서 복합체를 검출하며, 이들 샘플 사이에서 복합체 형성과 관련한 임의의 통계적으로 유의한 차이가 시험 샘플 내 CD30 존재에 대한 지표이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 인간 항-CD30 항체 및 그의 일부 (예컨대 그의 가변 영역)를 코딩하는 핵산 분자 및 본 발명의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터 및 상기 벡터로 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 이들 숙주 세포를 배양하여 항체를 생산하는 방법 역시 본 발명에 포함된다. 본 발명에서 제공되는 특별한 핵산은 인간 항-CD30 항체 (HuMab) 17G1의 중쇄 및 경쇄 각각을 코딩하는 서열 1 및 서열 3에 나타낸 뉴클레오티드 서열, 인간 항-CD30 항체 (HuMab) 2H9의 중쇄 및 경쇄 각각을 코딩하는 서열 5 및 서열 7에 나타낸 뉴클레오티드 서열 및 인간 항-CD30 항체 (HuMab) 5F11의 중쇄 및 경쇄 각각을 코딩하는 서열 9 및 서열 11에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 인간 항-CD30 항체 (즉, 이들의 배합물) 및 담체를 포함하는 치료 및 진단 조성물을 제공한다. 특별한 실시양태에 서, 상기 조성물은 하나 이상 다른 치료제, 예를 들어 세포독성제 또는 방사성독성제 또는 CD30 발현 또는 이펙터 세포에서 발현되는 분자의 발현을 상향 조절하는 작용제, 예를 들어 Fc 수용체의 발현을 상향 조절하는 GM-CSF를 추가로 포함한다.
CD30에 의해 매개되는 질환의 생체내 치료 및 예방을 위해서, 본 발명의 인간 항체를 환자 (예컨대 인간 대상체)에게 치료 효과적 투여량으로 임의의 적합한 투여 경로, 예를 들어 주사 및 항체-기재의 임상적 생성물에 대하여 당업계에 공지되어 있는 기타 투여 경로를 이용하여 투여한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 치료제, 예를 들어 세포독성제, 방사성독성제, 화학요법 약물, 면역저해제 또는 소염제, 예를 들어 스테로이드성 및 비-스테로이드성 소염제에 접합된 본 발명의 완전한 인간 항-CD30 항체를 포함하는 면역접합체, 예를 들어 면역독소를 제공한다.
별법으로, 본 발명의 인간 항체는 이러한 치료제 및 세포독성제에 결합되지 않은 채로 이들과 함께 공동 투여될 수 있다. 이들은 상기 작용제와 동시에 공동 투여될 수도 있고 (예를 들어 단일 조성물로 투여되거나 따로 투여됨) 또는 상기 작용제의 투여 전 또는 투여 후에 투여될 수도 있다. 상기한 바와 같이, 이러한 작용제로는 세포독성제, 방사성독성제 또는 화학요법제, 예를 들어 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 술페이트, 카르무스틴, 클로르암부실, 시클로포스프아미드 히드록시우레아 및 이들의 배합물 등을 들 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기하는 상세한 설명 및 실시예로부터 명백할 것이지만, 이들에 제한되지 않는다. 본원 전반에 걸쳐 인용하는 모든 참고문 헌, 특허 및 간행된 특허 명세서의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
도 1은 재조합 CD30에 대한 항-CD30 HuMab인 17G1, 5F11, 2H9 및 이소형 대조군의 투여량-의존성 결합을 비교하는 그래프이다.
도 2는 호지킨 림프종 세포주인 L540에 대한 항-CD30 HuMab인 17G1, 5F11, 2H9 및 이소형 대조군의 투여량-의존성 결합을 비교하는 그래프이다.
도 3은 항-CD30 HuMab인 17G1, 5F11, 2H9 및 이소형 대조군에 의한 L540 호지킨 종양 세포의 단핵 세포-매개된 항체 의존성 세포 매개 세포독성을 비교하는 그래프이다.
도 4는 항-CD30 HuMab인 17G1, 5F11, 2H9 및 이소형 대조군에 의한 L540 호지킨 종양 세포의 단핵구-매개된 항체 의존성 세포 매개 세포독성을 비교하는 그래프이다.
도 5는 HuMab 5F11을 사용한 세포 성장 억제를 나타내는 그래프이다.
도 6은 이종이식된 마우스 모델을 사용한, HuMab 5F11에 의한 CD30-발현 종양 세포의 생체내 성장 억제를 나타내는 그래프이다.
도 7은 HuMab 17G1 VH 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 1) 및 상응하는 아미노산 서열 (서열 2)을 나타낸다. CDR 영역을 표시하였다.
도 8은 HuMab 17G1 VL 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 3) 및 상응하는 아미노산 서열 (서열 4)을 나타낸다. CDR 영역을 표시하였다.
도 9는 HuMab 2H9 VH 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 5) 및 상응하는 아미노산 서열 (서열 6)을 나타낸다. CDR 영역을 표시하였다.
도 10은 HuMab 2H9 VL 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 7) 및 상응하는 아미노산 서열 (서열 8)을 나타낸다. CDR 영역을 표시하였다.
도 11은 HuMab 5F11 VH 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 9) 및 상응하는 아미노산 서열 (서열 10)을 나타낸다. CDR 영역을 표시하였다.
도 12는 HuMab 5F11 VL 영역의 뉴클레오티드 서열 (서열 11) 및 상응하는 아미노산 서열 (서열 12)을 나타낸다. CDR 영역을 표시하였다.
도 13은 배선 (germline) 서열 VH4-34, L15, VH3-11, A27 및 L6 각각의 뉴클레오티드 서열 (서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52 및 서열 53)을 나타낸다.
도 14는 클러스터 A에 대한 항체는 FITC-표지된 HuMab 5F11와 L540 세포의 결합을 억제할 수 있지만, 클러스터 B 또는 클러스터 C에 대한 항체는 억제할 수 없음을 나타내는 그래프이며, 이는 5F11이 클러스터 A 에피토프에 결합하거나 그 근처에 결합한다는 것을 지시한다.
도 15는 파종형 (disseminated) 모델에서 HuMab 5F11 처치가 인간 HL 세포 L540CY를 항원투여 (challenge)한 SCID 마우스의 생존에 미치는 효과를 나타내는 그래프이다.
본 발명은 CD30 및(또는) CD30-발현 세포에 의해 매개되는 각종 장애 (예를 들어 CD30의 증식 효과에 의해 유발되는 장애)를 치료하고 진단하는 개선된 항체-기재 요법을 제공한다. 본 발명의 요법, 특히 인간 요법에서는 CD30 또는 CD30-발현 세포에 결합하여 이들의 기능을 억제하는 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 이용한다.
한 실시양태에서, 상기 인간 항체는 V-D-J 재조합 및 이소형 전환을 통해 CD30에 대한 인간 모노클로날 항체의 다수의 이소형 (예컨대 IgG, IgA 및(또는) IgE)을 생산할 수 있는 비-인간 트랜스제닉 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스에서 생산된다. 따라서, 본 발명의 특별한 측면은 항체, 항체 단편 및 이의 제약 조성물 뿐만이 아니라, 상기 모노클로날 항체를 생산하는 비-인간 트랜스제닉 동물, B-세포 및 하이브리도마까지 포함한다. 본 발명의 항체를 사용하여, CD30-발현 세포를 시험관내 또는 생체내 검출하는 방법 역시 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체를 사용하여 CD30으로 유도된 활성, 예를 들어 증식 활성을 차단하거나 억제하는 방법도 제공되며, 이는 CD30과 관련이 있는 장애, 예를 들어 종양형성 질환 (예컨대 호지킨병) 및 자가면역 질환 (예컨대 HIV)의 치료에 유용하다.
본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해, 먼저 몇가지 용어를 정의한다. 추가의 정의는 발명의 상세한 설명에 기재하였다.
용어 "CD30" 및 "CD30 항원"은 본원에서 서로 혼용되며, 세포에 의해 자연적으로 발현되는 인간 CD30의 임의의 변형체, 이소형 및 종 동족체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체를 CD30-항원에 결합시키면 CD30 리간드와 CD30의 결합이 억제 또는 차단되어 CD30-발현 세포 (예컨대 종양 세포)의 성장이 억제된다. 용어 "CD30 리간드"는 CD30에 대한 모든 리간드 (예컨대 생리적 리간드)를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, CD30 리간드는 CD30L, CD153, TRAF1, TRAF2, TRAF3 또는 TRAF5이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체와 CD30-항원과의 결합은 CD30-발현 세포의 이펙터 세포 식작용 및(또는) 사멸을 매개한다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체와 CD30-항원과의 결합은 CD30-발현 세포의 이펙터 세포 ADCC를 매개한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "성장 억제" (예를 들어 세포의 성장 억제를 지칭함)는 항-CD30 항체와 접촉시킨 세포의 성장이 항-CD30 항체와 접촉시키지 않은 동일 세포의 성장에 비해 임의의 측정가능한 감소, 예를 들어 약 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 99％ 이상 또는 100％ 억제를 나타내는 것을 포함한다.
본원에 지칭하는 바와 같이, 용어 "항체"는 온전한 항체 및 그의 임의의 항원 결합 단편 (즉, "항원 결합 부분") 또는 단일쇄를 포함한다. "항체"는 이황화 결합에 의해 상호결합된 2개 이상의 중쇄 (H) 및 2개 이상의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질을 지칭한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH 1, CH 2 및 CH 3으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인, CL로 구성된다. VH 및 VL 영역 은 상보성 결정 영역 (CDR)이라고 불리는 초가변 영역으로 더 나누어질 수 있는데, 상기 초가변 영역 사이에는 프레임워크 영역 (Framework Region; FR)이라고 불리는, 보존성이 보다 높은 영역이 존재한다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역계의 다양한 세포 (예컨대 이펙터 세포) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분 (Clq) 등을 비롯한 숙주 조직 또는 인자에 대한 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 항체의 "항원 결합 부분" (또는 간단하게 "항체 일부")이라는 용어는 항원 (예컨대 CD30)에 대한 결합력을 보유하는 하나 이상의 항체 단편을 지칭한다. 항체의 항원 결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀진 바 있다. 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH 1 도메인으로 구성된 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH 1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 [Ward et al., (1989) Nature 341:544-546] 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)이 있다. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH는 별개의 유전자에 의 해 코딩되지만, 재조합 방법으로 VL 및 VH 영역이 쌍형성 (pairing)되어 1가 분자 (단일쇄 Fv (scFv)로 공지되어 있음; 예를 들어 문헌 [Bird et al., (1998) Science 242:423-426] 및 [Huston et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참조)를 형성한 단일 단백질 쇄가 되도록 할 수 있는 합성 링커를 통해 이들 2개 도메인을 연결시킬 수 있다. 이러한 단일쇄 항체도 항체의 "항원 결합 부분"이라는 용어에 포함된다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 수득하며, 상기 단편을 무손상 항체의 경우와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝한다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질 결정자를 의미한다. 에피토프는 통상적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같이 분자의 화학적 활성 표면기로 구성되고, 통상적으로는 특이적인 3차원 구조 특성 뿐만 아니라 특이적인 전하 특성을 갖는다. 입체형태 에피토프와 입체형태 에피토프는, 비-입체형태 에피토프와의 결합은 변성 용매의 존재하에 소실되지만, 비-입체형태 에피토프와의 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "결합 억제" 및 "결합 차단"은 예를 들어 CD30에 대한 CD30 리간드의 결합 억제/차단을 지칭한다. 억제/차단은 서로 혼용되며, 부분적 및 완전한 억제/차단 둘다를 포함한다. CD30의 억제/차단은 CD30 결합이 CD30으로 유도된 증식의 억제와 같은 억제 또는 차단없이 일어나는 경우에 발생하는 정상 수준 또는 정상 유형의 활성을 감소시키거나 변경시키는 것이 바람직하 다. 또한, 억제 및 차단은 CD30을 항-CD30 항체와 접촉시킨 경우에, CD30과 그의 수용체의 결합 친화도가 CD30을 항-CD30 항체와 접촉시키지 않은 경우에 비해 임의의 측정가능한 감소, 예를 들어 약 10％ 이상, 20％ 이상, 30％ 이상, 40％ 이상, 50％ 이상, 60％ 이상, 70％ 이상, 80％ 이상, 90％ 이상, 99％ 이상 또는 100％ 차단을 나타내는 것을 포함한다.
용어 "이중특이적 분자"는 2종의 상이한 결합 특이성 부위를 보유하는 임의의 작용제, 예를 들어 단백질, 펩티드, 단백질 복합체 또는 펩티드 복합체를 포함한다. 예를 들어 상기 분자는 (a) 세포 표면 항원 및 (b) 이펙터 세포의 표면상의 Fc 수용체에 결합하거나 그와 상호작용할 수 있다. 용어 "다중특이적 분자" 또는 "이종특이적 분자"는 2종 초과의 상이한 결합 특이성 부위를 보유하는 임의의 작용제, 예를 들어 단백질, 펩티드, 단백질 복합체 또는 펩티드 복합체를 포함한다. 예를 들어 상기 분자는 (a) 세포 표면 항원, (b) 이펙터 세포 표면 상의 Fc 수용체 및 (c) 하나 이상의 다른 성분에 결합하거나 그와 상호작용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 CD30과 같은 세포 표면 항원, 및 이펙터 세포 상의 Fc 수용체와 같은 다른 표적에 대해 지시된 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 및 기타 다중특이적 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
용어 "이중특이적 항체"는 디아보디 (diabody)를 추가로 포함한다. 디아보디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄에서 발현된 2가의 이중특이적 항체이지만, 동일 쇄에 존재하는 상기 2개 도메인 사이에 쌍형성이 일어나기에는 너무 짧은 링커를 사용하여 상기 도메인들이 또다른 쇄의 상보적 도메인과 쌍을 형성하게 함으로써 2개의 항원 결합 부위가 생성된다 (예를 들어 문헌 [Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448], [Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123] 참조). 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이종항체"는 2종 이상의 항체, 항체 결합 단편 (예컨대 Fab), 그의 유도체 또는 서로 연결된 항원 결합 영역 (이들 중 2종 이상은 상이한 특이성을 가짐)을 지칭한다. 이들 상이한 특이성에는 이펙터 세포 상의 Fc 수용체에 대한 결합 특이성 부위 및 종양 세포 등과 같은 표적 세포 상의 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성 부위가 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 보유하는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발이나 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"에는 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 배선으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열에 이식되어 있는 항체는 포함되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자 제제를 지칭한다. 모노클로날 항체 조성물은 특정 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다. 따라서, 용 어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 보유하는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 보유하는 트랜스제닉 비-인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 마우스로부터 수득한 B 세포를 불멸화 세포에 융합시켜 제조한 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 모든 인간 항체, 예를 들어 (a) 인간 이뮤노글로불린 유전자 (하기 단락 I에서 추가로 기재함)에 대한 트랜스제닉 동물 (예컨대 트랜스제닉 마우스)로부터 단리된 항체, (b) 숙주 세포로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용하여 발현시킨 항체, (c) 재조합의 조합형 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 및 (d) 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열에 스플라이싱 (splicing)하는 것을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리된 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 배선 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 보유한다. 그러나, 특정 실시양태에서는 이러한 재조합 인간 항체를 시험관내 돌연변이유발 (또는 인간 Ig 서열에 대한 트랜스제닉 동물이 사용된 경우에는 생체내 체세포 돌연변이유발)시킬 수 있으며, 이로써 수득한 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은, 인간 배선 VH 및 VL 서열로부터 유래하며 그와 관련되어 있지만 생체내 인간 항체 배선 레퍼토리 (repertoire)에는 자연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다..
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이종 항체"는 이러한 항체를 생산하는 트랜스제닉 비-인간 유기체와 관련하여 정의된다. 상기 용어는 트랜스제닉 비-인간 동물로 구성된 것이 아니라 일반적으로 트랜스제닉 비-인간 동물 종이 아닌 종으로부터 유래된 유기체에 존재하는 것에 상응하는 아미노산 서열 또는 코딩 핵산 서열을 보유하는 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이종하이브리드 항체"는 여러 유기체 기원의 경쇄 및 중쇄를 보유하는 항체를 지칭한다. 예를 들어 뮤린 경쇄와 결합된 인간 중쇄를 보유하는 항체는 이종하이브리드 항체이다. 이종하이브리드 항체의 예로는 전술한 키메라 항체 및 인간화 항체 등이 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된 항체"는 여러가지 항원 특이성을 보유하는 다른 항체가 실질적으로 존재하지 않는 항체를 지칭한다 (예를 들어 CD30에 결합하는 단리된 항체에는 CD30이 아닌 항원과 결합하는 항체는 실질적으로 존재하지 않음). 그러나, 인간 CD30의 에피토프, 이소형 또는 변형체에 결합하는 단리된 항체는 다른 종 (예컨대 CD30 종 동족체)으로부터의 다른 관련 항원에 교차 반응성을 가질 수 있다. 추가로, 단리된 항체는 다른 세포내 물질 및(또는) 화학물질이 실질적으로 존재하지 않을 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상이한 특이성을 보유하는 "단리된" 모노클로날 항체들의 배합물은 잘 규정되어 있는 조성물 중에서 배합한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "특이적 결합"은 소정의 항원에 대한 항체 결합을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 약 1 ×107 M-1 이상의 친화도로 결합하고, 소정의 항원에 대한 결합 친화도가 소정의 항원 또는 밀접하게 관련된 항원이 아닌 비-특이적 항원 (예컨대 BSA, 카제인)에 대한 결합 친화도보다 2배 이상 더 높다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이적인 항체"는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"라는 용어와 혼용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, IgG 항체에 대한 "고친화도"라는 용어는 약 107 M-1 이상, 바람직하게는 약 108 M-1 이상, 더욱 바람직하게는 약 109 M-1 이상, 1010 M-1 이상, 1011 M-1 이상, 예를 들어 1013 M-1까지의 결합 친화도를 지칭한다. 그러나, 다른 항체 이소형에서는 "고친화도" 결합이 달라질 수 있다. 예를 들어 IgM 이소형에 대한 "고친화도" 결합은 약 1 ×107 M-1 이상의 결합 친화도를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Kassoc" 또는 "Ka"는 특정 항체-항원 상호작용의 결합 상수를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Kdis" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "이소형"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예컨대 IgM 또는 IgG1)를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "이소형 전환"은 항체의 클래스 또는 이소형이 어떤 Ig 클래스에서 다른 Ig 클래스로 변화되는 현상을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "전환되지 않은 이소형"은 이소형 전환이 일어나지 않은 경우에 생산되는 중쇄의 이소형 클래스를 지칭하는데, 전환되지 않은 이소형을 코딩하는 CH 유전자는 기능적으로 재배열된 VDJ 유전자의 바로 아래에 위치하는 제1 CH 유전자인 것이 통상적이다. 이소형 전환은 고전적 이소형 전환 또는 비-고전적 이소형 전환으로 분류된다. 고전적 이소형 전환은 트랜스진 내 하나 이상의 전환 서열 영역이 관여하는 재조합 사건에 의해 일어난다. 비-고전적 이소형 전환은 예를 들어 인간 σμ과 인간 Σμ (δ-관련 결실) 사이의 상동성 재조합에 의해 일어날 수 있다. 무엇보다도 트랜스진 사이의 재조합 및(또는) 염색체 사이의 재조합과 같은 별법의 비-고전적 전환 메카니즘이 일어나 이소형 전환을 수행할 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "전환 서열"은 전환 재조합을 담당하는 DNA 서열을 지칭한다. 전형적인 μ전환 영역인 "전환 공여자" 서열은 전환 재조합 동안 결실될 구조물 영역의 5' (즉, 상류)일 것이다. "전환 수용자" 영역은 결실될 구조물 영역과 대체 불변 영역 (예컨대 γ, ε등) 사이에 위치할 것이다. 언제나 재조합이 일어나는 특정한 부위는 없기 때문에, 구조물로부터 최종 유전자 서열을 예측할 수 없는 것이 통상적이다.
본원에 사용된 "글리코실화 패턴"은 단백질, 더욱 구체적으로 이뮤노글로불린 단백질에 공유 결합된 탄수화물 단위의 패턴으로 정의된다. 이종 항체의 글리 코실화 패턴이 트랜스진의 CH 유전자가 유래된 종보다 비-인간 트랜스제닉 동물의 종에서의 글리코실화 패턴과 더 유사하다는 것을 당업자가 인식할 경우, 상기 이종 항체의 글리코실화 패턴은 비-인간 트랜스제닉 동물 종에 의해 생산되는 항체에서의 자연 발생 글리코실화 패턴과 실질적으로 유사하다는 것을 특징으로 할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 어떤 대상물에 적용되는 "자연 발생"이라는 용어는 상기 대상체가 자연계에 존재할 수 있다는 사실을 지칭한다. 예를 들어, 자연계의 공급원으로부터 단리할 수 있고 인간이 실험을 통해 고의로 변형시키지 않은 유기체 (바이러스를 포함함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연 발생적이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재배열된"은 V 절편이 본질적으로 완전한 VH 또는 VL 도메인 각각을 코딩하는 입체형태로 D-J 또는 J 절편과 바로 인접하여 위치하는 중쇄 또는 경쇄 이뮤노글로불린 좌위의 형태를 지칭한다. 재배열된 이뮤노글로불린 유전자 좌위는 배선 DNA와 비교하여 확인할 수 있고, 재배열된 좌위에는 하나 이상의 재조합 7량체/9량체 상동성 요소가 있을 것이다.
본원에서 V 절편에 대해 사용된 바와 같이, 용어 "재배열되지 않은" 또는 "배선 형태"라는 용어는 V 절편이 D 또는 J 절편에 바로 인접하도록 재조합되지 않은 형태를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포 함한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 이중 가닥 DNA인 것이 바람직하다.
CD30에 결합하는 항체 또는 항체 일부 (예컨대 VH, VL, CDR3)를 코딩하는 핵산에 대해 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "단리된 핵산 분자"는, 항체 또는 항체 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 CD30이 아닌 항원과 결합하는 항체 또는 항체 일부를 코딩하며 인간 게놈 DNA에서는 이 핵산을 자연적으로 플랭킹 (flanking)할 수 있는 다른 뉴클레오티드 서열이 존재하지 않는 핵산 분자를 지칭한다. 한 실시양태에서, 인간 항-CD30 항체 또는 그의 일부는 17G1, 2H9 또는 5F11의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 및 각각 서열 1과 서열 2, 서열 5와 서열 6 및 서열 9와 서열 10으로 나타낸 서열을 보유하는 중쇄 (VH) 가변 영역과 각각 서열 3과 서열 4, 서열 7과 서열 8 및 서열 11과 서열 12로 나타낸 서열을 보유하는 경쇄 (VL) 가변 영역을 포함한다.
본원에 개시되고 청구된 바와 같이, 서열 1 내지 서열 12에 기재된 서열은 "보존적 서열 변형", 즉, 상기 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되거나 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 유의하게 영향을 미치거나 상기 특성을 유의하게 변경시키지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 변형을 포함한다. 이러한 보존적 서열 변형은 뉴클레오티드 및 아미노산의 치환, 부가 및 결실을 포함한다. 변형은 부위-지정 돌연변이유발법 및 PCR-매개된 돌연변이유발법 등과 같은 당업계에 공지된 표준 기술에 의해 서열 1 내지 서열 12에 도입될 수 있다. 보존적 아미노산 치 환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 보유하는 아미노산 잔기로 치환되는 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 보유하는 아미노산 잔기의 군은 당업계에 정의되어 있다. 이들 군은 염기성 측쇄를 보유하는 아미노산 (예컨대 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 보유하는 아미노산 (예컨대 아스파르트산, 글루탐산), 비대전된 극성 측쇄를 보유하는 아미노산 (예컨대 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 세스테인, 트립토판), 비극성 측쇄를 보유하는 아미노산 (예컨대 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타-분지된 측쇄를 보유하는 아미노산 (예컨대 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 보유하는 아미노산 (예컨대 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 포함한다. 따라서, 인간 항-CD30 항체에서 비필수라고 예측되는 아미노산 잔기는 동일한 측쇄 군으로부터의 또다른 아미노산 잔기로 치환되는 것이 바람직하다.
별법으로, 또다른 실시양태에서는 예를 들어 포화 돌연변이유발법에 의해 항-CD30 항체 코딩 서열의 전체 또는 일부에 돌연변이가 무작위로 도입될 수 있고, 이로써 생성되는 변형된 항-CD 항체를 결합 활성에 대해 스크리닝할 수 있다.
따라서, 본원에 개시된 (중쇄 및 경쇄 가변 영역) 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되고(되거나) 또는 본원에 개시된 (중쇄 및 경쇄 가변 영역) 아미노산 서열 (즉, 서열 1 내지 서열 12)을 함유하는 항체는 보존적 변형된 유사 서열에 의해 코딩되거나 그를 함유하는 실질적으로 유사한 항체를 포함한다. 이처럼 실질적으로 유사한 항체를 본원에 서열 1 내지 서열 12로서 개시된 부분 (즉, 중쇄 및 경쇄 가변 영역)의 서열에 기초하여 생성할 수 있는 방법에 대한 추가 논의는 하기에 제공 된다.
핵산의 경우에 있어서, 용어 "실질적인 상동성"은 뉴클레오티드가 적당하게 삽입 또는 결실되어 있는 2개 핵산 또는 그의 특정 서열을 최적으로 정렬하여 비교할 때 뉴클레오티드의 약 80％ 이상, 통상적으로는 약 90 내지 95％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 98 내지 99.5％ 이상이 동일함을 나타낸다. 별법으로, 실질적인 상동성은 절편이 선택적인 혼성화 조건하에 상기 가닥의 상보체와 혼성화할 때 존재한다.
2개 서열 사이의 동일성(％)은 갭 (gap)의 수 및 각 갭의 길이를 고려하면서 2개 서열을 최적으로 정렬할 때 도입할 필요가 있는 서열이 공유하는 동일 위치의 수에 대한 함수이다 (즉, 상동성(％) = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 ×100). 서열의 비교 및 2개 서열 사이의 동일성(％) 측정은 하기하는 비제한적 실시예에 기재된 바와 같이 수학적인 알고리즘을 이용하여 수행할 수 있다.
2개 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성(％)은 GCG 소프트웨어 팩키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 중의 GAP 프로그램으로 NWSgapdna.CMP 메트릭스, 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하여 측정할 수 있다. 2개 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성(％)은 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)에 도입된 이. 메이어스 (E. Meyers) 및 더블유. 밀러 (W. Miller)의 알고리즘 [Comput. Appl. Biosci. 4:11-17 (1988)]으로 PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 패널티 및 4의 갭 패널티를 사용하여 측정할 수도 있다. 또한, 2개 아미노산 서열 사이의 동일성(％)은 GCG 소프트웨어 팩키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 중의 GAP 프로그램에 도입된 니들만 (Needleman) 및 웬치 (Wunsch)의 알고리즘 [J Mol. Biol. 48:444-453 (1970)]으로 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하여 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 및 단백질 서열을 "의문 서열"로서 추가로 사용하여 공공 데이타베이스를 검색함으로써 예를 들어 관련된 서열을 확인할 수 있다. 이러한 검색은 문헌 [Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 이용하여 수행할 수 있다. NBLAST 프로그램 (점수 = 100, 단어길이 = 12)으로 BLAST 뉴클레오티드를 검색하여 본 발명의 핵산 분자와 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. XBLAST 프로그램 (점수 = 50, 단어길이 = 3)으로 BLAST 단백질 검색을 수행하여 본 발명의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교하기 위한 갭 정렬을 얻기 위해서는 갭 BLAST를 문헌 [Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 이용할 경우, 각 프로그램 (예컨대 XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다. http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조한다.
핵산은 온전한 세포, 세포 용해물, 또는 부분 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩 (banding), 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 공지된 기타 기술을 비롯한 표준 기술에 의해 다른 세포내 성분 또는 다른 오염물질, 예를 들어 다른 세포 내 핵산 또는 단백질로부터 분리되어 정제된 경우 "단리된" 또는 "실질적으로 순수한" 형태가 된다 [F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)].
cDNA, 게놈 또는 그의 혼합물로부터의 본 발명의 핵산 조성물은 종종 천연 서열로 존재하지만 (변형된 제한 부위 등은 제외함), 표준 기술에 따라 이를 돌연변이시킨 유전자 서열을 제공할 수 있다. 코딩 서열의 경우, 이러한 돌연변이는 아미노산 서열에 원하는 바에 따라 영향을 미칠 수 있다. 특히, 천연 V, D, J 서열, 불변 서열 및 전환 서열 및 본원에 기재된 이러한 기타 서열과 실질적으로 상동성이 있거나 이들로부터 유래된 DNA 서열도 고려된다 (여기서, "유래된"은 한 서열이 또다른 서열과 동일하거나 그로부터 변형된 것임을 의미함).
핵산은 또다른 핵산 서열과 기능적 관계를 갖도록 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서가 코딩 서열의 전사에 영향을 준다면 이들은 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 전사 조절 서열의 경우, 작동가능하게 연결되어 있다는 것은 연결된 DNA 서열이 인접해 있고, 필요한 경우에는 2개의 단백질 코딩 영역이 인접하여 리딩 프레임으로 연결되어 있다는 것을 의미한다. 전환 서열의 경우, 작동가능하게 연결되어 있다는 것은 상기 서열이 전환 재조합을 수행할 수 있음을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 연결된 또다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 유형 중 하나는 추가 DNA 절편이 라이게이션될 수 있는 원형 이중가닥 DNA 루프를 지칭하는 "플라스미드"이다. 또다른 벡터 유형은 바이러스 벡터인데, 이 벡터에서는 추가 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 특정 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제될 수 있다 (예컨대 박테리아 복제 기원을 보유하는 박테리아 벡터 및 에피솜형 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예컨대 비-에피솜형 포유동물 벡터)도 숙주 세포로의 도입시에 숙주 세포의 게놈에 통합되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 추가로, 몇몇 벡터는 이들과 작동가능하게 연결된 유전자를 발현시킬 수 있다. 본원에서는 이러한 벡터를 "재조합 발현 벡터" (또는 간단하게 "발현 벡터")라고 지칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 벡터 형태이므로, 본 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 혼용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 바이러스 벡터 (예컨대 복제 결핍 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같이 동등한 기능을 수행하는 다른 형태의 발현 벡터도 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단하게 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 지칭한다. 이러한 용어는 특정 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손까지 지칭하는 것으로 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경적인 영향으로 인해 이후 세대에서 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 사실상 이러한 자손은 모(母) 세포와 동일하지 않을 수 있지만 본원에 사용된 "숙주 세포"라는 용어의 범위에 여전히 포함된다. 재조합 숙주 세포는 예를 들어 CHO 세포 및 림프구 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "트랜스펙토마 (trasnfectoma)"는 CHO 세 포 또는 NS/0 세포와 같은 항체를 발현하는 재조합 진핵 숙주 세포를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"는 임의의 인간 또는 비-인간 동물을 포함한다. "비-인간 동물"이라는 용어는 모든 척추동물, 예를 들어 포유동물 및 비-포유동물, 예를 들어 비-인간 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다.
용어 "트랜스제닉 비-인간 동물"은 하나 이상의 인간 중쇄 및(또는) 경쇄 트랜스진 또는 트랜스염색체 (transchromosome) (동물의 천연 게놈 DNA에 통합되거나 통합되지 않음)를 포함하며 인간 항체를 완전히 발현할 수 있는 게놈을 보유하는 비-인간 동물을 지칭한다. 예를 들어, 트랜스제닉 마우스는 인간 경쇄 트랜스진 및 인간 중쇄 트랜스진이나 인간 중쇄 트랜스염색체를 보유할 수 있어서, 상기 마우스는 CD64 항원 및(또는) CD64-발현 세포로 면역화되는 경우에 인간 항-CD64 항체를 생성한다. 인간 중쇄 트랜스진은 트랜스제닉, 예를 들어 HuMAb 마우스의 경우에서와 같이 마우스의 염색체 DNA로 통합될 수도 있고 인간 중쇄 트랜스진은 WO 02/43478에 기재된 바와 같이 트랜스염색체 (예컨대 KM) 마우스의 경우에서와 같이 염색체외에서 유지될 수도 있다. 이러한 트랜스제닉 및 트랜스염색체 마우스는 V-D-J 재조합 및 이소형 전환을 수행함으로써 CD64에 대한 인간 모노클로날 항체의 여러 이소형 (예컨대 IgG, IgA 및(또는) IgE)을 생성할 수 있다.
본 발명의 다양한 측면을 하기 단락에 더욱 상세하게 기재하였다.
I. CD 30에 대한 인간 항체의 생산
본 발명의 모노클로날 항체 (MAb)는 통상적인 모노클로날 항체 생산기술, 예 를 들어 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495]의 표준 체세포 혼성화 기술 등을 비롯한 다양한 기술로 생산할 수 있다. 체세포 혼성화 방법이 바람직하지만, 원칙적으로는 모노클로날 항체를 생산하는 다른 기술, 예를 들어 B 림프구의 바이러스 또는 종양유전자 형질전환을 이용할 수도 있다.
하이브리도마 제조에 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 제조는 매우 잘 확립된 방법이다. 융합을 위한 면역화 비장세포를 단리하는 면역화 프로토콜 및 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예컨대 뮤린 골수종 세포) 및 융합 방법도 공지되어 있다.
바람직한 실시양태에서, CD30에 대한 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템이 아니라 인간 면역계의 일부를 수반하는 트랜스제닉 마우스를 이용하여 생성시킬 수 있다. 본원에서 "HuMAb" 마우스라고 지칭하는 이들 트랜스제닉 마우스는, 내인성 μ쇄 및 κ쇄 좌위를 불활성화시키는 표적 돌연변이와 함께, 재배열되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니좌위 (miniloci)를 함유한다 [Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474):856-859]. 따라서, 상기 마우스는 마우스의 IgM 또는 κ의 발현이 감소된 것으로 나타나고, 면역화에 반응하여 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진에서 클래스 전환 및 체세포 돌연변이가 일어나 고친화도의 인간 IgGκ모노클로날 항체가 생산된다 ([Lonberg, N. et al. (1994), 상기 문헌 ([Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101]에서 검토됨)], [Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93] 및 [Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764:536-546]). HuMAb 마우스의 제조는 하기 단락 II 및 문헌 ([Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295], [Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5:647-656], [Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:3720-3724], [Choi et al., (1993) Nature Genetics 4:117-123], [Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12:821-830], [Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920], [Lonberg et al., (1994) Nature 368 (6474):856-859], [Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101], [Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6:579-591], [Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13:65-93], [Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764:536-546], [Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851])에 상세하게 기재되어 있고, 상기 모든 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 또한, 론버그 (Lonberg) 및 카이 (Kay) 및 젠팜 인터내셔날 (GenPharm International)의 미국 특허 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,625,126호, 동 제5,633,425호, 동 제5,789,650호, 동 제5,877,397호, 동 제5,661,016호, 동 제5,814,318호, 동 제5,874,299호 및 동 제5,770,429호; 수라니 (Surani) 등의 국 특허 제5,545,807호; 1998년 6월 11일자로 공개된 WO 98/24884; 1994년 11월 10일자로 공개된 WO 94/25585; 1993년 6월 24일자로 공개된 WO 93/1227; 1992년 12월 23일자로 공개된 WO 92/22645; 1992년 3월 19일자로 공개된 WO 92/03918도 참조할 수 있는데, 상기 모든 문헌의 개시 내용은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 별법으로, 실시예 2에 기재된 HCO12 트랜스제닉 마우스를 이용하여 인간 항-CD30 항체를 생성할 수 있다.
HuMAb 면역화
문헌 [Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474); 856-859], [Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851] 및 WO 98/24884)에 기재된 바와 같이, CD30에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위해 HuMAb 마우스를 CD30 항원 및 CD30-발현 세포가 정제되어 있거나 풍부한 제제로 면역화시킬 수 있다. 바람직하게는, 마우스는 제1 주입시에 6 내지 16주령일 것이다. 예를 들어, CD30 항원이 정제되어 있거나 풍부한 제제 (5 내지 20 ㎍) (예를 들어 CD30-발현 LNCaP 세포로부터 정제됨)를 사용하여 HuMAb 마우스를 복강내 면역화시킬 수 있다. CD30 항원이 정제되어 있거나 풍부한 제제를 사용한 면역화가 항체를 생성시키지 않을 경우에는 마우스를 CD30-발현 세포, 예를 들어 종양 세포주로 면역화시켜 면역 반응을 촉진할 수도 있다.
다양한 항원을 사용하여 누적된 경험에서 HuMAb 트랜스제닉 마우스는, 이를 처음에는 프로인트 (Freund's) 완전 아쥬반트 중의 항원으로 복강내 (IP) 면역화시킨 후에 프로인트 불완전 아쥬반트 중의 항원으로 (총 6회까지) 격주로 복강내 면역화하는 경우에 가장 잘 반응하는 것으로 밝혀진 바 있다. 면역 반응은 안와후 채혈로 수득한 혈장 샘플을 사용한 면역화 프로토콜 과정에 걸쳐 모니터링할 수 있다. 혈장을 ELISA (하기에 기재함)에 의해 스크리닝할 수 있고, 항-CD30 인간 이뮤노글로불린의 역가가 충분한 마우스를 융합에 사용할 수 있다. 마우스를 희생시 켜 비장을 적출하기 3일 전에 마우스를 항원으로 정맥내 부스팅 (boosting)시킬 수 있다. 각 항원에 대해 2 내지 3회의 융합을 수행할 필요가 있을 수 있음이 예측된다. 각 항원에 대해 여러 마리의 마우스를 면역화시킬 것이다. 예를 들어, HC07 및 HC012 종의 HuMAb 마우스 총 12마리를 면역화시킬 수 있다.
CD 30에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생성
표준 프로토콜을 기초로 하여 마우스 비장세포를 단리하고 PEG를 사용하여 마우스 골수종 세포주와 융합시킬 수 있다. 이어서, 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체 생산에 대해 스크리닝한다. 예를 들어, 면역화된 마우스로부터 얻은 비장 림프구의 단일 세포 현탁액을 50％ PEG를 사용하여 1/6 수의 P3X63-Ag8.653 비-분비 마우스 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580)와 융합시킨다. 대략 2 ×105개의 세포를 평편 바닥 미량역가 플레이트에 플레이팅한 후, 20％ 태아 클론 혈청, 18％ "653" 조건화 배지, 5％ 오리겐 (이겐 (IGEN) 제품), 4 mM L-글루타민, 1 mM L-글루타민, 1 mM 피루브산나트륨, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 유닛/ml 페니실린, 50 mg/㎖ 스트렙토마이신, 50 mg/㎖ 젠타마이신 및 1 ×HAT (시그마 (Sigma) 제품; HAT는 융합시킨 후 24시간 뒤에 첨가함)이 함유된 선별 배지에서 2주 동안 인큐베이션한다. 2주 후에는 HAT를 HT로 교체한 배지에서 세포를 배양한다. 이어서, ELISA로 개개의 세포를 인간 항-CD30 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 스크리닝한다. 일단 광범위한 하이브리도마 성장이 일어나면, 통상적으로 10 내지 14일 후에 배지를 관찰한다. 항체를 분비하는 하이브리도마를 다시 플레이팅 하여 다시 스크리닝하고, 인간 IgG, 항-CD30 모노클로날 항체에 대해 여전히 양성이면 제한 희석법으로 2회 이상 서브클로닝할 수 있다. 이어서, 안정한 서브클론을 조직 배양 배지 중에서 시험관내 배양하여 소량의 항체를 생산하고, 이를 사용하여 특징을 규명한다.
CD 30에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 트랜스펙토마의 생성
또한, 예를 들어 당업계에 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술과 유전자 형질감염 방법을 병행하여, 본 발명의 인간 항체를 숙주 세포 트랜스펙토마에서 생성할 수 있다 (예를 들어 문헌 [Morrison, S. (1985) Science 229:1202]).
예를 들어 항체 또는 그의 항체 단편을 발현시키기 위해서, 부분 또는 전장 경쇄 및 중쇄를 코딩하는 DNA를 표준 분자 생물학 기술 (예를 들어 PCR 증폭법, 부위-지정 돌연변이유발법)로 수득할 수 있고 발현 벡터에 삽입하여 상기 유전자를 전사 및 번역 제어 서열에 작동가능하게 연결시킬 수 있다. 본원에서, 용어 "작동가능하게 연결"은 항체 유전자를 벡터에 라이게이션시켜 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 항체 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 그의 의도된 기능을 수행하는 것을 의미한다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현 숙주 세포와 상용가능한 것으로 선택한다. 항체 경쇄 유전자 및 항체 중쇄 유전자는 별개의 벡터에 삽입할 수도 있고, 더욱 통상적으로는 상기 2개 유전자 모두를 동일 발현 벡터에 삽입한다. 항체 유전자는 표준 방법 (예를 들어 항체 유전자 단편 및 벡터에 존재하는 상보적 제한 부위의 라이게이션, 또는 제한 부위가 존재하지 않는 경우에는 평활 말단 라이게이션)을 이용하여 발현 벡터에 삽입한다. 본원에 기재된 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역은, 이들을 원하는 이소형의 중쇄 불변 및 경쇄 불변 영역을 이미 코딩하고 있는 발현 벡터에 삽입하여 VH 절편이 벡터 내에서 CH 절편(들)에 작동가능하게 연결되고 VL 절편이 벡터 내에서 CL 절편에 작동가능하게 연결되도록 함으로써 임의의 항체 이소형의 전장 항체 유전자 생성에 사용될 수 있다. 추가로 또는 별법으로, 재조합 발현 벡터는 숙주 세포로부터의 항체 쇄 분비를 용이하게 하는 신호 펩티드를 코딩할 수 있다. 항체 쇄 유전자는 벡터에 클로닝되어 신호 펩티드가 항체 쇄 유전자의 아미노 말단에 프레임내 (in-flame) 연결될 수 있다. 신호 펩티드는 이뮤노글로불린 신호 펩티드 또는 이종 신호 펩티드 (즉, 비-이뮤노글로불린 단백질로부터의 신호 펩티드)일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 항체 쇄 유전자 뿐 아니라 숙주 세포에서 항체 쇄 유전자의 발현을 제어하는 조절 서열을 함유한다. 용어 "조절 서열"은 항체 쇄 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소 (예컨대 폴리아데닐화 신호)를 포함한다. 이러한 조절 서열은 문헌 [Goeddel; Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, Sand Diego, CA (1990)] 등에 기재되어 있다. 당업자라면, 조절 서열의 선택을 포함하는 발현 벡터의 고안이 형질전환될 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 포유동물 숙주 세포에서의 발현에 바람직한 조절 서열은 사이토메갈로바이러스 (CMV), 시미안 바이러스 40 (Simian Virus 40; SV40), 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 주 요 후기 프로모터 (AdMLP)) 및 폴리오마로부터 유래된 프로모터 및(또는) 인핸서 등과 같이 포유동물 세포에서 단백질이 높은 수준으로 발현되도록 하는 바이러스 요소를 포함한다. 별법으로, 비-바이러스 조절 서열, 예를 들어 유비퀴틴 프로모터 또는 β-글로빈 프로모터를 사용할 수도 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 항체 쇄 유전자 및 조절 서열 뿐 아니라 숙주 세포에서의 벡터 복제를 조절하는 서열 (예를 들어 복제 기점) 및 선별가능한 마커 유전자 등의 추가 서열을 함유할 수 있다. 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포의 선택을 용이하게 한다 (예를 들어 액셀 (Axel) 등의 미국 특허 제4,399,216호, 동 4,634,665호 및 동 제5,179,017호 참조). 예를 들어, 전형적으로 선별가능한 마커 유전자는 벡터가 도입된 숙주 세포에 G418, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 약물 대한 내성을 부여한다. 바람직한 선별가능한 마커 유전자는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 유전자 (메토트렉세이트 선별/증폭을 이용하여 dhfr- 숙주 세포에서 사용하기 위함) 및 neo 유전자 (G418 선별을 위함)를 포함한다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 위해, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 발현 벡터(들)은 표준 기술에 의해 숙주 세포로 형질감염된다. 용어 "형질감염"의 다양한 형태는 외인성 DNA를 원핵 또는 진핵 숙주 세포에 도입하는데 통상적으로 이용되는 광범위하게 다양한 기술, 예를 들어 전기천공법, 칼슘-인산염 침전법, DEAE-덱스트란 형질감염법 등을 포함한다. 이론적으로는 본 발명의 항체를 원핵 또는 진핵 숙주 세포 에서 발현시킬 수 있지만, 진핵 세포, 가장 바람직하게는 포유동물 숙주 세포에서 발현시키는 것이 가장 바람직한데, 이는 이러한 진핵 세포, 특히 포유동물 세포가 원핵 세포보다 적절하게 폴딩 (folding)된 면역학적적 활성 항체를 조립하고 분비하기 더 쉽기 때문이다. 항체 유전자의 원핵 발현은 고수율의 활성 항체 생산에 효과적이지 못하다고 보고된 바 있다 [Boss, M.A. and Wood, C.R.(1985) Immunology Today 6:12-13].
본 발명의 재조합 항체 발현에 바람직한 포유동물 숙주 세포로는 예를 들어 문헌 [R.J. Kaufman and P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621]에 기재된 바와 같은 DHFR 선별가능한 마커와 함께 사용되는, 문헌 [Urlaub and Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220]에 기재된 차이니스 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary; CHO) 세포 (dhfr- CHO 세포를 포함함), NSO 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포 등이 있다. 특히, NSO 골수종 세포에 사용하기 위한 또다른 바람직한 발현 시스템은 WO 87/04462, WO 89/01036 및 EP 338,841에 개시된 GS 유전자 발현 시스템이다. 항체 유전자를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포유동물 숙주 세포에 도입하는 경우, 항체는 숙주 세포를 숙주 세포에서 항체가 발현될 만큼 또는 더욱 바람직하게는 숙주 세포가 성장하는 배양 배지 중으로 항체가 분비될 만큼 충분한 시간 동안 배양함으로써 생산된다. 표준 단백질 정제 방법을 이용하여 항체를 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
무손상 항체 발현을 위한 부분 항체 서열의 사용
항체는 주로 6개의 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역 (CDR)에 위치하는 아미노산 잔기를 통해 표적 항원과 상호작용한다. 이러한 이유로, 개개의 항체들 사이에서 CDR 내의 아미노산 서열이 CDR 외의 서열에 비해 더욱 다양하다. CDR 서열은 대부분의 항체-항원 상호작용을 담당하기 때문에, 상이한 성질의 여러가지 항체로부터의 프레임워크 서열에 특이적 천연 발생 항체로부터의 CDR 서열을 이식한 발현 벡터를 제작함으로써 특이적 천연 발생 항체의 성질을 모방하는 재조합 항체를 발현시키는 것이 가능하다 (예를 들어 문헌 [Riechmann, L. et al., 1998, Nature 332 323-327], [Jones, P. et al., 1986, Nature 321:522-525] 및 [Queen, C. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. See. U.S.A. 86:10029-10033] 참조). 이러한 프레임워크 서열은 배선 항체 유전자 서열을 포함하는 공공 DNA 데이타베이스로부터 얻을 수 있다. 이들 배선 서열은 B 세포 성숙 동안 V(D)J 연결에 의해 형성되어 완전 조립된 가변 유전자를 포함하지 않기 때문에 성숙 항체 유전자 서열과는 상이할 것이다. 또한, 배선 유전자 서열은 개개의 가변 영역에 전반에 걸쳐 고친화도의 2차 레퍼토리 항체의 서열과 상이할 것이다. 예를 들어, 체세포 돌연변이는 프레임워크 영역의 아미노-말단 부분에서는 비교적 드물다. 예를 들어, 체세포 돌연변이는 프레임워크 영역 1의 아미노-말단 부분 및 프레임워크 영역 4의 카르복시-말단 부분에서 비교적 드물다. 추가로, 많은 체세포 돌연변이가 항체의 결합 성질을 유의하게 변경시키지 않는다. 이러한 이유 때문에, 원래의 항체와 결합 성질이 유사한 무손상 재조합 항체를 재생성하기 위해 특정 항체의 전체 DNA 서열을 얻을 필요가 없다 (1999년 3월 12일자로 출원한 PCT/US99/05535 참조, 상기 문헌은 본원에 모든 목적으로 참고로 도입됨). 전형적으로, 이러한 목적에는 CDR 영역을 스패닝 (spanning)하는 부분 중쇄 및 경쇄 서열로 충분하다. 부분 서열을 사용하여, 어떠한 배선 가변 및 연결 유전자 절편이 재조합된 항체 가변 유전자에 기여하는지를 결정한다. 이어서, 배선 서열을 사용하여 가변 영역의 손실된 부분을 채운다. 중쇄 및 경쇄 리더 서열은 단백질 성숙 동안 절단되어, 최종 항체의 성질에는 기여하지 않는다. 이러한 이유로, 발현 구조물에는 상응하는 배선 리더 서열을 사용할 필요가 있다. 손실된 서열을 부가하기 위해, 클로닝된 cDNA 서열을 라이게이션 또는 PCR 증폭에 의해 합성 올리고뉴클레오티드와 조합할 수 있다. 별법으로, 전체 가변 영역을 짧은 중첩 올리고뉴클레오티드 세트로서 합성하여 PCR 증폭에 의해 조합하면, 전체의 합성 가변 영역 클론을 생성할 수 있다. 이 방법은 특정 제한 부위를 제거 또는 포함시키거나, 또는 특정 코돈을 최적화시키는 등의 몇가지 이점을 갖는다.
하이브리도마로부터 얻은 중쇄 및 경쇄 전사체의 뉴클레오티드 서열을 사용하여 합성 올리고뉴클레오티드의 중첩 세트를 고안하여, 천연 서열과 동일한 아미노산 코딩능을 보유하는 합성 V 서열을 생성한다. 합성 중쇄 및 카파 쇄 서열은, 올리고뉴클레오티드 합성 및 PCR 증폭을 용이하게 하기 위한 일련의 반복된 뉴클레오티드 염기가 삽입되어 있고, 코작 규칙 (Kozak's rule)에 따른 최적 번역 개시 부위가 혼입되어 있으며 [Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870], HindIII 부위가 번역 개시 부위의 상류에 유전자조작되어 있다는 세가지 측면에서 천연 서열과 상이할 수 있다.
중쇄 및 경쇄 가변 영역 둘다에서, 최적화된 코딩 및 상응하는 비-코딩 가닥 서열은 상응하는 비-코딩 올리고뉴클레오티드의 대략 중간지점에서 30 내지 50 뉴클레오티드에서 분해된다. 따라서, 각각의 쇄에서 올리고뉴클레오티드는 150 내지 400개 뉴클레오티드의 절편을 스패닝하는 중첩 이중 가닥 세트로 조립될 수 있다. 이어서, 풀 (pool)을 주형으로서 사용하여 150 내지 400개 뉴클레오티드의 PCR 증폭 생성물을 생성한다. 전형적으로, 단일 가변 영역 올리고뉴클레오티드 세트를 따로 증폭시켜 2개의 중첩 PCV 생성물이 생성된 2개의 풀로 분리한다. 이어서, 이들 중첩 생성물을 PCT 증폭으로 조합하여 완전한 가변 영역을 형성한다. 또한, PCR 증폭물에 중쇄 또는 경쇄 불변 영역의 중첩 단편 (카파 경쇄의 BbsI 부위 또는 감마 중쇄의 AgeI 부위를 포함함)을 포함시켜 발현 벡터 구조물로 쉽게 클로닝될 수 있는 단편을 생성하는 것이 바람직할 수도 있다.
이어서, 재구성된 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 클로닝된 프로모터, 번역 개시, 불변 영역, 3' 비번역, 폴리아데닐화 및 전사 종결 서열과 조합하여 발현 벡터 구조물을 형성한다. 중쇄 및 경쇄 발현 구조물을 단일 벡터에 조합하여 숙주 세포에 동시 형질감염시키거나, 순차적으로 형질감염시키거나 따로 형질감염시키면, 두 쇄 모두가 융합된 형태로 발현되는 숙주 세포가 형성된다.
인간 IgGκ를 위한 발현 벡터 제작에 사용하기 위한 플라스미드를 하기에 기재한다. PCR 증폭된 V 중쇄 및 V 카파 경쇄 cDNA 서열을 사용하여 완전 중쇄 및 경쇄 미니유전자 (minigene)를 재구성할 수 있도록 플라스미드를 제작하였다. 이 들 플라스미드를 사용하여 인간 또는 키메라 IgG1κ 또는 IgG4κ 항체를 완전히 발현시킬 수 있다. 다른 중쇄 이소형의 발현 또는 람다 경쇄를 포함하는 항체의 발현을 위한 유사한 플라스미드를 제작할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또다른 측면에서는 본 발명의 인간 항-CD30 항체, 예를 들어 17G1, 2H9 또는 5F11의 구조적 특징을 이용하여 CD30에 대한 결합성과 같이 본 발명에 따른 항체의 기능적 성질을 하나 이상 보유하는 구조적으로 관련있는 인간 항-CD30 항체를 생성한다. 더욱 구체적으로, 17G1, 2H9 또는 5F11의 하나 이상의 CDR을 공지된 인간 프레임워크 영역 및 CDR과 재조합적으로 조합하여 본 발명에 따라 재조합으로 유전자조작된 추가의 인간 항-CD30 항체를 생성할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또다른 실시양태에서 (1) 인간 중쇄 프레임워크 영역 및 하나 이상이 도 7, 도 9 또는 도 11에 나타낸 CDR의 아미노산 서열 (서열 16, 서열 17, 서열 18, 서열 28, 서열 29, 서열 30, 서열 40, 서열 41 및 서열 42)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 CDR 및 (2) 인간 경쇄 프레임워크 영역 및 하나 이상이 도 8, 도 10 또는 도 12에 나타낸 CDR의 아미노산 서열 (서열 22, 서열 23, 서열 24, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 46, 서열 47 및 서열 48)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 경쇄 CDR을 포함하며 CD30에 대한 결합력을 보유하는 항체를 제조하는 단계를 포함하는, 항-CD30 항체의 제조 방법을 제공한다. 항체의 CD30 결합력은 실시예에 기재한 바와 같은 표준 결합 분석법 (예컨대 ELISA)을 이용하여 측정할 수 있다.
항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 도메인이 항원에 대한 항체의 결합 특이성/친화도에 있어 특히 중요한 역할을 한다는 것이 당업계에 공지되어 있기 때문에, 상기와 같이 제조된 본 발명의 재조합 항체는 10F8의 중쇄 및 경쇄 CDR3을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 항체는 17G1, 2H9 또는 5F11의 CDR2를 추가로 포함할 수 있다. 항체는 또한 17G1, 2H9 또는 5F11의 CDR1을 추가로 포함할 수 있다. 항체는 CDR의 임의의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또다른 실시양태에서 (1) 인간 중쇄 프레임워크 영역, 인간 중쇄 CDR1 영역, 인간 중쇄 CDR2 영역 및 도 7, 도 9 또는 도 11에 나타낸 17G1, 2H9 또는 5F11의 중쇄 CDR3 (서열 18, 서열 30 또는 서열 42)인 인간 중쇄 CDR3 영역 및 (2) 인간 경쇄 프레임워크 영역, 인간 경쇄 CDR1 영역, 인간 경쇄 CDR2 영역 및 도 8, 도 10 또는 도 12에 나타낸 17G1, 2H9 또는 5F11의 경쇄 CDR3 (서열 24, 서열 36 또는 서열 48)인 인간 경쇄 CDR3 영역을 포함하며 CD30에 결합하는 항-CD30 항체를 추가로 제공한다. 상기 항체는 17G1, 2H9 또는 5F11의 중쇄 CDR2 및(또는) 경쇄 CDR2를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항체는 17G1, 2H9 또는 5F11의 중쇄 CDR1 및(또는) 경쇄 CDR1을 추가로 포함할 수 있다.
상기에 기재된 바와 같이 유전자조작된 항체의 CDR1, CDR2 및(또는) CDR3 영역은 본원에 개시된 17G1, 2H9 또는 5F11의 상기 영역들과 정확하게 동일한 아미노산 서열(들)을 포함할 수 있다. 그러나, 당업자는 17G1, 2H9 또는 5F11의 정확한 CDR 서열과 약간 차이가 있어도 항체의 효과적인 CD30 결합력을 여전히 보유할 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 또다른 실시양태에서, 상기 유전자조작된 항체는 17G1, 2H9 또는 5F11의 하나 이상의 CDR과 예를 들어 95％, 98％ 또는 99.5％ 동일한 하나 이상의 CDR로 구성될 수 있다.
추가로 또는 별법으로, 상기에 기재된 바와 같이 단순히 CD30에 결합하도록 유전자조작된 항체는 예를 들어
(1) 인간 CD30에 대한 결합 및 CD30-발현 종양 세포의 성장 억제;
(2) 인간 CD30에 대한 CD30 리간드의 결합 억제;
(3) 이펙터 세포의 존재하에 CD30-발현 종양 세포의 ADCC 유도;
(4) 대식세포의 존재하에 CD30-발현 종양 세포의 식작용 유도 및(또는)
(5) 평형 상수 (Ka) 108 M-1 이상으로 인간 CD30에 결합함
등과 같은 본 발명에 따른 항체의 다른 기능적 성질을 보유하는지 여부에 따라 선택할 수 있다.
CD 30에 대한 인간 모노클로날 항체 결합의 특징규명
본 발명의 인간 모노클로날 CD30 항체 결합을 특징규명하기 위해서, 면역화된 마우스로부터의 혈청을 예를 들어 ELISA로 시험할 수 있다. ELISA 프로토콜의 전형적인 예에서 (이에 제한되지는 않음), 미량역가 플레이트를 PBS 중 0.25 ㎍/㎖의 정제된 CD30으로 코팅한 후, PBS 중 5％ 소 혈청 알부민으로 차단한다. CD30-면역화된 마우스로부터의 혈장 희석액을 각각의 웰에 가하고 1 내지 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 후에 알칼리성 포스파타제에 접합된 염소 항-인간 IgG Fc-특이적 폴리클로날 시약과 함께 1시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션한다. 세척 후, 플레이트를 pNPP 기질 (1 mg/㎖)로 발색시켜 405 내지 650의 OD에서 분석한다. 최고 역가를 나타낸 마우스를 융합에 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기한 바와 같은 ELISA 분석법을 이용하여 CD30 면역원과의 양성 반응성을 나타내는 하이브리도마를 스크리닝할 수도 있다. CD30에 높은 화학력 (avidity)으로 결합하는 하이브리도마를 서브클로닝하여 추가로 특징규명한다. 모 세포의 반응성 (ELISA에 의해 측정함)을 보유하는 각 하이브리도마로부터 하나의 클론을 선택하여 5 내지 10개의 바이알 세포 뱅크를 제조하여 -140℃에 저장하고 항체를 정제할 수 있다.
인간 항-CD30 항체를 정제하기 위해서, 선별된 하이브리도마를 2 L 스피너 (spinner)-플라스크에서 성장시켜 모노클로날 항체를 정제할 수 있다. 상등액을 여과하고 농축한 후에 단백질 A-세파로스를 사용한 친화성 크로마토그래피 (미국 뉴저지주 피스카타웨이에 소재하는 파마시아 (Pharmacia) 제품)를 수행할 수 있다. 용출된 IgG를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피로 분석하여 순도를 확인할 수 있다. 완충 용액은 PBS로 교환할 수 있으며, 1.43 흡광 계수를 사용한 OD280으로 농도를 측정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하여 -80℃에 저장할 수 있다.
선택된 인간 항-CD30 모노클로날 항체가 특정한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 시판 시약 (미국 일리노이주 록포드에 소재하는 피어스 (Pierce) 제 품)을 사용하여 각 항체를 바이오티닐화시킬 수 있다. 상기한 바와 같이 CD30으로 코팅한 ELISA 플레이트를 사용하여, 표지되지 않은 모노클로날 항체 및 바이오티닐화된 모노클로날 항체를 사용한 경쟁 연구를 수행할 수 있다. 바이오티닐화된 MAb 결합은 스트렙타비딘 알칼리성 포스파타제 프로브로 검출할 수 있다.
정제된 항체의 이소형을 결정하기 위해, 이소형 ELISA를 수행할 수 있다. 예를 들어, 미량역가 플레이트의 웰을 10 ㎍/㎖ 항-인간 Ig로 4℃에서 밤새 코팅할 수 있다. 5％ BSA로 차단한 후, 상기 플레이트를 10 ㎍/㎖ 모노클로날 항체 또는 정제된 이소형 대조군과 상온에서 2시간 동안 반응시킨다. 이어서, 상기 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스파타제에 접합된 프로브와 반응시킬 수 있다. 플레이트를 상기한 바와 같이 발색시켜 분석한다.
CD30을 발현하는 살아있는 세포에 대한 모노클로날 항체의 결합을 입증하기 위해서는 유식세포측정법을 이용할 수 있다. 유식세포측정 프로토콜의 전형적인 예에서 (이에 제한되지는 않음), CD30-발현 세포주 (표준 성장 조건하에 성장시킴)를 0.1％ BSA 및 20％ 마우스 혈청을 함유하는 PBS 중 다양한 농도의 모노클로날 항체와 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후, 세포를 1차 항체 염색시와 동일한 조건하에 플루오레신-표지된 항-인간 IgG 항체와 반응시킨다. 샘플을 단일 세포에 대한 광산란 및 측산란 성질을 이용하는 FACScan 기기로 분석할 수 있다. 형광 현미경을 사용하는 별법의 분석법을 유식세포측정법과 병행하거나 유식세포측정법 대신에 이용할 수 있다. 상기한 바와 정확하게 동일한 방식으로 세포를 염색하여 형광 현미경으로 조사할 수 있다. 이 방법은 개개의 세포를 가시화할 수 있지만, 항원의 밀도에 따라 민감성이 감소될 수 있다.
웨스턴 블럿팅을 이용하여, 항-CD30 인간 IgG를 CD30 항원과의 반응성에 대해 추가로 시험할 수 있다. 예를 들어, CD30-발현 세포로부터의 세포 추출물을 제조하여 나트륨 도데실 술페이트 (SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시킬 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막으로 옮기고 20％ 마우스 혈청으로 차단하고, 시험할 모노클로날 항체로 프로빙 (probing)한다. 인간 IgG 결합을 항-인간 IgG 알칼리성 포스파타제를 사용하여 검출하고 BCIP/NBT 기질 정제 (미국 미주리주 세인트 루이스에 소재하는 시그마 케미칼 컴파니 (Sigma Chem. Co.) 제품)로 발색시킬 수 있다.
CD 30에 대한 인간 모노클로날 항체의 식작용 및 세포 사멸 활성
인간 모노클로날 항-CD30 항체는 CD30에 대한 특이적 결합 뿐 아니라 CD30-발현 세포의 식작용 및 사멸 매개력에 대해 시험할 수도 있다. 모노클로날 항체 활성의 시험관내 시험은 생체내 모델을 시험하기 전의 초기 스크리닝을 제공할 것이다. 요약하자면, 건강한 공여자의 다형핵 세포 (PMN) 또는 다른 이펙터 세포를 피콜 하이파크 (Ficoll Hypaque) 밀도 원심분리한 후에 오염물질인 적혈구를 용해시켜 정제할 수 있다. 세척된 PMN은 10％ 열-불활성화 태아 송아지 혈청으로 보충된 RPMI에 현탁시키고 이펙터 세포 대 종양 세포 (이펙터 세포 : 종양 세포)의 다양한 비율로 51Cr 표지된 CD30-발현 세포와 혼합할 수 있다. 이어서, 정제된 인간 항-CD30 IgG를 다양한 농도로 첨가할 수 있다. 관계없는 인간 IgG를 음성 대조군 으로서 사용할 수 있다. 분석은 37℃에서 4 내지 18시간 동안 수행할 수 있다. 배양 상등액으로의 51Cr 방출량을 측정함으로써 샘플을 세포용해에 관해 분석할 수 있다. 또한, 항-CD30 모노클로날을 서로 배합하여 시험함으로써 여러 모노클로날 항체를 사용하면 세포용해가 향상되는지 여부를 결정할 수도 있다.
또한, CD30에 결합하는 인간 모노클로날 항체를 생체내 모델 (예컨대 마우스)에서 시험하여, CD30-발현 세포, 예를 들어 종양 세포의 식작용 및 사멸을 매개하는 데 있어서의 그의 효능을 결정할 수도 있다. 이들 항체는 예를 들어 하기하는 비-제한적 기준을 기초로 선별할 수 있다:
1) 살아있는 CD30-발현 세포에의 결합;
2) CD30에의 높은 결합 친화도;
3) CD30상의 독특한 에피토프에의 결합 (조합하여 사용될 경우 상보적 활성을 보유하는 모노클로날 항체가 동일한 에피토프에의 결합에 대하여 경쟁할 가능성은 제외함);
4) CD30-발현 세포의 옵소닌화;
5) 인간 이펙터 세포의 존재하에 CD30-발현 세포의 성장 억제, 식작용 및(또는) 사멸의 매개.
본 발명의 바람직한 인간 모노클로날 항체는 상기 기준 중 하나 이상, 바람직하게는 모두를 충족시킨다. 특정 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 예를 들어 2종 이상의 항-CD30 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 포함하는 제약 조성물 로서 배합하여 사용된다. 예를 들면, 단일 요법에서 상이하지만 상보적인 활성을 보유하는 인간 항-CD30 모노클로날 항체를 배합하여 원하는 치료 또는 진단 효과를 달성할 수 있다. 이의 일례는 이펙터 세포의 존재하에 표적 세포의 고도로 효과적인 사멸을 매개하는 항-CD30 인간 모노클로날 항체를 함유하고 CD30-발현 세포의 성장을 억제하는 또다른 인간 항-CD30 모노클로날 항체와 배합된 조성물일 것이다.
II . 인간 모노클로날 항- CD 30 항체를 생성하는 트랜스제닉 비-인간 동물의 생산
다른 측면에서, 본 발명은 CD30에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현시킬 수 있는 트랜스제닉 및 트랜스염색체 비-인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 마우스를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 인간 중쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 보유하는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 마우스를 제공하며, 상기 마우스는 CD30 항원 및(또는) CD30-발현 세포로 면역화되는 경우에 인간 항-CD30 항체를 생성한다. 인간 중쇄 트랜스진은 본원에 상세하게 기재하고 예시한 바와 같은 트랜스제닉 (예컨대 HuMAb) 마우스의 경우와 같이, 마우스의 염색체 DNA로 통합될 수 있다. 별법으로, 인간 중쇄 트랜스진은 WO 02/43478에 기재된 바와 같이 트랜스염색체 (예컨대 KM) 마우스의 경우에서와 같이, 염색체외에서 유지될 수 있다. 이러한 트랜스제닉 및 트랜스염색체 동물은 V-D-J 재조합 및 이소형 전환을 수행함으로써 CD30에 대한 다수의 인간 모노클로날 항체의 여러 이소형 (예컨대 IgG, IgA 및(또는) IgE)을 생산할 수 있다. 이소형 전환은 예를 들어 고전적이거나 비-고전적인 이소형 전환에 의해 발생할 수 있다.
이종 항체 레퍼토리를 보유하는 외래 항원 자극에 대해 반응하는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 비-인간 동물을 고안하기 위해서는, 트랜스제닉 동물 내에 함유된 이종 이뮤노글로불린 트랜스진이 B-세포 발생 경로에 걸쳐 올바르게 작동할 것이 요구된다. 예를 들면, 이는 이종 중쇄 트랜스진의 이소형 전환을 포함한다. 따라서, 트랜스진은 이소형 전환을 수행하고, 하기 중 하나 이상을 나타내는 항체를 생성하도록 제작된다: (1) 고수준의 세포-유형 특이적 발현, (2) 기능적 유전자 재배열, (3) 대립유전자 배재의 활성화 및 이에 대한 반응, (4) 충분한 1차 레퍼토리의 발현, (5) 신호 전달, (6) 체세포 과다변이 및 (7) 면역 반응 동안의 트랜스진 항체 좌위의 우성화.
상기 기준 모두를 충족시킬 필요는 없다. 예를 들면, 트랜스제닉 동물의 내인성 이뮤노글로불린 좌위의 기능이 손상된 이러한 실시양태에서, 트랜스진은 대립유전자 배재를 활성화할 필요가 없다. 추가로, 트랜스진이 기능적으로 재배열된 중쇄 및(또는) 경쇄 이뮤노글로불린 유전자를 포함하는 이러한 실시양태에서, 기능적 유전자 재배열의 두번째 기준은 적어도 트랜스진이 이미 재배열된 경우에는 불필요하다. 분자 면역학의 배경 기술에 관해서는, 문헌 [Fundamental Immunology, 2nd edition (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N.Y.]를 참조한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체 생성에 사용되는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 비-인간 동물은 트랜스제닉 동물의 배선 내에 재배열된 이종 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진, 재배열되지 않은 이종 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진 또는 이들의 조합을 함유한다. 각각의 중쇄 트랜스진은 하나 이상의 CH 유전자를 포함한다. 또한, 중쇄 트랜스진은 트랜스제닉 동물의 B-세포에서 다수의 CH 유전자를 코딩하는 이종 트랜스진의 이소형 전환을 지지할 수 있는 기능적 이소형 전환 서열을 함유할 수 있다. 이러한 전환 서열은 트랜스진 CH 유전자의 공급원 역할을 하는 종 유래의 배선 이뮤노글로불린 좌위에서 자연적으로 발생하는 것일 수 있거나 또는 이러한 전환 서열은 트랜스진 구조물을 수용하게 될 종 (트랜스제닉 동물)에서 발생하는 것들로부터 유래될 수 있다. 예를 들어 트랜스제닉 마우스 생성에 사용되는 인간 트랜스진 구조물은 이 구조물이 마우스 중쇄 좌위에서 자연적으로 발생하는 것과 유사한 전환 서열을 혼입하는 경우, 아마도 마우스 전환 서열은 마우스 전환 재조합효소 시스템과 함께 작동하도록 최적화되어 있지만 인간 전환 서열의 경우에는 그렇지 못할 것이기 때문에, 이소형 전환 사건을 더 높은 빈도로 수행할 수 있다. 전환 서열은 통상의 클로닝 방법에 의해 단리 및 클로닝되거나 또는 이뮤노글로불린 전환 영역 서열에 대한 공개된 서열 정보를 바탕으로 고안된 합성 올리고뉴클레오티드를 중첩시켜 드 노보 (de novo)로 합성할 수 있다 (문헌 [Mills et al., Nucl. Acids Res. 15:7305-7316 (1991)], [Sideras et al., Intl. Immunol. 1:631-642 (1989)]). 상기 트랜스제닉 동물 각각의 경우, 기능적으로 재배열된 이종 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진은 트랜스제닉 동물의 B-세포의 유의한 비율 (10％ 이상)로 발견된다.
본 발명의 인간 모노클로날 항체 생산에 사용되는 트랜스제닉 비-인간 동물 발생에 사용되는 트랜스진은 하나 이상의 가변 유전자 절편, 하나의 다양성 (diversity) 유전자 절편, 하나의 연결 유전자 절편 및 하나 이상의 불변 영역 유전자 절편을 코딩하는 DNA를 포함하는 중쇄 트랜스진을 포함한다. 이뮤노글로불린 경쇄 트랜스진은 하나 이상의 가변 유전자 절편, 하나의 연결 유전자 절편 및 하나 이상의 불변 영역 유전자 절편을 코딩하는 DNA를 포함한다. 경쇄 및 중쇄 유전자 절편을 코딩하는 유전자 절편은 트랜스제닉 비-인간 동물로 구성되지 않은 종으로부터 얻은 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 절편을 코딩하는 DNA로부터 유래되거나 또는 이 DNA와 상응한다는 점에서 트랜스제닉 동물에 대해서 이종성이다. 본 발명의 한 측면에서, 트랜스진은 개별 유전자 절편이 재배열되지 않도록, 즉, 기능적 이뮤노글로불린의 경쇄 또는 중쇄를 코딩하도록 재배열되지 않게 제작한다. 재배열되지 않은 이러한 트랜스진은 V, D 및 J 유전자 절편의 재조합 (기능적 재배열)을 지지하며, 바람직하게는 CD30 항원에 노출되는 경우 트랜스제닉 동물에서 생성된 재배열된 이뮤노글로불린 중쇄 내의 D 영역 유전자 절편의 전부 또는 일부의 혼입을 지지한다.
별법의 실시양태에서, 트랜스진은 재배열되지 않은 "미니좌위"를 포함한다. 이러한 트랜스진은 전형적으로 C, D 및 J 절편의 실질적인 부분 뿐 아니라 V 유전자 절편의 하위군을 포함한다. 이러한 트랜스진 구조물에서, 다양한 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 클래스 전환 영역, RNA 프로세싱에 대한 스플라이스 공여자 및 스플라이스-수용자 서열 및 재조합 신호 등은 이종 DNA로부터 유래된 상응하는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열은 본 발명에 사용된 비-인간 동물과 동일한 종 또는 그와 관련된 종으로부터 얻은 트랜스진 내에 혼입될 수 있다. 예 를 들어 인간 이뮤노글로불린 유전자 절편은 트랜스제닉 마우스에서 사용하기 위한 설치류 이뮤노글로불린 인핸서 서열을 보유하는 트랜스진 내에서 조합될 수 있다. 별법으로, 합성 조절 서열이 포유동물의 게놈에서 자연 발생한다고 공지된 기능적 DNA 서열과 상동성이 없는 경우, 이러한 합성 조절 서열은 트랜스진에 혼입될 수 있다. 합성 조절 서열은 예를 들어 스플라이스-수용자 부위 또는 프로모터/인핸서 모티프의 허용되는 서열을 특정화하는 것과 같은 컨센서스 (consensus) 규칙에 따라 고안된다. 예를 들어 미니좌위는 자연 발생 배선 Ig 좌위에 비해 비필수적인 DNA 일부 (예컨대 개입 서열; 인트론 또는 그의 일부)의 내부 (즉, 그 일부의 말단부는 아님) 결실을 하나 이상 보유하는 게놈 이뮤노글로불린 좌위의 일부를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, CD30에 대한 인간 항체 생성에 사용되는 트랜스제닉 또는 트랜스염색체 동물은 WO 98/24884의 실시예 12에 기재된 트랜스진 (예컨대 pHC1 또는 pHC2)을 1개 카피 이상, 전형적으로 2 내지 10개 카피, 때로는 25 내지 50개 카피 이상 함유하며, 상기 동물을 WO 98/24884의 실시예 5, 6, 8 또는 14에 기재된 경쇄 트랜스진의 단일 카피를 함유하는 동물과 교배하고, 그 자손은 WO 98/24884의 실시예 10에 기재된 JH 결실 동물과 교배한다. 동물을 교배하여 이 세가지 특질 각각에 대한 동형접합체를 만들어 낸다. 이들 동물은 다음의 유전자형을 보유한다: 재배열되지 않은 인간 중쇄 미니좌위의 단일 카피 (염색체 반수체 세트 당) (WO 98/24884의 실시예 12에 기재됨), 재배열된 인간 κ경쇄 구조물의 단일 카피 (염색체 반수체 세트 당) (WO 98/24884의 실시예 14에 기재됨) 및 기능적 JH 절편의 전부가 제거된, 내인성 마우스 중쇄 좌위 각각에서의 결실 (WO 98/24884의 실시예 10에 기재됨). 이러한 동물을 JH 절편의 결실에 대하여 동형접합인 마우스 (WO 98/24884의 실시예 10)와 교배하여 JH 결실에 대하여 동형접합이고 인간 중쇄 및 경쇄 구조물에 대하여는 반접합인 자손을 생산하였다. 생산된 동물에 항원을 주사하고, 이를 사용하여 상기 항원에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산한다.
이러한 동물로부터 단리된 B 세포는 이들이 각 유전자의 단일 카피만을 함유하고 있기 때문에 인간 중쇄 및 경쇄에 대하여 단일특이적이다. 또한, 이들은 내인성 마우스 중쇄 유전자 카피 두개 모두가 WO 98/24884의 실시예 9 및 12에 기재된 바와 같이 도입된 JH 영역에 걸친 결실에 의해 비기능적으로 되기 때문에 인간 또는 마우스 중쇄에 대하여 단일특이적일 것이다. 또한, 재배열된 인간 κ경쇄 유전자의 단일 카피의 발현은 유의한 B 세포의 분획에서 내인성 마우스 κ및 람다 쇄 유전자의 재배열을 대립유전자적 및 이소형적으로 배제할 것이기 때문에, 실질적인 B 세포의 분획은 인간 또는 마우스 경쇄에 대하여 단일특이적일 것이다.
바람직한 트랜스제닉 및 트랜스염색체 비-인간 동물, 예를 들어 마우스는 천연 마우스의 이뮤노글로불린과 이상적으로는 실질적으로 유사한 유의한 레퍼토리를 보유하는 이뮤노글로불린을 생산할 것이다. 따라서, 예를 들어 내인성 Ig 유전자를 불활성화시킨 실시양태에서, 총 이뮤노글로불린 수준은 혈청의 약 0.1 내지 10 mg/㎖, 바람직하게는 0.5 내지 5 mg/㎖, 이상적으로는 약 1.0 mg/㎖ 이상의 범위일 것이다. IgM으로부터 IgG로의 전환을 수행할 수 있는 트랜스진이 트랜스제닉 마우스에 도입된 경우, 성숙 마우스의 혈청내 IgG 대 IgM의 비율은 바람직하게는 약 10 : 1이다. IgG 대 IgM 비율은 미성숙 마우스에서는 훨씬 더 낮을 것이다. 일반적으로, 비장 및 림프절 B 세포의 약 10％ 초과, 바람직하게는 40 내지 80％는 인간 IgG 단백질을 독점적으로 발현시킨다.
레퍼토리는 이상적으로는 천연 마우스에서 나타난 것과 비슷하고, 일반적으로는 약 10％ 이상, 바람직하게는 25 내지 50％ 이상일 것이다. 일반적으로, 약 1,000가지 이상의 상이한 이뮤노글로불린 (이상적으로는 IgG), 바람직하게는 104 내지 106가지 이상의 상이한 이뮤노글로불린이 주로 마우스 게놈 내에 도입된 상이한 V, J 및 D 영역의 수에 따라 생산될 것이다. 이러한 이뮤노글로불린은 전형적으로 고도로 항원성인 단백질, 예를 들어 포도상구균 (Staphylococcus) 단백질 A의 약 절반 이상을 인식할 것이다. 전형적으로, 이뮤노글로불린은 미리 선택된 항원에 대하여 10-7 M 미만, 예를 들어 10-8 M 미만, 10-9 M 미만 또는 10-10 M 미만 또는 그보다 훨씬 낮은 친화도 (KD)를 발휘할 것이다. 몇몇 실시양태에서, 소정의 항원 유형에 대한 항체 반응에서 나타나는 V 유전자의 선택을 제한하기 위해서는 소정의 레퍼토리를 보유하는 비-인간 동물을 발생시키는 것이 바람직할 수 있다. 소정의 레퍼토리를 보유하는 중쇄 트랜스진은 예를 들어 인간에서 소정의 항원 유형에 대 한 항체 반응에 주로 사용되는 인간 VH 유전자를 포함할 수 있다. 별법으로, 몇몇 VH 유전자는 여러가지 이유로 (예를 들어 소정의 항원에 대한 고친화도 V 영역을 코딩할 가능성이 낮기 때문에; 체세포 돌연변이 및 친화도 증대를 수행할 성향이 낮기 때문에; 또는 일부 인간에 대하여 면역원성이기 때문에) 정의된 레퍼토리로부터 배제시킬 수 있다. 따라서, 다양한 중쇄 또는 경쇄 유전자 절편을 함유하는 트랜스진의 재배열에 앞서, 예를 들어 혼성화 또는 DNA 서열분석함으로써 트랜스제닉 동물이 아닌 생물 종으로부터 유래된 상기 유전자 절편을 쉽게 확인할 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 트랜스제닉 및 트랜스염색체 비-인간 동물, 예를 들어 비-인간 마우스는 예를 들어 CD30 항원 및(또는) CD30-발현 세포의 정제된 또는 재조합적 생산으로 면역화할 수 있다. 별법으로, 트랜스제닉 동물은 인간 CD30을 코딩하는 DNA로 면역화할 수 있다. 그 후, 동물은 트랜스진내 전환 재조합 (시스-전환)을 통해 클래스-전환을 경험하여 CD30에 반응성인 이뮤노글로불린을 발현하는 B 세포를 생산할 것이다. 이뮤노글로불린은 인간 항체 (또한 "인간 서열 항체"로도 언급됨)일 수 있으며, 여기서 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 체세포 돌연변이에 의해 유도되는 서열 및 V 영역 재조합 연결부 뿐만 아니라 배선-코딩된 서열을 포함할 수 있는 인간 트랜스진 서열에 의해 코딩되며, 이러한 인간 항체는, 체세포 돌연변이 및 특이한 V-J 및 V-D-J 재조합 연결의 결과로서 다른 비-배선 서열이 존재할 수 있을지라도, 인간 VL 또는 VH 유전자 절편 및 인간 JL 또는 DH 및 JH 절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 것으로 언급될 수 있다. 각 항체 쇄의 가변 영역은 인간 배선 V, J 및 중쇄의 경우 D 유전자 절편에 의해 전형적으로 80％ 이상 코딩되고, 종종 가변 영역의 85％ 이상이 트랜스진 상에 존재하는 인간 배선 서열에 의해 코딩되며, 흔히 가변 영역 서열의 90 또는 95％ 이상이 트랜스진 상에 존재하는 인간 배선 서열에 의해 코딩된다. 그러나, 비-배선 서열은 체세포 돌연변이 및 VJ 및 VDJ 연결에 의해 도입되기 때문에, 인간 서열 항체는 흔히, 마우스의 배선 내의 인간 트랜스진(들)에 존재하는 인간 V, D 또는 J 유전자 절편에 의해 코딩되지 않는 몇몇 가변 영역 서열 (및 보다 덜 흔하게는 불변 영역 서열)을 보유할 것이다. 전형적으로, 이러한 비-배선 서열 (또는 각각의 뉴클레오티드 위치)은 CDR 내 또는 그 근처, 또는 체세포 돌연변이가 클러스터되어 있는 것으로 공지된 영역 내에 클러스터될 것이다.
소정의 항원에 결합하는 인간 항체는, 인간 서열 γ쇄 (예컨대 γ1, γ2a, γ2B 또는 γ3) 및 인간 서열 경쇄 (예컨대 κ)를 포함하는 인간 항체가 생산되도록, 이소형 전환으로부터 생성될 수 있다. 이러한 이소형-전환된 인간 항체는 종종, 특히 2차 (또는 후속) 항원 투여 후 항원에 의한 B 세포의 친화도 성숙 및 선택의 결과로서, 전형적으로는 가변 영역내에, 흔히 CDR의 잔기 약 10개 또는 그 이내에서 하나 이상의 체세포 돌연변이(들)을 함유한다. 이러한 고친화도 인간 항체의 결합 친화도 (KD)는 10-7 M 미만, 예를 들어 10-8 M, 10 -9 M 또는 10-10 M 미만이거나 그보다 훨씬 낮을 수 있다.
본 발명의 또다른 측면은 본원에 기재한 바와 같은 트랜스제닉 또는 트랜스 염색체 비-인간 동물로부터 유래된 B 세포를 포함한다. B 세포는 인간 CD30에 고친화도 (예컨대 10-7 M 미만)로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마 생성에 사용할 수 있다. 따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 분석물로서 재조합 인간 CD30을 사용하고 인간 CD30을 결합시키기 위한 리간드로서 상기 항체를 사용하여 비아코어 (BIACORE) 3000 기기에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 기술로 측정하였을 때, 친화도 (KD)가 10-7 M 미만, 예를 들어 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만이거나 그보다 훨씬 낮은 인간 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공하며, 여기서 항체는
(1) 인간 VL 유전자 절편 및 인간 JL 절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 보유하는 경쇄 가변 영역 및 (2) 인간 CL 유전자 절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 보유하는 경쇄 불변 영역으로 구성된 인간 경쇄 서열 및
(1) 인간 VH 유전자 절편, 임의로 D 영역 및 인간 JH 절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 보유하는 중쇄 가변 영역 및 (2) 인간 CH 유전자 절편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 보유하는 불변 영역으로 구성된 인간 중쇄 서열
을 포함한다.
CD30에 대한 고친화도 인간 모노클로날 항체의 개발은 통합된 인간 이뮤노글로불린 트랜스진을 포함하는 게놈을 보유하는 트랜스제닉 비-인간 동물에서 인간 가변 영역 유전자 절편의 레퍼토리를 확장하는 방법에 의해 용이해질 수 있으며, 이 방법은 상기 통합된 인간 이뮤노글로불린 트랜스진에 존재하지 않는 V 영역 유전자 절편을 포함하는 V 유전자 트랜스진을 게놈 내로 도입하는 것을 포함한다. V 영역 트랜스진은 V 유전자 절편이 손상되거나 결실되어 있을 수 있는 인간 VH 또는 VL (VK) 유전자 절편 배열물의 일부를 포함하는 효모 인공 염색체 (Yeast Artificial Chromosome; YAC)인 경우가 종종 있으며, 이는 인간 게놈에서 자연적으로 발생하거나 또는 재조합 방법에 의해 별도로 스플라이싱될 수 있기 때문이다. YAC 상에는 종종 5개 이상의 기능성 V 유전자 절편이 함유되어 있다. 이러한 변형법에서는 V 레퍼토리 확장 방법에 의해 생산되며 V 영역 트랜스진 상에 존재하는 V 영역 유전자 절편에 의해 코딩된 가변 영역 서열 및 인간 Ig 트랜스진 상에서 코딩된 C 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 쇄를 발현하는 트랜스제닉 동물을 생성할 수 있다. V 레퍼토리 확장 방법에 의해, 5개 이상의 별개의 V 유전자를 보유하는 트랜스제닉 동물을 생성할 수 있으며, 약 24개 이상의 V 유전자를 함유하는 동물도 생성할 수 있다. 몇몇 V 유전자 절편은 비-기능적일 수 있으며 (예컨대 슈도진 (pseudogene) 등), 이러한 절편은 유지시킬 수도 있고 또는 원한다면 당업자에게 이용가능한 재조합 방법을 통해 선택적으로 결실시킬 수도 있다.
마우스 배선을, J 및 C 유전자 절편을 함유하는 인간 Ig 트랜스진에는 실질 적으로 존재하지 않는 확장된 V 절편 레퍼토리를 보유하는 기능적 YAC를 함유하도록 유전자조작한다면, 상기 형질 (trait)은 확장된 V 절편 레퍼토리를 보유하는 기능적 YAC가 상이한 인간 Ig 트랜스진을 보유하는 비-인간 동물 배선 내로 혼입된 경우의 백그라운드 (background)를 비롯한 다른 유전자 백그라운드로 전달되어 혼입될 수 있다. 확장된 V 절편 레퍼토리를 보유하는 다수의 기능적 YAC는 배선 내로 혼입되어 인간 Ig 트랜스진 (또는 다수의 인간 Ig 트랜스진)과 함께 작동할 수 있다. 본원에서는 YAC 트랜스진이라고 지칭하지만, 이러한 트랜스진이 게놈 내로 통합되는 경우에는 효모에서의 자율 복제에 필요한 서열 등의 효모 서열이 실질적으로 결실되어 있을 수 있으며, 이러한 서열은 효모에서의 복제가 더 이상 필요하지 않게 된 후 (즉, 마우스 ES 세포 또는 마우스 전접합체로의 도입 이점)에 유전자 조작 (예컨대 제한 소화 및 펄스-필드 (pulsed-field) 겔 전기영동 또는 다른 적합한 방법)에 의해 임의로 제거될 수 있다. 인간 이뮤노글로불린 서열 발현의 형질을 전달하는 방법은 인간 Ig 트랜스진(들) 및 임의로는 확장된 V 절편 레퍼토리를 보유하는 기능적 YAC까지 보유하는 트랜스제닉 동물을 사육하는 것을 포함한다. YAC상에는 VH 및 VL 유전자 절편이 둘다 존재할 수 있다. 이 트랜스제닉 동물을, 인간 Ig 트랜스진 및(또는) 인간의 다른 림프구 단백질을 코딩하는 트랜스진을 비롯한 인간의 다른 트랜스진을 보유하는 백그라운드 등을 비롯하여 당업자가 원하는 임의의 백그라운드로 혼입시킬 수 있다. 본 발명은 또한 확장된 V 영역 레퍼토리 YAC 트랜스진을 보유하는 트랜스제닉 마우스에 의해 생산되는 고친화도 인간 서 열 이뮤노글로불린을 제공한다. 상기에는 본 발명의 인간 모노클로날 항체 생산에 사용되는 트랜스제닉 동물의 바람직한 실시양태를 기재하였으나, 본 발명에서는 하기의 4가지 카테고리로 분류된 다른 실시양태도 고려한다:
I. 재배열되지 않은 중쇄 및 재배열된 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 동물,
II. 재배열되지 않은 중쇄 및 재배열되지 않은 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 동물,
III. 재배열된 중쇄 및 재배열되지 않은 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 동물 및
IV. 재배열된 중쇄 및 재배열된 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 함유하는 트랜스제닉 동물.
이러한 트랜스제닉 동물의 카테고리 중에서, 바람직한 우선 순서는 II > I > III > IV (여기서, 내인성 경쇄 유전자 (또는 적어도 K 유전자)는 상동성 재조합 (또는 다른 방법)에 의해 넉아웃 (knock out)됨) 및 I > II > III > IV (여기서, 내인성 경쇄 유전자는 넉아웃되지 않았으며, 대립유전자 배제에 의해 우성화되어야 함)이다.
III. CD 30에 결합하는 이중특이적 / 다중특이적 분자
본 발명의 또다른 실시양태에서, CD30에 대한 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 유도체화시키거나 또는 다른 기능성 분자, 예를 들어 다른 펩티드 또는 단백질 (예컨대 Fab' 단편)에 연결하여 다수의 결합 부위 또는 표적 에 피토프에 결합하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 생성시킬 수 있다. 예를 들어 본 발명의 항체 또는 항원 결합 부분은 하나 이상의 다른 결합 분자, 예를 들어 또다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 기능적으로 결합될 수 있다 (예를 들어 화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 결합 또는 다른 방식으로 결합될 수 있음).
따라서, 본 발명은 CD30에 대한 하나 이상의 제1 결합 특이성 부위 및 제2 표적 에피토프에 대한 제2 결합 특이성 부위를 포함하는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 제2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들어 인간 FcγRI (CD64) 또는 인간 Fcα 수용체 (CD89)이다. 따라서, 본 발명은 FcγR, FcαR 또는 FcεR 발현 이펙터 세포 (예컨대 단핵구, 대식세포 또는 다형핵 세포 (PMN)) 및 CD30을 발현하는 표적 세포 둘다에 결합할 수 있는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다. 이러한 이중특이적 및 다중특이적 분자는 CD30-발현 세포를 이펙터 세포에 표적화하며, 본 발명의 인간 모노클로날 항체처럼 CD30-발현 세포의 식작용, 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC), 사이토카인 방출 또는 수퍼옥사이드 음이온 생성 등과 같은 Fc 수용체로 매개되는 이펙터 세포 활성을 촉발시킨다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 항-Fc 결합 특이성 부위 또는 항-CD30 결합 특이성 부위 뿐 아니라 제3의 결합 특이성 부위를 추가로 포함할 수도 있다. 한 실시양태에서, 제3의 결합 특이성 부위는 항-상승인자 (anti-Enhancement Factor; EF) 부분, 예를 들어 세포독성 활성에 관여하는 표면 단백질 과 결합함으로써 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시키는 분자이다. "항-상승인자 (EF) 부분"은 소정의 분자, 예를 들어 항원 또는 수용체와 결합함으로써 Fc 수용체, 표적 세포 항원에 대한 결합 결정자의 효과를 상승시키는 항체, 기능적 항체 단편 또는 리간드일 수 있다. "항-상승 인자 부분"은 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원과 결합할 수 있다. 별법으로, 항-상승 인자 부분은 제1 및 제2 결합 특이성 부위가 결합하는 실체와는 상이한 실체에 결합할 수 있다. 예를 들어 항-상승 인자 부분은 (예를 들어 표적 세포에 대한 면역 반응의 증가를 일으키는 CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 다른 면역 세포를 통해) 세포독성 T-세포와 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 결합 특이성 부위로서, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv를 비롯하여, 하나 이상의 항체 또는 그의 항체 단편을 포함한다. 항체는 1990년 8월 7일자로 허여된 래드너 (Ladner) 등의 미국 특허 제4,946,778호에 기재된 바와 같은 경쇄 또는 중쇄 이량체 또는 Fv 또는 단일쇄 구조물과 같은 그의 임의의 최소 단편일 수도 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 이펙터 세포 표면 상에 존재하는 FcγR 또는 FcαR에 대한 결합 특이성 부위 및 표적 세포 항원, 예를 들어 CD30에 대한 제2의 결합 특이성 부위를 포함한다.
한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성 부위는 인간 모노클로날 항 체에 의해 제공되고, 이 항체의 결합은 인간 이뮤노글로불린 G (IgG)에 의해 차단되지 않는다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "IgG 수용체"는 1번 염색체상에 위치하는 8개의 γ-쇄 유전자들 중 임의의 것을 의미한다. 이 유전자들은 3가지 Fcγ수용체 클래스, 즉, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)로 분류되는 총 12가지의 막횡단 또는 가용성 수용체 이소형을 코딩한다. 바람직한 한 실시양태에서, Fcγ수용체는 인간의 고친화도 FcγRI이다. 인간 FcγRI은 단량체성 IgG에 대해 고친화도 (108 M-1 내지 109 M-1)을 나타내는 72 kDa의 분자이다.
상기 바람직한 모노클로날 항체의 생산 및 특징은 팡거 (Fanger) 등의 PCT 출원 WO88/00052호 및 미국 특허 제4,954,617호에 기재되어 있으며, 상기 문헌의 교시 내용은 그 전문이 본원에 참고로 도입된다. 이들 항체는 수용체의 Fcγ결합 부위와는 다른 부위에서 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII의 에피토프에 결합하며, 따라서 이들의 결합은 생리적 수준의 IgG에 의해서 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에 유용한 특정 항-FcγRI 항체는 MAb 22, MAb 32, MAb 44, MAb 62 및 MAb 197이다. MAb 32를 생산하는 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 HB9469)는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)으로부터 이용가능하다. 항-FcγRI MAb 22, MAb 22의 F(ab')2 단편은 미국 뉴저지주 안난데일에 소재하는 메다렉스, 인크. (Medarex, Inc.)로부터 입수할 수 있다. 다른 실시양태에서, 항-Fcγ수용체 항체는 모노클로날 항체 22 (H22)의 인간화 형태이다. H22 항체의 생산 및 특징은 문헌 [Graziano, R. F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10):4996-5002] 및 PCT/US93/10384에 기재되어 있다. H22 항체를 생산하는 세포주는 1992년 11월 4일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 HA022CL1 명칭으로 기탁되어 기탁번호 CRL 11177을 배정받았다.
또다른 바람직한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이성 부위는 인간 IgA 수용체, 예를 들어 Fc-알파 수용체 (FcαRI (CD89))에 결합하는 항체에 의해 제공되고, 이 항체의 결합은 인간 이뮤노글로불린 A (IgA)에 의해 차단되지 않는 것이 바람직하다. 용어 "IgA 수용체"는 19번 염색체 상에 위치하는 1개의 α-유전자 (FcαRI)의 유전자 생성물을 포함하는 의미이다. 이 유전자는 달리 스플라이싱된, 55 내지 110 kDa의 여러 막횡단 이소형을 코딩한다고 공지되어 있다. FcαRI (CD89)은 단핵구/대식세포, 호산구 및 호중구 과립구에서는 기본적으로 발현되지만, 비-이펙터 세포 집단에서는 발현되지 않는다. FcαRI은 IgA1 및 IgA2 둘다에 대하여 친화도가 중간 정도 (약 5 ×107 M-1)이며, 이는 G-CSF 또는 GM-CSF 등의 사이토카인에 노출되는 경우에 증가한다 [Morton, H. C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440]. IgA 리간드 결합 도메인 이외의 부위에서 FcαRI과 결합하는, A3, A59, A62 및 A77로 확인된 4가지 FcαRI-특이적 모노클로날 항체는 문헌 [Monteiro, R. C. et al., 1992, J. Immunol. 148:1764]에 기재되어 있다.
FcαRI 및 FcγRI은 (1) 주로 면역 이펙터 세포, 예를 들어 단핵구, PMN, 대식세포 및 수상 세포 상에서 발현되고; (2) 고수준으로 발현되고 (예컨대 세포 당 5,000 내지 100,000); (3) 세포독성 활성 (예컨대 ADCC, 식작용)의 매개자이고; (4) 그들에 표적화되는 자가-항원을 비롯한 항원의 항원 제시 증대를 매개하기 때문에, 본 발명에 사용하기에 바람직한 촉발 수용체이다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 표적 세포 항원, 예를 들어 CD30을 인식하여 예를 들어 그에 결합하는 결합 특이성 부위를 추가로 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 결합 특이성 부위는 본 발명의 인간 모노클로날 항체에 의해 제공된다.
본원에서 언급된 바와 같은 "이펙터 세포 특이적 항체"는 이펙터 세포의 Fc 수용체와 결합하는 항체 또는 기능성 항체 단편을 의미한다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 항체는 내인성 이뮤노글로불린에 의해 결합되지 않는 부위에서 이펙터 세포의 Fc 수용체와 결합한다.
본원에서 사용된 바와 같은, 용어 "이펙터 세포"는 면역 반응의 인식 및 활성화 단계와 대립되는, 면역 반응의 이펙터 단계에 관여하는 면역 세포를 의미한다. 예시적인 면역 세포에는 골수 또는 림프 기원의 세포, 예를 들어 림프구 (예컨대 세포용해 T 세포 (CTL)를 비롯한 B 세포 및 T 세포), 킬러 (killer) 세포, 천연 킬러 세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 호중구, 다형핵 세포, 과립구, 비만 세포 및 호염기구가 포함된다. 몇몇 이펙터 세포는 특정 Fc 수용체를 발현하며, 특정 면역 기능을 수행한다. 바람직한 실시양태에서, 이펙터 세포는 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 유도할 수 있는데, 예를 들어 호중구는 ADCC를 유도할 수 있다. 예를 들어 FcR을 발현하는 단핵구, 대식세포는 표적 세포의 특이적 사멸 및 면역계의 다른 성분에게의 항원 제시 또는 항원 제시 세포와의 결합에 관여한다. 다른 실시양태에서, 이펙터 세포는 표적 항원, 표적 세포 또는 미생물을 식작용할 수 있다. 이펙터 세포 상의 특정 FcR의 발현은 사이토카인 등의 체액성 인자에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어 FcγRI의 발현은 인터페론 감마 (IFN-γ)에 의해 상향조절되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 상승된 발현은 표적에 대한 FcγRI-보유 세포의 세포독성 활성을 증가시킨다. 이펙터 세포는 표적 항원 또는 표적 세포를 식작용하거나 용해시킬 수 있다.
"표적 세포"는 대상체 (예컨대 인간 또는 동물)에서 본 발명의 조성물 (예컨대 인간 모노클로날 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자)에 의해 표적화될 수 있는, 임의의 바람직하지 않은 세포를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 표적 세포는 CD30을 발현하거나 과발현하는 세포이다. CD30-발현 세포는 전형적으로 종양 세포, 예를 들어 방광, 유방, 결장, 신장, 난소, 전립선, 신세포, 편평 세포, 폐 (비-소 (non-small) 세포) 및 머리 및 목 종양 세포를 포함한다. 다른 표적 세포는 활액 섬유아세포를 포함한다.
인간 모노클로날 항체가 바람직하지만, 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자에 이용될 수 있는 다른 항체는 뮤린, 키메라 및 인간화된 모노클로날 항체이다.
키메라 마우스-인간 모노클로날 항체 (즉, 키메라 항체)는 당업계에 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어 뮤린 (또는 다른 종) 모노클로날 항체 분자의 Fc 불변 영역을 코딩하는 유전자를 제한 효소로 소화시켜 뮤린 Fc를 코딩하는 영역을 제거하고, 인간 Fc 불변 영역을 코딩하는 유전자의 동일한 부분을 치환한다 (로빈슨 (Robinson) 등의 국제 특허 출원 제PCT/US86/02269호; 아키라 (Akira) 등의 유럽 특허 출원 제184,187호; 타니구치, 엠 (Taniguchi, M.)의 유럽 특허 출원 제171,496호; 모리슨 (Morrison) 등의 유럽 특허 출원 제173,494호; 뉴버거 (Neuberger) 등의 국제 특허 공개 제WO 86/01533호; 캐빌리 (Cabilly) 등의 미국 특허 제4,816,567호; 캐빌리 등의 유럽 특허 출원 제125,023호; 문헌 [Better et al. (1988 Science 240:1041-1043)]; [Liu et al. (1987) PNAS 84:3439-3443]; [Liu et al., 1987, J. Immunol. 139:3521-3526]; [Sun et al. (1987) PNAS 84:214-218]; [Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005]; [Wood et al. (1985) Nature 314:446-449] 및 [Shaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst. 80:1553-1559] 참조).
키메라 항체는 항원 결합에 직접 관여하지 않는 Fv 가변 영역의 서열을 인간 Fv 가변 영역의 동일한 서열로 대체하여 추가로 인간화할 수 있다. 인간화 키메라 항체에 대한 일반적인 검토를 위해서는 문헌 ([Morrison, S. L., 1985, Science 229:1202-1207] 및 [Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214])을 참조한다. 이들 방법은 중쇄 또는 경쇄 중 적어도 하나의 이뮤노글로불린 Fv 가변 영역의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산 서열을 단리, 조작 및 발현시키는 것을 포함한다. 이러한 핵산의 공급원은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들어 7E3, 항-GPIIbIIIa 항체 생산 하이브리도마로부터 수득할 수 있다. 그 후, 키메라 항체 또는 그의 단편 을 코딩하는 재조합 DNA를 적합한 발현 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 별법으로, 적합한 인간화 항체는 CDR 치환에 의해 생산할 수 있다 (미국 특허 제5,225,539호; 문헌 [Jones et al. 1986 Nature 321:552-525]; [Verhoeyan et al. 1988 Science 239:1534] 및 [Beidler et al. 1988 J. Immunol. 141:4053-4060]).
특정 인간 항체의 모든 CDR을 비-인간 CDR의 적어도 일부로 대체하거나, CDR의 일부만을 비-인간 CDR로 대체할 수 있다. CDR을 인간화 항체와 Fc 수용체의 결합에 요구되는 수만큼 대체하는 것만이 필요하다.
인간 항체의 CDR의 적어도 일부를 비-인간 항체로부터 유래된 CDR로 대체할 수 있는 임의의 방법에 의해, 항체를 인간화할 수 있다. 윈터 (Winter)는 본 발명의 인간화 항체 생산에 사용될 수 있는 방법을 1987년 3월 26일자로 출원된 영국 특허 출원 제GB 2188638A호에 개시하고 있는데, 상기 문헌의 내용은 본원에 참고로서 명백히 도입된다. 국제 특허 공개 제WO 94/10332호 (발명의 영문 명칭: Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes)에 기재된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 부위-지정 돌연변이유발을 이용하여 인간 CDR을 비-인간 CDR로 대체할 수 있다.
또한, 특정 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 키메라 및 인간화 항체도 본 발명의 범위에 포함된다. 특히, 바람직한 인간화 항체는 프레임워크 영역 내에 항원에 대한 결합을 개선시키는 아미노산 치환부를 보유한다. 예를 들어 마우스 CDR을 보유하는 인간화 항체에서 인간 프레임워크 영역 내에 위치하는 아미노산을 마우스 항체의 상응하는 부위에 위치하는 아미노산으로 대체할 수 있다. 이러한 치 환은 몇몇 경우에 인간화 항체와 항원의 결합을 개선시킨다고 공지되어 있다. 아미노산이 부가, 결실 또는 치환된 항체를 본원에서는 변형된 항체 또는 변경된 항체라 언급한다.
또한, 변형된 항체라는 용어는, 예를 들어 항체의 일부를 결실, 부가 또는 치환하여 변형시킨 모노클로날 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체 등과 같은 항체를 포함하는 의미이다. 예를 들어 불변 영역을 결실시키고, 그를 항체의 반감기, 예를 들어 혈청 반감기, 안정성 또는 친화도를 증가시키도록 의도된 불변 영역으로 대체하여 항체를 변형시킬 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자가 FcγR에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 영역을 보유하며 하나 이상의 이펙터 기능을 촉발시키는 한, 어떠한 변형도 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 화학적 기술 (예컨대 문헌 [D. M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807] 참조), "폴리도마 (polydoma)" 기술 (리딩 (Reading)의 미국 특허 제4,474,893호 참조) 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 생산할 수 있다.
특히, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 당업계에 공지되어 있으며 본원에서 제공된 실시예에 기재되어 있는 방법을 이용하여 성분 결합 특이성 부위들, 예를 들어 항-FcR 및 항-CD30 결합 특이성 부위를 접합시켜 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 및 다중특이적 분자의 각각의 결합 특이성 부위를 별도로 생성시킨 다음, 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이성 부위가 단백질 또는 펩티드인 경우, 공유 접합을 위해 다양한 커플링제 또는 가교제를 사용할 수 있다. 가교 제의 예로는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), 5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산) (DTNB), o-페닐렌디말레이미드 (oPDM), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)가 포함된다 (예를 들어 문헌 [Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686], [Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 다른 방법으로는 문헌 ([Paulus, Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132], [Brennan et al., Science (1985) 229:81-83] 및 [Glennie et al., J. Immunol. (1987) 139:2367-2375])에 기재된 방법이 포함된다. 바람직한 접합제는 미국 일리노이주 록포드에 소재하는 피어스 케미칼 캄파니 (Pierce Chemical Co.)로부터 입수할 수 있는 SATA 및 술포-SMCC이다.
결합 특이성 부위가 항체 (예컨대 2개의 인간화 항체)인 경우, 두 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합을 통해 이들을 접합시킬 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 힌지 영역이 홀수, 바람직하게는 1개의 술프히드릴 잔기를 포함하도록 변형시킨 다음, 접합시킨다.
별법으로, 두개의 결합 특이성 부위 모두 동일한 벡터내에 코딩시키고, 동일한 숙주 세포내에서 발현시켜 조립할 수 있다. 이 방법은 이중특이적 및 다중특이적 분자가 MAb ×MAb, MAb ×Fab, Fab ×F(ab')2 또는 리간드 ×Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자, 예를 들어 이중특이적 분자는 단일쇄 분자, 예를 들어 단일쇄 이중특이적 항체, 하나의 단일쇄 항체 및 결합 결정자를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자 또는 2개의 결합 결정자를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자는 또한 단일쇄 분자이거나, 2개 이상의 단일쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,260,203호, 동 제5,455,030호, 동 제4,881,175호, 동 제5,132,405호, 동 제5,091,513호, 동 제5,476,786호, 동 제5,013,653호, 동 제5,258,498호 및 동 제5,482,858호에 기재되어 있다.
이중특이적 및 다중특이적 분자와 그의 특이적 표적의 결합은 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA), 방사성면역분석 (RIA), FACS 분석, 생물분석 (예컨대 성장 억제) 또는 웨스턴 블럿 분석에 의해 확인할 수 있다. 이러한 각각의 분석은 일반적으로 특정한 해당 단백질-항체 복합체에 대해 특이적인 표지된 시약 (예컨대 항체)을 사용하여 상기 해당 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들어, FcR-항체 복합체는 예를 들어 항체-FcR 복합체를 인식하여 특이적으로 결합하는 효소-결합된 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출할 수 있다. 별법으로, 상기 복합체는 임의의 다양한 다른 면역분석을 이용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 항체를 방사성 물질로 표지하여 방사성면역분석 (RIA)에 이용할 수 있다 (예를 들어 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986] 참조). 방사성 동위원소는 γ 계수기 또는 섬광계수기를 사용하는 방법 또는 자가방사기록법으로 검출할 수 있다.
IV . 면역접합체
다른 측면에서, 본 발명은 치료 잔기, 예를 들어 세포독소, 약물 (예컨대 면역억제제) 또는 방사성독소에 접합된 인간 항-CD30 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 특징으로 한다. 본원에서는 이러한 접합체를 "면역접합체"라고 지칭한다. 세포독소 또는 세포독성제로는 세포에 해로운 (예컨대 세포를 사멸시키는) 임의의 작용제가 포함된다. 이들의 예로는 탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 마이토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미토잔트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 푸로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체가 포함된다.
면역접합체를 형성하기에 적합한 치료제로는 항-대사물질 (예컨대 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예컨대 메클로르에타민, 티오에파 클로르암부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C 및 시스-디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예컨대 다우노루비신 (이전에는 다우노마이신이라 함) 및 독소루비신), 항생제류 (예컨대 닥티노마이신 (이전에는 악티노마이신이라 함), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신 (AMC)) 및 항-유사분열제 (예컨대 빈크리스틴 및 빈블라스틴)가 포함되지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 바람직한 실시양태에서, 치 료제는 세포독성제 또는 방사성독성제이다. 또다른 실시양태에서, 치료제는 면역억제제이다. 또다른 실시양태에서, 치료제는 GM-CSF이다. 바람직한 실시양태에서, 치료제는 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 술페이트, 카르무스틴, 클로르암부실, 시클로포스프아미드 히드록시우레아 또는 리신 A이다.
본 발명의 항체를 방사성독소, 예를 들어 방사성 요오드에 접합시켜, 암과 같은 CD30 관련 장애의 치료를 위한 세포독성 방사성 약제를 생성시킬 수 있다. 본 발명의 항체 접합체를 사용하여 주어진 생물학적 반응을 변형시킬 수 있으며, 약물 잔기가 고전적인 화학 치료제로 한정되는 것으로 생각해서는 안된다. 예를 들어, 약물 잔기는 바람직한 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질로는 예를 들어 효소적으로 활성인 독소 또는 그의 활성 단편, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를 들어 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는 생물학적 반응 변형제, 예를 들어 림포카인, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF") 또는 다른 성장 인자가 포함될 수 있다.
이러한 치료 잔기를 항체에 접합시키는 기술은 잘 알려져 있으며, 예를 들어 문헌 [Arnon et al.,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)], [Hellstrom et al.,"Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)], [Thorpe,"Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)], ["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)] 및 [Thorpe et al.,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)]을 참조한다.
V. 제약 조성물
또다른 측면으로, 본 발명은 제약상 허용가능한 담체와 함께 제제화된, 본 발명의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부분(들) 중 하나 또는 이들의 배합물을 함유하는 조성물, 예를 들어 제약 조성물을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 상기 조성물은 본 발명의 다중의 (예컨대 2개 이상의) 단리된 인간 항체 또는 그의 항원-결합 부분의 배합물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 배합물에서 각각의 항체 또는 그의 항원-결합 부분은 별개의 미리 선택된 CD30 에피토프에 결합한다.
본 발명의 제약 조성물은 또한 병행 요법으로, 즉 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 병행 요법은 본 발명의 조성물과 1종 이상의 소염제 또는 1종 이상의 면역억제제를 포함할 수 있다. 이러한 치료제로는 무엇보다도 스테로이드성 및 비스테로이드성 소염 약물 (NSAIDS), 예를 들어 아스피린 및 다른 살리실레이트, 예컨대 이부프로펜 (모트린 (Motrin), 아드빌 (Advil)), 나프록센 (나프로신 (Naprosyn)), 술린닥 (클리노릴 (Clinoril)), 디클로페낙 (볼타렌 (Voltaren)), 피록시캄 (펠덴 (Feldene)), 케토프로펜 (오루디스 (Orudis)), 디플루니살 (돌로비드 (Dolobid)), 나부메톤 (렐라펜 (Relafen)), 에토돌락 (로딘 (Lodine)), 옥사프로진(다이프로 (Daypro)), 인도메타신 (인도신 (Indocin)) 및 고투여량의 아스피린이 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "제약상 허용가능한 담체"로는 생리적으로 상용가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제, 항진균제, 등장화제 및 흡수지연제 등이 포함된다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예컨대 주사 또는 주입)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자를 산의 작용 및 화합물을 불활성화시킬 수 있는 다른 천연 조건으로부터 보호하는 물질로 코팅할 수 있다.
"제약상 허용가능한 염"은 모 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 보유하며 임의의 바람직하지 않은 독성 효과를 부여하지 않는 염을 의미한다 (예를 들어 문헌 [Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19] 참조). 이러한 염의 예로는 산 부가염 및 염기 부가염이 포함된다. 산 부가염으로는 무독성 무기산, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 및 인산 등으로부터 유래된 것들 뿐만 아니라, 무독성 유기산, 예를 들어 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 방향족산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래된 것들이 포함된다. 염기 부가염으로는 알칼리 토금속, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘 등으로부터 유래된 것들 뿐만 아니라, 무독성 유기 아민, 예를 들어 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민 및 프로카인 등으로부터 유래된 것들이 포함된다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여할 수 있다. 당업자라면 투여 경로 및(또는) 방식이 원하는 결과에 따라 달라질 것임을 잘 알 것이다. 활성 화합물은 급속한 방출에 대하여 화합물을 보호하는 담체를 사용하여 임플란트, 경피 패취 및 마이크로캡슐화 전달계를 비롯한 조절 방출형 제제로서 제조될 수 있다. 생분해성 및 생적합성 중합체, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 다중 무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 작용제를 제조하는 많은 방법은 특허되었거나 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978] 참조).
본 발명의 화합물을 특정 투여 경로로 투여하기 위해, 화합물의 불활성화를 방지하는 물질로 화합물을 코팅하거나, 이러한 물질과 화합물을 공동 투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 화합물을 적절한 담체, 예를 들어 리포좀 또는 희석제 중에 넣어 대상체에게 투여할 수 있다. 제약상 허용가능한 희석제로는 염수 및 수성 완충액이 포함된다. 리포좀은 수중유중수 CGF 에멀젼뿐 아니라 통상적인 리포좀을 포함한다 (문헌 [Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27]).
제약상 허용가능한 담체로는 무균 주사용 용액제 또는 분산제의 즉석 제조를 위한 무균 수용액 또는 분산액 및 무균 분말이 포함된다. 제약상 활성인 물질을 위한 이러한 매질 및 작용제의 용도는 당업계에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 상용성인 한, 상기 매질 또는 작용제를 본 발명의 제약 조성물에 사용하는 것이 고려된다. 보충 활성 화합물 또한 조성물에 포함될 수 있다.
치료 조성물은 전형적으로 무균성이어야 하며 제조 및 저장 조건하에 안정해야 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀 또는 높은 약물 농도에 대해 적합한 다른 정돈된 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어 레시틴과 같은 코팅을 이용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입도를 유지함으로써, 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우에서, 조성물 중에 등장성제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시켜 주사가능한 조성물의 흡수를 지연시킬 수 있다.
필요량의 활성 화합물을 상기 언급한 성분들 중 하나 또는 이들의 배합물과 함께 적절한 용매 중에 혼입한 다음, 무균 미세여과하여 무균 주사용 용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 염기성 분산 매질 및 상기 언급한 것들 중 필요한 다른 성분을 포함하는 무균 비히클 중에 활성 화합물을 혼입시켜 분산액을 제조한다. 무균 주사용 용액의 제조를 위한 무균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 미리 무균 여과한 용액으로부터의 활성 성분과 임의의 추가의 바람직한 성분의 분말을 생성하는 진공 건조법 및 동결 건조법 (동결건조)이다.
투여법을 조절하여 최적의 바람직한 반응 (예컨대 치료 반응)을 제공한다. 예를 들어, 치료 상황의 요건에 따라 지시되는 바와 같이, 단일 농축괴를 투여하거나 또는 여러 번으로 나누어 시간에 따라 투여하거나 투여량을 비례적으로 감소 또는 증가시킬 수 있다. 투여를 용이하게 하고 투여량을 일정하게 하기 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유리하다. 본원에서 사용된 투여 단위 형태는 치료될 대상체에 대하여 단위 투여량으로 적합하도록 물리적으로 분리된 단위를 의미하며, 각 단위는 필요한 제약 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 나타내도록 계산된 미리 정해진 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 세부사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성하고자 하는 특정 치료 효과 및 (b) 개체에서 감응성 치료를 위해 이러한 활성 조합물을 배합하는 기술에 있어서의 고유한 제한에 의해 설명되며, 이들에 의해 직접적으로 좌우된다.
제약상 허용가능한 항산화제의 예로는 (1) 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 히드로클로라이드, 중황산나트륨, 메타중아황산나트륨 및 아황산나트륨 등; (2) 지용성 항산화제, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트 및 알파-토코페롤 등 및 (3) 금속 킬레이팅제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산 및 인산 등이 포함된다.
치료 조성물의 경우, 본 발명의 제제로는 경구, 비강, 국소 (구강 및 설하 포함), 직장, 질내 및(또는) 비경구 투여에 적합한 것들이 포함된다. 제제는 편리하게는 단위 투여 형태로 제공될 수 있으며, 제약 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 단일 투여 제형을 제조하기 위해 담체 물질과 배합할 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 단일 투여 제형을 제조하기 위해 담체 물질과 배합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양이다. 일반적으로, 상기 양은 100％ 중 활성 성분 약 0.01％ 내지 약 99％, 바람직하게는 약 0.1％ 내지 약 70％, 가장 바람직하게는 약 1％ 내지 약 30％의 범위이다.
또한, 질내 투여에 적합한 본 발명의 제제로는 당업계에 적절한 것으로 알려진 담체를 포함하는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 분무 제제가 포함된다. 본 발명의 조성물의 국소 또는 경피 투여용 투여 형태로는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패취 및 흡입제가 포함된다. 무균 조건하에 활성 화합물을 제약상 허용가능한 담체 및 필요에 따라 임의의 보존제, 완충제 또는 추진제와 함께 혼합할 수 있다.
본원에서 사용된 "비경구 투여" 및 "비경구로 투여된"이라는 구절은 장내 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 보통 주사를 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막 하, 지주막하, 척수강내, 경막외 및 흉강내 주사 및 주입을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 제약 조성물 중에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적절한 혼합물, 식물성유, 예를 들어 올리브유 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트가 포함된다. 예를 들어 레시틴과 같은 코팅 물질을 사용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입도를 유지함으로써, 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성을 유지할 수 있다.
이러한 조성물은 아쥬반트, 예를 들어 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 포함할 수도 있다. 상기 무균화 방법 및 다양한 항-박테리아제 및 항-진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올 및 페놀 소르브산 등을 포함시키는 방법 둘다에 의해 미생물 존재의 방지를 보장할 수 있다. 등장성제, 예를 들어 당, 염화나트륨 등을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함시켜 주사가능한 약제 제형의 흡수를 지연시킬 수 있다.
본 발명의 화합물을 인간 및 동물에게 약제로서 투여하는 경우, 화합물을 단독으로 투여하거나, 예를 들어 활성 성분 0.01 내지 99.5％ (더욱 바람직하게는, 0.1 내지 90％) 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물로서 투여할 수 있다.
선택된 투여 경로와 무관하게, 적합한 수화된 형태로 사용될 수 있는 본 발 명의 화합물 및(또는) 본 발명의 제약 조성물을 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해 제약상 허용가능한 투여 형태로 제제화한다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준을 변화시켜, 환자에게 무독성이면서 특정 환자의 목적하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양, 조성 및 투여 방식을 결정할 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시기, 사용된 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 기타 약물, 사용된 특정 조성물과 함께 사용된 화합물 및(또는) 물질, 치료될 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전체적인 건강 및 기존의 병력 및 의료분야에 잘 알려진 인자 등을 비롯하여 다양한 약물동력학적 인자에 따라 달라질 것이다.
당업계의 통상의 기술을 가진 의사 또는 수의사라면 필요한 제약 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 제약 조성물 중에 사용되는 본 발명의 화합물의 투여량을, 목적하는 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 양보다 더 낮은 수준에서 출발하여, 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 일일 투여량은 치료 효과를 제공하는 데 효과적인 가장 낮은 투여량에 해당하는 화합물의 양일 것이다. 이러한 효과적인 투여량은 일반적으로 상기 설명한 인자에 따라 달라질 것이다. 투여는 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하, 바람직하게는 표적 부위 근처에 투여하는 것이 바람직하다. 원하다면, 치료 조성물의 효과적인 일일 투여량을 임의로 단위 투여 형태로 하루 동안 2회, 3회, 4회, 5회, 6회에 걸쳐 투여하거나, 적절한 간격으로 보다 여러 회에 걸쳐 분할 투여할 수 있다. 본 발명의 화합물을 단독으로 투여할 수 있지만, 화합물을 제약 제제 (조성물) 형태로 투여하는 것이 바람직하다.
치료 조성물을 당업계에 공지된 의료 디바이스 (device)를 이용하여 투여할 수 있다. 예를 들어 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물을 바늘이 없는 피하 주사 디바이스, 예를 들어 문헌 미국 특허 제5,399,163호, 동 제5,383,851호, 동 제5,312,335호, 동 제5,064,413호, 동 제4,941,880호, 동 제4,790,824호 또는 동 제4,596,556호에 개시된 디바이스를 이용하여 투여할 수 있다. 본 발명에 유용한 잘 알려진 임플란트 및 모듈의 예로는 조절된 속도로 약물을 분배하는 이식가능한 미세-주입 펌프를 개시하는 미국 특허 제4,487,603호; 피부를 통해 약물을 투여하는 치료 디바이스를 개시하는 미국 특허 제4,486,194호; 정확한 주입 속도로 약물을 전달하는 약물 주입 펌프를 개시하는 미국 특허 제4,447,233호; 지속적인 약물 전달을 위한 가변 유동성의 이식가능한 주입 디바이스를 개시하는 미국 특허 제4,447,224호; 멀티-챔버 구획을 보유하는 삼투성 약물 전달계를 개시하는 미국 특허 제4,439,196호 및 삼투성 약물 전달계를 개시하는 미국 특허 제4,475,196호가 포함된다. 이들 특허의 내용은 본원에 참고로 포함된다. 이러한 다른 여러 임플란트, 전달계 및 모듈은 당업자에게 공지되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 생체내에서 적절히 분포되도록 제제화될 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 고도로 친수성인 화합물을 차단한다. 본 발명의 치료 화합물이 BBB를 통과하는 것을 보장하기 위 해, (원한다면) 이들 화합물을 예를 들어 리포좀내에 제제화할 수 있다. 리포좀의 제조 방법에 대하여는, 예를 들어 미국 특허 제4,522,811호, 동 제5,374,548호 및 동 제5,399,331호를 참조한다. 리포좀은 특이적 세포 또는 기관내로 선택적으로 운반되는 하나 이상의 잔기를 포함할 수 있으며, 따라서 표적화된 약물 전달을 증가시킨다 (예를 들어 문헌 [V. V. Ranade (1989) J Clin. Pharmacol. 29: 685] 참조). 표적화 잔기의 예에는 엽산 또는 바이오틴 (예를 들어 로우 (Low) 등에게 허여된 미국 특허 제5,416,016호 참조); 만노시드 (문헌 [Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038]); 항체 (문헌 [P. G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140], [M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180]); 계면활성제 단백질 A 수용체 (문헌 [Briscoe et al. (1995) Am. J Physiol. 1233:134]) (그의 여러 종은 본 발명의 제제 뿐만 아니라 본 발명의 분자 성분을 포함할 수 있음); p120 (문헌 [Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090])이 포함되며, 또한, 문헌 [K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123], [J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immuno방법 4: 273]을 참조한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 치료 화합물을 리포좀내에 제제화하고, 더욱 바람직한 실시양태에서, 리포좀은 표적화 잔기를 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 리포좀내 치료 화합물을 농축괴 주사에 의해 목적하는 영역 근처의 부위, 예를 들어 염증 또는 감염 부위 또는 종양 부위에 전달한다. 조성물은 주사 투여가 용이할 정도로 유동성이어야 한다. 조성물은 제조 및 저장 조건하에 안정해야 하며, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대하여 보존되 어야 한다.
"치료 유효량"은 바람직하게는 세포 성장 또는 종양 성장을 비처리된 대상체에 비해 약 20％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 40％ 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 60％ 이상, 가장 바람직하게는 약 80％ 이상까지 억제한다. 암을 억제하는 화합물의 능력은 인간 종양에서의 효능을 예상할 수 있는 동물 모델 시스템에서 평가할 수 있다. 별법으로, 조성물의 이러한 특성은 예를 들어 당업자에게 공지되어 있는 시험관내 분석에 의해 화합물의 억제 능력을 조사함으로써 평가할 수 있다. 치료 유효량의 치료 화합물은 대상체에서 종양 크기를 감소시킬 수 있거나, 달리 말하면 증상을 경감시킬 수 있다. 당업자라면 대상체의 크기, 대상체 증상의 중증도 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로와 같은 인자를 기준으로 하여 치료 유효량 결정할 수 있을 것이다.
조성물은 무균성이어야 하며, 주사기로 조성물을 전달할 수 있을 정도로 유동성이어야 한다. 물 이외에도, 담체는 등장성 완충 염수 용액, 에탄올, 폴리올 (예컨대 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅을 사용함으로써, 분산액의 경우 필요한 입도를 유지함으로써, 계면활성제를 사용함으로써 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우, 등장성제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨 및 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직하다. 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물 중에 포함시켜 주사가능한 조성물의 장기간에 걸친 흡수가 일어나도록 할 수 있다.
활성 화합물이 적합하게는 상기와 기재된 바와 같이 보호되는 경우, 화합물은 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 경구로 투여될 수 있다.
VI. 본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 인간 항체, 항체 조성물 및 방법은 CD30에 의해 매개되는 장애의 진단 및 치료와 관련된 수많은 시험관내 및 생체내 진단 및 치료에 유용하다. 예를 들어, 이들 분자는 예를 들어 시험관내 또는 생체외로 배지 중의 세포에 또는 예를 들어 생체내로 인간 대상체에 투여하여 다양한 장애를 치료, 예방 및 진단할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "대상체"라는 용어는 인간 및 인간이 아닌 동물을 포함한다. 바람직한 대상체로는 CD30 활성에 의해 매개되는 장애를 가진 인간 환자가 포함된다.
예를 들어, 본 발명의 인간 항체, 항체 조성물 및 방법을 이용하여, 종양형성 장애, 예를 들어 호지킨병, 미분화 대세포 림프종 (ALCL), 성인 T-세포 림프종 (ATL), 혈관면역아세포성 림프절증 (AILD)-유사 T 세포 림프종, HIV 관련 체강 기재 림프종, 태생기암, 비인강의 미분화 암종 (예컨대 쉬민케 종양), 캐슬맨병, 카포시 육종 및 기타 T-세포 또는 B-세포 림프종을 비롯한 CD30-발현 종양 세포의 존재를 특징으로 하는 장애를 가진 대상체를 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 인간 항체, 항체 조성물 및 방법을 이용하여, 다른 장애, 예를 들어 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 전신성 경화증, 아토피성 피부염, 그레브스병, 하시모토 갑상선염, 베게너 육아종증, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 전염성 단핵구증, HIV 및 헤르페스 바이러스 관련 질환을 비롯한 자가면역 질환을 가진 대상체를 치료할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 항체 (예컨대 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성물)를 사용하여, CD30의 수준 또는 막 표면 상에 CD30을 함유하는 세포의 수준을 검출할 수 있으며, 상기 수준을 특정 질환 증상과 연관지을 수 있다. 별법으로, 상기 항체를 사용하여 특정 질환 증상의 예방 또는 경감과 연관지을 수 있는 CD30의 기능을 억제하거나 차단함으로써, 상기 질환의 매개자로서 CD30을 관련시킬 수 있다. 이는 항-CD30 항체와 CD30 사이의 복합체 형성을 가능하게 하는 조건하에 샘플 및 대조 샘플과 항-CD30 항체를 접촉시킴으로써 달성된다. 상기 항체와 CD30 사이에 형성된 임의의 복합체를 검출하여 상기 샘플과 대조 샘플을 비교한다.
또다른 실시양태에서, 먼저 본 발명의 항체 (예컨대 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성물)를 치료 또는 진단의 용도와 관련된 결합 활성에 대해 시험관내에서 시험한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 하기 실시예에 기재된 ELISA 및 유식세포측정 분석에 의해 시험할 수 있다. 또한, CD30-발현 세포의 성장 및(또는) 사멸을 억제하는 것을 비롯하여, 하나 이상의 이펙터-매개된 이펙터 세포 활성을 촉발하는 데 있어서 이들 분자의 활성을 분석할 수 있다. 이펙터 세포-매개된 ADCC 또는 식작용을 분석하기 위한 프로토콜은 하기 실시예에서 기재된다.
본 발명의 항체 (예컨대 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성 물)는 또한 CD30 관련 질환의 치료 및 진단에 유용하다. 예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 면역접합체를 사용하여, 예를 들어 CD30-발현 세포의 성장 및(또는) 사멸을 억제하는 것, 인간 이펙터 세포의 존재하에 CD30-발현 세포의 식작용 또는 ADCC를 매개하는 것, 가용성 CD30의 쉐딩을 억제하는 것, CD30 리간드와 CD30의 결합을 차단하는 것, IL-4 발현을 억제하는 것 또는 Th2 표현형의 발현을 예를 들어 낮은 투여량에서 매개하는 것과 같은 생물학적 활성 중 하나 이상을 생체내 또는 시험관내에서 유도할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 항체 (예컨대 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성물)는 세포의 보체-매개된 용해를 유도할 수 없으며, 따라서 좌창과 같은 보체-활성화된 병증을 촉발하는 부작용이 거의 없다. 좌창의 1차 원인은 피지를 생성하는 여포 내에서 각질 형성 패턴의 변경이다. 각질 형성 세포는 CD30을 발현하고 피부에서 CD30 신호전달 프로세스를 방해하며, 여포에서 각질 형성 세포의 성장 및 분화를 변경시킬 수 있기 때문에, 그 결과 좌창을 일으킨다. 직접 면역형광 연구에 의해, 초기의 비염증성 및 염증성 좌창 병변에서 고전적이고 대안적인 보체 경로가 활성화된다는 것이 밝혀졌다.
특별한 실시양태에서, 본 발명의 항체 (예컨대 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성물)를 사용하여, 생체내에서 다양한 CD30 관련 질환을 치료하거나 예방하거나 진단할 수 있다. CD30 관련 질환의 예로는 무엇보다도 암, 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 미분화 대세포 림프종 (ALCL), 성인 T-세포 림프종 (ATL), 혈관면역아세포성 림프절증 (AILD)-유사 T 세포 림프종, HIV 관련 체강 기 재 림프종, 태생기암, 비인강의 미분화 암종 (예컨대 쉬민케 종양), 캐슬맨병, 카포시 육종 및 기타 T-세포 또는 B-세포 림프종이 포함된다. CD30에 의해 매개되는 다른 질환으로는 무엇보다도 자가면역 질환, 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 전신성 경화증, 아토피성 피부염, 그레브스병, 하시모토 갑상선염, 베게너 육아종증, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 전염성 단핵구증, HIV 및 헤르페스 바이러스 관련 질환이 포함된다.
특별한 실시양태에서, 본 발명의 항체 (예컨대 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성물)를 사용하면, 상기 항체가 호지킨병 (HD) 및 다른 종양형성 질환의 진행에 있어서 CD30의 역할을 제한하기 때문에 HD를 치료하거나 예방할 수 있다. 호지킨병은 림프종의 일종이다. 림프종은 신체 면역계의 일부인 림프계에서 발생하는 암이다. 림프 조직이 신체의 여러 부분에 있기 때문에, HD는 거의 신체의 어느 부분에서나 시작될 수 있다. 암은 간, 골수 (혈액 세포를 만드는 신체의 대골 내의 스폰지 조직) 및 비장을 비롯하여 거의 신체 중 어느 기관 또는 조직으로도 전이될 수 있다. 호지킨 및 리드-스턴버그 세포에서 CD30 발현의 상승이 HD의 특징적인 진단과 상호관련 있는 것으로 보고되었다. 따라서, 본 발명의 CD30 억제 항체를 사용하여 HD를 유발하는 CD30의 효과를 예방하거나 차단함으로써 이러한 질환을 예방하거나 치료할 수 있다.
본 발명의 인간 항체 (예컨대 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)를 사용하여, CD30의 다른 효과를 차단하거나 억제할 수 있다. 예를 들면, CD30이 또한 다양한 비-호지킨 림프종 아형 (subtype)에 의해 규칙적으로 발현 된다는 것이 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 항체의 또다른 용도로 비-호지킨 림프종 관련 질환의 예방 또는 치료가 포함된다. 이들 질환으로는 버키트 림프종, 미분화 대세포 림프종 (ALCL), 피부 T-세포 림프종, 결절성 소분할 세포 림프종, 림프구성 림프종, 말초 T-세포 림프종, 레너트 림프종, 면역아세포성 림프종, T-세포 백혈병/림프종 (ATLL), 성인 T-세포 백혈병 (T-ALL) 및 중심모세포/중심세포 (cb/cc) 여포성 림프종 암이 포함된다.
또다른 특별한 실시양태에서, 본 발명의 인간 항체 (예컨대 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 조성물)를 사용하여, CD30의 다른 효과를 차단하거나 억제할 수 있다. 예를 들면, 가용성 CD30이 CD30-발현 세포의 표면으로부터 규칙적으로 쉐딩되는 것 또한 공지되어 있다. 다양한 종양형성 및 자가면역 장애를 가진 환자의 혈청에서 sCD30 수준이 상승되는 것이 보고되었다. 따라서, 본 발명의 항체의 또다른 용도로 sCD30의 쉐딩을 차단하거나 억제하는 것과 관련된 질환의 예방 또는 치료가 포함된다. 이러한 질환으로는 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 전신성 경화증, 아토피성 피부염, 그레브스병, 하시모토 갑상선염, 베게너 육아종증 및 오멘 증후군이 포함되나, 이로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항체 조성물 (예컨대 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)의 생체내 및 시험관내 투여에 적합한 경로는 당업계에 널리 공지되어 있으며, 통상의 기술을 가진 자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 항체 조성물은 (예컨대 정맥내 또는 피하) 주사에 의해 투여될 수 있다. 사용되는 분자의 적합한 투여량은 대상체의 연령 및 체중 및 항체 조성물의 농도 및(또 는) 제형에 따라 좌우될 수 있다.
상기 기재한 바와 같이, 본 발명의 인간 항-CD30 항체는 세포독성제, 방사성독성제 또는 면역억제제와 같은 1종 이상의 다른 치료제와 함께 공동 투여될 수 있다. 상기 항체는 (면역복합체로서) 상기 다른 치료제에 결합될 수 있거나, 상기 다른 치료제와는 별도로 투여될 수 있다. 후자 (별도 투여)의 경우에는, 항체를 상기 다른 치료제를 투여하기 전에, 후에 또는 그와 동시에 투여하거나, 항암 요법 (예컨대 방사선)과 같은 다른 공지된 요법과 함께 공동 투여할 수 있다. 이러한 치료제로는 무엇보다도 항-신생물제, 예컨대 독소루비신 (아드리아마이신), 시스플라틴 블레오마이신 술페이트, 카르부스틴, 클로르암부실 및 시클로포스프아미드 히드록시우레아가 포함되며, 이들 자체는 환자에게 독성이거나 덜 독성인 수준에서만 효과적이다. 시스플라틴은 4주마다 한번씩 100 mg/㎡의 양으로 정맥내 투여하고, 아드리아마이신은 21일마다 한번씩 60 내지 75 mg/㎡의 양으로 정맥내 투여한다. 본 발명의 인간 항-CD30 항체 또는 그의 항원 결합 단편과 화학요법제의 공동 투여는 인간 종양 세포에 대해 세포독성 효과를 달성하는 상이한 메카니즘을 통해 작용하는 두가지 항암제를 제공한다. 이러한 공동 투여는 약물 내성의 발생 또는 종양 세포의 항원성의 변화로 인해 종양 세포가 항체와 반응하지 않게 되는 문제를 해결한다.
표적-특이적 이펙터 세포, 예를 들어 본 발명의 조성물 (예컨대 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)에 결합된 이펙터 세포 또한 치료제로 사용할 수 있다. 표적화를 위한 이펙터 세포는 인간 백혈구, 예를 들어 대식세포, 호중구 또 는 단핵구일 수 있다. 다른 세포로는 호산구, 천연 킬러 세포 및 다른 IgG- 또는 IgA-수용체 보유 세포가 포함된다. 원하다면, 이펙터 세포를 치료될 대상체로부터 얻을 수 있다. 표적-특이적 이펙터 세포는 생리적으로 허용되는 용액 중 세포 현탁액으로서 투여할 수 있다. 투여될 세포의 수는 약 108 내지 109개일 수 있지만, 치료 목적에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 상기 양은 표적 세포, 예를 들어 CD30-발현 종양 세포로의 국소화를 달성하고, 예를 들어 식작용에 의해 세포 사멸을 이루기에 충분한 양일 것이다. 투여 경로 또한 달라질 수 있다.
표적-특이적 이펙터 세포를 사용한 요법은 표적화된 세포의 제거를 위한 다른 기술과 함께 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 (예컨대 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자) 및(또는) 이들 조성물과 결합된 이펙터 세포를 사용하는 항-종양 요법을 화학요법과 함께 이용할 수 있다. 또한, 병행 면역요법을 이용하여 종양 세포 거부에 대한 2가지 별개의 세포독성 이펙터 집단을 유도할 수 있다. 예를 들어, 항-Fc-감마RI 또는 항-CD3에 결합된 항-CD30 항체를 IgG- 또는 IgA-수용체 특이적 결합제와 함께 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자를 사용하여, 예를 들어 이펙터 세포 표면 상의 수용체를 캡핑하고 제거함으로써 이펙터 세포 상의 FcγR 또는 FcαR 수준을 조정할 수 있다. 항-Fc 수용체의 혼합물 또한 이러한 목적을 위해 사용할 수 있다.
보체 결합 부위, 예를 들어 보체와 결합하는 IgG1, IgG2 또는 IgG3 또는 IgM 으로부터의 부위를 갖는 본 발명의 조성물 (예컨대 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체) 또한 보체의 존재하에 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 표적 세포를 포함하는 세포 집단을 본 발명의 결합제 및 적절한 이펙터 세포로 생체외 처리하는 것은 보체 또는 보체 함유 혈청의 첨가에 의해 보충될 수 있다. 보체 단백질을 결합시켜 본 발명의 결합제로 코팅된 표적 세포의 식작용을 개선시킬 수 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물 (예컨대 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)로 코팅된 표적 세포를 보체에 의해 용해시킬 수도 있다. 또다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 보체를 활성화시키지 않는다.
또한, 본 발명의 조성물 (예컨대 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자 및 면역접합체)을 보체와 함께 투여할 수도 있다. 따라서, 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 혈청 또는 보체를 포함하는 조성물은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 이들 조성물은 보체가 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자에 가까운 근처에 위치한다는 점에서 유리하다. 별법으로, 본 발명의 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자 및 보체 또는 혈청을 별도로 투여할 수 있다.
본 발명의 항체 조성물 (예컨대 인간 항체 및 면역접합체) 및 사용 지침서를 포함하는 키트 또한 본 발명의 범위 내에 포함된다. 상기 키트는 하나 이상의 추가의 시약, 예컨대 면역억제제, 세포독성제 또는 방사성독성제 또는 본 발명의 1종 이상의 다른 인간 항체 (예컨대 제1 인간 항체와는 별개인 CD30 상의 에피토프에 결합하는 보체 활성을 보유하는 인간 항체)를 추가로 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 항체 조성물로 치료한 환자에게 추가로 세포독성제 또는 방사성독성제와 같은 또다른 치료제를 (본 발명의 인간 항체의 투여 전에, 그와 동시에 또는 그 후에) 투여하여, 인간 항체의 치료 효과를 상승시키거나 증대시킬 수 있다.
다른 실시양태에서, 예를 들어 대상체는 Fcγ또는 Fcα수용체의 발현 또는 활성을 조정하는, 예를 들어 상승시키거나 억제하는 작용제, 예를 들어 사이토카인을 사용하여 추가로 치료할 수 있다. 다중특이적 분자로 치료하는 동안 투여하는 바람직한 사이토카인으로는 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 인터페론-γ(IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 (TNF-α)가 포함된다.
또다른 실시양태에서, 대상체를 림포카인 제제로 추가로 치료할 수 있다. CD30을 많이 발현하지 않는 암 세포를 림포카인 제제를 사용하여 CD30을 많이 발현하도록 유도할 수 있다. 림포카인 제제는 종양 세포 중에서 CD30의 더욱 균일한 발현을 일으켜, 더욱 효과적인 요법을 유도할 수 있다. 투여하기에 적합한 림포카인 제제로는 인터페론-감마, 종양 괴사 인자 및 이들의 배합물이 포함된다. 이들은 정맥내로 투여될 수 있다. 림포카인의 적합한 투여량은 환자 1인 당 10,000 내지 1,000,000 단위이다.
또한, 본 발명의 조성물 (예컨대 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)을 사용하여, 예를 들어 FcγR 또는 CD30을 발현하는 세포를 표적화, 예를 들어 이러한 세포를 표지할 수 있다. 이러한 용도의 경우, 결합제를 검출될 수 있는 분자에 결합시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 FcγR와 같은 Fc 수용체 또는 CD30을 발현하는 세포를 생체외 또는 시험관내에서 국소화하는 방법을 제공한다. 검출가능한 표지는 예를 들어 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조인자일 수 있다.
특별한 실시양태에서, 본 발명은 항체와 CD30 사이의 복합체 형성을 가능하게 하는 조건하에 CD30에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 샘플 및 대조 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하는, 샘플 중 CD30 항원의 존재를 검출하거나 CD30 항원의 양을 측정하는 방법을 제공한다. 그 후, 복합체의 형성에 대해 검출하며, 이 때, 샘플과 대조 샘플 사이의 상이한 복합체 형성이 샘플 중 CD30 항원의 존재에 대한 지표이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 대상체에게 상기 기재된 인간 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 CD30에 의해 매개되는 장애, 예를 들어 호지킨병, 성인 T-세포 림프종, 전염성 단핵구증 및 전신성 홍반성 루푸스를 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 항체 및 그의 유도체를 사용하여, 특정 장애와 관련된 CD30 유도된 활성, 예를 들어 증식 및 분화를 억제한다. 본 발명의 항체에 의해 억제될 수 있는 다른 CD30 유도된 활성으로는 sCD30 생성 증가, IL-4 발현 증가 및 Th2 표현형 생산 증가가 포함된다. 항체와 CD30을 접촉시킴으로써 (예를 들어 항체를 대상체에 투여함으로써), 상기 활성을 유도하는 CD30의 능력을 억제하여, 그와 관련된 장애를 치료한다. 바람직한 항체는 CD30에 특이적인 에피토프에 결합하여, 유리하게는 CD30 유도된 활성은 억제하고, NGFR, CD27 및 CD40와 같이 구조적으로 관련이 있는 표면 항원의 활성은 방해하지 않는다.
따라서, 또다른 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD30에 의해 매개된 종양형성 장애, 예를 들어 호지킨병, 비-호지킨 림프종, 미분화 대세포 림프종 (ALCL), 성인 T-세포 림프종 (ATL), 혈관면역아세포성 림프절증 (AILD)-유사 T 세포 림프종, HIV 관련 체강 기재 림프종, 태생기암, 비인강의 미분화 암종 (예컨대 쉬민케 종양), 캐슬맨병, 카포시 육종 및 기타 T-세포 또는 B-세포 림프종을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 장애의 치료 또는 예방 유효량의 본 발명의 항체 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 항체 조성물은 단독으로 투여되거나, CD30에 의해 매개되는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 항체 조성물과 연합적으로 또는 상승적으로 작용하는 세포독성제 또는 방사성독성제와 같은 또다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 호지킨병을 치료하는 방법을 제공한다. 또다른 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 ALCL을 치료하는 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 인간 CD30에 의해 매개된 자가면역 장애, 예를 들어 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 전신성 경화증, 아토피성 피부염, 그레브스병, 하시모토 갑상선염, 베게너 육아종증, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 전염성 단핵구증, HIV 및 헤르페스 바이러스 관련 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 상기 장애의 치료 또는 예방 유효량의 본 발명의 항체 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 항체 조성물은 단독으로 투여되거나, CD30에 의해 매개되는 질환을 치료 또는 예방하기 위한 항체 조성물과 연합적으로 또는 상승적으로 작용하는 면역억제제와 같은 또다른 치료제 와 함께 투여될 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 생체내 또는 시험관내에서 Fc-발현 세포의 존재를 검출하거나, 그의 양을 정량하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (i) 검출가능한 마커에 접합된 본 발명의 조성물 (예컨대 다중특이적 또는 이중특이적 분자) 또는 그의 단편을 대상체에게 투여하는 단계 및 (ii) 상기 검출가능한 마커를 검출하는 수단에 상기 대상체를 노출시켜 Fc-발현 세포를 함유하는 부위를 확인하는 단계를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명의 면역접합체를 사용하여, 화합물 (예컨대 치료제, 표지, 세포독소, 방사성독소, 면역억제제 등)을 항체에 결합시킴으로써 표면에 CD30이 결합된 (예를 들어 막 결합된 또는 CD30 수용체에 결합된) 세포에 대해 상기 화합물을 표적화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 CD30 및 CD30 수용체 발현 세포, 예를 들어 호지킨 세포 또는 리드-스턴버그 세포를 생체외 또는 시험관내에서 (예를 들어 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소 또는 효소 보조 인자와 같은 검출가능한 표지를 이용하여) 국소화시키는 방법을 제공한다. 별법으로, 상기 면역접합체를 사용하여, 세포독소 또는 방사성독소를 CD30에 대해 표적화함으로써 표면에 CD30이 결합되어 있는 (예를 들어 막 결합된 또는 CD30 수용체에 결합된) 세포를 사멸시킬 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되나, 이로 한정되는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예 1: CD 30-특이적 인간 모노클로날 항체 ( HuMab )의 생성
I. CD30에 대한 완전 인간 모노클로날 항체를 생성하기 위한 트랜스제닉 (Cmu 표적화 ) 마우스의 생성
CMD 표적화 벡터의 제작
플라스미드 pICEmu는 Balb/C 게놈 람다 파지 라이브러리로부터 수득되며, mu 유전자를 스패닝하는 뮤린 Ig 중쇄 좌위의 EcoRI/XhoI 단편을 함유한다 [Marcu et al. Cell 22:187, 1980]. 이 게놈 단편을 플라스미드 pICEMI9H의 XhoI/EcoRI 부위 [Marsh et al; Gene 32, 481-485, 1984]에 서브클로닝하였다. pICEmu에 포함되어 있는 중쇄 서열은 mu 인트론 인핸서의 3'에 근접하여 위치한 EcoRI 부위의 하류에서부터 mu 유전자의 마지막 막횡단 엑손의 대략 1 kb 하류에 위치한 XhoI 부위까지 연장되어 있으나, mu 전환 반복부 영역의 대부분은 대장균 (Esterichia coli) 내에서의 계대배양에 의해 결실되었다.
표적화 벡터를 하기와 같이 제작하였다: pICEmu로부터 1.3 kb HindIII/SmaI 단편을 절단하여 HindIII/SmaI로 소화시킨 pBluescript (미국 캘리포니아주 라 졸라에 소재하는 스타라타젠 (Stratagene) 제품)에 서브클로닝하였다. 이 pICEmu 단편은 Cmu1의 5'로부터 대략 1 kb에 위치한 HindIII 부위에서부터 Cmu1 내에 위치한 SmaI 부위까지 연장되어 있다. 이로써 생성된 플라스미드를 SmaI/SpeI로 소화시키고, pICEmu 내에서 Cmu1 3'내의 SmaI 부위에서부터 마지막 Cmu 엑손의 하류에 근접하여 위치한 XbaI 부위까지 연장되어 있는 대략 4 kb SmaI/XbaI 단편을 삽입하였다. 이로써 생성된 플라스미드 pTAR1을 SmaI 부위에서 선형화하고, neo 발현 카세 트를 삽입하였다. 이 카세트는 마우스 포스포글리세레이트 키나제 (pgk) 프로모터 (XbaI/TaqI 단편; [Adra et al. (1987) Gene 60:65-74])의 전사 제어를 받으며 pgk 폴리아데닐화 부위 (PvuII/HindIII 단편; [Boer et al. (1990) Biochemical Genetics 28:299-308])를 함유하는 neo 유전자로 구성되어 있다. 상기한 neo 카세트는 플라스미드 pKJ1 (문헌 [Tybulewicz et al. (1991) Cell 65:1153-1163]에 기재되어 있음)를 EcoRI/HindIII 단편으로서 절단하여 수득한 것이며, 이것을 EcoRI/HindIII로 소화시킨 pGEM-7Zf(+)에 서브클로닝하여 pGEM-7(KJ1)을 생성하였다. neo 카세트를 EcoRI/SalI 소화에 의해 pGEM-7(KJ1)로부터 절단하여 평활 말단으로 만들고, 플라스미드 pTAR1의 SmaI 부위에 게놈 Cmu 서열의 반대 방향으로 서브클로닝하였다. 문헌 [Mansour et al. (1988) Nature 336:348-352]에 기재된 바와 같이, 이로써 생성된 플라스미드를 NotI으로 선형화시키고 헤르페스 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (tk) 카세트를 삽입하여, 상동성 재조합된 ES 클론이 풍부해지도록 하였다. 문헌 [Tybulewicz et al. (1991) Cell 65:1153-1163]에 기재된 바와 같이, 이 카세트는 마우스 pgk 프로모터가 일괄하는 (bracket) tk 유전자 코딩 서열 및 폴리아데닐화 부위로 구성되어 있다. 이로써 생성된 CMD 표적화 벡터는 대략 총 5.3 kb의 중쇄 좌위 상동체를 함유하고, 제1 Cmu 엑손의 유일한 SmaI 부위 내에 neo 발현 카세트가 삽입된 돌연변이 mu 유전자를 생성하도록 고안된 것이다. 플라스미드 서열을 절단하는 PvuI을 사용하여 표적화 벡터를 선형화한 후에 ES 세포에 전기천공하였다.
표적화된 ES 세포의 생성 및 분석
문헌 [Robertson, E.J. (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach (E.J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 71-112]에 기재되어 있는 바와 본질적으로 동일한 방식으로, AB-1 ES 세포 [McMahon, A.P. and Bradley, A., (1990) Cell 62:1073-1085]를 유사분열 불활성인 SNL76/7 세포 공급자 층 (동일 문헌)에서 성장시켰다. 하스티 (Hasty) 등이 문헌 [Hasty, P.R. et al. (1991) Nature 350:243-246]에 기재한 방법에 따라, 상기 선형화된 CMD 표적화 벡터를 AB-1 세포에 전기천공하였다. 전기천공된 세포를 100 mm 디쉬에 1 ×106 내지 2 ×106개 세포/디쉬의 밀도로 플레이팅하였다. 24시간 후, 배지에 G418 (활성 성분 1 ㎖ 당 200 ㎍) 및 FIAU (5 ×10-7 M)를 첨가하고, 8 내지 9일 동안 약물 내성 클론이 생성되도록 했다. 클론을 골라내어 트립신처리하고, 둘로 나누어 더욱 증식시켰다. 이어서, 각각의 클론으로부터 유래된 세포에서 절반은 동결시키고 나머지 절반은 벡터와 표적 서열 사이의 상동성 재조합에 대해 분석하였다.
DNA 분석은 써던 블럿 혼성화로 수행하였다. 라이드 (Laird) 등의 문헌 [Laird, P.W. et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19:4293]에 기재된 바와 같이, 상기 클론으로부터 DNA를 단리하였다. 단리된 게놈 DNA를 SpeI으로 소화시키고 mu 인트론 인핸서와 mu 전환 영역 사이의 서열에 혼성화하는 915 bp SacI 단편인 프로브 A로 프로빙했다 (도 1 참조). 프로브 A는 야생형 좌위로부터의 9.9 kb SpeI 단편을 검출하고, CMD 표적화 벡터와 상동성 재조합된 mu 좌위로부터 특징적인 7.6 kb 밴드를 검출한다 (neo 발현 카세트는 SpeI 부위를 함유함). 써던 블럿 분석으로 스크리닝한 1132 G418 및 FIAU 내성 클론 중 3개는 mu 좌위에서의 상동성 재조합을 지시하는 7.6 kb SpeI 밴드를 나타내었다. 벡터가 mu 유전자 내로 상동성 통합되었음을 입증하기 위해, 이들 3개의 클론을 효소 BglI, BstXI 및 EcoRI으로 추가 소화시켰다. 프로브 A로 혼성화하는 경우, 야생형 DNA의 써던 블럿을 BglI, BstXI 또는 EcoRI으로 소화시키면 각각 15.7 kb, 7.3 kb 및 12.5 kb 단편이 생성되지만, 표적화된 mu 대립유전자가 존재하면 각각 7.7 kb, 6.6 kb 및 14.3 kb 단편으로 나타난다. SpeI 소화에 의해 검출된 3개의 양성 클론 모두가 Cmu1 엑손 내로의 neo 카세트 삽입에 특징적이라고 예상되는 BglI, BstXI 및 EcoRI 제한 단편을 나타내었다.
돌연변이된 mu 유전자를 가지는 마우스의 생성
브래들리 (Bradley)의 문헌 [Bradley, A. (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach. (E.J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 113-151]에 기재된 바와 같이, 번호 264, 272 및 408로 표시한 표적화된 ES의 3가지 클론을 해동시켜서 C57BL/6J 배반포로 주입하였다. 주입한 배반포를 가임신 암컷의 자궁에 전달하여, 투입 ES 세포 및 숙주 배반포로부터 유래된 세포들이 혼합된 키메라 마우스를 생성시켰다. ES 세포가 키메라에 기여하는 정도는 흑색의 C57BL/6J 백그라운드 상에 ES 세포주로부터 유래된 아구티 (agouti) 코트가 착색된 양에 의해 가시적으로 평가할 수 있다. 클론 272 및 클론 408은 키메라를 낮은 비율(즉, 아구티 착색 비율이 낮음)로만 생성하였으나, 클론 264는 수컷 키메 라를 높은 비율로 생성하였다. 이들 키메라를 C57BL/6J 암컷과 교배시켜 아구티 후손을 생성하였으며, 이는 ES 세포 게놈의 배선 전달에 대한 지표이다. 표적화된 mu 유전자에 대한 스크리닝은 꼬리 생검으로 BglI 소화시킨 DNA의 써던 블럿 분석에 의해 수행하였다 (ES 세포 DNA 분석에 대해 상기한 바와 같음). 대략 50％의 아구티 후손은 15.7 kb 야생형 밴드 뿐만 아니라 7.7 kb의 혼성화 BglI 밴드까지 나타내었는데, 이는 표적화된 mu 유전자의 배선 전달을 입증하는 것이다.
mu 유전자의 기능적 불활성화에 대한 트랜스제닉 마우스의 분석
neo 카세트의 Cmu1 내로의 삽입이 Ig 중쇄 유전자를 불활성화시켰는지의 여부를 결정하기 위해, 클론 264 키메라를 JH 유전자 절편이 결실되어 중쇄 발현이 불활성화된 JHD 돌연변이 동형접합 마우스와 교배시켰다 [Chen et al, (1993) Immunol. 5:647-656]. 4 마리의 아구티 후손이 생성되었다. 이들 동물이 1개월령이 되었을 때 혈청을 채취하여 뮤린 IgM 존재에 대한 ELISA 분석을 수행하였다. 4 마리 후손 중 2 마리는 IgM이 완전히 결손된 것이었다 (표 1 참조). BglI 소화에 의한 꼬리 생검을 통한 DNA의 써던 블럿 분석과 프로브 A와의 혼성화 (도 1 참조) 및 StuI 소화와 475 bp EcoRI/StuI 단편과의 혼성화 (동일 문헌)에 의한 상기 4 마리 동물의 유전자형 분석은, 혈청 IgM을 발현하지 못하는 상기 동물들이 중쇄 좌위의 대립유전자 중 하나에서는 JHD 돌연변이가 일어났고 다른 하나의 대립유전자에서는 Cmu1 돌연변이가 일어난 동물임을 입증하였다. JHD 돌연변이에 대한 이형접합 마우스는 혈청 Ig를 야생형 수준으로 나타내었다. 이들 데이타는 Cmu1 돌연변이가 mu 유전자의 발현을 불활성시킴을 입증한다.
마우스 혈청 IgM (㎍/㎖) Ig H 쇄 유전자형
42 <0.002 CMD/JHD
43 196 +/JHD
44 <0.002 CMD/JHD
45 174 +/JHD
129 ×BL6 F1 153 +/+
JHD <0.002 JHD/JHD

표 1은 CMD 및 JHD 돌연변이가 둘다 일어난 마우스 (CMD/JHD), JHD 돌연변이에 대한 이형접합 마우스 (+/JHD), 야생형 (129Sv ×C57BL/6J) F1 마우스 (+/+) 및 JHD 돌연변이에 대한 동형접합인 B 세포 결핍 마우스 (JHD/JHD)에 대해 ELISA로 검출한 혈청 IgM 수준을 나타낸다.
II. HC 012 트랜스제닉 마우스의 생성
pHC2의 80 kb 인서트 [Taylor et al., 1994, Int. Immunol., 6:579-591]와 pVx6의 25 kb 인서트를 공동 주입하여 HC012 인간 중쇄 트랜스진을 생성하였다. 플라스미드 pVx6은 하기와 같이 제작하였다:
대략 2.5 kb의 5' 플랭킹 게놈 서열과 대략 5 kb의 3' 플랭킹 게놈 서열을 함께 보유하는 배선 인간 VH 1-18 (DP-14) 유전자를 포함하는 8.5 kb HindIII/SalI DNA 단편을 플라스미드 벡터 pSP72 (미국 위스콘신주 메디슨에 소재하는 프로메가 (Promega) 제품)에 서브클로닝하여 플라스미드 p343.7.16을 생성하였다. 대략 5 kb의 5' 플랭킹 게놈 서열과 대략 1 kb의 3' 플랭킹 게놈 서열을 함께 보유하는 배선 인간 VH 5-51 (DP-73) 유전자를 포함하는 7 kb BamHI/HindIII DNA 단편을 pBR322 기재의 플라스미드 클로닝 벡터 pGP1f [Taylor et al. 1992, Nucleic Acids Res. 20:6287-6295]에 클로닝하여 플라스미드 p251f를 생성하였다. pGP1f로부터 유래한 새로운 클로닝 벡터인 pGP1k를 EcoRV/BamHI으로 소화시켜서, 대략 4 kb의 5' 플랭킹 게놈 서열과 대략 5 kb의 3' 플랭킹 게놈 서열을 함께 보유하는 배선 인간 VH 3-23 (DP-47) 유전자를 포함하는 10 kb EcoRV/BamHI DNA 단편과 라이게이션시켰다. 이로써 생성된 플라스미드 pl12.2RR.7을 BamHI/SalI으로 소화시키고, p251f의 정제된 7 kb BamHI/SalI 인서트와 라이게이션시켰다. 이로써 생성된 플라스미드 pVx4를 XhoI으로 소화시키고, p343.7.16의 8.5 kb XhoI/SalI 인서트와 라이게이션시켰다.
다른 2개의 V 유전자와 동일한 방향의 VH 1-18 유전자를 보유하는 클론을 수득하였다. 이어서, 호간 (Hogan) 등의 문헌 [B. Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, 2nd edition, 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview NY]에 기재된 바와 같이, pVx6로 명명한 상기 클론을 NotI으로 소화시키고, 정제된 26 kb 인서트를 pHC2의 정제된 80 kb NotI 인서트와 함께 1 : 1 몰비로 반나절이 된 (C57BL/6J ×DBA/2J)F2 배아의 전핵에 공동 주입하였다. 주사한 배아로부터 발생된 마우스로부터 Vx6 및 HC2 둘다의 서열을 포함하는 트랜스제닉 마우스의 3가지 독립 세포주를 수립하였다. 이들 세포주를 (HCO12)14881, (HCO12)15083 및 (HCO12)15087로 명명하였다. 이어서, 상기 3가지 세포주 각각을 실시예 1에 기재된 CMD 돌연변이, JKD 돌연변이 [Chen et al. 1993, EMBO J. 12:811-820] 및 (KCo5)9272 트랜스진 [Fishwild et al. 1996, Nature Biotechnology 14:845-851]을 함유하는 마우스와 교배시켰다. 이로써 생성된 마우스는 내인성 마우스 중쇄 및 카파 경쇄 좌위의 파괴에 동형접합인 백그라운드의 인간 이뮤노글로빈 중쇄 및 카파 경쇄 트랜스진을 발현한다.
III. CD 30에 대한 HuMab 의 제조
상기와 같이 생성한 트랜스제닉 마우스에서 인간 CD30에 대한 인간 모노클로날 항체를 하기와 같이 제조하였다:
항원: 제 1 면역화를 위해 가용성 CD30을 완전 프로인트 (시그마 F5881) 아쥬반트와 혼합하였다. 이어서, 상기 항원을 불완전 프로인트 (시그마 F5506)와 혼합하였다. 100 ㎕ PBS 중의 25 ㎍ CD30을 유화용 바늘을 사용하여 아쥬반트와 1 : 1로 혼합하였다. 제조한 항원 0.2 cc를 마우스 복강내로 주사하였다.
트랜스제닉 마우스: 마우스를 여과 케이지에서 사육하며, 양호한 건강 상태에서 면역화, 채혈 및 융합 일수에 대한 데이타를 평가하였다.
면역화 방법: 14일마다 마우스에 완전 프로인트 아쥬반트 중의 L540 세포를 IP 주사한 후에 불완전 프로인트 아쥬반트 중의 가용성 재조합 CD30을 IP 주사하는 것을 병행하여 상기 마우스를 면역화하였다. 융합 72시간 전에, CD30을 발현하는 세포주인 L540에 대한 항-CD30 역가를 생성하는 동물에게 가용성 재조합 CD30을 IV 주사하였다. 마우스 비장세포를 수거하여 정제하고 융합시켰다. 융합에는 하이브리도마 제조: P3 X63ag8.653 뮤린 골수종 세포주 (ATCC CRL 1580, 제품번호 F-15183)를 사용하였다. ATCC에서 얻은 바이알을 해동시키고 배양하여 증식시켰다. 이러한 증식물로부터 접종용 스톡 (stock) 바이알을 제조하여 동결시켰다. 세포를 3 내지 6개월 동안 계속 배양하고, 1주에 2회씩 계대배양하였다. P388D1 (ATCC TIB-63 FL)을 200 mL에 현탁하여 모두 사용하였다. 상등액을 회전시켜 가라앉히고 여과하여 조건화 배지라고 공지된 배지 첨가물로서 사용하였다. 상기 세포주를 3 내지 6개월 동안 계대배양한 후에 새로운 바이알을 해동시켰다.
5％ FBS을 함유하는 하이 글루코스 DMEM (High Glucose DMEM) (메디아텍 (Mediatech) 제품, 셀그로 (Cellgro) 번호 10013245) 및 페니실린-스트레파티엔토마이신 (셀그로 번호 30004030)을 골수종 및 P388D1 세포 배양에 사용하였다. 5％ FBS을 함유하는 하이 글루코스 DMEM (메디아텍 제품, 셀그로 번호 10013245) 및 페니실린-스트레파티엔토마이신 (셀그로 번호 30004030)을 골수종 및 P388D1 세포 배양에 사용하였다. 하이브리도마 성장 배지에 3％ 오리겐-하이브리도마 클로닝 인자 (이겐 제품, 36335), 10％ P388D1 조건화 배지 (8/10/99 DH), 10％ FBS (하이클론 (Hyclone) 제품, SH30071 제품번호 AGH6843), L-글루타민 (깁코 (Gibco) 번호 1016483), 0.1％ 젠타마이신 (깁코 번호 1020070), 2-메르카파티에탄올 (깁코 번호 1019091), HAT (시그마 제품, H0262) (1.0 ×104 M 히포크산틴, 4.0 ×10-7 M 아미노파티엔테린, 1.6 ×10-5 M 티미딘) 또는 HT (시그마 제품, H0137) (1.0 ×10-4 M 히포크산틴, 1.6 ×10-5 M 티미딘)을 포함하는 추가의 배지 보충물을 첨가하였다.
하이브리도마를 가시적인 콜로니가 수립될 때까지 1주일 동안 성장시켰다. 상등액을 수거하고, 인간 카파 쇄 특이적 포획 및 인간 Fc 특이적 검출을 이용하는 ELISA를 통한 인간 IgG의 초기 스크리닝에 사용하였다. 이어서, IgG 양성 상등액을 L540 세포 및 CD30 ELISA를 이용하는 유식세포측정법을 통해 CD30 특이성에 대해 분석하였다.
특이적 HuMab IgG을 생산하는 하이브리도마를 서브클로닝하고 증식시켰다. 이어서, HuMab를 하기 방법을 이용하는 단백질 A 컬럼 크로마토그래피로 정제하였다: (1) 로딩 조건: 상등액을 인산염 완충 염수 (PBS)로 평형시킨 5 ㎖ 단백질 A 컬럼에 로딩함, (2) 세척: PBS 완충액, (3) 용출: 150 mM NaCl을 함유하는 0.1 M 글리신 (pH 2.9). 용출액을 1 M Tris 완충액 (모든 2 ㎖ 분획물에 30 ㎕씩)으로 중화시켰다. 각각의 용출 분획물을 겔 상에서 이동시켜 풀링 (pooling)하였다. 일단 쿠마씨 (Coomassie) 염색으로 순도가 입증된 분획물은 풀링하여 150 mM NaCl을 함유하는 10 mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.2)에 대해 투석하였다. 이 프로토콜에 따라, 목적하는 3가지 항체인 17G1-1, 5F11 및 2H9을 단리하였다.
하이브리도마의 RNA로부터 HuMab 17G1-1, 5F11 및 2H9의 VH 및 VL 영역을 단리하여 cDNA로 역전사시키고, V 영역을 PCR로 증폭하고 PCR 생성물을 서열분석하였다.
실시예 2: 결합 연구
I. HuMab 5F11의 친화도 및 속도 상도의 측정
재료
(1) 클론 HuMab 5F11의 IgG 형태의 2개 샘플 (미국 뉴저지주 안난데일에 소 재하는 메다렉스, 인크. 제품).
(2) 인간 CD30 항원 (미국 뉴저지주 안난데일에 소재하는 메다렉스, 인크. 제품).
(3) 항-인간 CD30/TNFRSF8 폴리클로날 항체 (R ＆ D 시스템즈 (R ＆ D Systems) 제품; 카달로그 번호 AF229).
(4) CM5 칩, 커플링 완충액: 10 mM 아세테이트 완충액 (pH 6.0 (CD30 커플링) 및 pH 3.5 (단백질 A 커플링)), 재생 완충액: 10 mM HCl.
(5) 비아코어 3000 (비아에발 소프트웨어 (BiaEval Software); v. 3.0.1.).
단백질 A 커플링
단백질 A (Fc2, 2367 Rus, 주입 시간 10분, 유속: 5 ㎕/분, pH 3.5)를 아미노-커플링 화학을 사용하여 CH5 칩 상에 커플링시켰다.
결합 연구
HuMab 5F11 (1 ㎕/mL)을 2.5분 동안 단백질 A 표면 상에 포획하였다 (별도의 실험에서, 단백질-G 칩 상에서는 유의한 양의 항체가 포획되지 않았음). 여러가지 농도 범위의 CD30을 포획된 항체에 통과시키는 2가지 실험을 수행하였다. 실험 1의 농도 범위에는 10 ㎕/mL, 6.67 ㎕/mL, 5 ㎕/mL, 3.33 ㎕/mL 및 1.67 ㎕/mL를 포함시켰고, 실험 2에는 5 ㎕/mL, 4 ㎕/mL, 2 ㎕/mL, 1 ㎕/mL 및 0.5 ㎕/mL를 포함시켰다. 결합 상이 10분 동안 지속된 후에 해리 상이 10분 동안 지속되었다. 데이타를 랭뮤어 (Langmuir) 1 : 1 결합 모델에 대해 작도하여 각종 파라미터를 결정하고, 이를 하기 표 2에 나타냈다:
실시예 번호 항체 샘플 Kon (×104 1/Ms) Koff (×10-5 1/s) KD (×10-9 M) Chi2
1 5F11 6.09 7.47 1.23 2.83
1 5F11 5.16 7.03 1.36 10.6
2 5F11 6.13 6.86 1.12 7.92
2 5F11 5.77 6.58 1.14 13.6

포획된 항체 표면의 안정성
HuMab 5F11 (1 ㎕/mL)을 단백질 A 표면 상에 2.5분 동안 포획하였다. 완충액을 1.5시간 동안 유동시켜 CD30 항원의 결합 및 해리 상을 모방함으로써, 포획된 항체 표면이 안정한지 확인하였다. 실험은 전체 실험 기간에 걸쳐 5F11에 대해 표면 수준이 변화되지 않는 (< 0.1％) 안정한 표면임을 나타냈다. 따라서, 5F11 샘플은 CD30 항원에 대해 유사한 친화도 상수를 나타내었고, 포획된 항체 표면은 추가 결합 연구를 수행할 만큼 안정하였다.
II. 재조합 CD 30에 대한 HuMab 의 투여량 -의존성 결합
시판하는 뮤린 항-CD30 항체인 BER-H2 (미국 캘리포니아주 카르펜테리아에 소재하는 다코 코포레이션 (DAKO Corp.))를 사용한 포획 ELISA를 하기와 같이 이용하여, 선택된 HuMab의 재조합 CD30에 대한 결합력을 조사하였다:
미량역가 웰을 BerH2로 코팅하였다. 웰을 5％ BSA 용액으로 차단한 후에, 재조합 CD30을 발현하는 형질감염된 세포로부터의 상등액을 BER-H2 코팅된 웰과 반응시켰다. 상등액을 제거하고, 단백질 A로 정제한 HuMab 5F11, 2H9, 17G1 및 이소형 대조군을 다양한 농도로 CD30-결합 웰과 37℃에서 인큐베이션하였다. 1시간 후 에, 상기 웰을 PBS-Tween으로 세척하고, 세포를 알칼리성 포스파타제로 표지된 염소 항-인간 IgG Fc-특이적 프로브와 37℃에서 인큐베이션함으로써 결합된 항체를 검출하였다. 잉여 프로브를 웰로부터 세척해 내고, 플레이트를 pNPP 발색제로 발색시켰다. 미량역가 플레이트 판독기를 사용하여 405 nm에서의 광학 밀도를 측정하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 항-CD30 HuMab가 투여량-의존성 결합함이 입증되었으나 이소형 대조군은 그렇지 않았다. 이는 항-CD30 HuMab가 재조합 CD30을 특이적으로 인식한다는 것을 지시한다. 항-CD30 HuMab 사이에서 CD30에 대한 결합량의 차이는 5F11, 2H9 및 17G1이 같은 류의 항체임을 지시하는데, 이는 결합량의 차이가 재조합 형태의 CD30에 대한 친화도 차이 또는 인식력 차이로 인한 것이라고 여겨지기 때문이다.
III. L540에 대한 HuMab 의 투여량 -의존성 결합
호지킨 종양 세포 상의 CD30에 대한 항-CD30 HuMab의 결합력을 유식세포측정법으로 하기와 같이 조사하였다.
CD30을 고수준으로 발현하는 호지킨 림프종 세포주인 L540에 대한 결합에 대해 항체를 시험하였다. 단백질 A로 정제된 HuMab 5F11, 2H9, 17G1 및 이소형 대조군을 다양한 농도로 L540 세포주와 4℃에서 인큐베이션하였다. 1시간 후에, 세포를 PBS로 세척하고, 세포를 FITC 표지된 염소 항-인간 IgG Fc-특이적 프로브와 4℃에서 인큐베이션함으로써 결합된 항체를 검출하였다. PBS를 사용하여 과량의 프로브를 세포로부터 세척해 내고, 세포 결합 형광량을 FACS-Calibur 기기에 의한 분석 으로 측정하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, HuMab 5F11, 2H9 및 17G1이 L540 세포에 고수준으로 결합하며 1 ㎍/㎖ 미만의 농도에서 포화됨이 입증되었다. 이들 데이타는 상기 항체가 살아있는 종양 세포 상에 발현된 천연 CD30에 효율적이고 특이적으로 결합함을 입증한다.
IV. 에피토프 맵핑
CD30은 혈청학적으로 규명되어 A, B 및 C라고 명명되는 적어도 3종의 클러스터를 함유하는 것으로 밝혀진 바 있다. HuMab 5F11과 결합하는 클러스터를 결정하기 위해서, 클러스터 A (Ki-4 및 BerH2), 클러스터 B (Ki-1) 또는 클러스터 C (AC10)에 특이적인 뮤린 항체의 L540 세포에 대한 FITC-표지된 5F11의 결합 억제력을 조사하였다. 요약하자면, L540 세포를 FITC-5F11 및 10 내지 20배 과량의 표지되지 않은 항체와 함께 60분 동안 빙상에서 동시에 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, FACS로 분석하였다. 모든 차단 항체는 뮤린 기원이었으며, 이를 포화 농도의 10배 과량으로 사용하였다. 5F11 HuMab (1 ㎍/㎖)를 플루오레신 이소티오시아네이트 (FITC)로 표지하고, CD30에 대한 결합을 형광-활성화 세포 분류 (FACS) 유식세포측정기 (FACScan, 독일 하이델베르크에 소재하는 벡톤 딕킨슨 (Becton Dickinson) 제품)를 사용하여 측정하였다. 1차 항체를 0.2％ 소 혈청 알부민 및 0.02％ 아지드화나트륨 (염색 완충액)을 함유하는 빙냉 인산염 완충 염수 (PBS)에 희석하고, 1 ×105개의 L540 세포 및 5F11-FITC mAb와 60분 동안 빙상에서 인큐베이 션하였다.
도 14에 나타난 바와 같이, 클러스터 A에 결합하는 항체는 L540 세포에 대한 FITC-5F11 결합을 억제할 수 있지만 클러스터 B 또는 C에 결합하는 항체는 억제할 수 없었는데, 이는 5F11이 클러스터 A 에피토프 또는 그 주변에 결합한다는 것을 지시한다.
실시예 3: 항체 의존성 세포 매개 세포독성 ( ADCC ) 연구
I. HuMab를 사용한, L540 호지킨 종양 세포의 단핵구 -매개된 항체 의존성 세포 매개 세포독성
건강한 인간 단핵구를 사용한 51Cr-방출 분석으로, 항-CD30 HuMab의 CD30-발현 종양 세포 용해 매개력을 조사하였다. 배양 중인 건강한 인간 단핵구를 IFN-γ로 활성화시켜 Fc 수용체 및 세포용해 활성을 상향조절하였다. L540 세포를 IFN-γ-활성화된 단핵구에 의한 용해에 대한 표적으로서 사용하였다. 정상 성인 출처 류코파크 (leukopac)로부터 정제된 단핵구 (미국 펜실바니아주에 소재하는 바이올로지칼 스페셜티 코포레이션 (Biological Specialty Corp.) 제품)를 10％ FBS 및 IFN-γ (1000 u/㎖, 미국 미네소타주 미네아폴리스에 소재하는 R ＆ D 시스템즈 제품)로 보충한 대식세포 혈청 무함유 배지 (M-SFM, 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드에 소재하는 깁코 제품)에서 2일 동안 배양하였다. 표적 세포를 100 μCi 51Cr로 1 내지 2시간 동안 표지한 후에, 이펙터 세포 (E : T = 50 : 1) 및 HuMab와 U자형 바닥 미량역가 플레이트에서 배합하였다. 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후에, 상 등액을 수집하고 방사활성을 분석하였다. 세포독성을 하기 방정식으로 계산하였다:
용해율(％) = (실험 CPM - 표적 누출 CPM)/(세정제 용해 CPM - 표적 누출 CPM) × 100％.
특이적 용해 = HuMab를 사용한 경우의 용해율(％) - HuMab가 없는 경우의 용해율(％).
분석은 3벌로 수행하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, HuMab 5F11, 2H9 및 17G1은 이소형 대조군과 비교할 때 호지킨 종양에서 유래한 L540 세포의 특이적 용해를 매개하였다. 이 결과는 이들 HuMab가 CD30-발현 종양 세포를 이펙터 세포에 표적화시켜, Fc 수용체 매개된 용해가 일어나도록 할 수 있음을 입증한다.
II. HuMab를 사용한, L540 호지킨 종양 세포의 단핵 세포-매개된 항체 의존성 세포 매개 세포독성
신선한 인간 단핵 세포를 사용한 51Cr-방출 분석으로, 항-CD30 HuMab의 CD30-발현 종양 세포 용해 매개력을 조사하였다.
신선한 인간 단핵 세포에 의해 용해될 표적으로서 L540 세포를 사용하였다. 헤파린처리한 전혈을 피콜 하이파크 밀도 원심분리하여 단핵 세포를 정제하였다. 표적 세포를 100 μCi 51Cr로 1 내지 2시간 동안 표지한 후에 각종 이펙터 : 표적 비율의 이펙터 세포 및 HuMab (5 ㎍/㎖)와 U자형 바닥 미량역가 플레이트에서 합하 였다. 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션한 후에, 상등액을 수집하고, 방사활성에 대해 분석하였다. 세포독성을 하기 방정식으로 계산하였다:
용해율(％) = (실험 CPM - 표적 누출 CPM)/(세정제 용해 CPM - 표적 누출 CPM) × 100％.
특이적 용해 = HuMab를 사용한 경우의 용해율(％) - HuMab가 없는 경우의 용해율(％).
분석을 3벌로 수행하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, HuMab 5F11 및 17G1은 이소형 대조군과 비교할 때 호지킨 종양에서 유래한 L540 세포의 특이적 용해를 매개하였다. 이 결과는 이들 HuMab가 CD30-발현 종양 세포를 불활성화된 이펙터 세포, 가장 가능성있게는 천연 킬러 세포 (NK)에 표적화시켜서, Fc 수용체 매개된 용해가 일어나도록 할 수 있음을 입증한다.
실시예 4: HuMab 5F11의 성장 억제
웰 당 2 ×104개 세포 (L540, L1236, 카르파스 (Karpas) 299, L428, BL38)가 들어있는 96-웰 플레이트에서 가용성 HuMab 5F11 항체 (0.1 ㎍/㎖, 1 ㎍/㎖ 및 10 ㎍/㎖)를 염소 항-인간 IgG (GAH-IgG) 항체 (10배 과량)와 가교시켰다. 37℃ 및 5％ CO2에서 96시간 동안 인큐베이션한 후에, 발색성 테트라졸륨 염 (소듐 3'-[1-[(페닐아미노)-카르보닐]-3,4-테트라졸륨]-비스 (4-메톡시-6-니트로)벤젠-술폰산 히드레이트)인 XTT 분석법으로 성장 억제를 측정하였다. 요약하자면, 10배 과량의 GAH-IgG의 존재 또는 부재하에 HuMab 5F11의 각종 희석물을 96-웰 플레이트 중의 100 ㎕ 분취액에 분배하였다. 완전 배지의 100 ㎕ 분취액에 표적 세포 (L540, L1236, 카르파스 299)를 2 ×104 내지 4 ×104개로 첨가하고, 플레이트를 48시간 동안 37℃ 및 5％ CO2 분위기에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포 배양물을 XTT 및 N-메틸 디벤조피라진 메틸 술페이트 (각각 최종 농도가 1.49 mM 및 0.025 mM임)를 보충한 신선한 배양 배지 100 ㎕로 4시간 동안 펄스시켰다. 샘플의 분광광도 흡광량을 450 nm 및 650 nm (기준 파장)에서 ELISA 판독기 (독일 에베르스베르크에 소재하는 MWG 바이오테크 (MWG Biotech))로 측정하였다. 음성 대조군은 상술한 표적 세포와 함께 GAH-IgG mAb만을 사용하여 측정하고, CD30 음성 세포주 (BL38) 상에서 HuMab 5F11과 가교 항체인 GAH-IgG의 배합물을 사용하여 측정하였다. 미처치 대조 배양액에 상대적인 세포 생존율을 방정식, (시험 값/미처치 세포) ×100을 사용하여 계산하였다. 모든 측정은 3벌로 수행하였으며, 2회씩 반복하였다. 특히, 하기 대조군을 사용하였다: (1) 2차 가교 항체가 없는 샘플, (2) 2차 가교 항체만이 존재하는 샘플, (3) 항체가 존재하지 않는 세포 샘플 및 (4) XTT만이 존재하는 샘플.
T-세포와 유사한 HD 세포인 L540 및 카르파스 299 세포에서는 세포-대사에 대한 명백한 투여량-의존성 효과가 나타났으나, B-세포와 유사한 HD 세포인 L428 및 L1236에서는 나타나지 않았다. IC50이 최고 농도 10 ㎍/㎖에 도달하였으며, 이는 세포독성 영향이 중간 정도임을 시사한다 (도 5 참조). GAH-IgG 또는 5F11 항체 모두의 경우에서 이들 단독으로는 어떠한 효과도 나타나지 않았으며 활성이 L540 및 카르파스 299 세포에 제한되었다는 점으로 볼 때 이것은 인위적인 것이 아니었다.
실시예 5: HuMab 5F11의 생체내 활성
국소화 종양 모델
이종이식된 마우스 모델을 사용하여 HuMab 5F11의 CD30-발현 종양 세포 성장 억제력을 생체내 시험하였다. PBS 200 ㎕ 중에 재현탁된 L540CY 세포 (1 ×107개)를 SCID 마우스의 우측 옆구리에 주사함으로써 피하 충실성 L540CY 종양을 수립하였다. 3일마다 종양 악화를 측정하고, 종양 체적을 방정식 (길이 ×폭 ×높이)/2로 측정하였다. 최대 직경 4 내지 6 mm의 종양이 수립된 동물들을 여러개의 군으로 무작위로 나누고, 5F11 100 ㎍을 4일마다 총 4회 주사로 투여 (PBS 200 ㎕ 중에서 i.p.)하였다. 대조군 마우스에는 PBS만을 투여하였다. 대조군의 정중(正中) (median) 종양 직경이 20 mm를 초과할 때 (제107일) 실험을 중지하고 마우스를 도살하였다. 처치 및 대조군은 각각 5마리의 동물로 구성되었으며 결과는 제2 세트의 실험으로 확인하였다.
HuMab 5F11을 4일마다 복강내로 4회 투여하였다. 말초 혈액 림프구 (PBL)를 처치 제1일에 1회 정맥내 투여하였다. 결과를 일수 (days)에 대해 플롯팅한 종양 체적으로 나타냈다 (도 6). 단독 투여된 PBL은 종양 성장에 영향을 미쳤으나 항체 첨가는 이 영향을 강화시켰다. 항체만으로도 유사한 항-종양 활성이 나타났다 (도 6). 이들 결과는 HuMab 5F11이 이를 단독으로 투여하거나 또는 인간 PBL과 병용하 여 투여한 동물 모델에서 CD30-발현 종양 세포의 성장을 억제할 수 있음을 입증한다.
파종형 종양 모델
병원체가 없는 암컷 C.B-17/Icr SCID 마우스 (FOX CHASE SCID (등록상표), 덴마크 리에 소재하는 M ＆ B A/S)를 병원체가 없는 조건하에 유지시키고, 오토클레이브된 표준 먹이와 물을 공급하였다. 파종형 모델에서 HuMab 5F11 처치가 인간 HL 세포 L540CY를 항원투여한 SCID 마우스의 생존에 미치는 영향을 평가하였다. 파종형 모델을 위해서, 기하급수적으로 성장하는 1 ×107개 L540CY 세포를 3 내지 4주령 SCID 마우스에 꼬리 정맥을 통해 주사 (iv)하였다. L540CY 세포를 주사하고 1일이 지난 후에, PBS 200 ㎕ 중에 희석한 5F11 100 ㎍을 마우스에 복강내 (ip)로 4일마다 총 4회 주사하였다. 대조군에는 동일한 처치 스케줄을 사용하는 PBS 단독, 5F11 + 10배 과량의 GAH-IgG mAb 및 GAH-IgG mAb 단독이 포함된다. 진행성 질환 (주름진 모피, 불활성, 두개골 변형)의 징후를 보이는 마우스를 도살하였다. 전반적인 조사 후에, 육안상으로 L540CY 세포에 의해 침윤된 기관을 포르말린으로 고정시켰다. 제200일에는 그 때까지 생존한 동물을 도살하고, 추가 조사를 위해 주요 기관을 포르말린으로 고정시켰다.
카플란-마이어 (Kaplan-Meier) 분석으로 입증되는 바와 같이 (도 15), 평균 생존 시간은 PBS를 처치한 대조군의 경우가 43일 (40 내지 46일 범위)이고, GAH-IgG를 처치한 군의 경우가 39일 (15 내지 51일 범위)이었다. 5F11 처치군에서는 3/5의 마우스가 장기 생존 (139일) 동물이었고, 부검시에 어떠한 질환 징후도 나타나지 않았다. 제17일에는 동물 1 마리가 어떠한 육안상의 질환 징후 없이 사망하였는데, 이는 사망 원인이 종양과는 관련없음을 시사한다. 제57일에는 2번째 마우스가 진행성 질환으로 사망했다. GAH-IgG mAb와의 가교시에, 4/4 마리의 마우스에서는 어떠한 종양 징후도 악화되지 않았으며, 제200일에 도살하였다. 따라서, HuMab 5F11을 사용한 처치는 이러한 HL 이종이식 모델에서 대부분의 동물에 대해 치료력이 있었다 (5F11 + GAH-IgG 및 5F11 처치군 각각에 대해 p = 0.01 및 p = 0.046).
실시예 6: 플루오레신화된 HuMab 5F11과 정상적인 인간 조직의 교차반응성
플루오레신화된 형태의 HuMab 5F11과 정상적인 인간 조직 냉동절편과의 잠재적인 교차반응성을 평가하기 위해, 간접 면역과산화효소 방법을 이용하였다. 예상되지 않은 교차반응은 관찰되지 않았다.
식약청 실험실 실무 (Food and Drug Administration's Laboratory Practice) (GLP) 규정 (21 CFR 58부)에 따라 연구를 수행하였다. 인간 조직 패널에는 EC CPMP 지침 III/5271/94 "모노클로날 항체의 생산 및 품질 조절"의 부록 II에서 '교차 반응성의 면역조직화학 조사에 사용되는 추천 인간 조직 목록'에 기재된 조직 및 1997 US FDA/CBER "인간에 사용하기 위한 모노클로날 항체 생성물의 제작 및 시험에 있어서의 고려 사항"에 권고된 조직이 포함된다.
부검 또는 외과 생검으로 미리 수득해 둔 조직을 티슈-테크 (Tissue-Tek (등록상표)) O.C.T. 배지에 담궈 드라이아이스로 동결시켰다. 조직을 약 5 ㎛로 잘라 서 10분 동안 실온 아세톤 중에서 고정시켰다. 시험물을 2가지 농도 (2 및 10 ㎍/mL)로 슬라이드에 가하고, 간접 면역과산화효소 방법 (다코 엔비젼 키트 (Dako EnVision Kit))을 이용하여 결합을 검출하였다.
이 결과는 시험물 HuMab 5F11-FITC가 호지킨병-유래 세포주인 양성 대조군 CD30-발현 L540 세포의 막 뿐만이 아니라 인간 편도선 중의 양성 대조군 CD30-발현 림프구의 막을 특이적으로 염색함을 지시했다. 양성 대조군 냉동절편과의 반응성은 시험된 농도 (10 ㎍/mL 및 2 ㎍/mL) 모두에서 격렬할 만큼 강력했다. 인간 편도선에서, CD30-양성 세포는 여포 주변부 뿐만이 아니라 인접한 여포간 영역에도 위치하며 1 내지 2％ 미만의 편도 세포에서 나타났다.
인간 시험 조직의 패널 조사는 교차반응이 인간 편도선을 제외한 어떠한 조직에서도 관찰되지 않았음을 나타낸다. 조사된 3명의 기증자 모두에서, 여포 주변부 뿐만이 아니라 인접한 여포간 영역에 위치한 림프구/단핵 세포와의 반응성이 관찰되었다. 1％ 미만의 편도 세포가 염색되었다. 이 반응성은 CD30의 편도선 발현에 대한 기존의 보고 [Hecht et al., 1985]를 바탕으로 할 때 예상된 것이었다.
실시예 7: 항체 서열분석
실시예 1에 기재된 바와 같이, 특이적 HuMab IgG를 생산하는 하이브리도마로부터의 HuMab를 단백질 A 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 3가지 관심 항체 17G1-1, 5F11 및 2H9를 단리하였다. 이어서, 하이브리도마 RNA로부터 HuMab 17G1-1, 5F11 및 2H9의 VH 및 VL 영역을 단리하여 cDNA로 역전사시키고, V 영역을 PCR로 증 폭하고 PCR 생성물을 서열분석하였다. 하기 서열들이 HuMab VH 및 VL 영역의 핵산 및 아미노산 서열이다:
Figure 112004030360516-pct00001

Figure 112004030360516-pct00002

실시예 8: 인간에서 CD 30에 의해 매개되는 호지킨병 ( HD )의 치료
호지킨병 (HD)은 MOPP 또는 ABVD와 같은 다중화학요법 처방의 도입 및 개선 된 방사선 조사 기술에 의해 치료가능한 질환이 되었다 ([Devita VT, Jr. et al., Ann Intern Med 73:881 (1970)], [Bonadonna G et al., Cancer Treat Rep 66:881 (1982)] 및 [Kaplan H.S. Cancer 45:2439 (1980)]). 더욱 최근에는, 질환의 단계가 진행된 환자에서의 반응 및 생존률이 독일 호지킨 림프종 연구 군 (German Hodgkin's Lymphoma Study Group)에 의해 확립된 BEACOPP-처방에 의해 개선된 것으로 나타났다 [Diehl. V et al., J Clin Oncol 16:3810 (1998)]. 그러나, 대부분의 환자가 표준 접근법으로 치료될 수 있지만, 재발 환자가 2차 치료를 받았을 때 이들 중 30％ 미만에서는 증상이 완화된 무질환 상태가 지속되었다 [Carella A.M. et al., Leuk Lymphoma 7 Suppl:21 (1992)]. 이러한 결과는 원발성 난치병을 앓고 있는 환자의 경우에 훨씬 더 악화된다 [Linch D.C., et al., Lancet 341:1051 (1993)].
호지킨병 뿐만이 아니라 직장결장암, 골수 백혈병 또는 비-호지킨 림프종 (NHL)을 비롯한 다른 악성 질환에서 얻은 데이타는 1차 치료 후에 남아있는 소수의 잔류 종양 세포가 질환을 재발시킬 수 있음을 시사하였다 ([Kanzler H et al., Blood 87:3429 (1996)], [Wolf J et al., Blood 87:3418 (1996)], [Riethmuller G et al., Lancet 343:1177 (1994)], [Roy D.C. Blood 77:2404 (1991)] 및 [Gribben J.G. et al., N Engl J Med 325:1525 (1991)]). 따라서, 1차 치료 후에 남아있는 잔류 호지킨-리드/스턴버그 (H-RS) 세포를 제거하면 HD의 치료 결과를 더 개선시킬 수 있다. 항체-독소 구조물 (면역독소), 방사선면역접합체 및 비변형된 모노클로날 항체를 비롯한 수많은 여러 모노클로날 항체가 HD 환자의 치료에 대하여 평가되 어 왔다 ([Herpst J.M. et al., J Clin Oncol 13:2394 (1995)], [Schnell R., et al., LeukLymphoma 30:525 (1998)], [Engert A., et al., Blood 89:403 (1997)] 및 [Schnell R., et al., submitted, (2001)]). 가능한 별법으로서, 이중특이적 항체가 HD에서의 면역시약으로서 주목을 받아 왔다. 일반적으로, 이중특이적 항체는 허용성이 높은 것으로 밝혀져 있다. 그러나, 이들 구조물의 부작용 및 세포독성 가능성은 표적화된 이펙터 세포에 따라 크게 달라진다.
지금까지는 대부분의 이중특이적 항체가 림프구 또는 NK 세포의 여러가지 서브세트를 포함하였는데, 이는 악성 질환, 특히 HD를 앓고 있는 환자에서는 덜 효과적이었다 [Hartmann F., et al., Blood 89:2042 (1997)]. 따라서, 활성화된 호중구, 단핵구 및 대식세포에서 발현되는 고친화도의 FcγRI 수용체 (CD64) [Ravetch J.V. et al., Annu Rev Immunol 9:457 (1991)] 기재의 신규 이중특이적 분자 (이중특이적 분자)를 제작하였다. CD64는 FcγRI을 발현하는 세포 독성 이펙터 세포에서 촉발 분자로서 작용한다. 단량체 IgG 뿐만이 아니라 IgG-항원 복합체 둘다가 FcγRI에 결합한다. FcγRI에 IgG-항원 복합체만 결합하면 세포용해, 호흡 파열 및 산화 효소의 생성 등을 비롯한 세포독성 활성이 증가되는 결과를 초래한다 ([Fanger M.W. et al., Immunol Today 10:92 (1989)] 및 [van de Winkel J.G. et al., J Leukoc Biol 49:511 (1991)]).
뮤린 모노클로날 항체인 M22는 정상적인 Fc 결합 도메인 이외의 에피토프에서 FcγRI과 결합하여 혈청 IgG와 경쟁한다 [Guyre P.M. et al., J Immunol 143:1650 (1989)]. 본 발명에 보고된 신규 이중특이적 분자 제작에 사용되는 결합 단위는 H22라고 불리는, 항-CD64 모노클로날 항체 M22의 인간화 버전 [Graziano R.F. et al., J Immunol 155:4996 (1995)]을 기재로 한다. H22 F(ab') 단편을 항-CD30 모노클로날 항체 Ki-4로부터 유래된 F(ab') 단편에 화학적으로 결합시켰다. 이로써 생성된 이중특이적 분자 H22 ×Ki-4의 분자량은 104 kDa이기 때문에, 이 분자는 완전 항체와 비교할 때 종양으로의 침투가 더욱 양호하다. 또한, 이러한 유형의 구조물은 보체를 활성화시키지도 않고 Fc-수용체를 발현하는 비-세포독성 세포에 결합하지도 않기 때문에 부작용이 최소화된다 [Fanger M.W. et al., Crit Rev Immunol 12:101 (1992)].
H22 ×Ki-4의 전임상 실험관 내 시험 결과는 이러한 이중특이적 분자가 단핵구-유래된 대식세포 (MDM)와 관련된 식작용 뿐만 아니라 단핵구와 관련된 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)을 매개함을 입증하였다 [Sundarapandiyan K. et al., J Immunol Methods 248:113 (2001)]. 따라서, CD64는 HD에서 면역적격 이펙터 세포를 동원하는데 있어서의 유망한 표적이다. 하기하는 임상 제I상 연구를 수행하여, HD를 앓고 있는 환자에서 상기한 신규의 치료 이중특이적 분자의 효능을 입증하였다.
I. 환자 및 방법
환자
측정가능하며 활발한 진행성의 난치성 HD를 앓고 있으며 통상적인 화학요법으로는 치료되기 어려운 환자가 적합하다. CD30 항원의 존재는 H22 ×Ki-4를 처치하기 전 1년 이내에 실시한 종양 생검으로 수득한 H-RS 세포의 30％ 이상과 항- CD30 항체와의 반응성에 의해 입증되어야 한다. 기존의 화학요법 또는 방사선요법은 약물 투여 연구 4주 전에 종료해야 한다. 또한, 다음과 같은 조건들을 충족해야 한다: 객관적으로 측정가능한 질환 부위가 존재할 것, 세계 보건 기구 (WHO)에 따른 활동도 (performance status)가 2 이하일 것, 연령이 18 내지 70세일 것, 예상 수명이 3개월 이상일 것, 혈청-크레아티닌이 2 mg/100 ㎖ 미만일 것, 혈청-알부민이 하한선의 75％를 초과할 것, 초음파 심장 검진으로 측정한 심장 기능의 최저치 (baseline) 좌심실 박출률 (LVEF)이 35％를 초과할 것 및 기타 중요한 의학적 문제가 없을 것. 진행성 HD를 앓고 있는 환자는 코르티코스테로이드 요법이 필요한 경우가 종종 있기 때문에, 코르티코스테로이드 처치의 병행은 배제할 기준이 아니었다. 이 프로토콜은 공공 윤리 위원회의 승인을 받았으며, 환자는 처치의 조사 특성에 대한 서면 숙지 동의서 (informed consent)를 제출해야 한다.
연구의 고안
본 임상 실험은 공개적이었으며 무작위화한 것이 아니었고 투여량을 단계적으로 늘리는 제I상 연구였다. 첫번째 목적은 H22 ×Ki-4를 인간에게 정맥내 주입으로 투여하는 경우에 인간에서 H22 ×Ki-4의 최대 허용 투여량 (MTD)을 결정하는 것이었다. 두번째 목적은 약동학, 투여량 제한 독성 (DLT), 생물학적 최적 투여량 및 임의의 항종양 활성 측정을 포함했다. 환자에게 각각 4회 주입으로 구성된 처치 과정을 2회 이상 반복 적용하였다. 제1일, 제3일, 제5일 및 제7일에 H22 ×Ki-4를 각각 투여하였다. 환자 반응에 대한 조사자 개인의 소견에 따라 부가적인 치료 과정이 추가되었다.
투여량의 단계적 증가 및 주요 독성의 규정
최대 허용 투여량 (MTD)은 독성에 의해 제한되는 투여량에 미치기 직전의 최고 투여량 수준으로 정의하였다. 이 투여량은 3 또는 6명의 환자 중 2명 이상에서 DLT가 발생하는 양으로 정하였다. 6명의 환자로 MTD 결정 실험을 수행하였다. 다음과 같은 가속화된 적정법을 고안하여 MTD를 평가하였다: 가속기에 코호트 (cohort) 당 1명의 환자에게 투여량을 2배로 늘려 (100％ 증가)가면서 투여하는데, DLT의 첫번째 사례가 관찰되는 임의의 시기 또는 제II등급 독성의 두번째 사례가 관찰되는 임의의 시기까지 계속 반복한다 [Simon R et al., J Natl Cancer Inst 89:1138 (1997)]. 이어서, 현재 투여량 수준의 코호트 환자수를 3명 이상으로 늘리고, 표준 변형된 피보나시 (Fibonacci) 투여량 단계별 증량법 (투여량 증가분 50％)을 이후의 모든 투여량 수준에 이용했다. 상기 연구 약물과 관련이 있다고 판단되지 않는 부작용은 이러한 투여량 증량 규정 및 MTD 측정 규정 측면에서 독성으로 간주하지 않았다. 투여량 군은 1.0 mg/m2/d, 2.5 mg/m2/d, 5 mg/m2/d, 10 mg/m2/d 및 20 mg/m2/d이었다. 총 6명의 환자에게 독성 부재와 관계없이 20 mg/m2/d의 투여량 수준을 적용시켰다. DLT를 임의의 제III등급 또는 제IV등급의 비-혈액계 독성 (NCI 기준에 따름)으로 정의하거나 림프구감소증, 단핵구감소증 또는 호중구감소증을 제외한 제IV등급의 혈액계 독성으로 정의하였다. 환자에게 H22 ×Ki-4를 어떠한 투여량 수준으로 3차 투여까지 완료했는데도 DLT가 발생하지 않은 경우에는 그 다음 투여량 수준을 투여할 수 있었다. 주입하는 동안과 주입 후 6시 간까지는 매 시간마다 생체 징후를 제어하였다. 완전한 혈액 세포의 수치, 생화학적 변화, 뇨 상태, WHO 기준에 따른 활동도 및 독성 평가 등에 대하여 환자를 매주 모니터링하였다. 각 과정의 제28일에는 심전도 검사, 흉부 X-레이 촬영, 초음파 심장 검진, 폐 기능 시험, 혈청-크레아티닌 측정 및 종양 반응의 평가 등에 대한 최저치 평가를 반복하였다.
약물 제제화 및 투여
이전에 문헌 [Glennie M. J. et al., J Immunol 139:2367 (1987)]에 기재된 바와 같은 글레니 (Glennie)의 방법을 이용하여 H22 ×Ki-4를 생성하였다. 1 mg/㎖ H22 ×Ki-4를 함유하는 멸균된 10 ㎖ 바이알에 약물을 넣고 4℃에 보관하였다. 각각의 주입 전에, H22 ×Ki-4를 총 투여량의 10％ 또는 0.2 mg 중 더 적은 양으로 통상의 염수 50 ㎖ 중에 용해시킨 것을 초기 시험량으로 하여 10분에 걸쳐 환자에게 정맥내 투여하였다. 이어서, 환자에게 아세트아미노펜 1000 mg을 경구로 예비-투약하고, H22 ×Ki-4의 마지막 투여량을 투여하기 30분 전에 클레마스틴 1 mg을 경구 투약하였다. 이러한 시험 투여량이 30분 후에 임의의 유의한 독성을 나타내지 않고 허용되는 경우, H22 ×Ki-4를 통상의 염수 500 ㎖ 중에 희석하여 3 mg/시간으로 출발하여 정맥내 투여하였다. 60분 후에 부작용이 인지되지 않는 경우에는, 주입 속도를 각각 6 mg/시간으로 증가시킨 후에 9 mg/시간으로 증가시켰다.
약동학
H22 ×Ki-4 투여 제1일에, H22 ×Ki-4의 주입 전, 주입 직후, 매 회의 주입 후 제2시간, 제4시간, 제8시간, 제12시간, 제24시간 및 제48시간에 혈액 샘플을 헤 파린처리한 튜브에 담았다. 10분 동안 1,200 g에서 회전시켜 혈액 세포로부터 혈장을 분리한 후에 약동학 분석을 수행할 때까지 -20℃에 보관하였다. 처음 3명의 환자에 대한 H22 ×Ki-4 분석의 검출 한계는 0.125 ㎍/㎖이었고, 이후의 모든 환자들의 경우에는 0.04 ㎍/㎖이었다. 시간에 따른 혈장 H22 ×Ki-4 농도 변화에 대한 데이타를 각각의 대상체에 대하여 시간에 대한 H22 ×Ki-4 농도의 반대수(半對數) 플롯으로 검토하였다. Cmax 및 Tmax 값은 원래의 약동학 데이타로부터 관찰된 값이었다. 다른 표준 약동학 파라미터는 윈논린 프로 (WinNonlin Pro) 약동학 프로그램 (미국 캘리포니아주 마운틴 뷰에 소재하는 파르사이트 코포레이션 (Pharsight Corporation) 제품)을 이용하여 추정하였다. 농도-시간 데이타를 개방형 비-구획법 (윈논린 모델 202)을 이용하여 분석하였다. 최종 제거 속도 상수 (ke)는, 비-가중된 패러다임을 이용하여 혈장 H22 ×Ki-4 농도의 로그값 대 시간 플롯의 최종 3 내지 6 지점의 선형 회귀법을 이용한 비-구획 분석법으로 측정하였다. 최종 제거 반감기는 (T1/2)는 0.693/ke로부터 추정하였다. 마지막 데이타 수치까지의 AUC는 직선형 사다리꼴 규칙을 이용하여 추정하고, 바그너-넬슨 보정 (Wagner-Nelson correction (Clast/ke))하여 무한대까지 외삽법으로 추정하였다. 총 체내 제거율 (CL)은 투여량/AUC(0~무한대) 나눗셈으로 계산하였다. 겉보기 체적 분포 (Vdz)는 CL/ke로부터 추정하였다. 평균 체류 시간 (MRT)은 AUMC/AUC로부터 추정하였다. 정상 상태 (steady state)에서의 겉보기 체적 분포 (Vdss)는 식, Vdss = CL ×MRT로 부터 추정하였다. 누적 인자-R은 식, 처치X AUC(0-)/처치1 AUC(0-)로부터 추정하였다. 이 처치X에서 AUC(0-)는 0 내지 임의의 처치시 투여 간격까지의 AUC이고, AUC(0-)는 제1일에 0 ~ 무한대까지의 AUC였다.
생물학적 활성 평가
본 발명의 이중특이적 분자로는 DLT를 발생시키기가 쉽지 않기 때문에 생물학적 활성에 대한 대체 파라미터를 조사하였다. 말초혈에서의 단핵구 수를 H22 ×Ki-4의 주입 직전과 직후 및 주입 후의 제2시간, 제4시간, 제8시간 및 제24시간에 측정하였다. CD64-발현은 적절한 항체를 사용하여 FACS-분석에 의해 측정하였고, 이소형 대조군에 대한 상관관계를 분석하였다 (FACS-Calibur, 벡톤 딕킨슨 제품). 동일 시점에서, IL-6, IL-15, G-CSF 및 TNF-α의 혈청-수준을 시판되는 효소-결합 면역흡착 분석 (ELISA) 키트를 이용하여 측정하였다. 이어서, 처치 전의 사이토카인 수준과 이중특이적 분자 처치 후의 사이토카인 수준의 관계를 분석하고 윌콕스콘-시험 (Wilcoxcon-test)을 이용하여 유의성에 대하여 시험하였다. 이중특이적 분자 수준에 대한 상관관계를 피어슨 (Pearson) 계수를 이용하여 시험하였다.
종양과 관련하여, 이중특이적 분자의 각 투여일 전후로 sCD30 수준을 ELISA (다코 제품)로 측정하였다. 2명의 환자가 H22 ×Ki-4의 최종 주입 24시간 후에 팽대된 말초 림프절의 진단용 생검에 대한 숙지 동의서를 제공하였다. 이 물질을 둘로 나누고, 이 중 하나는 즉시 신선 동결시켜 -80℃에 보관하고, 다른 하나는 파라핀에 묻었다. 면역조직화학 조사를 위해서, 상기 조직을 파라핀에서 꺼내어 5 ㎛ 의 절편으로 절단하여, 돼지 혈청으로 10분 동안 차단시켜 비특이적 염색 가능성을 감소시켰다. 이어서, 1차 모노클로날 항체인 폴리클로날 토끼 항-마우스 Ab (다코 제품)를 PBS 중에 1 : 50으로 희석하여 첨가하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후에 바이오티닐화된 돼지 항-토끼 항체와 인큐베이션 (1 : 200으로 희석하여 45분 동안 실온에서 인큐베이션함, E 431 다코)하고, 표준 바이오틴-스트렙타티엔타비딘 키트 (다코 제품)에 적용하였다. 마지막으로, 슬라이드를 속성-레드 (fast-red) (다코 제품)로 염색하였다. 상기 과정 동안에, 본 연구에서 처치되지 않은 환자의 HD 표본을 제1 음성 대조군 (이중특이적 분자가 없음)으로서 염색하였다. 제2 음성 대조군 (염색 과정에 사용된 다른 항체로 인한 비특이적 교차반응을 배제시키기 위함)은 상기 실험에서 수득하여 1차 항체 없이 염색한 물질이었다.
HABA / HAMA -반응
이전에 문헌 [Pullarkat V., et al., Cancer Immunol Immunother 48:9 (1999)]에 기재된 바와 같은 방법을 이용하여, 인간 항-이중특이적-항체 반응을 측정하였다 . 요약하자면, 이중특이적 분자로 코팅된 미량역가 플레이트를 혈장 샘플 희석액과 함께 인큐베이션하고, 알칼리성 포스파타제에 접합된 염소 항-(인간 IgG) Fc-특이적 프로브로 항-이중특이적 분자 항체를 검출하였다. HABA-수준은 주입 전의 기준 수치에 대한 X배 증가량으로 나타내었다.
반응 평가
단계화 과정은 앤 아보 (Ann-Arbor) 분류 시스템에 따라 수행하였다. 완전 완화 (Complete Remission; CR) 상태는 4주 이상의 기간에 걸쳐 활성 질환에 대한 임의의 임상적 증거 또는 방사선학상의 증거가 없는 것으로서 정의하였다. 부분 완화 (Partial Remission; PR) 상태는 4주 이상의 간격을 두고 2회 연속 관찰하여 측정할 때, 모든 측정가능한 병소에서 2개의 가장 큰 직각 교차 (perpendicular) 직경의 수치가 50％ 이상 감소하는 것으로서 정의하였다. 다시 4주 이상 지속되는 종양의 총 질량이 25％ 미만으로 감소하거나 증가하는 것은 무변화 (NC)로 정의하였다. 진행성 질환은 임의의 새로운 병소가 발생하거나 종양 크기가 25％ 초과로 증가하는 것으로서 정의하였다.
II. 결과
환자 특성
환자군은 5가지 상이한 투여량 수준으로 수회 예비처치하였으며 평가가능한 HD 재발 환자 총 10명을 포함했으며, 이들 중 2명은 여성이었다. 이들의 연령은 21 내지 53세 범위였으며 정중 연령은 34.6세였다. 조직학 분석에는 혼합 세포충실성 (cellularity)의 호지킨병 환자 3명과 결절성 경화증 아형 환자 7명을 포함하였다. 정중 재발 회수는 3회였다 (1 내지 7회 범위). 10명 중 9명의 환자에서는 자가 줄기 세포 지지체의 고투여량 화학요법을 포함하는 예비 화학요법을 정중치 4회 (2 내지 6회 범위)로 투여하였다. 또한, 모든 환자를 방사선요법으로 예비처치하였다. 연구 시작 시점에서 환자군 중 7명의 환자는 제IV기 질환을, 3명의 환자는 제III기 질환을 앓고 있었으며, 5명의 환자에서는 B-증상이 있었고, 8명의 환자에게는 H22 ×Ki-4를 처치하는 치료 과정 (각 과정은 H22 ×Ki-4의 4회 주입으로 구성됨)을 2번 반복하고, 1명의 환자에게는 3번, 다른 1명의 환자에게는 4번 반복 하였다.
독성
모든 부작용은 주입하는 동안 및 주입 후 6시간 이내까지 발생하는 일시적인 현상이었다 (표 2 참조). 10명의 환자 모두에게서 경미한 피로가 관찰되었다. 다른 독성 증상으로는 경미한 저혈압 (제I등급; 4명), 빈맥 (제I등급; 6명), 발열 (제I등급; 2명, 제II등급; 3명), 오한 (제I등급; 4명) 및 근육통 (제I등급; 3명) 등을 포함했다. 이러한 부작용은 모두가 24시간 이내에 사라졌다. 혈액계 독성이나 기관 독성은 관찰되지 않았다.
약동학
이중특이적 분자 수준은 5 mg/m2/d 초과로 투여한 환자에서만 검출할 수 있었다. 매 처치일에 모든 대상체에서는 주입 완료시 또는 그 이후에 Tmax가 발생하였다. 모든 환자에서 시간에 따른 혈장 농도 감소는 1차 지수 (monoexponential)로 증가하였다. Cmax 및 AUC는 시간에 따라 증가하는 경향을 보였다. 따라서, 1주일의 처치 기간에 걸쳐 Cmax, T1/2z, AUC, Cl 및 Vdz에 있어서의 변동을 단일변량의 단일 인자로 반복 측정하는 분석을 수행하였다. 이러한 분석은 시간 경과가 Cmax (F = 5.885; p = 0.006) 및 AUC (F = 5.976; p = 0.005)에 미치는 영향이 유의함을 나타내었다. 이는 H22 ×Ki-4가 반복 투여에 의해 축적됨을 시사한다 (도 1 및 2 참조). 연구한 모든 환자의 경우에 있어서, 4차 투여시까지의 축적 인자 R의 정중 치는 1.36 (0.98 내지 3.90 범위)이었다. H22 ×Ki-4의 최종 반감기는 10 mg/m2/d 투여량 (n = 1)에서는 7.9시간이었고, 20 mg/m2/d 투여량 수준에서는 11.1시간 (평균) (정중치 11.1시간; 5.3 내지 18.2시간 범위)이었다 (표 3 참조). 체적 분포 범위는 20.26 내지 183.20 L/m2이었다. 20 mg/m2 투여군에서 체적 분포의 평균값 (Vdz)은 53.17 L/m2이었다. 제1일에 H22 ×Ki-4의 총 체내 제거율은 1.02 내지 14.06 L/m2로 달라지는데, 20 mg/m2를 투여한 환자군에서의 평균값은 3.91 L/시간/m2이었다. 측정가능한 수준의 이중특이적 분자를 투여한 모든 환자에서는 제2 치료 과정의 종료 후에 HABA가 낮은 수준으로 검출가능하였으며, 이중특이적 분자의 혈청 수준이 감소하지도 않았고 알레르기성 반응이 발생하지도 않았다 (표 2 참조). 이중특이적 분자를 4회 주기로 처치한 환자에서는 HABA가 높은 수준으로 발생하였다.
생물학적 활성
H22 ×Ki-4 주입 완료 후의 제2시간 내지 제4시간에는 IL-6, IL-15, TNF-α 및 G-CSF의 방출량이 최대였다. 사이토카인 방출량은 유의하지 않았는데, 이는 평가가능한 환자 수 (n = 6)가 제한되어 있고 사이토카인 수준이 환자간에 차이가 크기 때문인 것으로 여겨진다. 그럼에도 불구하고, 도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 사이토카인 방출에는 뚜렷한 경향이 있었다. 사이토카인 방출량은 이중특이적 분자의 반복 투여에 따라 호전되는 것으로 여겨지며, IL-15보다 G-CSF, TNF-α 및 IL-6의 경우에 더욱 현저하게 호전되었다. 이와 동시에, 말초혈 단핵구에서는 CD64 발현량 (p = 0.018) 뿐만이 아니라 이들의 혈액 수치도 유의하게 감소하였다 (도 5 참조). 혈청 sCD30-수준은 종양 수치가 높은 환자에서 현저하게 증가하였으나, 이중특이적 분자를 1차 주입한 이후에는 더 이상 검출가능하지 않았으며, 모든 환자에서 처치 완료시까지 매우 낮은 수준으로 유지되었다 (데이타는 나타내지 않음).
면역조직화학
상기한 방법을 이용하여, 2명의 환자 모두의 림프절 표본에서 이중특이적 분자의 뮤린 단편을 검출할 수 있다 (도 6 참조). 염색 결과는 HRS-세포가 세포질 전체에 위치한다는 것을 명시하였다. 또한, 이 조직의 대식세포도 동일한 염색 패턴을 나타내었다. 따라서, 이중특이적 분자가 악성 림프절에 침투한다는 것이 명백하게 입증되었다.
종양 반응
전반적으로, 4명의 환자에서 H22 ×Ki-4 이중특이적 분자에 대한 목적하는 반응이 관찰되었다. 최대 10 mm까지 크기의 미만성 폐결절 (diffuse pulmonary nodule)을 앓고 있는 환자에게서는 CR이 관찰되었다. 이러한 반응은 3개월 동안 지속되었다가 폐결절이 CT-스캔으로 다시 측정가능해졌으며, 이를 치료하기 위한 화학요법을 개시하였다. 3명의 환자에서는 4 내지 5개월 동안 지속되는 PR이 입증되었다. 4주 후에는 1명의 환자 (4번 환자)에게 추가의 화학요법을 시행하였다. 이 환자에서 유일한 질환 부위는 흉곽 척추 침윤부였다. 이중특이적 분자의 처치는 신경학적 결함을 완전히 해소하였고, 측정가능한 부분 반응을 유도하였다. H22 ×Ki-4를 또다른 2 주기 동안 투여한 후에는 반응이 더이상 개선되지 않았기 때문에, 화학요법을 시행하여 질환의 진행 및 치명적일 수 있는 척추 골절이 발생할 위험을 최소화했다.
2가지의 최저 투여량 수준으로 처치한 환자 중 2명은 진행성 질환을 앓고 있었고, 4명은 질환 상태가 안정하였다. 이들 중 이전에 화학요법을 받은 후에 생명을 위협하는 독성 (패혈증, 급성 신부전, 2개월 동안 기계적 호흡 보조장치를 사용함)을 경험한 적이 있는, 종양이 매우 심각한 (흉막이 있는 우측 상부 폐의 침윤 및 흉곽 벽의 침윤) 환자 (6번 환자)에서는 그의 증상 (기침, 도한(盜汗))이 두드러지게 개선되었다. 질환 안정화 및 상기 환자의 일반적 상태의 정상화는 12개월 동안 지속되었다.
III. 결론
상기한 연구 결과는 다음을 입증한다: 1) H22 ×Ki-4는 80 mg/m2 (제1일, 제3일, 제5일 및 제7일에 투여함) 이하의 투여량에서 단지 경미한 수준 내지는 중간 정도 수준의 일시적 부작용만을 수반할 정도로 허용성이 높음. 투여량 제한 독성은 없었으며 이 구조물의 최대 허용 투여량에는 도달하지 못했음; 2) 최대 투여량으로 투여한 H22 ×Ki-4의 반감기는 11.1시간이며, 이것은 Cmax 및 AUC에 의해 측정된 바와 같이 약물이 치료 기간에 걸쳐 유의하게 축적되도록 하고; 3) IL-6, IL-15, TNF-α 및 G-CSF의 사이토카인이 방출되었을 뿐만 아니라 단핵구 및 CD64 발현이 감소되어, 생물학적 유효 투여량 및 스케줄을 제안함; 4) H22 ×Ki-4가 예비처치된 진행성의 난치성 HD 환자에서 종양 반응을 유도함. H22 ×Ki-4는 뮤린 항-CD30 모노클로날 항체 Ki-4와 인간화된 항-CD64 모노클로날 항체 H22로부터 유래되어 화학적으로 결합된 2개의 F(ab') 단편으로 구성된 신규한 이중특이적 분자이다. 이 구조물은 H-RS 세포주에 대하여 시험관내 활성을 나타내었다 [Sundarapandiyan K. et al., J Immunol Methods 248:113 (2001)].
H22 ×Ki-4를 사용한 본 발명의 첫번째 임상 실험에서 가장 일반적인 부작용은 처치된 10명의 환자 모두에게서 발생한 피로였다. 다른 부작용으로는 빈맥, 저혈압, 오한, 발열 및 근육통 등이 있었다. H22 ×Ki-4의 독성 프로파일은 리툭시맵 (Rituximab), Campath-1H 또는 OKT3 등을 비롯하여 림프종 세포에 대한 여러 모노클로날 항체의 독성 프로파일에 대하여 기재된 "사이토카인-방출 증후군" ([Winkler U., et al., Blood 94:2217 (1999)], [Wing M.G. et al., J Clin Invest 98:2819 (1996)] 및 [Norman D. J. et al., Transplant Proc 25:89 (1993)])과 유사하였다. 이러한 증상은 모든 투여량 수준에서 발생하였고, 훨씬 더 낮은 투여량일지라도 생물학적 활성이 있음을 시사한다. 제II등급의 발열 및 경미한 근육통만이 최고 투여량 수준에 국한되었다. 나타난 증상은 다양하였지만 이러한 증상은 주입 완료 후 6시간이 지나서는 지속되지 않았다. 부작용과 이 연구에서 측정된 H22 ×Ki-4 또는 사이토카인 혈청 수준 사이의 직접적인 상관관계는 관찰되지 않았다.
이중특이적 분자를 비교적 높은 투여량으로 사용하였음에도 불구하고, H22 ×Ki-4의 MTD는 확실하지 않았다. 6명의 환자를 주기 당 80 mg/m2의 이중특이적 분자로 처치하였으며, 1명의 환자에게 투여한 이중특이적 분자의 최대 총량은 740 mg이었다. 이러한 투여량 수준에서 중요한 부작용이 발생하지 않았으므로 주기 당 제1일, 제3일, 제5일 및 제7일에서 80 mg/m2이 안전한 투여량이다. 이와 매우 유사한 발견이 리툭시맵과 같은 다른 특이적 모노클로날 항체와 관련하여 공지되어 있다 [Maloney D.G. et al., J Clin Oncol 15:3266 (1997)]. 따라서, 특히 유사한 항-CD64 이중특이적 분자를 사용한 이전의 연구 [Pullarkat V., et al., Cancer Immunol Immunother 48:9 (1999)]의 경우와 말초혈 단핵구의 포화도가 유사한 것으로 관찰되었으므로, 주기 당 80 mg/m2이 생물학적 활성 투여량이다.
계산된 반감기인 11.1시간은 다른 항-CD64 기재의 이중특이적 분자에 대하여 보고된 범위에 속하는 것이다 [Curnow R.T., Cancer Immunol Immunother 45:210 (1997)]. 이러한 반감기는 반감기가 400시간을 초과한다고 기재된 리툭시맵과 같은 인간화된 IgG-기재의 항체와 비교할 때 더 짧은 것이다. 그러나, H22 ×Ki-4는 무손상 IgG-기재의 항체보다 크기가 작으며 (104 kDa 대 180 kDa), Fc-부분이 없기 때문에 [Tobinai K. et al., Ann Oncol 9:527 (1998)], 본 발명의 상기 신규 분자의 반감기가 더 짧다는 것은 놀라운 일이 아니다. 또한, H22 ×Ki-4의 분자 크기는 악성 림프절로의 침투가 무손상 항체에 비하여 더욱 용이하도록 한다 [Jain R.K., Cancer Res. 50 (Suppl).:814s (1990)].
본 연구에 사용된 스케줄은 모든 말초혈 단핵구 및 sCD30을 이중특이적 분자로 포화시켜 이후에 조직으로 침투하여 HRS-세포에 결합할 수 있는 과량의 유리 이중특이적 분자를 생성하도록 고안된 것이었다. sCD30과의 결합은 H22 ×Ki-4의 분포에 중대한 영향을 미칠 수 있다. 피크 (peak)-수준 및 AUC로서 측정되는 유의한 H22x-Ki-4 축적이 관찰되었으며, 이는 이 구획의 포화 정도를 시사한다. 추가로, H22 ×Ki-4를 1차 주입한 후에는 sCD30이 전체 치료 기간 동안 매우 낮은 수준으로 유지되었는데, 이는 부분적으로는 Ki-4 항체에 의한 CD30 쉐딩 차단으로 인한 것이라 여겨진다 [Horn-Lohrens O., et al., Int J Cnacer 60:539 (1995)]. 또한, 면역조직화학 분석법을 통해 H22 ×Ki-4와 HRS-세포의 결합을 관찰하였다. 마지막으로, 이중특이적 분자와 이펙터 세포 상의 CD64의 결합과 더불어, 단핵구에서 유도된 사이토카인, 즉 G-CSF, IL-6, IL-15 및 TNF-α가 방출됨이 관찰되었다.
H22 ×Ki-4에 대한 유망한 반응은, 항-FcγRI 모노클로날 항체 H22를 사용한 충실성 종양에 대해 보고된 데이타에 신빙성을 부여한다. CD64와의 결합을 통한 ADCC 유도는 진행성 유방 암종 환자에서 입증되었다 [van Ojik H.H. et al., Cancer Immunol Immunother 45:207 (1997)]. 호르몬-난치성 전립선 암종에서, 항-CD64 ×항-HER2 이중특이적 분자는 본 발명의 실험에서 사용한 투여량보다 훨씬 더 낮은 투여량에서 활성을 나타내었다 [James N.D. et al., Br J Cancer 85:152 (2001)].
전반적으로, 상술한 연구는 본 발명의 이중특이적 분자 (예컨대 H22 ×Ki-4)가 예비처치된 진행성 또는 악성 HD 환자에서 우수한 독성 프로파일 및 유망한 효 능을 나타냄을 입증하고 있다.
동등물
당업자는 본원에 기재된 본 발명의 특정 실시양태의 많은 동등물을 인지하거나 단지 일상적인 실험만으로 확인할 수 있을 것이다. 상기 동등물은 하기 청구항에 포함된다.
참고문헌 인용
본원에서 인용한 특허 문헌, 계류 중인 특허 출원 및 기타 간행물 모두가 그 전문이 본원에 참고로 도입된다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (50)

  1. FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 서열을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 및 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 서열을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역을 포함하고, 이때 (a) 인간 중쇄 가변 영역 CDR3 서열이 서열 18, 서열 30, 서열 42 및 이들의 보존적 변형체로 구성된 군에서 선택되고, 인간 경쇄 가변 영역 CDR3 서열이 서열 24, 서열 36, 서열 48 및 이들의 보존적 변형체로 구성된 군에서 선택되고, (b) 인간 중쇄 가변 영역 CDR2 서열이 서열 17, 서열 29, 서열 41 및 이들의 보존적 변형체로 구성된 군에서 선택되고, 인간 경쇄 가변 영역 CDR2 서열이 서열 23, 서열 35, 서열 47 및 이들의 보존적 변형체로 구성된 군에서 선택되고, (c) 인간 중쇄 가변 영역 CDR1 서열이 서열 16, 서열 28, 서열 40 및 이들의 보존적 변형체로 구성된 군에서 선택되고, 인간 경쇄 가변 영역 CDR1 서열이 서열 22, 서열 34, 서열 46 및 이들의 보존적 변형체로 구성된 군에서 선택되는, 인간 CD30에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  2. 제1항에 있어서, CD30-발현 종양 세포의 성장을 억제하는 인간 항체.
  3. 제1항에 있어서, 이펙터 (effector) 세포의 존재하에 CD30-발현 종양 세포의 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity; ADCC)을 유도하는 인간 항체.
  4. 제1항에 있어서, ADCC가 단핵구에 의해 매개되는 인간 항체.
  5. 제1항에 있어서, ADCC가 단핵 세포에 의해 매개되는 인간 항체.
  6. 제2항에 있어서, 종양 세포가 골수 세포, 간 세포, 림프절 세포, 피부 세포, 비장 세포, 흉선 세포, 편도 세포, 탈락막 세포, 자궁내막 세포, 호지킨 세포, 리드-스턴버그 (Reed-Sternberg) 세포, 미분화 대세포 림프종 (Anaplastic Large-Cell Lymphomas; ALCL) 세포, 다형성 면역아세포성 림프종 세포, T 세포, B 세포, 천연 킬러 (Natural Killer; NK) 세포 또는 단핵구로 구성된 군에서 선택된 인간 항체.
  7. 제2항에 있어서, 종양 세포가 호지킨 세포 또는 리드-스턴버그 세포인 인간 항체.
  8. 제1항에 있어서, 인간 CD30에 친화도 상수 107 M-1 이상으로 결합하는 인간 항체.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 IgG 중쇄 및 인간 카파 경쇄를 포함하는 인간 항체.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1 또는 IgG3 중쇄를 포함하는 인간 항체.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서, 인간 CD30에 친화도 상수 108 M-1 이상으로 결합하는 단리된 인간 항체.
  15. 제1항에 있어서, 인간 CD30에 친화도 상수 109 M-1 이상으로 결합하는 단리된 인간 항체.
  16. 제1항에 있어서, 인간 중쇄 가변 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4 서열이 인간 중쇄 VH4-34 또는 VH3-11 배선 (germline) 서열로부터 유래된 단리된 인간 항체.
  17. 제1항에 있어서, 인간 경쇄 가변 영역 FR1, FR2, FR3 및 FR4 서열이 인간 경쇄 L15, A27 또는 L6 배선 서열로부터 유래된 단리된 인간 항체.
  18. (a) 서열 2, 서열 6, 서열 10 및 이들의 보존적 서열 변형체로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 및 (b) 서열 4, 서열 8, 서열 12 및 이들의 보존적 서열 변형체로 구성된 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 인간 경쇄 가변 영역을 포함하고, (c) 인간 CD30에 친화도 상수 107 M-1 이상으로 결합하고, (d) 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 분석시에 CD30+ 종양 세포의 용해를 매개하며, (e) CD30+ 종양 세포의 생체내 성장을 억제하는, 단리된 인간 모노클로날 항체.
  19. 제18항에 있어서, 인간 CD30에 친화도 상수 108 M-1 이상으로 결합하는 단리된 인간 항체.
  20. 제18항에 있어서, 인간 CD30에 친화도 상수 109 M-1 이상으로 결합하는 단리된 인간 항체.
  21. (a) 인간 중쇄 VH4-34 배선 서열로부터 유래되고, 서열 10의 아미노산 서열 또는 이의 보존적 서열 변형체를 포함하는 인간 중쇄 가변 영역 및 (b) 인간 경쇄 L15 배선 서열로부터 유래되고, 서열 12의 아미노산 서열 또는 이의 보존적 서열 변형체를 포함하는 인간 경쇄 가변 영역을 포함하고, (c) 인간 CD30에 친화도 상수 107 M-1 이상으로 결합하고, (d) 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 분석시에 CD30+ 종양 세포의 용해를 매개하며, (e) CD30+ 종양 세포의 생체내 성장을 억제하는, 단리된 인간 모노클로날 항체.
  22. 서열 2 및 서열 4 각각에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 및 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  23. 삭제
  24. 서열 6 및 서열 8 각각에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 및 인 간 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  25. 삭제
  26. 서열 10 및 서열 12 각각에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 인간 중쇄 및 인간 경쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 인간 모노클로날 항체.
  27. 삭제
  28. 제1항 내지 제8항, 제14항 내지 제22항, 제24항 및 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 중쇄 트랜스진 (transgene) 또는 트랜스염색체 (transchromosome) 및 인간 경쇄 트랜스진 또는 트랜스염색체를 포함하는 게놈을 보유하는 트랜스제닉 비-인간 동물로부터 수득한 B 세포를 불멸화 세포에 융합시켜 제조한 하이브리도마에 의해 생성된 단리된 인간 항체.
  29. 삭제
  30. 치료제에 결합된 제1항 내지 제8항, 제14항 내지 제22항, 제24항 및 제26항 중 어느 한 항의 인간 항체를 포함하는 면역접합체.
  31. 제30항에 있어서, 상기 치료제가 세포독소인 면역접합체.
  32. 제30항에 있어서, 상기 치료제가 방사성동위원소인 면역접합체.
  33. 삭제
  34. 제1항 내지 제8항, 제14항 내지 제22항, 제24항 및 제26항 중 어느 한 항의 인간 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
  35. 제34항에 있어서, 발현 벡터에 혼입된 단리된 핵산 분자.
  36. 제35항의 발현 벡터를 포함하는 트랜스펙토마 (transfectoma).
  37. 인간 중쇄 트랜스진 또는 트랜스염색체 및 인간 경쇄 트랜스진 또는 트랜스염색체를 포함하는 게놈을 보유하고 제1항 내지 제8항, 제14항 내지 제22항, 제24항 및 제26항 중 어느 한 항의 인간 항체를 발현하는 트랜스제닉 비-인간 동물.
  38. CD30-발현 세포 성장 억제 유효량의 제1항 내지 제8항, 제14항 내지 제22항, 제24항 및 제26항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, CD30-발현 세포의 성장 억제용 제약 조성물.
  39. CD30-발현 종양 세포의 성장을 특징으로 하는 질환의 치료 또는 예방 유효량의 제1항 내지 제8항, 제14항 내지 제22항, 제24항 및 제26항 중 어느 한 항의 인간 항체를 포함하는, CD30-발현 종양 세포의 성장을 특징으로 하는 질환의 치료 또는 예방용 제약 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 질환이 호지킨병, 미분화 대세포 림프종 (ALCL), 성인 T-세포 림프종 (Adult T-cell Lymphoma; ATL), 혈관면역아세포성 림프절증 (AngioImmunoblastic LymphaDenopathy; AILD)-유사 T 세포 림프종, HIV 관련 체강 기재 림프종, 태생기암, 비인강(鼻咽腔)의 미분화 암종 (예컨대 쉬민케 종양), 캐슬맨병, 카포시 육종 및 기타 T-세포 또는 B-세포 림프종으로 구성된 군에서 선택된 제약 조성물.
  41. 제39항에 있어서, 질환이 호지킨병인 제약 조성물.
  42. 제39항에 있어서, 질환이 비-호지킨 림프종인 제약 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 비-호지킨 림프종이 미분화 대세포 림프종 (ALCL)인 제약 조성물.
  44. CD30-발현 면역 세포가 관여하는 자가면역 질환의 치료 또는 예방 유효량의 제1항 내지 제8항, 제14항 내지 제22항, 제24항 및 제26항 중 어느 한 항의 인간 항체를 포함하는, CD30-발현 면역 세포가 관여하는 자가면역 질환의 치료 또는 예방용 제약 조성물.
  45. 제44항에 있어서, 자가면역 질환이 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스, 전신성 경화증, 아토피성 피부염, 그레브스병, 하시모토 갑상선염, 베게너 육아종증, 오멘 증후군, 만성 신부전, 급성 전염성 단핵구증, HIV 및 헤르페스 바이러스 관련 질환으로 구성된 군에서 선택된 제약 조성물.
  46. 제38항에 있어서, 인간 항체가 치료제에 접합된 제약 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 치료제가 세포독소인 제약 조성물.
  48. 제46항에 있어서, 치료제가 방사성동위원소인 제약 조성물.
  49. 제39항에 있어서, 인간 항체가 치료제에 접합된 제약 조성물.
  50. 제44항에 있어서, 인간 항체가 치료제에 접합된 제약 조성물.
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