BR112019024419A2 - anticorpos compreendendo regiões constantes pesadas modificadas - Google Patents

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Sandra V. Hatcher
Arvind Rajpal
Alan J. Korman
Mark J. Selby
Bryan C. Barnhart
Nils Lonberg
Mohan Srinivasan
Karla A. Henning
Michelle Minhua HAN
Ming Lei
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Abstract

A invenção refere-se a regiões constantes de cadeia pesada (referidas como "regiões constantes de cadeia pesada modificadas), ou fragmentos funcionalmente equivalentes das mesmas, que potencializam as propriedades biológicas de anticorpos com relação aos mesmos anticorpos em forma não modificada. Uma região constante de cadeia pesada modificada exemplar inclui uma dobra de IgG2 e três domínios constantes (isto é, domínios CH1, CH2 e CH3), em que um ou mais dos domínios de região constante são de um isotipo não IgG2 (por exemplo, IgG1, IgG3 ou IgG4). A região constante de cadeia pesada pode compreender sequências de domínio de IgG humana do tipo selvagem ou variantes dessas sequências. São também providos aqui métodos para potencialização de certas propriedades biológicas de anticorpos que compreendem uma dobra não IgG2, tais como internalização, agonismo e antagonismo, em que o método compreende substituição da dobra não IgG2 do anticorpo com uma dobra de IgG2.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS COMPREENDENDO REGIÕES CONSTANTES PESADAS MODIFICADAS",
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] O presente pedido reivindica prioridade para os Pedidos de Patente Provisórios U.S. Nº. 62/511.178 (depositado em 25 de maio de 2017) e 62/599.221 (depositado em 15 de dezembro de 2017). Os conteúdos de quaisquer patentes, pedidos de patente e referências citados em todo o presente relatório são aqui incorporados a título de referência em suas totalidades.
ANTECEDENTES
[002] Terapia com anticorpos é uma das áreas que crescem mais rápido no tratamento de doença, tais como câncer e distúrbios imunes. Não obstante, atingir eficientemente um antígeno com um anticorpo terapêutico permanece um grande desafio em cuidado de saúde. Desta maneira, engenharia de anticorpo se tornou um foco principal no mundo farmacêutico. A partir deste foco, uma miríade de novos anticorpos engenheirados surgiu, tais como fragmentos de anticorpos, conjugados de fármaco anticorpo (ADCs), anticorpos com regiões efetoras modificadas e anticorpos biespeciíficos.
[003] Os anticorpos facilitam suas propriedades terapêuticas através de muitos mecanismos diferentes. Os anticorpos podem inibir ou ativar diretamente um antígeno-alvo, desta maneira regulando sinalização celular. Os anticorpos podem inibir a ligação de um ligante a um receptor. Os anticorpos podem também induzir ou inibir uma resposta imune, por exemplo, ao reforçar o sistema imune do indivíduo para combater infecção ou câncer (por exemplo, como coestimuladores na ativação de células T).
[004] Ainda, internalização mediada por anticorpo de um receptor/antígeno de superfície celular é reconhecida como um mecanismo principal de ação para anticorpos terapêuticos. Neste caso, um anticorpo remove o alvo da superfície celular e da realização de sua função através da indução de internalização na célula. Na verdade, um dos precursores de terapia com anticorpos é trastuzumabe para o tratamento de câncer de mama. O trastuzumabe se direciona ao receptor ErbB2 e induz internalização de receptor/anticorpo, desta maneira inibindo sinalização de EGFR. No entanto, os anticorpos nem sempre exibem qualidades de internalização eficientes, desta maneira há uma necessidade contínua de anticorpos com funções de internalização melhoradas. Portanto, métodos para melhoria da internalização de anticorpos terapêuticos conhecidos são altamente desejáveis.
SUMÁRIO
[005] A invenção provê regiões constantes de cadeia pesada (referidas como "regiões constantes de cadeia pesada modificadas"), ou fragmentos funcionalmente equivalentes das mesmas, que potencializam ou modificam as propriedades biológicas de anticorpos em relação aos mesmos anticorpos em forma não modificada. Por exemplo, anticorpos compreendendo regiões constantes modificadas exibem atividade de internalização e/ou agonística ou antagonística aumentada. Portanto, os anticorpos da invenção são versões otimizadas do anticorpo não modificado original. Em certas modalidades, uma cadeia pesada compreende uma região constante modificada compreendendo uma ou mais mutações ou modificações em relação à região constante de cadeia pesada do tipo selvagem. Em certas modalidades, uma região constante de cadeia pesada modificada inclui uma dobra de IgG2 e três domínios constantes (isto é, domínios CH1, CH2 e CH3), onde um ou mais dos domínios de região constante é um isotipo humano não IgG2 (por exemplo, 1g9G1, IgG3 ou IgG4) ou fragmentos funcionalmente equivalentes do mesmo.
A região constante modificada pode incluir a sequência de aminoácido do tipo selvagem correspondente, ou uma variante da mesma, por exemplo, uma ou mais (por exemplo, entre 1-10 ou mais) substituições ou deleções de aminoácido dentro da dobra ou dos domínios CH1, CH3, CH3 em relação à sequência de aminoácido do tipo selvagem. Portanto, a sequência de aminoácido da dobra e/ou cada domínio constante é pelo menos cerca de 80%, 85%, 90%, 95% ou mais (isto é, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%) idêntica à sequência de aminoácido do tipo selvagem correspondente.
[006] Em uma modalidade, a região constante de cadeia pesada modificada inclui uma dobra de IgG2 humana do tipo selvagem ou uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de uma dobra de IgG2 humana do tipo selvagem. A dobra pode conter ainda modificações adicionais, por exemplo, para reduzir formação de ligação dissulfeto. Em uma modalidade, a dobra inclui a substituição de aminoácido C219S, em relação à dobra de IgG2 humana do tipo selvagem. Em certas modalidades, a dobra compreende a sequência de aminoácido mostrada em qualquer uma de SEQ ID Nº: 8, 21-23, 126-132 e 134- 147 ou uma dessas sequências que compreende 1-3 aminoácidos inseridos entre CVE e CPP.
[007] Em certas modalidades, a região constante de cadeia pesada modificada inclui um domínio CH1 de IgG2, por exemplo, um domínio CH1 de IgG2 humana do tipo selvagem, ou uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de um domínio CH1 de IgG2 humana do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 7).
[008] Em certas modalidades, a região constante de cadeia pesada modificada inclui um domínio CH2 de I9gG1, por exemplo, um domínio CH2 de I9gG1 humana do tipo selvagem, ou uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de um domínio CH2 de IgG1 humana do tipo selvagem. O domínio CH2 pode conter modificações adicionais (por exemplo, para reduzir ou eliminar funções efetoras) Em certas modalidades, o domínio CH2 compreende as substituições de aminoácido A330S e P331S, em relação ao CH2 de IgG1 humana de comprimento integral do tipo selvagem. Em certas modalidades, o domínio CH2 compreende SEQ ID Nº: 24.
[009] Em certas modalidades, a região constante de cadeia pesada modificada inclui um domínio CH3 de IgG1, por exemplo, um domínio CH3 de IgG1 humana do tipo selvagem, ou uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de um domínio CH3 de IgG1 humana do tipo selvagem. O domínio CH3 pode conter ainda modificações adicionais para conferir um alotipo particular. Em uma modalidade, o domínio CH3 contém o resíduo de aminoácido E na posição 356 e o aminoácido M na posição 358 (alotipo "f"), em relação ao I9gG1 humana de comprimento integral do tipo selvagem de um alotipo diferente (por exemplo, alotipo "fa", tendo D e L, respectivamente, nessas posições) Em certas modalidades, o domínio CH3 compreende SEQ ID Nº: 5.
[0010] Em uma modalidade particular, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada modificada em que (a) o domínio CH1 é um domínio CH1 de IgG2 humana do tipo selvagem ou um domínio CH1 de IgG1 do tipo selvagem, com ou sem modificação adicional, (b) a dobra é uma dobra de IgG2 do tipo selvagem com ou sem uma substituição C2198S, (c) o domínio CH2 é um domínio CH2 de IgG1 humana do tipo selvagem ou um domínio CH2 de IgG2 do tipo selvagem, com ou sem modificações adicionais e (d) o domínio CH3 é um domínio CH3 de IgG1 humana do tipo selvagem ou um domínio CH3 de I9gG2 humana do tipo selvagem, com ou sem aminoácido E na posição 356 e aminoácido M na posição 358 (por exemplo, de alotipo f ou fa). Em uma modalidade específica, a região constante de cadeia pesada modificada compreende uma sequência de aminoácido descrita aqui, por exemplo, mostrada em qualquer uma das SEQ ID Nº: 26-37 e 78-93.
[0011] Os anticorpos da invenção (isto é, anticorpos tendo uma região constante modificada) podem ser anticorpos totalmente humanos ou anticorpos humanizados, e ainda exibirem uma ou mais características potencializadas ou alteradas, comparado com os mesmos anticorpos sem uma região constante de cadeia pesada modificada. Essas características podem incluir internalização aumentada ou alterada por uma célula, atividade agonística, formação de complexos reticulados grandes, ADCC, sinalização mediada por receptor, atividade antagonística, atividade imunomoduladora e atividade antitumor; ou introdução de uma nova propriedade, por exemplo, atividade agonística.
[0012] Moléculas biespecíficas e imunoconjugados contendo regiões constantes modificadas da invenção são também providos, bem como composições que contêm os anticorpos, biespecíficos, ou imunoconjugado e um carreador farmacêutico aceitável. Tais composições podem incluir um ou mais agente terapêutico adicional, por exemplo, um agente que estimule o sistema imune, tal como um inibidor de ponto de checagem, uma molécula coestimuladora, um anticorpo anti-CD39 ou um anticorpo anti-A2AR.
[0013] Métodos para preparação de um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada são também providos. Certos métodos providos aqui incluem métodos de aumento da internalização de um anticorpo por uma célula, e métodos para aumento da atividade agonista de um anticorpo, comparado com o mesmo anticorpo compreendendo uma dobra de um isotipo não IgG2.
Tais métodos compreendem as etapas de provisão de um anticorpo tendo uma dobra que não é uma dobra de IgG2, e substituição da dobra com uma dobra de I|IgG2 (tal como uma dobra que seja uma dobra de IgG2 humana do tipo selvagem, uma dobra tendo uma sequência de aminoácido que seja pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de uma dobra de IgG2 humana do tipo selvagem ou uma dobra que seja modificada para reduzir formação de ligação dissulfeto, por exemplo, uma dobra que compreenda substituição de aminoácido C219S) Em uma modalidade, internalização do anticorpo é potencializada ou aumentada em pelo menos 10%, 30%, 50%, 75%, duas vezes, 3 vezes, 5 vezes ou mais, resultando em uma redução do T12 em pelo menos 10%, 30%, 50%, 75%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes ou mais. Em certas modalidades, atividade agonista é aumentada ou potencializada em pelo menos 10%, 30%, 50%, 75%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes ou mais conforme definido por liberação de citocina aumentada ou proliferação aumentada em células T efetoras; atividade de célula reguladora T reduzida se engajamento em Tregs reduzir a função de Treg; ou depleção aumentada de Tregs.
[0014] Em certas modalidades, o método inclui ainda a etapa de substituição de pelo menos um dos domínios CH1, CH2 ou CH3 com um domínio CH1, CH2 ou CH3 de um isotipo diferente. Tais substituições incluem, por exemplo: (a) substituição do domínio CH1 com um domínio CH1 de IgG1 ou um domínio CH1 de IgG2; (b) substituição do domínio CH2 com um domínio CH2 de IgG1 ou um domínio CH2 de IgG2; e/ou (b) substituição do domínio CH3 com um domínio CH3 de IgG1 ou um domínio CH3 de IgG2, em que o domínio de substituição tem a sequência do tipo selvagem ou pelo menos 95% de identidade com a sequência do tipo selvagem. Em certas modalidades, o domínio CH1 compreende a sequência de aminoácido como mostrado na SEQ ID Nº: 7. Em certas modalidades, o domínio CH2 é modificado para reduzir ou eliminar funções efetoras, por exemplo, o domínio CH2 compreende substituições de aminoácido A3S30S e P331S (SEQ ID Nº: 24). Em certas modalidades, o domínio CH3 compreende o resíduo de aminoácido E na posição 356 e o aminoácido M na posição 358 (SEQ ID Nº: 5, alotipo "f") e em certas modalidades, o domínio CH3 compreende alotipo "fa".
[0015] Os métodos providos aqui incluem métodos de tratamento de um indivíduo através da administração de um anticorpo, molécula biespecífica “ou imunoconjugado compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada. Um ou mais agentes terapêuticos adicionais, por exemplo, um agente terapêutico que estimule o sistema imune, tal como um inibidor de ponto de checagem, uma molécula coestimuladora também podem ser coadministrados.
[0016] São providos aqui anticorpos compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada compreendendo um domínio CH1, uma dobra, um domínio CH2 e um domínio CH3 na ordem do terminal N- para o C-, e onde (a) o domínio CH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº: 7 ou uma sequência de aminoácido que difere da mesma no máximo em 5 aminoácidos ou que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 7, e em que pelo menos um de C131, R133, E137, S138 ou R217 não é substituído ou deletado; (b) uma dobra compreendendo qualquer uma de SEQ ID Nº: 8, 21-23, 126-132 ou 134-147 ou uma sequência que compreende 1-3 aminoácidos inseridos entre CVE e CPP, ou que difere da mesma em no máximo 5 aminoácidos, em que a dobra não compreende uma substituição ou deleção em ambos C219 e C220; (c) o anticorpo tem pelo menos uma propriedade potencializadora ou uma nova propriedade introduzida em relação ao mesmo anticorpo que compreende uma dobra e domínio CH1 de IgG1; e (d) a região constante de cadeia pesada modificada não é uma região constante de IgG2 do tipo selvagem ou uma região constante de I1gG2 compreendendo C219S e/ou C220S.
A dobra pode compreender a sequência de aminoácido ERKXCVECPPCPAP (SEQ ID Nº: 129) ou ERKCXVECPPCPAP (SEQ ID Nº: 130), em que X é qualquer aminoácido exceto cisteína.
Por exemplo, a dobra pode compreender a sequência de aminoácido ERKSCVECPPCPAP (SEQ ID Nº: 131) ou ERKCSVECPPCPAP (SEQ ID Nº: 132). Em certas modalidades, pelo menos um, ou todos dos, resíduos de aminoácido P233, V234, A235 e G237 são deletados ou substituídos com um outro resíduo de aminoácido, por exemplo, o aminoácido correspondente em uma dobra de IgG1. Em certas modalidades, nenhum dos resíduos de aminoácido R133, E137, S138 e R217 e nenhum dos C131, R133, E137, S138 e R217 é substituído ou deletado.
Em certas modalidades, N192 e/ou F193 são substituídos com um outro aminoácido.
O anticorpo pode compreender um domínio CH2 que é pelo menos 95% idêntico àquele de IgG1 do tipo selvagem.
O anticorpo pode compreender um domínio CH3 que é pelo menos 95% idêntico àquele de IgG1 do tipo selvagem.
Em certas modalidades, o domínio CH2 e/ou CH3 não é um domínio CH2 e/ou CH3 de IgG1 do tipo selvagem, e o anticorpo tem uma função efetora que é mais potente do que aquela de IgG1 do tipo selvagem.
Em certas modalidades, o domínio CH2 e/ou CH3 não é um domínio CH2 e/ou CH3 de IgG2 do tipo selvagem, e o anticorpo tem uma função efetora que é menos potente do que aquela de IgG1 do tipo selvagem.
Em certas modalidades, o anticorpo compreende um domínio CH2 e/ou domínio CH1 que é pelo menos 95% idêntico àquele de IQgG1 ou IgG4 do tipo selvagem.
Em certas modalidades, o anticorpo tem pelo menos uma propriedade potencializada selecionada de atividade agonista, internalização de receptor mediada por anticorpo, ADCC, sinalização mediada por receptor, atividade antagonista, atividade imunomoduladora ou atividade antitumor; ou uma propriedade recém-introduzida, que é atividade agonista.
[0017] Em certas modalidades, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada modificada, onde (a) o domínio CH1 é um domínio CH1 de IgG2 humana do tipo selvagem; (b) a dobra compreende SEQ ID Nº: qualquer uma de SEQ ID Nº: 8, 21-23, 126-132 ou 134-147 ou uma sequência que compreende 1-3 aminoácidos inseridos entre CVE e CPP; (c) o domínio CH2 é um domínio CH2 de IgG1 humana do tipo selvagem ou um domínio CH2 modificado conferindo função efetora potencializada ou reduzida ao anticorpo; e (d) o domínio CH3 é um domínio CH3 de IgG1 humana do tipo selvagem ou um domínio CH3 modificado conferindo função efetora potencializada ou reduzida ao anticorpo. Um domínio constante de cadeia pesada modificado pode compreender a sequência de aminoácido mostrada em qualquer uma das SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262 ou uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma ou mais de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262. Para cadeias pesadas que compreendem um Fc tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a qualquer uma dessas sequências, é preferível que as mutações de aminoácido específicas feitas para modular atividade biológica nessas sequências não sejam variadas.
[0018] Em certas modalidades, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada modificada, em que a região constante de cadeia pesada compreende um domínio CH1 e uma dobra compreendendo a sequência
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKV
DKTVERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID Nº 133) ou uma sequência de aminoácido que difere de SEQ ID Nº: 133 em no máximo aminoácidos ou é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID Nº: 133, em que (i) pelo menos um de C131, R133, E137, S138 e R217 é não substituído com um outro aminoácido ou deletado; (ii) C219 e C220 podem ser substituídos com um outro aminoácido ou deletados, mas C219 e C220 podem não ser ambos substituídos ou deletados; (ili) 1-3 aminoácidos podem ser inseridos entre CVE e CPP na dobra; (iv) a dobra compreende opcionalmente um aminoácido adicional no terminal C, por exemplo, G; (v) um ou mais de aminoácidos P233, V234, A235 e G237 podem ser substituídos com um outro aminoácido (por exemplo, o aminoácido correspondente de IgG1) ou deletados; (vi) os domínios CH2 e CH3 podem ser domínios CH2 e CH3 de I1gG1, I9G2, I9G3 ou IgG4 do tipo selvagem ou modificados; (vii) a região constante de cadeia pesada modificada não é uma região constante de cadeia pesada de IgG2 do tipo selvagem ou um domínio constante pesado de IgG2 do tipo selvagem com C2198S ou C2208S; e (viii) o anticorpo tem pelo menos uma propriedade potencializada ou uma propriedade nova introduzida em relação ao mesmo anticorpo que compreende uma dobra de IgG1 e um domínio CH1. Em certas modalidades, o anticorpo tem pelo menos uma propriedade potencializada selecionada de atividade agonista, internalização de receptor mediada por anticorpo, ADCC, sinalização mediada por receptor, atividade antagonista, atividade de imunomodulação ou atividade antitumor; ou uma propriedade recém-introduzida, que é atividade agonista.
Em certas modalidades, nenhum dos aminoácidos C131; R133; E137; S138; R217 é substituído com um outro aminoácido ou deletado.
Em certas modalidades, N192 e/ou F193 não são substituídos ou são N192S e/ou F193L, respectivamente.
Em certas modalidades C219 é C219S, C220 é C220S, P233-G237 são substituídos ou deletados; V234-G237 são substituídos ou deletados; A235-G237 são substituídos ou deletados; G237 é substituído ou deletado; P233 é substituído ou deletado; P233-V234 são substituídos ou deletados; ou P233-A235 são substituídos ou deletados. O anticorpo pode ter um domínio CH2 de IgG1 do tipo selvagem ou modificado ou um domínio CH3 de IgG1 do tipo selvagem ou modificado.
[0019] Em certas modalidades, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada modificada, em que a região constante de cadeia pesada compreende um domínio CH1 compreendendo a sequência
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT
SGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTAQTYTCNVDHKPSNTKV DKTVE (SEQ |D Nº: 7) ou uma sequência de aminoácido que difere da SEQ ID Nº: 7 em no máximo 10 aminoácido sou é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID Nº: 7 em no máximo 10 aminoácidos ou é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID Nº: 7; em que (i) pelo menos um de C131, R133, E137, S138 e R217 é não substituído ou deletado; (ii) a região constante de cadeia pesada modificada não é uma região constante de cadeia pesada de IgG2 do tipo selvagem ou um domínio constante pesado de IgG2 do tipo selvagem com C2198S ou C2208; e (iii) o anticorpo tem pelo menos uma propriedade potencializada ou uma propriedade nova introduzida em relação ao mesmo anticorpo que compreende uma dobra e domínio CH1 de IgG1. O anticorpo pode ter pelo menos uma propriedade potencializada selecionada de atividade agonista, internalização de receptor mediada por anticorpo, ADCC, sinalização mediada por receptor, atividade antagonista, atividade de imunomodulação ou atividade antitumor; ou uma propriedade recém-introduzida, que é atividade agonista. Em certas modalidades, nenhum dos aminoácidos C131; R133; E137 e S138 é substituído com um outro aminoácido ou deletado. Em certas modalidades, N192 e/ou F193 não são substituídos ou são N192S e/ou F193L, respectivamente. O anticorpo pode ter função efetora ou ser privado de função efetora. O anticorpo pode compreende um domínio CH2 de IgG1 do tipo selvagem ou modificado ou um domínio CH3 de IgG1 do tipo selvagem ou modificado.
[0020] Um anticorpo pode compreender uma região constante de cadeia pesada modificada, em que a região constante de cadeia pesada compreende uma dobra compreendendo a sequência ERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID Nº: 8), ou uma sequência de aminoácido que difere de SEQ ID Nº: 8 em no máximo 5 aminoácidos, em que (i) C219 e C220 podem ser substituídos com um outro aminoácido ou deletados, mas C219 e C220 podem não ser ambos substituídos ou deletados; (ii) um ou mais de aminoácidos P233, V234, A235 e G237 podem ser substituídos ou deletados; (iii) 1-3 aminoácidos podem ser inseridos entre CVE e CPP na dobra; (iv) a dobra compreende opcionalmente um aminoácido adicional no terminal C, por exemplo, G; (v) os domínios CH2 e CH3 podem ser domínios CH2 e CH3 de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 do tipo selvagem ou modificados; (vi) a região constante de cadeia pesada modificada não é uma região constante de cadeia pesada de IgG2 do tipo selvagem ou um domínio constante pesado de IgG2 do tipo selvagem com C2198S ou C220S; e (vii) o anticorpo tem pelo menos uma propriedade potencializada ou uma propriedade nova introduzida com relação ao mesmo anticorpo que compreende uma dobra e domínio CH1 de IgG1. O anticorpo pode ter pelo menos uma propriedade potencializada selecionada de atividade agonista, internalização de receptor mediada por anticorpo, ADCC, sinalização mediada por receptor, atividade antagonista, atividade de imunomodulação ou atividade antitumor; ou uma propriedade recém-introduzida, que é atividade agonista. Em certas modalidades, C219 é C219S, C220 é C220S, P233-G237 são substituídos ou deletados; V234-G237 são substituídos ou deletados; A235-G237 são substituídos ou deletados; G237 é substituído ou deletado; P233 é substituído ou deletado; P233- V234 são substituídos ou deletados; ou P233-A235 são substituídos ou deletados. O anticorpo pode ter função efetora ou ser privado de função efetora. O anticorpo pode compreender um domínio CH2 de I9gG1 do tipo selvagem ou modificado e/ou um domínio CH3 de 19G1 do tipo selvagem ou modificado.
[0021] São também providos anticorpos compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada, em que a região constante de cadeia pesada compreende uma dobra de IgG1 ou 1gG2, e em que a dobra não tem 1-7 aminoácidos, e em que o anticorpo tem pelo menos uma propriedade potencializada ou uma propriedade nova introduzida em relação ao mesmo anticorpo que compreende uma dobra e domínio CH1 de IgG1. O anticorpo pode ter pelo menos uma propriedade potencializada selecionada de atividade agonista, internalização de receptor mediada por anticorpo, ADCC, sinalização mediada por anticorpo, atividade antagonista, atividade de imunomodulação ou atividade antitumor; ou uma propriedade recém- introduzida, que é atividade agonista. A dobra pode ser uma dobra de I9gG2 que não tem 1-4 aminoácidos, por exemplo, aminoácidos C219, C220, V222 e E224. A dobra é uma dobra de IgG1 que não tem os aminoácidos S219, C220, D221, K222, T223, H224 e 1225. O anticorpo pode compreender um domínio CH1 de IgG2 que é do tipo selvagem ou modificado; um domínio CH1 de IgG1 que é do tipo selvagem ou modificado e um domínio CH2 de IgG1, IgG2 ou IgG4 e um domínio CH3 de IgG1, IgG2 ou IgG4.
[0022] Anticorpos com regiões constantes de cadeia pesada modificadas podem ser anticorpos humanos ou humanizados ou porções de ligação a antígeno dos mesmos. Em certas modalidades, o anticorpo se liga especificamente a um antígeno que está envolvido em regulagem imune. O anticorpo pode ser um agonista de um receptor coestimulador ou um antagonista de um receptor inibidor. Por exemplo, o anticorpo pode se ligar a um receptor coestimulador, por exemplo, selecionado do grupo de B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB, GITR, OXA40, ICOS, CD70, CD27, CD40, DR3 ou CD28H ou o anticorpo pode se ligar a um receptor inibidor, por exemplo, selecionado do grupo de CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1 e TIM-4. Os antígenos podem ser um antígeno que precisa ser internalizado, por exemplo, CD73. O antígeno pode ser CD39.
[0023] Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada se liga especificamente a um receptor coestimulador, por exemplo, GITR, OX40, 4-1BB, CD28, ICOS, CD40, CD27 ou qualquer outro membro da superfamília TNFR, e compreende uma região constante de cadeia pesada modificada selecionada do grupo de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262. Em certas modalidades, o anticorpo exibe atividade agonista potencializada ou alterada em relação a um anticorpo tendo as mesmas regiões variáveis e cadeia leve, mas compreendendo uma região constante de cadeia pesada de IgG1.
[0024] Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada se liga especificamente a uma molécula de superfície celular, por exemplo, CD73, e dispara internalização mediada por anticorpo da molécula de superfície celular, e compreende uma região constante de cadeia pesada modificada selecionada do grupo de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125 e 152-232. Em certas modalidades, o anticorpo possui propriedades de internalização potencializadas ou aumentadas em relação a um anticorpo tendo as mesmas regiões variáveis e cadeia leve, mas compreendendo uma região constante de cadeia pesada de I|gG1. Anticorpos anti-CD73 podem ser também ligados a um Fc tendo qualquer sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID Nº: 234-245 e 247-262.
[0025] Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada se liga especificamente a um receptor inibidor, por exemplo, CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1I, TIM-1 e TIM, e compreende uma região constante de cadeia pesada modificada selecionada do grupo de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262. Em certas modalidades, o anticorpo exibe atividade antagonista mais potente ou alterada ou introduz uma nova atividade em relação ao mesmo anticorpo tendo uma região constante de cadeia pesada de IgG1. Em certas modalidades, o Fc compreende uma ou mais mutações para modular, por exemplo, reduzir, função efetora.
[0026] Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada se liga especificamente a uma molécula de superfície celular e dispara sinalização intracelular, em que o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada modificada selecionada do grupo de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262. Em certas modalidades, sinalização intracelular faz a mediação de atividade agonista, atividade antagonista, internalização da molécula de superfície celular ou ADCC. Em certas modalidades, o anticorpo dispara sinalização intracelular mais potente em relação a um anticorpo tendo as mesmas regiões variáveis e cadeia leve, mas compreendendo uma região constante de cadeia pesada de IgG1.
[0027] Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada se liga especificamente a uma molécula de superfície celular e dispara formação de complexos de anticorpo de peso molecular alto-molécula de superfície celular, em que o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada modificada selecionada do grupo de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262. Em certas modalidades, o anticorpo dispara formação de complexos de peso molecular maior com relação a um anticorpo tendo as mesmas regiões variáveis e cadeia leve, mas compreendendo uma região constante de cadeia pesada de IgG1.
[0028] Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada se liga especificamente a uma molécula de superfície celular e dispara agrupamento ou oligomerização da molécula de superfície celular, em que o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada modificada selecionada do grupo de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262. Em certas modalidades, o anticorpo dispara mais agrupamento ou oligomerização da molécula de superfície celular em relação a um anticorpo tendo as mesmas regiões variáveis e cadeia leve, mas compreendendo uma região constante de cadeia pesada de I9G1.
[0029] São também providas aqui moléculas biespecíficas compreendendo um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada ligada a uma molécula tendo uma segunda especificidade de ligação. São também providos aqui imunoconjugados compreendendo um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada, ligada a um segundo agente. Composições compreendendo um anticorpo, biespecífico, ou imunoconjugado descrito aqui e um carreador são também providas. As composições podem compreender um ou mais agentes terapêuticos adicionais, por exemplo, um agente terapêutico estimula o sistema imune e é, por exemplo, um antagonista de um inibidor de ponto de checagem ou um receptor coestimulador.
[0030] São também providos aqui métodos de preparação de um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada, em que o anticorpo compreende um domínio CH1, uma dobra, um domínio CH2 e um domínio CH3 na ordem do terminal N para o C, compreendendo as etapas de: (a) provisão de um anticorpo compreendendo uma dobra e/ou um domínio CH2 que não é uma dobra de IgG2 e/ou domínio CH1 de IgG1; e (b) substituição da dobra e/ou do domínio CH1 com uma dobra de IgG2 e/ou domínio CH1 de IgG2, respectivamente. São ainda providos aqui métodos de aumento da internalização de um anticorpo por uma célula, compreendendo: (a) provisão de um anticorpo compreendendo uma dobra e/ou um domínio CH2 que não é uma dobra de IgG1 e/ou domínio CH2 de |IgG2; e (b) substituição da dobra e/ou do domínio de CH1 com uma dobra de I9gG2 e/ou domínio CH1 de IgG2, respectivamente. Internalização do anticorpo pode ser aumentada comparado com internalização do mesmo anticorpo compreendendo uma dobra de um isotipo não IgG2, por exemplo, um anticorpo compreendendo uma região constante de IgG1. São também providos métodos de aumento da atividade agonista de um anticorpo, compreendendo: (a) provisão de um anticorpo compreendendo uma dobra e/ou um domínio CH1 que não é uma dobra de IgG2 e/ou um domínio CH1 de IgG2; e (b) substituição da dobra e/ou do domínio CH1 com uma dobra de IgG2 e/ou domínio CH1 de I1gG2, respectivamente. A atividade agonista pode ser aumentada comparado com a atividade agonista do mesmo anticorpo compreendendo uma dobre de um isotipo não IgG2, por exemplo, um anticorpo compreendendo uma região constante de I9G1. Uma dobra de I9G2 pode ser uma dobra de IgG2 humana do tipo selvagem ou compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de uma dobra de IgG2 humana do tipo selvagem e pode compreender, por exemplo, uma sequência mostrada na Tabela 4. Um método pode compreender a etapa de substituição de pelo menos um do domínio CH1, CH2 ou CH3 com um domínio CH1, CH2 ou CH3 de um isotipo diferente, respectivamente. Um método pode compreender as etapas de (a) substituir o domínio CH1 com um domínio CH1 de IgG2; (b) substituir o domínio CH2 com um domínio CH2 de IgG1; e/ou (b) substituir o domínio CH3 com um domínio CH3 de IgG1. Um método pode compreender as etapas de (a) substituir o domínio CH1 com um domínio CH1 de IgG2 humana do tipo selvagem ou um domínio pelo menos 95% idêntico ao mesmo; (b) substituição do domínio CH2 com um domínio CH2 de IgG1 humana do tipo selvagem ou domínio pelo menos 95% idêntico ao mesmo; e/ou (b) substituição do domínio CH3 com um domínio CH3 de I1gG1 humana do tipo selvagem ou um domínio pelo menos 95% idêntico ao mesmo. Um método pode compreender a etapa de substituição da região constante de cadeia pesada com uma região constante de cadeia pesada modificada compreendendo qualquer uma de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262 ou uma região pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152- 232, 234-245 e 247-262 (ou introdução no Fc das mutações de aminoácido dessas sequências). A dobra pode ser modificada para reduzir ou alterar formação de ligação dissulfeto. A dobra pode compreender substituição de aminoácido C219S. A dobra pode compreender uma sequência de aminoácido mostrada em qualquer uma de SEQ ID Nº: 8, 21-23, 126-132 ou 134-147 ou uma sequência que compreende 1-3 aminoácidos inseridos entre CVE e CPP. O domínio CH1 pode compreender a sequência de aminoácido
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT
SGVHTFPAVLQOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKV DKTV (SEQ ID Nº: 7). O domínio CH2 pode ser modificado para reduzir ou eliminar funções efetoras. O domínio CH2 pode compreender substituições de aminoácido A330S e P331S. O domínio CH2 pode compreenter a sequência de aminoácido
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV
HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAK (SEQ ID Nº: 4). O domínio CH2 pode compreender substituições de aminoácido A330S e P331S. O domínio CH2 pode compreender a sequência de aminoácido
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID Nº: 5).
[0031] São também providas aqui regiões constantes de cadeia pesada modificadas com ligação reduzida ou não detectável a um ou mais FceyRs (por exemplo, CD16, CD32, CD64). Tais regiões constantes de cadeia pesada modificadas podem ter 1-5, 1-3, 1-2 ou uma mutação única (por exemplo, substituição) em relação à região constante de cadeia pesada do tipo selvagem.
[0032] São também providos anticorpos, ou porção de ligação a antígeno dos mesmos, produzidos através dos métodos descritos aqui, por exemplo, mostrados acima, por exemplo, anticorpos humanos ou humanizados. Métodos de tratamento de um indivíduo, por exemplo, um indivíduo tendo câncer, com qualquer um dos anticorpos descritos aqui são também compreendidos aqui Os métodos podem compreender administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais, por exemplo, agentes terapêuticos que estimulam o sistema imune. Por exemplo, um agente terapêutico pode se direcionar a um inibidor de ponto de checagem ou uma molécula coestimuladora. Os métodos podem incluir administração de uma composição, molécula biespecífica ou imunoconjugado descritos aqui.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0033] A Figura 1A mostra a cinética de internalização mediada por anticorpo de CD73 em células H2228 (linhagem de célula de carcinoma de pulmão de células não pequenas) pelos anticorpos que seguem: 11F11, 4C3, 6D11, CD73.3-lgG1.1f com a cadeia leve 403Vk1 ("3-Vh- hHC-IgG1.1f/4C3Vk1"), CD73.4-I9G62CS com a cadeia leve 11F11 VK2 ("4-Vh-hHC-lgG2-C2198S/11F11-Vk2"), CD73.10-lgG2CS ("CD73.10-Vh- hHC-IgG2-C2198S"), — CD73.10-IgG2CS-Il9G1.1f ("CD73.10-Vh-hHC- I9gG2-C2198S-Ig9G1.1f") e CD73.10-Il9G1.1f ("CD73.10-Vh-hHC-IgG1.1f") anticorpos em células H2228. Os anticorpos 11F11 (que é de um isotipo de I1g9G2), CD73.4-lI9G2CS, CD73.10-lgG2CS e CD73.10-l9G2CS- IgG1.1f são internalizados mais rápido e para um grau maior do que os outros anticorpos testados, que são de um isotipo de I9G1.
[0034] A Figura 1B mostra a cinética de internalização de CD73 mediada por anticorpo dos mesmos anticorpos que aqueles mostrados na Figura 1A em células HCC115 (linhagem de célula de carcinoma de pulmão de células não pequenas), mostrando resultados similares àqueles obtidos em células H2228.
[0035] A Figura 1C mostra a cinética de internalização de CD73 mediada por anticorpo dos mesmos anticorpos que aqueles mostrados nas Figuras 1A e 1B, bem como CD73.11-l9G2CS ("11-Vh-hVC-IgG2- C2198S"), em células Calu6, mostrando resultados similares àqueles obtidos em células H2228 e HCC15.
[0036] A Figura 1D mostra a cinética de internalização de CD73 mediada por anticorpo dos mesmos anticorpos que aqueles mostrados na Figura 1C em células NCI-2030 (linhagem de célula de carcinoma de pulmão de células não pequenas), mostrando resultados simulares àqueles obtidos em células H2228, HCC15 e Calu6.
[0037] A Figura 1E mostra a cinética de internalização de CD73 mediada por anticorpo dos anticorpos indicados em células Calu6, conforme medido através de citometria de fluxo.
[0038] A Figura 1F mostra a cinética de internalização de CD73 mediada por anticorpo dos anticorpos indicados em células NCI-H292 (linhagem de célula de carcinoma de pulmão mucoepidermoide), conforme medido através de citometria de fluxo, mas onde os anticorpos não foram removidos após a primeira incubação das células com os anticorpos.
[0039] A Figura 1G mostra a porcentagem de CD73 internalizado em células Calu6 tratadas com os anticorpos indicados, mostrando internalização de CD73 mediada por anticorpo dos anticorpos indicados em células Calu6 com o tempo.
[0040] A Figura 1H mostra a porcentagem de CD73 internalizado em células NCI-H292 tratadas com os anticorpos indicados com o tempo, mostrando internalização de CD73 mediada por anticorpo dos anticorpos indicados em células NCI-H292 com o tempo.
[0041] A Figura 11 mostra a porcentagem de CD73 internalizado em células SNU-C1 (linhagem de célula de carcinoma de cólon) tratadas com os anticorpos indicados com o tempo, mostrando internalização de CD73 mediada por anticorpo dos anticorpos indicados em célula SNU-C1 com o tempo.
[0042] A Figura 1J mostra a porcentagem de CD73 internalizado em células NCI-H1437 (linhagem de célula de carcinoma de pulmão de células não pequenas) tratadas com os anticorpos indicados com o tempo, mostrando internalização de CD73 mediada por anticorpo dos anticorpos indicados em células NCI-H1437 com o tempo.
[0043] A Figura 2 mostra a cinética de ligação dos anticorpos para GITR anti-humanos a células T CD4 humanas ativadas anti-CD3 (revestidas na placa) e CD28 e seus valores de EC50 correspondentes derivados do gráfico.
[0044] As Figuras 3A, 3B e 3C mostram a secreção de IFN-y e IL- 2 a partir de células T CD4 doadoras estimuladas com anticorpos para GITR anti-humanos solúveis com regiões constantes de cadeia pesada diferentes. A Figura 3A mostra secreção de IFN-y a partir de células T CD4 doadoras estimuladas com células CHO expressando OKT3 e várias concentrações de anticorpos para GITR anti-humanos com uma região constante de IgG2-l9G1. A Figura 3B mostra secreção de IL-1 a partir de células T doadores CD4 estimuladas com células CHO expressando OKT3 e várias concentrações de um domínio constante de cadeia pesada de IgG1 ou um domínio constante de cadeia pesada híbrido IgG2-l9G1. A Figura 3C mostra secreção de IL-1 a partir de células T CD4 doadoras estimuladas com células CHO expressando OKT3 e várias concentrações de versões sem efetor (I9G1.1) dos anticorpos nas Figuras 3Ae B.
[0045] A Figura 4 mostra secreção de IL-2 a partir de células 3A9- hGITR culturadas em placas revestidas com anticorpo monoclional anti-CD3 na presença de quantidades grandes dos anticorpos para GITR anti-humanos indicados: o hibridoma anti-GITR (I19G2) e derivados recombinantes como IgG1f, IgG1.1 (sem efetor) ou uma quimera com a dobra de IgG2.
[0046] As Figuras 5A, 5B, 5C e 5D mostram o efeito de uma dobra de IgG2 sobre o tamanho de complexos de anticorpo/antígeno. As Figuras 5A, 5B e 5C mostram dados de cromatograma SEC, dados de DLS e dados de MALS, para complexos de hcD73-his com o anticorpo CD73.4 contendo regiões constantes diferentes. A Figura 5D mostra um modelo esquemático dos complexos de hcD73-his/mAb derivados das massas determinadas por MALS na Figura 5C.
[0047] A Figura 6 mostra dados de SEC-MALS para complexos de CD73/mAb.
[0048] A Figura 7 mostra dados de DLS para complexos de CD73/mAbs.
[0049] A Figura 8A mostra a porcentagem de CD73 internalizado em células Calu6 tratadas com os anticorpos indicados com o tempo, mostrando internalização de CD73 mediada por anticorpo dos anticorpos indicados em células Calu6 com o tempo.
[0050] A Figura 8B mostra a porcentagem de CD73 internalizado em células NCI-H292 tratadas com os anticorpos indicados com o tempo, mostrando internalização de CD73 mediada por anticorpo dos anticorpos indicados em células Calu6 com o tempo.
[0051] A Figura 8C mostra o nível de CD73 na superfície de células Calu6 tratadas com 5 po/ml dos anticorpos indicados por 0, 5, ou 30 minutos.
[0052] A Figura 9 mostra o nível de IL-2 secretada por células T CD4+ coculturadas com células CHO-OKT3 na presença de um anticorpo anti-GITR tendo as regiões constantes indicadas.
[0053] A Figura 10 mostra a porcentagem de internalização de CD73 mediada por anticorpo em 1, 4 ou 21 horas após a adição de cada um dos anticorpos mostrados. As barras para cada anticorpo são mostradas na ordem de 21 horas (à esquerda), 4 horas (meio) e 1 hora (direita).
[0054] A Figura 11h mostra sobreposição de dados de cromatograma SEC para complexos molares 1:1 de hoD73-his com 16 anticorpos para CD73.4 diferentes contendo sequências de região constante diferentes.
[0055] A Figura 11B mostra uma expansão dos dados de cromatograma de 11-19,5 min do cromatograma da Figura 10A, com 4 espécies de eluição distintas indicadas.
[0056] A Figura 11C mostra a porcentagem de área de sinal de cromatografia de UV para pico 2 da Figura 11B, representada em gráfico para os 16 complexos de anticorpo/CD73-his diferentes. Os dados são classificados a partir da esquerda para a direita em ordem de área de pico crescente.
[0057] A Figura 12 mostra a ligação de anticorpo a proteínas FeyR-his capturadas por Fab anti-his. As respostas de ligação são representadas em gráfico como uma porcentagem do Rmax teórico supondo uma estequiometria de ligação mMAb:FcyR 1:1. As barras para cada anticorpo são mostradas na ordem provida pelas legendas coloridas na parte inferior do slide.
[0058] A Figura 13 mostra ligação de anticorpo a proteínas FcyR- his capturadas por Fab anti-chiss Respostas de ligação são representadas em gráfico como uma porcentagem do Rmax teórico supondo uma estequiometria de ligação mAb:FcyR 1:1. As barras para cada anticorpo são mostradas na ordem provida pelas legendas coloridas na parte inferior do slide.
[0059] A Figura 14A mostra ligação de anticorpo a proteínas FcyR- his capturadas por Fab anti-hiss Respostas de ligação são representadas em gráfico como uma porcentagem do Rmax teórico supondo uma estequiometria de ligação MAb:FcyR 1:1. As barras para cada anticorpo são mostradas na ordem provida pelas legendas coloridas na parte inferior do slide.
[0060] A Figura 14B mostra ligação de anticorpo a proteínas FceyR- his capturadas por Fab anti-hisós Respostas de ligação são representadas em gráfico como uma porcentagem do Rmax teórico supondo uma estequiometria de ligação MAb:FcyR 1:1. As barras para cada anticorpo são mostradas na ordem provida pelas legendas coloridas na parte inferior do slide.
[0061] A Figura 15 mostra uma análise de curso de tempo de internalização de anticorpos anti-GITR.
[0062] A Figura 16A mostra análise de colocalização de GITR e marcador de endossomo inicial EEA2 no tempo zero.
[0063] A Figura 16B mostra análise de colocalização de GITR e marcador de endossomo inicial EEA2 nos tempos de 30 e 120 minutos.
[0064] A Figura 16C mostra os resultados de quantificação de colocalização endossomal mostrada nas Figuras 16A e 16B representados em gráfico como a razão de intensidade de pixel colocalizado em relação a tingimento total.
[0065] A Figura 17A mostra ativação de sinalização de NFKB em células T CD8+ tradas com os anticorpos anti-GITR indicados.
[0066] A Figura 17B mostra ativação de sinalização de NFKB em células T CD4+ tradas com os anticorpos anti-GITR indicados.
[0067] A Figura 18 mostra ativação de P38 em células T CD4+ tratadas com os anticorpos anti-GITR indicados.
[0068] A Figura 19 mostra a configuração das ligações dissulfeto em anticorpos IgG2 tendo conformação A, B ou A/B.
[0069] A Figura 20A mostra o nível de IL-2 secretada por células T CD4+ coculturadas com células CHO-OKT3 na presença de concentrações diferentes de um anticorpo anti-GITR tendo as regiões constantes indicadas.
[0070] A Figura 20B mostra o nível de IL-2 secretada por células T CD4+ coculturadas com células CHO-OKT3 na presença de 5 pg/ml de anticorpo anti-GITR tendo as regiões constantes indicadas (mesmo experimento que aquele na Figura 20A).
[0071] A Figura 20C mostra o nível de IL-2 secretada por células T CD4+ coculturadas com células CHO-OKT3 na presença de 1,25 pg/ml de anticorpo anti-GITR tendo as regiões constantes indicadas (mesmo experimento que aquele na Figura 20A).
[0072] A Figura 20D mostra o nível de IL-2 secretada por células T CD4+ coculturadas com células CHO-OKT3 na presença de 0,313 pg/ml de anticorpo anti-GITR tendo as regiões constantes indicadas (mesmo experimento que aquele na Figura 20A).
[0073] A Figura 21 mostra a sequência de aminoácido de uma porção de hIlgG1f, em que as sequências sublinhhadas são reproduzidas abaixo e mostram a localização das mutações nas sequências de aminoácido de hlgG1, hlgG1.1f, hlgG1.3f e hlgG1- P238K em relação a IgG1 do tipo selvagem.
[0074] As Figuras 22A, 22B, 22C, 22D, 22E, 22F, 22G, 22H, 221, 22J, 22K e 22L mostram uma comparação das taxas de dissociação do anticorpo Y1238 no contexto de regiões Fc diferentes dos receptores Fc indicados com base em dados de sensorgramas.
[0075] As Figuras 23A, 23B, 23C, 23D, 23E e 23F mostram os perfis de carga para moléculas de dAB-Fc conforme caracterizado por icIEF.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0076] Em certas modalidades, a invenção é baseada, pelo menos em parte, nas constatações que as propriedades de anticorpos que seguem são potencializadas ou alteradas quando os anticorpos compreendem uma dobra de IgG2 em relação aos mesmos anticorpos que compreendem uma dobra não IgG2 (ou em relação aos mesmos anticorpos compreendendo uma região constante de I|gG1): (1) internalização; (ii) função agonista; (iii) sinalização intracelular mediada por receptor; (ivjy ADCC; e (v) peso de complexos de anticorpo/antígeno. Ainda, essas características potencializadas ou alteradas de anticorpos são potencializadas ou alteradas mais quando os anticorpos compreendem, em adição à dobra de I9G2, um domínio CH1 de IgG2. Foi também observado que anticorpos tendo um domínio CH1 de IgG2, mas não uma dobra de IgG2, têm atividades potencializadas ou alteradas comparado com os mesmos anticorpos tendo um domínio CH1 de IgG1. Sem querer ser limitado a nenhum mecanismo de ação particular, os efeitos de potencialização de uma dobra de IgG2 foram verificados se relacionar com um aumento em tamanho de complexos de antígeno/anticorpo. O tamanho potencializado de complexos de anticorpo/antígeno quando o anticorpo tem uma dobra de IgG2 pode resultar de uma rigidez maior de dobras de IgG1 com relação àquela de outros isotipos. Ainda, foi mostrado que regiões ou aminoácidos específicos da dobra de IgG2 e domínio CH1 podem ser modificados, enquanto outros são preferivelmente não modificados, para preservar as atividades potencializadas ou alteradas.
[0077] Como descrito ainda aqui, essas regiões constantes de cadeia pesada modificadas conferindo aos anticorpos (ou regiões de ligação a antígeno dos mesmos) atividades potencializadas ou modificadas podem ter função efetora. Desta maneira, foi mostrado que podem ser criados anticorpos que têm as propriedades vantajosas conferidas por uma dobra de IgG2 e/ou domínio CH1 e também têm função efetora.
[0078] A invenção é também baseada pelo menos em parte na constatação que deleção de certas porções de uma dobra em um anticorpo IgG1 ou IgG2 resulta no anticorpo tendo propriedades potencializadas ou alteradas em relação ao anticorpo com uma região constante de I19G1.
[0079] São também descritas aqui regiões de cadeia pesada modificadas que têm mutações que reduzem a função efetora de ADCC e/ou CDC, por exemplo, uma mutação P238, por exemplo, P238K, e em algumas modalidades, tal uma ou mais mutação é combinada com uma mutação que potencializa (i) internalização; (ii) função agonista; (iii) sinalização intracelular mediada por receptor; (iv) ADCC; e/ou (v) peso de complexos de anticorpo/antígeno.
[0080] Portanto, são providos aqui (i) anticorpos tendo regiões constantes de cadeia pesada modificadas conferindo às regiões de ligação de antígeno dos anticorpos propriedades potencializadas ou alteradas e métodos de uso dos mesmos e (ii) métodos para potencialização e/ou alteração de células propriedades biológicas de anticorpos que compreendem uma dobra não IgG2 e/ou domínio CH1, tais como internalização, agonismo e antagonismo, em que o método compreende substituição da dobra não I9G2 e/ou domínio CH1 do anticorpo com uma dobra IgG2 e/ou domínio CH1 de IgG2 ou porção do mesmo.
[0081] São providas aqui "regiões constantes de cadeia pesada modificadas" que potencializam certas propriedades biológicas de anticorpos, por exemplo, anticorpos que têm uma dobra não IgG2 e/ou um domínio CH1 não IgG2, em relação aos mesmos anticorpos tendo regiões constantes diferentes. Regiões constantes de cadeia pesada modificadas exemplares incluem uma dobra de IgG2, um domínio CH1, um domínio CH2 e um domínio CH3, em que pelo menos um desses domínios constantes não é do isotipo IgG2 e pode ser, por exemplo, de uma IgG1, IgG3 ou IgG4. Em certas modalidades, uma região constante de cadeia pesada modificada compreende uma dobra de IgG2 e domínios CH2 e CH3 de IgG1. Em certas modalidades, uma região constante de cadeia pesada modificada compreende um domínio CH1 de IgG2 e uma dobra de IgG2. Em certas modalidades, uma região constante de cadeia pesada modificada compreende um domínio CH1 de IgG2, uma dobra de IgG2, um domínio CH2 de I9gG1 e um domínio CH3 de IgG1. Uma região constante de cadeia pesada modificada pode ter função efetora similar àquela de IgG1 do tipo selvagem ou pode ser engenheirada para ter função efetora reduzida ou potencializada em relação àquela IgG do tipo selvagem. Uma região constante de cadeia pesada modificada pode compreender um CH1 do tipo selvagem, dobra, domínio CH2 e/ou CH3 ou uma variante,
do mesmo, por exemplo, uma dobra de CH1, domínio CH2 e/ou CH3 tendo uma ou mais substituições, deleções ou adições de aminoácido com relação ao domínio do tipo selvagem correspondente e/ou tendo uma sequência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica, ou mais, à sequência do tipo selvagem correspondente.
[0082] São também providos anticorpos e proteínas de fusão compreendendo uma região constante de cadeia pesada de I9G1.3. Um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada de IgG1.3 pode ser um anticorpo antagonista ou um agonista, tal como um anticorpo antagonista para um inibidor de ponto de checagem ou um anticorpo agonista para um estimulador de ponto de checagem. Definições
[0083] A fim de que a presente invenção seja mais prontamente compreendida, certos termos são primeiro definidos. Definições adicionais são mostradas durante a descrição detalhada.
[0084] O termo "anticorpo" como aqui usado pode incluir anticorpos inteiros e quaisquer fragmentos de ligação a antígeno (por exemplo, um fragmento de ligação a antígeno que inclui uma dobra, um fragmento de ligação a antígeno que inclui uma dobra e um domínio CH1, fragmento de ligação a antígeno que inclui uma dobra e um domínio CH2 ou um fragmento de ligação a antígeno que inclui uma dobra, um domínio CH2 e uma porção de um domínio CH3) ou cadeias simples dos mesmos. Em uma modalidade, um "anticorpo" se refere a uma proteína, por exemplo, uma glicoproteína, compreendendo pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto ou uma porção de ligação a antígeno das mesmas. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como Vx) e uma região constante de cadeia pesada. Em certos anticorpos IgG, IgD e IgA de ocorrência natural, a região constante de cadeia pesada é compreendida de uma dobra, um domínio CH1, um domínio CH2 e um domínio CH3. Em certos anticorpos de ocorrência natural, cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como V.) e uma região constante de cadeia leve. À região constante de cadeia leve é compreendida de um domínio, CL. As regiões Vx e Vi podem ser subdivididas ainda em regiões de hipervariabilidade, = chamadas regioes de determinação de complementaridade (CDR), interespaçadas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões de estrutura principal (FR). Cada Vx e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do terminal amino para o carbóxi na ordem que segue: FR1, CDR1, FR2, CDR?2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clgq) do sistema de complemento clássico.
[0085] Uma imunoglobulina pode ser de quaisquer isotipos comumente conhecidos, incluindo, mas não limitado a, IgA, IgGA, IgG e IgM secretoras. O isotipo de IgG é dividido em subclasses em certas espécies: I9G1, IgG2, IgG3 e IgG4 em humanos e IgG1, IgG2a, IgG2b e |gG3 em camundongos. Em certas modalidades, os anticorpos descritos aqui são do subtipo I9G1 ou IgG2 humana. Imunoglobulinas, por exemplo, IgG1 humana, existem em vários alótipos, que diferem um do outro em no máximo alguns aminoácidos. "Anticorpo" pode incluir, a título de exemplo, ambos anticorpos de ocorrência natural e não natural; anticorpos monocionais e policlonais; anticorpos quiméricos e humanizados; anticorpos humanos e não humanos; anticorpos sintéticos integrais; e anticorpos sintéticos simples.
[0086] Em certas modalidades, uma cadeia pesada de um anticorpo compreende uma lisina C-terminal; uma glicina C-terminal (tendo perdido a lisina C-terminal) ou está sem GK ou está sem K. Quando se referindo a anticorpos compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada descrita aqui, o anticorpo pode compreender uma sequência provida tendo o GK ou K C-terminal ou, alternativamente, sem GK ou K.
[0087] Numeração de aminoácido é de acordo com o índice EU em Kabat, Kabat e outros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, e de acordo com as Figuras 3c-3f da Pub. de Ped. de Pat. UJS. No. 2008/0248028.
[0088] O termo "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo, como aqui usado, se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a habilidade de se ligar especificamente a um antígeno. Uma porção de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser uma "porção de ligação a antígeno contendo dobra". Foi mostrado que a função de ligação a antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento integral. Exemplos de fragmentos de ligação compreendidos dentro do termo "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo descrito aqui incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, Vu, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab'), um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobra; (ili) um fragmento Fd consistindo nos domínios Vn e CH1; (iv) um fragmento Fv consistindo nos domínios V. e Vi e um braço único de um anticorpo, (v) um fragmento dAB (Ward e outros, (1989) Nature 341:544-546), que consiste em um domínio VH; e (vi) uma região de determinação de complementaridade (CDR) isolada ou (vii) uma combinação de duas ou mais CDRs isoladas que podem ser opcionalmente unidas por um ligante sintético. Ainda, embora os dois domínios do fragmento Fv, V. e Vu, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que eles sejam feitos como uma cadeia de proteína simples em que as regiões V, e Vx emparelham para formar moléculas monovalentes conhecidas como Fv de cadeia simples (scFv); vide, por exemplo, Bird e outros (1988) Science 242:423-426; e Huston e outros (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples pretendem também ser compreendidos dentro do termo "porção de ligação a antígeno" de um anticorpo. Esses e outros construtos potenciais são descritos em Chan & Carter (2010) Nat. Rev. Immunol. 10:301. Esses fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas daqueles de habilidade no campo, e os fragmentos são avaliados quando à utilidade da mesma maneira que são os anticorpos intactos. Porções de ligação a antígeno podem ser produzidas através de técnicas de DNA recombinante ou através de clivagem enzimática ou química de imunoglobulinas intactas.
[0089] Uma "CDR" de domínio variável são resíduos de aminoácido dentro da região hipervariável que são identificados de acordo com as definições das definições Kabat, Chothia, a combinação de ambos Kabat, Chothia ADM, contato e/ou conformacionais ou qualquer método de determinação de CDR bem conhecido na técnica. CDRs de anticorpo podem ser identificadas como as regiões hipervariáveis originalmente definidas por Kabat e outros. Vide, por exemplo, Kabat e outros, 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C. As posições das CDRs podem ser também identificadas como as estruturas de alça estrutural originalmente descritas por Chothia e outros. Vide, por exemplo, Chothia e outros, 1989, Nature 342:877-883. Outras abordagens para identificação de
CDR incluem a definição de "ADM", que é um compromisso entre Kabat e Chothia e é derivado usando o software de modelagem de anticorpo ADM da Oxford Molecular (agora Accelrysº) ou a "definição de contato" de CDRs baseadas em contatos de antígeno observados, mostrado em MacCallum e outros, 1996, J. Mol. Biol., 262:732-745. Em uma outra abordagem, referida aqui como a "definição conformacional" de CDRs, as posições das CDRs podem ser identificadas como os resíduos que fazem contribuições entálpicas para ligação de antígeno. Vide, por exemplo, Makabe et al., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166. Ainda outras definições de limite de CDR podem não seguir estritamente uma das abordagens acima, mas vão, não obstante, se sobrepor a pelo menos uma porção das CDRs de Kabat, embora elas possam ser encurtadas ou alongadas à luz de predição ou constatações experimentais que resíduos particulares ou grupos de resíduo ou até mesmo CDRs inteiras não impactam significantemente ligação de antígeno. Como aqui usado, uma CDR pode se referir a CDRs definidas por qualquer abordagem conhecida na técnica, incluindo combinações de abordagens. Os métodos usados aqui podem utilizar CDRs definidas de acordo com qualquer uma dessas abordagens. Para qualquer dada modalidade contendo mais de uma CDRs, as CDRs podem ser definidas de acordo com qualquer uma das definições de Kabat, Chothia, estendida, ADM, contato e/ou conformacional.
[0090] Como aqui usado, "isotipo" se refere à classe de anticorpo (por exemplo, I9gG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE) que é codificado pelos genes de domínio constante da cadeia pesada. À sequência de aminoácido de comprimento integral de cada região constante de IgG humana do tipo selvagem (incluindo todos os domínios, isto é, domínio CH1, dobra, domínio CH2 e domínio CH3) é catalogada no banco de dados UniProt disponível on-line, por exemplo, como PO01857 (I9G1), PO1859 (IgG2), PO18SGSO (I9G3) e PO1861 (I9G4) ou alótipos diferentes dos mesmos (SEQ ID Nº: 1, 6, 11 e 16, respectivamente). Como aqui usado, um domínio de uma região constante de cadeia pesada, por exemplo, a dobra, é de um "isotipo IgG", "isotipo IGG2", "isotipo I9G3", "isotipo I9G4", se o domínio compreender a sequência de aminoácido do domínio correspondente do respectivo isotipo, ou uma variante da mesma (que tem uma homologia maior com o domínio correspondente do respectivo isotipo do que ela tem com aquele dos outros isotipos).
[0091] "Alotipo" se refere a variantes de ocorrência natural dentro de um grupo de isotipo específico, cujas variantes diferem em alguns aminoácidos (vide, por exemplo, Jefferies e outros (2009) mAbs 1:1). Anticorpos descritos aqui podem ser de qualquer alotipo.
[0092] Uma proteína do "tipo selvagem" ou porção da mesma é uma versão da proteína como é encontrada na natureza. Uma sequência de aminoácido de uma proteína do tipo selvagem, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada, é a sequência de aminoácido da proteína como ela ocorre na natureza. Devido a diferentes alotípicas, pode haver mais de uma sequência de aminoácido para uma proteína do tipo selvagem. Por exemplo, há vários alótipos de regiões constantes de cadeia pesada de IgG1 humana de ocorrência natural (vide, por exemplo, Jeffries e outros (2009) mAbs 1:1).
[0093] Uma "região Fc" (região do fragmento cristalizável) ou "domínio Fc" ou "Fc" se refere à região C terminal da cadeia pesada de um anticorpo que faz a mediação da ligação da imunoglobulina a tecidos ou fatores hospedeiros, incluindo ligação a receptores Fc localizados nas várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) ou ao primeiro componente (C1q) do sistema de complemento clássico. Desta maneira, uma região Fc de um anticorpo de isotipo IgG compreende a região constante de cadeia pesada do anticorpo excluindo o primeiro domínio da imunoglobulina de regia constante (CH1). Em isotipos de anticorpo IgG, IgA e |gD, a região Fe compreende domínios constantes Cr2 e Cx3 em cada uma das duas cadeias pesadas do anticorpo; regiões Fc de IgM e IgG compreendem três domínios constantes de cadeia pesada (domínios Cy 2-4) em cada cadeia polipeptídica. Para IgG, a região Fc compreende domínios de imunoglobulina consistindo na dobra, CH2 e CH3. Para os presentes propósitos, a região Fc é definida como iniciando no aminoácido 216 e terminando no aminoácido 447, em que a numeração é de acordo com o Índice EU como em Kabat. Kabat et a/. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, MD, e de acordo com as Figuras 3c-3f da Pub. Do Ped. De Pat. U.S. No. 2008/0248028. A Fc pode ser uma Fc nativa (ou de ocorrência natural ou do tipo selvagem), incluindo qualquer variante alotípica, ou uma Fc variante (por exemplo, uma Fc de ocorrência não natural), compreendendo, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 1-5, 1-10 ou 5-10 ou mais mutações de aminoácido, por exemplo, substituições, adições ou deleções. Por exemplo, uma Fc variante pode compreender uma sequência de aminoácido que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma Fc do tipo selvagem. Fes modificadas ou mutadas podem ter função efetora e/ou meia-vida potencializada ou reduzida. As regiões CH2 e CH3 são o sítio primário de funções efetoras e ligação a FcRn. Fc pode se referir a esta região em isolamento ou no contexto de um polipeptídeo de proteína compreendendo Fc tal como uma "proteína de ligação compreendendo uma região Fc", também referida como "proteína de fusão a Fc" (por exemplo, um anticorpo ou imunoadesina).
[0094] Uma "função efetora" se refere à interação de uma região Fc de anticorpo com um receptor ou ligante de Fc ou um evento bioquímico que resulta da mesma. "Funções efetoras" exemplares incluem ligação a Clq, citotoxicidade dependente do complemento (CDC), ligação a receptor Fc, funções efetoras mediadas por FcyR tal como ADCC e fagocitose mediada por célula dependente de anticorpo (ADCP), e sub-regulagem de um receptor de superfície celular (por exemplo, o receptor celular B; BCR). Tais funções efetoras geralmente requerem que a região Fc seja combinada com um domínio de ligação (por exemplo, um domínio variável de anticorpo).
[0095] Um "receptor Fc" ou "FcR" é um receptor que se liga à região Fc de uma imunoglobulina. FcRs que se liga a um anticorpo IgG compreendem receptores da família FcyR, incluindo variantes alélicas e formas alternativamente unidas desses receptores. A família FoyR consiste em três receptores de ativação (FcyRI, FeyRIll e FecyRIV em camundongos FCyRIA, FCyRIIA, e FeyRIIIA em humanos) e um receptor inibidor ((CcyRIIB). Várias propriedades de FcyR humanos são sumarizadas na Tabela 1. A maioria dos tipos de célula efetora inata coexpressa um ou mais FcyR de ativação e o FcyRIIB inibidor, enquanto células assassinas naturais (NK) expressam seletivamente um receptor Fc de ativação (FcyRIll em camundongos e FcyRIIIA em humanos) mas não o FcyRIIB inibidor em camundongos e humanos. IgG1 humana se liga à maioria dos receptores Fc humanos e é considerada equivalente à IgG2a de murino com relação aos tipos de receptores Fc de ativação que se ligam a ela.
Tabela 1. Propriedades de FcyRs humanos alélicas 1gG humana isotipo (CD64) descrita nM) neutrófilos ativados, células dendríticas? (CD32a) macrófagos, eosinófilos, células dendríticas, e e ee | Células NK, monócitos, CD16a) macrófagos, mastócitos, eosinófilos, células dendríticas? dendríticas, mastócitos
[0096] Um "domínio de dobra" ou "região de dobra" ou "região de dobra de anticorpo" se refere ao domínio de uma região constante de cadeia pesada que une o domínio CH1 ao domínio CH2 e inclui as porções superiores, média e inferior da dobra (Roux e outros, J. Immunol. 1998 161:4083) A dobra provê níveis variáveis de flexibilidade entre a ligação e as regiões efetoras de um anticorpo e também provê sítios para ligação dissulfeto intermolecular entre as duas regiões constantes de cadeia pesada. Como aqui usado, uma dobra inicia em Glu216 e terminal em Gly237 para todos os isotipos de IgG (Roux e outros, J. Immunol. 1998 161:4083). As sequências de dobras de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 do tipo selvagem são mostradas na Tabela 2.
Tabela 2 Aminoácidos da região de dobra Tipo de Ig C-terminal Ch1* Dobra Superior Dobra Média Dobra Inferior 961 VDKRV EPKSCDKTHT CPPCP APELLGG (SEQ ID Nº:57) (SEQ ID Nº:59) (SEQ ID Nº:64) (SEQ ID Nº:70) Ig62 VDKTV ERK CCVECPPCP APPVAG (SEQ ID Nº:58) (SEQ ID Nº:60) (SEQ ID Nº:65) (SEQ ID Nº:71) 1963 (17-15-1515) — VDKRV ELKTPLGDTTHT CPRCP (SEQ ID Nº66) — APELLGG (SEQ ID Nº:61) (EPKSCDTPPPCPRCP); (SEQ ID Nº:67) 1963 (17-15-15) VDKRV ELKTPLGDTTHT CPRCP APELLGG (EPKSCDTPPPCPRCP) 1963 (17-15) VDKRV ELKTPLGDTTHT CPRCP APELLGG (EPKSCDTPPPCPRCP): 1963 (15-15-15) — — VDKRV EPKS CDTPPPCPRCP APELLGG (SEQ ID Nº:62) (SEQ ID Nº:68) (EPKSCDTPPPCPRCP) 1963 (15) VDKRV EPKS CDTPPPCPRCP APELLGG 1964 VDKRV ESKYGPP CPSCP(SEQ ID Nº:69) APEFLGG (SEQ ID Nº:63) Sequências de aminoácido C-terminais dos domínios CH1
[0097] O termo "dobra" inclui dobras do tipo selvagem (tais como aquelas mostradas na Tabela 3), bem como variantes das mesmas (por exemplo, dobras de ocorrência não natural ou dobras modificadas). Por exemplo, o termo "dobra de IgG2" inclui dobra de IgG2 do tipo selvagem, como mostrado na Tabela 3, e variantes tendo 1, 2, 3,4,5, 1-3, 1-5, 3-5 e/ou no máximo 5, 4, 3, 2 ou 1 mutações, por exemplo, substituições, deleções ou adições. Variantes de dobra de I|gG2 exemplares incluem dobras de IgG2 em que 1, 2, 3 ou todas as 4 cisteínas (C219, C220, C226 e C229) são mudadas para um outro aminoácido. Em uma modalidade específica, uma dobra de IgG2 compreende uma substituição de C219X ou C220X, em que X é qualquer aminoácido, exceto cisteína. Uma dobra de IgG2 pode compreender uma substituição, que sozinha, ou junto com uma ou mais substituições em outras regiões da cadeia pesada ou leve, fará com que o anticorpo compreendendo a dobra adote a forma A ou B (vide, por exemplo, Allen e outros (2009) Biochemistry 48:3755). Em certas modalidades, uma dobra é uma dobra híbrida que compreende sequências de pelo menos dois isotipos. Por exemplo, uma dobra pode compreender a dobra superior, média ou inferior de um isotipo e o restante da dobra de um ou mais isotipos. Por exemplo, uma dobra pode ser uma dobra de IgG2/19G1 e pode compreender, por exemplo, as dobras superior e média de IgG2 e a dobra inferior de IIG1. Uma dobra pode ter função efetora ou ser privada de função efetora. Por exemplo, a dobra inferior de IgG1 do tipo selvagem provê função efetora.
[0098] Uma dobra "não IgG2" se refere a uma dobra que não é do isotipo I9G2.
[0099] O termo "domínio CH1" se refere a inclui domínios CH1 do tipo selvagem (tal como tendo SEQ ID Nº: 2 para IgG1 e SEQ ID Nº: 7 para I9gG2; Tabela 3), bem como variantes dos mesmos (por exemplo, domínios CH1 de ocorrência não natural ou domínios CH1 modificados). Por exemplo, o termo "domínio CH1" inclui domínios CH1 do tipo selvagem e variantes dos mesmos tendo 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 e/ou no máximo 5, 4, 3, 2 ou 1 mutações, por exemplo, substituições, deleções ou adições. Domínios CH1 exemplares incluem domínios CH1 com mutações que modificam uma atividade biológica de um anticorpo, tal como ADCC, CDC ou meia-vida. Modificações do domínio CH1 que afetam uma atividade biológica de um anticorpo são providas aqui.
[00100] O termo "domínio CH2" se refere à região constante de cadeia pesada ligando a dobra ao domínio CH3 em um domínio constante de cadeia pesada. Como aqui usado, um domínio CH2 inicia em P238 e termina em K340. O termo "domínio CH2" inclui domínios CH2 do tipo selvagem (tais como tendo SEQ ID Nº: 4 para IgG1; Tabela 3), bem como suas variantes (por exemplo, domínios CH2 de ocorrência não natural ou domínios CH2 modificados). Por exemplo, o termo "domínio CH2" inclui domínios CH2 do tipo selvagem e variantes dos mesmos tendo 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 e/ou no máximo 5,4,3,2 ou 1 mutações, por exemplo, substituições, deleções ou adições. Domínios CH2 exemplares incluem domínios CH2 com mutações que modificam a atividade biológica de um anticorpo, tal como ADCC, CDC ou meia-vida. Em certas modalidades, um domínio CH2 compreende as substituições A330S/P331S que reduzem função efetora. Outras modificações no domínio CH2 que afetam uma atividade biológica de um anticorpo são providas aqui.
[00101] O termo "domínio CH3" se refere à região constante de cadeia pesada que é C-terminal para o domínio CH2 em um domínio constante de cadeia pesada. Como aqui usado, um domínio CH3 inicia em G341 e termina em K447. O termo "domínio CH3" inclui domínios CH3 do tipo selvagem (tal como tendo SEQ ID Nº: 5 para IgG1; Tabela 3), bem como suas variantes (por exemplo, domínios CH3 de ocorrência não natural ou domínios CH3 modificados). Por exemplo, o termo "domínio CH3" inclui domínios CH3 do tipo selvagem e variantes dos mesmos tendo 1, 2, 3, 4, 5, 1-3, 1-5, 3-5 e/ou no máximo 5, 4, 3,2 ou 1 mutações, por exemplo, substituições, deleções ou adições. Domínios CH3 exemplares incluem domínios CH3 com mutações que modificam uma atividade biológica de um anticorpo, tal como ADCC, CDC ou meia-vida. Modificações no domínio CH3 que afetam uma atividade biológica de um anticorpo são providas.
Tabela 3 Domínio Sequência de aminoácido SEQ ID Nº: 1961 CH1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV 2
LOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTATYICNVNHKPSNTKVDKKV 1961 CH2 PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE
EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK 1961 CH3 GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP 5
PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK Ig62 CH1 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV 7
LOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVY Dobra de 1962 | ERKCCVECPPCPAPPVAG | Ig62 CH2 PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE
EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTK Ig62 CH3 GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP 10
PMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 1963 CH1 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV 12
LOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRV 1963 CH2 PKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFL 14
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS
TFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTK 1963 CH3 GQOPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTP 15
PMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK 1gG4 CH1 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV 17
LOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV
ESKYGPPCPSCPAPEFLGG 1gG4 CH2 PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE
EQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAK 1gG4 CH3 GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP 20
PVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSLGK
[00102] O termo "anticorpo monoclonal", como aqui usado, se refere a um anticorpo que exibe uma especificidade de ligação única e afinidade com um epítopo particular ou uma composição de anticorpos em que todos os anticorpos exibem uma especificidade de ligação única e afinidade com um epítopo particular. Tipicamente tais anticorpos monocionais serão derivados de uma célula ou ácido nucleico codificando o anticorpo único, e serão propagados sem introduzir intencionalmente quaisquer alterações de sequência. Portanto, o termo "anticorpo monoclonal humano" se refere a um anticorpo monoclonal que tem regiões variáveis e opcionais constantes derivadas de sequências da imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em uma modalidade, anticorpos monocionais humanos são produzidos por um hibridoma, por exemplo, obtido traves de fusão de uma célula B obtida de um animal não humano transgênico ou transcromossomal (por exemplo, um camundongo transgênico tendo um genoma compreendendo um transgene de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve humanos) a uma célula imortalizada.
[00103] O termo "anticorpo humano recombinante", como aqui usado, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados através de meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossomal para genes da imunoglobulina humana ou um hibridoma preparado a partir dos mesmos, (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, a partir de um transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo humana combinatorial, recombinante e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados através de qualquer outro meio que envolva união de sequências de gene de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes compreendem regiões variáveis e constantes que utilizam sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana particulares que são codificadas pelos genes da linhagem germinativa, mas incluem rearranjoos e mutações subsequentes que ocorrem, por exemplo, durante maturação do anticorpo. Como conhecido na técnica (vide, por exemplo, Lonberg (2005) Nature Biotech. 23(9):1117-1125), a região variável contém o domínio de ligação a antígeno, o qual é codificado por vários genes que se rearranjam para formar um anticorpo específico para um antígeno estranho. Em adição ao rearranjo, a região variável pode ser ainda modicada por mudanças de aminoácido único múltiplas (referidas como mutação somática ou hipermutação) para aumentar a afinidade do anticorpo com o antígeno estranho. A região constante mudará em mais resposta a um antígeno (isto é, troca de isotipo). Desta maneira, as sequências de ácido nucleico rearraniadas ou somaticamente mutadas que codifcam os polipeptídeos de imunoglobulina de cadeia leve e cadeia pesada em reposta a um antígeno podem não ser idênticas às sequências de linhagem germinativa original, mas ao invés disso serão substancialmente idênticas ou similares (isto é, tendo pelo menos 80% de identidade).
[00104] Um anticorpo "humano" (HuMAb) se refere a um anticorpo tendo regiões variáveis em que ambas a estrutura principal e regiões de CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Ainda, se o anticorpo contiver uma região constante, a região constante também é derivada de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Os anticorpos descritos aqui podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica de sítio in vitro ou por mutação somática in vivo). No entanto, o termo "anticorpo humano", como aqui usado, não pretende incluir anticorpos em que sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de uma outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas em sequências de estrutura principal humana. Os termos anticorpos "humanos" e anticorpos "totalmente humanos" são usados sinonimamente.
[00105] Um anticorpo "humanizado" se refere a um anticorpo em que alguns, a maioria ou todos dos aminoácidos fora dos domínios de CDR de um anticorpo anti-humano são substituídos com aminoácidos correspondentes derivados de imunoglobulinas humanas. Em uma modalidade de uma forma humanizada de um anticorpo, alguns, a maioria ou todos dos aminoácidos fora dos domínios de CDR foram substituídos com aminoácidos de imunoglobulinas humanas, enquanto alguns, a maioria ou todos dos aminoácidos dentro da uma ou mais regiões CDR são não modificados. Adições, deleções, inserções, substituições ou modificações pequenas de aminoácidos são permissíveis contanto que elas não anulem a habilidade do anticorpo em se ligar a um antígeno particular. Um anticorpo "humanizado" retém uma especificidade antigênica similar àquela do anticorpo original.
[00106] Um "anticorpo quimérico" se refere a um anticorpo em que as regiões variáveis são derivadas de uma espécie e as regiões constantes são derivadas de uma outra espécie, tal como um anticorpo em que as regiões variáveis são derivadas de um anticorpo de camundongo e as regiões constantes são derivadas de um anticorpo humano.
[00107] Um "biespecífico" ou "anticorpo bifuncional" é um anticorpo híbrido artificial tendo dois pares de cadeia pesada/leve diferentes, dando origem a dois sítios de ligação de antígeno com especificidade para antígenos diferentes. Anticorpos biespecíficos podem ser produzidos através de uma variedade de métodos incluindo fusão de hibridomas ou ligação de fragmentos Fab. Vide, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).
[00108] As expressões "um anticorpo reconhecendo um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são usados intercomutavelmente aqui com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno".
[00109] Um "anticorpo isolado", como aqui usado, pretende se referir a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente a antígeno "x" é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos outros que não antígeno "x"). Um anticorpo isolado que se liga especificamente a um epítopo de antígeno "x" pode, no entanto, ter reatividade cruzada com outras proteínas do antígeno "x" de espécies diferentes.
[00110] Como aqui usado, um "anticorpo agonista" se refere a um anticorpo que é um agonista de um receptor coestimulador, por exemplo, um anticorpo que é capaz de reforçar o sistema imune (ou uma resposta imune) de um indivíduo ao estimular a atividade de uma proteína que, por sua vez, estimula uma célula imune, por exemplo, uma célula T, tal como uma proteína B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, GITR, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, CD70 ou CD27, DR3 ou CD28H. Em certas modalidades, um anticorpo agonista é um anticorpo que potencializa a atividade de um receptor inibidor, por exemplo, CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2 ou LAG-3, TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina-1, TIGIT, CD113, GPRB56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, CD73, PD1H, LAIR1, TIM-1 ou TIM-A4, e desta maneira inibe uma resposta imune.
[00111] Como aqui usado, um "anticorpo antagonista" se refere a um anticorpo que é um antagonista de um sinal inibidor em uma célula imune, por exemplo, uma célula T, por exemplo, um anticorpo que é capaz de inibir ou bloquear uma proteína que inibe ativação de célula T (por exemplo, inibidores de ponto de checagem imune), tais como CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2 ouLAG-3, TIM-3, Galectina 9, CEACAM- 1, BTLA, CD69, Galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, CD73, PD1H, LAIR1, TIM-1 ou TIM-4, e desta maneira estimula uma resposta imune. Em certas modalidades, um anticorpo antagonista é um anticorpo que inibe a atividade de um receptor estimulador, por exemplo, B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4-1BBL, GITR, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, CD70 ou CD27, DR3 ou CD28H, e desta maneira inibe uma resposta imune.
[00112] Ambos os anticorpos agonista e antagonista resultam em amplificação de respostas de célula T específica de antígeno ou inibição de respostas de célula T específicas de antígeno (reguladores de ponto de checagem imune).
[00113] O termo "epítopo" ou "determinante antigênico" se refere a um sítio em um antígeno (por exemplo, GITR) ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo se liga especificamente. Epítopos com antígenos de proteína podem ser formados ambos a partir de aminoácidos — contíguos (geralmente um epítopo linear) ou aminoácidos não contíguos justapostos por dobra terciária da proteína (geralmente um epítopo conformacional). Epítopos formados a partir de aminoácidos contíguos são tipicamente, mas não sempre, retidos em exposição a solventes desnaturantes, enquanto epítopos formados por dobra terciária são tipicamente perdidos em tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo inclui tipicamente pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 90, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos em uma conformação espacial única. Métodos para determinação de quais epítopos são ligados por um dado anticorpo (isto é, mapeamento de epítopo) são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ensaios de immunoblotting e imunoprecipitação, em que peptídeos em sobreposição ou contíguos são testados quanto á reatividade com um dado anticorpo. Métodos de determinação de conformação espacial de epítopos incluem técnicas no campo e aquelas descritas aqui, por exemplo, cristalografia de raio-X, ressonância magnética nuclear 2-dimensional e HDX-MS (vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
[00114] O termo "ocorrência natural" como aqui usado conforme aplicado a um objeto se refere ao fato que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeo ou polinucleotídeo que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolada de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificada pelo homem no laboratório é de ocorrência natural.
[00115] Um "polipeptídeo" se refere a uma cadeia compreendendo pelo menos dois resíduos de aminoácido consecutivamente ligados, sem nenhum limite superior no comprimento da cadeia. Um ou mais resíduos de aminoácido na proteína podem conter uma modificação tal como, mas não limitado a, glicosilação, fosforilação ou uma ligação dissulfeto. Uma "proteína" pode compreender um ou mais polipeptídeos.
[00116] O termo "molécula de ácido nucleico", como aqui usado, pretende incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de filamento simples ou duplo e pode ser cDNA.
[00117] São também providas aqui "modificações de sequência conservativas" das sequências mostradas aqui que incluem, por exemplo, substituições de nucleotídeo e aminoácido conservativas, bem como adições e deleções de nucleotídeo e aminoácido. Por exemplo, modificações podem ser introduzidas em SEQ ID Nº: 1-74 através de técnicas padrão conhecidas no campo, tais como mutagênese direcionada a sítio e mutagênese mediada por PCR. Modificações de sequência conservativas incluem substituições de aminoácido conservativas, em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina).
[00118] Em uma modalidade, modificações de sequência de aminoácido em uma região constante de cadeia pesada ou domínio da mesma não modificam ou anulam certas propriedades da região constante de cadeia pesada. Essas propriedades incluem, por exemplo, a rigidez da dobra, bem como atividade agonista ou antagonista do anticorpo. Em certas modalidades, modificações de sequência de aminoácido em uma região constante de cadeia pesada ou domínio da mesma realmente modificam ou anulam certas propriedades da região constante de cadeia pesada.
[00119] Métodos de identificação de substituições conservativas de aminoácido que anulam e não anulam propriedades de anticorpo e/ou região constante são bem conhecidos na técnica, por exemplo, como descrito aqui na seção Exemplos.
[00120] Para ácidos nucleicos, o termo "homologia substancial" indica que dois ácidos nucleicos, ou sequências dos mesmos designadas, quando otimamente alinhados e comparados, são idênticos, com inserções ou deleções de nucleotídeo apropriadas, em pelo menos cerca de 80% dos nucleotídeos, geralmente pelo menos cerca de 90% a 95% e mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% a 99,5% dos nucleotídeos. Alternativamente, homologia substancial existe quando segmentos hibridizarão sob condições de hibridização seletivas para o complemento do filamento.
[00121] Para polipeptídeos, o termo "homologia substancial" indica que dois polipeptídeos, ou sequências designadas dos mesmos, quando opcionalmente alinhados e comparados, são idênticos, com inserções ou deleções de aminoácido apropriadas, em pelo menos cerca de 80% dos aminoácidos, geralmente pelo menos cerca de 90% a 95% e mais preferivelmente pelo menos cerca de 98% a 99,5% dos aminoácidos.
[00122] A identidade percentual entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências quando as sequências são otimamente alinhadas (isto é, homologia % = Nº. de posições idênticas/total Nº. de posições x 100), com alinhamento ótimo determinado levando em consideração o número de lacunas, e o comprimento de cada lacuna, com necessidade de ser introduzida para alinhamento ótimo das duas sequências. A composição de sequências e determinação de identidade percentual entre duas sequências podem ser realizadas usando um algoritmo matemático, como descrito nos exemplos não limitantes abaixo.
[00123] A identidade percentual entre duas sequências de nucleotídeo pode ser determinada usando o programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gceg.com), usando uma matriz NWSgapdna.CMP e uma peso de lacuna de 40, 50, 60, 70 ou 80 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. A identidade percentual entre duas sequências de nucleotídeo ou aminoácido pode ser também determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) que foi incorporado ao programa ALIGN (versão 2.0)), usando uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4. Ainda, a identidade percentual entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando o algoritmo Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que foi incorporado ao programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.geg.com), usando ou uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de lacuna de 16, 14, 12, 10, 8,6 ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3,4, 5ou6.
[00124] As sequências de ácido nucleico e proteína descritas aqui podem ser ainda usadas como uma "sequência de investigação" para realizar uma pesquisa em bancos de dados públicos para, por exemplo, identificar sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas usando os programas NBLAST e XBLAST (versão 2.0) de Altschul e outros (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Pesquisas de nucleotídeo podem ser realizadas com o programa NBLAST, classificação = 100, comprimento da palavra = 12 para obter sequências de nucleotídeo homólogas às moléculas de ácido nucleico descritas aqui. Pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, classificação = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácido homólogas às moléculas de proteína descritas aqui. Para obter alinhamentos de lacuna para propósitos de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul e outros, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-
3402. Quando utilizando programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros default dos respectivos programas (por exemplo, XLBAST e NBLAST) podem ser usados. Vide www.ncbi.nIm.nih.gov.
[00125] “Como aqui usado, o termo "antígeno" se refere a qualquer substância imunogênica natural ou sintética, tal como uma proteína, peptídeo ou hapteno. Um antígeno pode ser uma proteína de comprimento integral ou madura ou um fragmento da mesma.
[00126] Uma "resposta imune" se refere a uma resposta biológica dentro de um vertebrado contra agentes estranhos, cuja resposta protege o organismo contra esses agentes e doenças causados por eles. Uma resposta imune é mediada pela ação de uma célula do sistema imune (por exemplo, um linfócito T, um linfócito B, célula assassina natural (NK), macrófago, eosinófilo, mastócito, célula dendrítica ou neutrófilo) e macromoléculas solúveis produzidas por qualquer uma dessas células ou pelo fígado (incluindo anticorpos, citocinas e complemento) que resulta em direcionamento seletivo, ligação a, dano a, destruição de e/ou eliminação do corpo do vertebrado de patógenos invasores, células ou tecidos infectados com patógenos, células cancerosas ou outras anormais ou, em casos de inflamação de autoimunidade ou patológica, células ou tecidos humanos normais. Uma reacao imune inclui, por exemplo, ativação ou inibição de uma célula T, por exemplo, uma célula T efetora ou uma célula Th, tal como uma célula T CD4+ ou CD8+, ou a inibição de uma célula Treg.
[00127] Um "imunomodulador" ou "imunorregulador" se refere a um agente, por exemplo, um componente de uma via de sinalização, que pode estar envolvido em modulação, regulagem ou modificação de uma resposta imune. "Modulação", "regulagem" ou "modificação" de uma resposta imune se refere a qualquer alteração em uma célula do sistema imune ou na atividade de tal célula (por exemplo, uma célula T efetora). Tal modulação inclui estimulação ou supressão do sistema imune que pode ser manifestada por um aumento ou diminuição no número de vários tipos de célula, um aumento ou diminuição na atividade dessas células ou quaisquer outras mudanças que possam ocorrer dentro do sistema imune. Ambos imunomoduladores inibidores e estimuladores foram identificados, alguns dos quais podem ter função potenciaizadda em um microambiente de tumor. Em modalidades preferidas, o imunomodulador está localizado na superfície de uma célula T. Um "alvo imunomodulador" ou "alvo imunorregulador" é um imunomodulador que é direcionado para ligação por, e cuja atividade é alterada pela ligação de, uma substância, agente, porção, composto ou molécula. Alvos imunomoduladores incluem, por exemplo, receptores na superfície de uma célula ("receptores imunomoduladores") e ligantes receptores ("ligantes imunomoduladores").
[00128] "Imunoterapia" se refere ao tratamento de um indivíduo afligido com, ou sob risco de contrair ou sofrer uma recorrência de, uma doença através de um método compreendendo indução, potencialização, supressão ou de outro modo modificação de uma resposta imune.
[00129] "Terapia de imunoestimulação" ou "terapia imunoestimuladora" se refere a uma terapia que resulta em aumento (indução ou potencialização) de uma resposta imune em um indivíduo para, por exemplo, tratamento de câncer.
[00130] "Potencializaçção de uma resposta imune endógena" significa aumento da eficácia ou potência de uma resposta imune existente em um indivíduo. O aumento em eficácia de potência pode ser obtido, por exemplo, superando os mecanismos que suprimem a resposta imune hospedeira endógena ou estimulando mecanismos que potencializam a resposta imune hospedeira endógena.
[00131] Células "efetoras T" ("Ter") se refere a células T (por exemplo, células T CD4+ e CD8+) com atividades citolítica bem como células T auxiliares (Th), que secretam citocinas e ativam e direcionam outras células imunes, mas não incluem células T reguladoras (células Treg).
[00132] “Como aqui usado, o termo "ligado" se refere à associação de duas ou mais moléculas. A ligação pode ser covalente ou não covalente. A ligação também pode ser genética (isto é, recombinantemente fundida). Tais ligações podem ser obtidas usando uma ampla variedade de técnicas reconhecidas no campo, tais como conjugação química e produção de proteína recombinante.
[00133] Como aqui usado, "administração" se refere à introdução física de uma composição compreendendo um agente terapêutico em um indivíduo, usando qualquer um dos vários métodos e sistemas de administração conhecidos daqueles versados na técnica. Vias de administração preferidas para anticorpos descritos aqui incluem intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, espinhal ou outras vias de administração parenterais, por exemplo, através de injeção ou infusão. A expressão "administração parenteral" como aqui usado significa modos de administração outros que não administrações enteral e tópica, geralmente através de injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intralinfática, intralesional, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradermal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural e intrasternal, bem como eletroporação in vivo. Alternativamente, um anticorpo descrito aqui pode ser administrado através de uma via não parenteral, tal como uma via de administração tópica, epidermal ou mucosal, por exemplo, intranasalmente, oralmente, vaginalmente, retalmente, sublingualmente ou topicamente.
Administração pode ser também realizada, por exemplo, uma vez, uma pluralidade de vezes e/ou durante um ou mais períodos prolongados.
[00134] Como aqui usado, o termo "resposta mediada por célula T" se refere a uma resposta mediada por células T, incluindo células T efetoras (por exemplo, células CD8*) e células T auxiliares (por exemplo, células CD4*). Respostas mediadas por célula T incluem, por exemplo, citotoxicidade e proliferação de célula T.
[00135] Como aqui usado, o termo "resposta de linfócito T citotóxico (CTL)" se refere a uma resposta imune induzida por células T citotóxicas. Respostas CTL são mediadas principalmente por células T CD8*.
[00136] Como aqui usado, os termos "inibe" e "bloqueia" (por exemplo, se referindo à inibição/bloqueio de um ligante a seu receptor ou a uma resposta intracelular subsequente) são usados intercomutavelmente e compreendem ambas inibição/bloqueio parcial e completo. Em algumas modalidades, o anticorpo inibe ligação em pelo menos cerca de 50%, por exemplo, pelo menos cerca de 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou 100%, determinado, por exemplo, como descrito mais aqui.
[00137] Como aqui usado, "câncer" se refere a um grupo amplo de doenças caracterizadas pelo crescimento descontrolado de células anormais no corpo. Divisão de célula não regulada pode resultar na formação de tumores malignos ou células que invadem tecidos vizinhos e pode metastatizar para partes distantes do corpo através do sistema linfático ou corrente sanguínea.
[00138] Os termos "tratar", "tratando" e "tratamento", como aqui usado, se referem a qualquer tipo de intervenção ou processo realizado no, ou administração de um agente ativo a, indivíduo com o objetivo de reverter, aliviar, melhorar, inibir ou deixar mais lento ou prevenir a progressão, desenvolvimento, severidade ou recorrência de um sintoma, complicação, condição ou indícios bioquímicos associados com uma doença. Profilaxia se refere à administração a um indivíduo que não tem uma doença, para prevenir que a doença ocorra ou minimizar seus efeitos se ela ocorrer.
[00139] Um "mal hematológico" inclui um linfoma, leucemia, mieloma ou um mal linfoide, bem como um câncer do baço e dos nós linfáticos. Linfomas exemplares incluem ambos linfomas de células B e linfomas de células T. Linfomas de células B incluem ambos linfomas de Hodgkin e a maioria dos linfomas não Hodgkin. Exemplos não limitantes de linfomas de células B incluem linfoma difuso de grandes células B, linfoma folicular, linfoma do tecido linfático associado à mucosa, linfoma linfocítico de pequenas células (coincide com a leucemia linfocítica crônica), linfoma de células do manto (MCL), linfoma de Burkitt, linfoma mediastinal de grandes células B, macroglobulinemia de Waldenstrôm, linfoma de células B de zona marginal nodal, linfoma de zona marginal esplênica, linfoma intravascular de grandes células B, linfoma primário de efusão, granulomatose linfomatoide, exemplos não limitantes de linfomas de célula T incluem linfoma de célula T extranodal, linfomas de célula T cutâneos, linfoma anaplástico de grandes células e linfoma de células T angioimunoblástico. Males hematológicos também incluem leucemia, tais como, mas não limitado a, leucemia secundária, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielógena aguda, leucemia mielógena crônica e leucemia linfoblástica aguda. Males hematológicos incluem ainda mielomas, tais como, mas não limitado a, mieloma múltiplo e mieloma múltiplo latente. Outros cânceres hematológicos e/ou associados a células B ou células B são compreendidos pelo termo mal hematológico.
[00140] O termo "dose eficaz" ou "dosagem eficaz" é definido como uma quantidade suficiente para obter ou pelo menos parcialmente obter um efeito desejado. Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "dosagem terapeuticamente eficaz" de um fármaco ou agente terapêutico é qualquer quantidade do fármaco que, quando usado sozinho ou em combinação com um outro agente terapêutico, promove regressão de doença evidenciada por uma diminuição em severidade de sintomas da doença, um aumento em frequência e duração de períodos livres de sintomas da doença ou uma prevenção de prejuízo ou incapacidade devido ao sofrimento da doença. Uma "quantidade profilaticamente eficaz" ou "uma dosagem profilaticamente eficaz" de um fármaco é uma quantidade do fármaco que, quando administrado sozinho ou em combinação com um outro agente terapêutico a um indivíduo sob risco de desenvolver uma doença ou de sofrer uma recorrência de doença, inibe o desenvolvimento ou recorrência da doença. A habilidade de um agente terapêutico ou profilático em promover regressão de doença ou inibir o desenvolvimento ou recorrência da doença pode ser avaliada usando uma variedade de métodos conhecidos do praticante versado, tal como em indivíduos humanos durante testes clínicos, em sistemas de modelo animal preditivos de eficácia em humanos ou através do ensaio da atividade do agente em ensaios in vitro.
[00141] A título de exemplo, um agente anticâncer é um fármaco que deixa mais lenta a progressão de câncer ou promove regressão de câncer em um indivíduo. Em modalidades preferidas, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um fármaco promove regressão do câncer para o ponto de eliminação do câncer. "Promoção de regressão de câncer" significa que administração de uma quantidade eficaz do fármaco, sozinho ou em combinação com um agente antineoplástico, resulta em uma redução em crescimento ou tamanho de tumor, necrose do tumor, uma diminuição em severidade de pelo menos um sintoma da doença, um aumento em frequência e duração dos períodos livres de sintomas da doença, uma prevenção de prejuízo ou incapacidade devido ao sofrimento da doença, ou outra melhora de sintomas de doença no paciente. Eficácia farmacológica se refere à habilidade do fármaco em promover regressão de câncer no paciente. Segurança fisiológica se refere a um nível de toxidez aceitavelmente baixo, ou outros efeitos fisiológicos adversos no nível celular, de órgão e/ou organismo (efeitos adversos) resultantes da administração do fármaco.
[00142] A título de exemplo para o tratamento de tumores, uma quantidade ou dosagem terapeuticamente eficaz do fármaco preferivelmente inibe crescimento celular ou crescimento de tumor em pelo menos cerca de 20%, mais preferivelmente em pelo menos cerca de 40%, ainda mais preferivelmente em pelo menos cerca de 60%, e ainda mais preferivelmente em pelo menos cerca de 80% em relação a indivíduos não tratados. Nas modalidades mais preferidas, uma quantidade ou dosagem terapeuticamente eficaz do fármaco inibe completamente crescimento celular ou crescimento de tumor, isto é, inibe preferivelmente crescimento celular ou crescimento de tumor em 100%. A habilidade de um composto em inibir crescimento de tumor pode ser avaliada usando os ensaios descritos infra. Alternativamente, essa propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando a habilidade do composto em inibir crescimento celular, tal inibição pode ser medida in vitro através de ensaios conhecidos do praticante versado. Em outras modalidades preferidas descritas aqui, regressão de tumor pode ser observada e pode continuar por um período de pelo menos cerca de 20 dias, mais preferivelmente pelo menos cerca de 40 dias ou ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 60 dias.
[00143] Os termos "paciente" e "indivíduo" se referem a qualquer animal humano ou não humano que recebe tratamento ou profilático ou terapêutico. Por exemplo, os métodos e composições descritos aqui podem ser usados para tratar um indivíduo tendo câncer. O termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelha, cachorro, vaca, galinhas, anfíbios, répteis, etc.
[00144] Vários aspectos descritos aqui são descritos em mais detalhes nas subseções que seguem. Regiões constantes de cadeia pesada modificadas
[00145] São descritas aqui "regiões constantes de cadeia pesada modificadas" que, quando presentes em anticorpos, potencializam ou alteram certas propriedades ou características biológicas dos anticorpos, em relação aos mesmos anticorpos que não têm uma região constante de cadeia pesada modificada, tais como anticorpos que contêm uma dobra não I|IgG2, por exemplo, anticorpos IgG1. Propriedades biológicas potencializadas ou alteradas de anticorpos incluem: internalização aumentada ou alterada por uma célula; atividade agonista aumentada ou alterada; atividade agonista ou de bloqueio aumentada ou alterada; ADCC potencializada; geração de uma propriedade nova; transdução de sinal aumentada ou alterada; formação de complexos reticulados de anticorpo/antígeno maiores; agrupamento ou oligomerização aumentado da molécula de superfície de célula-alvo; inibição aumentada de uma resposta imune.
[00146] São também providos aqui anticorpos compreendendo cadeias pesadas compreendendo uma ou mais mutações de aminoácido que modulam a função efetora, por exemplo, reduz a função efetora.
Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada faz a mediação de internalização de receptor dependente de anticorpo de região constante de cadeia pesada modificada (ou ligante ou molécula de superfície) mais efetivamente, por exemplo, o anticorpo internaliza uma molécula-alvo ou de superfície (por exemplo, um receptor ou ligante) e/ou internaliza ele mesmo com um taxa e/ou grau de internalização maior em uma célula após o anticorpo se ligar a seu alvo na membrana celular, em relação ao mesmo anticorpo que não compreende uma região constante de cadeia pesada modificada, e compreende, por exemplo, uma cadeia pesada de IgG1. A taxa e extensao de internalização de um anticorpo podem ser determinadas, por exemplo, como mostrado nos Exemplos.
A taxa de internalização, conforme medido, por exemplo, através de T12 de internalização, por exemplo, como mostrado nos Exemplos, pode ser potencializada ou aumentada em pelo menos 10%, 30%, 50%, 75%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes ou mais, resultando em uma redução do T12 em pelo menos 10%, 30%, 50%, 75%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes ou mais.
Por exemplo, ao invés de ter um T12 de 10 minutos, uma região constante de cadeia pesada modificada pode aumentar a taxa de internalização e desta maneira reduzir o T12 para 5 minutos (isto é, um aumento de duas vezes em taxa de internalização ou uma diminuição de 2 vezes em T12). "T12" é definido como o tempo que metade da internalização máxima é atingida, conforme medido a partir do tempo que o anticorpo é adicionado às células.
Em certas modalidades, T12 é reduzido em pelo menos 10 minutos, 30 minutos ou 1 hora.
O nível máximo de internalização pode ser o nível de internalizado no platô de um gráfico representando a internalização representada em gráfico contra concentração de anticorpo ou tempo.
Uma região constante de cadeia pesada modificada pode aumentar o número máximo de internalização de um anticorpo em pelo menos 10%, 30%, 50%, 75%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes ou mais. Uma outra maneira de comparar eficácias de internalização de anticorpos diferentes, tal como um anticorpo com, e o mesmo anticorpo sem, uma região constante de cadeia pesada modificada, é comparar seu nível de internalização em uma dada concentração de anticorpo (por exemplo, 100 nM) e/ou em um dado tempo (por exemplo, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos ou 30 minutos). Comparação de níveis de internalização também pode ser feita comparando os níveis de ECso de internalização. O nível de internalização de um anticorpo pode ser definido em relação àquele de um dado anticorpo (referência), por exemplo, um anticorpo descrito aqui, por exemplo, 11F11 ou CD73.4-I9G2CS-IlgG1, e pode ser indicado como uma porcentagem do valor obtido com o dado anticorpo (referência). O grau de internalização pode ser potencializado em pelo menos 10%, 30%, 50%, 75%, duas vezes, 3 vezes, 5 vezes ou mais, comparado com qualquer um desses métodos.
[00147] Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada tem atividade agonista mais potente, em relação ao mesmo anticorpo que não compreende uma região constante de cadeia pesada modificada, e compreende, por exemplo, uma cadeia pesada de IgG1. Em certas modalidades, a atividade agonista potencializada potencializa a atividade estimuladora de uma molécula-alvo, por exemplo, GITR, ou outras moléculas que estimulam ou coestimulam uma resposta imune, por exemplo, atividade de célula T. Em certas modalidades, a atividade agonista potencializada potencializa a atividade inibidora de uma molécula-alvo que inibe uma resposta imune, por exemplo, atividade de célula T (por exemplo, um inibidor de ponto de checagem). A atividade agonista potencializada de um anticorpo que modula atividade de células T pode ser determinada, por exemplo, conforme mostrado nos
Exemplos, por exemplo, através da medição do nível de secreção de IFN-y ou IL-2 a partir de células T que são contatadas com o anticorpo. A atividade agonista de um anticorpo que se liga a um alvo estimulador pode ser potencializada em pelo menos 10%, 30%, 50%, 75%, duas vezes, 3 vezes, 5 vezes ou mais, conforme definido por liberação de citocina aumentada ou proliferação aumentada de células T efetoras; atividade de célula T reguladora reduzida se engajamento em Tregs reduzir a função de Treg, ou depleção aumentada de Tregs. Por exemplo, a quantidade de IFN-y ou I|L-2 secretada a partir das células T estimuladas com um anticorpo que se liga a um alvo estimulador compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada pode ser pelo menos 10%, 30%, 50%, 75%, duas vezes, 3 vezes, 5 vezes ou mais do que aquela de células T estimuladas com o mesmo anticorpo que não compreende uma região constante de cadeia pesada modificada. A atividade agonista de um anticorpo que se liga a um alvo inibidor pode ser potencializada em pelo menos 10%, 30%, 50%, 75%, 2 vezes, 3 vezes, 5 vezes ou mais conforme definido pela liberação de citocina reduzida ou proliferação reduzida de células T efetoras; atividade de célula T reguladora aumentada; ou depleção diminuída de Tregs. Por exemplo, a quantidade de IFN-y ou IL-2 secretada a partir das células T estimuladas com um anticorpo que se liga a um alvo inibidor compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada pode ser pelo menos 10%, 30%, 50%, 75%, duas vezes, 3 vezes, 5 vezes ou mais menor do que aquela de células T estimuladas com o mesmo anticorpo que não compreende uma região constante de cadeia pesada modificada.
[00148] Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada tem atividade antagonista ou de bloqueio mais potente, em relação ao mesmo anticorpo que não compreende uma região constante de cadeia pesada modificada e compreende, por exemplo, uma cadeia pesada de IgG1. A atividade antagonista potencializada de um anticorpo pode ser determinada, por exemplo, através da medição de liberação e/ou proliferação de citocina em contextos que incluem condições de ativação de célula T. A atividade antagonista pode ser potencializada em pelo menos 10%, 30%, 50%, 75%, duas vezes, 3 vezes, 5 vezes ou mais.
[00149] Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada tem atividade ADCC aumentada, em relação ao mesmo anticorpo que não compreende uma região constante de cadeia pesada modificada e compreende, por exemplo, uma cadeia pesada de I9gG1. ADCC potencializada pode ser determinada de acordo com métodos conhecidos na técnica. ADCC também pode ser potencializada em pelo menos 10%, 30%, 50%, duas vezes, 5 vezes ou mais.
[00150] Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada tem a habilidade de formar complexos reticulados de anticorpo/antígeno maiores, em relação ao mesmo anticorpo que não compreende uma região constante de cadeia pesada modificada e compreende, por exemplo, uma cadeia pesada de IgG1. A habilidade em formar complexos pode ser determinada como descrito, por exemplo, nos Exemplos. Complexos de anticorpo/antígeno formados com um anticorpo que compreende uma região constante de cadeia pesada modificada podem ser pelo menos 50%, duas vezes, 3 vezes, 5 vezes ou 10 vezes maiores do que os complexos formados com o mesmo anticorpo que não compreende uma região constante de cadeia pesada modificada. Em certas modalidades, complexos de pelo menos 2.000 kDa; 3.000 kDa; 5000 kDa; 10.000 kDa, 50.000KkDa ou 100.000 kDa são formados com anticorpos tendo uma região constante de cadeia pesada modificada.
[00151] Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada dispara mais agrupamento ou oligomerização da molécula-alvo na superfície celular, em relação ao mesmo anticorpo que não compreende uma região constante de cadeia pesada modificada, e compreende, por exemplo, uma cadeia pesada de IgG1. O grau de agrupamento de uma oligomerização pode ser determinado, por exemplo, através da medição do tamanho de complexos de anticorpo/antígeno.
[00152] Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada transduz um nível maior ou tipo diferente de sinalização ou transdução de sinalização, em relação ao mesmo anticorpo que não compreende uma região constante de cadeia pesada modificada, e compreende, por exemplo, uma cadeia pesada de IgG1. Transdução de sinal pode ser monitorada através da determinação do nível de ativação de uma ou mais proteínas em vias de transdução de sinal. Em certas modalidades, transdução de sinal é determinada através da medição da atividade (ou fosforilação) de uma proteína de transdução de sinal, por exemplo, NFKB ou p38, como descrito, por exemplo, nos Exemplos. Transdução de sinal disparada por um anticorpo que compreende uma região constante de cadeia pesada modificada pode ser maior ou menor em pelo menos 10%, 20%, 50%, duas vezes, 5 vezes ou mais do que a transdução de sinal com o mesmo anticorpo que não compreende uma região constante de cadeia pesada modificada. Por exemplo, transdução de sinal disparada por um anticorpo que se liga a uma molécula estimuladora (por exemplo, GITR) e compreende uma região constante de cadeia pesada modificada pode ser potencializada em pelo menos 10% em relação àquela obtida com o mesmo anticorpo tendo uma cadeia pesada de I9G1. Por exemplo, ECs5o de atividade de NFKB ou p38 (por exemplo,
fosforilação) pode ser reduzida em pelo menos 50%, duas vezes, 5 vezes ou mais.
[00153] Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada tem uma habilidade aumentada em estimular ou potencializar uma resposta imune ou o sistema imune, em relação ao mesmo anticorpo que não compreende uma região constante de cadeia pesada modificada, e compreende, por exemplo, uma cadeia pesada de IgG1. Uma habilidade aumentada em estimular uma resposta imune ou o sistema imune pode resultar de uma atividade agonista potencializada de receptores coestimuladores de célula T e/ou atividade antagonista potencializada de receptores inibidores. Uma habilidade aumentada em estimular uma resposta imune ou o sistema imune pode ser refletida por uma razão de aumento da ECso ou nível de atividade máximo em um ensaio que mede uma resposta imune, por exemplo, um ensaio que mede mudanças em liberação de citocina ou quimiocina, atividade citolítica (determinada diretamente em células-alvo ou indiretamente através da detecção de CD107a ou granzimas) e proliferação. A habilidade em estimular uma resposta imune ou a atividade do sistema imune pode ser potencializada em pelo menos 10%, 30%, 50%, 75%, duas vezes, 3 vezes, 5 vezes ou mais.
[00154] Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada tem uma atividade antiproliferativa e antitumor aumentada, em relação ao mesmo anticorpo que não compreende uma região constante de cadeia pesada modificada e compreende, por exemplo, uma cadeia pesada de IgG1. A atividade antitumor potencializada de um anticorpo pode ser determinada, por exemplo, através do crescimento de um tumor em um animal que foi tratado com o anticorpo. A atividade antitumor pode ser potencializada em pelo menos 10%, 30%, 50%, 75%, duas vezes, 3 vezes, 5 vezes ou mais. Atividade antitumor pode ser medida, por exemplo, como uma diminuição em carga de tumor, por exemplo, manifestada por cinética de crescimento de tumor diminuída e regressão de tumor completa.
[00155] Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada tem uma habilidade aumentada em inibir ou suprimir uma resposta imune ou o sistema imune, em relação ao mesmo anticorpo que não compreende uma região constante de cadeia pesada modificada, e compreende, por exemplo, uma cadeia pesada de IgG1. Uma habilidade aumentada em inibir ou suprimir uma resposta imune ou o sistema imune pode resultar de uma atividade antagonista potencializada de receptores coestimuladores de células T e/ou atividade agonista potencializada de receptores inibidores. Uma habilidade aumentada em estimular uma resposta imune ou o sistema imune pode ser refletida por uma razão de aumento da ECso ou nível de atividade máximo em um ensaio que mede uma resposta imune, por exemplo, um ensaio que mede mudanças em liberação de citocina ou quimiocina, atividade citolítica (determinada diretamente em células-alvo ou indiretamente através da detecção de CD107a ou granzimas) e proliferação. A habilidade em inibir ou suprimir uma resposta imune ou a atividade do sistema imune pode ser potencializada em pelo menos 10%, 30%, 50%, 75%, duas vezes, 3 vezes, 5 vezes ou mais.
[00156] Em certas modalidades, uma região constante de cadeia pesada modificada ou porção da mesma, por exemplo, a dobra, é mais rígida, comparado com outras regiões constantes de cadeia pesada, por exemplo, regiões constantes de cadeia pesada de IgG1, IgG2, I9G3 e/ou I9gG4. Por exemplo, uma região constante de cadeia pesada modificada é uma região constante de cadeia pesada de ocorrência não natural que é mais rígida do que, ou tem uma porção, por exemplo, uma dobra, que é mais rígida do que uma região constante de cadeia pesada de ocorrência natural ou dobra da mesma. A rigidez de uma região constante de cadeia pesada ou porção da mesma, tal como a dobra, pode ser determinada através de, por exemplo, modelagem por computador, microscopia eletrônica, espectroscopia tal como Ressonância Magnética Nuclear (RMN), cristalografia de raios X (fatores B) ou Velocidade de Sedimentação por Ultracentrifugação Analítica (AUC) para medir ou comparar o raio de rotação de anticorpos compreendendo a dobra. Alternativamente, a rigidez de uma região constante de cadeia pesada ou porção da mesma pode ser determinada através da medição dos tamanhos de complexos de anticorpo/antígeno, por exemplo, como descrito mais aqui.
[00157] Um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada e exibindo uma propriedade funcional potencializada conforme determinado de acordo com as metodologias conhecidas na técnica e descritas aqui será compreendido se relacionar a uma diferença estatisticamente significante na atividade particular em relação àquela vista no mesmo anticorpo, mas com uma região constante de cadeia pesada diferente.
[00158] Em certas modalidades, uma região constante de cadeia pesada modificada compreende uma dobra do isotipo I9G2 (uma "dobra de IgG2") e um domínio CH1, CH2 e CH3. Em certas modalidades, uma região constante de cadeia pesada modificada compreende uma dobra de IgG2 e um domínio CH1, CH2 e CH3, em que pelo menos um dos domínios CH1, CH2 e CH3 não é do isotipo de IgG2. Em certas modalidades, uma região constante de cadeia pesada modificada compreende uma dobra de |IgG2 e um domínio CH1, CH2 e CH3, em que o domínio constante de cadeia pesada não é uma região constante de I9gG2 do tipo selvagem ou não é uma região constante de IgG2 com uma mutação no aminoácido 219 ou 220. À dobra de IgG2 pode ser uma dobra de IgG2 do tipo selvagem, por exemplo, uma dobra de IgG2 do tipo selvagem (por exemplo, tendo SEQ ID Nº: 8) ou uma variante da mesma, contanto que a dobra de I9gG2 retenha a habilidade em conferir ao anticorpo uma atividade potencializada em relação àquela do mesmo anticorpo que compreende uma dobra não IgG2 ou compreendendo uma cadeia pesada de IgG1. Em certas modalidades, uma variante de dobra de IgG2 retém rigidez similar àquela de uma dobra de IgG2 do tipo selvagem. A rigidez de uma dobra pode ser determinada, por exemplo, através de modelagem por computador, microscopia eletrônica, espectroscopia tal como Ressonância Magnética Nuclear (RMN), cristalografia de raios X (fatores B) ou Velocidade de Sedimentação por Ultracentrifugação Analítica (AUC) para medir ou comparar o raio de rotação de anticorpos compreendendo a dobra. Uma dobra tem rigidez similar ou maior em relação àquela de uma outra dobra se um anticorpo compreendendo a dobra tiver um valor obtido do um ou mais testes descritos na sentença anterior que seja diferente do valor do mesmo anticorpo com uma dobra diferente, por exemplo, uma dobra de IgG1, em menos de 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ou 100%. Um versado seria capaz de determinar a partir dos testes se uma dobra tem rigidez pelo menos similar àquela de uma outra dobra através de interpretação dos resultados desses testes.
[00159] Uma variante de dobra de IgG2 humana exemplar é uma dobra de IgG2 que compreende uma substituição de um ou mais dos quatro resíduos cisteína (isto é, C219, C220, C226 e C229) com um outro aminoácido. Uma cisteína pode ser substituída por uma serina. Uma dobra de IgG2 exemplar é uma dobra de I|gG2 humana compreendendo uma mutação C219X ou uma mutação C220X, em que X é qualquer aminoácido exceto cisteína. Em certas modalidades,
uma dobra de IgG2 não compreende ambas uma substituição C219 e uma C220X. Em certas modalidades, uma dobra de I9G2 compreende C2198S ou C2208S mas não ambos C2198S e C22S. Outras variantes de dobra de IgG2 que podem ser usadas incluem dobras de IgG2 humana compreendendo uma substituição C220, C226 e/ou C229, por exemplo, uma mutação em C220S, C226S ou C229S (que pode ser combinada com uma mutação em C219S). Uma dobra de IgG2 pode ser também uma dobra de IgG2 em que uma porção da dobra é aquela de um outro isotipo (isto é, ela é uma dobra quimérica ou híbrida), contanto que a rigidez da dobra quimérica seja pelo menos similar àquela de uma dobra de IgG2 do tipo selvagem. Por exemplo, uma dobra de IgG2 pode ser uma dobra de IgG2 em que a dobra inferior (como definido na Tabela 2) é de um isotipo de I9G1 e é, por exemplo, uma dobra inferior de IgG1 do tipo selvagem.
[00160] Uma dobra "híbrida" ou "quimérica" é referida como sendo de um isotipo específico se mais de metade dos aminoácidos consecutivos da dobra forem daquele isotipo. Por exemplo, uma dobra tendo uma dobra superior e média de IgG2 e a dobra inferior de I9G1 é considerada ser uma dobra híbrida de 19G2.
[00161] Em certas modalidades, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada modificada que compreende uma dobra de I9gG2 compreendendo uma sequência mostrada na Tabela 4, por exemplo, uma das sequências de aminoácido que seguem: 8, 21, 22, 23, 126-129 e 134-147. Em certas modalidades, a dobra compreende SEQ ID Nº: 8, 21, 126, 134 ou 135, em que 1,2, 3 ou todos os 4 aminoácidos P233, V234, A235 e G237 (correspondendo aos 4 aminoácidos C-terminais "PVAG" (SEQ ID Nº: 148) são deletados ou substituídos com um outro aminoácido, por exemplo, os aminoácidos do terminal C da dobra de I9G1 (ELLG (SEQ ID Nº: 149) ou ELLGG (SEQ ID Nº: 150)) Em certas modalidades, a dobra compreende SEQ ID Nº: 8, 21, 126, 134 ou 135, em que V234, A235 e G237 são deletados ou substituídos com um outro aminoácido. Em certas modalidades, a dobra compreende SEQ ID Nº: 8, 21, 126, 134 ou 135, em que A235 e G237 são deletados ou substituídos com um outro aminoácido. Em certas modalidades, a dobra compreende SEQ ID Nº: 8, 21, 126, 134 ou 135, em que G237 é deletado ou substituído com um outro aminoácido. Em certas modalidades, a dobra compreende SEQ ID Nº: 8, 21, 126, 134 ou 135, em que V234 e A235 são deletados ou substituídos com um outro aminoácido. Substituição de PVAG (SEQ ID Nº: 143) em uma IgG2 com os aminoácidos correspondentes de uma dobra de IgG1, isto é, (ELLG (SEQ ID Nº: 144) ou ELLGG (SEQ ID Nº: 145)) para obter uma dobra híbrida tendo SEQ ID Nº: 22 ou 138 ou suas variantes (vide, por exemplo, Tabela 4) provê uma dobra tendo as vantagens de uma dobra de IgG2 ea função efetora de dobras de IgG1.
[00162] Em certas modalidades, uma região constante de cadeia pesada modificada compreende uma dobra que consiste em ou consiste essencialmente em uma das sequências na Tabela 4, por exemplo, SEQ ID Nº: 8, 21, 22, 23, 127-132 e 134-141 e, em certas modalidades, não compreende resíduos de aminoácido de dobra adicionais.
Tabela 4. Dobras de I9G2 exemplares semente o ewemenmtentms fo X é qualquer aminoácido, exceto cisteína.
[00163] Em certas modalidades, uma região constante de cadeia pesada modificada compreende uma dobra de IgG2 mostrada na Tabela 4, em que 1-5, 1-3, 1-2 ou 1 aminoácido é inserido entre os resíduos de aminoácido CVE e CPP. Em certas modalidades, THT ou GGG é inserido. Em certas modalidades, 1, 1-2 ou 1-3 aminoácidos podem ser inseridos entre a dobra e domínio CH2. Por exemplo, uma glicina adicional pode ser inserida entre a dobra e o domínio CH2.
[00164] Em certas modalidades, uma região constante de cadeia pesada modificada é uma região constante de IgG1 ou IgG2, em que a dobra compreende uma deleção de 1-10 aminoácidos. Como mostrado nos Exemplos, um anticorpo IgG1 sem os resíduos de aminoácido SCDKTHT (S219, C220, D221, K222, T223, H224 e T225; SEQ ID Nº: 151) conferiu internalização de CD73 mediada por anticorpo mais efetivamente do que o mesmo anticorpo tendo uma região constante de IgG1 do tipo selvagem. Similarmente, no contexto de um anticorpo IgG2, um anticorpo IgG2 sem os resíduos de aminoácido CCVE (C219, C220, V222 e E224; SEQ |D Nº: 152) conferiu internalização de CD73 mediada por anticorpo mais efetivamente do que o mesmo anticorpo tendo uma região constante de IgG1 do tipo selvagem. Portanto, são providas aqui regiões constante de cadeia pesada modificadas em que a dobra compreende uma deleção de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 resíduos de aminoácido selecionados dos resíduos S219, C220, D221, K222, T223, H224 e T225 para um anticorpo IgG1 e resíduos C219, C220, V222 e E224 para um anticorpo 1gG2.
[00165] Em certas modalidades, uma região constante de cadeia pesada modificada compreende um domínio CH1 que é um domínio CH1 do tipo selvagem do isotipo IgG1 ou IgG2 ("domínio CH1 de IgG1" ou "domínio CH1 de IgG2", respectivamente). Domínios CH1 dos isotipos IgG3 e IgG4 ("domínio CH1 de I9G3" e "domínio CH1 de I9G2", respectivamente) podem ser também usados. Um domínio CH1 pode ser também uma variante de um domínio CH1 do tipo selvagem, por exemplo, uma variante de um domínio CH1 de IgG1, IgG2, I9G3 ou IgG4 do tipo selvagem. Variantes exemplares de domínios CH1 incluem A114C, C1318S e/ou T173C. Um domínio CH1, por exemplo, um domínio CH1 de IgG2, pode compreender a substituição C131S, substituição que confere ao anticorpo IgG2 ou anticorpo tendo um CH1 de I9gG2 e dobra a forma (ou conformação) B.
[00166] Em certas modalidades, uma região constante de cadeia pesada modificada compreende um domínio CH1 que é do isotipo I9G2. Em certas modalidades, o domínio CH1 é domínio CH1 de 19G2 do tipo selvagem, por exemplo, tendo a sequência de aminoácido:
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT
SGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFEGTQATYTCNVDHKPSNTKV DKTV (SEQ ID Nº: 7). Em certas modalidades, o domínio CH1 é uma variante de SEQ ID Nº: 7 e compreende 1-10, 1-5, 1-2 ou 1 substituições ou deleções de aminoácido em relação à SEQ ID Nº: 7. Como descrito ainda nos Exemplos, foi mostrado aqui que um domínio CH1 de IgG2 ou variantes do mesmo conferem propriedades potencializadas a anticorpos em relação a anticorpos I9G1 e propriedades ainda mais potencializadas quando os anticorpos compreendem também uma dobra de IgG2. Em certas modalidades, variantes de CH1 de IgG2 não compreendem uma substituição ou seleção de aminoácido em um ou mais dos resíduos de aminoácido que segue: C131, R133, E137 e S138, resíduos de aminoácido que são mostrados em negrito e sublinhados na SEQ ID Nº: 7 mostrada acima. Por exemplo, uma região constante de cadeia pesada modificada pode compreender um domínio CH1 de IgG2 em que nenhum de R133, E137 e S138 é substituído com um outro aminoácido ou é deletado ou em que nenhum de C131, R133, El37 e S138 é substituído com um outro aminoácido ou deletado. Em certas modalidades, C131 é substituído com um outro aminoácido, por exemplo, C131S, cuja substituição dispara o anticorpo a adotar a conformação B. Anticorpos com ambas conformação A e conformação B tendo regiões constantes de cadeia pesada modificadas foram mostrados aqui ter atividades potencializadas em relação ao mesmo anticorpo com uma região constante de IgG1.
[00167] Em certas modalidades, N192 e/ou F193 (mostrados como resíduos em itálico e sublinhados na SEQ ID Nº: 7 mostrada acima) são substituídos com um outro aminoácido, por exemplo, com os aminoácidos correspondentes em IgG1, isto é, N1928S e/ou F193L.
[00168] Em certas modalidades, um ou mais resíduos de aminoácido de um domínio CH1 de IgG2 são substituídos com os resíduos de aminoácido correspondentes em IgG4. Por exemplo, N192 pode ser N192S; F193 pode ser F193L; C131 pode ser C131K; e/ou T214 pode ser T214R.
[00169] Um anticorpo pode compreender uma região constante de cadeia pesada modificada compreendendo um domínio CH1 de IgG2 ou variante do mesmo e dobra de IgG1 ou variante da mesma. À dobra e o domínio CH1 podem ser uma combinação de qualquer dobra de IgG2 e domínio CH1 de I|IgG2 descrito aqui. Em certas modalidades, o CH1 de IgG2 e a dobra compreendem a sequência de aminoácido que segue
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT
SGVHTFPAVLQOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKV DKTVERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID Nº: 133) ou uma sequência de aminoácido que difere da mesma em no máximo 1-10 aminoácidos. As variantes de aminoácido são descritas para a dobra e domínios CH1 acima.
[00170] Em certas modalidades, anticorpos compreendem pelo menos uma dobra de IgG2 e opcionalmente também um domínio CH1 de IgG2 ou fragmento ou derivado da dobra e/ou do domínio CH1 e o anticorpo adotou a forma (ou conformação) A (vide, por exemplo, Allen et al. (2009) Biochemistry 48:3755) Em certas modalidades, anticorpos compreendem pelo menos uma dobra de 1I9gG2, e opcionalmente também um domínio CH1 de IgG2 ou fragmento ou derivado da dobra e/ou domínio CH1 e o anticorpo adotou a forma B (vide, por exemplo, Allen e outros (2009) Biochemistry 48:3755).
[00171] Em certas modalidades, uma região constante de cadeia pesada modificada compreende um domínio CH2 que é um domínio CH2 do tipo selvagem do isotipo I9G1, IgG2, IgG3 ou IgG4 ("domínio CH2 de IgG1", "domínio CH2 de I9G2", "domínio CH2 de IgG3" ou "domínio CH2 de IgG4", respectivamente. Um domínio CH2 pode ser também uma variante de um domínio CH2 do tipo selvagem, por exemplo, uma variante de um domínio CH2 de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 do tipo selvagem. Variantes exemplares de domínios CH2 incluem variantes que modulam uma atividade biológica da região Fc de um anticorpo, tal como ADCC ou CDC, ou modulam a meia-vida do anticorpo ou sua estabilidade. Em uma modalidade, o domínio CH2 é um domínio CH2 de IgG1 humana com uma mutação A330S e/ou P331S, em que o domínio CH2 tem função efetora reduzida em relação à mesma mutação de CH2 sem as mutações. Um domínio CH2 pode ter função efetora potencializada. Domínios CH2 podem compreender uma ou mais das mutações que seguem: SE (S267E), SELF (S267E/L328F) SDIE (S239D/I332E) SEFF, GASDALIE (G236A/S239D/A330L/1332E) e/ou uma ou mais mutações nos aminoácidos que seguem: E233, L235, G237, P238, H268, P271, L328, A330 e K322. Notar que algumas dessas mutações são realmente parte da dobra, ao invés do domínio CH2 como aqui definido. Outras mutações são mostradas mais aqui em outro ponto.
[00172] Em certas modalidades, uma região constante de cadeia pesada modificada compreende um domínio CH3 que é um domínio CH3 do tipo selvagem do isotipo I9G1, I9G2, IgG3 ou I9G4 ("domínio
CH3 de IgG1", "domínio CH3 de I9G2", "domínio CH3 de IgG3" ou "domínio CH3 de Ig9G4", respectivamente. Um domínio CH3 pode ser também uma variante de um domínio CH3 do tipo selvagem, por exemplo, uma variante de um domínio CH3 de I9G1, IgG2, I9G3 ou I9G4 do tipo selvagem. Variantes exemplares de domínios CH3 incluem variantes que modulam a atividade biológica da região Fc de um anticorpo, tal como ADCC ou CDC, ou modulam a meia-vida do anticorpo ou sua estabilidade.
[00173] Em bdgeral, variantes dos domínios CH1, dobra, CH2 ou CH3 podem compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais mutações e/ou no máximo 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 mutações ou 1-10 ou 1-5 mutações ou compreendem uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica àquela do domínio do tipo selvagem correspondente (domínio CH1, dobra, CH2, CH3, respectivamente), contanto que a região constante de cadeia pesada compreendendo a variante específica retenha a atividade biológica necessária.
[00174] A Tabela 5 mostra regiões constantes de cadeia pesada humanas exemplares compreendendo domínios CH1, dobra, CH2 e/ou CH3 humanos, em que cada domínio é ou um domínio do tipo selvagem ou uma variante do mesmo que provê a atividade biológica desejada à região constante de cadeia pesada. Uma célula não preenchida na Tabela 5 indica que o domínio está presente ou não, e se presente pode ser de qualquer isotipo, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Por exemplo, um anticorpo compreendendo a região constante de cadeia pesada 1 na Tabela 5 é um anticorpo que compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo pelo menos uma dobra de IgG2, e que pode também compreender um domínio de CH1, CH2 e/ou CH3, e se presente, que domínio CH1, CH2 e/ou CH3 seja de um isotipo I9G1, IgG2, I9gG3 ou IgG4. Como um outro exemplo para compreensão da Tabela 5, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada 8 é um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada compreendendo um domínio CH1 de IgG2, uma dobra de I9gG2, um domínio de CH2 de IgG1 e que pode ou não também compreender um domínio CH3, que está presente, pode ser de um isotipo IgG1, IgG2, IgG3 ou Ig9G4. Tabela 5 fuecer Jem oe em es Po e TA 2 er we — q [Eee ge ===" E e e Bee we E e Te Po e eg [Eee e ge er e e — e e we e e e =" E e e E e e “o E e ge 1" a e gg Eee e er Fe TE Te Ee Ee e PO e e Te *Região constante de cadeia pesada modificada
[00175] Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada como mostrado na Tabela 5 tem uma atividade biológica aumentada em relação ao mesmo anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada que não compreende a região constante de cadeia pesada específica ou em relação ao mesmo anticorpo que compreende uma região constante de I9G1.
[00176] Em certas modalidades, um método para melhoria da atividade biológica de um anticorpo que compreende uma dobra não IgG1 e/ou domínio CH1 não IgG2 compreende provisão de um anticorpo que compreende uma dobra não IgG2 e/ou um domínio CH1 não I|gG2 e substituição da dobra não IgG2 e do domínio CH1 não IgG2 com uma dobra de IgG2 e um domínio CH1 de 1IgG2, respectivamente. Um método para melhoria da atividade biológica de um anticorpo que não compreende uma região constante de cadeia pesada modificada pode compreender provisão de um anticorpo que não compreende uma região constante de cadeia pesada modificada e substituição de sua região constante de cadeia pesada com uma região constante de cadeia pesada modificada.
[00177] Regiões constantes de cadeia pesada modificadas exemplares são providas na Tabela 6, que mostra a identidade de cada um dos domínios.
Tabela 6 Região constante de | CH1 Dobra cH2 cH3 SEQID NO cadeia pesada de MHCCR modificada inteiro IgG1-Ig62-1961 1961 tipo IgG62/1961 1961 tipo 1gG1 tipo SEQID selvagem SEQ ID Nº-22 selvagem selvagem Nº:26 SEQ ID Nº:2 SEQID Nº4 SEQ1D Nº:5 IgG1-lg62-I9612 1961 tipo 1gG2 tipo selvagem 1961 tipo 1gG1 tipo SEQ ID selvagem SEQ ID Nº:8 selvagem selvagem Nº27 SEQ ID Nº:2 SEQ ID Nº4 SEQ ID Nº:5 IgG1-l962CS-I9G1 1gG1 tipo Ig62C2198/19G1 19G1 tipo 1961 tipo SEQID ºo. selvagem SEQ ID Nº:23 selvagem selvagem Nº:32 SEQ ID Nº:2 SEQ ID Nº4 SEQ1D Nº:5 IgG1-l9G2CS-l9612 | 1961 tipo 1962 C2198 1961 tipo 1961 tipo SEQ ID ºo. selvagem SEQ ID Nº-21 selvagem selvagem Nº33 SEQ ID Nº:2 SEQ ID Nº4 SEQ1D Nº:5 1962-1961 1962 tipo 1962/1961 19G1 tipo 1gG1 tipo SEQID " selvagem SEQ ID Nº:22 selvagem selvagem Nº:28 SEQ ID Nº:7 SEQ ID Nº:4 SEQ ID Nº:5 1962-9612 1962 tipo 1gG2 tipo selvagem 19G1 tipo 1gG1 tipo SEQID " selvagem SEQ ID Nº:8 selvagem selvagem Nº:29 SEQ ID Nº:7 SEQ ID Nº4 SEQ1D Nº:5 Ig62CS-IgG61 1962 tipo Ig6202198/1961 1961 tipo 1961 tipo SEQ ID " selvagem SEQ ID Nº-23 selvagem selvagem Nº:34 SEQ ID Nº:7 SEQ ID Nº:4 SEQ ID Nº:5 Ig62CS-Ig612 1962 tipo 962 C2198 1961 tipo 1961 tipo SEQ ID " selvagem SEQ ID Nº-21 selvagem selvagem Nº:35 SEQ ID Nº:7 SEQ ID Nº:4 SEQ ID Nº:5 IgG1CH1-lgG2Dobra- | Ig9G1 tipo 1gG2 tipo selvagem 1961 1gG1 tipo SEQID IgG1CH2 (A330S, selvagem o. A330S/P331S selvagem Nº:30 P3318)-IgG1CH3 SEQ ID Nº:8 SEQ ID Nº:2 SEQ ID Nº:24 SEQ1D Nº:5 ou IgG1-Ig962-1961.1 IgG1CH1- 1961 tipo 1962 C2198 1961 1961 tipo SEQID IgG2Dobra(C219S)- selvagem SEQ ID Nº-21 A330S/P331S selvagem Nº:36 IgG1CH2(A330S, SEQ ID Nº24 P3318)-IgG1CH3 9/0 Nº: ou I961-1962CS- SEQ ID Nº:2 SEQ1D Nº:5
961.1 1962-1961.1 1gG2 tipo 1gG2 tipo selvagem 1961 1961 tipo SEQID " selvagem SEQ ID Nº:8 A330S/P331S selvagem Nº31 SEQ ID Nº:7 SEQ ID Nº:24 SEQ1D Nº:5 IgG2CS-I9G1.1 1gG2 tipo 1962 02198 161 1gG1 tipo SEQID selvagem SEQ ID Nº-21 A330S/P331S selvagem Nº37 SEQ ID Nº:7 SEQ ID Nº:24 SEQ ID Nº:5
[00178] 'de IgG2 compreendendo uma sequência de aminoácido que (i) difere de qualquer uma de SEQ ID Nº: 8, 21, 22, 23, 126-132, 134-136 e 137 em 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições, adições ou deleções de aminoácido; (ii) difere de qualquer uma de SEQ ID Nº: 8, 21, 22, 23, 126-132, 134-136 e 137 em no máximo 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições, adições ou deleções de aminoácido; (iii) difere de qualquer uma de SEQ ID Nº: 8, 21, 22, 23, 126-132, 134-136 e 137 em 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 ou 3-5 substituições, adições ou deleções de aminoácido e/ou (iv) compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a qualquer uma de SEQ ID Nº: 8, 21, 22, 23, 126-132, 134-136 ou 137, em que em qualquer uma de (i)-(iv), uma substituição de aminoácido pode ser uma substituição de aminoácido conservativa ou uma substituição de aminoácido não conservativa; e em que a região constante de cadeia pesada modificada tem uma atividade biológica potencializada em relação àquela de uma outra região constante de cadeia pesada, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada que compreende uma dobra não IgG2 ou em relação à mesma região constante de cadeia pesada modificada que compreende uma dobra não I|gG2.
[00179] Em certas modalidades, uma dobra compreende uma sequência que é uma variante de qualquer uma de SEQ ID Nº: 8, 21, 22, 23, 126-132, 134-136 e 137, em que R217 (segundo aminoácido na dobra de IgG2 do tipo selvagem (SEQ ID Nº: 8) não é deletado ou substituído com um outro aminoácido. Em certas modalidades em que uma dobra é uma variante de qualquer uma de SEQ ID Nº: 8, 21, 22, 23, 126-132, 134-136 e 137, a dobra tem uma rigidez que é similar àquela de uma |gG2 do tipo selvagem.
[00180] Em certas modalidades, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada modificada compreendendo um domínio CH1 de IgG1 compreendendo SEQ ID Nº: 2 ou um domínio CH1 de IgG2 compreendendo SEQ ID Nº: 7, ou uma variante de SEQ ID Nº: 2 ou 7, variante que (i) difere de SEQ ID Nº: 20u7 em 1,2,3,4 ou 5 substituições, adições ou deleções de aminoácido; (ii) difere de SEQ ID Nº: 2 ou 7 em no máximo 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições, adições ou deleções de aminoácido; (iii) difere de SEQ ID Nº: 2 ou 7 em 1-5, 1- 3, 1-2, 2-5 ou 3-5 substituições, adições ou deleções de aminoácido e/ou (iv) compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID Nº: 2 ou 7, em que em qualquer um de (i)-(iv), uma substituição de aminoácido pode ser uma substituição de aminoácido conservativa ou uma substituição de aminoácido não conservativa; e em que a região constante de cadeia pesada modificada tem uma atividade biológica potencializada em relação àquela de uma outra região constante de cadeia pesada, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada que compreende uma dobra não IgG2 ou em relação à mesma região constante de cadeia pesada modificada que compreende uma dobra não IgG2.
[00181] Em certas modalidades, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada modificada compreendendo um domínio CH2 de IgG1 compreendendo SEQ ID Nº: 4 ou 24, ou uma variante de SEQ ID NO; 4 ou 24, variante que (i) difere de SEQ ID Nº: 4 ou 24 em 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições, adições ou deleções de aminoácido; (ii) difere de SEQ ID Nº: 4 ou 24 em no máximo 5,4,3,2 ou 1 substituições, adições ou deleções de aminoácido; (iii) difere de SEQ ID Nº: 4 ou 24 em 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 ou 3-5 substituições, adições ou deleções de aminoácido e/ou (iv) compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID Nº: 4 ou 24, em que em qualquer um de (i)-(iv), uma substituição de aminoácido pode ser uma substituição de aminoácido conservativa ou uma substituição de aminoácido não conservativa; e em que a região constante de cadeia pesada modificada tem uma atividade biológica potencializada em relação àquela de uma outra região constante de cadeia pesada, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada que compreende uma dobra não IgG2 ou relação à mesma região constante de cadeia pesada modificada que compreende uma dobra não IgG2.
[00182] Em certas modalidades, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada modificada compreendendo um domínio CH3 de IgG1 compreendendo SEQ ID Nº: 5 ou uma variante de SEQ ID Nº: 5, variante que (i) difere da SEQ ID Nº: 5 em 1,2,3,4 ou 5 substituições, adições ou deleções de aminoácido; (ii) difere de SEQ ID Nº: 5 em no máximo 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições, adições ou deleções de aminoácido; (ili) difere de SEQ ID Nº: 5 em 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 ou 3-5 substituições, adições ou deleções de aminoácido e/ou (iv) compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID Nº: 5, em que em qualquer um de (i)-(iv), uma substituição de aminoácido pode ser uma substituição de aminoácido conservativa ou uma substituição de aminoácido não conservativa; e em que a região constante de cadeia pesada modificada tem uma atividade biológica potencializada em relação àquela de uma outra região constante de cadeia pesada, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada que compreende uma dobra não IgG2 ou em relação à mesma região constante de cadeia pesada modificada que compreende uma dobra não IgG2.
[00183] Regiões constantes de cadeia pesada modificadas podem também compreender uma combinação dos domínios CH1, dobra, CH2 e CH3 descritos acima.
[00184] Em certas modalidades, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada modificada descrita aqui ou uma variante de uma região constante de cadeia pesada modificada descrita aqui, variante que (i) difere de uma região constante de cadeia pesada modificada descrita aqui em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácido; (ii) difere de uma região constante de cadeia pesada modificada descrita aqui em no máximo 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições, adições ou deleções de aminoácido; (iii) difere de uma região constante de cadeia pesada modificada descrita aqui em 1-5, 1-3, 1-2, 2-5, 3-5, 1-10 ou 5- substituições, adições ou deleções de aminoácido e/ou (iv) compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma região constante de cadeia pesada modificada descrita aqui, em que em qualquer um de (i)-(iv), uma substituição de aminoácido pode ser uma substituição de aminoácido conservativa ou uma substituição de aminoácido não conservativa; e em que a região constante de cadeia pesada não modificada tem uma atividade biológica potencializada em relação àquela de uma outra região constante de cadeia pesada, por exemplo, região constante de cadeia pesada que compreende uma dobra não IgG2 ou relativa à mesma região constante de cadeia pesada modificada que compreende uma dobra não I|gG2.
[00185] Em certas modalidades, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada modificada compreendendo qualquer uma de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262 ou variante de qualquer uma de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262, variante que (i) difere de qualquer uma de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262 em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições,
adições, ou deleções de aminoácidos; (ii) de qualquer uma de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262 em no máximo 10, 9, 8, 7, 6,5, 4, 3, 2 ou 1 substituições, adições ou deleções de aminoácido; (iii) difere de qualquer uma de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262 em 1-5, 1-3, 1-2, 2-5, 3-5, 1-10 ou 5-10 amino substituições, adições ou deleções de aminoácido e/ou (iv) compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a qualquer uma de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234- 245 e 247-262, em que em qualquer um de (i)-(iv), uma substituição de aminoácido pode ser uma substituição de aminoácido conservativa ou uma substituição de aminoácido não conservativa; e em que a região constante de cadeia pesada modificada tem uma atividade biológica potencializada (e/ou função efetora reduzida) em relação àquela de uma outra região constante de cadeia pesada, por exemplo, uma região constante de cadeia pesada que compreende uma dobra não IgG2 ou em relação à mesma região constante de cadeia pesada modificada que compreende uma dobra não IgG2.
[00186] Regiões constantes de cadeia pesada modificadas podem ter (i) função efetora similar, reduzida ou aumentada (por exemplo, ligação a um FceyR) em relação a uma região constante de cadeia pesada do tipo selvagem e ou (ii) meia-vida similar, reduzida ou aumentada (ou ligação ao receptor FCRn) em relação a uma região constante de cadeia pesada do tipo selvagem.
[00187] Em certas modalidades, um anticorpo (ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo) compreende uma região constante de cadeia pesada modificada compreendendo SEQ ID Nº: 198 ou uma porção da mesma compreendendo P238K, ou uma variante de qualquer uma de SEQ ID Nº: 198 ou porção da mesma, variante que (i) difere de SEQ ID Nº: 198 ou uma porção da mesma compreendendo P238K em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais substituições, adições ou deleções de aminoácido; (ii) difere de SEQ ID Nº: 198 ou uma porção da mesma compreendendo P238K em no máximo 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições, adições ou deleções de aminoácido; (iii) difere de SEQ ID Nº: 198 ou uma porção da mesma compreendendo P238K em 1-5, 1-3, 1-2, 2-5, 3-5, 1-10 ou 5-10 substituições, adições ou deleções de aminoácido e/ou (iv) compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica à SEQ ID Nº: 198 ou porção da mesma compreendendo P238K, em que a substituição de aminoácido pode ser uma substituição de aminoácido conservativa ou uma substituição de aminoácido não conservativa; e em que a região constante de cadeia pesada modificada tem função efetora reduzida, por exemplo, ligação não detectável ao FeVRs de baixa afinidade (por exemplo, CD32a, CD32b e CD16a) e opcionalmente ligação não detectável ao FCvR de alta afinidade (CD64), tal como determinado em um ensaio descrito aqui.
[00188] Em certas modalidades, um Fc IgG1 compreendendo uma mutação P238K (por exemplo, compreendendo SEQ ID Nº: 198 ou uma porção da mesma) não compreende quaisquer outras mutações em relação a um Fc IgG1 do tipo selvagem, por exemplo, aquelas descritas aqui. Em certas modalidades, um Fc IgG1 compreendendo uma mutação P238K (por exemplo, compreendendo SEQ ID Nº: 198 ou uma porção da mesma) compreende 1-5 mudanças de aminoácido em adição a P238K em relação ao Fc IgG1 humana do tipo selvagem, por exemplo, ele compreende SEQ ID Nº: 198 ou uma porção da mesma e 1-5 mudanças de aminoácido em relação à SEQ ID Nº: 198 ou a porção da mesma, contanto que o Fc IgG1 tenha função efetora reduzida.
[00189] Em certas modalidades, um Fc IGG1 compreendendo uma mutação P238K não compreende qualquer outra mutação que reduza a função efetora. Em certas modalidades, um Fc IgG1 compreendendo uma mutação P238K compreende 1-5 mutações que reduzem a função efetora.
[00190] Em certas modalidades, um Fc IgG compreendendo uma mutação P238K também compreende uma mutação L235E e/ou uma mutação K322A e pode, em certas modalidades, não conter nenhuma mutação de Fc adicional que module a função efetora de Fc, por exemplo, ele não inclui uma mutação em P330, P331 ou uma mutação da dobra inferior, por exemplo, nos aminoácidos 234 e 236-237. O IgG pode ser um IgG1 ou IgG2.
[00191] Em certas modalidades, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo um domínio constante de IgG2, ou pelo menos a dobra do mesmo, em que o domínio constante de I9gG2 ou dobra do mesmo compreende uma mutação selecionada do grupo consistindo em P238A, P238K, L235A, K322A, e opcionalmente uma mutação em C219 e/ou C220, por exemplo, C2198S e/ou C220S.
[00192] Em certas modalidades, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo um domínio constante de IgG1 compreendendo uma ou mais de L234A, L235E e G237A. Como aqui usado, "IgG1.3" se refere a uma cadeia pesada de IgG1 compreendendo L234A, L235E e G237A (vide, por exemplo, SEQ ID Nº: 248). Regiões constantes de IgG1 compreendendo essas três mutações podem compreender também mutações adicionais, tais como aquelas descritas aqui. Sequências exemplares compreendendo mutações L234A, L235E e G237A e mutações adicionais são providas aqui na Tabela de Sequências. Um IgG1.3 Fc provê um anticorpo com função efetora significantemente reduzida, tal como ADCC ou CDC. Em certas modalidades, um Fc compreende a mutação de IgG1.3 e mutações adicionais, por exemplo, P238K.
[00193] Em certas modalidades, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada de IgG1.3, região constante que não compreende qualquer outra mutação que module função efetora, em adição a L234A, L235E e G237A. Em certas modalidades, um anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada de I9gG1.3, região constante que não compreende qualquer outra mutação, em adição a L234A, L235E e G237A.
[00194] Regiões constantes de cadeia pesada são providas na Tabela de Sequências. Em certas modalidades, um anticorpo compreende uma das regiões constantes de cadeia pesada mostradas na Tabela, em que a região constante não compreende nenhuma mutação em adição àquela na sequência mostrada na Tabela. Em certas modalidades, um anticorpo compreende uma das regiões constantes de cadeia pesada mostradas na Tabela, em que a região constante (i) difere de uma sequência na Tabela de Sequências em 1, 2, 3, 4 ou 5 substituições, adições ou deleções de aminoácido; (ii) difere de uma sequência na Tabela de Sequências em no máximo 5, 4, 3, 2 ou 1 substituições, adições ou deleções de aminoácido; (iii) difere de uma sequência na Tabela de Sequências em 1-5, 1-3, 1-2, 2-5 ou 3-5 substituições, adições ou deleções de aminoácido e/ou (iv) compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntica a uma sequência na Tabela de Sequências, em que em qualquer um de (i)-(iv), uma substituição de aminoácido pode ser uma substituição de aminoácido conservativa ou uma substituição de aminoácido não conservativa; e em que a atividade biológica da região constante não é significantemente mudada por essa(s) mutação(ões).
[00195] Regiões constantes de cadeia pesada podem compreender uma combinação de mutações que confere a um anticorpo compreendendo a região de cadeia pesada uma combinação das atividades biológicas conferidas por cada mutação individual. Por exemplo, uma ou mais mutação que potencializem formação de atividade agonista de complexos de superfície celular grandes ou que potencializem internalização do anticorpo podem ser combinadas com uma ou mais mutações que modulem a função efetora. Sequências de cadeia constantes exemplares compreendendo uma combinação de mutações conferindo funções biológicas diferentes são mostradas na Tabela de Sequências. Il. Anticorpos com regiões constantes de cadeia pesada modificadas e seus antígenos-alvo
[00196] Regiões constantes de cadeia pesada modificadas podem ser usadas em uma ampla faixa de anticorpos, tais como anticorpos que requerem internalização (por exemplo, conjugados de anticorpo fármaco (ADCs) e anticorpos anti-CD73), atividade agonista (por exemplo, anticorpos que são efetivos em modulação de respostas imunes, por exemplo, em estimulação de ativação de célula T, tais como anticorpos anti-GITR agonistas), atividade antagonista (por exemplo, anticorpos que inibem ou bloqueiam uma proteína que inibe uma resposta imune, por exemplo, ativação de células T, tal como um anticorpo para PD-1 antagonista), função efetora, por exemplo, ADCC e CDC, ou função efetora reduzida, transdução de sinal ou atividade antitumor. Por exemplo, internalização de um receptor inibidor de superfície celular pode limitar sua habilidade em interagir com seu(s) receptor(es) e diminuir função(ões) celular(es).
[00197] Em uma modalidade, anticorpos compreendendo um domínio constante de cadeia pesada modificado são anticorpos que requerem sua internalização para atividade (por exemplo, anticorpos que são específicos para receptores de superfície celular) através de,
por exemplo, indução de endocitose mediada por receptor quando eles se ligam à superfície celular. Tais anticorpos podem ser usados como veículos para administração direcionada de fármaco, toxinas, enzimas ou DNA para aplicações terapêuticas. Desta maneira, aumento das propriedades de internalização desses anticorpos é desejável. Anticorpos exemplares que podem se beneficiar de internalização eficaz são conjugados de anticorpo fármaco. Vários ensaios para medição das propriedades de internalização de um anticorpo são conhecidos na técnica e descritos aqui. Esses ensaios utilizam, por exemplo, uma ampla gama de corantes para marcação de anticorpo que podem ser usados em ensaios à base de lavagem ou extinção para monitorar internalização. Internalização de anticorpo pode ser também monitorada em ensaios sem lavagem que se baseiam em marcadores fluorescentes.
[00198] Em uma modalidade, anticorpos compreendendo um domínio constante de cadeia pesada modificado são anticorpos que requerem a internalização do antígeno ao qual eles se ligam, por exemplo, uma molécula de superfície celular, tal como um receptor ou um ligante, para atividade. Desta maneira, anticorpos para as proteínas de superfície celular que necessitam ser sub-reguladas para atividade biológica (por exemplo, terapêutica) podem usar uma região constante de cadeia pesada modificada descrita aqui.
[00199] Em certas modalidades, anticorpos compreendendo um domínio constante de cadeia pesada modificado se ligam a moléculas de superfície celular e agonizam ou antagonizam a atividade biológica da molécula de superfície celular, por exemplo, uma molécula de superfície celular em uma célula imune, por exemplo, uma célula T, célula Teff, célula Th1, célula Th2, célula T CD4+, célula T CD8+, célula Treg, célula dendrítica, macrófago, monócito, célula de Langerhans, célula NK, célula supressora derivada de mieloide, célula
B ou qualquer outra célula imune. A molécula de superfície celular pode ser uma molécula estimuladora, por exemplo, coestimuladora (por exemplo, GITR, OX40, CD137, CDA40, ICOS e outros membros da família TNFR), e o anticorpo pode estimular ainda a atividade (um anticorpo agonista) ou o anticorpo pode inibir a atividade (um anticorpo antagonista). A molécula de superfície celular pode ser uma molécula inibidora (por exemplo, CTLA-4, PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3) e o anticorpo pode estimular ainda a atividade (um anticorpo agonista) ou o anticorpo pode inibir a atividade (um anticorpo antagonista).
[00200] Em certas modalidades, anticorpos compreendendo um domínio constante de cadeia pesada modificado são anticorpos agonistas de moléculas estimuladoras (ou coestimuladoras) que, por exemplo, reforçam o sistema imune de um indivíduo, por exemplo, através da indução de secreção de IL-2 e/ou IFN-y a partir de células T (por exemplo, anticorpos anti-GITR). Outros anticorpos agonistas foram mostrados ativar APCs, promotor respostas de célula T antitumor e/ou promover células mieloides citotóxicas com o potencial de controlar câncer na ausência de imunidade de célula T. Anticorpos agonistas de moléculas estimuladoras são diferentes de anticorpos antagonistas de moléculas inibidoras, que bloqueiam ponto de checagem imune negativo tal como anti-CTLA-4 ou anti-PD-1. Atividade agonista, tal como proliferação de células T, pode ser medida usando uma variedade de métodos conhecidos na técnica.
[00201] Em certas modalidades, anticorpos compreendendo um domínio constante de cadeia pesada modificado são anticorpos antagonistas de inibidores de ponto de checagem que reforçam a resposta imune de um indivíduo ao bloquear ou inibir ponto de checagem negativo, tais como anticorpos anti-CTLA-4 ou anti-PD-1, por exemplo, ao se direcionarem ao receptor inibidor expresso em células T ativadas. Atividade antagonista, tal como inibição de proliferação de células T, pode ser medida usando uma variedade de métodos conhecidos na técnica.
[00202] Em uma modalidade, o anticorpo é (i) um agonista de um receptor coestimulador ou (ii) um antagonista de um sinal inibidor em, por exemplo, células T, ambos podem resultar em amplificação de respostas imunes, por exemplo, respostas de célula T específicas de antígeno (reguladores de ponto de checagem imune). Em certas modalidades, um anticorpo é (i) um antagonista de um receptor coestimulador ou (ii) um agonista de um sinal inibidor, por exemplo, em células T. Moléculas coestimuladoras e coinibidoras podem ser membros da superfamília de imunoglobulina (I9SF), e anticorpos tendo regiões constantes de cadeia pesada modificadas podem se ligar a qualquer um deles. Uma família importante de ligantes ligados à membrana que se ligam a receptores coestimuladores ou coinibidores é a família B7, que inclui B7-1, B7-2, B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2 (ICOS-L), B7-H3, B7-H4, B7-H5 (VISTA) e B7-H6, e anticorpos tendo regiões constantes de cadeia pesada modificadas podem se ligar a qualquer um deles. Uma outra família de ligantes ligados à membrana que se ligam a receptores coestimuladores ou coinibidores é a família TNF de moléculas que se ligam a membros da família de receptor TNF cognato (TNFR), que incluem CD40 e CD40L, OX-40, OX-40L, CD70, CD27L, CD30, CD30L, 4-1BBL, CD137, TRAIL/Apo2- L, TRAILRI/DR4, TRAILR2/DR5, TRAILR3, TRAILR4, OPG, RANK, RANKL, TWEAKR/Fn14, TWEAK, BAFFR, EDAR, XEDAR, TACI, APRIL, BCMA, LTBR, LIGHT, DcR3, HVEM, VEGI/TLIA, TRAMP/DR3, EDAR, EDA1, XEDAR, EDA2, TNFR1, Linfotoxina a/TNFB, TNFR?2, TNFa, LTa, LTB, LTBR, Linfotoxina a 182, FAS, FASL (CD178), DR3 (TNFRSF25), RELT, DR6, TROY, NGFR (vide, por exemplo, Tansey (2009) Drug Discovery Today 00:1). Desta maneira, os anticorpos descritos aqui podem se ligar a qualquer uma dessas moléculas de superfície, e eles podem ser, por exemplo, (i) agonistas ou antagonistas (ou inibidores de agentes de bloqueio) de proteínas da família IISF ou família B7 ou da família TNFR que inibem ativação de célula T ou antagonistas de citocinas que inibem ativação de célula T (por exemplo, IL-6, IL-10, TFG-B, VEGF; "citocinas imunossupressoras") e/ou (ii) agonistas ou antagonistas de receptores estimuladores da família I9SF, família B7 ou a família TNF ou de citocinas que estimulam ativação de célula T, para modulagem, por exemplo, estimulação, de uma resposta imune, por exemplo, para tratamento de doenças proliferativas, tal como câncer.
[00203] Portanto, um anticorpo com um domínio constante de cadeia pesada modificado pode ser usado como um dos agentes que seguem: um agonista de uma proteína que estimula, por exemplo, ativação de célula T, tal como B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB (CD137), 4- 1BBL, GITR, ICOS, ICOS-L, OX40, OX40L, CD70, CD27, CD40, DR3 ou CD28H; ou um antagonista (inibidor ou agente de bloqueio) de uma proteína que inibe ativação de células T (por exemplo, inibidores de ponto de checagem imune), tais como CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2 e LAG-3, como descrito acima, e qualquer uma das proteínas que seguem: TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, CD73, PD1H, LAIR1, TIM-1 ,TIM-4, CD39.
[00204] Outros anticorpos incluem antagonistas de receptores inibidores em células NK e agonistas de receptores de ativação em células NK, por exemplo, KIR, TIGIT, NKG2A.
[00205] Em geral, anticorpos que podem se beneficiar de uma região constante de cadeia pesada modificada incluem, por exemplo, anticorpos agonistas que se ligam receptores coestimuladores positivos, bloqueando anticorpos que atenuam sinalização através de receptores inibidores, anticorpos antagonistas e anticorpos que aumentam sistemicamente a frequência de células T antitumor, anticorpos que superam vias supressivas imunes distintas dentro do microambiente do tumor (por exemplo, engajamento de receptor inibidor de bloqueio (por exemplo, interações PD-L1/PD-1), depletam ou inibem Tregs (por exemplo, um anticorpo monoclional anti-CD25, inibem enzimas metabólicas tal como IDO, ou revertem/previnem anergia ou exaustão de célula T) e anticorpos que disparam ativação imune inata e/ou inflamação em sítios de tumor. Uma internalização aumentada de receptores inibidores pode se traduzir em um nível menor de um inibidor potencial.
[00206] Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada é um anticorpo que é conjugado a um agente terapêutico para formar um imunoconjugado, tal como um conjugado de anticorpo fármaco (ADC), imunoconjugado que requer internalização para sua atividade. Em um ADC, o anticorpo funciona como um agente de direcionamento para direcionamento do ADC a uma célula-alvo expressando seu antígeno, tal como um antígeno em uma célula de câncer. Neste caso, o antígeno pode ser um antígeno associado a tumor, isto é, um que é unicamente expresso ou superexpresso pela célula de câncer. Uma vez lá, o fármaco é liberado, ou dentro da célula-alvo ou na sua vizinhança, para agir como um agente terapêutico. Para uma revisão do mecanismo de ação e uso de ADCs em terapia de câncer vide Schrama e outros, Nature Rev. Drug Disc. 2006, 5, 147.
[00207] Para tratamento de câncer, o agente ou fármaco terapêutico de um ADC é preferivelmente um fármaco citotóxico que causa morte da célula de câncer-alvo. Fármacos citotóxicos que podem ser usados em ADCs incluem os tipos de compostos que seguem e seus análogos e derivados: enodiinas tais como calicheamicina (vide, por exemplo, Lee e outros, J. Am. Chem. Soc. 1987, 109, 3464 e3466) e uncialamicina (vide, por exemplo, Davies e outros, WO 2007/038868 A2 (2007) e Chowdari e outros, US 8,709,431 B2 (2012)); tubulisinas (vide, por exemplo, Domling e outros, US 7,778,814 B2 (2010); Cheng e outros, US 8.394.922 B2 (2013); e Cong e outros, US 2014/0227295 A1; CC-1065 e duocarmicina (vide, por exemplo, Boger, US
6.5458.530 B1 (2003); Sufi e outros, US 8,461,117 B2 (2013); e Zhang e outros, US 2012/0301490 A1 (2012)); epotilonas (vide, por exemplo, Vite e outros, US 2007/0275904 A1 (2007) e US RE42930 E (2011)); auristatinas (vide, por exemplo, Senter e outros, US
6.844.869 B2 (2005) e Doronina e outros, US 7.498.298 B2 (2009)); dímeros de pirrolbenzodiazepina (PBD) (vide, por exemplo, Howard e outros, US 2013/0059800 A1(2013); US 2013/0028919 A1 (2013); e WO 2013/041606 A1 (2013)); e maitansinoides tais como DM1 e DMA4 (vide, por exemplo, Chari e outros, US 5.208.020 (1993) e Amphlett e outros, US
7.374.762 B2 (2008)).
[00208] Em ADCs, o anticorpo e agente terapêutico podem ser conjugados através de um ligante, por exemplo, um ligante clivável, tal como um ligante peptidila, dissulfeto ou hidrazona. Por exemplo, o ligante pode ser um ligante peptidila tal como Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala- Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val, Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Ala-Ala- Asn, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, ou Glu. Os ADCs podem ser preparados como descrito nas Pat. U.S. Nos. 7.087.600; 6.989.452; e
7.129.261; Publicações PCT WO 02/096910; WO 07/038658; WO 07/051081; WO 07/059404; WO 08/083312; e WO 08/103693;
Publicações de Patente U.S. 20060024317; 20060004081; e 20060247295; cujas descrições são aqui incorporadas a título de referência.
[00209] —Alvos exemplares de ADCs que podem ser potencializados com uma região constante de cadeia pesada modificada incluem B7H4 (Korman e outros, US 2009/0074660 A1); CD19 (Rao-Naik e outros, 8,097,703 B2); CD22 (King e outros, US 2010/0143368 A1); CD30 (Keler e outros, US 7.387.776 B2 (2008); CD70 (Terrett e outros, US
8.124.738 B2); CTLA-4 (Korman e outros, US 6.984.720 B1 (2006)); PD-1 (Korman e outros, US 8.008.449 B2 (2011); PSMA (Huang e outros, US 2009/0297438 A1 e Cardarelli e outros, US 7.875.278 B2); PTK7 (Terrett e outros, US 2010/0034826 A1); glipicano-3 (Terrett e outros, US 2010/0209432 (A1)); RG1 (Harkins e outros, US 7,335,748 B2(2008)); mesotelina (Terrett e outros, US 8,268,970 B2 (2012)); e CD44 (Xu e outros, US 2010/0092484 A1).
[00210] Os domínios constantes de cadeia pesada modificados podem ser também parte de anticorpos para usos fora de oncologia, por exemplo, doenças imunológicas, tais como artrite reumatoide, lúpus, etc.
[00211] Os domínios constantes de cadeia pesada modificados podem ser também fundidos a moléculas não anticorpo (ou variantes de anticorpo) ou fragmentos dos mesmos, e podem ser fundidos a qualquer polipeptídeo que necessite a presença de um Fc. Um domínio constante de cadeia pesada modificado pode ser fundido a um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo, como definido mais aqui (por exemplo, na seção de definição).
[00212] Em certas modalidades, um domínio constante de cadeia pesada ou porção do mesmo compreendendo uma mutação P238K, que é destituído de certa função efetora, é fundido a um polipeptídeo, por exemplo, a porção de cadeia pesada de um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo. Como descrito adicionalmente aqui, um Fc de IgG, por exemplo, IgG1, compreendendo uma mutação P238K e compreendendo, por exemplo, a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID Nº: 198, pode ser fundido a um domínio variável de cadeia pesada de um anticorpo, em que o anticorpo se liga a qualquer alvo, por exemplo, uma proteína-alvo descrita aqui (por exemplo, CD40 ou CDA40L). Um Fc de IgG com uma mutação P238K (por exemplo, fa I9gG1 P238K tendo a sequência de aminoácido SEQ ID Nº: 198 ou no contexto de IgG1 tendo alotipo f) pode ser usado em qualquer anticorpo ou com qualquer fragmento de ligação a antígeno do mesmo para o qual função efetora, em particular ligação a FcyRs CD32a, CD32b e CD16a, não é desejada. Em adição a P238K, uma região constante de cadeia pesada pode compreender mais 1 ou 2 mutações, por exemplo, substituições, que reduzem a ligação a FcyR CD64, ou P238K pode ser usado no contexto de uma dobra de I|gG2, por exemplo, uma dobra de IgG2 compreendendo C219S, como descrito adicionalmente aqui.
111. Métodos de modificação da atividade biológica de anticorpos
[00213] São providos aqui métodos para potencialização da atividade biológica de certos anticorpos, tais como uma ou mais das atividades biológicas que seguem: internalização aumentada ou alterada por uma célula; atividade agonista aumentada ou alterada; atividade antagonista ou de bloqueio aumentada ou alterada; ADCC potencializada ou reduzida; geração de uma nova propriedade.
formação de complexos reticulados de anticorpo/antígeno; agrupamento ou oligomerização aumentado da molécula- alvo de superfície celular;
estimulação ou potencialização aumentada de uma resposta imune; e/ou inibição aumentada de uma resposta imune.
[00214] Um método para potencializaçção de uma atividade biológica de um anticorpo pode compreender substituição da região constante de cadeia pesada ou uma porção da mesma, por exemplo, a dobra e/ou domínio CH1, com uma região constante de cadeia pesada modificada ou porção da mesma, por exemplo, uma dobra de IgG2 e/ou domínio CH1 de IgG2.
[00215] Em certas modalidades, um método para melhoria da atividade biológica de um anticorpo compreende (i) prover e um anticorpo que não compreende uma região constante de cadeia pesada modificada como aqui descrito; e (ii) substituir a região constante de cadeia pesada do anticorpo com uma região constante de cadeia pesada modificada, ou uma porção da mesma, que potencializa a atividade biológica do anticorpo. Em certas modalidades, um método para melhoria da atividade biológica de um anticorpo compreende (i) prover um anticorpo que compreende uma dobra não IgG2 (por exemplo, uma dobra IgG1, uma dobra IgG3 ou uma dobra IgG4); e (ii) substituir a dobra não I9G2 do anticorpo com uma dobra IgG2. Em certas modalidades, um método para melhoria da atividade biológica de um anticorpo compreende (i) prover um anticorpo que compreende uma dobra de IgG2 não potencializadora; e (ii) substituir a dobra de I9G2 potencializadora do anticorpo com uma dobra de IgG2. Uma "dobra de IgG2 não potencializadora" é uma dobra de IgG2 variante que difere de uma dobra de IgG2 de tal maneira que ela não tem mais a característica necessária para potencialização da atividade biológica de um anticorpo, por exemplo, uma dobra variante que não tem mais a rigidez da dobra de I9G2 do tipo selvagem.
[00216] Métodos exemplares para potencialização da atividade biológica de um anticorpo compreende (i) prover um anticorpo que compreende uma dobra não IgG2 ou uma dobra de IgG2 não potencializadora e (ii) substituir a dobra com uma dobra compreendendo SEQ ID Nº: 8, 21, 22, 23, 126-132, 134-136 ou 137 ou variantes da mesma, por exemplo, as variantes descritas aqui. Métodos para potencialização da atividade biológica de um anticorpo podem também compreender (i) prover um anticorpo que compreende região constante de cadeia pesada que não é uma região constante de cadeia pesada modificada e (ii) substituir a região constante de cadeia pesada com uma região constante de cadeia pesada modificada. Substituição da região constante de cadeia pesada pode compreender substituição do domínio CH1, dobra, CH2 e/ou CH3. Por exemplo, uma região constante de cadeia pesada pode ser modificada através da substituição da dobra com uma dobra de IgG2 ou variante da mesma e/ou substituindo o domínio CH1 com um domínio CH1 de IgG1 ou IgG2 ou variante do mesmo. Em certas modalidades, a dobra é substituída com uma dobra de IgG2 ou o domínio CH2 é substituído com um domínio CH2 de IgG1. Em certas modalidades, a dobra é substituída com uma dobra de IgG2 e o domínio CH3 é substituído com um domínio CH3 de IgG1. Em certas modalidades, a dobra é substituída com uma dobra de I9gG2, o CH1 é substituído com uma dobra de IgG2, o domínio CH2 é substituído com um domínio CH2 de IgG1 e o domínio CH3 é substituído com um domínio CH3 de IgG1. Em certas modalidades, uma região constante de cadeia pesada é substituída com regiões de cadeia pesada modificadas 1-27 mostradas na Tabela 5 acima ou as regiões constantes de cadeia pesada mostradas na Tabela 6 ou descritas aqui.
[00217] São também providos aqui métodos para potencialização da atividade biológica de um anticorpo IGG1 ou IgG2, compreendendo deleção de 1-10 aminoácidos na dobra do anticorpo I9G1 ou I1gG2, respectivamente. Por exemplo, um ou mais dos aminoácidos S219, C22, D221, K222, T223, H224 e T225 podem ser deletados. Em uma modalidade, todos dos aminoácidos S219, C22, D221, K222, 1223, H224 e T225 são deletados.
[00218] São ainda providos aqui métodos para fabricação e provisão de anticorpos sem efetor ou fragmentos de ligação a antígeno dos mesmos, por exemplo, através da mutação P238, por exemplo, a P238K, para eliminar ou reduzir a função efetora de um anticorpo.
[00219] Em certas modalidades, substituição da região constante de cadeia pesada de um anticorpo, por exemplo, para modificar sua atividade biológica, não é acompanhada por uma redução ou uma redução significante em sua atividade de ligação ao antígeno-alvo. Como descrito nos Exemplos, substituição da região constante de cadeia pesada de anticorpos anti-GITR e anti-CD73 não mudou significantemente sua afinidade com o GITR humano e antígenos CD73 humanos, respectivamente.
[00220] Será compreendido que quando se referindo à substituição de um domínio de um isotipo específico com o mesmo domínio de um isotipo diferente ou com um domínio incluindo uma mutação, por exemplo, uma mutação P238, não é necessário literalmente substituir o domínio, mas ao contrário, pode ser apenas necessário mudar os aminoácidos que são diferentes entre os dois isotipos.
[00221] Ensaios padrão para avaliar a habilidade de ligação dos anticorpos com relação a um antígeno de várias espécies são conhecidos na técnica e são descritos adicionalmente aqui, e incluem, por exemplo, ELISAs, Western blots e RIAs. Ensaios adequados são descritos em detalhes nos Exemplos. A cinética de ligação (por exemplo, afinidade de ligação) dos anticorpos pode ser também avaliada através de ensaios padrão conhecidos na técnica, tal como através de análise BIACOREº? SPR. Ensaios para avaliar as propriedades de anticorpos tendo regiões constantes modificadas (por exemplo, ligação de ligante, proliferação de células T, produção de citocina) são descritos em mais detalhes infra e nos Exemplos.
[00222] — Anticorpos exemplares que podem ser modificados como aqui descrito incluem, por exemplo, anticorpos para tratamento de câncer, tais como: Yervoy'Y (ipilimumabe) ou Tremelimumaba (para CTLA-4), galiximabe (para B7.1), BMS-936558 (para PD-1), CT-011 (para PD-1), MK-3475 (para PD-1), AMP224 (para B7DC), BMS- 936559 (para B7-H1), MPDL3280A (para B7-H1), MEDI-570 (para ICOS), AMG557 (para B7H2), MGA271 (para B7H3), IMP321 (para LAG-3), BMS-663513 (para CD137), PF-05082566 (para CD137), CDX-1127 (para CD27), anti-OX40 (Providence Health Services), huMAbOX40L (to OX40L), Atacicepte (para TACI), CP-870893 (para CD40), Lucatumumabe (para CD40), Dacetuzumabe (para CDA40), Muromonabe-CD3 (para CD3), Ipbilumumabe (para CTLA-4).
[00223] Outros anticorpos que podem ser modificados como aqui descrito incluem anticorpos antagonistas para PD-1 e PD-L1. Um anticorpo anti-PD-1 exemplar que pode ser modificado como descrito aqui é nivolumabe (BMS-936558); um anticorpo que compreende as CDRs ou regiões variáveis de um dos anticorpos 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 7D3, 5F4 e 4A11 descritos no WO 2006/121168; MK-3475 (Lambrolizumabe) descrito no WO2012/145493; AMP-514 descrito no WO 2012/145493; CT-011 (Pidilizumabe; anteriormente CT-AcTibody ou BAT; vide, por exemplo, Rosenblatt e outros (2011) J. Immunotherapy 34:409); aqueles descritos nos WO 2009/014708, WO 03/099196, WO 2009/114335, WO 2011/066389, WO 2011/161699, WO 2012/145493, WO2013/173223, Patentes U.S. Nos. 7.635.757 e
8.217.149 e Publicação de Patente U.S. No. 2009/0317368.
[00224] — Anticorpos adicionais que podem ser modificados incluem anticorpos anti-PD-L1, por exemplo, BMS-936559 (referido como 12A4 no WO 2007/005874 e Patente US No. 7.943.743); um anticorpo que compreende as CDRs ou regiões variáveis de 3G10, 12A4, 10A5, 5F8, 10H10, 1B12, 7H1, 11E6, 12B7 e 13G4, que são descritas na Publicação PCT WO 07/005874 e Patente US No. 7.943.743; MEDI4736 (também conhecido como Anti-B7-H1); MPDL3280A (também conhecido como RG7446); qualquer um dos anticorpos anti- PD-L1 revelados — nos VWO2013/173223, WO2011/066389, WO?2012/145493, Patentes U.S. Nos. 7.635.757 e 8.217.149 e Publicação U.S. No. 2009/145493.
[00225] Outros anticorpos que podem ser modificados incluem anticorpos anti-CTLA-4, por exemplo, Yervoy'Y (ipilimumabe ou anticorpo 10D1, descrito na Publicação PCT WO 01/14424); tremelimumabe — (antes ticilimumabe, CP-675,206); anticorpo monoclonal ou um anti-CTLA-4 descrito em qualquer uma das publicações que seguem: WO 98/42752; WO 00/37504; Pat. U.S. No.
6.207.156; Hurwitz e outros (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(17):10067-10071; Camacho e outros (2004) J. Clin" Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (antibody CP-675206); e Mokyr e outros (1998) Cancer Res. 58:5301-5304; e qualquer um dos anticorpos anti- CTLA-4 revelados no WO2013/173223.
[00226] Outros anticorpos que podem ser modificados incluem anticorpos anti-LAG-3, por exemplo, BMS-986016; IMP731 descrito na US 2011/007023; e IMP-321.
[00227] Outros anticorpos que podem ser modificados incluem anticorpos agonistas anti-GITR, por exemplo, o anticorpo anti-GITR 6C8 ou suas versões humanizadas, descritos no WO2006/105021; um anticorpo descrito no WO2011/028683; e um anticorpo descrito no JP2008278814.
[00228] Anticorpos que se direcionam a outros antígenos, incluindo aqueles descritos em qualquer outro ponto aqui, podem ser também modificados. Por exemplo, anticorpos anti-Her2 que requerem internalização, por exemplo, transtuzumabe (Herceptina), podem ser modificados como aqui descrito. IV. Modificações de domínio constante de cadeia pesada adicionais
[00229] Em adição às modificações descritas aqui em anticorpos para potencializar sua atividade biológica ou reduzir função efetora, mutações adicionais podem ser feitas, por exemplo, ao domínio CH1, dobra, CH2 ou CH3, por exemplo, para reduzir mais a função efetora, ligação a FcyRs e/ou a estabilidade dos anticorpos. Por exemplo, qualquer uma das modificações descritas aqui, por exemplo, abaixo, pode ser combinada com uma mutação P238, por exemplo, P238K, tal como em um Fc de IgG1 ou híbrido de IgG1-l9G2 ou porção do mesmo. Fcs e Fes modificados
[00230] Anticorpos descritos aqui podem compreender um Fc compreendendo uma ou mais mutações, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tal como meia-vida do soro, fixação de complemento, ligação a receptor Fc e/ou
[00231] citotoxicidade celular dependente de antígeno. Por exemplo, modificações podem ser feitas na região Fc a fim de gerar uma variante de Fc com (a) citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo aumentada ou diminuída (ADCC), (b) citotoxicidade mediada pelo complemento aumentada ou diminuída (CDC), (c) afinidade com C1iq aumentada ou diminuída e/ou (d) afinidade com receptor Fc aumentada ou diminuída com relação ao Fc parental. Tais variantes de região Fc compreenderão geralmente pelo menos uma modificação de aminoácido na região Fc. Combinação de modificações de aminoácido é pensada ser particularmente desejável.
Por exemplo, a região Fc variante pode incluir duas, três, quatro, cinco, etc., substituições na mesma, por exemplo, das posições da região Fc específicas identificadas aqui. Variantes de sequência Fc exemplares são reveladas aqui, e são também providas nas Patentes U.S. Nº. 5.624.821; 6.277.375; 6.737.056; 6.194.551; 7.317.091;
8.101.720; Publicações de Patente PCT WO 00/42072; WO 01/58957; WO 04/016750; WO 04/029207; WO 04/035752; WO 04/074455; WO 04/099249; WO 04/063351; WO 05/070963; WO 05/040217, WO 05/092925 e WO 06/020114.
Redução da Função Efetora
[00232] Atividade de ADCC pode ser reduzida modificando a região Fc. Em certas modalidades, sítios que afetam a ligação a receptores Fc podem ser removidos (por exemplo, através de mutação), preferivelmente sítios que não sítios de ligação de receptor selvagens. Em outras modalidades, uma região Fc pode ser modificada para remover um sítio ADCC. Sítios ADCC são conhecidos na técnica; vide, por exemplo, Sarmay e outros (1992) Molec. Immunol. 29 (5): 633-9 com relação a sítios ADCC em IgG1. Em uma modalidade, as variantes G236R e L328R de IgG1 humana eliminam efetivamente ligação a FcyR. Horton e outros (2011) J. Immunol. 186:4223 e Chu e outros (2008) Mol. Immunol. 45:3926. Em outras modalidades, o Fc tendo ligação reduzida a FcyRs compreendia as substituições de aminoácido L234A, L235E e G237A. Gross e outros (2001) Immunity 15:289.
[00233] Atividade de CDC pode ser também reduzida através da modificação da região Fc. Mutações nas posições de I9G1 D270, K322, P329 e P331, especificamente mutações em alanina D270A, K322A, P329A e P331A, reduzem significantemente a habilidade do composto correspondente em se ligar a C1iq e ativar complemento. Idusogie e outros (2000) J. Immunol. 164:4178; WO 99/51642.
Modificação da posição 331 de IgG (por exemplo, P331S) foi mostrada reduzir ligação a complemento. Tao e outros (1993) J. Exp. Med. 178:661 and Canfield & Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483. Em um outro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido com posições de aminoácido 231 a 239 são alterados para desta maneira reduzir a habilidade do anticorpo em fixar complemento. WO 94/29351.
[00234] Em algumas modalidades, o Fc com fixação de complemento reduzida tem as substituições de aminoácido A330S e P331S. Gross e outros (2001) Immunity 15:289.
[00235] Para usos onde função efetora deve ser evitada completamente, por exemplo, quando ligação a antígeno sozinha é suficiente para gerar o benefício terapêutico desejado, e função efetora leva apenas a (ou ao risco aumentado de) efeitos colaterais indesejados, anticorpos IgG4 podem ser usados, ou anticorpos ou fragmentos sem a região Fc ou uma porção substancial da mesma podem ser planejados, ou o Fc pode ser mutado para eliminar glicosilação completamente (por exemplo, N297A). Alternativamente, um construto de híbrido de I9G2 humana (domínio CHx1 e região de dobra) e IgG4 humana (domínios Cx2 e CrK3) foi gerado, o qual é destituído de função efetora, sem a habilidade em se ligar ao FcyR (tal como IgG2) e incapaz de ativar complemento (talo como IgG4). Rother e outros (2007) Nat. Biotechnol. 25:1256. Vide também Mueller e outros (1997) Mol. Immunol. 34:441; Labrijn e outros (2008) Curr. Op. Immunol. 20:479 (discutindo modificações de Fc para reduzir função efetora de modo geral).
[00236] Em outras modalidades, a região Fc é alterada através de substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido diferente para reduzir toda(s) a(s) função(ões) efetora(s) do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318,
320 e 322 podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente de modo que o anticorpo tem afinidade diminuída com um ligante efetor, mas retém a habilidade de ligação a antígeno do anticorpo parental. O ligante efetor para o qual afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor Fc (resíduos 234, 235, 236, 237, 297) ou o componente C1 de complemento (resíduos 297, 318, 320, 322). Patentes U.S. Nos. 5.624.821 e 5.648.260, ambas de Winter e outros
[00237] OWO 88/007089 propôs modificações na região Fc de IgG para diminuir ligação a FcyRI para diminuir ADCC (234A; 235E; 236A; G237A) ou bloquear ligação a componente de complemento C1a para eliminar CDC (E318A ou V/K320A e K322A/Q). Vide também Duncan & Winter (1988) Nature 332:563; Chappel e outros (1991) Proc. Nat' Acad. Sci. (USA) 88:9036; e Sondermann e outros (2000) Nature 406:267 (discutindo os efeitos dessas mutações sobre ligação de FeyRiI).
[00238] Modificações de Fc reduzindo função efetora também inclui substituições, inserções e deleções nas posições 234, 235, 236, 237, 267, 269, 325 e 328, tais como 234G, 235G, 236R, 237K, 267R, 269R, 325L e 328R. Uma variante de Fc pode compreender 236R/328R. Outras modificações para redução de FcyR e interações de complemento incluem substituições 297A, 234A, 235A, 237A, 318A, 228P, 236E, 268Q, 309L, 3308, 331 S, 2208, 226S, 2298, 2388, 233P e 234V. Essas e outras modificações são revistas em Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691. Funções efetoras (ambos ADCC e ativação de complemento) podem ser reduzidas, enquanto mantendo ligação a FcR neonatal (mantendo a meia-vida), através da mutação de resíduos de IgG em uma ou mais de posições 233 — 236 and 327 — 331, tais como E233P, L234V, L235A, opcionalmente G2364, A327G, A330S e P331S em IgG1; E233P,
F234V, L235A, opcionalmente G236A em IgG4; e A330S e P331S em IgG2. Vide Armour e outros (1999) Eur. J. Immunol. 29:2613; WO 99/58572. Outras mutações que reduzem a função efetora incluem L234A e L235A em IgG1 (Alegre e outros (1994) Transplantation 57:1537); V234A e G237A em I|IgG2 (Cole e outros (1997) J. Immunol. 159:3613; vide também Pat. U.S. No. 5,834,597); e S228P e L235E para IgG4 (Reddy e outros (2000) J. Immunol. 164:1925). Uma outra combinação de mutações para redução da função efetora em uma IgG1 humana inclui L234F, L235E and P331S. Oganesyan e outros (2008) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 64:700. Vide em geral Labriinh e outros. (2008) Curr. Op. Immunol. 20:479. Mutações adicionais verificadas diminuir função efetora no contexto de uma proteína de fusão Fc (IgG1) (abatacepte) são C226S, C229S e P238S (numeração de resíduo EU). Davis e outros (2007) J. Immunol. 34:2204.
[00239] Outras variantes de Fc tendo ADCC e/ou CDC reduzida são reveladas em Glaesner e outros (2010) Diabetes Metab. Res. Rev. 26:287 (F234A e L235A para diminuir ADCC e ADCP em um I|gG4); Hutchins e outros (1995) Proc. Nat'l Acad. Sci. (USA) 92:11980 (F234A, G237A e E318A em um IgG4); An e outros (2009) MAbs 1:572 e Pub. de Ped. De Pat. U.S. 2007/0148167 (H268Q, V309L, A3S3OS e P331S em um IgG2); McEarchern e outros (2007) Blood 109:1185 (C226S, C229S, E233P, L234V, L235A em um IgG1); Vafa e outros (2014) Methods 65:114 (V234V, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S, P331S em um I|gG2).
[00240] Em certas modalidades, é escolhido um Fc que não tem essencialmente nenhuma função efetora, isto é, ele tem ligação reduzida a FcyR e fixação de complemento reduzida. Um Fc exemplar, por exemplo, Fc de IgG1, que é sem efetor compreende as cinco mutações que seguem: L234A, L235E, G237A, A330S e P331S.
Gross e outros (2001) Immunity 15:289. Essas cinco substituições podem ser combinadas com N297A para eliminar glicosilação também. Potencialização de Função Efetora
[00241] É Alternativamente, atividade de ADCC pode ser aumentada modificando a região Fc. Com relação à atividade de ADCC, I9G1 > I9G3 > IgG4 2 IgG2 humana, de modo que um domínio constante de IgG1, ao invés de um IgG2 ou IgG4, seria escolhido para uso em um fármaco onde ADCC é desejada. Alternativamente, a região Fc pode ser modificada para aumentar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e/ou aumentar a afinidade com um receptor Fcy através da modificação de um ou mais aminoácidos nas posições que seguem: 234, 235, 236, 238, 239, 240, 241, 243, 244, 245, 247, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 262, 263, 264, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 313, 315, 320, 322, 324, 325, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 433, 434, 435, 436, 437, 438 ou 439. Vide WO 2012/142515; vide também WO 00/42072. Substituições exemplares incluem 236A, 239D, 239E, 268D, 267E, 268E, 268F, 324T, 332D e 332E. Variantes exemplares incluem 239D/332E, 236A/332E, 236A/239D/332E, 268F/324T, 267E/268F, 267E/324T e 267E/268F/324T. Por exemplo, Fcs de IgG1 humana compreendendo a variante G236A, que pode ser opcionalmente combinada com 1332E, foram mostrados aumentar a razão de afinidade de ligação FcylIA/FceyllB aproximadamente 15 vezes. Richards e outros (2008) Mol. Cancer Therap. 7:2517; Moore e outros (2010) mAbs 2:181. Outras modificações para potencialização de interações FcyR e complemento incluem, mas não estão limitadas a, substituições 298A, 333A, 334A, 326A, 247l, 339D, 339Q, 280H, 290S, 298D, 298V, 243L, 292P, 300L, 396L, 305! e 396L. Essas e outras modificações são revistas em Strohl (2009) Current Opinion in Biotechnology 20:685-691. Especificamente, ambas ADCC e CDC podem ser potencializadas por mudanças nas posições E333 de IgG1, por exemplo, E333A. Shields e outros (2001) J. Biol. Chem. 276:6591. O uso de mutações P247l eA339D/Q para potencializar a função efetora em um IgG1 é revelado no WO 2006/020114 e D280H, K290S + S298D/V é revelado no WO 2004/074455. As variantes K326A/W e E333A/S foram mostradas aumentar a função efetora em 1I1gG1 humana e E333S em I|gG2. Idusogie e outros (2001) J. Immunol. 166:2571.
[00242] Especificamente, os sítios de ligação em IgG1 humana para FeyR1, FeyRIl, FeyRIll e FcRn foram mapeados, e variantes com ligação melhorada foram descritos. Shields e outros (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604. Mutações específicas nas posições 256, 290, 298, 333, 334 e 339 foram mostradas melhorar a ligação a FeyRilIl, incluindo os mutantes de combinação T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A e S298A/E333A/K334A (tendo ligação a FeyRlilla e atividade de ADCC potencializadas). Outras variantes de I9gG1 com ligação fortemente potencializada a
[00243] FeyRlilla foram identificadas, incluindo variantes com mutações S239D/1332E e S239D/I332E/A330L que mostraram o aumento mais alto em afinidade com FcyRllla, uma diminuição em ligação a FcyRiIlb e atividade citotóxica forte em macacos cynomolgus. Lazar e outros(2006) Proc. Nat'l Acad Sci. (USA) 103:4005; Awan e outros (2010) Blood 115:1204; Desjarlais & Lazar (2011) Exp. Cell Res. 317:1278. Introdução das mutações triplas em anticorpos tais como alemtuzumabe (específico para CD52), trastuzumabe (specífico para HER2/neu), rituximabe (específico para CD20) e cetuximabe (específico para EGFR) se traduziu em atividade de ADCC bastante potencializada in vitro, e a variante S239D/I1332E mostrou uma capacidade potencializada em depletar células B em macacos. Lazar e outros(2006) Proc. Nat'l Acad Sci. (USA) 103:4005. Ainda, mutantes de IgG1 contendo mutações L235V, F243L, R292P, Y300L, V305| e P396L que exibiram ligação potencializadda a FoyRilla e concomitantemente potencializaram a atividade de ADCC em camundongos transgênicos expressando FcyRllla em modelos de males de célula B e câncer de mama foram identificados. Stavenhagen e outros (2007) Cancer Res. 67:8882; Pat.U.S. Nº. 8,652,466; Nordstrom e outros (2011) Breast Cancer Res. 13:R123.
[00244] —Isotipos de IgG diferentes também exibiram atividade de CDC diferencial (IgG3>IgG1>>IgG2=Ig9G4). Dangl e outros (1988) EMBO J. 7:1989. Para usos em que CDC potencializada é desejada, é também possível introduzir mutações que aumentam a ligação a C1q. A habilidade em recrutar complemento (CDC) pode ser potencializada por mutações em K326 e/ou E333 em uma I|gG2, tal como K326W (que reduz atividade de ADCC) e E333S, para aumentar a ligação a C1q, o primeiro componente da cascata de complemento. Idusogie e outros (2001) JJ Immunol. 166:2571. Introdução — de S267E/H268F/S324T (sozinho ou em qualquer combniação) em IgG1 humana potencializa a ligação a C1iq. Moore e outros (2010) mAbs 2:181. A região Fc do anticorpo de isotipo híbrido IgG1/I19G3 "113F" de Natsume e outros (2008) Cancer Res. 68:3863 (figure 1 therein) também confere CDC potencizaliada. Vide também Michaelsen e outros (2009) Scand. J. Immunol. 70:553 e Redpath e outros (1998) Immunology 93:595.
[00245] “Mutações adicionais que podem aumentar ou diminuir a função efetora são reveladas em Dall'Acqua e outros (2006) J. Immunol. 177:1129. See also Carter (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:343; Presta (2008) Curr. Op. Immunol. 20:460.
[00246] Variantes de Fc que potencializam a afinidade com o receptor inibidor FcyRIlb podem ser também usadas, por exemplo, para potencializar a atividade de indução de apoptose ou adjuvante. Li & Ravetch (2011) Science 333:1030; Li & Ravetch (2012) Proc. Nat' Acad. Sci (USA) 109:10966; Pub. de Ped. de Pat. U.A. 2014/0010812. Tais variantes podem prover um anticorpo com atividades imunomoduladoras relacionadas a células FeyRiIlb*, incluindo, por exemplo, células B e monócitos. Em uma modalidade, as variantes de Fc proveem afinidade seletivamente potencializada com FcyRiIlb em relação a um ou mais receptores de ativação. Modificações para alteração da ligação a FCcyRilb incluem uma ou mais modificações em uma posição selecionada do grupo consistindo em 234, 235, 236, 237, 239, 266, 267, 268, 325, 326, 327, 328 e 332, de acordo com o índice EU. Substituições exemplares para potencialização de afinidade com FcyRIlb incluem, mas não estão limitadas a, 234D, 234E, 234F, 234W, 235D, 235F, 235R, 235Y, 236D, 236N, 237D, 237N, 239D, 239E, 266M, 267D, 267E, 268D, 268E, 327D, 327E, 328F, 328W, 328Y e 332E. Substituições exemplares incluem 235Y, 236D, 239D, 266M, 267E, 268D, 268E, 328F, 328W e 328Y. Outras variantes de Fc para potencialização de ligação a FcyRilb incluem 235Y/267E, 236D/267E, 239D/268D, 239D/267E, 267E/268D, 267E/268E e 267E/328F. Especificamente, as variantes S267E, G236D, S239D, L328F e |1332E, incluindo a variante dupla S267E + L328F, de IgG1 humana são de valor particular em potencializar especificamente afinidade com o receptor FcyRIlb inibidor. Chu e outros (2008) Mol. Immunol. 45:3926; Pub. de Ped. de Pat U.S. 2006/024298; WO 2012/087928. Especificidade potencializada para FcyRIlb (conforme distinguido de FeyRIlaR'*!) pode ser obtida adicionando a substituição P238D. Mimoto e outros (2013) Protein Eng. Des. & Selection 26:589; WO 2012/115241.
Glicosilação
[00247] Glicosilação de um anticorpo é modificada para aumentar ou diminuir função efetora. Por exemplo, um anticorpo aglicosilado pode ser feito, o qual carece de toda função efetora ao mutar o resíduo asparagina conservado na posição 297 (por exemplo, N297A), desta maneira abolindo ligação a complemento e FcyRI. Bolt e outros (1993) Eur. J. Immunol. 23:403. Vide também Tao & Morrison (1989) J. Immunol. 143:2595 (usando N297Q em I|gG1 para eliminar glicosilação na posição 297).
[00248] Embora anticorpos aglicosilados geralmente careçam de função efetora, mutações podem ser introduzidas para restaurar essa função. Anticorpos aglicosilados, por exemplo, aqueles resultantes de mutações N297A/C/D ou H ou produzidos em sistemas (por exemplo, E. coli) que não glicosilam proteínas, podem ser mutados mais para restaurar a ligação a FceyR, por exemplo, S298G e/ou T299A/G/ou H (WO 2009/079242) ou E382V e M428I (Jung e outros (2010) Proc. Nat' Acad. Sci (USA) 107:604).
[00249] Ainda, um anticorpo com ADCC potencializada pode ser feito através da alteração da glicosilação. Por exemplo, remoção de fucose de oligossacarídeos ligados a Asn297 da cadeia pesada foi mostrada potencializar ADCC, com base em ligação melhorada a FeoyRllla. Shields e outros (2002) JBC 277:26733; Niwa e outros (2005) J. Immunol. Methods 306: 151; Cardarelli e outros (2009) Clin. Cancer Res.15:3376 (MDX-1401); Cardarelli e outros (2010) Cancer Immunol. Immunotherap. 59:257 (MDX-1342). Tais anticorpos com baixo teor de fucose podem ser produzidos, por exemplo, em células de ovário de hamster Chinês (CHO) inativadas sem fucosiltransferase (FUT8) (Yamane-Ohnuki e outros (2004) Biotechnol. Bioeng. 87:614), ou em outras células que geram anticorpos afucosilados. Vide, por exemplo, Zhang e outros (2011) mAbs 3:289 e Li e outros (2006) Nat. Biotechnol. 24:210 (ambos descrevendo produção de anticorpo em
Pichia pastoris glicoengenheirada); Mossner e outros (2010) Blood 115:4393; Shields e outros (2002) J. Biol. Chem. 277:26733; Shinkawa e outros (2003) J. Biol. Chem. 278:3466; EP 1176195B1. ADCC pode ser também potencializada como descrito na Publicação PCT WO 03/035835, que revela uso de uma linhagem celular CHO variante, Lec13, com habilidade reduzida em ligar fucose a carboidratos ligados a Asn(297), também resultando em hipofucosilação de anticorpos expressos nesta célula hospedeira (vide também Shields, R.L. e outros (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). Alternativamente, análogos de fucose podem ser adicionados ao meio de cultura durante produção do anticorpo para inibir incorporação de fucose ao carboidrato no anticorpo. WO 2009/135181.
[00250] Aumento de estruturas de GlcNac de bissecção em oligossacarídeos ligados a anticorpo também potencializa ADCC. A publicação PCT WO 99/54342 de Umana e outros descreve linhagens celulares engenheiradas para expressar dglicosil transferase de modificação — de —glicoproteina (por exemplo, beta(1,4)-N- acetilglucosaminiltransferase Ill (GnTIIl)) de modo que anticorpos expressos nas linhagens celulares engenheiradas exibem mais estruturas de GlcNac de bissecção com resultados em atividade de ADCC aumentada dos anticorpos (vide também Umana e outros (1999) Nat. Biotech. 17:176-180).
[00251] Variantes de glicosilação adicionais foram desenvolvidas, as quais são destituídas de resíduos de galactose, ácido siálico, fucose e xilose (as chamadas glicoformas GNGN), que exibem ADCC e ADCP potencializadas, mas CDC diminuída, bem como outras que são destituídas de ácido siálico, fucose e xilose (as chamadas glicoformas G1/G2), que exibem ADCC, ADCP e CDC potencializada. Pub. de Ped. de Pat. U.S. Nº. 2013/0149300. Anticorpos tendo esses padrões de glicosilação são opcionalmente produzidos em plantas de
N. benthamiana geneticamente modificadas em que os genes de xilosil e fucosil transferase endógenos foram inativados.
[00252] —Glicoengenharia pode ser também usada para modificar as propriedades anti-inflamatórias de um construto de IgG mudando o teor de a2,6 sialila das cadeias de carboidrato ligadas a Asn297 das regiõêeês Fc, em que uma proporção aumentada de formas a2,6 sialiladas resulta em efeitos anti-inflamatórios potencializados. Vide Nimmerjahn e outros (2008) Ann. Rev. Immunol. 26:513. Por outro lado, redução na proporção de anticorpos tendo carboidratos a2,6 sialilados pode ser útil em casos onde propriedades anti-inflamatórias não são desejadas. Métodos de modificação de teor de sialilação a2,6 de anticorpos, por exemplo, através da purificação seletiva de formas 02,6 sialiladas ou através de modificação enzimática, são providos na Pub. de Ped. de Pat. U.S. Nº. 2008/0206246. Em outras modalidades, a sequência de aminoácido da região Fc pode ser modificada para imitar o efeito de sialilação a2,6, por exemplo, através da inclusão de uma modificação F241A. WO 2013/095966.
[00253] — Anticorpos descritos aqui podem conter um ou mais sítios de glicosilação ou na região variável de cadeia leve ou pesada. Tais sítios de glicosilação podem resultar em imunogenicidade aumentada do anticorpo ou uma alteração do pK do anticorpo devido à ligação a antígeno alterada (Marshall e outros, (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala e Morrison (2004) J. Immunol 172:5489-94; Wallick e outros, (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh e outros, (1985) Nature 316:452-7; Mimura e outros (2000) Mol Immunol 37:697-706). Glicosilação é conhecida ocorrer em motivos contendo uma sequência N-X-S/T. Meia-vida biológica
[00254] Em certas modalidades, o anticorpo é modificado para aumentar sua meia-vida biológica. Várias abordagens são possíveis.
Por exemplo, isso pode ser feito aumentando a afinidade de ligação da região Fc com FcRn. Em uma modalidade, o anticorpo é alterado dentro da região CH1 ou CL para conter um epítopo de ligação de receptor selvagem obtido de duas alças de um domínio CH2 de uma região Fc de uma IgG, como descrito nas Pat. U.S. Nos. 5.869.046 e
6.121.022 de Presta e outros. Outras variantes de Fc exemplares que aumentam a ligação a FcRn e/ou melhoram as propriedades farmacocinéticas incluem substituições nas posições 259, 308 e 434 incluindo, por exemplo, 2591, 308F, 428L, 428M, 4348, 434H, 434F, 434Y e 434M. Outras variantes que aumentam a ligação de Fc a FERN incluem: 250E, 250Q, 428L, 428F, 250Q/428L (Hinton e outros, 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216, Hinton e outros, 2006 Journal of Immunology 176:346-356), 256A, 272A, 305A, 307A, 31 1A, 312A, 378Q, 380A, 382A, 434A (Shields e outros, Journal of Biological Chemistry, 2001, 276(9):6591-6604), 252F, 252Y, 252W, 254T, 2560, 256E, 256D, 433R, 434F, 434Y, 252Y/254T/256E, 433K/434F/436H (Del' Acqua e outros, Journal of Immunology, 2002, 169:5171-5180, Dall'Acqua e outros, 2006, Journal of Biological Chemistry 281:23514- 23524). Vide Pat. U.S. Nº. 8.367.805.
[00255] “Modificações de certos resíduos conservados em Fc de I9G1 (1253/H310/Q0311/H433/N434), tal como a variante N434A (Yeung e outros (2009) J. Immunol. 182:7663), foram propostas como uma maneira de aumentar a afinidade com FcRn, desta maneira aumentando a meia-vida do anticorpo em circulação. WO 98/023289. A variante de Fc em combinação compreendendo M428L e N434S foi mostrada aumentar a afinidade com FcRn e meia-vida no soro aumentada até cinco vezes. Zalevsky e outros (2010) Nat. Biotechnol. 28:157. A combinação da variante de Fc compreendendo modificações T307A, E380A e N434A também prolonga a meia-vida de anticorpos I9gG1. Petkova e outros (2006) Int. Immunol. 18:1759. Ainda, variants de Fc em combinação compreendendo as variantes M252Y/M428L, M428L/N434H, —M428L/N434F, M428L/N434Y, M428L/N434A, M428L/N434M e M428L/N434S também foram mostradas prolongar a meia-vida. WO 2009/086320.
[00256] Ainda, uma variante de Fc em combinação compreendendo M252Y, S254T e T256E aumenta a meia-vida em quase 4 vezes. Dal'Acqua e outros (2006) J. Biol. Chem. 281:23514. Uma modificação em IgG1 relacionada provendo afinidade com FcRn aumentada, mas dependência do pH reduzida (M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F), tem sido usada para criar um construto de IgG1 ("MST-HN Abdeg") para uso como um competidor para prevenir ligação de outros anticorpos a FcRn, resultando em eliminação aumentada deste outro anticorpo, ou IgG endógeno (por exemplo, em um ambiente autoimune) ou um outro mAb exógeno (terapêutico). Vaccaro e outros (2005) Nat. Biotechnol. 23:1283; WO 2006/130834.
[00257] Outras modificações para o aumento de ligação a FcRn são descritas em Yeung e outros (2010) J. Immunol. 182:7663-7671;
6.277.375; 6.821.505; WO 97/34631; WO 2002/060919.
[00258] Em certas modalidades, isotipos de IgG híbridos podem ser usados para aumentar a ligação a FcRn, e potencialmente aumentar a meia-vida. Por exemplo, uma variante híbrida IGG1/I9G3 pode ser construída substituindo posições de IG1 na região CH2 e/ou CH3 com os aminoácidos de IgG3 nas posições onde os dois isotipos diferem. Desta maneira, um anticorpo IgG variante híbrido pode ser construído, o qual compreende uma ou mais substituições, por exemplo, 274Q, 276K, 300F, 339T, 356E, 358M, 384S, 392N, 397M, 422], 435R e 436F. Em outras modalidades descritas aqui, uma variante híbrida IgG1/I9G2 pode ser construída substituindo posições em IgG2 na região CH2 e/ou CH3 com aminoácidos de I9gG1 em posições onde os dois isotipos diferem. Desta maneira um anticorpo I9G1 variante híbrido pode ser construído, o qual compreende uma ou mais substituições, por exemplo, uma ou mais das substituições de aminoácido que seguem: 233E, 234L, 235L, -236G (referindo a uma inserção de uma glicina na posição 236 236) e 327A. Vide Pat. U.S. Nº. 8.629.113. Um híbrido de sequências de IgG1/I9G2/I9G4 foi gerado, o que aumenta propositadamente a meia-vida no soro e melhora a expressão. Pat. U.S. Nº. 7.867.491 (número de sequência 18 no mesmo).
[00259] A meia-vida no soro dos anticorpos da presente invenção pode ser também aumentada por peguilação. Um anticorpo pode ser peguilado para, por exemplo, aumentar a meia-vida biológica (por exemplo, soro) do anticorpo. Para peguilar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento do mesmo, tipicamente é reagido com um reagente polietileno glicol (PEG), tal como um derivado éster ou aldeído reativo de PEG, sob condições em que um ou mais grupos PEG se tornam ligados ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. Preferivelmente, a peguilação é realizada através de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Como aqui usado, o termo "polietileno glicol" pretende compreender qualquer uma das formas de PEG que têm sido usadas para derivatizar outras proteínas, tal como mono (C1-C10)alcóxi- ou ariloxi-polietileno glicol ou polietileno glicol- maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser peguilado é um anticorpo aglicosilado. Métodos para peguilação de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados a anticorpos descritos aqui. Vide, por exemplo, EP 0154316 de Nishimura e outros de EP 0401384 de Ishikawa e outros.
[00260] Alternativamente, sob algumas circunstâncias, pode ser desejável diminuir a meia-vida de um anticorpo da presente invenção, ao invés de aumenta-la. Modificações tais como 1253A (Hornick e outros (2000) J. Nucl. Med. 41:355) e H435A/R 1253A ou H310A (Kim e outros (2000) Eur. J. Immunol. 29:2819) em Fc de IgG1 humana podem diminuir ligação a FcRn, desta maneira diminuindo a meia-vida (aumentando a eliminação) para uso em situações onde eliminação rápida é preferida, tal como uma imagem médica. Vide também Kenanova e outros (2005) Cancer Res. 65:622. Outros meios para potencializar a eliminação incluem formatação dos domínios de ligação de antígeno da presente invenção como fragmentos de anticorpo sem a habilidade de se ligar a FcRn, tais como fragmentos Fab. Tais modificações podem reduzir a meia-vida de circulação de um anticorpo de algumas semanas para uma questão de horas. PEGuilação seletiva de fragmentos de anticorpo pode então ser usada para fazer pequenos ajustes (aumentar) a meia-vida dos fragmentos de anticorpo se necessário. Chapman e outros (1999) Nat. Biotechnol. 17:780. Fragmentos de anticorpo também podem ser fundidos à algumina de soro humana, por exemplo, em um construto de proteína de fusão, para aumentar a meia-vida. Yeh e outros (1992) Proc. Nat'l Acad. Sci. 89:1904. Alternativamente, um anticorpo biespecífico pode ser construído com um primeiro domínio de ligação de antígeno da presente invenção e um segundo domínio de ligação de antígeno que se liga a uma albumina do soro humana (HSA). Vide Pub. de Ped. de Pat. Int. WO 2009/127691 e referências de patente citadas nela. Alternativamente, sequências de polipeptídeo especializadas podem ser adicionadas aos fragmentos de anticorpo para aumentar a meia- vida, por exemplo, sequências de polipeptídeo "XTEN". Schellenberger e outros (2009) Nat. Biotechnol. 27:1186; Pub. de Ped. de Pat. Int. WO 2010/091122.
Estabilidade
[00261] Um sítio de clivagem de protease potencial na dobra de construtos de IgG1 pode ser eliminado por modificações D221G e
K2228S, aumentando a estabilidade do anticorpo. WO 2014/043344.
[00262] Em certas modalidades, os anticorpos descritos aqui não contêm sítios de isomerismo de asparagina. A desaminação de asparagina pode ocorrer em sequências N-G ou D-G e pode resultar na criação de um resíduo de ácido isoaspártico que pode introduzir uma torção na cadeia polipeptídica e pode diminuir sua estabilidade (efeito do ácido isoaspártico).
[00263] Cada anticorpo terá um ponto isoelétrico (pl) único, que geralmente se encaixa na faixa de pH entre 6 e 9,5. O pl para um anticorpo IgG1 tipicamente se encaixa na faixa de pH de 7-9,5e o pl para um anticorpo IgG4 tipicamente se encaixa na faixa de pH de 6-8. Há especulação que anticorpos com um pl fora da faixa normal possam ter algum desdobramento e instabilidade sob condições in vivo. Desta maneira, é preferido ter um anticorpo que contenha um valor de pl que se encaixe na faixa normal. Isso é obtido ou através de seleção de anticorpos com um pl na faixa normal ou através de resíduos de superfície carregados mutantes.
[00264] Cada anticorpo terá uma temperatura de fusão característica, com uma temperatura de fusão maior indicando estabilidade total maior in vivo (Krishnamurthy, R. e Manning, M.C. (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Em geral, é preferido que a Tm (a temperatura de desdobramento inicial) seja maior do que 60ºC, preferivelmente maior do que 65ºC, ainda mais preferivelmente maior do que 70ºC. O ponto de fusão de um anticorpo pode ser medido usando calorimetria de varredura diferencial (Chen e outros, (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando e outros, (1999) Immunol Lett 68:47-52) ou dicroísmo circular (Murray e outros (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).
[00265] Em uma modalidade preferida, são selecionados anticorpos que não degradam rapidamente. Degradação de um anticorpo pode ser medida usando eletroforese capilar (CE) e MALDI-MS (Alexander,
A. J. e Hughes, D. E. (1995) Anal Chem 67:3626-32).
[00266] Quando usando um domínio constante de 1I9gG4, é geralmente preferível incluir a substituição S228P, que imita a sequência de dobra em IgG1 e desta maneira estabiliza moléculas de IgG4, por exemplo, reduzindo a troca de braço Fab entre o anticorpo terapêutico e IgG4 endógena no paciente sendo tratado. Labrijin e outros (2009) Nat. Biotechnol. 27:767; Reddy e outros (2000) J. Immunol. 164:1925. Similarmente, em anticorpos contendo dobra de IgG2, uma mutação C219S e/ou C220S estabiliza o anticorpo compreendendo uma dobra de IgG2. Agregação
[00267] Em uma outra modalidade preferida, são selecionados anticorpos que têm efeitos de agregação mínimos, que podem levar ao disparo de uma resposta imune indesejada e/ou propriedades farmacocinéticas alteradas ou desfavoráveis. Em geral, anticorpos são aceitáveis com agregação de 25% ou menos, preferivelmente 20% ou menos, ainda mais preferivelmente 15% ou menos, ainda mais preferivelmente 10% ou menos e ainda mais preferivelmente 5% ou menos. Agregação pode ser medida através de várias técnicas, incluindo coluna de exclusão de tamanho (SEC), cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e espalhamento de luz. V. Derivados de proteínas não anticorpo e anticorpos
[00268] A invenção descrita aqui pode ser também aplicada a moléculas que não são anticorpos de comprimento integral, contanto que elas compreendam uma dobra. Por exemplo, proteínas de fusão a IgG com uma atividade biológica potencializada ou falta de função efetora podem ser feitas. Portanto, são providas aqui proteínas de fusão compreendendo uma porção ativa ligada, por exemplo, covalentemente ligada, a uma região constante de IgG, por exemplo, uma região Fc, compreendendo uma dobra de IgG2 e opcionalmente domínios CH2 e CH3 ou porções dos mesmos, ou ligadas a um IgG (por exemplo, um IgG1) ou porção do mesmo com função efetora reduzida, por exemplo, compreendendo uma mutação em P238, por exemplo, P238K. O Fc pode ser qualquer Fc de uma região constante de cadeia pesada modificada descrita aqui, tais como as porções Fc das regiões constantes de cadeia pesada modificadas mostradas na Tabela 5, 6 ou na Tabela de Sequências.
[00269] — Anticorpos descritos aqui podem ser também usados para formação de moléculas biespecíficas ou moléculas para terapia CAR- T. Um anticorpo, ou porções de ligação a antígeno do mesmo, pode ser derivatizado ou ligado a uma outra molécula funcional, por exemplo, um outro peptídeo ou proteína (por exemplo, um outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois sítios de ligação ou moléculas-alvo diferentes. Os anticorpos descritos aqui podem ser derivatizados ou ligados a mais de uma outra molécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam a mais de dois sítios de ligação e/ou moléculas-alvo diferentes; tais moléculas multiespecíficas são também pretendidas ser compreendidas pelo termo "molécula biespecífica" como aqui usado. Para criar uma molécula biespeciífica, um anticorpo descrito aqui pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, através de acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra maneira) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tal como um outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação, de modo que uma molécula biespecífica resulta. VI. Composições
[00270] São ainda providas composições, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combinação de anticorpos, ou porção(ões) de ligação a antígeno dos mesmos,
descritos — aqui, — formulados juntos com um carreador farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem incluir um ou uma combinação de (por exemplo, dois ou mais diferentes) anticorpos ou imunoconjugados ou moléculas específicas descritas aqui. Por exemplo, uma composição farmacêutica descrita aqui pode compreender uma combinação de anticorpos (ou imunoconjugados ou biespecíficos) que se ligam a epítopos diferentes no antígeno-alvo ou que têm atividades complementares.
[00271] Em certas modalidades, uma composição compreende um anticorpo descrito aqui em uma concentração de pelo menos 1 mg/ml, mg/ml, 10 mg/ml, 50 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 1- 300 mg/ml ou 100-300 mg/ml.
[00272] “Composições farmacêuticas descritas aqui também podem ser administradas em terapia de combinação, por exemplo, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpo descrito aqui combinado com pelo menos um outro agente anticâncer e/ou estimulador de célula T (por exemplo, ativação). Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser usados em terapia de combinação são descritos em mais detalhes abaixo na seção sobre usos dos anticorpos descritos aqui.
[00273] Em algumas modalidades, as composições terapêuticas reveladas aqui podem incluir outros compostos, fármacos e/ou agentes usados para o tratamento de câncer. Tais compostos, fármacos e/ou agentes podem incluir, por exemplo, fármacos para quimioterapia, fármacos de molécula pequena ou anticorpos que estimulam a resposta imune para um dado câncer. Em alguns casos, composições terapêuticas podem incluir, por exemplo, um ou mais de um anticorpo anti-CTLA-4, um anticorpo anti-PD-1, um anticorpo anti- PDL-1, um anticorpo anti-OX40 (também conhecido como CD134, TNFRSFA4, ACT35 e/ou TXGP1L) ou um anticorpo anti-LAG-3.
[00274] Como aqui usado, "carreador farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardo de absorção e similar que sejam fisiologicamente compatíveis. Preferivelmente, o carreador é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinal ou epidermal (por exemplo, através de injeção ou infusão). Dependendo da via de administração, o composto ativo, isto é, anticorpo, imunoconjugado ou molécula biespecífica, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que possam inativar o composto.
[00275] Os compostos farmacêuticos descritos aqui podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitável" se refere a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto parental e não causa quaisquer efeitos toxicológicos indesejáveis (vide, por exemplo, Berge, S.M. e outros (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Exemplos de tais sais incluem sais de adição ácidos e sais de adição de base. Sais de adição ácidos incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como clorídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromídrico, iodrídico, fosforoso e similar, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos tais como ácidos alifáticos mono- e dicarboxílicos, álcoois alcanoicos substitudos com fenila, ácidos hidroxi alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos e similar. Sais de adição de base incluem aqueles derivados de metais alcalino-terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e similar, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N ,N'-dibenziletilenodiamina, N- metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína e similar.
[00276] Uma composição farmacêutica descrita aqui pode incluir também um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio e similar; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbila, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil galato, alfa-tocoferol e similar; e (3) agentes quelantes de metal, tais como ácido cítrico, ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e similar.
[00277] Exemplos de carreadores aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas descritas aqui incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e similar) e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. Fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de materiais de revestimento, tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersos, e através do uso de tensoativos.
[00278] Essas composições também podem conter adjuvantes tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes de dispersão. Prevenção da presença de micro-organismos pode ser assegurada ambos através de procedimentos de esterilização, supra, e através da inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, ácido fenol sórbico e similar. Pode ser também desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio e similar, às composições. Ainda, absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser causada pela inclusão de agentes que retardam a absorção tais como monoestearato de alumínio e gelatina.
[00279] Carreadores farmaceuticamente — aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersão injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto até o ponto que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o composto ativo, uso do mesmo nas composições farmacêuticas descritas aqui é compreendido. Compostos ativos suplementares podem também ser incorporados às composições.
[00280] Composições terapêuticas devem ser tipicamente estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossomo ou outra estrutura ordenada adequada para concentração alta de fármaco. O carreador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido e similar) e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através do uso de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através do uso de tensoativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tal como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio na composição. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser causada incluindo na composição um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.
[00281] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido por microfiltragem de esterilização. Em geral, dispersões são preparadas incorporando o composto ativo a um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são secagem a vácuo ou secagem por congelamento (liofilização) que fornecem um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional a partir de uma solução previamente filtrada estéril do mesmo.
[00282] A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material carreador para produzir uma forma de dosagem única variará dependendo do indivíduo sendo tratado e do modo de administração particular. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material carreador para produzir uma forma de dosagem única será geralmente aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Em geral, de cem por cento, esta quantidade variará de a partir de cerca de 0,01 por cento a cerca de noventa e nove por cento de ingrediente ativo, preferivelmente de a partir de cerca de 0,1 a cerca de 70 por cento, sobretudo preferivelmente de a partir de cerca de 1 por cento a cerca de 30 por cento de ingrediente ativo em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável.
[00283] Os regimes de dosagem são ajustados para prover a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, um bolo único pode ser administrado, várias doses divididas podem ser administradas com o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais em forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma de dosagem unitária como aqui referido se refere a unidades fisicamente separadas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos sendo tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o carreador farmacêutico requerido. As especificações para as formas de dosagem unitárias descritas aqui são ditadas por e diretamente dependentes de (a) as características únicas do composto ativo e do efeito terapêutico particular a ser obtido e (b) os limites inerentes na técnica de composição tal como um composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.
[00284] Para administração do anticorpo, a dosagem varia de a partir de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e mais comumente 0,01 a 5 mg/kg, do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, formas de dosagem podem ser 0,3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar compreende administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez por mês, uma vez a cada 3 meses ou uma vez a cada 6 meses. Regimes de dosagem preferidos para um anticorpo descrito aqui incluem 1 mg/kg de peso corporal ou 3 mg/kg de peso corporal através de administração intravenosa, com o anticorpo sendo dado usando um dos programas de dosagem que seguem: (i) a cada quatro semanas para seis dosagens, então a cada três meses; (ii) a cada três semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal uma vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal a cada três semanas.
[00285] Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com especificidades de ligação diferentes são administrados simultaneamente, caso em que a dosagem de cada anticorpo administrado se encaixa nas faixas indicadas. Anticorpo é geralmente administrado em ocasiões múltiplas. Intervalos entre dosagens únicas podem ser, por exemplo, semanalmente, mensalmente, a cada três meses ou anualmente. Os intervalos podem ser também irregulares conforme indicado pela medição dos níveis sanguíneos de anticorpo para o antígeno-alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para obter uma concentração de anticorpo no plasma de cerca de 1-1000 um e em alguns métodos cerca e 25-300 ug/ml.
[00286] Um anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada, caso em que administração menos frequente é requerida. Dosagem e frequência variam dependendo da meia-vida do anticorpo no paciente. Em geral, anticorpos humanos mostram a meia-vida mais longa, seguido por anticorpo humanizados, anticorpos quiméricos e anticorpos não humanos. A dosagem e a frequência de administração podem variar dependendo de se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente infrequentes durante um período de tempo longo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento para o resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é algumas vezes requerida até progressão da doença ser reduzida ou terminada e, preferivelmente, até o paciente mostrar melhora parcial ou completa de sintomas de doença. Em seguida, o paciente pode ser administrado com um regime profilático.
[00287] Níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas descritas aqui podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição e modo de administração particular, sem ser tóxica para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos incluindo a atividade das composições particulares descritas aqui empregadas, ou do éster, sal ou amida do mesmo, da via de administração, do tempo de administração, da taxa de excreção do composto particular sendo empregado, da duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, da idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história médica anterior do paciente sendo tratado, e fatores similares bem conhecidos no campo da medicina.
[00288] Uma "dosagem terapeuticamente eficaz" de um anticorpo descrito aqui resulta preferivemente em uma diminuição na severidade de sintomas da doença, um aumento em frequência e duração de períodos livres de sintoma da doença ou uma prevenção de prejuízo ou incapacidade devido à aflição da doença. No contexto de câncer, uma dose terapeuticamente eficaz evita preferivelmente deterioração adicional de sintomas físicos associados com câncer. Sintomas de câncer são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, características incomuns de verruga, uma mudança na aparência de uma verruga, incluindo assimetria, limite, cor e/ou diâmetro, uma área da pele recém-pigmentada, uma verruga anormal, área escurecida sob a unha, nódulos na mama, mudanças no mamilo, cistos na mama, dor na mama, morte, perda de peso, fraqueza, fadiga excessiva, dificuldades para comer, perda de apetite, tosse crônica, piora de falta de ar, tosse com sangue, sangue na urina, sangue nas fezes, náusea, vômito, metástases para o fígado, metástases para o pulmão, metástases para os ossos, plenitude abdominal, gases, fluido na cavidade peritoneal, sangramento vaginal, constipação, distensão abdominal, perfuração do cólon, peritonite aguda (infecção, febre, dor), dor, sangue no vômito, sudorese forte, febre, hipertensão, anemia, diarreia, icterícia, vertigem, calafrios, espasmos musculares, metástases para o cólon, metástases para o pulmão, metástases para a bexiga, metástases para o fígado, metástases para Os OSSOS, metástases para os rins e metástases para o pâncreas, dificuldade em engolir a similar.
[00289] Uma dose terapeuticamente eficaz pode prevenir ou retardar o início de câncer, como pode ser desejado quando sinais iniciais ou preliminares da doença estão presentes. Testes de laboratório utilizados no diagnóstico de câncer incluem químicas, hematologia, sorologia e radiologia. Desta maneira, qualquer ensaio clínico ou bioquímico que monitore qualquer um dos acima pode ser usado para determinar se um tratamento particular é uma dose terapeuticamente eficaz para tratamento de câncer. Um versado comum na técnica seria capaz de determinar tais quantidades com base em fatores tais como o tamanho do indivíduo, a severidade dos sintomas do indivíduo e a composição ou via de administração particular selecionada.
[00290] Uma composição descrita aqui pode ser administrada através de uma ou mais vias de administração usando um ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Como será compreendido pelo versado na técnica, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados. Vias de administração preferidas para anticorpos descritos aqui incluem intravenosa, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras vias de administração parenterais, por exemplo, através de injeção ou infusão. A expressão "administração parenteral" como aqui usado significa modos de administração outros que não administrações enteral e tópica, geralmente através de injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradermal, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural e intrasternal.
[00291] —Alternativamente, um anticorpo descrito aqui pode ser administrado através de uma via não parenteral, tal como uma via de administração tópica, epidermal ou mucosal por exemplo, intranasalmente, oralmente, vaginalmente, retalmente, sublingualmente ou topicamente.
[00292] Os compostos ativos podem ser preparados com carreadores que protegerão o composto contra liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos e sistemas de administração microencapsulados. Polímeros biocompatíveis, biodegradáveis, podem ser usados, tais como etileno acetato de vinila, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para as preparações de tais formulações são patentes ou geralmente conhecidos daqueles versados na técnica. Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.
[00293] “Composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade preferida, uma composição terapêutica descrita aqui pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, tais como os dispositivos revelados nas Patentes U.S. Nos.
5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; ou
4.596.556. Exemplos de implantes e módulos bem conhecidos para uso com anticorpos descritos aqui incluem: Patente U.S. No.
4.487.603, que revela uma bomba de microinfusão implantável para aplicação de medicação em uma taxa controlada; Patente U.S. No.
4.486.194, que revela um dispositivo terapêutico para administração de medicamentos através da pele; Patente U.S. No. 4.447.233, que revela uma bomba de infusão de medicação para administração de medicação em uma taxa de infusão precisa; Patente U.S. Nº.
4.447.224, que revela um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para administração de fármaco contínua; Patente U.S. No.
4.349.196, que revela um sistema de administração de fármaco osmótico tendo compartimentos com camaras duplas; e Patente U.S. No. 4.475.196, que revela um sistema de administração de fármaco osmótico. Essas patentes são aqui incorporadas a título de referência. Muitos outros implantes, sistemas de administração e módulos do tipo são conhecidos daqueles versados na técnica.
[00294] Em certas modalidades, os anticorpos descritos aqui podem ser formulados para assegurar distribuição apropriada in vivo. Por exemplo, a barreira sangue-cérebro (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para assegurar que os compostos terapêuticos descritos aqui cruzem a BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomos. Para métodos de fabricação de lipssomos, vide, por exemplo, Patentes U.S. 4.522.811;
5.374.548; e 5.399.331. Os lipossomos podem compreender uma ou mais porções que são seletivamente transportadas para células ou órgãos específicos, desta maneira aumentam a administração de fármaco direcionada (vide, por exemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Porções de direcionamento exemplares incluem folato ou biotina (vide, por exemplo, Patente U.S. 5.416.016 para Low e outros); manosídeos (Umezawa e outros, (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticorpos (P.G. Bloeman e outros (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais e outros (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor A de proteína tensoativa (Briscoe e outros (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier e outros (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); vide também K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; 1.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.
VII. Usos e Métodos
[00295] Os anticorpos, composições de anticorpo e métodos descritos aqui têm várias utilidades in vitro e in vivo envolvendo, por exemplo, o tratamento de vários distúrbios, por exemplo, cânceres. Por exemplo, anticorpos descritos aqui podem ser administrados a células em cultura, in vitro ou ex vivo, ou a indivíduos humanos, por exemplo, in vivo. Portanto, são providos aqui métodos de tratamento de um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada, de modo que tratamento ocorre. São também providos aqui métodos de modificação de uma resposta imune em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo um anticorpo de modo que a resposta imune no indivíduo seja modificada. Preferivelmente, a resposta é potencializada, estimulada ou suprarregulada. No entanto, em outras modalidades, uma resposta imune é inibida.
[00296] Indivíduos preferidos incluem pacientes humanos nos quais potencialização de uma resposta imune seria desejável. Os métodos são particularmente adequados para tratamento de pacientes humanos tendo um distúrbio que pode ser tratado através do aumento de uma resposta imune (por exemplo, a resposta imunomediada por célula T) Em uma modalidade particular, os métodos são particularmente adequados para tratamento de câncer in vivo. Em uma modalidade, o indivíduo é um indivíduo carregando tumor e uma resposta imune contra o tumor é estimulada. Um tumor pode ser um tumor sólido ou um tumor líquido, por exemplo, um mal hematológico. Em certas modalidades, um tumor é um tumor imunogênico. Em certas modalidades, um tumor é não imunogênico. Em certas modalidades, um tumor é positivo para PD-L1. Em certas modalidades, um tumor é negativo para PD-L1. Um indivíduo também pode ser um indivíduo carregando vírus e uma resposta imune contra o vírus é estimulada.
[00297] São ainda providos métodos para inibição de crescimento de células de tumor em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo um anticorpo descrito aqui de modo que crescimento do tumor é inibido no indivíduo. São também providos métodos de tratamento de infecção viral em um indivíduo compreendendo administrar ao indivíduo um anticorpo descrito aqui de modo que a infecção viral é tratada no indivíduo.
[00298] São também compreendidos aqui métodos para depleção de células Tregs a partir do microambiente do tumor de um indivíduo tendo um tumor, por exemplo, tumor canceroso, compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo descrito aqui que compreende um Fc que estimula depleção de células Treg no microambiente do tumor. Um Fc pode ser, por exemplo, um Fc com função efetora ou função potencializada, tal como ligação ou tendo ligação potencializada a um ou mais receptores Fc de ativação.
[00299] Em certas modalidades, um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada se liga a uma molécula estimuladora e inibe sua atividade, isto é, é um antagonista de uma molécula estimuladora, ou o anticorpo se liga a uma molécula inibidora e estimula sua atividade, isto é, é um agonista de uma molécula inibidora. Tais anticorpos podem ser usados para tratamento de doença em que o sistema imune ou uma resposta imune deve ser sub- regulado, por exemplo, doenças autoimunes ou para prevenir rejeições de transplante. Câncer
[00300] São providos aqui métodos para tratamento de um indivíduo tendo câncer compreendendo administrar ao indivíduo anticorpo descrito aqui, de modo que o indivíduo é tratado, por exemplo, de maneira que crescimento de tumores cancerosos é inibido ou reduzido e/ou que os tumores regridem. Por exemplo, ativação de GITR por anticorpos anti-GITR pode potencializar a resposta imune a células cancerosas no paciente. O anticorpo pode ser usado sozinho para inibir o crescimento de tumores cancerosos. Alternativamente, o anticorpo pode ser usado em conjunto com um outro agente, por exemplo, outros agentes imunogênicos, tratamentos para câncer padrão ou outros anticorpos, como descrito abaixo.
[00301] Cânceres cujo crescimento pode ser inibido usando os anticorpos descritos aqui incluem cânceres tipicamente responsivos à imunoterapia. Exemplos não limitantes de cânceres para tratamento incluem carcinoma de célula escamosa, câncer de pulmão de pequenas células, câncer de pulmão de não pequenas células, câncer de pulmão de não pequenas células escamoso (NSCLC), não NSCLC, glioma, câncer gastrintestinal, câncer renal (por exemplo, carcinoma de células claras), câncer ovariano, câncer de fígado, câncer colorretal, câncer endometrial, câncer de rim (por exemplo, carcinoma de célula renal (RCC)), câncer de próstata (por exemplo, adenocarcinoma de próstata refratário a hormônio), câncer de tireoide, neuroblastoma, câncer pancreático, glioblastoma (glioblastoma multiforme), câncer cervical, câncer de estômago, câncer de bexiga, hepatoma, câncer de mama, carcinoma de cólon e câncer de cabeça e pescoço (ou carcinoma), câncer gástrico, tumor de célula germinativa, sarcoma pediátrico, assassina natural sinonasal, melanoma (por exemplo, melanoma maligno metastático, tal como melanoma maligno cutâneo ou intraocular), câncer ósseo, câncer de pele, câncer uterino, câncer da região anal, câncer testicular, carcinoma dos tubos falopianos, carcinoma do endométrio, carcinoma de cérvice, carcinoma da vagina, carcinoma da vulva, câncer do esôfago, câncer do intestino delgado, câncer do sistema endócrino, câncer da glândula paratireoide, câncer da glândula adrenal, sarcoma de tecido mole, câncer da uretra, câncer do pênis, tumores sólidos da infância, câncer da uretra, carcinoma da pélvis renal, neoplasma do sistema nervoso central (SNC), linfoma do SNC primário, angiogênese de tumor, tumor do eixo espinhal, glioma do tronco cerebral, adenoma da pituitária, sarcoma de Kaposi, câncer epidermoide, câncer de célula escamosa, linfoma de célula T, cânceres ambientalmente induzidos incluindo aqueles induzidos por asbestos, canceres relacionados a vírus (por exemplo, tumor relacionado a papiloma vírus humano (HPV)) e males hematológicos derivados de qualquer uma das duas principais linhagens de célula sanguínea, isto é, a linhagem de célula mieloide (que produz granulócitos, eritrócitos, trombócitos, macrófagos e mastócitos) ou linhagem de célula linfoide (que produz células B, T, NK e do plasma), tais como todos os tipos de leucemias, linfomas e mielomas, por exemplo, leucemias aguda, crônica, linfocítica e/ou mielógenas, tais como leucemia aguda (ALL), leucemia mielógena aguda (AML), leucemia linfocítica crônica (CLL) e leucemia mielógena crônica (CML), AML não diferenciada (MO), leucemia mieloblástica (M1), leucemia mieloblástica (M2; com maturação celular), leucemia promielocítica (M3 ou variante de M3 [M3V], leucemia mielomonocítica (M4 ou variante de M4 com eosinofilia [M4E]), leucemia monocítica (M5), eritroleucemia (M6), leucemia megacarioblástica (M7), sarcoma granulocítico isolado e cloroma; linfomas, tais como linfoma de Hodgkin (HL), linfoma não Hodgkin (NHL); linfomas de células B, linfomas de células T, linfoma linfoplasmacitoide, linfoma de células B monocitoides, linfoma de tecido linfoide associado à mucosa (MALT), linfoma anaplástico de grandes células (por exemplo, Ki 1+), leucemia/linfoma de células T do adulto, linfoma de células do manto, linfoma de células T angio imunoblástico, linfoma angiocêntrico, linfoma de células T intestinal, linfoma de células B mediastinal primário, linfoma T-Hinfoblástico precursor, T-linfoblástico; e linfoma/leucemia (T-Lbly/T-ALL), linfoma de células T periférico, linfoma linfoblástico, distúrbio linfoproliferativo pós-transplante, linfoma histiocítico verdadeiro, linfoma do sistema nervoso central primário, linfoma primário de efusão, linfoma linfoblástico (LBL), tumores hematopoiéticos de linhagem linfoide, leucemia linfoblástica aguda, linfoma difuso de grandes células B, linfoma de Burkitt, linfoma folicular, linfoma difuso histiocítico (DHL), linfoma imunoblástico de grandes células, linfoma linfoblástico B precursor, linfoma cutâneo de células T (CTCL) (também chamado micose fungoide ou síndrome de Sezary) e linfoma linfoplasmacitoide (LPL) com macroglobulinemia de Waldenstrom; mielomas, tal como mieloma de IgG, mieloma de cadeia leve, mieloma não secretor, mieloma latente (também chamado mieloma indolente), plasmocitoma solitário e mielomas múltiplos, leucemia linfocítica crônica (CLL), linfoma de célula pilosa; tumores hematopoiéticos de linhagem mieloide, tumores de origem mesenquimal, — incluindo — fibrossarcoma e — rabdomiossarcoma; seminoma, teratocarcinoma, tumores do sistema nervoso central e do sistema nervoso periférico, incluindo astrocitoma, schwannomas; tumores de origem mesenquimal, incluindo fibrossarcoma, rabdomiossarcoma e osteossarcoma; e outros tumores, incluindo melanoma, xeroderma pigmentoso, queratoacantoma, seminoma, câncer da tireoide folicular e teratocarcinoma, tumores hematopoiéticos de linhagem linfoide, por exemplo, tumores de células T e células B, incluindo, mas não limitado a, distúrbios de células T tal como leucemia T-prolinfocítica (T-PLL), incluindo do tipo de pequenas células e células cerebriformes; leucemia linfocítica granular grande (LGL) preferivelmente do tipo de células T; linfoma hepatosplênico T- NHL ad; linfoma de células T periférico/pós-tímico (subtipos pleomórfico e imunoblástico); linfoma de células T angiocêntricas
(nasal); câncer da cabeça ou pescoço, câncer renal, câncer retal, câncer da glândula tireoide; linfoma mieloide agudo, bem como qualquer combinação dos ditos cânceres. Os métodos descritos aqui também podem ser usados para tratamento de cânceres metastáticos, cânceres refratários (por exemplo, cânceres refratários a imunoterapia anterior, por exemplo, com anticorpo de bloqueio CTLA-4 ou PD-1) e cânceres recorrentes. Terapias de Combinação
[00302] Em adição às terapias providas acima, os anticorpos descritos aqui também podem ser usados em combinação com uma outra terapia. Por exemplo, para tratamento de câncer, um anticorpo descrito aqui pode ser administrado a um indivíduo que está também recebendo um outro tratamento para câncer, tal como quimioterapia, radiação, cirurgia ou terapia genética.
[00303] “Métodos de tratamento podem incluir coadministração de um anticorpo descrito aqui (por exemplo, um anticorpo antagonista, anticorpo agonista e ADC tendo uma região constante de cadeia pesada modificada) com uma outra molécula, por exemplo, anticorpo (por exemplo, um anticorpo antagonista, anticorpo agonista e ADC). Um anticorpo descrito aqui que estimula o sistema imune pode ser administrado com uma outra molécula que estimule o sistema imune, por exemplo, uma molécula que é um agonista de uma molécula coestimuladora ou um inibidor de uma molécula inibidora.
[00304] Um anticorpo descrito aqui sozinho ou com um ou mais anticorpos de estimulação imune adicionais (por exemplo, bloqueio de CTLA-4 e/ou PD-1 e/ou PD-L1 e/ou LAG-3) pode ser combinado com tratamentos para câncer padrão. Por exemplo, um anticorpo descrito aqui sozinho ou com um ou mais anticorpos adicionais pode ser efetivamente combinado com regimes quimioterapêuticos. Nesses casos, pode ser possível reduzir a dose de outro reagente quimioterapêutico administtado com a combinação da presente invenção (Mokyr e outros (1998) Cancer Research 58: 5301-5304). Um exemplo de tal combinação é uma combinação de um anticorpo descrito aqui, com ou sem um anticorpo adicional, ainda em combinação com decarbazina ou IL-2 para o tratamento de melanoma.
[00305] Um anticorpo descrito aqui pode ser combinado com um anticorpo antineoplástico, tal como Rituxanº (rituximabe), Herceptinº (trastuzumabe), Bexxarº (tositumomabe), Zevalinº (ibritumomabe), Campathº (alemtuzumabe), Lymphocideº (eprtuzumabe), Avastinº (bevacizumabe) e Tarcevaº (erlotinibe) e similar. Anticorpos descritos aqui também podem ser combinados com um ou mais dos agentes quimioterapêuticos que seguem: camptotecina (CPT-11), 5-fluoruracila (5-FU), cisplatina, doxorrubicina, irinotecano, paclitaxel, gemcitabina, cisplatina, paclitaxel, carboplatina-paclitaxel (Taxol), doxorrubicina, 5- fu ou camptotecina + apo2l/TRAIL (a 6X combo)); um inibidor de proteassoma (por exemplo, bortezomibe ou MG132); um inibidor de Bcl-2 (por exemplo, BH31-2' (inibidor de bcl-xl), inibidor de indoleamina dioxigenase-1 (IDO1) (por exemplo, INCB24360), AT-101 (R-(-)- derivado de gossipol), ABT-263 (molécula pequena), GX-15-070 (obatoclax) ou antagonistas de MCL-1 (proteína-1 de diferenciação de célula de leucemia mieloide), antagonistas de iAP (inibidor da proteína de apoptose) (por exemplo, smac7, smac4, mimético de smac de molécula pequena, peptídeos smac sintéticos (vide Fulda e outros, Nat Med 2002;8:808-15), ISIS23722 (LY2181308) ou AEG-35156 (GEM- 640)), inibidores de HDAC (histona desacetilase), anticorpos anti- CD20 (por exemplo, rituximabe), inibidores de angiogênese (por exemplo, bevacizumabe), agentes antiangiogênicos se direcionando a VEGF e VEGFR (por exemplo, Avastina), triterpenoides sintéticos (vide Hyer e outros, Cancer Research 2005;65:4799-808), moduladores de c-FLIP (proteína inibidora de FLICE celular) (por exemplo, ligantes naturais e sintéticos de PPARy (receptor y ativado por proliferador de peroxissoma), 5809354 ou 5569100), inibidores de cinase (por exemplo, Sorafenib)) Trastuzumabe, Cetuximabe, Temsirolimus, inibidores de mTOR tais como rapamicina e temsirolimus, Bortezomibe, inibidores de JAK2, inibidores de HSP90, inibidores de PISK-AKT, Lenalildomida, inibidores de GSK3BE, inibidores de IAP e/ou fármacos genotóxicos.
[00306] Os anticorpos e terapias com anticorpo de combinação descritos aqui podem ser ainda usados em combinação com um ou mais agentes citotóxicos antiproliferativos. Classes de compostos que podem ser usados como agentes citotóxicos antiproliferativos incluem os, mas não estão limitados aos, que seguem: agentes de alquilação (incluindo, sem limitação, nitrogênio mostardas, derivados de etilenoimina, alquil sulfonatos, nitrosoureias e triazenos); Uracil mostarda, Clormetina, Ciclofosfamida (CYTOXANTY) fosfamida, Melfalano, Clorambucil, Pipobromano, Trietilenomelamina, Trietilenotiofosforamina, Bussulfano, Carmustina, Lomustina, Estreptozocina, Dacarbazina e Temozolomida.
[00307] —Antimetabolitos (incluindo, sem limitação, antagonistas de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inibidores de adenosina desaminase): Metotrexato, 5-Fluoruracila, Floxuridina, Citarabina, 6-Mercaptopurina, 6-Tioguanina, Fosfato de fludarabina, Pentostatina e Gemcitabina.
[00308] Agentes antiproliferativos adequados para combinação com anticorpos descritos aqui, sem limitação, taxanos, paclitaxel (paclitaxel está comercialmente disponível como TAXOLº), docetaxel, discodermolídeo (DDM), dictiostatina (DCT), Pelorusida A, epotilonas, epotilona A, epotilona B, epotilona C, epotilona D, epotilona E, epotiona F, furanoepotiona D, desoxiepotilona Bl, [17]- desidrodesoxiepotilona B, [18]desidrodesoxiepotilonas B, C12,13-
ciclopropil-epotilona A, epotilona em ponte A C6-C8, trans-9,10- desidroepotilona D, cis-9,10-desidroepotilona D, 16-desmetilepotilona B, epotilona B10, discoderomolídeo, patupilona (EPO-906), KOS-862, KOS-1584, ZK-EPO, ABJ-789, XAAZ96A (Discodermolídeo), TZT- 1027 (soblidotina), ILX-651 (cloridrato de tasidotina), Halicondrina B, Mesilato de eribulina (E-7389), Hemiasterlina (HTI-286), E-7974, Cirptoficinas, LY-355703, Imunoconjugados maitansinoides (DM-1), MKC-1, ABT-751, T1-38067, T-900607, SB-715992 (ispinesibe), SB- 743921, MK-0731, STA-5312, eleuterobina, 17beta-acetoxi-2-etoxi-6- oxo-B-homo-estra-1,3,5(10)-trien-3-ol, ciclostreptina, isolaulimalida, laulimalida, 4-epi-7-desidroxi-14,16-didemetil-(+)-discodermolídeos e criptotiona 1, em adição a outros agentes de estabilização de microtubulina conhecidos na técnica.
[00309] Tratamentos de combinação podem ser administrados simultaneamente ou sequencialmente. Em certos exemplos, combinações são combinações de dose fixas.
[00310] Em casos onde é desejável tornar células aberrantemente proliferativas quiescentes em conjunto com ou antes do tratamento com os anticorpos descritos aqui, hormônios e esteroides (incluindo análogos sintéticos), tais como 17a-Etinilestradiol, Dietilestilbestro|, Testosterona, — Prednisona, — Fluoximesterona, Propionato de dromostanolona, Testolactona, Megestrolacetato, Metilprednisolona, Metil-testosterona, = Prednisolona, Triamcinolona, Clorotrianiseno, Hidroxiprogesterona, Aminoglutetimida, Estramustina, Medroxiprogesteroneacetato, Leuprolida, Flutamida, Toremifeno, ZOLADEXTY, podem ser também administrados ao paciente. Quando empregando os métodos ou composições descritos aqui, outros agentes usados na modulação de crescimento de tumor ou metástase em um ambiente clínico, tais como antimiméticos, podem ser também administrados como desejado.
[00311] Métodos para a administração segura e eficaz de agentes quimioterapêuticos são conhecidos daqueles versados na técnica. Ainda, sua administração é descrita na literatura padrão. Por exemplo, a administração de muitos agentes terapêuticos é descrita no Physicians' Desk Reference (PDR), por exemplo, edição de 1996 (Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, USA); cuja descrição é aqui incorporada a título de referência.
[00312] O(s) agente(s) quimioterapêutico(s) e/ou terapia de radiação pode ser administrado de acordo com protocolos terapêuticos bem conhecidos na técnica. Será aparente àqueles versados na técnica que a administração do agente(s) quimioterapêutico e/ou terapia de radiação pode ser variada dependendo da doença a ser tratada e dos efeitos conhecidos do(s) agente(s) quimioterapêutico(s) e/ou terapia de radiação naquela doença. Também, de acordo com o conhecimento do clínico versado, os protocolos terapêuticos (por exemplo, quantidades de dosagem e tempos de administração) podem ser variados em vista dos efeitos observados dos agentes terapêuticos administrados no paciente, e em vista das respostas observadas da doença aos agentes terapêuticos administrados.
[00313] A presente descrição é ilustrada ainda pelos exemplos que seguem, que não devem ser considerados como limitantes. Os teores de todas as figuras e todas as referências, sequências do Genbank, patentes e pedidos de patente publicados citados em todo o presente pedido são expressamente aqui incorporados a título de referência. Em particular, a descrição de pedidos PCT WO 09/045957, WO 09/073533, WO 09/073546, WO 09/054863, PCT/US2013/072918, PCT/US15/61632 e Publicação de Patente U.S. No. 2011/0150892 são aqui expressamente incorporados a título de referência.
EXEMPLOS Exemplo 1: internalização potencializada de anticorpos anti-CD3 com uma dobra de IgG2 em relação aos mesmos anticorpos com uma dobra não IgG2
[00314] Foi observado que anticorpo anti-CD73 derivado de hibridoma 11F11, que tem uma região constante de IgG2, é mais potente em ensaios de inibição de CD73 celular do que o anticorpo 11F11 como um IgG1 ou IgG1.1 (I9GG1 sem efetor), e mais potente do que outros anticorpos anti-CD73 tendo regiões constantes de IgG1. Com base pelo menos nesta observação, foi tomado como hipótese que atividade inibidora aumentada de anticorpos anti-CD73 tendo dobras de IgG2 em relação àqueles tendo dobras não IgG2, tais como dobras de IgG1, foi devido à internalização aumentada dos anticorpos. Para testar esta hipótese, anticorpos anti-CD3 tendo regiões constantes de I9G1 ou IgG2 ou porções das mesmas foram testados em ensaios de internalização.
[00315] Os anticorpos que foram usados são listados na Tabela 7 que provê as identidades de cada um dos domínios das regiões constantes (todas humanas) de cada anticorpo, incluindo mutações específicas se presente. Tabela 7 1D Nº 1D Nº Leno fremo fee fue eo ve dao e | C2198-I961.1 (A330S/P331S) L234A/L235E/G237A) (A330S/P331S) L234A/L235E/G237A) (A330S/P331S) 1SEQ ID Nº: de cadeia pesada de comprimento integral ?SEQ ID Nº de cadeia leve de comprimento integral
[00316] Os anticorpos foram feitos através da expressão das cadeias pesada e leve em células HEK296-6E e meio de cultura foi coletado 5 dias após transfecção.
[00317] Ligação dos construtos a FcyRs foi medida. Dados de ligação de hoD64 e hop32a-H131 para moléculas de I9gG1.1 e I9G2 estavam de acordo com valores esperados para os Fcs diferentes. I9G1.1f é o Fc mais inerte. I9G2 e I9G2-C2198 mostraram ligação a FcR típica para IgG2. Como esperado, dados para IgG2-C2198S-G1.1f sugerem ligação significantemente mais fraca do que IgG1 ou IgG2 do tipo selvagem, mas ligação aumentada comparado com IgG1.1f.
[00318] A afinidade dos anticorpos com CD73 humana foi medida para determinar se a mudança da região constante os afeta. As afinidades foram determinadas através de Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR) como segue. Cinética de ligação a CD73 e afinidade foram estudadas através de Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR) usando um instrumento Biacore T100 (GE Healthcare) a 25ºC. Este experimento testou a ligação do domínio N- terminal de hCD73 (consistindo nos resíduos 26-336 de CD73 humana; chamada N-hCD73) a anticorpos que foram capturados em superfícies de proteína A imobilizada. Para esses experimentos, proteína A (Pierce) foi imobilizada para uma densidade de 3000-4000 RU em células de fluxo 1-4 de um sensor chip CM5 (GE Healthcare) usando química de etil(dimetilaminopropil)carbodiimida (ECD)/N- hidroxissuccinimida (NHS), com bloqueio de etanolamina, em um tampão de processamento de HEPES 0,01M, pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tween 20 0,005% v/v. Experimentos de cinética foram realizados primeiro capturando anticorpos (5-10 ug/ml) nas superfícies da proteína A usando um tempo de contato de 30 s a 10 ul/min, com ligação de 600, 200, 66,7, 22,2, 7,4 e 2,5 nM de N-hCD73-his, usando um tempo de associação de 180 s e tempo de dissociação de 360 s em uma taxa de fluxo de 30 ul/min. O tampão de processamento para os experimentos cinéticos foi fosfato de sódio 10 mM, cloreto de sódio 130 mM, Tween 20 0,05%, pH 7,1. As superfícies foram regeneradas após cada ciclo usando dois pulsos de 30 s de glicina 10 mM, pH 1,5, em uma taxa de fluxo de 30 ul/min. Dados de sensorgramas foram duplamente referidos e então ajustados a um modelo Langmuir 1:1 usando software de avaliação Biacore T100 v2.0.4, para determinar a constante de taxa de dissociação (ka), a constante de taxa de dissociação (kd) e a constante de dissociação de equilíbrio (KD).
[00319] Os resultados são mostrados na Tabela 8. A tabela compila dados de experimentos diferentes. Para anticorpos para os quais dois conjuntos de números são mostrados, cada conjunto corresponde a dados obtidos em um experimento separado. Tabela 8 [Ge TO em Tem Tem] CAL ess es e CAL ese ess Te CL Esses Te Css ses Ts LC ss es Te EA ass e e
[00320] Os resultados indicam que a presença das regiões constantes diferentes em um anticorpo, por exemplo, CD73.10, não mudou a afinidade do anticorpo com CD73 humana.
[00321] A internalização de anticorpos anti-CD73 foi medida em dois ensaios diferentes. Ensaio de internalização de alto teor (ensaio de tempo fixo de duas horas
[00322] Os anticorpos anti-CD73 usados para testar internalização de CD73 dependente de anticorpo anti-CD73 em células Calu6 através da avalição de expressão celular após duas horas de incubação de anticorpo. Células (2.000 células/poço) em 20 ul de meio completo (Meio RPMI 1640Gibco — com soro bovino fetal inativado por calor a 10%) foram plaqueadas em placa Falcon 384 BD e cultivadas de um dia para o outro a 37ºC, CO2 5% e umidade 95%. Anticorpos anti-CD73 foram serialmente diluídos com tampão PBS contendo BSA 2,0% e adicionados 5 ul/poço na placa de célula. As células foram incubadas com anticorpos por duas horas a 37ºC, CO? 5% e umidade 95%, seguido por lavagem uma vez com tampão PBS. Formaldeído (final 4% em PBS) foi então adicionado à placa de célula a ul/poço, e a placa foi incubada em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, todo o líquido foi aspirado e as células foram lavadas uma vez com PBS 30 ul. Anticorpo de detecção (2,5 ug/poço de anti-CD73 Ab CD73.10.19G2C219S) foi adicionado a 15 ug/poço na placa de célula fixada. As células foram incubadas a 14ºC de um dia para o outro. No dia seguinte, a placa foi lavada duas vezes com tampão PBS, seguido pela adição de anticorpo secundário contendo Alexa-888 anti-humano de cabra e DAPI, tingida por uma hora em temperatura ambiente. Após 3 lavagens em tampão PBS, a placa teve imagem capturada em Arrayscan Vti (Cellomics, Pittsburgh, PA). IC5so e Ymax foram medidos. Ymax foi determinado comparando a uma dose de 100 nM de 11F11 como máximo interno. Todos os cálculos foram determinados como uma porcentagem de internalização comparado com este controle, que foi ajustado para 100%.
[00323] Os resultados são providos na Tabela 9 mm te Eee E me de ma fis Rb E leme fee o bre Tabela 9 ND = Não detectado NA = Não aplicável
[00324] Os resultados mostram que anticorpos anti-CD73 tendo uma dobra de IgG2 têm uma EC5o menor e Ymax maior.
[00325] Estudos de internalização cinética foram realizados para avaliar a taxa de internalização. Várias linhagens celulares foram testadas: células H2228, células HCC15, células Calu6 e NCI-H2030. Células (2.000 célculas/poço) em 20 ul de meio completo (Meio RPMI Media 1640 Gibco com soro bovino fetal inativado por calor 10%) foram plaqueadas em placa 384 BD Falcon e cultivadas de um dia para o outro a 37ºC, CO2 5% e umidade 95%. Anticorpos CD73 foram diluídos com tampão PBS contendo BSA 0,2% para 10 ugiml e adicionados 5 pg/ml na placa de células. As células foram incubadas com anticorpos por curso de tempo de 0-2 horas a 37ºC, seguido por lavagem uma vez com tampão PBS. As células foram subsequentemente fixadas com formaldeído (4% final em PBS) em temperatura ambiente por 10 minutos, e então lavadas uma vez com PBS 30 ul. Anticorpos de detecção (2,5 ug/poço de anti-CD73 Abs
CD73.10.19G62C219S) foram diluídos com tampão PBS contendo BSA 0,2%, e adicionados 15 ul/poço na placa de célula fixada. A placa foi incubada a 4ºC de um dia para o outro. No dia seguinte, após 3 lavagens em tampão PBS, Anticorpos secundários Alexa-488 anti- humano de cabra com DAPI foram adicionados. As células foram tingidas por 60 minutos em temperatura ambiente, após 3 lavagens, as imagens foram adquiridas usando Arrayscan Vti (Cellomics, Pittsburgh, PA). Os resultados são providos nas Figura 1A-J e Tabelas 10 e 11. Os valores na Tabela 10 derivam dos dados mostrados nas Figuras 1A-J.
Tabela 10 Linhagem celular | 11F11(19G2) | 6GE11(I9G1) | CD73.10.1961.1f Ti12 (min) Ti12 (min) Tv2 (min) eme se a rs
Tabela 11. Tire % de internalização de anticorpos CD73 em 4 linhagens de célula humanas [O ese Teses Tue Tem] ne ice Te interna- Te % Tr % Te % min lização min internalização min internalização | min | internalização ee o o ss [a] | Ig620S 41 85 emo ps e | [| [4] «| Ig620S 97 93 26 30 E EX 85 sen | e Je | [| [a] + | IgG2CS-I9G61.1f 94 92 30 31 E 43 87 CD73.4-19620S
SSNNNNINIINP CD73.10-1961.1f
SNNNANINIINA CD73.3-1961 1f
NNNNINNNN Fo EE EEE EA e ED Ds res] Er ED Ds e]
[00326] Os resultados indicam que 11F11 (um anticorpo 19G2) internalizou dentro de minutos, atingindo um platô em 30 minutos, enquanto 6E11 (um anticorpo IgG1) internalizou mais lentamente, atingindo um platô em cerca de 1 h (Figuras 1A-J). Similarmente, 11F11 com uma região constante de IgG1 internalizou mais lentamente do que 11F11 com uma região constante de I9G2. Essa tendência foi observada em várias linhagens celulares (Tabelas 10 e 11 e Figuras 1A-J). Internalização medida através de citometria de fluxo
[00327] Internalização de CD73 mediada por anticorpo anti-CD73 foi também testada através de citometria de fluxo. As células indicadas foram incubadas com 10 ug/mL do anticorpo indicado por 30 minutos em gelo, lavadas várias vezes e transferidas para 37ºC pelo tempo indicado. As células foram coletadas ao mesmo tempo após o tempo de incubação indicado. As células foram tingidas com anticorpo primário novamente (o mesmo anticorpo usado para incubação inicial) seguido por anticorpo secundário anti-humano. As células foram então ensaiadas quanto à expressão de CD73 através de citometria de fluxo.
[00328] Os resultados, que são mostrados na Figura 1E e Tabela 11, estão de acordo com aqueles obtidos nos ensaios de internalização descritos acima, e indicam que todos os anticorpos com dobra de IgG2 e CH1 induziram internalização rápida e completa. Os níveis de CD73 permaneceram baixos após 22 horas pós-eliminação, indicando que internalização é durável.
[00329] Resultados similares mostrados na Figura 1F e na Tabela 11 foram obtidos na linhagem celular NCI-H292 em que o anticorpo foi mantido em cultura durante o tempo de incubação (sem eliminação). Novamente, esses dados indicam internalização rápida e significante e manutenção de sub-regulagem de CD73 endógena.
[00330] Ensaios de internalização foram também conduzidos com as células SNU-C1 (linhagem celular de câncer de cólon) e NCI-H1437 (linhagem celular de carcinoma de pulmão de células não pequenas). Os resultados, que são mostrados nas Figuras 1|l e J, também indicam internalização rápida com um nível máximo atingido dentro de 5 horas e um nível máximo de internalização de cerca de 50% para CD73.4.19G2-C2198S-I9G1.1f em células SNU-C1 e 60% para NCI- H1437. As Figuras 1G e H mostram cinética de internalização similar de CD73.4.19G2-C219S-IgG1.1f em células Calu6 e NCI-H292. Para gráficos, que mostram % de CD73 internalizada, este número foi obtido como segue:
% CD73 internalizado = 100 — es nm x 100) MFl;=o — MFIvackxgrouna onde para cada anticorpo, MFlt=, é o MFI em um dado ponto de tempo e MFlr-o é a fluorescência máxima em t=O e MFlvackgrouna É O MFI do Ab secundário apenas. Tabela 12. EC5o de internalização de CD73 mediada por anticorpo em várias linhagens celulares (dados das Figuras 1G-l) Cave Notreso NU NU NoHIA3T NoHIA3T
CEI ESFRE Ymax | Tie(h) Ymax | Tielhe) max | Te max | Te max | Te max | Te Ceci erE TETE EG2-I8GL1f eo ee ee e62
EGLIF
[00331] Desta maneira, anticorpos anti-CD73 com uma dobra de IgG2 internaliza mais rápido e para um grau maior em relação a anticorpos anti-CD73 com uma dobra de IgG1. Exemplo 2: atividade agonista potencializada de anticorpos para GITR com uma dobra de IgG2 em relação aos mesmos anticorpos com uma dobra de I9G1
[00332] Este Exemplo demonstra que anticorpos anti-GITR compreendendo uma dobra de IgG2 têm uma habilidade aumentada em induzir secreção de IL-2 e IFN-y a partir de células em relação aos mesmos anticorpos que têm uma dobra de IgG1.
[00333] Tinha sido observado em ensaios de CHO-OKT3 e 3A9 descritos acima que anticorpos derivados de hibridoma, tendo uma região constante de IgG2, são mais potentes em estimulação de secreção de citocina do que os mesmos anticorpos em que a região constante de cadeia pesada foi trocada para aquela de IgG1 ou um IgG1 sem efetor (I9G1.1). Desta maneira, o efeito de uma região constante de IgG2 ou dobra foi testado mais em anticorpos anti-GITR nesses ensaios.
[00334] A região variável de cadeia pesada de um anticorpo para GITR anti-humano (SEQ ID Nº: 75) foi ligada às regiões constantes de cadeia pesada mostradas na Tabela 13. A cadeia leve dos anticorpos anti-GITR compreendia SEQ ID Nº: 77. A Tabela 13 mostra a identidade de cada domínio das regiões constantes. Tabela 13. Regiões constantes de cadeia pesada de anticorpos usados neste Exemplo ea TIE CRER CCR TR TE anteGITR 1962 1962 1962 962 SEQ ID SEQIDN7 | SEQIDNº8 SEQ ID Nº:9 SEQ ID Nº:52 Nº10 anti-GITR -lgG2 Ig62 1962 IgG2 1962 SEQ ID SEQIDNº7 | SEQIDNº8 SEQ ID Nº:9 SEQ ID Nº:52 Nº: 10 anti-GITR -lgG1 1961 1961 1961 1961 SEQ ID SEQIDN%2 | SEQIDNº3 SEQ ID Nº4 SEQ ID Nº:5 | Nº:53 ant-GITR 961.1 611 19611 9611 611 SEQD SEQ ID Nº:2 (L234A/L235E/G237A) | (A330S/P331S) SEQIDNº5 | Nº54 SEQ ID Nº:25 SEQ ID Nº:24 antrGITR-IgG2-961 — | IgG2 Híbrido de 962/1961 | IgG1 161 SEQD ou anti-GITR.92.91 SEQ ID Nº:7 SEQ ID Nº:22 SEQ ID Nº:4 SEQ ID Nº:5 | Nº:55 anti-GITR -lgG2-l9G1.1 | 1gG2 1g62 961.1 1961 SEQ ID ouantiGITRA2.91.1 | SEQIDN7 | SEQIDNº8 (A3308/P331S) SEQ ID Nº:5 | Nº:56 SEQ ID Nº:24 *SEQ ID Nº de região constante de cadeia pesada de comprimento integral
[00335] Primeiro, as afinidades de ligação desses anticorpos para GITR foram comparadas com aquelas de anticorpos para GITR tendo uma dobra de IgG1. As afinidades de ligação dos anticorpos anti-GITR com GITR solúvel foram determinadas através de Biacore como segue. Anticorpos anti-GITR foram capturados em chips revestidos de kappa humano (-5KRUs; Southernbiotech catf£2060-01) e GITR humano recombinante (rHGITR/Fc: R&D systems, CATH$689-GR) foi deixado fluir através do chip em concentrações de 500 nM, 250 nM, 125 NM, 62 nM e 31 nM. A concentração de captura do mAb/volume foi 2-40 ug/mL (5 ul a 10 uL/min). O tempo de associação de antígeno foi 5 minutos a 15 ulL/min, o tempo de dissociação de antígeno foi 6 minutos e regeneração foi realizada com HCI 50 MM/NaOH 50 mM (12 uL cada um a 100 uL/min).
[00336] Os resultados, que são mostrados na Figura 2, indicam que todos os três anticorpos para GITR tendo uma dobra de IgG2 têm afinidades similares com células T ativadas a anticorpos que têm região constante de IgG1 ou I9G1.1.
[00337] Em seguida, a habilidade de anticorpos para GITR tendo uma região constante de IgG1 ou dobra de IgG2/domínio Fc de I9G1 foi testada quanto à sua habilidade em induzir secreção de |L-2 e IFN- y a partir de células T doadoras humanas estimuladas com células CHO expressando anti-CD3scFv (OKT3) As células CHO expressaram níveis baixos de OKT3 para promover estimulação subótima para ser capaz de observar agonismo por anticorpos anti- GITR. Células T CD4+ de um doador foram estimuladas com células CHO expressando OKT3 e um anticorpo anti-GITR, e secreção de IL-2 e IFN-y foi medida. Os experimentos foram conduzidos como segue. Para experimentos com células T CD4+, células T CD4+ foram obtidas de PBMCs humanas com coquetel de enriquecimento de célula T CD4+ RossetteSep (StemCell Technology No. 15062) de acordo com o protocolo do fabricante. Células CHO expressando anti-CD3scFv (OKT3) (CHO-OKT3) foram lavadas duas vezes com meio RPM! e submetidas à irradiação com uma dosagem de 50K Rad. As células foram coletadas e ressuspensas em meio de cultura (RPMI-1640 suplementado com Soro Bovino Fetal 10%, L-glutamina 2 mM, B- mercaptoetanol 55 nM, piruvato de sódio 1 mM e
Penicilina/estreptomicina 100U/mL) a 2,5x10%/mL. 2,5x10º células CHO-OKT3 e 1x10º células T foram semeadas por poço em uma placa de fundo plano de grau TC de 96 poços (Costar). As células foram incubadas com uma titulação de 4 vezes, 8 pontos, de anticorpo para GITR começando em 40 pg/mL. Um hlgG1 irrelevante foi adicionado a 40 ugimLl como um controle de isotipo. Uma amostra com células apenas foi incluída para mostrar atividade de linha basal sem qualquer tratamento. Sobrenadante de cada amostra foi coletado no dia 2 para medição de I|L-2 (apenas para ensaios com células T CD4+) (BD opt EIA Human IL- 2 ELISA kit; BD Biosciencett555190) e no dia 3 para medição de IFN- y (BD optEIA human IFN-g ELISA Kit; BD Biosciencett555142).
[00338] Como mostrado nas Figuras 3A e B, o anticorpo com a dobra de IgG2/domínio Fc de IgG1 (anti-GITR.92.91) induziu secreção de ambos IL-2 e IFN-y a partir de células T para um grau maior do que o anticorpo com a região constante de IgG1 (anti-GITR.91). Resultados similares foram obtidos com as versões sem efetor desses domínios constantes (Figura 3C).
[00339] Para confirmar mais a ativação aumentada de células T com os anticorpos anti-GITR compreendendo uma dobra de IgG2, secreção de IL-2 em um formato experimental diferente foi testada. Neste experimento, a habilidade de anticorpos para GITR em induzir secreção de IL-2 a partir de células 3A9-hGITR (linhagem de célula 3A9 de hibridoma de célula T de camundongo expressando ectopicamente GITR humano) foi testada como segue. Linhagem de célula 3A9 de hibridoma de célula de camundongo que expressa ectopicamente GITR humano (3A9-hGITR) foi culturada em placas revestidas com anticorpo monocional anti-cCD3 na presença de quantidades crescentes dos anticorpos indicados. 5 x 10º células 3A9- hGITR foram culturadas em placas revestidas com 1 pg/ml de anticorpo anti-CD3 (Clone 145-2C11; BD Biosciences) e tratadas com as concentrações indicadas de anticorpos por 7 horas.
[00340] “Como mostrado na Figura 4, todos os anticorpos tendo a dobra de I9G2 (anti-GITR.9.2, anti-GITR.92.91f) e anti-GITR.92.91.f) induziram secreção de IL-2 a partir de células 3A9-hGITR para um grau maior do que suas contrapartes contendo região constante de I9G1 (anti-GITR.9g1f e anti-GITR.91.1f).
[00341] Esses resultados sugerem coletivamente que anticorpos anti-GITR tendo uma dobra de IgG2 e regiões constantes de g1 ou
91.1 são mais potentes do que os mesmos anticorpos tendo uma dobra de IgG1. Exemplo 3: impacto de combinações de dobra/Fc diferentes sobre tamanho de complexos de anticorpo/antígeno
[00342] “Como mostrado nos Exemplos acima, anticorpos anti-CD73 com uma dobra de IgG2 são inibidores melhores de atividade celular de CD73 e internalizam melhor do que os mesmos anticorpos com uma dobra de IgG1 e anticorpos anti-GITR com uma dobra de |IgG2 são agonistas mais potentes do que os mesmos anticorpos com uma dobra de IgG1. Com base nesta observação, e no fato que uma dobra de IgG2 é mais rígida do que uma dobra de IgG1, foi tomado como hipótese que complexos maiores são formados entre um antígeno e anticorpos tendo uma dobra de IgG2 em relação a anticorpos tendo uma dobra de IgG1. O experimento que segue foi conduzido para analisar esta hipótese.
[00343] A estrutura e estado oligomérico de complexos de CD73/anticorpo em solução foram examinados através de SEC-MALS e DLS. Para esses estudos, anticorpos contendo ou uma região constante de IgG1 ou I|IgG2 foram misturados em razões molares variantes com proteínas recombinantes compreendendo ou o domínio extracelular de comprimento integral de CD-73 humano contendo um marcador de poli-histidina C-terminal (resíduos de aminoácido 26-546 de CD73 humana, chamada hCD73-his) ou um fragmento correspondendo ao domínio N-terminal de CD73 humana (resíduos de aminoácido 26-336, chamados N-hCD73-his).
[00344] O estado oligomérico de complexos de CD73/anticorpo foi examinado através de cromatografia de exclusão de tamanho acoplada a um detector de espalhamento de luz de multiângulo em linha (SEC-MALS). Separações isocráticas foram realizadas em uma coluna Shodex PROTEIN KW-803 conectada a um Prominence Shimadzu UFLC em tampão contendo K2HPO. 200 mM, NaCl 150 mM, pH 6,8, contendo azida Na 0,02% (filtrado 0,1 um) correndo a 0,5 mL/min. As amostras foram injetadas na coluna usando um autoamostrador SIL-20AC Prominence Shimadzu, e os dados foram obtidos de três detectores em linha conectados em série: um espectrofotômetro UWV/vis de disposição de diodo seguido por um Wyatt miniDAWN'Y TREOS Multi-Angle Light Scattering Detector então um Wyatt Optilab T-rEX Refractive Index Detector. Os dados foram coletados e analisados usando software Astra (Wyatt) e Labsolutions (Shimadzu).
[00345] Estudos de espalhamento de luz dinâmico (DLS) foram realizados em uma leitora de placa Wyatt DynaPro em placas de 384 poços a 25ºC. Parâmetros experimentais foram 20 aquisições de 5s cada por medição, e as medições foram registradas em quadruplicata, com a média e desvio padrão relatados. Funções de autocorrelação de intensidade foram ajustadas usando o algoritmo "Regularization" no software Dynamics (Wyatt Technologies).
[00346] Um sumário do SEC-MALS e DLS é provido na Figura 6 e na Figura 7. Análise dos anticorpos sozinhos mostra tempos de retenção (ceca de 16-17 min), massas (140-150 kDa) e raios hidrodinâmicos (5,0-5,4 nm) para cada anticorpo que são típicos para um anticorpo monoclonal monomérico. Os dados para a proteína hCcD73-his estão de acordo com a proteína adotando a estrutura dimérica esperada em solução; em particular, a massa determinada a partir dos dados de SEC-MALS (120 kDa) está de acordo com aquela esperada para um dímero de CD73-his (117 kDa) e não está de acordo com o que seria esperado para um monômero de hCD73-his (58,5 kDa). Os dados para N-hCD73 estão de acordo com a proteína de domínio N recombinante sendo monomérica em solução (massa medida em SEC-MALS = 38 kDa, comparado com massa monomérica esperada = 35,0 kDa), o que é esperado porque a região do domínio extracelular de CD73 de comprimento integral que é responsável pela dimerização da proteína está contida dentro do domínio C-terminal sem contribuição de resíduos de domínio N.
[00347] Misturas equimolares de um dado anticorpo com N-hCD73- his foram verificadas eluir como uma espécie única no SEC com tempo de retenção menor do que o anticorpo ou N-hCD73-his sozinho, bem como raios hidrodinâmicos (Rh) maiores por DLS, que está de acordo com a formação de complexos. Dados MALS indicam massas para esses complexos de aproximadamente 210 kDa. Isso está de acordo com uma molécula N-hCD73-his ligada a cada um dos dois domínios Fab de um dado anticorpo para formar um complexo de anticorpo:N-hCD73-his 1:2.
[00348] Dados de SEC-MALS para misturas de anticorpos anti- CD73 com dímero de hCD73-his mostram que a mistura elui antes do que ou o hcD73-his ou anticorpo sozinho, sugerindo que complexos são formados. Comparação dos dados para mAbs que contêm a mesma região variável, mas domínios constantes diferentes, mostra que os tempos de eluição para os complexos de hCD73-his com mAbs contendo domínios constantes de I9G2 (I9G2-C219S, IgG2-C219S- IgG1.1f) são mais cedo do que aqueles para complexos de hcD73-his com mAbs contendo um domínio constante de IgG1.1f. Ainda, as massas determinadas por MALS para complexos de hocD73-his com mAbs contendo um domínio constante de IgG2 são maiores do que aquelas para complexos de hCD73-his com mAbs contendo um domínio constante de IgG1. Dados de DLS mostram ainda que os raios hidrodinâmicos de complexos de hcD73-his com mAbs contendo um domínio constante de IgG2 são maiores do que aqueles para complexos de hcD73-his com mAbs contendo um domínio constante de IgG1. Por exemplo, os dados de SEC-MALS e DLS para CD73.4 com três regiões constantes diferentes (IG9G2-C219S, I9G2-C219S- I9G1.1f ou I9G1.1f) são mostrados na Figura 5. Aqui pode ser visto que o complexo de hCD73-his com CD73.4 contendo o domínio constante de IgG2 tem tempos de retenção mais curtos (Figura 5A), raios hidrodinâmicos maiores (Figura 5B) e massas determinadas por MALS maiores (Figura 5C), comparado com os complexos de hcD73- his com CD73.4-l9G1.1f. Com base nas massas de MALS um modelo esquemático para estrutura e estequiometria dos complexos entre hCD73-his e os anticorpos é mostrado na Figura 5D, onde complexos contendo CD73.4-I9G1.1f formam predominantemente complexos de dímero 2:2 (pico | = -550 kDa) ou 4:4 mAb/CD73 menores (pico 2 = —-1300 kDa), enquanto CD73.4-I9G2-C2198S ou CD73.4-I9G2-C219S- I9G1.1f forma complexos muito maiores (>3000 kDa) com hcD73-his, para os quais estrutura e estequiometria precisas não podem ser modeladas confiavelmente.
[00349] —Coletivamente os dados de SEC-MALS e DLS demonstram que complexos maiores são formados entre hCD73-his e mAbs contendo uma região de dobra de I9gG2 (IgG2-C2198S ou IgG2-C219S- I9G1.1f), comparado com aqueles contendo a região de dobra de I9G1 (I9G1.1f).
Exemplo 4: CH1 de Isotipo IgG2 melhora mais a internalização de CD73 mediada por anticorpo
[00350] Ensaios de internalização adicionais foram conduzidos em células Calu6 e H292 para discriminar mais o papel de isotipo sobre internalização. Os ensaios de internalização foram conduzidos como descrito nos Exemplos 1A e 1B (protocolo de citometria de fluxo sem a etapa de eliminação dos anticorpos), e os anticorpos de isotipos híbridos variantes mostrados na Tabela 14 foram mantidos em cultura a 10 ug/mL durante o tempo de incubação. Para os experimentos de citometria de fluxo, o método do Exemplo 1B foi adaptado para análise de alto rendimento em placas de 96 poços (oposto a placas de 48 poços) e com 50.000 células por cavidade. Tabela 14. Regiões constantes testadas com as regiões variáveis de CD73.4 io | 5 Entieententates | essa | so liedorasiperorde ana tudo mantem | lacaserar | so er e dobra superior de jgG2.5, tudo mais igGtf | lacaspustmr | ss —— Jigua3 com sequência THT (de 1961) adicionada à dobra
[00351] Ligação a FcyR foi mostrada ser como esperado para cada construto, isto é, ligação a FcyR é dirigida por região de dobra/CH2 inferior.
[00352] Os resultados são mostrados nas Figuras 8A, Be C e nas Tabelas 15 e 16. Dados mostrados na Tabela 15 foram gerados usando os mesmos protocolos descritos no Exemplo 1B (sem eliminação dos anticorpos). Os dados mostrados na Tabela 16 foram gerados usando o mesmo protocolo descrito no Exemplo 1A. Tabela 15. Ymax e T12 de internalização de CD73 mediada por anticorpo em células Calu6 e NCI-292 Po eme | nor — | Ymax Tie (hr) Ymax Ti (hr) (%) (%)
Tabela 16. Características de internalização de CD73.4 com várias regiões constantes em células Calu6 Internalização CD73 mAb Clones Max Velocidade
[00353] As Figuras 8A-C e Tabelas 15 e 16 indicam que anticorpos tendo uma dobra e domínio CH1 do isotipo IgG1 são os mais eficientes em dirigir internalização de CD73, enquanto os anticorpos que têm uma dobra e domínio CH1 de IgG1 correspondem às curvas menores na figura, isto é, grau de internalização menor. Ainda, anticorpos com apenas a dobra de I|gG2 têm uma internalização aumentada comparado com uma dobra de IgG1 humana. Desta maneira, anticorpos tendo uma dobra e domínio CH1 do isotipo I9G2 têm características de internalização superiores em relação aos anticorpos com um isotipo IgG1.
[00354] Desta maneira, anticorpo anti-CD73 mAb-CD73.4-I9G2CS- I9G1.1f (tendo uma dobra de IgG2 com substituição de C2198S e um domínio CH1 de IgG2) induziu internalização rápida dependente de linhagem celular testada. A T1/2 para internalização variou de minutos a menos de uma hora. A maioria das linhagens celulares testadas tinha uma T1/2 abaixo de 10 minutos. Uma internalização quase que completa foi induzida para algumas linhagens de célula e a maioria testada tinha pelo menos uma redução de 50% em expressão de CD73 na superfície que tipicamente atingiu níveis máximos em 5 horas, muito mais curto em alguns casos. Exemplo 5: CH1 de IgG2 potencializa a secreção de IL-2 induzida por Ab GITR por células T CD4+
[00355] Este Exemplo mostra que um domínio CH1 do isotipo I9gG2 potencializa atividade de célula T induzida por anticorpo anti-GITR, em relação ao anticorpo com um domínio CH1 do isotipo I9G1.
[00356] As mesmas regiões constantes de cadeia pesada que foram usadas no Exemplo 4 foram ligadas a regiões variáveis do anticorpo anti-GITR (do Exemplo 2). Células T CD4+ doadoras foram incubadas com células CHO expressando OKT3-scFv e os vários anticorpos anti-GITR, e o nível de IL-2 secretada foi medido. Isso foi conduzido como descrito no Exemplo 2.
[00357] Os resultados, que são mostrados na Figura 9, indicam que todos os anticorpos anti-GITR tendo um domínio CH1 do isotipo IgG2, em adição a uma dobra do isotipo IgG2, são mais eficazes na estimulação de secreção de IL-2 a partir de células T CD4+ do que aqueles tendo uma dobra de IgG1 e CH1.
[00358] Desta maneira, esse Exemplo mostra que a presença de uma dobra de IgG2 e domínio CH1 de I9gG2 em um anticorpo anti- GITR agonista potencializa mais a atividade agonista do anticorpo em relação ao mesmo anticorpo que não tem uma dobra e/ou um domínio CH1 do isotipo de I9G2. Um anticorpo tendo ambos uma dobra e um domínio CH1 do isotipo I9G2 tem um efeito agonista mais forte em relação a um anticorpo tendo uma dobra, mas não CH1, do isotipo I9G2. Ainda, um anticorpo com um domínio CH1 de IgG2 tem uma atividade agonista mais forte do que um anticorpo com um domínio CH1 de isotipo IG1. Um anticorpo com uma dobra de IgG2 e um domínio CH1 de IgG1 tem atividade agonista mais forte do que um anticorpo com um CH1 e dobra de isotipo I9G1. Exemplo 6: relevância de certos resíduos de aminoácido em CH1 de IgG2 e dobra em melhoria de internalização de CD73 mediada por anticorpo
[00359] — Anticorpos anti-CD73 (CD73.4) com as regiões constantes de cadeia pesada mostradas na Tabela 17 foram preparados e testados como descrito acima em ensaios de internalização de CD73 mediados por anticorpo.
Tabela 17. Regiões constantes de cadeia pesada que foram fundidas a regiões variáveis anti-CD73 Descrição Construtos SEQ ID NO de região constante Também, mutante Cys>Ser para reduzir G2.5-G1-G1-G1 95 heterogeneidade de dissulfeto potencial: | pon ore gor comido mas tda s | oras ss Trocar regiões CH1 em IgG1 com aquelas de | eTKRGEESS gg [e Trocar regiões CH1 em IgG2 com aquelas de IgG1 com resíduos de domínio CH2 de IgG2: IgG2 com resíduos de domínio CH2 G62.5-G2.3-G1-G2-KH Trocar regiões de dobra entre I9G1 é [| T75.GLG62.G2-AY Truncações de dobra -
[00360] Os resultados, que são mostrados na Figura 10, proveem a informação que segue no contexto de internalização de CD73:
[00361] e Domínio CH2 não parece ter um impacto como mostrado por
[00362] oa) pouquíssima diferença em habilidade de internalização foi observada entre os anticorpos compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada com formato "AY" (tendo a dobra de IgG2 ERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID Nº: 8) em relação àqueles com formato "KH" (ERKCCVECPPCPAPELLGG (SEQ ID Nº: 22) (Conjuntos 5, 6 e 7);
[00363] ob) trocasdeCH2 são comparáveis a G1 ou G2 do tipo selvagem (Conjuntos 5 e 6); e
[00364] oc) oresíduo237 não tem nenhum impacto sobre internalização: nem a adição de um resíduo "G" a uma dobra de IgG2 nem a deleção de "G" do terminal C em uma dobra de IgG1 afetou a normalização (Conjunto 9).
[00365] Isso sugere que o domínio CH2 não impacta a internalização (isto é, o domínio CH2 pode ser de IgG1 ou 19G2);
[00366] e Mudança das regiões CH1 indicadas no Conjunto 3 (KRGEGSSNLF; KRGEGS; SNLF; ITNDRTPR e SNLFPR) em IgG1 com aquelas de IgG2 provê pouco benefício, isto é, a internalização permanece similar àquela de IgG1; vide Conjunto 3);
[00367] e Mudança das regiões CH1 indicadas no Conjunto 4 (RKEGSGNSFL; RKEGSG; NSFL; TIDNTRRP e NSFLRP) em IgG2 com aquelas de IgG1 tem impacto variável; mudança de NSFL não tem impacto, enquanto as outras 2 regiões (RKEGSG & RP) estão envolvidas (vide Conjunto 4). Com base nos resultados de Conjuntos 3 e 4, parece que há uma interação entre a região de CH1 e a dobra, com regiõêês RKEGSG e RP sendo mais importantes do que região NSFL;
[00368] e A região de dobra impacta a internalização, isto é, a dobra de IgG2 provê melhor normalização em relação à dobra de I9G1 (vide Conjuntos 7 e 8). Ainda, IGG1 com uma deleção (dobra G1-delta) melhora a internalização com relação a IgG1. IgG2 com uma deleção (dobra G2-delta) provê um nível similar de internalização em relação àquela de uma dobra de |gG2. Isso sugere que a região de dobra impacta internalização, cujo efeito é aumentado por um CH1 de IgG2 (G2-G1-G2-G2-AY é comparável a G1-G2-G1-G1-AY);
[00369] e IgG2.4(C220S) tem internalização similar ou reduzida comparado com IgG2.3 (C219S). IgG2.3/4 (C219S/C220S) tem internalização muito reduzida comparado com IgG2.3 ou I1g9G2.4 sozinho (vide Conjunto 10). Isso sugere que internalização de um anticorpo com uma dobra de IgG2 e C219S é mais ou menos aquela de uma dobra de IgG2 com C2208S, ambas são muito melhores do que aquela de uma dobra de IgG2 com ambas C219S e C220S;
[00370] e IgG25 (mutação C131S) tem internalização reduzida comparado com construtos com C131 (Vide Conjuntos 1,6 e 7).
[00371] Desta maneira, esses resultados indicam que o domínio CH1 e a dobra são ambos relevantes na internalização de CD73 mediada por anticorpo, e que um anticorpo tendo as sequências de IgG2 desses domínios é internalizado com eficácia melhor com relação a um anticorpo tendo essas regiões de I9G1. Exemplo 7: anticorpos tendo uma dobra e/ou domínio CH1 de IgG2 formam complexos de peso molecular alto
[00372] Anticorpos CD73.4 tendo as regiões constantes de cadeia pesada mostradas na Tabela 14 foram também testados quanto à formação de complexos de peso molecular alto através de experimentos sec-MALS e DLS, como descrito no Exemplo 3.
[00373] Três dos 16 anticorpos neste estudo foram testados previamente: CD73.4-19G1.1f, CD73.4-I9G62-C2198S (também chamado
CD73.4-I9G62.3) e CD73.4-I9G62-C2198-I9G1.1f (também chamado CD73.4-I9G62.3G1.1f-KH). Dados de SEC-MALS e DLS dos anticorpos sozinhos mostraram tempos de retenção, massas e raios hidrodinâmicos para cada anticorpo que são típicos para um anticorpo monoclonal monomérico.
Complexos equimolares de cada anticorpo (5,5 uM) com hCD73-his (5,5 uM) mostraram tempos de retenção mais lentos para todos os complexos comparado com anticorpo ou hcD73- his sozinho indicando a formação de complexos.
Uma sobreposição dos dados de cromatograma SEC para cada um dos 16 complexos é mostrada na Figura 11A.
Os dados de cromatograma podem ser divididos em 4 picos distintos, que são mostrados na Figura 11B.
O pico 1 contém as espécies maiores, com massas determinadas por MALS sugerindo complexos com equivalente de massa de complexos hCcD73-his:mAb de mais de 4:4. O pico 2 contém espécies com massas determinadas por MALS sugerindo complexos de hCD37- his:mAb de cerca de 2:2. O pico 3 é uma espécie menor com sinal baixo e massas determinadas por MALS sugerindo complexos de hCD37-his:mAb de cerca de 1:1. O pico 4 corresponde à eluição do mAbs sozinho com massas determinadas por MALS de acordo com anticorpo livre.
Para quantificar as quantidades relativas de cada espécie, os 4 picos de cada cromatograma foram integrados como pico 1 (<12,9 min), pico 2 (12,9 — 15,1 min), pico 3 (15,1 — 16,7 min), pico 4 (16,7 — 19,3 min). A integração também incluía uma faixa integrada adicional chamada pico 5 (>19,3 min) para dar conta de quaisquer espécies de peso molecular baixo que foram verificadas ser insignificantes (<3,5% para todos os complexos). A porcentagem de cada espécie desta integração é sumarizada na Tabela 18. Todos os complexos continham uma porcentagem pequena similar de pico 3 (cerca de 6-9%), mas quantidades variáveis dos outros picos.
O mais notável é que todos os complexos entre hCD73-his e anticorpos contendo um domínio CH1 de hlgG1 tinham uma porcentagem significantemente maior de complexos menores (pico 2), enquanto aqueles contendo domínio CH1 de hlgG2 tinham uma porcentagem maior de complexos maiores (pico 1) (Tabela 18 e Figura 11C). Isso sugere um papel importante não apenas para a região de dobra, mas também para o domínio CH1 em formação de complexo de ordem maior. Tabela 18. Tempos de retenção de anticorpos para CD73.4 com regiões constantes de cadeia pesada | Picot | Picor | Picos | Picos | Picos | [O emma [arm [assar tara azia] roms | | co7ssgerezserav+ncoTanis | 146 [| 202 | sa | a3 | 16 | | — corssmeasshoranis — | 37 [| 24 | 8 | 35 | 31 | | coraalgGaseiitkHancozanis | 307 | 23 | so | 37 [| 34 | | — cprastgaseikH+ncoTanis | 24 [| 21 | 70 [ a6 | 1 | Exemplo 8: ligação de receptor Fc para anticorpos com domínios constantes engenheirados
[00374] Esse Exemplo demonstra que anticorpos tendo regiões constantes de cadeia pesada modificadas compreendendo o CH1 e dobra de IgG2 se ligam a FcyRs quando eles contêm domínios CH2 e CH3 de IgG1.
[00375] Em adição à ligação de antígeno pelos domínios variáveis, anticorpos podem atrair receptores Fce-gama (FcegRs) através de interação com os domínios constantes. Essas interações fazem a mediação de funções efetoras tais como citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP). Atividade de função efetora é alta para o isotipo I9G1, mas muito baixa ou ausente para IgG2 e IgG4 devido a esses isotipos tendo afinidade menor com FegRs. Ainda, a função efetora de IgG1 pode ser modificada através de mutação de resíduos de aminoácido dentro das regiões constantes para alterar a afinidade e seletividade com FcgR.
[00376] A ligação de anticorpos a receptores Fc gama (FcyRs ou FcgRs) foi estudada usando tecnologias de biossensor incluindo ressonância de plasmon de superfície Biacore (SPR) e Fortebio Biolayer Interferometry (BLI). Estudos SPR foram realizados em um instrumento Biacore T100 (GE Healthcare) a 25ºC. O fragmento Fab de um anticorpo anti-6xHis de murino foi imobilizado em um sensor chip CM5 usando EDC/NHS em uma densidade de -3000 RU. Vários FegRs marcados com his (7 ug/ml) foram capturados através do marcador his C-terminal usando um tempo de contato de 30 s a 10 ul/min, e a ligação de anticorpo 1,0 uM foi avaliada em um tampão de processamento de NaPO4 10 mM, NaCl 130 mM, p20 0,05% (PBS-T) pH 7,1. FcgRs usados para esses experimentos incluíam CD64 (FcgRI), CD32a-H131 (FcgRlla-H131), CD32a-R131 (FcegRIla-R131), CD32b (FecgRIlb) CD16a-VI58 (FcgRIlla-VI58), CD1I6b-NA1 (FCcgRINb-NAI) e CD1I6B-NA2 (FcecgRIIIb-NA2). Experimentos BLI foram realizados em um instrumento Fortebio Octet RED (Pall, Fortebio) a 25 ºC em NaPO410 mM, NaCl 130 mM, p20 0,05% (PBS- T) pH 7.1. Os anticorpos foram capturados de sobrenadantes de expressão não diluídos em sensores revestidos com proteína A, seguido pela ligação de analitos de hcD32a-H131, hoD32a-R131, hcD32b, hoD16a-V158 1uM ou hoD64 0,1 uM.
[00377] Primeiro, anticorpos se ligando a vários alvos foram feitos, os quais contêm domínios Fc de IgG1 incluindo as substituições S267E (SE) e S267E/L328F (SELF), bem como várias combinações das mutações P238D, P271G, H268D, A330R, G237D, E233D, referidas como V4, V7, V8, V9 e V12. A ligação desses anticorpos foi estudada pelo Biacore SPR com comparação a anticorpos IgG1f, I9G2.3 (I9gG2-C219S) e I9G4.1 (I9G4-S8228P), bem como um anticorpo I9G1.1f que foi engenheirado para reduzir ligação a todos os FcgRs. Os resultados, que são mostrados na Figura 12, demonstram as propriedades de ligação a FcgR esperadas para IgG1f, I9G2.3 e IgG4.1 e os anticorpos IgG1 mutados, incluindo ligação de CD32a- H131, CD32a-R131 eCD32b aumentada para SE e SELF, bem como seletividade aumentada para os mutantes V4, V7, V8, V9 eV12 para CD32b com relação a CD32a-H131 e CD32a-R131, Figura 12.
[00378] O próximo conjunto de construtos foi usado para engenheirar função efetora no isotipo de IgG2 de outro modo negativo para função efetora. Para esse estudo, as mutações descritas acima foram introduzidas no contexto de região constante de I9G2.3 ou um híbrido de I19G2.3/I9G1f chamado 1gG2.3G1-AY, Tabela 19. Os anticorpos foram expressos em escala pequena como sobrenadantes, e testados quanto à ligação a FcgRs usando tecnologia de biossensor Fortebio Octet BioLayer Interferometry. Uma vez que os anticorpos estavam presentes em concentração baixa nos sobrenadantes, o experimento foi realizado através da captura de anticorpos dos sobrenadantes usando sensores revestidos com proteína A, seguido por ligação de analitos de FcgR em solução. IgG1f purificado e controle de sobrenadante incluindo anticorpos I9G1 do tipo selvagem, SE, P238D, V4 e V12 foram também incluídos para comparação, e cada um desses anticorpos controle demonstrou propriedades de ligação a FcgR esperadas, Figura 13. O anticorpo I9G2.3 também demonstrou o perfil de ligação esperado, com ligação apreciável a apenas CD32a-H131. No entanto, todas as mutações para introduzir as mutações S267E, L328F, P238D, P271G, H268D, A330R, G237D ou E233D em IgG2.3 falharam em recapitular a afinidade com FcgR dos mAbs IgG1 engenheirados correspondentes, Figura 13. Em contraste, o construto de IgG2.3G1-AY foi capaz de preservar totalmente as propriedades de ligação a FcgR de IgG1 do tipo selvagem, enquanto retendo o CH1 e regiões de dobra de I19G2.3. Ainda, todos os mutantes IgG2.3G1-AY contendo S267E, L328F, P238D, P271G, H268D, A3S30R, G237D e E233D demonstraram propriedades de ligação a FcgR comparável a mAbs de versão I|g9G1 contendo as mesmas mutações, Figura 13. Isso demonstra a engenharia bem-sucedida de anticorpos com CH1 e regiões de dobra de IgG2 em combinação com função efetora de IgG1 do tipo selvagem ou mutante.
Tabela 19. Construtos de IgG2 engenheirados
962.3 hHC-I962-C2198 DA I962.3-V13 hHC-Ig62-C2198 — P238D DA I962.3-V14 hHC-Ig62-C2198 — P238D,P271G DA I962.3-V15 hHC-Ig62-C2198 — P238D,H268D,P271G DA 1 I962.3-V16 hHC-Ig62-C2198 — P238D,P271G,A330R DA Ig62.3.V17 hHC-Ig62-C2198 — P238D,H268D,P271G,A330R DA I962.3-V18 hHC-I962-C2198 — S267E DA Ig62.3.-V19 hHC-Ig62-C2198 — S267E,L328F DA I962.361 hHC-Ig62-C2198/hHC-lgG1f DA Ig62.3G1-AY-V20 hHC-IgG62-C2198/hHC-IgG1f - P238D DA I962.3G1-AY-V21 hHC-Ig62-C2198S/hHC-IgG1f - P238D,P271G DA hHC-Ig62-C219S/hHC-IgG1f - I962.3G1-AY-V22 P238D,H268D,P271G hHC-I962-C219S/hHC-l9G1f - I962.3G1-AY-V23 P238D,P271G,A330R 2 hHC-I962-C219S/hHC-l9G1f -
1962.3G1-AY-V24 P238D,H268D,P271G,A330R hHC-I962-C2198/hHC-Ig9G1f -
1962.3G1-AY-V25 G237D,P238D,H268D,P271G,A330R hHC-I962-C2198/hHC-Ig9G1f - I962.3G1-AY-V26 E233D,G237D,P238D,H268D,P271G,A330R I962.361-AY-V27 hHC-IgG2-C2198/hHC-I9G1f - S267E DA I962.3G1-AY-V28 hHC-IgG62-C2198/hHC-lgG1f - S267E,L328F DA
[00379] Essa estratégia de engenharia foi explorada mais através da produção de outros anticorpos formatados com I1gG2.3G1-AY, I9G2.3G1-AY-S267E (I9G2.3G1-AY-V27), bem como variantes da forma I9G2-B (I9G2.5G1-AY e Ig9gG2.5G1-AY-V27), e outros anticorpos híbridos contendo combinações diferentes de domínios constantes de I9G1 e IgG2, e teste da ligação desses anticorpos a FcgRs marcados com his capturados por Fab anti-his usando tecnologia Biacore SPR.
Em concordância com os dados de sobrenadante Octet, os dados de SPR mostraram que os anticorpos IgG2.3G1-AY e |IgG2.3G1-AY-V27 tinham propriedades de ligação a FcgR comparáveis a IgG1f e IgG1f- S267E, respectivamente, apesar de conterem o CH1 e regiões de dobra de um anticorpo IgG1 de forma A (IgG2.3) (Figuras 14Ae Be Tabela 20). Dados similares foram também obtidos usando anticorpos I9G2.5G1-AY e I9G2.5G1-AY-V27, demonstrando a engenharia bem- sucedida de anticorpos IgG2 de forma B (contendo mutação C131S chamada IgG2.5) tendo funções efetoras de IIG1F ou do tipo IgG1f modificadas.
Dados para vários outros anticorpos com regiões constantes de IgG2.3G1-AY, IgG2.3G1-AY-V27, IgG2.5G1-AY ou I9G2.5G1-AY-V27, mas regiões variáveis diferentes, mostram que esta estratégia de engenharia é amplamente aplicável a outros anticorpos independente dos domínios variáveis (Figuras 14A e B e Tabela 20). Outros construtos que demonstraram propriedades de ligação a FegR do tipo I9gG1f são IgG1-G2.3G1-AY e IgG1deltaTHT, enquanto vários dos construtos de região constante modificados foram incapazes de reter propriedades de ligação a FcgR do tipo IgG1f, incluindo construtos I9G2.3G1-KH, I9G2.5G1-KH, I9gG2.3plusTHT, IgG2.5plusTHT e IgG2.3plusGGG, (Figuras 14A e B e Tabela 20).
Tabela 20. Valores Rmax % para anticorpos 1 uM se ligando a proteínas FcgR-his capturadas por Fab anti-his [O Tas] RE [emas [105 [on [55 |
E | emregeme | 1 a oo | e [om Lo Lo Lo RR Ri O O A
RE RR RC O E
GITR.6-1962.361-KH 3% 13% 3% 0% 3% 1%
E RE E E
[00380] Tomados juntos esses dados mostram que a sequência imediatamente C-terminal para o motivo CPPCPAP conservado na região de dobra confere função efetora mediada por FcgR, enquanto CH1 e porções superiores da dobra do anticorpo podem ser substituídos com IgG2 ou sequências de IgG2 modificadas, para combinar potencialmente as funções efetoras de IgG1 e I1gG1 modificado com as propriedades de internalização ou sinalização superiores de anticorpos contendo CH1 e/ou regiões de dobra de 19G2. Exemplo 9: internalização de Ab agonista para GITR é potencializada em anticorpos tendo uma dobra e domínio CH1 de 19G2
[00381] Para induzir expressão de GITR, as células foram incubadas por 72 h a 37ºC com 20 ng/ml de anti-CD3 + 1000 ng/ml de CD28. Como um método alternativo de ativação de células T, bateladas grandes de células T CD4+ ativadas foram preparadas através de um protocolo de cultura de três estágios. Em suma, células T CD4+ foram estimuladas com CD3 ligado à placa (1,5 ug/ml) suplementado com 1 ug/ml de CD28 solúvel por 72 h a 37ºC, expandidas em cultura por 14 dias na presença de 20 u/ml de IL-2 e finalmente expostas a uma outra rodada de ativação pela adição de 10 ug/ml de PHA, 2 u/ml de IL-2 e 1 ugiml de CD28 por 72 h a 37ºC. Células T estimuladas foram semeadas em placas de imagem PDL de 384 poços por 2 h para aderir as células, esfriadas por 15 min a 4ºCe então anticorpos para GITR marcados com Alexa 488 foram adicionados separadamente por uma hora. As placas finalmente tiveram imagem feita por HCS e os dados foram relatados como intensidade total por célula.
[00382] Três anticorpos para GITR diferentes foram avaliados usando os métodos de ativação de célula T mencionados acima. Eles são anticorpo GITR.6 como um isotipo de G1 e um isotipo inerte (I9G1.1) para se ligar a receptores Fc, bem como uma quimera com a dobra de IgG2 no lugar da dobra de IgG1.
[00383] Internalização induzida por anticorpo para GITR foi avaliada em células T CD4+ estimuladas com CD3 usando o formato de ensaio de extinção com Alexa. Células T positivas para CD4+ recém-obtidas foram incubadas como descrito acima para induzir expressão de GITR. Após estimulação, as células foram ressuspensas em meio fresco e plaqueadas para ensaios de internalização como segue. As células foram incubadas com anticorpo como acima descrito, lavadas com meio morno e incubadas a 37ºC pelos tempos indicados antes da fixação e extinção. Anticorpo internalizado foi medido como fluorescência aumentada acima do sinal inextinguível pequeno observado no tempo zero e então normalizada contra o "controle não extinto" de fluorescência total inicialmente ligado às células. Como mostrado na Figura 15, ligação a GITR resultou em atingimento de pico de internalização rápido entre 30-60 minutos para cada anticorpo testado enquanto anticorpos controle foram verificados manter localização para a membrana plasmática. Os resultados indicam que a região de dobra de IgG2 potencializa internalização induzida por ligação a GITR.
[00384] Para analisar mais os mecanismos detalhados de internalização e dinâmica associada, endocitose de anticorpo e administração em compartimentos de endossomo inicial foram analisadas. Neste experimento, as células foram submetidas à análise de busca por pulso com anticorpos não marcados. Quando da fixação, as células foram permeabilizadas e tingidas para o marcador de endossomo inicial EEA1 (tecnologia de sinalização celular), lavadas e então detectadas com anticorpo secundário anti-coelho conjugado a Alexa fluor-488 (EEA1I) e anticorpo anti-humano conjugado a Alex fluor-647 (GITR. As placas tiveram imagem capturada em um sistema confocal Opra com uma objetiva de imersão em água de 60X. Os resultados indicaram segregação clara entre o tingimento de anticorpo anti-GITR ligado à membrana e sinal de EEA1 intracelular. Quando do aquecimento das culturas, agrupamento de alguns anticorpos foi detectado, que parede colocalizar com proteínas endossomais.
Quantificação de colocalização endossomal foi realizada usando HCS Studio Software e os resultados são representados em gráfico como a razão de intensidade de pixel colocalizada em relação a tingimento total (Figura 16). A colocalização de anticorpo para GITR e endossomo inicial é mais proeminente em 30 minutos. Neste ponto de tempo testado, GITR.6.G2.G1f mostrou uma fração maior colocalizadas do que anticorpo GITR.6.G1f. Os resultados de colocalização se relacionam com as observações feitas usando o método de extinção Alexa descrito acima e apoiam um modelo sugerindo que a dobra de G2 tem vantagem potencial com relação a G1 para indução de internalização de GITR. Exemplo 10: sinalização de Ab agonista para GITR em células T CD4+ e CD8+ ativadas por receptor de célula T é potencializada em anticorpos tendo uma dobra e domínio CH1 de IgG2
[00385] Para investigar mais os mecanismos para anticorpos agonistas anti-GITR, várias vias de sinalização envolvidas em ativação de célula T, tais como vias de sinalização NFKB e P38, foram monitoradas.
[00386] CélulasT CD4+ e CD8+ de um doador saudável (M6576) foram ativadas com anti-CD3 0,4 upugml e anti-CD28 0,4 pg/ml revestidos em placa. Após 3 dias, as células foram coletadas e plaqueadas em placas de imagem de 384 poços para ativação de sinalização. Após as células terem sedimentado na placa por 2 horas, elas foram tratadas com anticorpos para GITR por 15 minutos e os eventos de sinalização foram terminados através da adição de formaldeído para um final de 10% na placa de ensaio. Então as células foram permeabilizadas e tingidas com anticorpo NFKB fosfor-p65 para detecção de sinalização. Como mostrado na Figura 17, anticorpos GITR.6.G2 e GITR.6.G2.G1f tinham respostas de sinalização maiores comparado com o GITR.6.G1f em ambas as células T CD4+ e CD8+.
Embora não haja nenhuma evidência direta de ligação de internalização e ativação de via de sinalização, é intrigante notar que isotipo G2 parece melhorar ambos os aspectos de atividades funcionais de anticorpo comparado com o IgG1 para GITR.6.
[00387] Para quantificar as atividades de sinalização para cada anticorpo, ambos EC50 e Emax para cada anticorpo foram calculados, uma vez que ambos os parâmetros são críticos para capturar a extensão total do evento de sinalização. O nível de resposta de GITR.6.G2.G1f é escolhido ser o controle de 100%, e todos os outros anticorpos foram normalizados contra ele. Como mostrado na Tabela 21 para ambas as populações de célula T CD4+ e CD8+ ativadas por anticorpos anti-CD3 e anti-CD28, havia uma gama de atividades para anticorpos para GITR em termos de ambos potência (EC50s) e eficácia (WEmax). Embora GITR.6.G2, GITR.6.62.G1f e GITR.6.G1f tenham mostrado potências similares (EC50s) mais ou menos na faixa de 10 nM, a eficácia (Emax) foi bastante diferente para isotipos diferentes, sugerindo que o anticorpo G1 não sinaliza tão efetivamente quanto o G1 ou isotipos quiméricos. Tabela 21. Sumário das Atividades de Sinalização de NFKB HuMab para GITR em células T CD4+ e CD8+ ativadas por TOR Células T CD4+ PEA PEXNiRIATAT) EC50 (nM) Emax(%) EC50(nNM) Emax(%) | GmR&G2 | EEN EENNIEINEIES [eme | am im | o | e [oem | a | e | as | x | | sonata seno meet | mano | a | memo | 6
[00388] Para confirmar mais se a diferença em sinalização de GITR.6.G2 e GITR.6.G2.G1f comparado com GITR.6.G1f é limitada à sinalização de NFKB apenas ou se ela é verdadeira para outros eventos de sinalização também, uma leitura de sinalização de P38MAPK foi explorada. Como mostrado na Figura 18, anticorpos GITR.6.G2 e GITR.6.G2.G1f tinham respostas de sinalização maiores comparado com o anticorpo GITR.6.G1f em um ensaio de ativação de p38 MAPK de célula CD4+. Desta maneira as melhores atividades de sinalização para isotipo de G2 de GITR.6 comparado com isotipo G1 não são apenas limitadas à sinalização com NFKB.
[00389] Em adição à atividade agonista e internalização potencializadas, foi também mostrado que regiões constantes de cadeia pesada modificadas podem conceder ADCC potencializada (para, por exemplo, um agonista de um receptor estimulador), bem como prover uma nova atividade para um anticorpo. Por exemplo, foi constatado que mudando o domínio de cadeia pesada constante de um anticorpo que se liga a uma molécula de superfície celular inibidora e previne a atividade inibidora da molécula de superfície celular (um antagonista) para uma região constante de cadeia pesada modificada descrita aqui, resultou no anticorpo perdendo sua habilidade em ser um antagonista, e ao contrário o dotou de atividade agonista (da atividade inibidora). Exemplo 11: confirmação de ligações dissulfeto de construtos de 19G2.3 e 962.5
[00390] As estruturas de ligação dissulfeto em um anticorpo compreendendo o domínio constante IgG2.3 (forma A), I9G2.3G1 (forma A) e IgG2.5 (forma B) foram confirmadas ser corrigidas pela comparação de digestões Lys-C não reduzidas com reduzidas.
[00391] As amostras de anticorpo foram digeridas com Lys-C que cliva especificamente ligações peptídicas no lado terminal carboxila de resíduos Lisina (K, Lys). Peptídeos na digestão foram separados usando uma coluna Waters ACQUITY BEH C18, 1,7um, 2,1xX150mm, coluna de HPLC de fase reversa e detectados com um detector de ultravioleta (UV) a 214 nm e espectrômetro de massa Thermo LTQ.
[00392] Digestão enzimática com Lys-C e redução de ligações dissulfeto: a um frasco contendo 100 ug da amostra de anticorpo, 120 ul de tampão desnaturado foram adicionados, resultando em uma solução de GuHCI 3,7M, Tris 0,2M, pH 7,0. A mistura foi incubada a 55ºC por 30 minutos. Alquilação de proteína foi feita adicionando 1 ul de lodoacetamida 50 mM na solução acima, então incubação no escuro em temperatura ambiente por 30 minutos. Amostras alquilada foi diluída com 80 ul de dH2O e Waco Lys-C foi adicionado em razão de enzima para substrato como 1:10. Os anticorpos foram digeridos de um dia para o outro no escuro em temperatura ambiente. Após digestão, uma alíquota de 100 uL foi removida da amostra digerida com Lys-C e 10 uL de DTT 0,5 M foram adicionados. Essa amostra foi incubada em temperatura ambiente por 1 hora para reduzir as ligações dissulfeto.
[00393] Os resultados obtidos são como segue.
[00394] Estrutura dissulfeto dos anticorpos I9G2.3 e I19G2.3G1 (forma A): dentro da região Fab da cadeia pesada Cys22 (H) é ligado a Cys98 (H) e Cys151 (H) é ligado a Cys 207(H). Dentro da região Fc da cadeia pesada Cys265(H) é ligado a Cys325 (H) e Cys371 (H) é ligado a Cys429 (H). Dentro da região Fab da cadeia leve Cys23 (L) é ligado a Cys88 (L) e Cys134 (L) é ligado a Cys194 (L). O terminal C da cadeia leve Cys214 (L) é ligado à cadeia pesada em Cys138 (H). À região de dobra da cadeia pesada contém três resíduos cisteína Cys227 (H), Cys230 (H) eCys233 (H), que proveem três ligações dissulfeto intercadeia. A ligação mais provável é Cys227 (H) a Cys227 (H), Cys230 (H) a Cys230 (H) e Cys233 (H) a Cys233 (H) que é o arranjo dissulfeto teórico coreto da forma A de IgG2.
[00395] Estrutura dissulfeto do anticorpo I9G2.5 (forma B): dentro da região Fab da cadeia pesada Cys22 (H) é ligado a Cys98 (H) e
Cys151 (H) é ligado a Cys 207(H). Dentro da região Fc da cadeia pesada Cys264(H) é ligado a Cys324 (H) e Cys370 (H) é ligado a Cys428 (H). Dentro da região Fab da cadeia pesada Cys23 (L) é ligado a Cys88 (L) e Cys134 (L) é ligado a Cys194 (L). A região de dobra da cadeia pesada contém quatro resíduos cisteína Cys226(H), Cys227 (H), Cys230 (H) e Cys233 (H). O terminal C de Cys214 (L) de cadeia leve é ligado a um resíduo cisteína de cadeia pesada na região de dobra, e os três resíduos cisteína restantes proveem três ligações dissulfeto intercadeia. A ligação mais provável é Cys214 (L) a Cys226 (H), então Cys227 (H) a Cys227 (H), Cys230 (H) a Cys230 (H) e Cys233 (H) a Cys233 (H), que é o arranjo dissulfeto teórico correto de forma B de IgG2. Ainda, as ligações dissulfeto na região de dobra foram confirmadas usando espectrometria de massa em tandem disparada por dissociação de transferência de elétrons (ETD) usando um espectrômetro de massa de aprisionamento de íon. Exemplo 12: relevância de certos resíduos de aminoácido em CH1 e dobra de IgG2 em melhora de agonismo para GITR em células T
[00396] Anticorpos anti-GITR (GITR.6) com as regiões constantes de cadeia pesada mostradas na Tabela 17 foram preparados e testados em ensaio de produção de IL-2 como descrito no Exemplo 2, mas em que sobrenadantes foram coletados em 40 horas ao invés de 48 horas.
[00397] Os resultados, que são mostrados nas Figuras 20A-D, estavam amplamente de acordo com os resultados de internalização de CD73 (vide Figura 10) obtidos com anticorpos anti-CD73 tendo as mesmas regiões constantes de cadeia pesada que aquelas usadas neste Exemplo.
Exemplo 13: eliminação de funções efetoras com uma mutação P238K
[00398] Regiões variáveis de um anticorpo foram fundidas a um Fc de IgG1 que difere de um Fc de IgG1 do tipo selvagem em um único resíduo de aminoácido: P238K (SEQ ID Nº: 198). Com esta mutação única, o anticorpo demonstrou uma falta de função efetora, não tendo essencialmente nenhum sinal de ligação detectável em relação aos FevRs de baixa afinidade hoD32a-H131, hoD32a-R131, hcD32b, hCcD16a-V158 ou hoD16b-NA?Z (vide dados no Exemplo 14). Ainda, o anticorpo com IgG P238K mostrou redução significante em afinidade de ligação com o FcvR CD64 de afinidade alta (vide dados no Exemplo 14). Ligação do anticorpo a CD64 demonstrou uma taxa de dissociação mais rápida (constante de dissociação) em relação a anticorpos com um domínio constante de I9gG1 do tipo selvagem.
[00399] A falta de função efetora de um Fc de IgG1 tendo uma mutação P238K (SEQ ID Nº: 198) foi demonstrada também com uma variante de anticorpo.
[00400] Desta maneira, um Fc de IgG1 humana com uma mutação única (P238K), por exemplo, em que a região constante de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido SEQ ID Nº: 198, pode ser usado em quaisquer anticorpos em que as funções efetoras não são desejáveis. Exemplo 14: eliminação de funções efetoras com uma P238K e mutações adicionais
[00401] Anticorpos adicionais foram gerados com Fcs tendo mutação(ões) para reduzir mais a função efetora, preferivelmente ambas ADCC e CDC. Mutantes foram gerados para reduzir mais ligação a FCcºRn como mostrado na Tabela 22. Em particular, como mostrado acima, P238K elimina ligação a FcR detectável exceto para CD64, de modo que o objetivo era combinar P238K com mutações adicionais para reduzir ligação a CD64. As mutações foram testadas no contexto de formatos de isotipo I9G1, IgG2.3 e isotipo I9G62.5 e isotipo I9G62.3G1. Os Fes usados nesses anticorpos compreendem uma das sequências de aminoácido tendo SEQ ID Nº: 234-245 e 247-
262.
[00402] A localização da mutação é mostrada na Figura 21.
[00403] A ligação de FecyRs humanos a anticorpos foi estudada através de ressonância de plasmon de superfície usando um sistema Biacore 8K (GE Healthcare). Para esses estudos, proteína A foi imobilizada em células de fluxo 1-4 do sensor chip CM5 usando química etil — (dimetilaminopropil)carbodi-imida — (EDC)/N-hidroxissuccinimida (NHS) padrão, com bloqueio de etanolamina, em um tampão de processamento de HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensoativo p20 0,05%, para uma densidade de -3000 RU. Anticorpos purificados (10 ug/mL) ou sobrenadantes de expressão (diluídos para —10 ug/ml) foram capturados na superfície da proteína A para uma densidade de —-1000-1200 RU, e a ligação de analitos de FcyR foi testada em tampão de processamento consistindo em NaPO4 10 mM, NaCl 130 mM, p20 0,05%, tampão (PBS-T) pH 7,1 a 25ºC, usando tempo de associação de 120 s e tempo de dissociação de 120 s em uma taxa de fluxo de 20 ul/min. Os dados foram analisados usando software de avaliação Biacore 8K, através da determinação da resposta de ligação medida como uma porcentagem da resposta de ligação máxima teórica para cada anticorpo (Rmax %), com base no nível de anticorpo capturado, supondo 100% de atividade funcional e apenas levando em conta massa de proteína sem glicosilação, como segue. T compara a ligação de FcgR de moléculas diferentes, os dados de ligação de SPR foram analisados através do cálculo da resposta de ligação máxima como uma porcentagem da resposta de ligação máxima teórica (Rmax %) como geralmente mostrado na Eq. 1:
DGRINAA: nes (Analito de Resposta de Ligação Observado) (Analito de Resposta de Ligação Teórica Máxima) Eq. 1
[00404] Especificamente, a Rmax% foi calculada usando a equação: onde "Analito" é o anticorpo e "Ligante" é a proteína FcgR capturada. Esta análise não leva em conta a massa de glicosilação de anticorpo ou FegR e supõe 100% de atividade funcional para o ligante capturado.
[00405] A'"análisedeRmax %" é particularmente útil para avaliação da ligação dos FcgRs de "afinidade baixa", por exemplo, FcgRs, por exemplo, hcD32a-H131, hcD32a-R131, hcD32b, hcD16a-V158, hCD16a-F158, hOD1I6b-NAI1 e hCD1I6b-NA2, que têm taxas de associação e dissociação relativamente rápidas próximo ou abaixo da concentração de analito testada (1 micromolar (uM)), de modo que saturação da superfície geralmente não é obtida sob essas condições. Em contraste, o FegR hcD64 de "alta afinidade" se liga com afinidade maior e cinética de dissociação menor do que os outros FcgRs, particularmente a IgG1 e IgG4, e então esses isotipos realmente saturam a superfície de hCD64 abaixo de concentrações de analito micromolares, e são mais difíceis de diferenciar afinidades usando Rmax %. Para essas interações, diferenças entre anticorpos podem ser facilmente observadas através da comparação das taxas de dissociação nos dados de sensorgramas.
1) Os resultados são mostrados na Tabela 22 e dados de sensorgramas exemplares são providos nas Figuras 21 A-L.
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[00406] “Como mostrado na Tabela 22 e na Figura 22, os mutantes de combinação demonstraram ligação a FCcR muito fraca. Adição de mutações L235 a isotipo P238K reduziu a ligação a CD64 para níveis similares a I9G1.3f. L235E era superior à mutação L235A para redução de ligação a CD64. Adição de mutação P238K a I1gG2 (I9gG2.3-P238K) resultou em um isotipo totalmente inerte, não demonstrando nenhuma ligação detectável a nenhuma das proteínas FcR. As mutações também mostraram tendências similares no contexto de formatos de IgG1 e IgG2.xG1. A mutação K322A, que reduziu a ligação a c1q (atividade de CDC), e foi adicionada em alguns construtos, teve impacto mínimo sobre ligação a FcR de maneira que efeito de K332A não foi muito observado. Exemplo 14: eliminação de funções efetoras com Fc de I9G1.3
[00407] Este Exemplo é descrito nos Exemplos 2 e 3 do pedido PCT codepositado e de copropriedade intitulado "MODIFIED IgG1 Fc DOMAINS AND ANTI-CD40 DOMAIN ANTIBODY FUSIONS THEREWITH."
[00408] Este Exemplo mostra que um anticorpo ou polipeptídeo com uma Fc de IgG1.3 é essencialmente destituído de ligação a CD16, CD32a, CD32b e CD64. Isso foi também observado quando um Fc de I9G1.3 foi ligado ao domínio variável de anticorpos anti-TIM3 (vide WO2018/013818). IgG1.3 era derivado do Fc de "IgG1.1" ("lgG1.1" é um IgG1 com substituições de L234A, L235E, G237A, ASSOS e P331S) através da remoção de A330S e P331S, desta maneira retendo 3 das 5 mutações, isto é, L234A, L235E, G237A. Foi surpreendentemente constatado que a ausência de A330S e P331S no Fc de IgG1.1 não afetou significantemente a inércia deste Fc. Abaixo se encontram medições de ligação a FcyR exemplares de I9G1.1 e IgG1.3 (e outros Fcs para propósitos comparativos) contendo anticorpos e proteínas de fusão, comparando a inércia de I9G1.1 e
I9G1.3 no contexto de um anticorpo bem como no contexto de uma proteína não anticorpo.
[00409] Materiais e métodos usados neste exemplo incluem o que segue. SPR de ligação a FegR: ligação a FcgR pode ser medida in vitro usando FcyRs purificados usando ressonância de plasmon de superfície Biacore"" (SPR). Dois métodos foram usados aqui.
[00410] Um método testa a ligação de anticorpos purificados ou proteínas dAb-Fc a proteínas FcgR marcadas com His (FcgR-His ("FecgR" é usado intercomutavelmente com "FeyR") que são capturadas no fragmento Fab imobilizado de um anticorpo anti-His. Esses experimentos são realizados em um instrumento ou Biacore'Y T100 ou Biacore'" T200 (GE Healthcare) a 25ºC. O fragmento Fab de um anticorpo anti-6xHis de murino (gerado na casa) é imobilizado em um sensor chip CM5 usando química etil(dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)/N-hidroxissuccinimida (NHS) com bloqueio de etanolamina, para uma densidade de -300 Unidades de Ressonância RU em um tampão de processamento de HEPES 10 milimolar (mM) pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensoativo p20 0,05% (HBS-EP+). Todos os estudos restantes são realizados usando um tampão de processamento de NaPO, 10 mM, NaCl 130 mM, p20 0,05% (PBS-T) em pH 7,1. Várias proteínas FcgR contanto um marcador poli-histidina 6x C-terminal (gerado na casa) foram capturadas nesta superfície (tipicamente usando concentração de proteína FcgR-His de -7 pg/ml) usando um tempo de contato de 30 segundos a 10 ul/min. Várias concentrações de anticorpo purificado ou proteínas dAb-Fc são testadas quanto à ligação, por exemplo, usando um tempo de associação de 120 segundos a 30 ul/min e um tempo de dissociação de 120 segundos a 30 ul/min. Proteínas FcgR testadas nesses estudos incluem a FcgR hCD64 de "alta afinidade" (hFcgRI),
bem como a FcgRs hcD32a-H131 de "baixa afinidade" (FcgRlla- H131), hoD32a-R131 (FegRIla-R131), hoD32b (FegRIlb), hoD16a- V158 (FcaoRilla-V158), hoD16a-F158 (FcegRilla-F158), hoD16b-NA1 (FegRIIIb-NA1) e hoD16b-NA?Z (FegRIIIb-NA2).
[00411] Para analisar quantitativamente as respostas de ligação e comparar a ligação a FcgR de moléculas diferentes, os dados de ligação de SPR podem ser analisados através do cálculo da resposta de ligação máxima como uma porcentagem da resposta de ligação máxima teórica (RmMax %) como geralmente mostrado na Eq. 1: dúRinas = Cnalito de Resposta e Fignção Observado) Eq.1 (Analito de Resposta de Ligação Teórica Máxima)
[00412] Especificamente, o RmMax % é calculado usando a equação: onde "Analito" é o anticorpo ou dAb-Fc e "Ligante" é a proteína FcgR capturada. Esta análise não leva em conta a massa de glicosilação de anticorpo, dAb-Fc ou FcgR e supõe 100% de atividade funcional para o ligante capturado.
[00413] A"análisedeRmax %" é particularmente útil para avaliação da ligação dos FcgRs de "afinidade baixa", por exemplo, hoD32a- H131, hCD32a-R131, hCD32b, hCD16a-VI58 hCD16a-F158, hCD1I6b-NAI1 e hCD1I6b-NA2Z, que têm taxas de associação e dissociação relativamente rápidas próximo ou abaixo da concentração de analito testada (1 micromolar (uM)), de modo que saturação da superfície geralmente não é obtida sob essas condições. Em contraste, o FcgR hCD64 de "alta afinidade" se liga com afinidade maior e cinética de dissociação menor do que os outros FcgRs, particularmente a IgG1 e IgG4, e então esses isotipos realmente saturam a superfície de hCD64 abaixo de concentrações de analito micromolares, e são mais difíceis de dife-renciar afinidades usando Rmax %. Para essas interações, diferenças entre anticorpos podem ser facilmente observadas através da comparação das taxas de dissociação nos dados de sensorgramas.
[00414] Um segundo ensaio SPR para teste da interação entre anticorpos ou proteínas dAb-Fc com proteínas FcgR é um método de captura de proteína A. Esses experimentos são também realizados em um instrumento ou Biacore'""t T100 ou Biacore'"" T200 (GE Healthcare) a 25ºC. Para esses estudos, a proteína A é imobilizada em células de fluxo 1-4 de um sensor chip CM5 usando química etil(dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC)/N-hidroxissuccinimida (NHS), com bloqueio de etanolamina, em um tampão de processamento de HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, tensoativo p20 0,05%, para uma densidade de -3000 RU. Anticorpo ou proteínas dAb-Fc (tipicamente —3-10 pg/ml) são capturados na superfície da proteína A, e a ligação de analitos de FcgR é testada em um tampão de processamento consistindo em NaPO., 10 mM, NaCl! 130 mM, p20 0,05%, tampão (PBS-T) em pH 7,1 e a 25ºC, usando, por exemplo, tempo de associação de 120 s e tempo de dissociação de 180 s em uma taxa de fluxo de 30 uL/min.
[00415] O ensaio de captura de proteína A pode ser também usado para analisar sobrenadantes não purificados contendo moléculas de anticorpo ou de dAb-Fc. Para essa análise, o anticorpo ou as proteínas de dAb-Fc podem ser capturados ou em sobrenadantes não diluídos ou sobrenadantes diluídos com tampão de processamento. Para analisar quantitativamente as respostas de ligação e comparar a ligação a FcgR de moléculas diferentes, os dados de ligação de SPR podem ser analisados calculando a RmMax % usando a Eq. 1 acima, em que Analito é a proteína FcgR purificada e Ligante é o anticorpo ou proteína dAb-Fc capturado.
[00416] Em adição à análise Rmax%, análise quantitativa da cinética e afinidade de ligação pode ser realizada através do teste de uma titulação de analito de FcgR quanto à ligação a anticorpos capturados por proteína A ou proteínas dAb-Fc. Por exemplo, FegR em uma diluição serial 3:1 pode ser titulado de a partir de 10 uM para baixo ou para 0,15 nM (hCD64) ou 1,5 nM (todos os outros FcgRs). Esses dados cinéticos podem ser ajustados ou a um modelo Langmuir 1:1 ou a um modelo de ligação de curso estável usando software de avaliação Biacore'Y T200 para obter valores de cinética e afinidade.
[00417] dAb-Fcs: os dAb-Focs estudados neste exemplo são mostrados na Tabela 23. Nessas sequências, os resíduos 3h56-269 do domínio variável único são aminoácidos 1-118 (sublinhados). O ligante AST tem duplo sublinhado. Tabela 23 re ame Deo 263 EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVROAPGKGLERVSA
INPOGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOQMNSLRAEDTAVYYCAKLP 3h56-269-l9G4.1 | FRESDRGOGTLVTVSSASTESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKD
OR TLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST BMS-986090 — | YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVY
TLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD
SDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 264 EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSA
INPOGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLP
FRFSDRGQOGTLVTVSSASTEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPK 3h56-269-CT
PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP
| ps Ai] VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 265 EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSAINPQOG
TRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLPFRFSDRGOGTLV
TVSSASTEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD 3h56-269-19G1.1f | VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH
NHYTOKSLSLSPGK 266 EVOLLESGGGLVAOPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSAINPOG
TRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLPFRFSDRGQOGTLV
TVSSASTEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD 3h56-269-19G1.3f | VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYK
CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH
NHYTOKSLSLSPGK 267 EVOLLESGGGLVAPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLERVSAINPQG
TRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLPFRFSDRGOGTLV 3n56-260-1961. | TVSSASTEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVA 065% VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYK
CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTOKSLSLSPGK
[00418] As sequências de IgG1.1f e I9gG1.3f, cada uma começando com "EPK" (isto é, as sequências em SEQ ID Nº“: 77 e 78), que são mostradas na Tabela 23 são idênticas às sequências começando em EPK nas SEQ ID Nº: 83 e 248, respectivamente.
[00419] — mAb controle: um anticorpo monoclional controle (1F4) foi também formatado com mutações de domínio Fc similares. As sequências de cadeia individuais são mostradas na Tabela 24, incluindo a sequência (SEQ ID Nº: 268) da porção da cadeia pesada de 1F4 incluindo a região variável e a região CH1. Essa sequência está sublinhada nas sequências de cadeia pesada (SEQ ID Nº: 269- 275). O par de sequências de cadeia pesada e cadeia leve para cada variante de mAb 1F4 é mostrado na Tabela 25.
Tabela 24 Seq Identidade de Sequência ID Nº. sequência 268 EVOLLESGGGLVOQPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVRQAPGKG Região variável de | LEWVSAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLOMNSLRAE cadeia pesada e — | DIAVYYCAKVDYSNYLEEDYWGOGTLVIVSSASTKGPSVFPLAPS CH1 de SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOS
SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV 1F4 269 EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSISSSYLAWYQQKPGOAPR Região variável de | | | MGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQOY cadeia leve e CL de | GssSPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLN 1F4 NFYPREAKVOWKVDNALQOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLS
KADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 270 EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVRQAPGKG
LEWVSAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLQMNSLRAE DTAVYYCAKVDYSNYLFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOS
SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK Cadeia pesada de 1F4-19618 THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH
EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPG
K 271 EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVRQAPGKG
LEWVSAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLQMNSLRAE DTAVYYCAKVDYSNYLFFDYWGOQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPC
SRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOS Cadeia pesada de | SGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGP 1F4-19G4.1 PCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQED
PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTK NQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF
LYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLG 272 EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVRQAPGKG
LEWVSAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLQMNSLRAE Cadeia pesada de | DTAVYYCAKVDYSNYLFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS 1F4-1961.1f SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOS
SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK THTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH
Seq Identidade de Sequência ID Nº. sequência
EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 273 EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVRQAPGKG
LEWVSAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLOQMNSLRAE DTAVYYCAKVDYSNYLFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS
SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOS Cadeia pesada de | SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK 1F4-19G1.3f THTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH
EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQOKSLSLSPG 274 EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVRQOAGKGL
EWVSAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLQMNSLRAED TAVYYCAKVDYSNYLFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS
KSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSS Cadeia pesada de | GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKT 1F4-D265A HTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHOQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFF
LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 275 EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVRQAPGKG
LEWVSAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLQMNSLRAE DTAVYYCAKVDYSNYLFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPS
SKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOS Cadeia pesada de | SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK 1F4-CT THTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH
EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDEL TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
Tabela 25 1F4-I9G1f SEQ H: 270 SEQ *: 269 1F4-19G4.1 SEQ É: 271 SEQ *: 269 1F4-19G1.1f SEQ *H: 272 SEQ *: 269 1F4-19G1.3f SEQ H: 273 SEQ *: 269 1F4-D265A SEQ H: 274 SEQ *: 269 1F4-CT SEQ É: 275 SEQ *: 269
[00420] Resultados: as moléculas de dAb-Fc foram produzidas com mutações no domínio Fc para reduzir ligação a FcgR. Especificamente, o anticorpo de domínio anti-CD40 3h56-269 foi formatado com as variantes de domínio Fc que seguem: I1gG1.1f, I9G1.3f e I9G1-D265A. Em cada um de 3h-56-269-I9G1.1f (SEQ ID Nº: 77), 3h-56-269-l9G1.3f (SEQ ID Nº: 78) e 3h-56-269-l9G1-D265A (SEQ ID Nº: 79), os aminoácidos 1-116 são 3h-56-269 dAb, os aminoácidos 117-119 são um ligante e os aminoácidos 12-135 são o domínio Fc.
[00421] Cada uma dessas proteínas de fusão dAb-Fc, bem como cada um de 3h56-269-I9G4.1 e 3h56-269-CT, foi confirmado se ligar com afinidade alta ao monômero humano-CD40 purificado (hCD40monomer, gerado na casa) conforme medido através de SPR Biacore'Y, Como mostrado na Tabela 26, os valores de KD variam entre 7,3 nM e 11,5 nM para as variantes de Fc diferentes. Cada uma das moléculas de dAb-Fc também se ligaram a CD40 humano com alta afinidade, conforme medido através de SPR usando hcD40-Fc na superfície de um sensor chip e a molécula dAb-Fc como analitos solúveis em solução, onde dados para injeções de analito de dAb-Fc de 250 nM e 25 nM foram ajustados para um modelo Langmuir 1:1 para estimar valores KD aparentes influenciados por avidez (KDaparente) para todos os dAb-Fcs as <1 nM. Vide Tabela 26. Tabela 26. Dados de SPR para ligação de moléculas de dAb-Fc a CD40 humano Ligação de dAb-Fc hcD40monômero se ligando a moléculas à superfície de de dAb-Fc capturadas em superfície de hcp40-Fe Ligante proteína A capturada (Afinidade) imobilizada (Avidez) [rss [ses [5 | 3h56-269-CT 3h56-269-CT (UCOE-CHO)* 3h56-269-19G1.3f [nes [ves [5 | aseneeream | ves | ass | 50 | *3h-56-269-CT expresso e purificado a partir de células UCOE-CHO
[00422] As propriedades de ligação a FcgR das moléculas de mAb- Fc e dos vários anticorpos 1F4 monoclonais controle foram caracterizadas por SPR. O primeiro ensaio envolveu ligação de dAb- Fes 1 uM a 10 uM ou um controle de anticorpo IgG1f humano (1F4- IgG1f) a superfícies de FcgR-His capturadas por Fab anti-His.
Tabela 27. Dados de Rmax % para dAb-Fcs 1 uM a 10 UM ou controle de anticorpo 1F4-I9G1f a proteínas hFcgR-His capturadas por Fab anti-His afinidade (pM) hcp64 H131 R131 2b V158 NA2 3h56-269-19G1- 3h56-269-19G1-
[00423] Em um outro ensaio, analitos de FcgR (a 1 uM ou 10 UM) foram testados quanto à ligação a superfícies de dAb-Fc capturadas por proteína A (dados mostrados na Tabela 28) e para ligação a superfícies de anticorpo (dados mostrados na Tabela 29).
Tabela 28. Dados de Rmax % para ligação de FcgRs 1 uM ou 10 uM a proteínas dAb-Fc capturadas por proteína À 3h56-269- Conc | 3h56-269- | IgG1- |3h56-269-|3h56-269- | 3h56- Amostra (um) Teens [1 [me De [5 [|
Tabela 29. Dados de Rmax % para ligação de FcgRs 1 uM ou 10 uM a anticorpos capturados por proteína À Ts Ta TE Ts TT Te] ee [e [e [om [os [e e] men | [Im [Om [om [o [e De] e TR e 5 [E =)
ECXTENOEETENCENCENCENCENT [eee [e Dm [e [a a [5 [6]
[00424] Com base nas respostas de ligação ou falta das mesmas nesses experimentos, um subconjunto das interações de dAb-Fc/FegR ou Ab/FcgR de afinidade maior com respostas de ligação mais fortes foi selecionado para caracterização de cinética/afinidade usando titulações de analito (analitos de FcgR se ligando a anticorpos capturados por proteína A ou dAb-Fces) Esses dados são apresentados na Tabela 30.
Tabela 30. Valores de KD (em nM) para analitos de FcgR purificados se ligando a anticorpos ou dAb-Fc capturados por proteína À Lo | | | | || > ee H131 Vv1S58 NA2 esse [seen | o | [ameaner | 46 [5000 [x6000 | vamo | s5000 | s5000 |
[00425] Coletivamente, esses dados de SPR de ligação a FcgR mostram que as moléculas de isotipos IgG1f e IgG4.1 têm afinidade com FcgR significantemente maior em todas as FcgRs comparado com as moléculas de IgG1-D265A, IgG1.1f, I9gG1.3f ou CT variantes de Fc modificadas. Das variantes de Fc modificadas, a afinidade de ligação com hCD64 foi a mais forte para 3h56-269-CT (KD = 4,6 nM), mais fraca para 3h56-269-lg9G1-D265A (KD = 62 nM) e a mais fraca de todas para3h56-269-19G1.1f e 3h56-269-Ig9G1.3f, para a qual afinidade foi muito fraca para quantificar sob as condições testadas (Kp > 5 uM), que é metade da concentração de analito mais alta testada). Todas das outras interações de FcgR (hCD32a-H131, hCcD32a-R131, hcD32b, hoD16a-V158, hoD16b-NA2) para as variantes I9G1-D265A, I9G1.1f, I9G1.3f e CT foram também muito fracas para obter valores de Kp confiáveis (Ko > 5 uM). No entanto, diferenças nas respostas de ligação relativas podem ser observadas nos dados de Rmax %. Por exemplo, a variante IgG1-D265A tem resposta de ligação mais forte para hoD32a-H131 comparado com as variantes I9G1.1f, I9G1.3f ou
CT (Tabela 28). Em contraste, as variantes I9G1.1f e I9G1.3f têm respostas de ligação mais fortes para hCD32a-R131 comparado com as variantes IgG1-D265A e CT (Tabela 28).
[00426] IgG1.3 contendo proteína de fusão ou anticorpo foram avaliados através de DSC, icIEF e espectrometria de massa. Materiais e métodos são descritos abaixo.
[00427] Calorimetria de varredura diferencial: experimentos de DSC foram realizados em um instrumento de DSC MicroCal VP- Capillary (Malvern Instruments, Malvern, UK) em NaPO,. 10 mM, NaCl 130 mM, pH 7,1. Amostras de 1 mg/ml de dAB-Fc ou anticorpo foram testadas usando uma faixa de varredura de 10-110ºC e uma taxa de varredura de 90ºC/h. Os dados foram analisados usando um software MicroCal-Origin 7.0.
[00428] Foco lsoelétrico Capilar com Imagem: experimentos iCIEF foram realizados em um ProteinSimple ICE3'Y System (ProteinSimple, San Jose, CA). Para esses estudos, as amostras de dAb-Fc ou anticorpo, tipicamente em uma concentração de 2 mg/ml, foram misturadas com uma mistura de anfólitos carreadores consistindo em ureia 2 M, metilcelulose 0,35%, Pharmalyte 5-8 1%, Pharmalyte 8-10,5 3% e marcadores de pl 5.85 e 10.10, para uma concentração de proteína final de 0,20 mg/mL e analisadas usando um tempo de pré-foco de 1 min a 1,5 kV e um tempo de foco de 10 min a 3 kV.
[00429] Espectrometria de massa: para análise de espectrometria de massa (espec. massa), as amostras foram reduzidas usando DTT 100 mM e N-desglicosilação foi realizada com peptídeo:N-Glicosidase (FPNGaseF). Instrumentação de cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC/MS) usada foi um Waters Synaptº G2 (Waters Corporation, Milford, MA) com um Waters Acquity? UPLC (cromatografia líquida de ultrtadesempenho). A coluna de UPLC era uma Waters Acquityº BEH (partícula híbrida em ponte de etileno) C4 (2,1 x 150 mm, 300 À, partícula de 1,7 um). O gradiente foi 10% a 38% (Fase Móvel B) em taxa de fluxo de 10 min a 200 uL/min. A fase móvel A era ácido fórmico 0,1% em água. A fase móvel B era ácido fórmico 0,1% em acetonitrila. A temperatura da coluna era 60ºC. Análise de dados foi realizada manualmente com o auxílio de software Waters MassLynxTY; desconvolução espectral foi realizada com o algoritmo MaxEnt1.
[00430] Estudos de Estabilidade Acelerada: estudos de estabilidade acelerada foram conduzidos primeiro dialisando extensivamente moléculas de dAb-Fc em tampões de formulação-alvo a 4ºC. As amostras foram recuperadas e concentradas usando Amiconº Ultra Centrifugal Filter Units (Merck KgaA, Alemanha) e preparadas em concentrações-alvo diferentes em tampão de diálise. Essas amostras foram incubadas em várias temperaturas, tipicamente 4ºC, 25ºC, 32ºC e/ou 40ºC por várias semanas, com alíquotas removidas e analisadas através de cromatografia de exclusão de tamanho analítica. Cromatografia de exclusão de tamanho analítica foi conduzida em uma HPLC Agilent 1260, usando uma coluna Shodex Ty K403-4F (Showa Denko America, Inc., New York, NY) em uma fase móvel de Fosfato de Sódio 100 m, Cloreto de Sódio 150 mm, pH 7,3, taxa de fluxo de 0,3 ml/min.
[00431] Resultados — calorimetria de varredura diferencial: DSC pode ser usada para medir a estabilidade térmica de uma proteína. Os valores de Tm de melhor ajuste são sumarizados na Tabela 31.
Tabela 31. Valores de temperatura de fusão térmica (Tm) para moléculas de dAb-Fc conforme determinado através de DSC Tm dAb e domínio cH2 Tm domínio CH3 (ºC)
[00432] Com base nos perfis de desnaturação térmica característicos para domínios Fc de IgG, a transição de domínio CH3 de Fc para 3h56-269-IgG4.1 foi chamada transição com valor de ponto médio (Tm) de 69,6ºC; e o domínio CH3 de Fc das várias moléculas de IgG foi chamado a transição com Tm próximo —82-83ºC. As desnaturações do domínio dAb e domínio CH2 para dAb-Fces foram chamadas(s) transição(ões) abaixo de 65ºC, com diferença entre construtos diferentes, ambos no início da desnaturação térmica (Tinício), no formato da transição de desdobra e nos valores Tm de melhor ajuste. Por exemplo, a transição térmica para os domínios dAb e CH2 de 3h56-269-l9G4.1 aparece como uma sobreposição simples ou transição cooperativa, com valor Tm de 62,8ºC. Os perfis de desnaturação para os domínios dAb e CH2 de 3h56-269-I9G1-D265A, 3h56-269-I9G1.1f e 3h56-269-l9G1.3f estão todos de acordo com uma transição mais simétrica, que foi melhor descrita por duas transições tendo valores Tm entre -56-63ºC. 3h56-269-CT teve o Tiníico Mais baixo, começando a desdobrar próximo de 40ºC, com uma transição térmica ampla e os mais baixos valores de Tm ajustados de Tm1=55,4ºC e Tm2=60,4"C.
[00433] Resultados — Foco isoelétrico capilar com imagem capturada (iclEF): foco isoelétrico capilar com imagem (iclIEF) pode ser usado para caracterizar homogeneidade ou heterogeneidade de amostra. A habilidade em gerar um produto homogêneo é um outro critéio “de capacidade de desenvolvimento importante. Consequentemente, durante o desenvolvimento e otimização de um produto terapêutico de proteína novo, vários métodos analíticos são utilizados para caracterizar e quantificar heterogeneidades de amostra, e selecionar as moléculas mais homogêneas.
[00434] Os perfis de carga para moléculas de dAb-Fc foram caracterizados por iclIEF. Os dados são mostrados na Figura 23. Os perfis de iclIEF para 3h56-269-lIg9G4.1 (FIG. 23A), 3h56-269-I9G1.1f (FIG. 23E) e 3h56-269-l9G1.3f (FIG. 23F) são todos relativamente simples, cada um consistindo em um pico principal distinto com área de 69-86% e entre duas e quatro variantes de carga em abundância menor. Este perfil de iciEF é similar ao perfil típico obtido para um anticorpo. O pico principal para 3h56-269-I9G1-D265A (FIG. 23D) é abundância um pouco menor (49%) com um nível correspondente maior de variantes ácidas com pelo menos seis espécies detectáveis. Em contraste, o perfil para 3h56-269-CT (FIG. 23B) é altamente heterogêneo, consistindo em pelo menos 16 espécies diferentes e nenhum pico principal claro. O perfil de iclIEF para 3h56-269-CT expresso em uma linhagem celular diferente (UCOE-CHO) foi igualmente heterogêneo (FIG. 23C), embora a distribuição das variantes de carga tenha sido consideravelmente diferente do material expresso em HEK293.
[00435] Resultados — Espectrometria de Massa: glicosilação típica sobre o domínio Fc de IgG ou proteínas contendo Fc é uma mistura de GOF, G1F e algumas espécies G2F. Outras glicoformas, tais como formas sialladas ou não fucosiladas, são geralmente encontradas em abundância muito menor ou em níveis não detectáveis.
[00436] Para caracterizar os perfis de glicosilação das proteínas dAb-Fc, e comparar as proteínas dAb-Fc a anticorpos controle com mutações de Fc similares, experimentos de espectrometria de massa foram conduzidos. Os dados são mostrados na Tabela 32. Tabela 32. Glicoformas detectadas em moléculas de dAb-FC e anticorpo conforme determinado através de espectrometria de massa [ameno [om [ow | om [orsi [ora] [aeee fem am a | | [semen fam em | | [O seemea fem sa | [o een fes e | | 1 [mens fam en | |
[00437] Dados de espectrometria de massa para os anticorpos controle 1F4-l9G1f e 1F4-I9G1.3f, bem como para anticorpos dAb-Fc 3h56-269-l9G4.1, 3h56-269-19G1.1f, 3h56-269-l9G1.3f, mostrou que essas proteínas consistem em uma mistura típica de glicoformas de GOF, G1F, com uma abundancia menor de espécies de G2F.
[00438] Desta maneira, IgG1.3 (região constante de cadeia pesada e Fc) é essencialmente destituído de ligação a CD16, CD32a, CD32b e CD64 e tem boas propriedades biofísicas. Isso também foi observado quando um IgG1.3 foi ligado ao domínio variável de um anticorpo anti-TIM3 (vide WO2018/013818). Um anticorpo anti-TIM3 compreendendo IgG1.3 foi mostrado ter boa estabilidade térmica (Tm! = 68,1ºC, Tm2 = 80,3ºC, Tm3 = 82,6ºC) e reversibilidade térmica (95,6% a 74ºC, 25,5% a 80ºC), o que sugere que a molécula retém sua integridade estrutural sob estresse térmico e tem propriedades de redobra robustas quando estresse é liberado. SEQUÊNCIA TABELA 33 SEQID Descrição Sequência Nº 1961 comprimento integral — | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG tipo selvagem VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE
PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 2 CH1 IgG1 tipo selvagem ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOTYICNVNHKPSNTKVDKKV Dobra IgG1 tipo selvagem EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG 4 CH2 IgG1 tipo selvagem PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI
SKAK CH3 1961 tipo selvagem GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY
TOKSLSLSPGK IgG2 comprimento integral — | ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG tipo selvagem VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV
ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQODWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 7 CH1 IgG2 tipo selvagem ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV | Dobra IgG2 tipo sevagem — | ERKCCVECPPCPAPPVAG | 9 [emegeemosamaçem | PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTI
SKTK CH3 IgG2 tipo selvagem GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY
TOKSLSLSPGK un 1gG3 comprimento integral ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG tipo selvagem VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRV
ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEP KSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTOKSLSLSPGK 12 CH1 IgG3 tipo selvagem ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRV Dobra IgG3 tipos elvagem ELKTPLGDTTHTCPRCPE 14 CH2 IgG3 tipo selvagem PKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELL
GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEV HNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE
KTISKTK CH3 IgG3 tipo selvagem GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPEN
NYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTOQ
KSLSLSPGK 16 1gG4 comprimento integral ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG tipo selvagem VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE
SKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR
WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSLGK 17 CH1 IgG4 tipo selvagem ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRV Dobra IgG4 tipo selvagem ESKYGPPCPSCPAPEFLGG 19 CH2 IgG4 tipo selvagem PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHN
AKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTI
SKAK CH3 IgG4 tipo selvagem GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE
NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHY TOKSLSLSLGK
21 Dobra IgG2 modificada ERKSCVECPPCPAPPVAG (02198) Dobra híbrida I9G2/19G1 ERKCCVECPPCPAPELLGG 23 Dobra híbrida C2198S/19G1 ERKSCVECPPCPAPELLGG 1962 24 CH2 modificado Ig9G1 PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN (A330S/P331S) AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTI
SKAK Dobra 961.1 EPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGA (L234A/L235E/G237A) 26 1g61-lg962-l9G1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG (1961-I9G2/1961(SEQH22)- VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE 1961-1961) RKCCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 27 1g61-I962-19612 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG (1961-I9G2(SEQH8)-I961- VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE 1961) RKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WOQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 28 1962-1961 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG (1962-1962/1961(SEQH22)- VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV 1961-1961) ERKCCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH
EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 29 1962-9612 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG (1962-I9G2(SEQH8)-I961- VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV 1961) ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
NS WOQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPG Ig61-962-1961 1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG (961-IgG2(SEAH). VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE 1961(A3308/P3318)-961) | RKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWWVDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPG 31 Ig62-1961.1 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG (19G2-19G2(SEQH8)- VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV 1961(A330S/P331S)-I9G1) ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 32 IgG1-I962CS-1961 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG (gG1-igaa(ca1as)-961. — | VATFPAVLOSSGLYSLSSWTVPSSSLGTATYICNVNHKPSNTKVDKKVE 1961) RKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPG 33 Ig61-I962CS-I9612 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG (gG1gsarca1as) ga. — | VATFPAVLOSSGLYSLSSVWTVPSSSLGTATYICNVNHKPSNTKVDKKVE 1961) RKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPG 34 Ig62CS-Ig61 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG (gG2-ge2(c219s)-961. — | VATFPAVLOSSGLYSLSSWTVPSSNFGTATYTCNVDHKPSNTKVDKTV 1961) ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPG IgG2CS-Ig9612 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG (gG2.962a(c21es) gar. — | VATFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTATYTCNVDHKPSNTKVDKTV 1961) ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 36 Ig61-I9g62CS-I96G1.1 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG (1961-I962(C2198)- VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE I961(A330S/P3318)-19G1) RKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED
PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHOQDWLNGKE YKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 37 IgG2CS-Ig9G1.1 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG (I962-IgG2(C219S)- VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV I9G1(A330S/P331S)-I9G1) ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE
DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WAQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPG 38 Ab 11F11 VH QVQLVESGGGVVAOPGRSLRLSCATSGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEW
VAVILYDGSNKYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
RGGSSWYPDSFDIWGOGTMVTVSS 39 Ab 4C3 VH EVOLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW
VSGISWKSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCV
KGYYVILTGLDYWGQGTLVTVSS 40 Ab CD73.10 VH QVALVESGGGVVAOPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEW
VAVIWYDESNKYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC
ARGGSSWYPDSFDIWGOGTMVTVSS 441 Ab CD73.3 VH (4C3/V94A) | EVOLVESGGGLVOPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW
VSGISWKSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTVLYYCV
KGYYVILTGLDYWGOGTLVTVSS 42 Ab 6E11 VH EVOLVESGGALVOQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW
VSGITWNSGGIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCA
KDRYYSSWLLFDNWGQGILVTVSS 43 Ab CD73.4 VH QVQLVESGGGVVAQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEW
VAVILYDGSNKYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
RGGSSWYPDSFDIWGAQGTMVTVSS 44 HC comprimento integral Ab | QVALVESGGGVVAPGRSLRLSCATSGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEW 11F11 VAVILYDGSNKYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
RGGSSWYPDSFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPS SNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQ PREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOK
SLSLSPGK 45 HC comprimento integral Ab | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW 4c3 VSGISWKSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCV
KGYYVILTGLDYWGQOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTO
KSLSLSPGK 46 HC comprimento integral Ab | EVQLVESGGALVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW 6E11 VSGITWNSGGIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCA
KDRYYSSWLLFDNWGQGILVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY
TOKSLSLSPGK 47 HC comprimento integral Ab | QVALVESGGGVVAPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEW CD73.10-1962-C219S VAVIWYDESNKYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC
ARGGSSWYPDSFDIWGOGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVP SSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTO
KSLSLSPG 48 HC comprimento integral Ab | QVALVESGGGVVAPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEW CD73.10-I1962-C219S8- VAVIWYDESNKYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC 19611 ARGGSSWYPDSFDIWGOGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTA
ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVP SSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTO
KSLSLSPG 49 HC comprimento integral Ab | QVALVESGGGVVAPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEW CD73.10-1961.1 VAVIWYDESNKYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (9611- ARGGSSWYPDSFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA
1961.1(L234AL235E/G237 ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVP A)IGG1.1(A3308/P331S)- SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAP 196141) SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNA
KTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN
HYTOKSLSLSPG 50 HC comprimento integral Ab | QVALVESGGGVVAPGRSLRLSCAASGFTFSNYGMHWVRQAPGKGLEW CD73.4-1962-C2198 VAVILYDGSNKYYPDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
RGGSSWYPDSFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPS SNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQ PREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOK
SLSLSPG 51 HC comprimento integral Ab | EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEW CD73.3-1961.1 VSGISWKSGSIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTVLYYCV (9611- KGYYVILTGLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALG
1961.10L234A/L235E/G237 CLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSS A)IGG1.1(A3308/P331S)- LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVF 19611) LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK
PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAK GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY
TOKSLSLSPG 52 Região constante de cadeia | ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG pesada de comprimento VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV integral I962-I9G2-1962- ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE Ig62 DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK
EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 53 Região constante de cadeia | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG pesada de comprimento VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE integral I9G61-l9G1-I961- PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV 1961 SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL
NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 54 Região constante de cadeia | ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG pesada de comprimento VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVE integral I9G1- PKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
1961.1(L234A/L235E/G237 | SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL A)-IgG1.1 (A330S/P331S)- NGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS 1961 LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 55 Região constante de cadeia | ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG pesada de comprimento VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV integral I962-lg9G2/1961 ERKCCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH hybrid-lgG1-l961 EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG
KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 56 Região constante de cadeia | ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGE pesada de comprimento VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV integral I9G2-lI9G2- ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE
1961.1(A330/P331S)-lgG1 DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK
EYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WOQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Tabela 2 - domínio de dobra | VDKRV [a frame o Tabela 2 - domínio de dobra | EPKS [x frame dar Tabela 2 - domínio de dobra | EPASCDTPPPCPRCP
| e | Tabela 2 - domínio de dobra | CDOTPPPCPRCP | 60 | Tabela 2 - domínio de dobra | CPSCP 72 Cadeia leve 11F11 DIQMTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPEKAPKSLIYA
ASSLOSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQYNSYPLTFG GGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGEC 73 Cadeia leve 403 EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQOAPRLLIYG
ASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPLTFGG GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHO
GLSSPVTKSFNRGEC TA Cadeia leve 6D11 EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY
GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQHYGSSFTFGP GTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVOWKV DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQ
GLSSPVTKSFNRGEC 75 Anti-GITR AbVH QVOLVESGGGVVAQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEW
VAVIWYEGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC
ARGGSMVRGDYYYGMDVWGQGTTVTVSS 76 Anti-GITR Ab VL AIQLTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDA
SSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLOPEDFATYYCQQFNSYPYTFGQ
GTKLEIK T7 Anti-GITR Ab LC AIQLTOSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDA
SSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNSYPYTFGQ GTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKV DNALOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHO
GLSSPVTKSFNRGEC 78 1Ig61f ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 79 1962.3 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
1962.3G1-AY ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 81 1962.361-KH ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 82 1962.5 ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 83 1961.1f ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
1962.3G1.1f-KH ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
85 IgG1-deltaTHT ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 1gG2.3-plusTHT ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVETHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 87 1g62.3-plusGGG ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVEGGGCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDW LNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 88 1962.5G1.1f-KH ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 1g62.5G1-AY ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
1962.5G1-KH ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPGK n 1gG2.5-plusTHT ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVETHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWL NGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 92 1961-G2.3G1-AY ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE RKSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPGK os 1961-G2.3G1-KH ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE RKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKE YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQAGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK G62-61-61-61 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE R KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ES) G2.5-61-61-G1 ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG Vv
HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE R KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC
LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR Ww
QQAGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 61-62.3-62-62 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLN GK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QAGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 97 G1-KRGEGSSNLF ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QQAGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK G1-KRGEGS ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC
LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR w
QQAGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK G1-SNLF ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK IgG1-ITNDRTPR ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG Vv
HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE R KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QQAGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK G1-SNLFPR ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVER KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
[q =] QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 102 G2-RKEGSGNSFL ASTKGPSVFPLAPCSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE R KSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLN GK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 103 G2-RKEGSG ASTKGPSVFPLAPCSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG Vv
HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE R KSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLN GK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 104 G2-NSFL ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE R KSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLN GK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC
LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR w
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
105 IgG2-TIDNTRRP ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG Vv
HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLN GK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QQAGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK G2-NSFLRP ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG Vv
HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVEP KSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLN GK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QQAGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 107 G61-G61-62-G1-AY ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG Vv
HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLN GK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK G61-61-62-G1-KH ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLN GK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QQAGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK G62-62.3-61-G2-KH ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE R KSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 110 G62.5-G2.3-G1-G2-KH ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG Vv
HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE R KSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 111 G62-62.3-61-62-AY ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE R KSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QQAGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 112 G62.5-G2.3-61-G2-AY ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE R KSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QQAGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 113 G61-62.3-G1-G1-KH ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QAGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 114 G62-G1-G2-G2-AY ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE R KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLN GK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QAGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 115 G62.5-G1-62-G62-AY ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE R KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLN GK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QQAGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 116 G1-G2-G1-G1-AY ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QAGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 17 G62-61-62-62-KH ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE R KSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLN GK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC
LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR Ww
QQAGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPG G62.5-G1-G2-G2-KH ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE R KSCDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLN GK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QAGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 119 IgG1-deltaHinge ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QAGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 120 IgG2-deltaHinge ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE R KCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLN GK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR W
QAGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 121 1gG2.5-deltaHinge ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
V HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTOTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE R KCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLN GK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC
LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR wW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 122 1961-deltaG237 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG v
HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTOTYICNVNHKPSNTKVDKRVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC
LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR w
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPG 123 I962-plusG237 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG v
HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTATYTCNVDHKPSNTKVDKTVE R KSCVECPPCPAPPVAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLN fe
EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC
LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR w
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 124 1962.4 ASTKGP SVFPLAPCSR STSESTAALG
CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LOSSGLYSLS SVVTVPSSNF GTQTYTCNVD HKPSNTKVDK TVERKCSVEC PPCPAPPVAG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVOQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STFRVVSVLT VWVHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPAPIEKTIS KTKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPM LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT
QKSLSLSPGK 125 1962.3/4 ASTKGP SVFPLAPCSR STSESTAALG
CLVKDYFPEP VTVSWNSGAL TSGVHTFPAV LOSSGLYSLS SVVTVPSSNF GTQTYTCNVD HKPSNTKVDK TVERKSSVEC PPCPAPPVAG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVQFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQFN STFRVVSVLT VWVHQDWLNGK EYKCKVSNKG LPAPIEKTIS KTKGQPREPQ VYTLPPSREE MTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPM LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT
QKSLSLSPGK 127 Dobra híbrida Ig9G2/19G1 ERKCSVECPPCPAPELLGG C220S 128 Porção de dobra IgG2 tipo ERKCCVECPPCPAP selvagem 129 Porção de dobra I9G2 ERKSCVECPPCPAP C2198 130 Porção de dobra I9G2 ERKCSVECPPCPAP C220S 131 Porção de dobra IgG2 ERKXCVECPPCPAP C219X 132 Porção de dobra IgG2 ERKCXVECPPCPAP C220X 133 IgG2 CH1+IgG2 dobra (tipo | ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG selvagem) VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV
ERKCCVECPPCPAPPVAG 1962 com C219X ERKXCVECPPCPAPPVAG
1gG2 com C220X ERKCXVECPPCPAPPVAG 136 Híbrido I9G2/19G1 com ERKXCVECPPCPAPELLGG C219X 1837 Híbrido I9G2/19G1 com ERKCVECPPCPAPELLGG C220X Híbrido IgG2/19G1 deltaG ERKCCVECPPCPAPELLG 139 Híbrido I9G2/19G1 com ERKSCVECPPCPAPELLG C2198 deltaG Híbrido I9G2/19G1 com ERKCSVECPPCPAPELLG C2208 deltaG Híbrido IgG2/19G1 com ERKXCVECPPCPAPELLG C219X deltaG 142 Híbrido IgG2/19G1 com ERKCXVECPPCPAPELLG C220X deltaG 143 1gG2 tipo selvagem com X ERKCCVECPPCPAPPVAGX C-terminal 144 1962 com C2198 com X C- | ERKSCVECPPCPAPPVAGX terminal 145 1gG2 com C220S com XC- | ERKCSVECPPCPAPPVAGX terminal 1gG2 com C219X com XC- | ERKXCVECPPCPAPPVAGX terminal 147 IgG2 com C220X com XC- | ERKCXVECPPCPAPPVAGX terminal 8 | 1gG2 porção de dobra PVAG le | 1gG1 porção de dobra SCDKTHT 1gG1 porção de dobra 1 ELLG 1gG1 porção de dobra 2 ELLGG 152 1962.3-V13 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGDSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
1962.3-V14 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGDSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DGEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 154 1962.3-V15 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGDSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSDE DGEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPGK 155 1962.3-V16 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGDSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DGEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPRPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 156 1962.3-V17 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGDSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSDE DGEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPRPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPGK 157 1962.3-V18 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 158 1962.3-V19 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGFPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
159 1962.361 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
1962.3G1-V20 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELLGGDSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
1962.361-V21 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELLGGDSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHODWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 162 1962.3G1-V22 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELLGGDSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSD EDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 163 1962.3G61-V23 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELLGGDSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPRPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 164 1962.3G1-V24 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELLGGDSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSD EDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPRPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
[O o ReeowAcSENTDTTAÇPK == | 165 1962.3G61-V25 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELLGDDSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSD EDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPRPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
1962.3G1-V26 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPDLLGDDSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSD EDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPRPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 167 1962.361-V27 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
1962.3G1-V28 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
1962.3G1-AY-V9-D270E ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELLGDDSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EEGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPRPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 170 1962.3G1-AY-V11 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELLGDDSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSD EDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPRPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT
CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS do resmameanA | 171 1962.5G1-AY-V9-D270E ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPELLGDDSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EEGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPRPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 172 1962.5G1-AY-VI1 ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPELLGDDSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSD EDGEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHODWLNG KEYKCKVSNKALPRPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 173 IgG1fGASDALIE ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD
KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 174 IgG1f-G236A ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 175 1g62.3G1-AY-G236A ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELLAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHOQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 176 1962.3G1-AY-GASDALIE ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 7 1962.5G1-AY-G236A ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPELLAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 178 1gG62.5G1-AY-GASDALIE STKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV
HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE RKCCVECPPCPAPELLAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPGK 179 1962.3G1.1f-AY ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
1962.3G1.3-AY ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
1962.3G1-AY-D265A ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 182 1962.3G1-AY-N297A ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 183 1962.5G1.1f-AY ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 184 1962.5G1.3f-AY ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 185 1962.5G1-AY-D265A ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPGK 1gG62.5G1-AY-N297A ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 187 cr ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQOKSLSLSPGK
1962.3-CT ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVESPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
1962.5-CT ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVESPPSPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK IgG1fa-C226S ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTSPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 192 IgG1fa-C229S ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPSPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 193 IgG1fa-C2268,C2298S ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPGK
194 IgG1fa-P238S ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGSSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 195 IgG1fa-C226A ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTAPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK IgG1fa-C229A ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPAPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 197 IgG1fa-C226A,C229A ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTAPPAPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGOPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK IgG1fa-P238K ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHODWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 1g62.3-R133K ASTKGPSVFPLAPCSKSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
LL ya — 200 1962.3-E137G ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGSTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 201 1962.3-8138G ASTKGPSVFPLAPCSRSTSEGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 202 1962.3-E137G-S138G ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPGK 203 1962.3-T214R ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKRV ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 204 1gG62.3-R217P ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV EPKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 205 1962.3-R217S ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ESKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC
LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR do Serena | 206 1962.3-V224A ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCAECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPGK 207 1962.3-E225A ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVACPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 208 1gG2.3-R133A ASTKGPSVFPLAPCSASTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 209 1962.3-E137D ASTKGPSVFPLAPCSRSTSDSTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVY ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 210 1962.3-E137Q ASTKGPSVFPLAPCSRSTSQOSTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 211 1962.3-8138T ASTKGPSVFPLAPCSRSTSETTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 212 1962.3-S138E ASTKGPSVFPLAPCSRSTSEETAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 213 1962.3-E137A-S1381 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSAITAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV
HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE RKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKE YKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 214 1962.3-E1371-8138A ASTKGPSVFPLAPCSRSTSIATAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGV
HTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE RKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQODWLNGKE YKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 215 1962.3-R217G ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV EGKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 216 1gG62.3-R217A ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV EAKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 217 1962.3-R2171 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV EIKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPGK 218 1962.3-R217E ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV EEKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 219 1962.3-R217K ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV EKKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPGK 220 1962.3-V224| ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCIECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 221 1gG2.3-E225D ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVDCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 222 1962-G4.1-G4-G4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKS
RWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 223 1964-G2.3-G2-G2 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE SKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQODWLNGKE YKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW
QQAGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPGK 224 1962-G4.1-G2-G2 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 225 1964-G2.3-G4-G4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE SKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQED PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKE YKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCL VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRW
QEGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSLGK 226 1962-G2.3-G4-G4 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHODWLNGK EYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR
WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSLGK 227 1964-G4.1-G2-G2 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE SKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 228 1g9G4-G4.1-G1-G1 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE SKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE SKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR
WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 230 19G4.1-R214T ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKTVE SKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR
WOQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 231 1964.1-8217R ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE RKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR
WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSLGK 232 1964.1-8217P ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVE PKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSR
WQEGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSLGK 233 IgG1fa ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG 234 1961.3fa ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPGK
235 IgG1fa-P238K ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 236 1961.3fa-P238K ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 237 IgG1fa-L235E-P238K ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELEGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 238 IgG1fa-L235A-P238K ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELAGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGOPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 239 IgG1fa-L235E-P238K- ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG K322A VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE
PKSCDKTHTCPPCPAPELEGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHODWL NGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 240 1962.3 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
LL ya — 241 1962.3-P238K ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPPVAGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 242 1962.361 ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 243 1962.3G61-P238K ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 244 1962.3G1-L235E-P238K ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELEGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 245 1g62.5G1-P238K ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 246 hige1f ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS
LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK do deem | 247 hIgG1f-P238K ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 248 hlg61.3f ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 249 hIgG1.3f-P238K ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 250 hIgG1f-L235E-P238K ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE PKSCDKTHTCPPCPAPELEGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 251 hIgG1f-L235E-P238K- ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG K322A VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVE
PKSCDKTHTCPPCPAPELEGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK
SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOQKSLSLSPGK 252 1962.361.3f ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 253 1962.3G1.3f-P238K ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPEAEGAKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 244 1962.3G1-L235E-P238K ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKSCVECPPCPAPELEGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 254 1962.361-L235E-P238K- ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG K322A VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV
ERKSCVECPPCPAPELEGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 255 1962.5 ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHE DPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR
WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 256 1g62.5-P238K ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPPVAGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVOQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 257 1962.561 ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 258 I962.5G1-P238K ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNG KEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 259 1gG62.5G1.3f ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTATYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPEAEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 260 I962.5G1.3f-P238K ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPEAEGAKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 261 1g962.5G1-L235E-P238K ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV ERKCCVECPPCPAPELEGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHOQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK 262 1962.5G1-L235E-P238K- ASTKGPSVFPLAPSSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG K322A VHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTV
ERKCCVECPPCPAPELEGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCAVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS
RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 263 3h56-269-19G4.1 EVOLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLER oR vãA
BMS-986090 INPOGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLP
FRFSDRGQGTLVTVSSASTESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPK D
TLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVOFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS 7T
YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQV Y TLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL D
SDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK 264 EVOLLESGGGLVAPGGESLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLER
VSA INPOGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKLP FRFSDRGQGTLVTVSSASTEPKSSDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLFPPK
PKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ 3h56-269-CT Y
NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP P VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP
GK 265 EVOLLESGGGLVAPGESLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLER
VSAINPOGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCA
KLPFRFSDRGOGTLVTVSSASTEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFL 3h56-269-1961 1 FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP 9 REEQYNSTYRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTO
KSLSLSPGK 266 EVOLLESGGGLVAPGESLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLER
VSAINPOGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCA
KLPFRFSDRGOGTLVTVSSASTEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFL 3h56-269-1961 31 FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP 9 REEQYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG
QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGK
267 EVOLLESGGGLVAPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVRQAPGKGLER
VSAINPOGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOQMNSLRAEDTAVYYCA KLPFRFSDRGOGTLVTVSSASTEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF
PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR 3h56-269-19G1-D265A
EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOK
SLSLSPGK 268 EVOLLESGGGLVAPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVRQAPGKGLEWV
SAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLOMNSLRAEDTAVYYCAK 1F4 Região variável de
VDYSNYLFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC cadeia pesada e CH1
LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSL
GTQTYICNVNHKPSNTKVDKRV 269 EIVLTOSPGTLSLSPGERATLSCRASQSISSSYLAWYQQKPGQAPRLLIY
GASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPYTFG 1F4 Região variável de deia h ec QGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK cadeia leve e
VDNALOSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTH
QGLSSPVTKSFNRGEC 270 EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVRQAPGKGLEWYV
SAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLQMNSLRAEDTAVYYCAK VDYSNYLFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSL
GTATYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFL 1F4-Ig9G1f cadeia pesada
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQO
KSLSLSPGK 271 EVOLLESGGGLVAPGESLRLSCAASGFTFSIYAMSWVRQAPGKGLEWV
SAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLOMNSLRAEDTAVYYCAK VDYSNYLFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSL
GTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPP 1F4-19G4.1 cadeia pesada
KPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGOPR EPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLS
LSLG 272 EVOLLESGGGLVAPGESLRLSCAASGFTFSIYAMSWVRQAPGKGLEWV 1F4-19G1.1f cadeia pesada | SAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLOMNSLRAEDTAVYYCAK
VDYSNYLFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFL FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPSSIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTO
KSLSLSPG 273 EVOLLESGGGLVAPGGESLRLSCAASGFTFSIYAMSWVRQAPGKGLEWV
SAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLQMNSLRAEDTAVYYCAK VDYSNYLFFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC
LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSL 1F419G1.31 cadeia pesada GTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAEGAPSVFL
FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTO
KSLSLSPG 274 EVOLLESGGGLVOQPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVROAGKGLEWVS
AISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLQMNSLRAEDTAVYYCAKV DYSNYLFFDYWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCL VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSLG
TQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP 1F4-D265A cadeia pesada
PKPKDTLMISRTPEVTCVVVAVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSL
SLSPGK 275 EVOLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSIYAMSWVRQAPGKGLEWYV
SAISDSGGRTYFADSVRGRFTISRDNSKNTLSLOMNSLRAEDTAVYYCAK VDYSNYLFFDYWGOGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSSL
GTAOTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGSSVFLF 1F4-CT cadeia pesada
PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ PREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNY KTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTOK SLSLSPGK
[00439] Aqueles versados na técnica reconhecerão ou serão capazes de determinar, usando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes das modalidades específicas descritas aqui.
Tais equivalentes pretendem ser compreendidos pelas reivindicações que seguem.

Claims (185)

REIVINDICAÇÕES
1. —Anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende uma região constante de cadeia pesada modificada em que a região constante de cadeia pesada modificada compreende um domínio CH1, uma dobra, um domínio CH2 e um domínio CH3 na ordem do terminal N para o C, em que a dobra é de um isotipo IgG2 e pelo menos um dos domínios CH1, CH2 ou CH3 não é um isotipo IgG2.
2. Anticorpoy de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dobra é uma dobra de I9gG2 humana do tipo selvagem ou compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de uma dobra de I9gG2 humana do tipo selvagem.
3. —Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a dobra contém uma ou mais modificações que reduzem a formação de ligação dissulfeto.
4. "Anticorpoy de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a dobra compreende a substituição de aminoácido C219S.
5. —Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a dobra compreende a sequência de aminoácido de qualquer uma de SEQ ID Nº: 8, 21-23, 126-132 ou 134-147 ou uma sequência que compreende 1-3 aminoácidos inseridos entre CVE e CPP.
6. Anticorpoy, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o domínio CH1 é um domínio CH1 de 1gG2.
7. Anticorpoy, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o domínio CH1 é um domínio CH1 de IgG2 humana do tipo selvagem ou compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95%
idêntica à sequência de aminoácido de um domínio CH1 de I1gG2 humana do tipo selvagem.
8. —Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o domínio CH1 de 1I1gG2 compreende a sequência de aminoácido
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT
SGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTATYTCNVDHKPSNTKV DKTV (SEQ ID Nº: 7).
9. Anticorpoy, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o domínio CH2 é um domínio CH2 de I9G1.
10. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o domínio CH2 é um domínio CH2 de IgG1 humana do tipo selvagem ou compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de um domínio CH2 de IgG1 humana do tipo selvagem.
11. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o domínio CH2 compreende uma ou mais modificações que reduzem ou eliminam funções efetoras.
12. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o domínio CH2 compreende substituições de aminoácido A330S e P331S.
13. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o domínio cH2 compreende a sequência de aminoácido
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV
HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAK (SEQ ID Nº: 4).
14. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o domínio CH3 é um domínio CH3 de IgG1.
15. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o domínio CH3 é um domínio CH3 de IgG1 humana do tipo selvagem ou compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de um domínio CH3 de I1gG1 humana do tipo selvagem.
16. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o domínio cH3 compreende a sequência de aminoácido
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID Nº: 5).
17. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o domínio CH3 compreende substituições de aminoácido E356D e M358L.
18. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que tem pelo menos uma propriedade potencializada ou uma propriedade nova introduzida em relação ao mesmo anticorpo que compreende uma dobra e domínio CH1 de IgG1.
19. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem pelo menos uma propriedade potencializada selecionada de atividade agonista, internalização de receptor mediada por anticorpo, ADCC, sinalização mediada por — receptor, atividade antagonista, atividade imunomoduladora e atividade antitumor; ou uma propriedade recém- introduzida, que é atividade agonista.
20. Anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende uma região constante de cadeia pesada modificada compreendendo um domínio CH1, uma dobra, um domínio CH2 e um domínio CH3 na ordem do terminal N para o C e em que (a) o domínio CH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID Nº: 7 ou uma sequência de aminoácido que difere da mesma no máximo em 5 aminoácidos ou que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 7, e em que pelo menos um de C131, R133, E137, S138 ou R217 não é substituído ou deletado; (b) uma dobra compreendendo qualquer uma de SEQ ID Nº: 8, 21-23, 126-132 ou 134-147 ou uma sequência que compreende 1-3 aminoácidos inseridos entre CVE e CPP, ou que difere da mesma em no máximo 5 aminoácidos, em que a dobra não compreende uma substituição ou deleção em ambos C219 e C220; (c) o anticorpo tem pelo menos uma propriedade potencializadora ou uma nova propriedade introduzida em relação ao mesmo anticorpo que compreende uma dobra e domínio CH1 de IgG1; e (d) a região constante de cadeia pesada modificada não é uma região constante de IgG2 do tipo selvagem ou uma região constante de IgG2 compreendendo C219S e/ou C2208S.
21. Anticorpoy, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a dobra compreende a sequência de aminoácido — ERKXCVECPPCPAP É(SEQ |D Nº 129) ou ERKCXVECPPCPAP (SEQ ID Nº: 130), em que X é qualquer aminoácido exceto cisteína.
22. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a dobra compreende a sequência de aminoácido — ERKSCVECPPCPAP É(SEQ I|D Nº 131) ou ERKCSVECPPCPAP (SEQ ID Nº: 132).
23. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo fato de que pelo menos um de P233, V234, A235 ou G237 é deletado ou substituído com um outro resíduo de aminoácido.
24. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que P233, V234, A235 e G237 são deletados ou substituídos com um outro resíduo de aminoácido.
25. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 24, caracterizado pelo fato de que nenhum dos resíduos de aminoácido R133, E137, S138 e R217 é substituído ou deletado.
26. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que nenhum dos resíduos de aminoácido C131, R133, E137, S138 e R217 é substituído ou deletado.
27. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 26, caracterizado pelo fato de que N192 é substituído com um outro aminoácido.
28. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 27, caracterizado pelo fato de que F193 é substituído com um outro aminoácido.
29. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 28, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio CH2 que é pelo menos 95% idêntico àquele de uma IgG1 do tipo selvagem.
30. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 29, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio CH3 que é pelo menos 95% idêntico àquele de IgG1 do tipo selvagem.
31. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, caracterizado pelo fato de que o domínio CH2 e/ou CH3 não é um domínio CH2 e/ou CH3 de IgG1 do tipo selvagem, e em que o anticorpo tem uma função efetora que é mais potente do que aquela de IgG1 do tipo selvagem.
32. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, caracterizado pelo fato de que o domínio CH2 e/ou CH3 não é um domínio CH2 e/ou CH3 de IgG1 do tipo selvagem, e em que o anticorpo tem uma função efetora que é menos potente do que aquela de IgG1 do tipo selvagem.
33. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 32, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio CH2 que é pelo menos 95% idêntico àquele de IgG4 do tipo selvagem.
34. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 32, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio CH3 que é pelo menos 95% idêntico àquele de IgG4 do tipo selvagem.
35. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 34, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem pelo menos uma propriedade potencializada selecionada de atividade agonista, internalização de receptor mediada por anticorpo, ADCC, sinalização mediada por receptor, atividade antagonista, atividade imunomoduladora ou atividade antitumor; ou uma propriedade recém- introduzida, que é atividade agonista.
36. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que (a) odomínio CH1 é um domínio CH1 de IgG2 humana do tipo selvagem; (b) a dobra compreende SEQ ID Nº: qualquer uma das SEQ ID Nº: SEQ ID Nº: 8, 21-23, 126-132 ou 134-147 ou uma sequência que compreende 1-3 aminoácidos inseridos entre CVE e
CPP; (c) odomínio CH2 é um domínio CH2 de IgG1 humana do tipo selvagem ou um domínio CH2 modificado conferindo função efetora potencializada ou reduzida ao anticorpo; e (d) odomínio CH3 é um domínio CH3 de IgG1 humana do tipo selvagem ou um domínio CH3 modificado conferindo função efetora potencializada ou reduzida ao anticorpo.
37. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações — precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de aminoácido mostrada em qualquer uma das SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262 ou uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica às SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262.
38. Anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende uma região constante de cadeia pesada modificada, em que a região constante de cadeia pesada compreende um domínio CH1 e uma dobra compreendendo a sequência
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT
SGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKV DKTVERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID Nº 133) ou uma sequência de aminoácido que difere da SEQ ID Nº: 133 em no máximo aminoácidos ou é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID Nº: 133, em que pelo menos um de C131, R133, E137, S138 e R217 é não substituído com um outro aminoácido ou deletado; C219 e C220 podem ser substituídos com um outro aminoácido ou deletados, mas C219 e C220 podem não ser ambos substituídos ou deletados; 1-3 aminoácidos podem ser inseridos entre CVE e CPP na dobra; a dobra compreende opcionalmente um aminoácido adicional no terminal C, por exemplo, G; um ou mais de aminoácidos P233, V234, A235 e G237 podem ser substituídos com um outro aminoácido (por exemplo, o aminoácido correspondente de I9gG1) ou deletados; os domínios CH2 e CH3 podem ser domínios CH2 e CH3 de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 do tipo selvagem ou modificados; a região constante de cadeia pesada modificada não é uma região constante de cadeia pesada de IgG2 do tipo selvagem ou um domínio constante pesado de IgG2 do tipo selvagem com C2198S ou C2208S; e o anticorpo tem pelo menos uma propriedade potencializada ou uma propriedade nova introduzida em relação ao mesmo anticorpo que compreende uma dobra de IgG1 e um domínio cH1.
39. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem pelo menos uma propriedade potencializada selecionada de atividade agonista, internalização de receptor mediada por anticorpo, ADCC, sinalização mediada por — receptor, atividade antagonista, atividade imunomoduladora ou atividade antitumor; ou uma propriedade recém- introduzida, que é atividade agonista.
40. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que nenhum dos aminoácidos C131; R133; E137; S138; R217 é substituído com um outro aminoácido ou deletado.
41. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 40, caracterizado pelo fato de que N192 e/ou F193 são não substituídos ou são N1928S e/ou F193L, respectivamente.
42. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 41, caracterizado pelo fato de que C219 é C219S.
43. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 41, caracterizado pelo fato de que C220 é C2208S.
44. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 43, caracterizado pelo fato de que P233-G237 são substituídos ou deletados.
45. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 43, caracterizado pelo fato de que V234-G237 são substituídos ou deletados.
46. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 43, caracterizado pelo fato de que A235-G237 são substituídos ou deletados.
47. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 43, caracterizado pelo fato de que G237 é substituído ou deletado.
48. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 43, caracterizado pelo fato de que P233 é substituído ou deletado.
49. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 43, caracterizado pelo fato de que P233-V234 são substituídos ou deletados.
50. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 43, caracterizado pelo fato de que P233-A235 são substituídos ou deletados.
51. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 50, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem função efetora.
52. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 50, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não tem função efetora.
53. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 52, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio CH2 de IgG1 do tipo selvagem ou modificado.
54. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 38 a 52, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio CH3 de IgG1 do tipo selvagem ou modificado.
55. Anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende uma região constante de cadeia pesada modificada, em que a região constante de cadeia pesada compreende um domínio CH1 compreendendo a sequência
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT
SGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQATYTCNVDHKPSNTKV DKTVE (SEQ |D Nº: 7), ou uma sequência de aminoácido que difere da SEQ ID Nº: 7 em no máximo 10 aminoácidos ou é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID Nº: 7, em que pelo menos um de C131, R133, E137, S138 e R217 é não substituído ou deletado; a região constante de cadeia pesada modificada não é uma região constante de cadeia pesada de IgG2 do tipo selvagem ou um domínio constante pesado de IgG2 do tipo selvagem com C2198S ou C2208S; e o anticorpo tem pelo menos uma propriedade potencializada ou uma propriedade nova introduzida com relação ao mesmo anticorpo que compreende uma dobra e domínio CH1 de IgG1.
56. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem pelo menos uma propriedade potencializada selecionada de atividade agonista, internalização de receptor mediada por anticorpo, ADCC, sinalização mediada por — receptor, atividade antagonista, atividade imunomoduladora ou atividade antitumor; ou uma propriedade recém- introduzida, que é atividade agonista.
57. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 55 ou 56, caracterizado pelo fato de que nenhum dos aminoácidos C131; R133; E137 e S138 é substituído com um outro aminoácido ou deletado.
58. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 57, caracterizado pelo fato de que N192 e/ou F193 não são substituídos ou são N192S e/ou F193L, respectivamente.
59. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 58, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem função efetora.
60. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 58, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não tem função efetora.
61. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 60, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio CH2 de IgG1 do tipo selvagem ou modificado.
62. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 a 61, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio CH3 de IgG1 do tipo selvagem ou modificado.
63. Anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende uma região constante de cadeia pesada modificada, em que a região constante de cadeia pesada compreende uma dobra compreendendo a sequência ERKCCVECPPCPAPPVAG (SEQ ID Nº: 8), ou uma sequência de aminoácido que difere da SEQ ID Nº: 8 em no máximo 5 aminoácidos, em que C219 e C220 podem ser substituídos com um outro aminoácido ou deletados, mas C219 e C220 podem não ser ambos substituídos ou deletados; um ou mais de aminoácidos P233, V234, A235 e G237 podem ser substituídos ou deletados; 1-3 aminoácidos podem ser inseridos entre CVE e CPP na dobra; a dobra compreende opcionalmente um aminoácido adicional no terminal C, por exemplo, G; os domínios CH2 e CH3 podem ser domínios CH2 e CH3 de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 do tipo selvagem ou modificados; a região constante de cadeia pesada modificada não é uma região constante de cadeia pesada de IgG2 do tipo selvagem ou um domínio constante pesado de IgG2 do tipo selvagem com C2198 ou C2208S; e o anticorpo tem pelo menos uma propriedade potencializada ou uma propriedade recém-introduzida com relação ao mesmo anticorpo que compreende uma dobra e domínio CH1 de IgG1.
64. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem pelo menos uma propriedade potencializada selecionada de atividade agonista, internalização de receptor mediada por anticorpo, ADCC, sinalização mediada por receptor, atividade antagonista, atividade imunomoduladora ou atividade antitumor; ou uma propriedade recém- introduzida, que é atividade agonista.
65. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 64, caracterizado pelo fato de que C219 é C219S.
66. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 64, caracterizado pelo fato de que C220 é C220S.
67. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 66, caracterizado pelo fato de que P233-G237 são mutados ou deletados.
68. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 66, caracterizado pelo fato de que V234-G237 são mutados ou deletados.
69. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 66, caracterizado pelo fato de que A235-G237 são mutados ou deletados.
70. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 66, caracterizado pelo fato de que 6237 é mutado ou deletado.
71. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 66, caracterizado pelo fato de que P233 é mutado ou deletado.
72. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 66, caracterizado pelo fato de que P233-V234 são mutados ou deletados.
73. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 66, caracterizado pelo fato de que P233-A235 são mutados ou deletados.
74. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 73, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem função efetora.
75. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 73, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não tem função efetora.
76. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 75, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio CH2 de IgG1 do tipo selvagem ou modificado.
77. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 63 a 76, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio CH3 de IgG1 do tipo selvagem ou modificado.
Anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende uma região constante de cadeia pesada modificadaem que a região constante de cadeia pesada compreende uma dobra IgG1 ou I19G2, e em que a dobra não possui 1-7 aminoácidos, e em que o anticorpo possui pelo menos uma propriedade potencializada ou uma propriedade recém-introduzida em relação ao mesmo anticorpo que compreende uma dobra IgG1 e um domínio CH1.
79. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem pelo menos uma propriedade potencializada selecionada de atividade agonista, internalização de receptor mediada por anticorpo, ADCC, sinalização mediada por receptor, atividade antagonista, atividade imunomoduladora ou atividade antitumor; ou uma propriedade recém-introduzida, que é atividade agonista.
80. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 78 ou 79, caracterizado pelo fato de que a dobra é uma dobra de I9gG2 que não tem 1-4 aminoácidos.
81. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que a dobra de IgG1 não tem os aminoácidos C219, C220, V222 e E224.
82. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 78 ou 79, caracterizado pelo fato de que a dobra é uma dobra de IgG1 que não tem os aminoácidos S219, C220, D221, K222, T223, H224 e T225.
83. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 78 a 82, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio CH1 de IgG2 que é do tipo selvagem ou modificado.
84. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 78 a 82, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio CH1 de IgG1 que é do tipo selvagem ou modificado.
85. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 78 a 84, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio CH2 de IgG2.
86. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 78 a 84, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio CH2 de IgG1.
87. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 78 a 86, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio CH3 de IgG2.
88. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 78 a 86, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio CH3 de IgG1.
89. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo humano ou humanizado ou porção de ligação a antígeno do mesmo.
90. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga especificamente a um antígeno que está envolvido em regulagem imune.
91. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um agonista de um receptor coestimulador ou um antagonista de um receptor inibidor.
92. Anticorpo,y de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o receptor coestimulador é selecionado do grupo de B7-1, B7-2, CD28, 4-1BB, GITR, OX40, ICOS, CD70, CD27, CD40, DR3 ou CD28H.
93. Anticorpoy, de acordo com a reivindicação 91, caracterizado pelo fato de que o receptor inibidor é selecionado do grupo de CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM-1 e TIM-4.
94. Anticorpo,y de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que o antígeno é CD73 ou CD39.
95. Anticorpo caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a um receptor coestimulador e compreende uma região constante de cadeia pesada selecionada do grupo de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262.
96. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 95, caracterizado pelo fato de que o receptor coestimulador é GITR, OXA40, 4-1BB, CD28, ICOS, CD40L, CD27 ou qualquer outro membro da superfamília TNFR.
97. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 95 ou 96, caracterizado pelo fato de o anticorpo exibe atividade agonista potencializada ou alterada em relação a um anticorpo tendo as mesmas regiões variáveis e cadeia leve, mas compreendendo uma região constante de cadeia pesada de IgG1.
98. Anticorpo caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a uma molécula de superfície celular e dispara internalização mediada por anticorpo da molécula de superfície celular e compreende uma região constante de cadeia pesada modificada selecionada do grupo de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262.
99. Anticorpo,y, de acordo com a reivindicação 98, caracterizado pelo fato de que a molécula de superfície celular é CD73.
100. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 98 ou 99, caracterizado pelo fato de que o anticorpo possui propriedades de internalização potencializadas ou alteradas em relação a um anticorpo tendo as mesmas regiões variáveis e cadeia leve, mas compreendendo uma região constante de cadeia pesada de IgG1.
101. Anticorpo caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a um receptor inibidor e compreende uma região constante de cadeia pesada modificada selecionada do grupo de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262.
102. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 101, caracterizado pelo fato de que o receptor inibidor é CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM-3, Galectina 9, CEACAM-1, BTLA, CD69, Galectina-1, TIGIT, CD113, GPR56, VISTA, 2B4, CD48, GARP, PD1H, LAIR1, TIM- 1 e TIM-4.
103. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 101 ou 102, caracterizado pelo fato de que o anticorpo exibe atividade antagonista mais potente ou alterada ou introduz uma nova atividade em relação ao mesmo anticorpo tendo uma região constante de cadeia pesada de Ig9G1.
104. Anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de superfície celular e dispara sinalização intracelular, caracterizado pelo fato de que compreende uma região constante de cadeia pesada modificada selecionada do grupo de SEQ ID NOs 26-37, 54-56, 78- 125, 152-232, 234-245 e 247-262.
105. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 104, caracterizado pelo fato de que a sinalização intracelular faz a mediação da atividade agonista, atividade antagonista, internalização da molécula de superfície celular ou ADCC.
106. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 104 ou 105, caracterizado pelo fato de que o anticorpo dispara sinalização intracelular mais potente em relação a um anticorpo tendo as mesmas regiões variáveis e cadeia leve, mas compreendendo uma região constante de cadeia pesada de Ig9G1.
107. Anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de superfície celular e dispara formação de complexos de anticorpo de peso molecular alto-molécula de superfície celular, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada modificada selecionada do grupo de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262.
108. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 107, caracterizado pelo fato de que o anticorpo dispara formação de complexos de peso molecular maior em relação a um anticorpo tendo as mesmas regiões variáveis e cadeia leve, mas compreendendo uma região constante de cadeia pesada de IgG1.
109. Anticorpo que se liga especificamente a uma molécula de superfície celular e dispara agrupamento ou oligomerização da molécula de superfície celular, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada modificada selecionada do grupo de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262.
110. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que o anticorpo dispara mais agrupamento ou oligomerização da molécula de superfície celular em relação a um anticorpo tendo as mesmas regiões variáveis e cadeia leve, mas compreendendo uma região constante de cadeia pesada de I9G1.
111. Molécula biespecífica compreendendo o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizada pelo fato de ser ligada a uma molécula tendo uma especificidade de ligação secundária.
112. Imunoconjugado compreendendo o anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de ser ligado a um segundo agente.
113. Composição caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo, biespecífico ou imunoconjugado, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 112, e um carreador.
114. Composição, de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um ou mais agentes terapêuticos adicionais.
115. Composição, de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico adicional estimula o sistema imune.
116. Composição, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico é um antagonista de um inibidor de ponto de checagem ou um receptor coestimulador.
117. Método de preparação de um anticorpo compreendendo uma região constante de cadeia pesada modificada, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio CH1, uma dobra, um domínio CH2 e um domínio CH3 na ordem do terminal N para o C compreendendo as etapas de: (a) provisão de um anticorpo compreendendo uma dobra e/ou um domínio CH1 que não é uma dobra de IgG2 e/ou domínio CH1 de 19G2; (b) substituição da dobra e/ou domínio CH1 com uma dobra de IgG2 e/ou domínio CH1 de IgG2, respectivamente.
118. Método de aumento da internalização de um anticorpo por uma célula caracterizado pelo fato de que compreende: (a) provisão de um anticorpo compreendendo uma dobra e/ou domínio CH1 que não é uma dobra de IgG2 e/ou um domínio CH1 de 19G2; (b) substituição da dobra e/ou do domínio CH1 com uma dobra de IgG2 e/ou domínio CH1 de IgG2, respectivamente.
119. Método, de acordo com a reivindicação 118, caracterizado pelo fato de que internalização do anticorpo é aumentada comparado com internalização do mesmo anticorpo compreendendo uma dobra de um isotipo não IgG2, por exemplo, um anticorpo compreendendo uma região constante de IgG1.
120. Método de aumento da atividade agonista de um anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende: (a) provisão de um anticorpo compreendendo uma dobra e/ou um domínio CH1 que não é uma dobra de IgG2 e/ou domínio CH1 de 19G2; (b) substituição da dobra e/ou do domínio CH1 com uma dobra de IgG2 e/ou domínio CH1 de IgG2, respectivamente.
121. Método, de acordo com a reivindicação 120, caracterizado pelo fato de que a atividade agonista é aumentada comparado com atividade agonista do mesmo anticorpo compreendendo uma dobra de um isotipo não IgG2, por exemplo, um anticorpo compreendendo uma região constante de IgG1.
122. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 117 a 121, caracterizado pelo fato de que a dobra de I9G2 é uma dobra de IgG2 humana do tipo selvagem ou compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de uma dobra de IgG2 humana do tipo selvagem.
123. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 117 a 122, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de substituir pelo menos um dos domínios CH1, CH2 ou CH3 com um domínio CH1, CH2 ou CH3 de um isotipo diferente respectivamente.
124. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 117 a 123, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) substituir o domínio CH1 com um domínio CH1 de
19G2; (b) substituir o domínio CH2 com um domínio CH2 de I9G1; e/ou (c) substituir o domínio CH3 com um domínio CH3 de IgG1.
125. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 117 a 124, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de (a) substituir o domínio CH1 com um domínio CH1 de IgG2 humana do tipo selvagem ou um domínio pelo menos 95% idêntico a ele; (b) substituição do domínio CH2 com um domínio CH2 de IgG1 humana do tipo selvagem ou domínio pelo menos 95% idêntico a ele; e/ou (c) substituição do domínio CH3 com um domínio CH3 de IgG1 humana do tipo selvagem ou um domínio pelo menos 95% idêntico a ele.
126. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 117 a 125, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de substituir a região constante de cadeia pesada com uma região constante de cadeia pesada compreendendo qualquer uma de SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78-125, 152-232, 234-245 e 247-262 ou uma região pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 26-37, 54-56, 78- 125, 152-232, 234-245 e 247-262.
127. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 117 a 126, caracterizado pelo fato de que a dobra é modificada para reduzir formação de ligação dissulfeto.
128. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 117 a 127, caracterizado pelo fato de que a dobra compreende substituição de aminoácido C219S.
129. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 117 a 128, caracterizado pelo fato de que a dobra compreende uma sequência de aminoácido mostrada em qualquer uma de SEQ ID Nº: 8, 21-23, 126-132 ou 134-147 ou uma sequência que compreende 1-3 aminoácidos inseridos entre CVE e CPP.
130. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 117 a 129, caracterizado pelo fato de que o domínio cH1 compreende a sequência de aminoácido
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALT
SGVHTFPAVLOSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKV DKTV (SEQ ID Nº: 7).
131. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 117 a 130, caracterizado pelo fato de que o domínio CH2 é modificado para reduzir ou eliminar funções efetoras.
132. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 117 a 131, caracterizado pelo fato de que o domínio CH2 compreende substituições de aminoácido A330S e P331S.
133. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 117 a 132, caracterizado pelo fato de que o domínio cH2 compreende a sequência de aminoácido
PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEV
HNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAK (SEQ ID Nº: 4).
134. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 117 a 133, caracterizado pelo fato de que o domínio CH2 compreende substituições de aminoácido A330S e P331S.
135. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 117 a 134, caracterizado pelo fato de que o domínio cH3 compreende a sequência de aminoácido
GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQ
PENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID Nº: 5).
136. Anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de ser produzido através do método como definido em qualquer uma das reivindicações 117 a 135.
137. Anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo humano ou humanizado.
138. Método de tratamento de um indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende administrar o anticorpo, ou porção de ligação a antígeno do mesmo, de qualquer uma das reivindicações precedentes.
139. Método, de acordo com a reivindicação 138, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de administrar um ou mais agentes terapêuticos adicionais.
140. Método, de acordo com a reivindicação 139, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico estimula o sistema imune.
141. Método, de acordo com a reivindicação 140, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é um inibidor de ponto de checagem ou uma molécula coestimuladora.
142. Método de tratamento de um indivíduo caracterizado pelo fato de que compreende administrar a composição, molécula biespecífica ou imunoconjugado de qualquer uma das reivindicações precedentes.
143. Anticorpo (ou fragmento de ligação a antígeno do mesmo) compreendendo um domínio constante de cadeia pesada modificado compreendendo um domínio constante de cadeia pesada de IgG humana, caracterizado pelo fato de que o aminoácido na posição 238 não é P, e o domínio constante de cadeia pesada modificado tem função efetora reduzida com relação ao mesmo domínio constante de cadeia pesada de IgG, em que o aminoácido na posição 238 é prolina.
144. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 143, caracterizado pelo fato de que o domínio constante de cadeia pesada de IgG é um domínio constante de cadeia pesada de IgG1 humana.
145. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 143 ou 144, caracterizado pelo fato de que o aminoácido na posição 238 é K.
146. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 143 a 145, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada modificada compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica à SEQ ID Nº: 198, em que P238 não é P (ou não P nem S) e é, por exemplo, P238k.
147. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 146, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada modificada compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 198, em que P238 não é P (ou não P nem S) e é, por exemplo, P238K.
148. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 147, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada modificada compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 99% idêntica à SEQ ID Nº: 198, em que P238 é P (ou não P nem S) e é, por exemplo, P238K.
149. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 143 a 148, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada modificada não compreende uma ou mais das modificações de aminoácido P238 reveladas na Patente U.S. No.
5.637.481 (cujos conteúdos são aqui especificamente incorporados a título de referência), por exemplo, C2208S, C2268S e C229S.
150. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 143 a 149, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada modificada compreende uma sequência de aminoácido consistindo em SEQ ID Nº: 198.
151. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 143 a 150, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo (por exemplo, um Dab ou scFv) que é ligado à região constante de cadeia pesada modificada.
152. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 143 a 150, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada ligado ao domínio constante de cadeia pesada modificado e um domínio variável de cadeia leve ligado a um domínio constante de cadeia leve.
153. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 143 a 152, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de comprimento integral (cadeias pesada e leve são cadeias pesada e leve de comprimento integral, respectivamente).
154. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 143 a 153, caracterizado pelo fato de que o domínio constante de cadeia pesada modificado não compreende uma ou mais outras mutações que reduzem função efetora.
155. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 154, caracterizado pelo fato de que o domínio constante de cadeia pesada modificado não compreende uma ou mais outras mutações reveladas aqui que reduzem função efetora.
156. Anticorpo,y, de acordo com qualquer uma das reivindicações 143 a 153, caracterizado pelo fato de que o domínio constante de cadeia pesada modificado compreende 1-3 outras mutações que reduzem função efetora.
157. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 156, caracterizado pelo fato de que o domínio constante de cadeia pesada modificado compreende 1-3 outras mutações reveladas aqui que reduzem função efetora.
158. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 143 a 157, caracterizado pelo fato de que a função efetora do anticorpo é mais ou menos aquela de um anticorpo IgG2.
159. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 143 a 158, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem afinidade de ligação menor com os FcvRs de afinidade baixa em relação ao anticorpo com um IgG1 do tipo selvagem.
160. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 159, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não tem nenhuma ligação detectável com os FcvVRs de afinidade baixa.
161. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 159 ou 160, caracterizado pelo fato de que os FcvRs de afinidade baixa são hcD32a-H131, hoD32a-R131, hoD32b, hocD16a-VI58 e hcD16b- NA?2.
162. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 161, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não tem nenhuma ligação detectável (por exemplo, com concentração de anticorpo de 10 UM) em relação aos FcVRs de baixa afinidade hcD32a-H131, hcD32a- R131, hoD32b, hoD16a-V158 ou hoD16b-NA?2.
163. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 143 a 162, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga ao FcgR CD64 de alta afinidade (hFcgRI) com uma taxa de separação (taxa de dissociação) mais rápida em relação ao anticorpo com uma região constante de IgG1 do tipo selvagem.
164. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 143 a 163, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não tem nenhuma ligação detectável (por exemplo, com concentração de anticorpo de 10 UM) em direção aos FevRs de baixa afinidade hcD32a-H131, hoD32a-R131, hoD32b, hoeD16a-V1I58 ou hcD16b- NA? e tem uma taxa de separação mais rápida em relação ao anticorpo com uma região constante do tipo selvagem.
165. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 159 a 164, caracterizado pelo fato de que afinidade de ligação e taxa de separação para FcVRs são determinadas através de Biacore.
166. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 143 a 165, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem estabilidade térmica superior em relação ao anticorpo com uma região constante de IgG1 do tipo selvagem.
167. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 143 a 166, caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem heterogeneidade reduzida em relação ao anticorpo com uma região constante de I9gG1 do tipo selvagem.
168. Anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo as mutações L234A, L235E e G337A, mas não contém uma mutação em A330 e/ou P331 que reduz a função efetora (por exemplo, não compreende A3S30S e/ou P331S), em que o anticorpo tem função efetora reduzida (ADCC reduzida e CDC opcionalmente reduzida) em relação ao mesmo anticorpo sem essas mutações.
169. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 168, caracterizado pelo fato de que se liga a um receptor inibidor em uma célula imune, por exemplo, uma célula T.
170. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 168 ou 169, caracterizado pelo fato de que se liga com afinidade reduzida a FeyRs hcD32a-H131, hoD32a-R131, hoD32b, hoD16a-V158, hoD16b-NA2 e hoD64, em relação ao mesmo anticorpo sem essas mutações.
171. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 168 a 170, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 234 ou 248.
172. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 168 a 171, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido SEQ ID Nº: 234 ou 248, incluindo 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 ou 1 substituições de aminoácido (por exemplo, uma substituição de aminoácido conservativa), em que as substituições de aminoácido não aumentam significantemente a ligação a um ou mais FcyRs.
173. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 168 a 172, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido SEQ ID Nº: 234 ou 248, incluindo ou excluindo a lisina C-terminal.
174. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 168 a 172, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido SEQ ID Nº: 236, 249, 252, 253, 259 ou 260, incluindo ou excluindo a lisina C-terminal.
175. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 168 a 174, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de comprimento integral (ou compreende uma cadeia pesada de comprimento integral e uma cadeia leve de comprimento integral), com ou sem lisina C-terminal.
176. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 168 a 175, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um antagonista de um inibidor de ponto de checagem ou um agonista de um estimulador de ponto de checagem.
177. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 168 a 176, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não é um anticorpo revelado no WO 2018/013818.
178. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 168 a 177, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não se liga a TIM 3 humano.
179. Proteína de fusão caracterizada pelo fato de que compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo as mutações L234A, L235E e G337A, mas não contém uma mutação em A330 e/ou P331 que reduz função efetora (por exemplo, não compreende A330S e/ou P331S), em que o anticorpo tem função efetora reduzida (ADCC reduzida e CDC opcionalmente reduzida) em relação ao mesmo anticorpo sem essas mutações.
180. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 179, caracterizada pelo fato de que se liga com afinidade reduzida aos FeyRs hcD32a-H131, hCD32a-R131, hCD32b, hCD16a-V158, hCD16b-NA2 ehCD64, em relação ao mesmo anticorpo sem essas mutações.
181. Proteína de fusão, de acordo com a reivindicação 179 ou 180, caracterizada pelo fato de que a região constante de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID Nº: 234 ou 248.
182. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 179 a 181, caracterizada pelo fato de que a região constante de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido SEQ ID Nº: 234 ou 248, incluindo 1-5, 1-4, 1-3, 1-2 ou 1 substituições de aminoácido (por exemplo, uma substituição de aminoácido conservativa), em que as substituições de aminoácido não aumentam significantemente a ligação a um ou mais FcyRs.
183. Proteína de fusão, de acordo com qualquer uma das reivindicações 179 a 182, caracterizada pelo fato de que a região constante de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido SEQ ID Nº: 234 ou 248, incluindo ou excluindo a lisina C-terminal.
184. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 179 a 183, caracterizado pelo fato de que a região constante de cadeia pesada compreende a sequência de aminoácido SEQ ID Nº: 236, 249, 252, 253, 259 ou 260, incluindo ou excluindo a lisina C-terminal.
185. Anticorpo caracterizado pelo fato de que compreende uma região constante de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido mostrada na Tabela de Sequência ou uma sequência que é pelo menos 95% idêntica a ela
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