ES2923143T3

ES2923143T3 - Anticuerpos monoclonales antagonistas contra CD40 y sus usos

Info

Publication number: ES2923143T3
Application number: ES18730621T
Authority: ES
Inventors: Aaron Yamniuk; Mary Struthers; Suzanne J Suchard
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2017-05-25
Filing date: 2018-05-24
Publication date: 2022-09-23
Anticipated expiration: 2038-05-24
Also published as: TW201902934A; JP2020521453A; US11220550B2; EP3630831B1; EP3630831A1; US20180340031A1; JP7257335B2; US11613585B2; WO2018217976A1; US20230322941A1; KR20200011937A; CN110621697B; AR111830A1; US20220177596A1; CN110621697A

Abstract

La descripción proporciona anticuerpos que se unen a CD40, incluido un anticuerpo humanizado y un anticuerpo quimérico con diferentes dominios Fc. Los anticuerpos se unen a CD40 y no muestran actividad agonista de CD40. Los anticuerpos pueden comprender un dominio Fc de IgG1 modificado y exhibir una activación mínima de células dendríticas inmaduras. Se proporcionan composiciones que comprenden anticuerpos, métodos de uso para el tratamiento de enfermedades que involucran actividad de CD40 y uso en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que involucra actividad de CD40. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos monoclonales antagonistas contra CD40 y sus usos

Campo

La descripción proporciona anticuerpos que se unen a CD40, que incluye un anticuerpo humanizado y un anticuerpo quimérico con dominios Fc diferentes. Los polipéptidos del anticuerpo se unen a CD40 y no exhiben actividad agonista de CD40. Los anticuerpos pueden comprender un dominio Fc de IgG1 modificado y exhibir activación mínima de células dendríticas inmaduras. Se proporcionan composiciones que comprenden anticuerpos, métodos de uso para el tratamiento de enfermedades que incluyen la actividad de CD40, y el uso en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad que incluye la actividad de CD40.

Antecedentes

CD40 es una molécula coestimuladora que pertenece a la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral (TNF) que está presente en las células presentadoras de antígenos (APC), que incluyen células dendríticas, linfocitos B y macrófagos. Las APC se activan cuando CD40 se une a su ligando, CD154 (CD40L), en los linfocitos Th. La activación de APC mediada por CD40 también participa en varias respuestas inmunitarias, que incluyen producción de citocinas, regulación ascendente de moléculas coestimuladoras (tales como CD86) y presentación antigénica y proliferación de linfocitos B mejoradas. También es posible expresar CD40 mediante células endoteliales, células del músculo liso, fibroblastos y células epiteliales.

La activación de CD40 también participa en varias respuestas de linfocitos T no deseadas relacionadas a autoinmunidad, rechazo al trasplante o respuestas alérgicas, por ejemplo. Una estrategia para controlar las respuestas de linfocitos T no deseadas es actuar sobre CD40 con un anticuerpo antagonista. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal HCD122 (Lucatumumab), anteriormente conocido como Chiron 1212, se investiga actualmente en ensayos clínicos para el tratamiento de algunas enfermedades inflamatorias mediadas por CD4. Véase "Study of HCD122 (Lucatumumab) and Bendamustine Combination Therapy in CD40+ Rituximab-Refractory Follicular Lymphoma," Clinical Trials Feeds, en Internet en el protocolo de transferencia de hipertexto: clinicaltrialsfeeds.org/clinical-trials/show/NCT01275209 (última actualización 11 de enero de 2011). Sin embargo, los anticuerpos monoclonales pueden mostrar actividad agonista. Por ejemplo, la utilidad del anticuerpo anti-CD40, Chi220, se encuentra limitada por su potencial de estimulación débil. Véase Adams, et al., "Development of a chimeric anti-CD40 monoclonal antibody that synergizes with LEA29Y to prolong islet allograft survival," J. Immunol. 174: 542 50 (2005).

La Pub. de Pat. estadounidense 20160376371 describe el anticuerpo 5F11-45 como un anticuerpo humanizado con alta afinidad por el CD40 humano que está modificado por ingeniería genética para tener actividad agonista, y la capacidad de unirse preferentemente a CD32a-R131 y CD32b.

El documento US 2015/337053 describe anticuerpos con múltiples mutaciones y otras moléculas que contienen Fc, con múltiples variaciones en la región Fc. En él se analiza la unión de los anticuerpos y las moléculas a los receptores Fc gamma, y su uso en el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos.

Sumario

En una primera forma de realización, la presente invención proporciona un anticuerpo aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a ^cD40 humana, como se define en las reivindicaciones. El anticuerpo reivindicado comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde dicha cadena pesada comprende una CDR1 que comprende GYTFTDLSm Hw (SEQ ID NO: 1), una CDR2 que comprende YITPSSGYTAYNQKFKG (SEQ ID NO: 2), una CDR3 que comprende LILQRGAY (SEQ ID NO: 3); y dicha cadena ligera comprende una CDR1 que comprende RASKN^vD^sYGⁿS^fMHW (SEQ ID ⁿO: 4), una CD^r2 que comprende RASNLES (SEQ ID NO: 5), y una CDR3 que comprende QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 6).

También se describe en la presente para la comprensión de la invención un anticuerpo aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD40 humana, en donde el anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde dicha cadena pesada comprende una CDR1 que comprende GYAFTNYLIE (SEQ ID NO: 17), una CDR2 que comprende VINPGSGGTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 que comprende SQLGRRFDY (S^eQ ID NO: 19); y dicha cadena ligera comprende una C^dR1 que comprende KASQ^dV^rTG^vA (SEQ ID NO: 20), una CDR2 que comprende SASYRNT (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 que comprende QQHYSPPYT (SEQ ID NO: 22).

El anticuerpo aislado reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede antagonizar las actividades de CD40. El anticuerpo aislado reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, por lo tanto, puede ser un anticuerpo quimérico. El anticuerpo aislado reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo humanizado. El anticuerpo aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede comprender una región constante de la cadena pesada humana y una región constante de la cadena ligera humana.

El anticuerpo aislado reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, descrito en la presente comprende un dominio Fc de IgG1 humana que comprende una mutación en la posición 238 Kabat que reduce la unión a los receptores Fc gamma (FcgR), en donde prolina 238 (P238) se muta a uno de los residuos seleccionados del grupo que consiste en lisina (K) y arginina (R), y en donde el anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, tiene una unión a FcgR reducida.

En algunas formas de realización, el anticuerpo aislado reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, descrito en la presente puede tener P238 mutado a lisina (P238K) en un dominio Fc de IgG1 humana. El anticuerpo aislado reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo puede comprender un dominio Fc que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH

EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC

KVSNKALPAPEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA

VEWESN GQPENN YKTTPP VLDSDGSFFL Y SKLT VDK SRW QQGNVF SC S VMHEALH

NHYTQKSLSLSPG (IgGla-P238K (-C-term Lys); SEQ ID NO: 98), EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH

EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC

KVSNKALPAPEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA

VEWESN GQPENN YKTTPP VLDSDGSFFL Y SKLT VDK SRW QQGNVF SC S VMFEALH

NHYTQKSLSLSPGK (IgGla-P23SK; SEQ ID NO: 9), ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC

PPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV

EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEKTIS

K AKGQPREPQ V YTLPP SRDELTKN Q V SLTCLVKGF YPSDIA VEWESN GQPENNYKT

TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

(CH1 -IgGla-P238K(-C-term Lys); SEQ ID NO: 99), ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC

PPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV

EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEKTIS

K AKGQPREPQ V YTLPP SRDELTKN QV SLTCLVKGF YPSDI A VEWESN GQPENNYKT

TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

(CH1 -IgG 1 a-P238K, SEQ ID NO: 10), EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH

EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC

KVSNKALPAPEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA

VEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMFLEALH NHYTQKSLSLSPG (lgG lf-P238K (-C-term Lys); SEQ ID NO: 100),

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH

EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAP1EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (IgGlf-P238K; SEQ ID NO: II),

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

(CH1 -TgG]f-P238K(-C-term Lys); SEQ ID NO: 101).

o

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK

(C H l-IgG lf-P238K ; SEQ ID NO: 12).

También se describe en la presente para la comprensión de la invención reivindicada un anticuerpo aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, descrito en la presente puede comprender un dominio Fc de IgG1 humana que comprende una alanina sustituida en la posición 297 Kabat. Este anticuerpo aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo puede comprender el dominio Fc en donde el dominio Fc comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH

EDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKC

KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA

VEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVM HEALH

NHYTQKSLSLSPG (IgG la-N297A(-C-term Lys); SEQ ID NO: 102),

EPKSCDK.THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR.TPEVTCVVVDVSH

EDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKCQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYK.TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (IgG la-N 297A ; SEQ ID NO: 13),

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHT

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPBVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

(CH ]-IgG la-N297A(-C-tcrm Lys); SEQ ID NO: 103),

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHT

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKJPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPÍEK.TISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSETCLVKGFYPSDIAVHWESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

(CH I-IgG la-N297A ; SEQ ID NO: 14),

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH

EDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVEHQDW LNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTTSKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALII NHYTQKSESLSPG (IgG lf-N297A(-C-term Lys); SEQ ID NO: 104),

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH

EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPÍEKTISKAKGQPREPQVYTEPPSREEMTKNQVSLTCLVK.GFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK.SRWQQGNVFSCSVMHEALFI NHYTQKSLSLSPGK (IgG 1 f-N297A; SEQ ID NO: 15),

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT

FPAVLQSSGLYSI.SSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTT

PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG

(C H l-IgG lf-N 297A (-C -term Lys); SEQ ID NO: 105),

o

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHT

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY1CNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC

PPCPAPELLGGPSW LFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVE

VHNAKTKPREEQ YASTYRVVS VLTVLHQDW LNGKEYKCK VSNK ALPAPIEKTISK

AKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTT

PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK

(C H I-IgG lf-N 297A ; SEQ ID NO: 16).

En algunas formas de realización, el anticuerpo aislado reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, comprende: (1) una cadena pesada variable (V^h) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 o (2) una cadena ligera variable (V^l) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. Por ejemplo, el anticuerpo aislado reivindicado, o una porción de unión a antígeno, comprende: (1) una cadena pesada variable (Vh) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, y (2) una cadena ligera variable (V^l) que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8. En una forma de realización específica, el anticuerpo aislado reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, comprende (1) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85, y (2) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88. También se describe en la presente para la comprensión de la invención reivindicada un anticuerpo aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende:

(1) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 106 y (2) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88;

(1) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 107, y (2) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88;

(1) una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 108 y (2) una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88; o

(1) una cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 84, 109, 110 o 111; y (2) una cadena ligera de 5F11-45 que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88.

También se describe en la presente para la comprensión de la invención reivindicada un anticuerpo aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende (1) una cadena pesada variable (Vh) seleccionada del grupo que consiste en: hz-HC1 (SEQ ID NO: 23), hz-HC2 (SEQ ID NO: 24), hz-HC3 (SEQ ID NO: 25), hz-HC4 (SEQ ID NO: 26), hz-HC5 (SEQ ID NO: 27), hz-HC6 (SEQ ID NO: 28), hz-HC7 (SEQ ID NO: 29), hz-HC8 (SEQ ID NO: 30), hz-HC9 (SEQ ID NO: 31), hz-HC10 (SEQ ID NO: 32) y hz-HC11 (SEQ ID NO: 33); y/o (2) una cadena ligera variable (V^l) seleccionada del grupo que consiste en: hz-LC1 (SEQ ID NO: 34), hz-LC2 (S^eQ ID NO: 35), hz-LC3 (SEQ ID NO: 36), hz-LC4 (SEQ ID NO: 37) y hz-LC5 (SEQ ID NO: 38).

También se describe en la presente para la comprensión de la invención reivindicada un anticuerpo aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende (1) una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43, en donde el terminal C opcionalmente también comprende una lisina; y/o (2) una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable (V^L) seleccionada de SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 44. Con fines ilustrativos, el anticuerpo aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, se selecciona del grupo que consiste en:

a) Y1238-hz1-P238K que tiene una cadena pesada de SEQ ID NO: 39 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 41; b) Y1238-hz1-N297A que tiene una cadena pesada de SEQ ID NO: 40 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 41; c) Y1238-hz2-P238K que tiene una cadena pesada de SEQ ID NO: 42 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 44; y d) Y1238-hz2- N297A que tiene una cadena pesada de SEQ ID NO: 43 y la cadena ligera de SEQ ID NO: 44.

La porción de unión a antígeno reivindicada puede seleccionarse del grupo que consiste en Fv, Fab, F(ab')2, Fab', dsFv, scFv, sc(Fv)2, diacuerpos y scFv-Fc.

El anticuerpo reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo puede estar ligado a un agente terapéutico.

El anticuerpo reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo puede estar ligado a una segunda porción funcional que tiene una especificidad de unión diferente que dicho anticuerpo reivindicado o porción de unión a antígeno del mismo.

El anticuerpo reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo puede comprender una porción adicional.

La invención también proporciona un ácido nucleico que codifica el anticuerpo aislado reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo. La invención también proporciona un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico reivindicada. La invención también proporciona una célula transformada con el vector de expresión como se describe en las reivindicaciones.

También se describe un método para preparar un anticuerpo anti-CD40 humana, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende:

a) expresar el anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, en la célula transformada con un vector de expresión reivindicado que comprende una molécula de ácido nucleico reivindicada que codifica un anticuerpo aislado reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, descrito en la presente; y

b) aislar el anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, de la célula.

La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende: a) un anticuerpo reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo; b) un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

La invención también proporciona el anticuerpo reivindicado, o la porción de unión a antígeno del mismo, para su uso en un método para tratar o prevenir una respuesta inmunitaria en un sujeto que comprende administrar al sujeto el anticuerpo, ola porción de unión a antígeno del mismo reivindicada. En dicho método para tratar o prevenir una respuesta inmunitaria en el sujeto, el sujeto tiene una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: enfermedad de Addison, alergias, anafilaxis, espondilitis anquilosante, asma, ateroesclerosis, alergia atópica, enfermedades autoinmunitarias auditivas, enfermedades autoinmunitarias oculares, hepatitis autoinmunitaria, parotiditis autoinmunitaria, asma bronquial, cardiopatía coronaria, enfermedad de Crohn, diabetes, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad intestinal inflamatoria, respuesta inmunitaria a productos farmacológicos recombinantes (por ejemplo, Factor VII en pacientes hemofílicos), lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia grave, pénfigo, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, rechazo al trasplante, vasculitis y colitis ulcerosa.

También se contempla un uso de un anticuerpo reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, o un medicamento que lo comprende, para el uso en el tratamiento de un sujeto que lo necesita. También se contempla un anticuerpo reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo en una cantidad terapéuticamente eficaz, para el uso en el tratamiento o la prevención de una respuesta inmunitaria, en donde el anticuerpo reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, se administra a un paciente que lo necesita.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 ilustra los datos del sensograma de SPR para la captura de 7 pg/ml de hCD64-His en una superficie de anti-His FAB con unión de 1 pM de anticuerpos 5F11-45.

La Figura 2, que comprende las Figuras 2A-2C, ilustra los datos de activación de iDC para el tratamiento de células dendríticas inmaduras (iDC) mediante el anticuerpo anti-CD40, 5F11, en dos donantes independientes. Aumentos en IL-6 (interleucina-6) (Figura 2A) del medio de cultivo celular y la expresión del marcador de la superficie celular (CD54 y CD86) como se indica mediante tinción de media de fluorescencia de citometría de flujo con anticuerpos anti-CD86 y anti-CD54. La media de intensidad de fluorescencia (MFI) se mide en el eje Y en ambas Figuras 2B y 2C. Se indica la concentración del anticuerpo en pg/ml. La inclusión de las células CHO-CD32 en el ensayo se indica mediante el 'ligadorx'.

La Figura 3 , que comprende las Figuras 3A-3C, ilustra los datos de activación de iDC para el tratamiento de las células dendríticas inmaduras (iDC) con los anticuerpos anti-CD40 Y1238 quiméricos en dos donantes independientes. Aumentos en IL-6 (Figura 3A) y la expresión del marcador de la superficie celular (es decir, CD54 y c D86) como se indica mediante tinción de media de fluorescencia de citometría de flujo con anticuerpos anti-CD86 y anti-CD54. 3C) y anti-CD54 (Figura 3B). Se indica la concentración del anticuerpo en pg/ml. La inclusión de las células CHO-CD32 se indica mediante el 'ligadorx'.

La Figura 4, que comprende las Figuras 4A-4C, ilustra los datos de la activación de iDC para el tratamiento de las células dendríticas inmaduras (iDC) mediante anticuerpos anti-CD40, Y1238-P238K y Y1238-N297A. Se midieron los aumentos en IL-6 (Figura 4A) del medio de cultivo celular. La expresión del marcador de la superficie celular (CD54 y CD86) se midió según se indica mediante tinción de media de fluorescencia de citometría de flujo con anticuerpos anti-CD86 (FIG. 4B) y anti-CD54 (FIG. 4C). Se indica la concentración del anticuerpo en pg/ml. Se indica la inclusión de las células CHO-CD32.

La Figura 5, que comprende las Figuras 5A-5C, ilustra los datos de la activación de iDC para el tratamiento de iDC con versiones humanizadas (hz) de los anticuerpos Y1238 con (ligador x) y sin la adición de células CHO que sobreexpresan CD32. Se indica la concentración de tratamiento del anticuerpo de 10, 30 o 100 pg/ml. Figura 5A: Producción de citocina IL-6 en pg/ml (panel superior). Figura 5B: Media de intensidad de fluorescencia de tinción para CD54. La Figura 5C: Media de intensidad de fluorescencia de CD86.

La Figura 6, que comprende las Figuras 6A-6C, ilustra los datos de activación de iDC para el tratamiento de células dendríticas inmaduras (iDC) mediante el anticuerpo anti-CD40, 5F11, en ocho donantes independientes. Aumentos en IL-6 (interleucina-6) (Figura 6A) del medio de cultivo celular y expresión del marcador de la superficie celular (CD54; Figura 6B y CD86; Figura 6C) como se indicó mediante tinción de media de fluorescencia de citometría de flujo con anticuerpos anti-CD86 y anti-CD54. La media de intensidad de fluorescencia (MFI) se mide en el eje Y en ambas Figuras 6B y 6C. Se indica la concentración del anticuerpo en pg/ml (10, 30 o 100 pg/ml). La inclusión de las células CHO-CD32 en el ensayo se indica para mediar la reticulación o el agrupamiento mediados por FcgR. El anticuerpo agonista contra CD40 #2141 y el anti-CD40-dAB-IgG4 sirven como posibles controles. Una proteína de fusión IgG4-L6 sirve como control negativo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente descripción se refiere a anticuerpos anti-CD40 y, en particular, anticuerpos antagonistas anti-CD40. Para dianas terapéuticas tales como CD40, la reticulación mediada por FcgR de anticuerpo anti-CD40 tiene el potencial de generar señalización agonista no deseada y toxicidad. La presente descripción también describe anticuerpos antagonistas anti-CD40 que tienen acoplamiento reducido de FcgR hCD32a/FcgRIIa, hCD32b/FcgRIIb, hCD16a/FcgRIIIa y hCD16b/FcgRIIIb de "baja afinidad". Se espera que el acoplamiento reducido de FcgR de baja afinidad reduzca la probabilidad de la señalización agonista no deseada y el potencial no deseado para la toxicidad. Definiciones y abreviaturas

Se proporcionan otras abreviaturas y definiciones más abajo.

APC células presentadoras de antígenos

CD54 también denominado ICAM-1

CDR regiones determinantes de la complementariedad

C^hoCH cadena pesada constante

Cl o CL cadena ligera constante

Célula CHO célula de ovario de hámster chino

dAb anticuerpo de dominio

FcgR intercambiable con FcyR

FR región de marco

GM-CSF factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos

HC cadena pesada

iDC células dendríticas inmaduras

IFN interferón

IgG inmunoglobulina G

IL-6 interleucina-6

LC cadena ligera

mAb anticuerpo monoclonal

mg miligramo

ml mililitro

ng nanogramo

nM nanomolar

pI punto isoeléctrico

SPR resonancia de plasmones superficiales

TNF factor de necrosis tumoral

|jg microgramo

jM micromolar

Vl o VL dominio de la cadena ligera variable

V^ho VH dominio de la cadena pesada variable

Se proporcionan en la presente otras abreviaturas y definiciones.

De acuerdo con esta descripción detallada, se aplican las siguientes abreviaciones y definiciones. Cabe destacar que, como se usan en la presente, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen la referencia al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De este modo, por ejemplo, la referencia a "un anticuerpo" incluye varios de esos anticuerpos, y la referencia a "la dosis" incluye la referencia a una o más dosis y equivalentes de las conocidas por las personas del oficio de nivel medio, etc.

Como se usa en la presente, el término "alrededor de" es conocido por las personas del oficio de nivel medio y variará, en cierta medida, según el contexto en que se use. En general, "alrededor de" abarca un rango de valores que son más/menos 10 % de un valor de referencia a menos que se indique lo contrario en la memoria descriptiva.

Se entiende que se incluyen en la presente todos los números enteros totales o parciales entre los rangos establecidos. CD40 también se conoce y se denomina antígeno CD40 de la superficie del linfocito B, Bp50, receptor CD40L, CDw40, CDW40, MGC9013, p50, TNFRSF5 y miembro 5 de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral. "CD40 humana" se refiere a CD40 que comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:

MVRLPLQCVL WGCLLTAVHP EPPTACREKQ YLINSQCCSL CQPGQKLVSD CTEFTETECL PCGESEFLDT WNRETHCHQH KYCDPNLGLR VQQKGTSETD TICTCEEGWH CTSEACESCV LHRSCSPGFG VKQIATGVSD TICEPCPVGF FSNVSSAFEK CHPWTSCETK DLVVQQAGTN KTDVVCGPQD RLRALVVIPI I F G I L F A I L L VLVFIKKVAK KPTNKAPHPK QEPQEINFPD DLPGSNTAAP VQETLHGCQP VTQEDGKESR ISVQERQ (SEQ ID NO: 45).

Como se usa en la presente, la expresión "dominio variable" se refiere a dominios variables de inmunoglobulina definidos por Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, 5^aedición, U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C. (1991). La numeración y el posicionamiento de residuos de aminoácidos CDR en los dominios variables se realizan de conformidad con la renombrada convención de numeración de Kabat. V^h, "cadena pesada variable" y "dominio de la cadena pesada variable" se refiere al dominio variable de la cadena pesada. V^L, "cadena ligera variable" y "dominio de la cadena ligera variable" se refiere al dominio variable de la cadena ligera.

El término "humano", cuando se aplica a los anticuerpos, significa que el anticuerpo tiene una secuencia, por ejemplo, FR y/o dominios CH, derivada de una inmunoglobulina humana. Una secuencia "deriva de" una secuencia codificante de inmunoglobulina humana cuando la secuencia: (a) se aísla de un individuo humano o de una célula o línea celular de un individuo humano; (b) se aísla de una colección de secuencias génicas de anticuerpos humanos clonados o de secuencias de dominio variable de anticuerpo humano; o (c) se diversifica mediante la mutación y selección de uno o más de los polipéptidos anteriores.

Como se usa en la presente, un compuesto "aislado" significa que el compuesto se retira de al menos un componente con el que el compuesto se asocia naturalmente.

Los anticuerpos de la presente descripción se pueden administrar a pacientes humanos y, a la vez, evitar en gran medida la respuesta inmunitaria contra anticuerpos generalmente provocada por la administración de anticuerpos de otras especies, por ejemplo, ratón. Por ejemplo, los anticuerpos murinos se pueden "humanizar" mediante el injerto de CDR murinas en una FR de dominio variable humana, de acuerdo con los procedimientos conocidos en el estado de la técnica. Sin embargo, los anticuerpos humanos descritos en la presente se pueden producir sin la necesidad de manipulación genética de una secuencia de anticuerpos murinos.

Los anticuerpos anti-CD40 útiles en la presente descripción comprenden tres regiones determinantes la complementariedad (CDR) y cuatro regiones de marco (FR), dispuestas desde el terminal amino hasta el terminal carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, C^dR3, FR4. Las tres CDR contienen la mayor parte de los residuos que forman las interacciones específicas con el antígeno y son las principales responsables del reconocimiento del antígeno.

Los anticuerpos anti-CD40 reivindicados de la presente descripción comprenden CDR del anticuerpo 5F11-45 humanizado. Las secuencias de aminoácidos de 5F11-45 se proporcionan en la Tabla 1.

TABLA 1: Secuencias de F11-45

continuación

continuación

continuación

continuación

Los anticuerpos reivindicados comprenden las secuencias de aminoácidos de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de las secuencias de las cadenas pesada y ligera variables de 5F11-45 humanizado (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 7 y 8 respectivamente, como ejemplo). Los anticuerpos monoclonales contienen las 6 CDR (3 para la V^hy 3 para la V^l), por ejemplo, GYTFTDLSMHW (SEQ ID NO: 1), YITPSSGYTAYNQKFKG (SEQ ID NO: 2) y LILQRGAY (SEQ ID NO: 3) para las CDR variables de la cadena pesada 1-3, respectivamente y RASKNVDSYGNSFMHW (SEQ ID NO: 4), RASNLES (SEQ ID NO: 5) y QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 6) para las CDR variables de la cadena ligera 1-3, respectivamente.

También se describe en la presente para la comprensión de la invención los anticuerpos que comprenden las secuencias de aminoácidos de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de las secuencias de las cadenas pesada y ligera variables de Y1238 humanizado (véase, por ejemplo, SEQ ID NO: 23 y 34, respectivamente, como ejemplo). Los anticuerpos monoclonales contienen las 6 CDR (3 para la Vh y 3 para la Vl), por ejemplo, GYAFTNYLIE (SEQ ID NO: 17), VINPGSGGTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 18) y SQLGRRFDY (SEQ ID NO: 19) para las CDR variables de la cadena pesada 1-3, respectivamente y KASQDVRTGVA (SEQ ID NO: 20), SASYRNT (SEQ ID NO: 21) y QQHYSPPYT (SEQ ID NO: 22) para las CDR variables de la cadena ligera 1-3, respectivamente.

Un "anticuerpo" (Ab) debe incluir, sin limitación, una inmunoglobulina que se une específicamente a un antígeno y comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante puentes disulfuro, o una porción de unión a antígeno del mismo. Cada cadena H comprende una región variable de la cadena pesada (que se abrevia en la presente como V^h) y una región constante de la cadena pesada. La región constante de la cadena pesada comprende tres dominios constantes, Ch¹, Ch²y Ch³. Cada cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (que se abrevia en la presente como Vl) y una región constante de la cadena ligera. La región constante de la cadena ligera comprende un dominio constante, C^l. Las regiones V^hy V^ltambién se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas regiones de marco (FR). Cada V^hy V^lcomprende tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el terminal amino al terminal carboxi en el siguiente orden: FR1, Cd R1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno.

Una "porción de unión a antígeno" de un Ab (también denominado "fragmento de unión a antígeno") o una porción de unión a antígeno del mismo se refieren a una o más secuencias de un Ab (de longitud completa o fragmento del anticuerpo de longitud completa) que mantiene la capacidad de unión específica al antígeno unido mediante el Ab completo. Los ejemplos de fragmentos de unión a antígeno incluyen Fab, F(ab')², scFv (fragmento variable monocatenario), Fab', dsFv, sc(Fv)2 y scFv-Fc.

Un anticuerpo "humanizado" se refiere a un Ab en donde algunos, todos o la mayor parte de los aminoácidos fuera de los dominios CDR de un Ab no humano se reemplazan por los aminoácidos correspondientes que derivan de inmunoglobulinas humanas. En una forma de realización de una forma humanizada de un Ab, algunos, todos o la mayor parte de los aminoácidos fuera de los dominios CDR se reemplazaron por aminoácidos de inmunoglobulinas humanas, mientras que algunos, todos o la mayor parte de los aminoácidos dentro de una o más regiones CDR permanecen sin cambios. Se permiten pequeñas adiciones, eliminaciones, inserciones, sustituciones o modificaciones de aminoácidos, siempre que no anulen la capacidad del Ab de unirse a un antígeno en particular. Un Ab "humanizado" retiene una especificidad antigénica similar a aquella del Ab original.

Un "anticuerpo quimérico" se refiere a un Ab en donde las regiones variables derivan de una especie y las regiones constantes derivan de otra especie, tal como un Ab en donde las regiones variables derivan de un Ab de ratón y las regiones constantes derivan de un Ab humano.

Como se usa en la presente, "unión específica" se refiere a la unión de un antígeno mediante un anticuerpo con una constante de disociación (K^d) de alrededor de 1 Do menos según se mide, por ejemplo, con resonancia de plasmones superficiales (SPR). Los sistemas de ensayos adecuados incluyen el sistema de resonancia de plasmones superficiales BIAcore™ (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA) y el software de evaluación cinética BIAcore™ (por ejemplo, versión 2.1).

La unión de los anticuerpos a CD40 reivindicados puede antagonizar la actividad de CD40. Las "actividades de CD40" incluyen, entre otras, la activación de los linfocitos T (por ejemplo, inducción de la proliferación de linfocitos T o secreción de citocinas), activación macrofágica (por ejemplo, la inducción de especies reactivas de oxígeno y óxido nítrico en el macrófago), y la activación de linfocitos B (por ejemplo, la proliferación de linfocitos B, intercambio de isotipo de anticuerpo, o diferenciación de células plasmáticas). Las actividades de CD40 pueden estar mediadas por la interacción con otras moléculas. Las "actividades de CD40" incluyen la interacción funcional entre CD40 y las siguientes moléculas, que se definen por su número de acceso de Uniprot entre paréntesis:

CALR (P27797);

ERP44 (Q9BS26);

FBL (P22087);

POLR2H (P52434);

RFC5 (P40937);

SGK1 (000141);

SLC30A7 (Q8NEW0);

SLC39A7 (Q92504);

TRAF2 (Q5T1L5);

TRAF3 (Q13114);

TRAF6 (Q9Y4K3);

TXN (Q5T937);

UGGT1 (Q9NYU2); y

USP15 (Q9Y4E8).

Por ejemplo, una "actividad" de CD40 incluye una interacción con TRAF2. La interacción CD40/TRAF2 activa NF-^kB y JNK. Véase Davies et al., Mol. Cell Biol. 25: 9806-19 (2005). Esta actividad de CD40, por lo tanto, se puede determinar mediante la activación de NF-kB y JNK celular dependiente de CD40, con respecto a una referencia.

Como se usan en la presente, los términos "activar", "activa" y "activado" se refieren al aumento de una determinada cantidad de CD40 medible de al menos 10 % con respecto a una referencia, por ejemplo, al menos 10 %, 25 %, 50 %, 75 %, incluso 100 % o más. Una actividad CD40 se "antagoniza" si la actividad de CD40 se reduce en al menos 10 % y, en una forma de realización de ejemplo, al menos alrededor de 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 % o incluso 100 % (es decir, actividad no detectable) con respecto a la ausencia del antagonista. Por ejemplo, un anticuerpo puede antagonizar parcial o totalmente la actividad de CD40, sin activar CD40. Por ejemplo, el anticuerpo puede no activar la proliferación de linfocitos B. El anticuerpo puede no activar la secreción de citocinas mediante linfocitos T, en donde la citocina es al menos una citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-6, IL-10, IL-13, TNF-a, IFN-^y.

Los dominios variables pueden comprender una o más regiones de marco (FR) con la misma secuencia de aminoácidos que una región de marco correspondiente codificada por un segmento génico de anticuerpo germinal humano. Las secuencias de marco preferidas para usar en los anticuerpos descritas en la presente son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias de marco usadas por los anticuerpos descritas en la presente. Las secuencias de CDR1,2 y 3 de Vh y las secuencias de CDR1,2 y 3 de Vl se pueden injertar en regiones de marco que tienen una secuencia idéntica a la que se halla en el gen de inmunoglobulina de la línea germinal del que deriva la secuencia de marco, o las secuencias de CDR se pueden injertar en las regiones de marco que contienen hasta 20 sustituciones de aminoácidos, preferentemente, conservadoras, en comparación con las secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, se ha descubierto que, en algunos casos, es conveniente mutar los residuos en las regiones de marco para mantener o mejorar la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses N.° 5.530.101, 5.585.089, 5.693.762 y 6.180.370 otorgadas a Queen et al).

Las regiones de marco de ejemplo incluyen, entre otras, aquellas en las Tablas 2 y 3 más adelante. Las secuencias están en un formato terminal amino a carboxi. Las regiones de marco de la cadena pesada de ejemplo se muestran en la Tabla 2. Un grupo preferido de secuencias de marco de la cadena pesada para 5F11-45 VH humanizado es: QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKAS (FR1; SEQ ID NO: 46), WVRQAPGQGLEWMG (FR2; SEQ ID NO: 49), KTTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR (FR3; SEQ ID NO: 51) y WGQGTLVTVSS (FR4: SEQ ID NO: 60). Un grupo preferido de secuencias de marco de la cadena pesada para Y1238 VH humanizado, que se describe en el presente documento para la comprensión de la invención, es: QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS (FR1; SEQ ID NO: 47), WVRQAPGQGLEWMG (FR2; SEQ ID NO: 49), RVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR (FR3; SEQ ID NO: 52) y WGQGTLVTVSS (FW4; SEQ ID NO: 60).

TABLA 2

Las regiones de marco de la cadena ligera de ejemplo se muestran en la Tabla 3. Un grupo preferido de regiones de marco de la cadena ligera para 5F11-45 VL humanizado incluye los siguientes: DIVLTQSPDSLAVSLGERATINC (FR1; SEQ ID NO: 61), WYQQKPGQPPKLLIY (FR2; SEQ ID NO: 63), GVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYC (FR3; SEQ ID NO: 66) y FGQGTKLEIK (FR4; S^eQ ID NO: 71). Un grupo preferido de regiones de marco de la cadena ligera para Y1238 VL humanizado, que se describe en la presente para la comprensión de la invención, incluye los siguientes: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (FR1; SEQ ID NO: 62), WYQQKPGKAPKLLIY (FR2; SEQ ID NO: 64), GVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (FR3; SEQ ID NO: 67), GVPSRFSGSRSGTDFTFTISSLQPEDIATYYC (FR3; SEQ ID NO: 68) y FGGGTKVEIK (FR4; SEQ ID NO: 72).

TABLA 3

continuación

Una variante del dominio variable puede diferir del dominio variable de la secuencia de 5F11-45 o Y1238 humanizados en hasta 10 aminoácidos o cualquier valor entero intermedio, en donde la variante del dominio variable se une específicamente a CD40. De manera alternativa, la variante del dominio variable puede tener al menos 90 % de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos 92 %, 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia) con respecto a la secuencia de 5F11-45 o Y1238 humanizado, respectivamente. Los residuos de aminoácidos que no son idénticos o los aminoácidos que difieren entre dos secuencias pueden representar sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos. Los residuos que difieren entre dos secuencias aparecen como posiciones que no son idénticas, en donde las dos secuencias están alineadas mediante cualquier algoritmo adecuado de alineación de secuencia de aminoácidos, tal como BLAST® (una marca registrada de Biblioteca Nacional de Medicina de los Estados Unidos).

Los anticuerpos contra CD40 de ejemplo de la presente invención incluyen un anticuerpo aislado, reivindicado o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD40 humana, en donde dicho anticuerpo comprende una cadena pesada y una cadena ligera, en donde:

dicha cadena pesada comprende una CDR1 que comprende GYTFTDLSMHW (SEQ ID NO: 1), una CDR2 que comprende YITPSSGYTAYNQKFKG (SEQ ID NO: 2), una CDR3 que comprende LILQRGAY (SEQ ID NO: 3); y dicha cadena ligera comprende una CDR1 que comprende RASk Nv DSy Gn SFMHW (SEQ ID NO: 4), una CDR2 que comprende RASNl Es (SEQ ID NO: 5), y una CDR3 que comprende QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 6).

También se describe en la presente para la comprensión de la invención un anticuerpo que comprende una cadena pesada que comprende una CDR1 que comprende GYAFTNYLIE (SEQ ID NO: 17), una CDR2 que comprende VINPGSGGTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 18), y una CDR3 que comprende SQLGRRFDY (SEQ ID NO: 19); y una cadena ligera que comprende una CDR1 que comprende KASq Dv RTGVA (SEQ ID NO: 20), una CDr 2 que comprende SASYRNT (SEQ ID NO: 21), y una CDR3 que comprende QQHYSPPYT (SEQ ID NO: 22).

El anticuerpo reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD40 humana, comprende (1) una cadena pesada que comprende una CDR1 que comprende GYTFTDLSMHW (SEQ ID NO: 1), una CDR2 que comprende YITPSSGYTAYNQKFKG (SEQ ID NO: 2), una CDR3 que comprende LILQRGAY (SEQ ID NO: 3); y (2) comprende una cadena ligera que comprende una Cd R1 que comprende rAs KNVDSYGNSFMHW (SEQ ID NO: 4), una CDR2 que comprende R^aSⁿLES (SEQ ID NO: 5), y una C^dR3 que comprende QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 6). Opcionalmente, dicho anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, comprende (1) una cadena pesada variable de SEQ ID NO: 7; y/o (2) una cadena ligera variable de SEQ ID NO: 8. A modo ilustrativo, dicho anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, comprende (1) una cadena pesada que comprende la cadena pesada variable de SEQ ID NO: 7; y (2) una cadena ligera que comprende la cadena ligera variable de SEQ ID NO: 8.

Un anticuerpo reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD40 humana, puede comprender una cadena pesada que comprende la cadena pesada variable de SEQ ID NO: 7, y una cadena ligera que comprende la cadena ligera variable de SEQ ID NO: 8, en donde la cadena pesada comprende un dominio Fc que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 98. Un anticuerpo reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD40 humana, puede comprender una cadena pesada que comprende la cadena pesada variable de SEQ ID NO: 7, y una cadena ligera que comprende la cadena ligera variable de SEQ ID NO: 8, en donde la cadena pesada comprende un dominio Fc que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o SEQ ID NO: 99.

Un anticuerpo reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD40 humana, puede comprender (1) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 106, 107 o 108; y (2) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88. A modo ilustrativo, dicho anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, comprende (1) una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85; y (2) una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88.

El anticuerpo aislado reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede antagonizar las actividades de CD40. El anticuerpo aislado reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo quimérico. El anticuerpo aislado reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo humanizado. El anticuerpo aislado reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, comprende una región constante de la cadena pesada humana y una región constante de la cadena ligera humana.

El anticuerpo aislado reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio Fc de IgG1 humana que comprende una mutación en la posición 238 Kabat que reduce la unión a los receptores Fc gamma (FcgR), en donde prolina 238 (P238) se muta a uno de los residuos seleccionados del grupo que consiste en lisina (K) andarginina (R), y en donde el anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, tiene una unión a FcgR reducida. El anticuerpo aislado reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede tener P238 mutado a lisina en un dominio Fc de IgG1 humana.

El anticuerpo aislado reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede comprender un dominio Fc que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH

EDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKC

KVSNKALPAP1EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA

VEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVM HEALH

NHYTQKSLSLSPG (IgGla-P238K(-C-term Lys); SEQ ID NO: 98),

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH

EDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKC

KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA

VEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVM HEALH

NHYTQKSLSLSPGK (IgGla-P238K; SEQ ID NO: 9),

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDK.THTC PPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTfCPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

(CH1 -IgGIa-P238K(-C-term Lys); SEQ ID NO: 99),

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHfíPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALFÍNHYTQKSLSLSPGK

(CHMgGla-P238K; SEQ ID NO: 10),

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH

EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPG (IgGlf-P238K(-C-term Lys); SEQ ID NO: 100),

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH

EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSPGK (IgGlf-P238K; SEQ ID NO: 11),

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGKSVFLFPPKPKDTLMÍSRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

(CFI1 -IgG I f-P238K(-C~term Lys); SEQ ID NO: 101),

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGKS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VV VD VSFIEDPEVKFNWYVDG V E VHNAKTKPREEQ YNSTY RV VS VLTVLHQDWLNGKE YKCK V SNK ALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK

(C H 1 -IgG 1 f-P238K; S E Q ID N O : 12)

También se describe en la presente para la comprensión de la invención un anticuerpo aislado o una porción de unión a antígeno del mismo que puede comprender un dominio Fc de IgGl humana que comprende una alanina sustituida en la posición 297 de Kabat. Por ejemplo, este anticuerpo aislado o una porción de unión a antígeno del mismo, comprende un dominio Fc que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKC KV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCL VKGF YP SDIA VEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVM HEALH NHYTQKSLSLSPG (IgG la-N297A(-C-term Lys), SEQ ID NO: 102), EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH EDPEVKFNW YVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKC KV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCL VKGF YP SDIA VEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVM HEALH NHYTQKSLSLSPGK (IgG la-N 297A , SEQ ID NO: 13),

ASTKGPS VFPL AP S SK STSGGT AALGCLVKD YFPEP VTV SW NSGALTSGVHT FPA VLQ S SGL YSL S S VVTVPS S SLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKRVEPK SCDKTHTC PPCPAPELLGGP S VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVD VSHEDPEVKFNW YVDGVE VHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPG

(CH 1 -IgG la-N297A(-C-term Lys), SEQ ID NO: 103),

ASTKGPS VFPL AP S SK STSGGT AALGCLVKD YFPEP VTV SW NSGALTSGVHT FPA VLQ S SGLY SLS S VVTVPS S SLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKRVEPK SCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVE VHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTT

PPVLDSDGSFFLYSKLFVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYFQKSLSLSPGK

(CH l-IgG la-N 297A; SEQ ID NO: 14), EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM1SRTPEVTCVVVDVSH

EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC

KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA

VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH

NFIYTQKSLSLSPG (IgGlf-N297A(-C-term Lys); SEQ ID NO: 104), EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSH

EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC

KVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA

VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH

NHYTQKSLSLSPGK (IgG lf-N297A; SEQ ID NO: 15), ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT

FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNFIKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC

PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE

VFíNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPEEKTISK

AKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTT

PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

(CHl-IgGIf-N297A(-C-term Lys); SEQ ID NO: 105),

o

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHT FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTY1CNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLM ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNW YVDGVE VHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISK AKGQPREPQVYTLPPSREEM TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTT PPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVM HEALHNHYTQKSLSLSPGK

(C H l-IgG lf-N 297A ; SEQ ID NO: 16).

También se describe en la presente para la comprensión de la invención un anticuerpo aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo comprende (1) una cadena pesada variable (Vh) seleccionada del grupo que consiste en: hz-HC1 (SEQ ID NO: 23), hz-HC2 (SEQ ID NO: 24), hz-HC3 (SEQ ID NO: 25), hz-HC4 (SEQ ID NO: 26), hz-HC5 (SEQ ID NO: 27), hz-HC6 (SEQ ID NO: 28), hz-HC7 (SEQ ID NO: 29), hz-HC8 (SEQ ID NO: 30), hz-HC9 (SEQ ID NO: 31), hz-HC10 (SEQ ID NO: 32) y hz-HC11 (SEQ ID NO: 33); y/o (2) una cadena ligera variable (V^l) seleccionada del grupo que consiste en: hz-LC1 (SEQ ID NO: 34), hz-LC2 (Se Q ID NO: 35), hz-LC3 (SEQ ID NO: 36), hz-LC4 (SEQ ID NO: 37) y hz-LC5 (SEQ ID NO: 38).

También se describe en la presente para la comprensión de la invención un anticuerpo aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42 y SEQ ID NO: 43.

También se describe en la presente para la comprensión de la invención un anticuerpo aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, descrito en la presente, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 41 y SEQ ID NO: 44.

También se describe en la presente para la comprensión de la invención un anticuerpo aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en:

El anticuerpo reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede ser un inmunoconjugado en donde el anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, está ligado a un agente terapéutico.

El anticuerpo reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede ser un anticuerpo biespecífico, en donde el anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, está ligado a una segunda porción funcional que tiene una especificidad de unión diferente a dicho anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo.

El anticuerpo reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, también puede comprender una porción adicional.

Dominio Fc

La "mitad" del terminal carboxi de cada cadena pesada define una región constante (Fc) que es la principal responsable de la función efectora. Como se usa en la presente, la expresión "dominio Fc" se refiere a las secuencias de anticuerpos de la región constante que comprenden los dominios constantes CH2 y CH3 delimitados de acuerdo con Kabat et al., Sequences of ImmunologicalInterest, 5.a edición, U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C. (1991). La región Fc de un anticuerpo reivindicado o de una porción de unión a antígeno del mismo se deriva de una IgG humana. La región Fc se deriva de una región Fc de IgG1 humana. Un dominio variable de la cadena pesada se puede fusionar a un dominio Fc. El terminal carboxilo del dominio variable se puede ligar o fusionar al terminal amino del dominio Fc CH2. De manera alternativa, el terminal carboxilo del dominio variable se puede ligar o fusionar al terminal amino de una secuencia de aminoácidos ligadora, que por sí misma se fusiona al terminal amino de un dominio Fc. De manera alternativa, el terminal carboxilo del dominio variable se puede ligar o fusionar al terminal amino de un dominio CH1, que por sí mismo se fusiona al dominio Fc CH2. Opcionalmente, la proteína puede comprender la región bisagra después del dominio CH1, en su totalidad o en parte. Opcionalmente, una secuencia de aminoácidos ligadora está presente entre el dominio variable y el dominio Fc. El terminal carboxilo del dominio variable de la cadena ligera se puede ligar o fusionar al terminal amino del dominio CL.

Una secuencia de ejemplo para la cadena pesada CH1 de un anticuerpo reivindicado o de una porción de unión a antígeno del mismo es aminoácidos 118-215 de SEQ ID NO: 85. Una secuencia de ejemplo para la cadena ligera CL de un anticuerpo reivindicado o de una porción de unión a antígeno del mismo es aminoácidos 112-218 de SEQ ID NO: 88.

El anticuerpo reivindicado puede ser un anticuerpo de fusión que comprende un primer dominio variable que se une específicamente a CD40 humana, y un segundo dominio que comprende un dominio Fc.

Los dominios Fc de ejemplo utilizados en una proteína de fusión reivindicada incluyen dominios de IgG humana. Los dominios Fc de IgG humana incluyen el dominio Fc de IgG4 y el dominio Fc de IgG1. Mientras que los genes de la cadena pesada de IgG humana codifican una lisina en el terminal C, la lisina a menudo está ausente de los anticuerpos endógenos como resultado de una escisión en la circulación sanguínea. Los anticuerpos que tienen cadenas pesadas de IgG que incluyen una lisina en el terminal C, cuando se expresan en cultivos celulares de mamíferos, también pueden tener niveles variables de la lisina en el terminal C presente (Cai et al, 2011, Biotechnol Bioeng. 108(2):404-12). Consecuentemente, se puede omitir la lisina en el terminal C de cualquier dominio Fc de la cadena pesada de IgG descrita en la presente.

El anticuerpo aislado reivindicado, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede comprender un dominio Fc que comprende una secuencia de aminoácidos de:

VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY(N/A)STYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR(D/E)E(L/M)TKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(K/no presente) (consenso Fc; SEQ ID NO: 112).

en donde el aminoácido en la posición 23 es K.

Salvo que se indique lo contrario, el dominio Fc de un anticuerpo reivindicado o una porción de unión a antígeno del mismo puede comprender una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias en la Tabla 4. SEQ ID NO: 10, 12, 14, 16, 99, 101, 103 y 105 comprenden un dominio CH1 en el terminal N (residuos 1-98).

TABLA 4

continuación

continuación

continuación

continuación

continuación

Las regiones variables de los anticuerpos reivindicados se pueden ligar opcionalmente al dominio Fc mediante un "ligador de aminoácidos" o "ligador". Por ejemplo, el terminal C de un dominio de la cadena pesada variable se puede fusionar al terminal N de un ligador de aminoácidos, y un dominio Fc se puede fusionar al terminal C del ligador. Si bien los ligadores de aminoácidos pueden tener cualquier longitud y pueden comprender cualquier combinación de aminoácidos, la longitud del ligador puede ser relativamente corta (por ejemplo, cinco o menos aminoácidos), a fin de reducir las interacciones entre los dominios ligados. La composición de aminoácidos del ligador también se puede ajustar para reducir la cantidad de aminoácidos con cadenas laterales voluminosas o aminoácidos susceptibles de introducir una estructura secundaria. Los ligadores de aminoácidos adecuados incluyen, entre otros, aquellos de hasta 3, 4, 5, 6, 7, 10, 15, 20 o 25 aminoácidos de longitud. Las secuencias ligadoras de aminoácidos representativas incluyen GGGGS (SEQ ID NO: 73), y un ligador que comprende 2, 3, 4 o 5 copias de GGGGS (SEQ ID NO: 74-77, respectivamente). La Tabla 5 enumera las secuencias ligadoras adecuadas para el uso en la presente descripción.

TABLA 5

Preparación del anticuerpo

El anticuerpo reivindicado se puede producir y purificar usando técnicas conocidas en el estado de la técnica en una línea celular de mamífero huésped adecuada, tal como CHO, 293, COS, NSO y similares, y luego mediante purificación usando un método o una combinación de métodos, que incluyen cromatografía de afinidad de la proteína A, intercambio iónico, técnicas de fase inversa o similares.

Como se sabe en el estado de la técnica, múltiples codones pueden codificar el mismo aminoácido. Por ello, los ácidos nucleicos que codifican una secuencia proteica incluyen ácidos nucleicos que tienen degeneración del codón. Las secuencias de polipéptidos descritas en la presente se pueden codificar mediante varios ácidos nucleicos. El código génico es universal y conocido. Los ácidos nucleicos que codifican cualquier secuencia de polipéptidos de la presente se pueden concebir fácilmente en función del conocimiento convencional en el estado de la técnica al igual que optimizar para la producción. Debido a que existe una gran cantidad de secuencias de ácidos nucleicos posibles que codifican un determinado polipéptido, mediante una tabla estándar del código génico y una computadora, la persona del oficio de nivel medio podrá generar fácilmente todas las combinaciones posibles de secuencias de ácidos nucleicos que codifican un determinado polipéptido.

Una secuencia de ácidos nucleicos representativa que codifica un dominio variable de la cadena pesada de 5F11-45 es: caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggat acaccttcactgacttatcgatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatacattactcctagcagtg gatatactgcgtacaatcagaagttcaagggcaagaccacgttgaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgag cagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagattgatcttacaacggggagcttactggggccagggaaccctgg tcaccgtctcctca (SEQ ID NO: 113). En esta secuencia, los nucleótidos 76-10 codifican CDR1, los nucleótidos 148-196 codifican CDR2 y los nucleótidos 295-318 codifican CDR3 del dominio variable de la cadena pesada de 5F11-45.

Una secuencia de ácidos nucleicos representativa que codifica un dominio variable de la cadena ligera de 5F11-45 es:

gacatcgtgctgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagagccagta

aaaatgttgatagttatggcaatagttttatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttaccgtgcatcca

acctagaatctggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaa

gatgtggcagtttattactgtcagcaaagtaatgaggatCCtCtCacqt t tq q c c a q q q q a c c a a q c i tq q a q a tc a a a

(SEQ ID NO: 114). En esta secuencia, los nucleótidos 70-117 codifican CDR1, los nucleótidos 160-180 codifican CDR2 y los nucleótidos 277-303 codifican CDR3 del dominio variable de la cadena ligera de 5F11-45.

Una secuencia de ácidos nucleicos representativa que codifica una cadena pesada de 5F11-45 que comprende un dominio Fc P238K es:

caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggat acaccttcactgacttatcgatgcactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatacattactcctagcagtg gatatactgcgtacaatcagaagttcaagggcaagaccacgttgaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgag cagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagattgatcttacaacggggagcttactggggccagggaaccctgg tcaccgtctcctcagctagcaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggcc ctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacacct tcccggccgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctac atctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgccc accgtgcccagcacctgaactcctggggggaaagtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccgga cccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggt gcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccagga ctggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaa gggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctg gtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctccc gtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatg ctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggt (SEQ ID NO: 115). En esta secuencia, los nucleótidos 1-351 codifican el dominio variable de la cadena pesada. Los nucleótidos 352-645 codifican el dominio CH1, y los nucleótidos 646-1338 codifican el dominio Fc. Opcionalmente, un codón para lisina se puede agregar al extremo 3' de la secuencia del dominio Fc.

Una secuencia de ácidos nucleicos representativa que codifica una cadena ligera de 5F11-45 es: gacatcgtgctgacccagtctccagactccctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagagccagtaaaaatgtt gatagttatggcaatagttttatgcactggtaccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttaccgtgcatccaacctaga atctggggtccctgaccgattcagtggcagcgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggc agtttattactgtcagcaaagtaatgaggatcctctcacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaacgtacggtggctgcacc atctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagag gccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacag cacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatca gggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgt

(SEQ ID NO: 116). En esta secuencia, los nucleótidos 1-333 codifican el dominio variable de la cadena ligera, y los nucleótidos 334-654 codifican CL.

La secuencia codificante para las cadenas pesada y/o ligera codifica un péptido de señal, tal como MRAWIFFLLCLAGRALA(SEQ ID NO: 119), en el extremo 5' de la secuencia codificante. Las secuencias codificantes de ejemplo para una cadena ligera y una cadena pesada de 5F11-45, en donde cada una incluye una secuencia codificante de péptido de señal, son:

atgagggcttggatcttctttctgctctgcctggccgggagagcgctcgcacaggtgcagctggtgcagtctggggctga ggtgaagaagcctgggtcctcggtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcactgacttatcgatgcactgggtgcgaca ggcccctggacaagggcttgagtggatgggatacattactcctagcagtggatatactgcgtacaatcagaagttcaagggcaaga ccacgttgaccgcggacaaatccacgagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactg tgcgagattgatcttacaacggggagcttactggggccagggaaccctggtcaccgtctccícagctagcaccaagggcccatcgg tcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccg gtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggccgtcctacagtcctcaggactctactccct cagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaa ggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaaag tcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagc cacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagca gtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtct ccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgc ccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtgga gtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagc aagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactaca cgcagaagagcctctccctgtctccgggt (SEQ ID NO: 117)

y

atgagggcttggatcttctttctgctctgcctggccgggcgcgccttggccgacatcgtgctgacccagtctccagactcc ctggctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcagagccagtaaaaatgttgatagttatggcaatagttttatgcactggta ccagcagaaaccaggacagcctcctaagctgctcatttaccgtgcatccaacctagaatctggggtccctgaccgattcagtggcag cgggtctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcaggctgaagatgtggcagtttattactgtcagcaaagtaatgaggat cctctcacgtttggccaggggaccaagctggagatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagc agttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgc cctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgct gagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagctt caacaggggagagtgt (SEQ ID NO: 118).

Consecuentemente, la invención también proporciona un ácido nucleico que codifica un anticuerpo reivindicado. Dicho ácido nucleico se puede insertar en un vector, tal como un vector de expresión adecuado, por ejemplo, pHEN-1 (Hoogenboom et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:4133-4137). La invención también proporciona una célula huésped aislada que comprende un vector y/o ácido nucleico reivindicados.

El anticuerpo reivindicado se puede producir y purificar usando solo técnicas conocidas en el estado de la técnica en cualquier línea celular de mamífero huésped adecuada, tal como CHO (células de ovario de hámster chino), 293 (célula de riñón embrionario humano 293), células COS, células NSO y similares, y luego mediante purificación usando un método o una combinación de métodos, que incluyen cromatografía de afinidad de la proteína A, intercambio iónico, técnicas de fase inversa o similares.

Composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento

Una composición farmacéutica reivindicada comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más anticuerpos reivindicados y un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Los vehículos aceptables desde el punto de vista farmacéutico incluyen, por ejemplo, agua, solución salina, solución salina amortiguada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de estos. Los vehículos aceptables desde el punto de vista farmacéutico también pueden comprender cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulgentes, conservantes o amortiguadores que mejoran la vida útil o la efectividad de la proteína de fusión. Las composiciones se pueden formular para proveer una liberación rápida, sostenida o retrasada de los ingredientes activos después de la administración. Las composiciones farmacéuticas y los procesos adecuados para prepararlas se conocen en el estado de la técnica. Véase, por ejemplo, Remington, The Science and Practice of Pharmacy, A. Gennaro, et al., eds., 21a edición, Mack Publishing Co. (2005).

La composición farmacéutica reivindicada también puede comprender un agente inmunosupresor/inmunomodulador y/o antiinflamatorio.

Un método de tratamiento de una enfermedad inmunitaria en un paciente que lo necesita puede comprender administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo reivindicado. La antagonización de la activación de linfocitos T mediada por CD40 podría inhibir respuestas no deseadas de linfocitos T que se producen, por ejemplo, durante la autoinmunidad, el rechazo al trasplante o las respuestas alérgicas. La inhibición de la activación de linfocitos T mediada por CD40 podría moderar la progresión y/o la gravedad de estas enfermedades.

También se proporciona el uso de un anticuerpo reivindicado, o una sal de este aceptable desde el punto de vista farmacéutico, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad inmunitaria en un paciente que necesita dicho tratamiento. El medicamento se puede administrar, por ejemplo, en combinación con un agente inmunosupresor/inmunomodulador y/o antiinflamatorio.

Como se usa en la presente, un "paciente" significa un animal, por ejemplo, un mamífero, incluidos un ser humano. Al paciente se le puede diagnosticar una enfermedad inmunitaria. Los términos "tratamiento" o "tratar" se refieren al proceso que implica aliviar la progresión o la gravedad de un síntoma, un trastorno, una afección o una enfermedad. Una "enfermedad inmunitaria" se refiere a cualquier enfermedad asociada al desarrollo de una reacción inmunitaria en un individuo, que incluye una reacción inmunitaria celular y/o humoral. Los ejemplos de enfermedades inmunitarias incluyen, entre otras, inflamación, alergia, enfermedad autoinmunitaria o enfermedad relacionada con el injerto. Una "enfermedad autoinmunitaria" se refiere a cualquier enfermedad asociada al desarrollo de una reacción autoinmunitaria en un individuo, que incluye una reacción inmunitaria celular y/o humoral. Un ejemplo de enfermedad autoinmunitaria es la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), que incluye, entre otras, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn. Otras enfermedades autoinmunitarias incluyen lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, diabetes, psoriasis, esclerodermia y ateroesclerosis. Las enfermedades relacionadas con el injerto incluyen enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD), rechazo al trasplante agudo y rechazo al trasplante crónico.

Las enfermedades que se pueden tratar mediante la administración de un anticuerpo reivindicado se pueden seleccionar del grupo que consiste en enfermedad de Addison, alergias, anafilaxia, espondilitis anquilosante, asma, ateroesclerosis, alergia atópica, enfermedades autoinmunitarias auditivas, enfermedades autoinmunitarias oculares, hepatitis autoinmunitaria, parotiditis autoinmunitaria, asma bronquial, cardiopatía coronaria, enfermedad de Crohn, diabetes, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad intestinal inflamatoria, respuesta inmunitaria a productos farmacológicos recombinantes (por ejemplo, Factor VII en pacientes hemofílicos), lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia grave, pénfigo, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, rechazo al trasplante, vasculitis y colitis ulcerosa.

La composición farmacéutica reivindicada se puede administrar sola o en un tratamiento conjunto (es decir, de manera simultánea o secuencial) con un agente inmunosupresor/inmunomodulador y/o antiinflamatorio. Las diferentes enfermedades inmunitarias pueden requerir del uso de compuestos auxiliares específicos útiles para el tratamiento de enfermedades inmunitarias, lo que puede determinarse en función de cada paciente en particular. Por ejemplo, la composición farmacéutica reivindicada se puede administrar en combinación con uno o más adyuvantes adecuados, por ejemplo, citocinas (IL-10 e IL-13, por ejemplo) u otros estimuladores inmunitarios, por ejemplo, quimiocinas, antígenos asociados a tumores y péptidos. Los adyuvantes adecuados se conocen en el estado de la técnica.

Se puede usar cualquier vía o método adecuados para administrar el anticuerpo reivindicado o la composición farmacéutica reivindicada. Las vías de administración incluyen, por ejemplo, la administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intramuscular. Una dosis terapéuticamente eficaz del anticuerpo reivindicado administrado depende de varios factores que incluyen, por ejemplo, el tipo y la gravedad de la enfermedad inmunitaria que se trate, el uso del tratamiento conjunto, la vía de administración del anticuerpo o la composición farmacéutica, y el peso del paciente. Un rango no limitativo para una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo de dominio reivindicado es de 0,1-20 miligramos/kilogramo (mg/kg) y, en un aspecto, 1-10 mg/kg, con respecto al peso corporal del paciente.

Kits

También se describe para la compresión de la invención un kit útil para el tratamiento de una enfermedad inmunitaria en un paciente humano. El kit puede comprender (a) una dosis de un anticuerpo reivindicado y (b) material instructivo para usar el anticuerpo reivindicado en el método para tratar una enfermedad inmunitaria en un paciente.

Como se usa en la presente, "material instructivo" incluye una publicación, un registro, un diagrama o cualquier otro medio de expresión, que se puede usar para comunicar la utilidad de la composición y/o el compuesto de la invención en un kit. El material instructivo del kit puede adherirse, por ejemplo, a un recipiente que contiene el compuesto y/o la composición de la invención o se puede enviar junto con un recipiente, que contiene el compuesto y/o la composición. De manera alternativa, el material instructivo se puede enviar separado del recipiente con el fin de que el destinatario utilice el material instructivo y el compuesto conjuntamente. El envío del material instructivo puede ser, por ejemplo, mediante envío físico de la publicación u otro medio de expresión que comunica la utilidad del kit, o se puede lograr, de manera alternativa, mediante transmisión electrónica, por ejemplo, mediante una computadora, tal como mediante correo electrónico o descarga de un sitio web.

EJEMPLOS

Los anticuerpos y las porciones de unión a antígeno de éstos de la invención se definen claramente en las reivindicaciones. En el contexto de la descripción anterior, es fácilmente evidente cuáles de las moléculas descritas en los siguientes ejemplos entran en el ámbito de la invención reivindicada, y qué moléculas son ejemplos de referencia útiles para la comprensión de la invención reivindicada.

Ejemplo 1: El formateo con Fc de anticuerpos anti-CD40 afecta la activación de células dendríticas inmaduras.

Los anticuerpos se pueden modificar por ingeniería genética para tener diferentes afinidades y selectividad para FcgR (F^cyR) mediante la mutación de la región constante de la cadena pesada, tal como en el dominio bisagra y Fc. Las mutaciones se pueden introducir para mejorar o reducir la unión a FcgR. Estas mutaciones pueden aumentar o reducir la señalización y/o reticulación mediadas por FcgR. Para dianas terapéuticas tales como CD40, la reticulación mediada por FcgR de anticuerpo anti-CD40 puede tener el potencial de generar señalización agonista no deseada y toxicidad. Es importante para identificar anticuerpos antagonistas anti-CD40 que demuestran unión a FcgR reducida y potencial para reticulación y/o señalización, específicamente, acoplamiento reducido de FcgR hCD32a/FcgRIIa, hCD32b/FcgRIIb, hCD16a/FcgRIIIa y hCDl6b/FcgRIIIb de "baja afinidad". Por lo general, se cree que el acoplamiento del receptor CD64/FcgRI de "alta afinidad" es de menor interés debido a la saturación de este receptor con IgG en suero.

El anticuerpo 5F11-45 se describe en la publicación de la patente estadounidense N.° 20160376371 como un anticuerpo humanizado con alta afinidad a CD40 humana que está modificada por ingeniería genética para tener actividad agonista, y la capacidad de unirse preferentemente a CD32a-R131 y CD32b. La Tabla 6 a continuación proporciona las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de 5F11-45. En la región variable de la cadena pesada, CDR1 es aminoácidos 26-35, CDR2 es aminoácidos 50-66, y CDR3 es aminoácidos 99-106. En la región variable de la cadena ligera, CDR1 es aminoácidos 24-38, CDR2 es aminoácidos 54-60, y CDR3 es aminoácidos 93-101. Las CDR están subrayadas en cada región variable.

Para explorar el impacto del formateo con Fc en la activación de células dendríticas inmaduras (iDC), el anticuerpo anti-CD40 humanizado, 5F11-45, se formateó con un isotipo IgG1f humano de tipo silvestre (5F11-45-IgG1f) así como cuatro isotipos con mutaciones diseñadas para reducir la unión a FcgR (es decir, 5F11-45-IgG1.3f, 5F11-45-CTza, 5F11-45-P238K, 5F11-45-N297A). Véanse SEQ ID NO: 81-85 en la Tabla 6. La Tabla 6 también enumera las regiones constantes de las cadenas pesada y ligera para cada anticuerpo 5F11-45. El dominio Fc está subrayado en la Tabla 6. La región variable de la cadena pesada (aminoácidos 1-117) y la región variable de la cadena ligera (aminoácidos 1-111) están en negrita. La secuencia (aminoácidos 118-215 de la cadena pesada) entre la región variable (en negrita) y el dominio Fc (subrayado) comprende el dominio CH1 en la cadena pesada. La secuencia que no está en negrita (aminoácidos 112-218) en la cadena ligera comprende el dominio CL.

TABLA 6

(co n tin u a c ió n )

(co n tin u a c ió n )

(co n tin u a c ió n )

Como controles, el mismo anticuerpo 5F11-45 se modificó por ingeniería genética para tener unión mejorada a las proteínas CD32a y CD32b humanas (5F11-45-SE; las cadenas pesada (HC) y ligera (LC) se indican como SEQ ID NO: 86 y 88, respectivamente) o selectividad mejorada para hCD32b con respecto a hCD32a (5F11-45-V11; las cadenas pesada y ligera se indican como SEQ ID NO: 87 y 88, respectivamente).

Todas las variantes Fc de 5G11-45 demostraron alta afinidad para unirse a la diana CD40 mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR) Tabla 7.

TABLA 7: Los datos cinéticos y de afinidad de SPR para el monómero de CD40 humana que se une a anticuerpos F11-4 r n l rfi i n hi n r l r ín A.

Los perfiles de unión a FcgR de los anticuerpos 5F11-45 modificados por ingeniería genética con Fc se caracterizaron mediante SPR para determinar si las mutaciones de Fc tenían impactos deseados en la unión a y selectividad para FcgR. Los datos de SPR para la unión a FcgR se muestran en la Tabla 8.

TABLA 8: Datos %Rmax para 1 pM o 10 pM de anticuerpos 5F11-45 que se unen a proteínas hFcgR-his capturadas por anti-his Fab.

Como se muestra en la Tabla 8, 5F11-45-IgG1f se une a todos los FcgR, con una unión particularmente fuerte a CD64, CD16a-V158 y CD32a-H131. La variante S267E (5F11-45-SE) (control) demuestra la unión mejorada prevista a las proteínas CD32a y CD32b. Las cinco mutaciones presentes en el isotipo IgG1 V11 de 5F11-45-V11 proporcionaron selectividad mejorada para CD32b.

Las otras cuatro variantes Fc de 5F11-45 mostraron unión a FcgR reducida. 5F11-45-IgG1.3f demostró unión reducida a todos los FcgR que incluyen la unión más débil a CD64. A concentraciones de anticuerpo muy altas (es decir, 10 pM), se observó un poco de unión débil de 5F11-45-IgG1.3f a CD32a-R131. En contraste, las otras tres variantes (5F11-45-CTza, 5F11-45-P238K y 5F11-45-N297A) demostraron una unión casi no detectable a cualquier FcgR de baja afinidad, incluso a una concentración de anticuerpo de 10 pM. Véase la Tabla 7 más arriba. También se observaron diferencias en la unión a CD64, en especial, en las velocidades de disociación, que son considerablemente más rápidas para 5F11-45-P238K y 5F11-45-N297A en comparación con 5F11-45-CTza o 5F11-45-IgG1f, Figura 1.

Las células dendríticas inmaduras (iDC) son sensibles a la activación indirecta de CD40 a través de agrupamiento/reticulación que puede producir la activación de DC inmaduras y así genera la liberación de citocinas (por ejemplo, interleucina-6, Il-6) y la regulación ascendente de señales de activación de la superficie celular (por ejemplo, CD86 y CD54). Las células de ovario de hámster chino (CHO) que sobreexpresan altamente CD32a, y que tienen una baja afinidad a FcgR se usaron para demostrar el potencial de agrupamiento/reticulación mediados por FcgR. La relación de células CHO con respecto a iDC es 1:6, que representa un nivel exagerado de agrupamiento/reticulación.

BMS-986090 es un anticuerpo de dominio antagonista anti-CD40 fusionado con el dominio Fc de IgG4 y tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

EVQLLESGGGLVOPGGSLRLSCAASGFTFRDYEMWWVROAPGKGLERVSAINPQG TRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLOMNSLRAEDTAVYYCAKLPFRFSDRGOGTL VTVSSASTESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQ EDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK, (SEQ ID NO: 89)_(que es SEQ ID NO: 1287 en WO 2012/145673). La porción subrayada con línea continua de la secuencia de BMS-986090 corresponde al anticuerpo de dominio BMS3h-56-269 (que es SEQ ID NO: 417 en WO 2012/145673). "AST" subrayado con línea punteada es un ligador, y el resto es el dominio Fc denominado IgG4.1. 2141 (mAb 134-2141) es un anticuerpo agonista contra CD40 (véase Robert Vonderheide et al., "Clinical Activity and Immune Modulation in Cancer Patients Treated with CP-870,893, a Novel CD40 Agonist Monoclonal Antibody," 25(7): 876-883 (2007)). BMS-986090 y 2141 se usaron como controles positivos para la activación de iDC mediada por reticulación de anti-CD40. L6-IgG4, una proteína de fusión sin capacidad de unión a CD40, que funciona como control negativo. Como se muestra en la Figura 2, 5F11-45-CTza, 5F11-45-P238K y 5F11-45-N297A no muestran activación de iDC mediada por reticulación de anti-CD40 según se mide mediante el aumento de citocina (interleucina-6; Il-6; Figura 2A) o los aumentos del marcador de activación (CD86 MFI; Figura 2C y CD54 MFI; Figura 2B) cuando son solubles o están reticuladas/agrupadas por CD32 de superficie celular. 5F11-45-IgG1.3f demostró activación de iDC modesta solo cuando se coincubó con células CHO CD32, según se indicó mediante aumentos en la tinción de la superficie celular de CD54 y CD86. Todas las variantes que demostraron unión a FcgR de baja afinidad (es decir, 5F11-45-IgG1f, 5F11-45-SE y 5F11-45-V11) demostraron activación de iDC que aumentó drásticamente con la adición de células CHO CD32, Figura 2. El anticuerpo 5F11-45 formateado con CTza, P238K y N297A no demostró ninguna activación de iDC detectable. Estos datos respaldan que el anticuerpo 5F11-45 formateado con CTza, P238K o N297A antagoniza la actividad de CD40.

Con el fin de evaluar adicionalmente estas observaciones en otros anticuerpos, un anticuerpo anti-CD40 humana de ratón potente, Y1238, se formateó como un anticuerpo quimérico con estos isotipos y como IgG1.3f (SEQ ID NOS: 90-93 para las cadenas pesadas y SEQ ID NO: 94 para las cadenas ligeras). Véase la Tabla 9. La región variable de la cadena pesada es aminoácidos 1-118 (negrita). En la región variable de la cadena pesada, CDR1 es aminoácidos 26-36, CDR2 es aminoácidos 50-66, y CDR3 es aminoácidos 99-107. El dominio Fc es aminoácidos 217-448. La secuencia (aminoácidos 119-216 de la cadena pesada) entre la región variable (en negrita) y el dominio Fc (subrayado) comprende el dominio CH1 en la cadena pesada. La región variable de la cadena ligera es aminoácidos 1-107. En la región variable de la cadena ligera, CDR1 es aminoácidos 24-34, CDR2 es aminoácidos 50-56, y CDR3 es aminoácidos 89-97. Los aminoácidos 108-214 en la cadena ligera comprenden el dominio CL.

TABLA 9

continuación

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Estos anticuerpos quiméricos se evaluaron para determinar la unión a CD40 y FcgR mediante SPR, así como para la activación de iDC. Todos los anticuerpos Y1238 quiméricos con variante de Fc demostraron alta afinidad a CD40 humana, Tabla 10.

TABLA 10 Los datos cinéticos y de afinidad de SPR para el monómero de CD40 humana que se une a anticuerpos Y12 im ri r n l rfi i n hi n r l r ín A.

Al igual que 5F11-45, los anticuerpos Y1238 quiméricos con dominios Fc modificados por ingeniería genética demostraron una unión a FcgR mucho más débil en comparación con el control de isotipo lgG1f. La molécula de Y1238-lgG1.3f demostró algunas respuestas de unión débiles pero medibles a FcgR de baja afinidad, en particular, CD32a-R131 y CD32b. En contraste, las variantes CTza, P238K y N297A tuvieron unión muy débil o no detectable a estos FcgR, incluso a una concentración de anticuerpo de 10 ^jM, Tabla 11.

TABLA 11 Datos %Rmax para 1 ^jM o 10 ^jM de anticuerpos Y1238 quiméricos que se unen a proteínas hFcgR-his r r ni-Hi F .

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La unión a CD64 fue similar para los anticuerpos Y1238 quiméricos que con las variantes de 5F11-45, en donde IgG1.3f demostró la unión a CD64 más débil. Ambas variantes P238K y N297A tiene velocidades de disociación considerablemente más rápidas que CTza, ya sea en forma de anticuerpo Y1238 quimérico o en 5F11-45.

Al igual que 5F11-45, el Y1238 quimérico no demostró activación de iDC, ya sea solo o con la adición de células CHO que sobreexpresan FcgR (CD32) cuando se formatean con los isotipos de CTza, P238K o N297A, Figura 3. La activación mínima se observó para Y1238 quimérico con la secuencia de IgG1.3f Fc. Sin embargo, la liberación de citocinas de iDC (Figura 3A) y la regulación ascendente del marcador de activación (Figuras 3B y 3C) aumentaron con la coincubación con células CHO que expresan CD32.

Y1238-P238K y Y1238-N297A quiméricos también se evaluaron en iDC de donantes adicionales, lo que confirma que estas moléculas no activan las células dendríticas inmaduras, ya sea solas o con la adición de células CHO CD32, Figura 4. Los controles positivos en estos estudios son BMS-986090 y 2141; ambos anticuerpos generan la activación de iDC en células de un subgrupo de donantes cuando se usan en solución (Figuras 3 y 4). Sin embargo, la activación de iDC aumentó drásticamente con el agrupamiento y la reticulación de células CHO CD32, que se observó en células de cada donante evaluado en estas condiciones.

Ejemplo 2: El anticuerpo antagonista contra CD40 humanizado, Y1238, demuestra una potente inh ib ic ión de la señalización de CD40 y ninguna señal agonista cuando se formatea con isotipos que contienen mutaciones P238K o N297A.

Los antecedentes y el procedimiento de humanización son como se analizan en la sección "II. Engineered and Modified Antibodies" en WO2017004006. En función de este análisis, 11 secuencias V^h(SEQ ID NO: 23-33) y 5 secuencias V^k(SEQ ID NO: 34-38) se seleccionan para evaluación. Las sustituciones se indican en negrita y subrayadas con línea de puntos. Las CDR en cada cadena pesada variable y cadena ligera variable, en orientación CDR1-CDR2-CDR3, se indican subrayadas, es decir, GYAFTNYLIE (SEQ ID NO: 17), VINPGSGGTNYNEKFKG (SEQ ID NO: 18), y SQLGRRFDY (SEQ ID NO: 19) respectivamente para las ^cD^rde la cadena pesada variable (Tabla 12) y KASQDVRTGVA (SEQ ID NO: 20), SASYRNT (SEQ ID NO: 21), y QQHYSPPYT (SEQ ID NO: 22) para las CDR de la cadena ligera variable, respectivamente (Tabla 13).

TABLA 12: n i l n v ri l Y12 h m niz :

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TABLA 13: Secuencias de la cadena li era variable de Y1238 humanizado:

Las secuencias V^hse formatearon en el contexto de un isotipo IgG1.3f. Las secuencias V^kse formatearon como una cadena ligera completa con una secuencia CL común. Las 55 combinaciones de estos constructos HC y LC humanizados, así como la molécula de Y1238 quimérico se expresaron como 3 ml de sobrenadantes para análisis de unión mediante SPR. Cada uno de los 56 sobrenadantes, así como un anticuerpo IgG1 quimérico Y1238 purificado, se capturó en un chip sensor de la proteína A y se evaluó para determinar la unión a dos concentraciones (es decir, 200 nM y 1000 nM) de monómero de hCD40 mediante SPR BIAcore™ en un ensayo de cribado. Todos los anticuerpos, excepto aquellos que contienen hz-HC3, se capturaron a altos niveles (>300 RU) usando una dilución de 100 veces del sobrenadante de expresión, lo que indicó un título alto de anticuerpo en el sobrenadante excepto para las muestras de hz-HC3. Los datos cinéticos para las dos concentraciones de monómero de hCD40 se ajustaron a un modelo Langmuir 1:1, para obtener cálculos de los valores cinéticos y de afinidad de estas interacciones, y para comparar las diferentes moléculas. Estos datos mostraron que los anticuerpos capturados se unen con alta afinidad a CD40; valores de KD estimados entre 2,65 nM y 18,2 nM, véase la TABLA 14. Para una determinada cadena ligera, los anticuerpos con cadenas pesadas hzHC1, hz-HC2, hz-HC4, hz-HC5, hz-HC6, hz-HC7, hz-HC8 y hz-HC9 demostraron mayor afinidad a CD40 que aquellos que contienen hz-HC10 o hz-HC11. Además, para una determinada cadena pesada, los anticuerpos con cadenas ligeras hz-LC1 o hz-LC2 tuvieron mayor afinidad a CD40 que aquellos con hz-LC3, hz-LC4 o hz-LC5. Una serie de titulaciones cinéticas completa de la unión a CD40 para sobrenadantes representativos y Y1238 quimérico purificado también demostró que los valores de K^destimados en función de los datos de cribado de dos valores (200 nM y 1000 nM), eran cálculos razonables de la cinética y afinidad de unión para las muestras de sobrenadantes cuando se comparó con una serie de titulaciones cinéticas completa de analito como se muestra en la Tabla 14.

TABLA 14: Datos cinéticos y de afinidad de SPR para el monómero de CD40 humana que se une a anticuerpos Y1238 humanizados capturados en la superficie de un chip sensor de la proteína A. Los datos se muestran para un ensayo de cribado de 2 valores donde las muestras de 200 nM y 1000 nM de monómero de CD40 humana se evaluaron, así como para un ensayo "cinético completo" donde se evaluó una serie de concentraciones completa de monómero de CD40 humana.

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En función de los datos de SPR del cribado de sobrenadantes y con preferencia hacia los constructos con pocas retromutaciones de marco, un subgrupo de anticuerpos Y1238 humanizados se seleccionó para expresión, purificación y caracterización adicional. Dos de estos anticuerpos (es decir, Y1238-hz1 y Y1238-hz2) se formatearon con los isotipos P238Ky N297A(es decir, SEQ ID NO: 39, 40, 42 y 43 para cadenas pesadas; véase la Tabla 15 para cadenas ligeras) y se evaluaron para determinar la unión a CD40 y FcgR mediante SPR. Los datos de SPR de unión a CD40 mostraron que cada anticuerpo unido a la diana CD40 con alta afinidad, Tabla 16. Los datos se compararon con los de otro anticuerpo anti-CD40, anticuerpo BI-mAb-B (es decir, SEQ ID NO: 95 y 96, descritas en la patente estadounidense N.° 9.090.696 y denominado en aquella "Anticuerpo B"), que se une con una afinidad mucho menor que las moléculas de Y1238 humanizado, Tabla 15. El dominio Fc está subrayado.

TABLA 15

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La alineación de las dos secuencias de la cadena ligera para Hz1 y Hz2 de la Tabla 15 (SEQ ID NO: 41 y 44) es la siguiente y muestra una diferencia de mutación (en la posición 66; subrayada más adelante) entre las dos secuencias:

41 (1 ) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVRTGVAWYQQKPGKAPKLLIYS 44 (1 ) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVRTGVAWYQQKPGKAPKLLIYS 51 100 41 ( 51 ) ASYRNTGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSPPYTFGG 44 ( 51 ) ASYRNTGVPSRFSGSRSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQHYSPPYTFGG 1 01 150 41 ( 101 ) GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV 44 ( 101 ) GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKV 1 51 200 41 ( 151 ) DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG 44 ( 151 ) DNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQG 201 21 4

41 ( 201 ) LSSPVTKSFNRGEC

44 ( 201 ) LSSPVTKSFNRGEC

TABLA 16: Datos cinéticos y de afinidad de SPR para el monómero de CD40 humana que se une a anticuerpos Y12 h m niz BI-mA -B r n l rfi i n hi n r l r ín A.

Todos los anticuerpos Y1238 se demuestran como antagonistas potentes de la proliferación de linfocitos B impulsados por el trímero de CD40L soluble o CD40L celular de células CHO que expresan CD40L (véase la Tabla 17). En contraste, el anticuerpo competidor BI-mAb-B y 5F11-45-P238K mostraron inhibición potente de la proliferación de linfocitos B impulsada por señales de CD40L soluble, pero fue menos eficaz para inhibir la proliferación de linfocitos B impulsada por CD40L celular (células CHO que sobreexpresan CD40L). Los anticuerpos Y1238 quiméricos y humanizados exhibieron solo alrededor de un desplazamiento de 10 veces en potencia cuando se usó CD40L celular para linfocitos B estimulados.

Tabla 17. Inhibición de linfocitos B humanos de amígdalas impulsada por trímero de CD40L soluble o CD40L celular de células CHO que sobreexpresan CD40L. La IC50 para la inhibición de la proliferación de linfocitos B se determina en ng/ml. Se indican la desviación estándar (STDEV) y la cantidad de donantes (n). *BI mAb-B y 5F11-45-P238K no inhi i m l m n l r lif r i n linf i B. L inhi i i n r m i in i 1 ml.

La unión a FcgR para los anticuerpos Y1238 humanizados (es decir, Y1238-hz1-N297A, Y1238-hz1-P238K, Y1238-hz2-P238Ky Y1238-hz1-N297A) coincidían con los datos previos para los anticuerpos Y1238 quiméricos y anticuerpos 5F11-45, que muestran respuestas de unión muy débiles para todos los FcgR de baja afinidad, Tabla 18.

TABLA 18 Datos %Rmax para 1 pM o 10 pM de anticuerpos Y1238 humanizados que se unen a proteínas hFcgR-His c r r ni-Hi F .

Además, las versiones humanizadas de los anticuerpos Y1238 exhibieron activación mínima de iDC en comparación con la proteína de control negativo L6-IgG4 cuando se evaluó sola o con la adición de células CHO que expresan FcgR CD32. Esta observación coincide con la incapacidad de los anticuerpos Y1238 humanizados para activar CD40 incluso con la reticulación exagerada proporcionada por las células CHO que sobreexpresan CD32. En contraste, los controles 2141 y BMS-986090 mostraron activación dependiente del donante moderada de iDC sola que aumentó fuertemente cuando se reticuló o se agrupó mediante las células CHO CD32, Figura 5 y Figura 6. De manera similar, 5F11-45-P238K, cuando se evaluó en un panel más grande de donantes de iDC, no exhibió activación sola o con agrupamiento o reticulación mediada por CD32, Figura 6.

Materiales y métodos para los Ejemplos

SPR PARA UNIÓN A FCGR: La unión a FcgR se puede medir in vitro usando FcgR purificados mediante métodos tales como resonancia de plasmones superficiales BIAcore™ (SPR). Un método evalúa la unión de anticuerpos purificados a proteínas FcgR etiquetadas con His (FcgR-His) que se capturan en el fragmento Fab inmovilizado de un anticuerpo anti-His. Estos experimentos se realizan en un instrumento BIAcore™ T100 o BIAcore™ T200 (GE Healthcare Life Sciences, Marlborough, MA) a 25 °C. El fragmento Fab de un anticuerpo anti-6xHis murino (generado de manera interna) se inmoviliza en un chip sensor CM5 usando química de etil(dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC)/N-hidroxisuccinimida (NHS) estándar con bloqueo de etanolamina, a una densidad de ~3000 UR en un amortiguador de corrida de 10 mM de HEPES pH 7,4, 150 mM de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,05 % de tensioactivo p20 (HBS-EP+). Los estudios restantes se llevan a cabo usando un amortiguador de corrida de 10 mM de NaPO4, 130 mM de NaCl, 0,05 % de p20 (PBS-T) pH 7,1. Distintas proteínas F^cyR que contienen una etiqueta 6x poli-histidina del terminal C (generada de manera interna) se capturan en la superficie (en general usando una concentración de proteína FcgR-his de ~7 pg/ml) con un tiempo de contacto de 30 s a 10 pl/min. Distintas concentraciones de anticuerpo purificado se evalúan para determinar la unión, por ejemplo, con un tiempo de asociación de 120 segundos a 30 pl/min, y un tiempo de disociación de 120 segundos a 30 pl/min. Las proteínas FcgR evaluadas en estos estudios incluyen FcgR CD64 de "alta afinidad" (hFcgRI), así como FcgR CD32a-H131 (FcgRIIa-H131), CD32a-R131 (FcgRIIa-R131), CD32b (FcgRIIb), CD16a-V158 (FcgRIIIa-V158) y CD16b-NA2 (FcgRIIIb-NA2) de "baja afinidad".

Para analizar cuantitativamente las respuestas de unión y comparar la unión a FcgR de diferentes moléculas, los datos de unión según SPR se pueden analizar calculando la respuesta de unión máxima como un porcentaje de la respuesta de unión máxima teórica (%Rmax), usando la ecuación:

ECUACIÓN 1: %Rmax = (Respuesta de unión del analito) / [ ((Mw del analito) / (Mw del ligando)) x (Repuesta del ligando) x (estequiometría analito:ligando) ]

en donde "analito" es el anticuerpo y "ligando" es la proteína FcgR capturada.

Este análisis no contempla la masa de glucosilación del anticuerpo o FcgR, y supone el 100 % de actividad fraccionaria para el ligando capturado. Debido a que los FcgR son glucosilados, los valores %Rmax son generalmente menos de 100 % incluso en condiciones de saturación. El análisis %Rmax es particularmente útil para evaluar la unión de FcgR CD32a-H131, CD32a-R131, CD32b, CD16a-V158 y CD16b-NA2 de "baja afinidad", que tiene velocidades de asociación y disociación relativamente rápidas y afinidades cerca o por debajo de las concentraciones de analito evaluadas (1 uM), por lo tanto, la saturación de la superficie no se logra generalmente en estas condiciones. En contraste, el FcgR CD64 de "alta afinidad" se une con mayor afinidad y cinética de disociación más lenta que los otros FcgR, en particular, a IgG1 y IgG4. Por ende, estos isotipos generalmente saturan la superficie de CD64 en concentraciones de analito micromolares, y las afinidades de unión son más difíciles de diferenciar usando %Rmax. Para estas interacciones, las diferencias entre anticuerpos se pueden observar fácilmente mediante comparación de las velocidades de disociación en los datos del sensograma.

CINÉTICA Y AFINIDAD DE UNIÓN A CD40: La afinidad de unión a CD40 monovalente de las moléculas de anticuerpo se mide mediante SPR en un instrumento BIAcore™ T100 o T200 (GE Healthcare) a 25 oC capturando el anticuerpo en una superficie del chip sensor de la proteína A inmovilizada, y luego fijándose a la proteína del monómero de CD40 humana (generado de manera interna) con un tiempo de asociación de 180 segundos, tiempo de disociación de 360 segundos a 30 pl/min en PBS-T (solución salina amortiguada con fosfato con Tween®20) a pH 7,1.

AISLAMIENTO Y CULTIVO DE CÉLULAS PRIMARIAS: Las PBMC (células mononucleares de sangre periférica) se aíslan de sangre humana heparinizada mediante separación de gradiente de densidad Ficoll. Los monocitos se aíslan de PBMC de acuerdo con el protocolo Manual EasySep (STEMCELL, Vancouver, Canadá). Un millón de monocitos aislados se colocan en cada cavidad de una placa de 6 cavidades en 6 ml de medio completo (RPMI-1640, 10 % de suero bovino fetal termoinactivado, 100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina), que contiene IL-4 humana (Interleucina-4, 100 ng/ml) y GM-CSF humano (factor estimulante de colonia de granulocitos y macrófagos, 100 ng/ml) y se incuban durante 6 días a 37°C/5 % de CO², cambiando el medio día por medio y reemplazándolo con medio nuevo que contiene la misma concentración de citocinas. Las iDC se recolectan el día 6, se lavan exhaustivamente y se vuelven a suspender en medio completo.

TRATAMIENTO DE iDC CON ANTICUERPOS ANTI-CD40 EN PRESENCIA O AUSENCIA DE AGRUPAMIENTO/RETICULACIÓN DE FcyR: Las titulaciones de los distintos agentes biológicos se realizan en medio completo, y se agregan a placas de 96 cavidades por duplicado. En el caso de la reticulación, los anticuerpos se agregan a las células durante 30 min antes de la adición de células CHO que expresan CD32a en una relación de 1:6. Las células se incubaron a 37°C a 5% de CO²durante aproximadamente 18-20 horas. Se retiran 150 pl de sobrenadante de cada cavidad, se diluye 1:5 y se evalúa para determinar las concentraciones de proteína de IL-6, TNFa e IL-12 usando kits ELISA disponibles en el comercio (R&D Systems, Minneapolis, MN), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células restantes en las placas de los sobrenadantes recolectados se combinan en 1 muestra por tratamiento duplicado, y se transfieren a una nueva placa de fondo redondo (RB) de 96 cavidades, y se colocan a 4 °C. Las células se lavan con D-PBS (solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco), sin Ca++ y Mg++, y se tiñeron durante 30 min en hielo para viabilidad celular usando el kit de tinción de células muertas por infrarrojo cercano fijable LIVE/DEAD® (Invitrogen, Carlsbad, CA). Las células se lavan y se vuelven a suspender en D-PBS, sin Ca++ y Mg++, 2 % de suero bovino fetal (FBS), 0,1 % de NaN³(amortiguador de tinción) y se bloquean con

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD40 humana, en donde dicho anticuerpo comprende una cadena pesada, y una cadena ligera, en donde:

dicha cadena pesada comprende una CDR1, que comprende GYTFTDLSMHW (SEQ ID NO: 1), una CDR2, que comprende YITPSSGYTAYNQKFKG (SEQ ID NO: 2), una CDR3, que comprende LILQRGAY (SEQ ID NO: 3), y una región constante de la cadena pesada humana; y

dicha cadena ligera comprende una CDR1, que comprende RASKNVDSYGNSFMHW (SEQ ID NO: 4), una CDR2, que comprende RASN^lE^s(SEQ ID NO: 5), una C^dR3, que comprende QQSNEDPLT (SEQ ID NO: 6) y una región constante de la cadena ligera humana, y

dicha región constante de la cadena pesada humana es un dominio Fc de IgG1 humana, que comprende una mutación en la posición 238 Kabat que reduce la unión a los receptores Fc gamma (FcgR), en donde prolina 238 (P238) se muta a lisina o arginina, y en donde el anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo tiene una unión a FcgR reducida.

2. El anticuerpo aislado o una porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en el que dicha región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 y la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

3. El anticuerpo aislado o una porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que P238 se muta a lisina.

4. El anticuerpo aislado o una porción de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el dominio Fc comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de: SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 101 o SEQ ID NO: 12.

5. El anticuerpo aislado o una porción de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo aislado o la porción de unión a antígeno del mismo está humanizado.

6. El anticuerpo aislado o una porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en el que dicha cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 107 o SEQ ID NO: 108, y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88.

7. El anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, en donde la porción de unión a antígeno es un scFv-Fc.

8. El anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 7, en donde el anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo está ligado a un agente terapéutico.

9. El anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 7, en donde el anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo está ligado a una segunda porción funcional que tiene una especificidad de unión diferente a dicho anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo.

10. El anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende además una fracción adicional.

11. Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo aislado o una porción de unión a antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. Un vector de expresión que comprende la molécula del ácido nucleico de la reivindicación 11.

13. Una célula que comprende el vector de expresión de la reivindicación 12.

14. Un método para preparar un anticuerpo anti-CD40 humana o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende:

a) expresar el anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo en la célula de la reivindicación 13; y b) aislar de la célula el anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo.

15. Una composición farmacéutica que comprende: a) el anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10; y b) un vehículo aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

16. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo, de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o la composición farmacéutica de la reivindicación 15 para su uso en el tratamiento o en la prevención de una enfermedad inmunitaria en un sujeto.

17. El anticuerpo o la porción de unión a antígeno del mismo o la composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 16, en donde el sujeto tiene una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en: enfermedad de Addison, alergias, anafilaxis, espondilitis anquilosante, asma, ateroesclerosis, alergia atópica, enfermedades autoinmunitarias auditivas, enfermedades autoinmunitarias oculares, hepatitis autoinmunitaria, parotiditis autoinmunitaria, asma bronquial, cardiopatía coronaria, enfermedad de Crohn, diabetes, epididimitis, glomerulonefritis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Hashimoto, anemia hemolítica, púrpura trombocitopénica idiopática, enfermedad intestinal inflamatoria, respuesta inmunitaria a productos farmacológicos recombinantes (por ejemplo, Factor VII en pacientes hemofílicos), lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia grave, pénfigo, psoriasis, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, escleroderma, síndrome de Sjogren, espondiloartropatías, tiroiditis, rechazo al trasplante, vasculitis y colitis ulcerosa.