KR20210130260A - Ｆｃ영역 개변체 - Google Patents

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KR20210130260A
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amino acid
region
antigen
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binding
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후타 미모토
히토시 가타다
도모유키 이가와
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추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
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Abstract

EU 넘버링 238번째 아미노산 개변과 다른 특정 아미노산 개변이 조합되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 항체 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 모든 활성형 FcγR, 그 중에서도 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성을 감소시키는 것을 발견하였다.

Description

Ｆｃ영역 개변체{Fc region variant}
본 발명은 항체의 Fc영역에 아미노산 개변을 도입함으로써 천연형 인간 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교한 경우에, FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 또한 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성, 특히 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성을 저감시키는 것이 가능한 Fc영역 개변체, 그 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드를 함유하는 의약 조성물에 관한 것이다.
항체는 혈장 중에서의 안정성이 높고 부작용도 적은 것으로부터 의약품으로서 주목되고 있다. 그 중에서도 IgG형의 항체 의약은 다수 시판되고 있고 현재도 많은 항체 의약이 개발되고 있다(비특허문헌 1 및 비특허문헌 2). 한편 제2세대 항체 의약에 적용 가능한 기술로서 다양한 기술이 개발되어 있어, 이펙터 기능, 항원 결합능, 약물 동태, 안정성을 향상시키거나 또는 면역원성 리스크를 저감시키는 기술 등이 보고되어 있다(비특허문헌 3). 항체 의약은 일반적으로 투여량이 매우 높기 때문에 피하 투여 제제의 제작이 곤란한 것, 제조 비용이 높은 것 등을 과제로서 생각할 수 있다. 항체 의약의 투여량을 저감시키는 방법으로서 항체의 약물 동태를 향상시키는 방법과 항체와 항원의 친화성을 향상시키는 방법을 생각할 수 있다.
항체의 약물 동태를 향상시키는 방법으로서 불변영역의 인공적인 아미노산 치환이 보고되어 있다(비특허문헌 4 및 비특허문헌 5). 항원 결합능, 항원 중화능을 증강시키는 기술로서 친화성 성숙 기술(비특허문헌 6)이 보고되어 있어, 가변영역의 CDR영역 등의 아미노산에 변이를 도입함으로써 항원으로의 결합 활성을 증강시키는 것이 가능하다. 항원 결합능의 증강에 의해 시험관 내(in vitro)의 생물활서을 향상시키거나 또는 투여량을 저감시키는 것이 가능하고, 또한 생체 내(in vivo)에서의 약효를 향상시키는 것도 가능하다(비특허문헌 7).
한편 항체 1 분자당 중화할 수 있는 항원량은 친화성에 의존하여 친화성을 강하게 함으로써 적은 항체량으로 항원을 중화하는 것이 가능하여, 다양한 방법으로 항체의 친화성을 강하게 하는 것이 가능하다(비특허문헌 6). 또한 항원에 공유 결합적으로 결합하여 친화성을 무한대로 할 수 있다면 1 분자의 항체로 1 분자의 항원(2가의 경우는 2 항원)을 중화하는 것이 가능하다. 그러나 지금까지의 방법에서는 1 분자의 항체는 1 분자의 항원(2가의 경우는 2 항원)에 결합하는 것이 한계였다. 한편 최근 들어 항원에 대해 pH 의존적으로 결합하는 항원 결합 분자를 사용함으로써 1 분자의 항원 결합 분자가 복수 분자의 항원에 결합하는 것이 가능한 것이 보고되었다(특허문헌 1, 비특허문헌 8). pH 의존적 항원 결합 분자는 항원에 대해 혈장 중의 중성 조건하에 있어서는 강하게 결합하고 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 항원을 해리한다. 또한 항원을 해리한 후에 당해 항원 결합 분자가 FcRn에 의해 혈장 중으로 리사이클되면 재차 항원에 결합하는 것이 가능하기 때문에, 하나의 pH 의존적 항원 결합 분자로 복수의 항원에 반복해서 결합하는 것이 가능해진다.
또한 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 FcRn 결합을 증강시키도록 개변된 pH 의존적 항원 결합 분자는 항원에 반복해서 결합할 수 있는 효과 및 혈장 중으로부터 항원을 소실시키는 효과를 가지고 있기 때문에, 이러한 항원 결합 분자의 투여에 의해 혈장 중으로부터 항원을 제거하는 것이 가능한 것이 보고되었다(특허문헌 2). 통상의 IgG 항체의 Fc영역을 포함하는 pH 의존적 항원 결합 분자는 중성 조건하에 있어서 FcRn에 대해 대부분 결합이 확인되지 않는다. 이 때문에 당해 항원 결합 분자와 항원의 복합체가 세포 내에 흡수되는 것은 주로 비특이적인 흡수에 의한 것으로 생각된다. 이 보고에 의하면, 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 FcRn 결합을 증강시키도록 개변된 pH 의존적 항원 결합 분자는 통상의 IgG 항체의 Fc영역을 포함하는 pH 의존적 항원 결합 분자보다도 그 항원 소실을 더욱 가속시키는 것이 가능하다(특허문헌 2).
항원의 혈장 중 체류성은 FcRn을 매개로 한 리사이클 메커니즘을 갖는 항체와 비교하여 매우 짧기 때문에, 항원은 혈장 중에서 당해 리사이클 메커니즘을 갖는(그 결합이 pH 의존적이지 않은) 항체와 결합함으로써 통상 혈장 중 체류성이 길어지고, 혈장 중 항원 농도는 상승한다. 예를 들면 혈장 중 항원이 복수 종류의 생리 기능을 갖는 경우, 만일 항체의 결합에 의해 1종류의 생리 활성이 차단되었다고 하더라도 당해 항원의 혈장 중 농도가 항체의 결합에 의해 다른 생리 기능이 병의 원인이 되는 증상을 악화시키는 것도 생각할 수 있다. 이러한 관점에서 혈장 중의 항원을 소실시키는 것이 바람직한 경우가 있어, 항원의 소실을 가속시킬 목적으로 상기와 같은 FcRn으로의 결합을 증강시키는 Fc영역에 대한 개변을 가하는 방법이 보고되어 있는데, 그 이외의 방법으로 항원의 소실을 가속시키는 방법은 지금까지 보고되어 있지 않다.
이에 더하여 몇 개의 항체 의약에 있어서는 IgG와 FcγR의 상호작용에 유래하는 부작용이 보고되어 있다. 예를 들면 VEGF에 대한 항체인 베바시주맙(bevacizumab)이 투여된 환자군에서는 혈전 색전증의 빈도가 상승하는 것이 알려져 있다(비특허문헌 9). 또한 CD40 리간드에 대한 항체의 임상 개발 시험에 있어서도 마찬가지로 혈전 색전증이 관찰되어 임상 시험이 중지되었다(비특허문헌 10). 혈소판의 세포 상에는 활성형 Fcγ 수용체인 FcγRIIa가 발현되고 있으나(비특허문헌 11), 동물 모델 등을 사용한 그 후의 연구에 의해 투여된 어느 항체도 혈소판 상의 FcγRIIa에 대한 결합을 매개로 혈소판이 응집되고, 그 결과 혈전을 형성하는 것이 시사되어 있다(비특허문헌 12, 비특허문헌 13). 자기면역 질환의 하나인 전신성 에리테마토데스의 환자에 있어서는 FcγRIIa 의존적인 메커니즘에 의해 혈소판이 활성화되어 혈소판의 활성화가 중증도와 상관하는 것으로 보고되어 있다(비특허문헌 14).
또한 지금까지 동물 모델을 사용한 연구에 의해 항체와 다가 항원의 면역 복합체가 활성형 FcγR을 매개로 아나필락시스를 유도하는 것도 보고되어 있다(비특허문헌 15).
이에 더하여, 활성형의 FcγR을 매개로 다가 항원과 항체의 면역 복합체가 흡수됨으로써 그 항원에 대한 항체가의 생산이 높아지는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 16, 비특허문헌 17). 이 결과는 다가 항원을 인식하는 항체 의약품의 경우, 항체 의약품 자신에 대한 항체가 생산되기 쉬워질 가능성을 시사하고 있다. 항체 의약품에 대한 항체가 생산된 경우, 그 혈중 동태가 악화되거나 또는 중화 항체가 의약품의 효과를 감약시키는 것을 생각할 수 있다.
이와 같이 항체가 다가 항원과 결합함으로써 면역 복합체를 형성하고, 그 복합체가 활성형 FcγR과 상호작용함으로써 다양한 부작용을 유도할 것으로 생각되어, 항체의 의약품으로서의 가치를 감소시켜 버린다.
국제공개 제WO2009/125825호 국제공개 제WO2011/122011호
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본 발명은 이러한 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 항체의 Fc영역에 아미노산 개변을 도입함으로써 항원의 소실을 가속시키는 한편으로, 활성형 FcγR에 대한 결합에 유래하는 결점을 극복한 분자를 제공하는 것에 있다. 즉, 천연형 IgG 항체의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교한 경우에, FcγRIIb에 대한 결합 활성은 유지되어 있으나, 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성, 그 중에서도 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성을 저감시키는 것이 가능한 Fc영역 개변체, 그 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드 및 그 폴리펩티드를 함유하는 의약 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 Fc영역에 아미노산 개변을 도입함으로써 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교한 경우에, FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 모든 활성형 FcγR, 그 중에서도 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성을 저감시키는 것이 가능한 Fc영역 개변체, 당해 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드에 대해서 예의 연구를 행하였다. 그 결과, 본 발명자들은 Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산이 개변되어 있는 Fc영역 개변체에 다른 아미노산 개변을 조합함으로써, FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성, 특히 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성을 저감시키는 것이 가능해지는 것을 발견하였다.
즉 본 발명은 아래에 관한 것이다.
〔1〕Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산 및 하기의 (a) 내지 (k) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 개변을 포함하는 Fc영역 개변체로서, 천연형 IgG의 Fc영역과 비교한 경우에 그 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되고 또한 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소되어 있는 개변체.
(a) Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산
(b) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산
(c) Fc영역의 EU 넘버링 241번째 아미노산
(d) Fc영역의 EU 넘버링 268번째 아미노산
(e) Fc영역의 EU 넘버링 295번째 아미노산
(f) Fc영역의 EU 넘버링 296번째 아미노산
(g) Fc영역의 EU 넘버링 298번째 아미노산
(h) Fc영역의 EU 넘버링 323번째 아미노산
(i) Fc영역의 EU 넘버링 324번째 아미노산
(j) Fc영역의 EU 넘버링 330번째 아미노산
(k) (a) 내지 (j)로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산
〔2〕상기〔1〕의 (k)에서 선택되는 2개 이상의 아미노산이 하기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 아미노산의 조합인, 상기〔1〕에 기재된 개변체.
(1) Fc영역의 EU 넘버링 241번째 아미노산, 268번째 아미노산, 296번째 아미노산 및 324번째 아미노산
(2) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산, 241번째 아미노산, 296번째 아미노산 및 330번째 아미노산
(3) Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산, 237번째 아미노산, 241번째 아미노산 및 296번째 아미노산
〔3〕Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp이고, 또한 하기의 (a) 내지 (k) 중 어느 하나에 기재된 아미노산을 갖는 Fc영역 개변체로서, 천연형 IgG의 Fc영역과 비교한 경우에 그 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되고 또한 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소되어 있는 개변체.
(a) Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산이 Phe
(b) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산이 Gln 또는 Asp
(c) Fc영역의 EU 넘버링 241번째 아미노산이 Met 또는 Leu
(d) Fc영역의 EU 넘버링 268번째 아미노산이 Pro
(e) Fc영역의 EU 넘버링 295번째 아미노산이 Met 또는 Val,
(f) Fc영역의 EU 넘버링 296번째 아미노산이 Glu, His, Asn 또는 Asp,
(g) Fc영역의 EU 넘버링 298번째 아미노산이 Ala 또는 Met,
(h) Fc영역의 EU 넘버링 323번째 아미노산이 Ile,
(i) Fc영역의 EU 넘버링 324번째 아미노산이 Asn 또는 His
(j) Fc영역의 EU 넘버링 330번째 아미노산이 His 또는 Tyr
(k) (a) 내지 (j)로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산
〔4〕Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp이고, 또한 하기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 아미노산을 갖는 Fc영역 개변체.
(1) Fc영역의 EU 넘버링 241번째 아미노산이 Met, 268번째 아미노산이 Pro, 296번째 아미노산이 Glu 및 324번째 아미노산이 His
(2) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산이 Gln 또는 Asp, 241번째 아미노산이 Met, 296번째 아미노산이 Glu 및 330번째 아미노산이 His
(3) Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산이 Phe, 237번째 아미노산이 Gln 또는 Asp, 241번째 아미노산이 Met 및 296번째 아미노산이 Glu
〔5〕Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산 및 271번째 아미노산, 및 하기의 (a) 내지 (h) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 개변을 포함하는 Fc영역 개변체로서, 천연형 IgG의 Fc영역과 비교한 경우에 그 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되고 또한 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소되어 있는 개변체.
(a) Fc영역의 EU 넘버링 234번째 아미노산
(b) Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산
(c) Fc영역의 EU 넘버링 236번째 아미노산
(d) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산
(e) Fc영역의 EU 넘버링 239번째 아미노산
(f) Fc영역의 EU 넘버링 265번째 아미노산
(g) Fc영역의 EU 넘버링 267번째 아미노산
(h) Fc영역의 EU 넘버링 297번째 아미노산
〔6〕상기 아미노산 개변이 하기의 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 개변의 조합인, 상기〔5〕에 기재된 개변체.
(1) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 238번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산, 268번째 아미노산 및 271번째 아미노산
(2) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 237번째 아미노산, 238번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산, 296번째 아미노산, 297번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 396번째 아미노산
(3) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 238번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산 및 296번째 아미노산
〔7〕Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp 및 271번째 아미노산이 Gly이고, 또한 하기의 (a) 내지 (h) 중 어느 하나에 기재된 아미노산을 갖는 Fc영역 개변체로서, 천연형 IgG의 Fc영역과 비교한 경우에 그 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되고 또한 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소되어 있는 개변체.
(a) Fc영역의 EU 넘버링 234번째 아미노산이 Ala, His, Asn, Lys 또는 Arg
(b) Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산이 Ala
(c) Fc영역의 EU 넘버링 236번째 아미노산이 Gln
(d) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산이 Arg 또는 Lys
(e) Fc영역의 EU 넘버링 239번째 아미노산이 Lys
(f) Fc영역의 EU 넘버링 265번째 아미노산이 Lys, Asn, Arg, Ser 또는 Val
(g) Fc영역의 EU 넘버링 267번째 아미노산이 Lys, Arg 또는 Tyr
(h) Fc영역의 EU 넘버링 297번째 아미노산이 Ala
〔8〕Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp 및 271번째 아미노산이 Gly이고, 또한 하기의 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 아미노산을 포함하는 Fc영역 개변체.
(1) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산이 Asp, 238번째 아미노산이 Asp, 264번째 아미노산이 Ile, 267번째 아미노산이 Arg, 268번째 아미노산이 Glu 및 271번째 아미노산이 Gly
(2) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산이 Asp, 237번째 아미노산이 Asp, 238번째 아미노산이 Asp, 264번째 아미노산이 Ile, 267번째 아미노산이 Ala, 268번째 아미노산이 Glu, 271번째 아미노산이 Gly, 296번째 아미노산이 Asp, 297번째 아미노산이 Ala, 330번째 아미노산이 Arg 및 396번째 아미노산이 Met
(3) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산이 Asp, 238번째 아미노산이 Asp, 264번째 아미노산이 Ile, 267번째 아미노산이 Arg, 268번째 아미노산이 Pro, 271번째 아미노산이 Gly 및 296번째 아미노산이 Glu
〔9〕또한 보체로의 결합이 감소되어 있는, 상기〔1〕내지〔8〕중 어느 하나에 기재된 Fc영역 개변체.
〔10〕보체로의 결합이 감소되어 있는 Fc영역 개변체가 Fc영역의 EU 넘버링 322번째 아미노산 개변 또는 Fc영역의 EU 넘버링 327번째, 330번째 및 331번째 아미노산 개변을 포함하는, 상기〔9〕에 기재된 Fc영역 개변체.
〔11〕Fc영역의 EU 넘버링 322번째 아미노산이 Ala 또는 Glu, 또는 Fc영역의 EU 넘버링 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser 및 331번째 아미노산이 Ser인, 상기〔9〕에 기재된 Fc영역 개변체.
〔12〕Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산의 아미노산 개변을 포함하는 Fc영역 개변체로서, 천연형 IgG의 Fc영역과 비교한 경우에 그 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되고 또한 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소되어 있는 개변체.
〔13〕추가로 하기의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 개변을 포함하는, 상기〔12〕에 기재된 개변체.
(a) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산
(b) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산
(c) Fc영역의 EU 넘버링 264번째 아미노산
(d) Fc영역의 EU 넘버링 267번째 아미노산
(e) Fc영역의 EU 넘버링 268번째 아미노산
〔14〕상기 아미노산 개변이 하기의 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 개변의 조합인, 상기〔13〕에 기재된 개변체.
(1) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산, 238번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산
(2) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 237번째 아미노산, 238번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산
(3) Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산, 267번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산
(4) Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산
〔15〕Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp, 271번째 아미노산이 Gly, 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser 및 331번째 아미노산이 Ser인 Fc영역 개변체로서, 천연형 IgG의 Fc영역과 비교한 경우에 그 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되고 또한 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소되어 있는 개변체.
〔16〕추가로 하기의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 아미노산을 갖는 상기〔15〕에 기재된 개변체.
(a) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산이 Asp
(b) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산이 Asp
(c) Fc영역의 EU 넘버링 264번째 아미노산이 Ile
(d) Fc영역의 EU 넘버링 267번째 아미노산이 Ala
(e) Fc영역의 EU 넘버링 268번째 아미노산이 Asp 또는 Glu
〔17〕Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp 및 271번째 아미노산이 Gly이고, 또한 하기의 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 아미노산을 포함하는 Fc영역 개변체.
(1) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산이 Asp, 238번째 아미노산이 Asp, 268번째 아미노산이 Asp 또는 Glu, 271번째 아미노산이 Gly, 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser 및 331번째 아미노산이 Ser
(2) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산이 Asp, 237번째 아미노산이 Asp, 238번째 아미노산이 Asp, 268번째 아미노산이 Asp, 271번째 아미노산이 Gly, 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser 및 331번째 아미노산이 Ser
(3) Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp, 267번째 아미노산이 Ala, 268번째 아미노산이 Glu, 271번째 아미노산이 Gly, 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser 및 331번째 아미노산이 Ser
(4) Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp, 264번째 아미노산이 Ile, 267번째 아미노산이 Ala, 271번째 아미노산이 Gly, 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser 및 331번째 아미노산이 Ser
〔18〕FcγRIIb에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역 결합량의 적어도 80%를 갖고, FcγRIIaR에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역 결합량의 30% 이하인, 상기〔1〕내지〔17〕중 어느 하나에 기재된 Fc영역 개변체.
〔19〕천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 결합 활성과 비교한 상대적인 결합 활성의 비가 적어도 0.75이고, 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성의 비가 0.2 이하인, 상기〔1〕내지〔18〕중 어느 하나에 기재된 Fc영역 개변체.
〔20〕추가로 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIa R에 대한 결합 활성과 비교한 상대적인 결합 활성의 비가 0.1 이하인, 상기〔19〕에 기재된 Fc영역 개변체.
〔21〕상기〔1〕내지〔20〕중 어느 하나에 기재된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드.
〔22〕상기 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드가 IgG 항체인, 상기〔21〕에 기재된 폴리펩티드.
〔23〕상기 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드가 Fc 융합 단백질 분자인, 상기〔21〕에 기재된 폴리펩티드.
〔24〕상기〔21〕내지〔23〕중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 및 의학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 의약 조성물.
〔25〕추가로 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는, 상기〔21〕에 기재된 폴리펩티드.
〔26〕이온 농도의 조건이 칼슘 이온 농도의 조건인, 상기〔25〕에 기재된 폴리펩티드.
〔27〕상기 항원 결합 도메인이, 저칼슘 이온 농도 조건하에서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도 조건하에서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인인, 상기〔26〕에 기재된 폴리펩티드.
〔28〕이온 농도의 조건이 pH의 조건인, 상기〔25〕내지〔27〕중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드.
〔29〕상기 항원 결합 도메인이, pH 산성역에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인인, 상기〔28〕에 기재된 폴리펩티드.
〔30〕상기 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드가 IgG 항체인, 상기〔25〕내지〔29〕중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드.
〔31〕상기 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드가 Fc 융합 단백질 분자인, 상기〔25〕내지〔29〕중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드.
〔32〕상기〔25〕내지〔31〕중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 및 의학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 의약 조성물.
〔33〕의약용 조성물이 상기〔25〕내지〔31〕중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드의 항원 결합 도메인과 결합하는 혈장 중의 항원으로서, 당해 항원의 혈장 중으로부터의 소실을 촉진시키기 위한, 상기〔32〕에 기재된 의약 조성물.
〔34〕상기〔25〕내지〔31〕중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드의 항원 결합 도메인과 결합하는 혈장 중의 항원으로서, 당해 항원의 혈장 중으로부터의 소실을 촉진시키기 위한 그 폴리펩티드의 사용.
〔35〕Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산 및 Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산, 237번째 아미노산, 241번째 아미노산, 268번째 아미노산, 295번째 아미노산, 296번째 아미노산, 298번째 아미노산, 323번째 아미노산, 324번째 아미노산 및 330번째 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 개변하는 것에 의한, 그 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합을 저감시키는 방법.
〔36〕Fc영역의 아미노산의 개변이 EU 넘버링 238번째 아미노산의 Asp로의 치환, 235번째 아미노산의 Phe로의 치환, 237번째 아미노산의 Gln으로의 치환, 241번째 아미노산의 Met 또는 Leu로의 치환, 268번째 아미노산의 Pro로의 치환, 295번째 아미노산의 Met 또는 Val로의 치환, 296번째 아미노산의 Glu, His, Asn 또는 Asp로의 치환, 298번째 아미노산의 Ala 또는 Met로의 치환, 323번째 아미노산의 Ile로의 치환, 324번째 아미노산의 Asn 또는 His로의 치환, 330번째 아미노산의 His 또는 Tyr로의 치환인, 상기〔35〕에 기재된 방법.
〔37〕Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산 및 Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산, 237번째 아미노산, 241번째 아미노산, 268번째 아미노산, 295번째 아미노산, 296번째 아미노산, 298번째 아미노산, 323번째 아미노산, 324번째 아미노산 및 330번째 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 개변하는 것에 의한, 개변 전과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합이 저감되어 있는 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법.
〔38〕Fc영역의 아미노산의 개변이 EU 넘버링 238번째 아미노산의 Asp로의 치환, 235번째 아미노산의 Phe로의 치환, 237번째 아미노산의 Gln으로의 치환, 241번째 아미노산의 Met 또는 Leu로의 치환, 268번째 아미노산의 Pro로의 치환, 295번째 아미노산의 Met 또는 Val로의 치환, 296번째 아미노산의 Glu, His, Asn 또는 Asp로의 치환, 298번째 아미노산의 Ala 또는 Met로의 치환, 323번째 아미노산의 Ile로의 치환, 324번째 아미노산의 Asn 또는 His로의 치환, 330번째 아미노산의 His 또는 Tyr로의 치환인, 상기〔37〕에 기재된 방법.
〔39〕Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서, FcγRIIb에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역과 비교하여 2배 이상이 되는 아미노산 개변과 모든 FcγR에 대한 결합 활성을 저감시키는 아미노산 개변을 조합해서 도입하는 것에 의한, 천연형 IgG와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 같은 정도로 유지하면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성을 저감시키는 방법.
〔40〕FcγRIIb에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역과 비교하여 2배 이상이 되는 아미노산 개변이 표 11에 기재된 아미노산 개변인, 상기〔39〕에 기재된 방법.
〔41〕모든 FcγR에 대한 결합 활성을 저감시키는 아미노산 개변이 Fc영역의 EU 넘버링 234번째 아미노산, 235번째 아미노산, 236번째 아미노산, 237번째 아미노산, 239번째 아미노산, 265번째 아미노산, 267번째 아미노산 및 297번째 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변인, 상기〔39〕 또는〔40〕에 기재된 방법.
〔42〕Fc영역의 아미노산의 개변이 EU 넘버링 234번째 아미노산의 Ala, His, Asn, Lys 또는 Arg로의 치환, 235번째 아미노산의 Ala로의 치환, 236번째 아미노산의 Gln으로의 치환, 237번째 아미노산의 Arg 또는 Lys로의 치환, 239번째 아미노산의 Lys로의 치환, 265번째 아미노산의 Lys, Asn, Arg, Ser 또는 Val로의 치환, 267번째 아미노산의 Lys, Arg 또는 Tyr로의 치환, 297번째 아미노산의 Ala로의 치환인, 상기〔39〕내지〔41〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔43〕FcγRIIb에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역 결합량의 적어도 80%를 유지하고, FcγRIIaR에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역 결합량의 30% 이하로 저감되는, 상기〔35〕,〔36〕 및〔39〕내지〔42〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔44〕천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 결합 활성과 비교한 상대적인 결합 활성의 비가 적어도 0.75를 유지하고, 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성의 비가 0.2 이하로 저감되는, 상기〔35〕,〔36〕 및〔39〕내지〔43〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔45〕추가로 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIa R에 대한 결합 활성과 비교한 상대적인 결합 활성의 비가 0.05 이하로 저감되는, 상기〔44〕에 기재된 방법.
〔46〕FcγRIIb에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역과 비교하여 2배 이상이 되는 아미노산 개변과 모든 FcγR에 대한 결합 활성을 저감시키는 아미노산 개변을 조합시켜 도입하는 것에 의한, 천연형 IgG와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 같은 정도로 유지하면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 저감되어 있는 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법.
〔47〕FcγRIIb에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역과 비교하여 2배 이상이 되는 아미노산 개변이 표 11에 기재된 아미노산 개변인, 상기〔46〕에 기재된 방법.
〔48〕모든 FcγR에 대한 결합 활성을 저감시키는 아미노산 개변이 Fc영역의 EU 넘버링 234번째 아미노산, 235번째 아미노산, 236번째 아미노산, 237번째 아미노산, 239번째 아미노산, 265번째 아미노산, 267번째 아미노산 및 297번째 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변인, 상기〔46〕 또는〔47〕에 기재된 방법.
〔49〕Fc영역의 아미노산의 개변이 EU 넘버링 234번째 아미노산의 Ala, His, Asn, Lys 또는 Arg로의 치환, 235번째 아미노산의 Ala로의 치환, 236번째 아미노산의 Gln으로의 치환, 237번째 아미노산의 Arg 또는 Lys로의 치환, 239번째 아미노산의 Lys로의 치환, 265번째 아미노산의 Lys, Asn, Arg, Ser 또는 Val로의 치환, 267번째 아미노산의 Lys, Arg 또는 Tyr로의 치환, 297번째 아미노산의 Ala로의 치환인, 상기〔46〕내지〔48〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔50〕FcγRIIb에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역 결합량의 적어도 80%를 유지하고, 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역 결합량의 30% 이하로 저감되는, 상기〔37〕,〔38〕 및〔46〕내지〔49〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔51〕천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 결합 활성과 비교한 상대적인 결합 활성의 비가 적어도 0.75를 유지하고, 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성의 비가 0.2 이하로 저감되는, 상기〔37〕,〔38〕 및〔46〕내지〔50〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔52〕추가로 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIa R에 대한 결합 활성과 비교한 상대적인 결합 활성의 비가 0.1 이하로 저감되는, 상기〔51〕에 기재된 방법.
〔53〕추가로 보체로의 결합을 감소시키는 개변을 조합해서 도입하는, 상기〔37〕, 〔38〕 및 〔46〕내지〔52〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔54〕보체로의 결합을 감소시키는 개변이 Fc영역의 EU 넘버링 322번째 아미노산 개변 또는 Fc영역의 EU 넘버링 327번째, 330번째 및 331번째 아미노산 개변인, 상기〔53〕에 기재된 방법.
〔55〕보체로의 결합을 감소시키는 개변이 Fc영역의 EU 넘버링 322번째 아미노산의 Ala 또는 Glu로의 치환, 또는 Fc영역의 EU 넘버링 327번째 아미노산의 Gly로의 치환, 330번째 아미노산의 Ser로의 치환 및 331번째 아미노산의 Ser로의 치환인, 상기〔53〕에 기재된 방법.
〔56〕Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산, 또는 추가로 Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 237번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산 및 268번째 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 개변하는 것에 의한, 그 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합을 저감시키는 방법.
〔57〕Fc영역의 아미노산의 개변이 Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산의 Asp로의 치환, 271번째 아미노산의 Gly로의 치환, 327번째 아미노산의 Gly로의 치환, 330번째 아미노산의 Ser로의 치환, 331번째 아미노산의 Ser로의 치환, 233번째 아미노산의 Asp로의 치환, 237번째 아미노산의 Asp로의 치환, 264번째 아미노산의 Ile로의 치환, 267번째 아미노산의 Ala로의 치환, 268번째 아미노산의 Asp 또는 Glu로의 치환인, 상기〔56〕에 기재된 방법.
〔58〕Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산, 또는 추가로 Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 237번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산 및 268번째 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 개변하는 것에 의한, 개변 전과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되고 모든 활성형 FcγR에 대한 결합이 저감되면서, 또한 보체로의 결합이 저감되어 있는 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법.
〔59〕Fc영역의 아미노산의 개변이 Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산의 Asp로의 치환, 271번째 아미노산의 Gly로의 치환, 327번째 아미노산의 Gly로의 치환, 330번째 아미노산의 Ser로의 치환, 331번째 아미노산의 Ser로의 치환, 233번째 아미노산의 Asp로의 치환, 237번째 아미노산의 Asp로의 치환, 264번째 아미노산의 Ile로의 치환, 267번째 아미노산의 Ala로의 치환, 268번째 아미노산의 Asp 또는 Glu로의 치환인, 상기〔58〕에 기재된 방법.
또한 본 발명은 본 발명의 Fc영역의 아미노산 개변을 도입하는 것에 의한, 그 Fc영역의 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서, 또한 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성, 특히 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성을 저감시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명의 Fc영역의 아미노산 개변을 도입하는 것에 의한, 그 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 대한 항체의 생산을 억제하는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명의 Fc영역의 아미노산 개변이 도입된 Fc영역 개변체 및 혈장 중에 가용형으로 존재하여 병의 원인이 되는 항원에 대해 결합 활성을 갖고, 이온 농도의 조건에 따라 당해 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 의한, 혈장 중의 당해 항원의 소실을 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명의 Fc영역의 아미노산 개변이 도입된 Fc영역 개변체 및 혈장 중에 가용형으로 존재하여 병의 원인이 되는 항원에 대해 결합 활성을 갖고, 이온 농도의 조건에 따라 당해 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 혈장 중의 당해 항원의 소실을 촉진시키기 위한 사용에 관한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 면역 염증성 질환의 치료 또는 예방제에 관한 것이다. 또한 본 발명의 폴리펩티드를 대상에 투여하는 공정을 포함하는 면역 염증성 질환의 치료방법 또는 예방방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 면역 염증성 질환의 치료방법 또는 예방방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 면역 염증성 질환의 치료제 또는 예방제의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 면역 염증성 질환의 치료방법 또는 예방방법에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드에 관한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 B세포, 마스트 세포, 수상(樹狀) 세포 및/또는 호염기구의 활성화 억제제에 관한 것이다. 또한 본 발명의 폴리펩티드를 대상에 투여하는 공정을 포함하는 B세포, 마스트 세포, 수상 세포 및/또는 호염기구의 활성화 억제방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 B세포, 마스트 세포, 수상 세포 및/또는 호염기구의 활성화 억제방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 B세포, 마스트 세포, 수상 세포 및/또는 호염기구의 활성화 억제제의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 B세포, 마스트 세포, 수상 세포 및/또는 호염기구의 활성화 억제방법에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드에 관한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 생체에 필요한 단백질을 결손하는 질환의 치료제에 관한 것이다. 또한 본 발명의 폴리펩티드를 대상에 투여하는 공정을 포함하는 생체에 필요한 단백질을 결손하는 질환의 치료방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 생체에 필요한 단백질을 결손하는 질환의 치료방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 생체에 필요한 단백질을 결손하는 질환의 치료제 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 생체에 필요한 단백질을 결손하는 질환의 치료방법에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드에 관한 것이다.
또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 바이러스의 증식 억제제에 관한 것이다. 또한 본 발명의 폴리펩티드를 대상에 투여하는 공정을 포함하는 바이러스의 증식 억제방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 바이러스의 증식 억제방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 바이러스의 증식 억제제 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 바이러스의 증식 억제방법에 사용하기 위한 본 발명의 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명에 의해 천연형 IgG의 Fc영역과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서, 또한 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성, 특히 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성이 저감된 Fc영역 개변체가 제공되었다. 그 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 사용함으로써, FcγRIIb를 매개로 한 면역 복합체를 소실시키는 성질이 천연형 IgG와 같은 정도로 유지된 상태로, FcγRIIb의 ITIM의 인산화를 매개로 한 염증성 면역반응의 억제성 시그널을 증강시키는 것이 가능해진다. 또한 FcγRIIb에 선택적으로 결합하는 성질을 Fc영역에 부여함으로써 항항체 생산의 억제가 가능해질 가능성이 있다. 또한 활성형 FcγR에 대한 결합을 저감시킴으로써 혈소판 상의 FcγRIIa와 면역 복합체의 상호작용을 매개로 한 혈소판의 활성화, 활성형 FcγR의 가교에 의한 수상 세포의 활성화를 회피하는 것이 가능해진다.
도 1은 인간 IgE와 pH 의존적 항IgE 항체인 클론 278이 pH 의존적으로 큰 면역 복합체를 형성하는 것을 확인한 겔 여과 크로마토그래피 분석 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 인간 IgE 단독 투여군, 인간 IgE＋클론 278 항체 투여군 및 인간 IgE＋Xolair 항체 투여군의 정상 마우스 혈장 중 인간 IgE의 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 3은 인간 IgE＋클론 278 투여군 및 인간 IgE＋Xolair 항체 투여군의 정상 마우스 혈장 중 항체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 4는 인간 IgE 단독 투여군, 인간 IgE＋278-IgG1 항체 투여군 및 인간 IgE＋278-F760 항체 투여군의 정상 마우스 혈장 중 인간 IgE의 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 5는 인간 IgE＋278-IgG1 항체 투여군 및 인간 IgE＋278-F760 항체 투여군의 정상 마우스 항체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 6은 Fc 개변체에 의한 DC의 활성화를 IL-8의 발현량을 지표로 하여 평가한 결과의 도면이다.
도 7은 Fc 개변체를 가했을 때의 세정 혈소판 막 표면의 CD62p(p-selectin)의 발현을 확인한 도면이다. 실선은 5c8-F648을 첨가하여 ADP 자극을 가한 경우, 빈틈없이 모두 칠한 부분은 5c8-P600을 첨가하여 ADP 자극을 가한 경우를 나타낸다.
도 8은 Fc 개변체를 가했을 때의 세정 혈소판 막 표면의 활성형 인테그린(PAC-1)의 발현을 확인한 도면이다. 실선은 5c8-F648을 첨가하여 ADP 자극을 가한 경우, 빈틈없이 모두 칠한 부분은 5c8-P600을 첨가하여 ADP 자극을 가한 경우를 나타낸다.
도 9는 pH 의존적 결합 항체가 반복해서 가용형 항원에 결합하는 것을 나타내는 도면이다. (i) 항체가 가용형 항원과 결합하는 것, (ii) 비특이적으로 음세포작용(pinocytosis)에 의해 세포 내로 흡수되는 것, (iii) 엔도솜 내에서 항체는 FcRn과 결합하고 가용형 항원은 항체로부터 해리되는 것, (iv) 가용형 항원은 리소좀으로 이행하여 분리되는 것, (v) 가용형 항원이 해리된 항체는 FcRn에 의해 혈장 중으로 리사이클되는 것, (vi) 리사이클된 항체는 재차 가용형 항원으로 결합하는 것이 가능해진다.
도 10은 중성 조건하에서 FcRn으로의 결합을 증강시킴으로써 pH 의존적 결합 항체가 항원에 반복해서 결합할 수 있는 효과를 더욱 향상시키는 것을 나타내는 도면이다. (i) 항체가 가용형 항원과 결합하는 것, (ii) FcRn을 매개로 음세포작용에 의해 세포 내로 흡수되는 것, (iii) 엔도솜 내에서 가용형 항원은 항체로부터 해리되는 것, (iv) 가용형 항원은 리소좀으로 이행하여 분해되는 것, (v) 가용형 항원이 해리된 항체는 FcRn에 의해 혈장 중으로 리사이클되는 것, (vi) 리사이클된 항체는 재차 가용형 항원으로 결합하는 것이 가능해진다.
도 11은 Biacore를 사용한 항인간 IgA 항체의 pH 7.4 및 pH 5.8, Ca2+ 1.2 mM 및 Ca2+ 3 μM에 있어서의 인간 IgA로의 상호작용을 나타내는 센서그램을 나타내는 도면이다.
도 12는 정상 마우스에 있어서의 GA2-IgG1 및 GA2-F1087의 혈장 중 항체 농도 추이를 나타낸 도면이다.
도 13은 hIgA 단독, GA2-IgG1 및 GA2-F1087이 투여된 정상 마우스에 있어서의 혈장 중 hIgA 농도 추이를 나타낸 도면이다.
도 14는 Fv4-mIgG1, 마우스 FcγRIIb, 마우스 FcγRIII에 대한 결합이 증강된 Fv4-mIgG1의 개변체인 Fv4-mIgG1-mF44, 및 추가로 마우스 FcγRIIb, 마우스 FcγRIII에 대한 결합이 증강된 Fv4-mIgG1의 개변체인 Fv4-mIgG1-mF46이 정상 마우스에 투여되었을 때의 당해 마우스의 혈장 중 인간 IL-6 수용체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 15는 Fv4-mIgG1, 마우스 FcγRIIb, 마우스 FcγRIII에 대한 결합이 증강된 Fv4-mIgG1의 개변체인 Fv4-mIgG1-mF44, 및 추가로 마우스 FcγRIIb, 마우스 FcγRIII에 대한 결합이 증강된 Fv4-mIgG1의 개변체인 Fv4-mIgG1-mF46이 FcγRIII 결손 마우스에 투여되었을 때의 당해 마우스의 혈장 중 인간 IL-6 수용체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 16은 Fv4-mIgG1, 마우스 FcγRIIb, 마우스 FcγRIII에 대한 결합이 증강된 Fv4-mIgG1의 개변체인 Fv4-mIgG1-mF44, 및 추가로 마우스 FcγRIIb, 마우스 FcγRIII에 대한 결합이 증강된 Fv4-mIgG1의 개변체인 Fv4-mIgG1-mF46이 Fc 수용체 γ쇄 결손 마우스에 투여되었을 때의 당해 마우스의 혈장 중 인간 IL-6 수용체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 17은 Fv4-mIgG1, 마우스 FcγRIIb, 마우스 FcγRIII에 대한 결합이 증강된 Fv4-mIgG1의 개변체인 Fv4-mIgG1-mF44, 및 추가로 마우스 FcγRIIb, 마우스 FcγRIII에 대한 결합이 증강된 Fv4-mIgG1의 개변체인 Fv4-mIgG1-mF46이 FcγRIIb 결손 마우스에 투여되었을 때의 당해 마우스의 혈장 중 인간 IL-6 수용체 농도 추이를 나타내는 도면이다.
도 18은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4의 불변영역을 구성하는 아미노산 잔기와 EU 넘버링(본 명세서에 있어서 EU INDEX라고도 불린다)의 관계를 나타내는 도면이다.
도 19는 단량체 항원에 존재하는 2개 이상의 에피토프를 인식하여 큰 면역 복합체를 형성하는 데 적절한 다가 특이성(multispecific) pH/Ca 의존성 항체의 항체 1 분자당 항원을 소실시키는 효율을 예시하는 도면이다.
본 발명은 천연형 IgG 항체의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교한 경우에, FcγRIIb에 대한 결합 활성은 유지되어 있으나, 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성, 그 중에서도 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성을 저감시키는 것이 가능한 Fc영역 개변체, 당해 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
보다 구체적으로는, EU 넘버링 238번째 아미노산 개변과 다른 특정 아미노산 개변이 조합되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 Fc영역 개변체, 및 당해 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 또한 본 발명은 Fc영역에 그 아미노산 개변을 도입함으로써 천연형 IgG 항체의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성, 그 중에서도 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성을 저감시키는 방법, 및 Fc영역에 상기 아미노산 개변을 도입함으로써 천연형 IgG 항체의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성, 그 중에서도 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성이 저감된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다. 또한 Fc영역에 상기 아미노산 개변이 도입된 Fc영역 개변체 및 혈장 중에 가용형으로 존재하여 병의 원인이 되는 항원에 대해 결합 활성을 갖고, 이온 농도의 조건에 따라 당해 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드, 당해 폴리펩티드에 의한 혈장 중의 당해 항원의 소실을 촉진하는 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서의 「폴리펩티드」란 통상 10 아미노산 정도 이상의 길이를 갖는 펩티드 및 단백질을 가리킨다. 또한 통상 생물 유래의 폴리펩티드이나 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 인공적으로 설계된 서열로 이루어지는 폴리펩티드여도 된다. 또한 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드, 재조합 폴리펩티드 등 중 어느 것이어도 된다.
본 발명의 폴리펩티드의 바람직한 예로서 항체를 들 수 있다. 더욱 바람직한 예로서 천연형 IgG, 특히 천연형 인간 IgG를 들 수 있다.
천연형 IgG란 천연으로 발견되는 IgG와 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 면역 글로불린 감마 유전자에 의해 실질적으로 코드되는 항체의 클래스에 속하는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들면 천연형 인간 IgG란 천연형 인간 IgG1, 천연형 인간 IgG2, 천연형 인간 IgG3, 천연형 인간 IgG4 등을 의미한다. 천연형 IgG에는 그것으로부터 자연으로 생성되는 변이체 등도 포함된다.
항체의 경쇄 불변영역에는 IgK(Kappa, κ쇄), IgL1, IgL2, IgL3, IgL6, IgL7(Lambda, λ쇄) 타입의 불변영역이 존재하고 있는데, 어느 경쇄 불변영역이어도 된다. 인간 IgK(Kappa) 불변영역과 인간 IgL7(Lambda) 불변영역으로서는 유전자 다형에 의한 복수의 알로타입 서열이 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242에 기재되어 있는데, 본 발명에 있어서는 그 어느 것이어도 된다. 또한 본 발명에 있어서 경쇄 불변영역은 아미노산의 치환, 부가, 결손, 삽입 및/또는 수식 등의 개변이 행해진 경쇄 불변영역이어도 된다. 항체의 Fc영역으로서는, 예를 들면 IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM 타입의 Fc영역이 존재하고 있다. 본 발명의 항체의 Fc영역은, 예를 들면 인간 IgG 항체의 Fc영역을 사용할 수 있고, 바람직하게는 인간 IgG1 항체의 Fc영역이다. 본 발명의 Fc영역으로서, 예를 들면 천연형 IgG의 불변영역, 구체적으로는 천연형 인간 IgG1을 기원으로 하는 불변영역(서열번호：31), 천연형 인간 IgG2를 기원으로 하는 불변영역(서열번호：32), 천연형 인간 IgG3를 기원으로 하는 불변영역(서열번호：33), 천연형 인간 IgG4를 기원으로 하는 불변영역(서열번호：34) 유래의 Fc영역을 사용할 수 있다. 도 18에는 천연형 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4의 불변영역의 서열을 나타낸다. 천연형 IgG의 불변영역에는 그것으로부터 자연으로 생성되는 변이체 등도 포함된다. 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4 항체의 불변영역으로서는, 유전자 다형에 의한 복수의 알로타입 서열이 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242에 기재되어 있는데, 본 발명에 있어서는 그 중 어느 것이어도 된다. 특히 인간 IgG1의 서열로서는 EU 넘버링 356-358번째 아미노산 서열이 DEL이어도 EEM이어도 된다.
Fcγ 수용체(본 명세서에서는 Fcγ 수용체, FcγR 또는 FcgR로 기재하는 경우가 있다)란 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론 항체의 Fc영역에 결합 가능한 수용체를 말하고, 실질적으로 Fcγ 수용체 유전자에 코드되는 단백질 패밀리의 모든 멤버를 의미한다. 인간의 경우는, 이 패밀리에는 아이소폼 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64)；아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131(H형) 및 R131(R형)을 포함한다), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함한다) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32)； 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함한다) 및 FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함한다)를 포함하는 FcγRIII(CD16), 및 어떠한 미발견의 인간 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되는데, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한 인간 FcγRIIb에는 스플라이싱 배리언트로서 FcγRIIb1과 FcγRIIb2가 보고되어 있다. 또한 그 이외에도 FcγRIIb3라는 스플라이싱 배리언트도 보고되어 있다(J. Exp. Med, 1989, 170: 1369). 인간 FcγRIIb에는 이 스플라이싱 배리언트, 이에 더하여 NCBI에 등록되어 있는 NP_001002273.1, NP_001002274.1, NP_001002275.1, NP_001177757.1, NP_003992.3의 스플라이싱 배리언트를 모두 포함한다. 또한 인간 FcγRIIb에는 기존의 보고된 모든 유전자 다형을 포함하고, FcγRIIb(Arthritis Rheum, 2003, 48: 3242-52, Hum Mol Genet, 2005, 14: 2881-92, Arthritis Rheum. 2002 May;46(5):1242-54.)도 포함되며, 또한 향후 보고되는 모든 유전자 다형도 포함된다.
FcγR은 인간, 마우스, 랫트, 토끼 및 원숭이 유래의 것이 포함되는데, 이들에 한정되지 않고 어떠한 생물 유래여도 된다. 마우스 FcγR류에는 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIII-2(CD16-2), 및 어떠한 미발견의 마우스 FcγR류 또는 FcγR 아이소폼 또는 알로타입도 포함되는데, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 Fcγ 수용체의 적합한 예로서는 인간 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB(CD32), FcγRIIIA(CD16) 및/또는 FcγRIIIB(CD16)를 들 수 있다.
FcγRI의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：35(NM_000566.3) 및 36(NP_000557.1)에,
FcγRIIA의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：37(BC020823.1) 및 38(AAH20823.1)에,
FcγRIIB의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：39(BC146678.1) 및 40(AAI46679.1)에,
FcγRIIIA의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：41(BC033678.1) 및 42(AAH33678.1)에, 및
FcγRIIIB의 폴리뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호：43(BC128562.1) 및 44(AAI28563.1)에 기재되어 있다(괄호 안은 RefSeq 등록번호를 나타낸다).
또한 FcγRIIa에는 FcγRIIa의 131번째 아미노산이 히스티딘(H형) 또는 아르기닌(R형)으로 치환된 2종류의 유전자 다형이 존재한다(J. Exp. Med, 172, 19-25, 1990).
FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64) 및 아이소폼 FcγRIIIa(알로타입 V158 및 F158을 포함하는)를 포함하는 FcγRIII(CD16)는 IgG의 Fc 부분과 결합하는 α쇄와 세포 내에 활성화 시그널을 전달하는 ITAM을 갖는 공통 γ쇄가 회합한다. FcγRIIIb(알로타입 FcγRIIIb-NA1 및 FcγRIIIb-NA2를 포함하는)는 GPI 앵커 단백질이다. 한편 아이소폼 FcγRIIa(알로타입 H131 및 R131을 포함하는) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32) 자신의 세포질 도메인에는 ITAM이 포함되어 있다. 이들 수용체는 마크로파지나 마스트 세포, 항원 제시 세포 등의 많은 면역세포에 발현하고 있다. 이들 수용체가 IgG의 Fc 부분에 결합함으로써 전달되는 활성화 시그널에 의해 마크로파지의 탐식능이나 염증성 사이토카인의 생산, 마스트 세포의 탈과립, 항원 제시 세포의 기능 항진이 촉진된다. 상기와 같이 활성화 시그널을 전달하는 능력을 갖는 Fcγ 수용체는 본 발명에 있어서도 활성형 Fcγ 수용체라 불린다.
한편 FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2를 포함하는) 자신의 세포질 내 도메인에는 억제형 시그널을 전달하는 ITIM이 포함되어 있다. B세포의 경우는 FcγRIIb와 B세포 수용체(BCR)의 가교에 의해 BCR로부터의 활성화 시그널이 억제되는 결과 BCR의 항체 생산이 억제된다. 마크로파지의 경우는 FcγRIII와 FcγRIIb의 가교에 의해 탐식능이나 염증성 사이토카인의 생산능이 억제된다. 상기와 같이 억제화 시그널을 전달하는 능력을 갖는 Fcγ 수용체는 본 발명에 있어서도 억제형 Fcγ 수용체라 불린다.
본 발명에 있어서 「Fc영역 개변체」는 본 발명의 아미노산 개변이 도입되어 있지 않은 Fc영역에 본 발명의 하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 개변되어 있는 Fc영역을 의미한다. 여기서 「하나 이상의 아미노산이 다른 아미노산으로 개변되어 있는」 것에는, 당해 아미노산 개변이 도입된 Fc영역 및 그와 동일한 아미노산 서열로 이루어지는 Fc영역이 포함된다.
천연형 IgG란 천연으로 발견되는 IgG와 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 면역 글로불린 감마 유전자에 의해 실질적으로 코드되는 항체의 클래스에 속하는 폴리펩티드를 의미한다. 예를 들면 천연형 인간 IgG란 천연형 인간 IgG1, 천연형 인간 IgG2, 천연형 인간 IgG3, 천연형 인간 IgG4 등을 의미한다. 천연형 IgG에는 그것으로부터 자연으로 생성되는 변이체, FcγR에 대한 결합 활성에 실질적인 영향을 미치지 않는 개변이 도입된 IgG 등도 포함된다.
천연형 IgG의 Fc영역이란, 천연으로 발견되는 IgG를 기원으로 하는 Fc영역과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 Fc영역을 의미한다. 천연형 IgG의 중쇄 불변영역은 도 18(서열번호：31~34)에 나타내고 있는데, 예를 들면 도 18의 천연형 인간 IgG1을 기원으로 하는 중쇄 불변영역 중의 Fc영역, 천연형 인간 IgG2를 기원으로 하는 중쇄 불변영역 중의 Fc영역, 천연형 인간 IgG3를 기원으로 하는 중쇄 불변영역 중의 Fc영역, 천연형 인간 IgG4를 기원으로 하는 중쇄 불변영역 중의 Fc영역을 의미한다. 천연형 IgG의 Fc영역에는 그것으로부터 자연으로 생성되는 변이체 등도 포함된다.
본 발명에 있어서 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드 또는 Fc영역 개변체가 각종 FcγR에 대한 결합 활성이 증강되었거나 또는 결합 활성이 유지 또는 감소되었는지 여부는, 예를 들면 본 실시예 또는 참고 실시예에 나타내어지는 바와 같이, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 상호작용 해석기기인 BIACORE를 사용하여 항체를 센서칩 상에 고정화 또는 Protein A, Protein L, Protein A/G, Protein G, 항lamda쇄 항체, 항kappa쇄 항체, 항원 펩티드, 항원 단백질 등으로 캡쳐한 센서칩에 대해 각종 FcγR을 애널라이트로서 상호작용시킨 센서그램의 해석 결과로부터 얻어지는 해리상수(KD)의 값이 저하되었거나 또는 증가되었는지 여부로 판단 가능하다. 또는 센서칩 상에 고정화했거나 또는 Protein A, Protein L, Protein A/G, Protein G, 항lamda쇄 항체, 항kappa쇄 항체, 항원 펩티드, 항원 단백질 등으로 캡쳐한 센서칩 상의 항체에 대해 각종 FcγR을 애널라이트로서 상호작용시킨 전후에서의 센서그램 상의 리조넌스 유닛(RU)값의 변화량을 센서칩에 항체를 고정화 또는 캡쳐시킨 전후에서의 리조넌스 유닛(RU)의 변화량으로 나눈 값이 저하되었거나 또는 증가되었는지 여부로도 판단 가능하다. 또한 FcγR을 센서칩에 직접 고정화하였거나 또는 항태그 항체 등을 매개로 고정화한 센서칩을 사용하여, 평가하고자 하는 항체 등의 시료를 애널라이트로서 상호작용시킨 센서그램의 해석으로부터 얻어지는 해리상수(KD)의 값이 저하되었거나 또는 증가되었는지 여부로 판단 가능하다. 또는 FcγR을 센서칩에 직접 고정화하였거나 또는 항태그 항체 등을 매개로 고정화한 센서칩에 대해 평가하고자 하는 항체 등의 시료를 애널라이트로서 상호작용시킨 전후에서의 센서그램의 값의 변화량이 저하되었거나 또는 증가되었는지 여부로도 판단 가능하다.
구체적으로는 Fc영역 개변체의 Fcγ 수용체에 대한 결합 활성은 ELISA나 FACS(fluorescence activated cell sorting) 외에, ALPHA 스크린(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)이나 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 BIACORE법 등에 의해 측정할 수 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010).
ALPHA 스크린은 도너와 액셉터의 2개의 비드를 사용하는 ALPHA 테크놀로지에 의해 하기 원리를 토대로 실시된다. 도너 비드에 결합한 분자가 액셉터 비드에 결합한 분자와 생물학적으로 상호작용하여, 2개의 비드가 근접한 상태일 때만 발광 시그널이 검출된다. 레이저에 의해 여기된 도너 비드 내의 감광제(photosensitizer)는 주변의 산소를 여기상태의 일중항산소로 변환한다. 일중항산소는 도너 비드 주변으로 확산되어 근접해 있는 액셉터 비드에 도달하면 비드 내의 화학 발광 반응을 일으켜 최종적으로 빛이 방출된다. 도너 비드에 결합한 분자와 액셉터 비드에 결합한 분자가 상호작용하지 않을 때는 도너 비드가 생산하는 일중항산소가 액셉터 비드에 도달하지 않기 때문에 화학 발광 반응은 일어나지 않는다.
예를 들면 도너 비드에 비오틴 표지된 폴리펩티드 회합체가 결합되고, 액셉터 비드에는 글루타티온 S 트랜스페라아제(GST)로 태그화된 Fcγ 수용체가 결합된다. 경합하는 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드 회합체의 비존재하에서는 야생형 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드 회합체와 Fcγ 수용체는 상호작용하여 520-620 nm의 시그널을 발생시킨다. 태그화되어 있지 않은 변이 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드 회합체는 야생형 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드 회합체와 Fcγ 수용체 간의 상호작용과 경합한다. 경합의 결과 나타나는 형광의 감소를 정량함으로써 상대적인 결합 활성이 결정될 수 있다. 항체 등의 폴리펩티드 회합체를 Sulfo-NHS-비오틴 등을 사용하여 비오틴화하는 것은 공지이다. Fcγ 수용체를 GST로 태그화하는 방법으로서는 Fcγ 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오티드와 GST를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 인프레임으로 융합한 융합 유전자를 발현 가능한 벡터에 보유한 세포 등에 있어서 발현하고, 글루타티온 칼럼을 사용하여 정제하는 방법 등이 적절히 채용될 수 있다. 얻어진 시그널은 예를 들면 GRAPHPAD PRISM(GraphPad사, San Diego) 등의 소프트웨어를 사용하여 비선형 회귀해석을 이용하는 일부위 경합(one-site competition) 모델에 적용시킴으로써 적합하게 해석된다.
상호작용을 관찰하는 물질의 한쪽(리간드)을 센서칩의 금박막 상에 고정하고, 센서칩의 안쪽에서 금박막과 유리의 경계면에서 전반사되도록 빛을 조사하면, 반사광의 일부에 반사 강도가 저하된 부분(SPR 시그널)이 형성된다. 상호작용을 관찰하는 물질의 다른 쪽(애널라이트)을 센서칩의 표면에 흐르게 하여 리간드와 애널라이트가 결합하면, 고정화되어 있는 리간드 분자의 질랴이 증가하여 센서칩 표면 용매의 굴절률이 변화된다. 이 굴절률의 변화에 의해 SPR 시그널의 위치가 시프트된다(반대로 결합이 해리되면 시그널의 위치는 되돌아간다). Biacore 시스템은 상기의 시프트되는 양, 즉 센서칩 표면에서의 질량 변화를 세로축에 취하고, 질량의 시간 변화를 측정 데이터로서 표시한다(센서그램). 센서그램으로부터 센서칩 표면에 포착한 리간드에 대한 애널라이트의 결합량이 구해진다. 또한 센서그램의 커브로부터 키네틱스：결합속도상수(ka)와 해리속도상수(kd)가, 당해 상수의 비로부터 해리상수(KD)가 구해진다. BIACORE법에서는 저해 측정법도 적합하게 사용된다. 저해 측정법의 예는 Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11), 4005-4010에 있어서 기재되어 있다.
FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지된 Fc영역 또는 당해 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드란 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드(모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 모체 폴리펩티드라고도 한다)와, 당해 Fc영역에 본 발명의 아미노산 개변을 포함하는 폴리펩티드(Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드)의 양을 본질적으로 동일하게 하여 어세이를 행하였을 때, 모체 폴리펩티드와 본질적으로 변화가 없는 동등한 결합 활성으로 FcγRIIb와 결합하는 것을 말한다. 구체적으로는, 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcgRIIb로의 결합을 적어도 55.5% 유지하고 있는 Fc영역 개변체를 말한다.
또한 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소, 저감 또는 감약(減弱)된 Fc영역 또는 당해 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드란, 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드(모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드 또는 모체 폴리펩티드라고도 한다)와, 당해 Fc영역에 본 발명의 아미노산 개변을 포함하는 폴리펩티드(Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드)의 양을 본질적으로 동일하게 하여 어세이를 행하였을 때에, 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드보다도 본질적으로 보다 약한 결합 활성으로 활성형 FcγR과 결합하는 Fc영역 개변체 또는 당해 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 말한다.
본 발명의 Fc영역 개변체가 천연형 IgG의 Fc영역의 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하고 있는지 여부는, 예를 들면 상기 예에 따라 구한 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값과 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값을 비교함으로써 판단하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 비해 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 KD값이 동등하거나 그 이하의 값인 경우, 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 비해 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지한 것으로 판단할 수 있다. 또한 본 발명의 Fc영역 개변체가 천연형 IgG의 Fc영역의 활성형 FcγR에 대한 결합 활성보다 감소되어 있는지 여부에 대해서도. 예를 들면 마찬가지로 상기 예에 따라 구한 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 활성형 FcγR에 대한 KD값과 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 활성형 FcγR에 대한 KD값을 비교함으로써 판단하는 것이 가능하다. 구체적으로는, 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 비해 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 KD값이 증대되어 있는 경우, 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 비해 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소된 것으로 판단할 수 있다. 특히 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성은 다른 활성형 FcγR에 대한 것보다도 FcγRIIb에 대한 결합 활성과 상관하기 쉽기 때문에, FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성을 감소시킬 수 있는 아미노산 개변을 발견하는 것이, FcγRIIb 이외의 다른 활성형 FcγR에 대한 결합 활성을 선택적으로 감소시키는 데 가장 곤란한 과제이다.
FcγRIIb에 대한 결합 활성이 동등하거나 유지되어 있다는 것은, 예를 들면 상기 측정법으로 측정한 KD값에 있어서, 〔모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕/〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 KD값〕의 KD값 비가 바람직하게는 적어도 0.75, 보다 바람직하게는 적어도 0.8, 더욱 보다 바람직하게는 적어도 0.9를 갖는다. 또한 당해 KD값 비는 5정도면 충분하고, FcγRIIb에 대한 결합 활성이 동등하거나 또는 유지되어 있다고 하기 위해서는 그 이상 높을 필요는 없다.
활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소, 저감 또는 감약이란, 예를 들면 상기 측정법으로 측정한 KD값에 있어서, 〔모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 활성형 FcγR에 대한 KD값〕/〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 활성형 FcγR에 대한 KD값〕의 KD값 비가 바람직하게는 0.2 이하, 보다 바람직하게는 0.15 이하, 더욱 보다 바람직하게는 0.1 이하이다.
특히 FcγRIIa는 FcγRIIb와 세포외영역의 서열이 93% 일치하여 매우 구조가 유사하기 때문에, FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 결합 활성을 감소시키는 것이 곤란한 FcγRIIa R에 대한 결합에 대해서는, 〔모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIa R에 대한 KD값〕/〔Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIa R에 대한 KD값〕의 KD값 비가 0.1 이하가 바람직하고, 0.05인 것이 보다 바람직하다.
또한 본 발명의 폴리펩티드의 각종 FcγR에 대한 결합 활성이 유지, 증강 또는 감소되었는지 여부는 상기 예에 따라 구한 각종 FcγR의 본 발명의 폴리펩티드에 대한 결합량의 증감으로 판단하는 것도 가능하다. 여기서 각종 FcγR의 폴리펩티드에 대한 결합량은 각 폴리펩티드에 대해 애널라이트인 각종 FcγR을 상호작용시킨 전후에서 변화된 센서그램에 있어서의 RU값의 차를 센서칩에 폴리펩티드를 포착시킨 전후에서 변화된 센서그램에 있어서의 RU값의 차로 나눈 값을 의미한다.
또한 FcγRIIb에 대한 선택성이 향상된 Fc영역 또는 당해 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드란, 또는 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 선택적으로 저감된 Fc영역 또는 당해 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드란, FcγRIIb에 대한 결합 활성은 유지하면서도 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소, 저감 또는 감약된 Fc영역 또는 당해 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드를 말한다.
또한 본 발명의 Fc영역 개변체로서는 FcγRIIb 및 활성형 FcγR에 대한 KD값(mol/L)에 특별히 제한은 없으나, 예를 들면 FcγRIIb에 대한 값이 7.0×10-6 이하면 되고, 바람직하게는 6.0×10-6 이하, 보다 바람직하게는 5.0×10-6 이하이며, 활성형 FcγR에 대한 값이 2.5×10-9 이상이면 되고, 바람직하게는 3.0×10-9 이상, 보다 바람직하게는 3.5×10-9 이상, 특히 FcγRIIa(R형)에 대한 값이 2.0×10-5 이상인 것이 바람직하다.
「Fc영역」은 항체 분자 중의 힌지부 또는 그의 일부, CH2, CH3 도메인으로 이루어지는 프래그먼트를 말한다. IgG 클래스의 Fc영역은 EU 넘버링(본 명세서에서는 EU INDEX로도 불린다)(도 18 참조)으로, 예를 들면 226번째의 시스테인으로부터 C말단 또는 230번째의 프롤린으로부터 C말단까지를 의미하는데, 이것에 한정되지 않는다.
Fc영역은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론 항체 등을 펩신 등의 단백질 분해효소로 부분 소화한 후에, 프로테인 A 칼럼에 흡착된 분획을 재용출함으로써 적합하게 취득될 수 있다. 이러한 단백 분해효소로서는 pH 등의 효소의 반응 조건을 적절히 설정함으로써 제한적으로 Fab나 F(ab')2를 발생시키도록 전장 항체를 소화할 수 있는 것이라면 특단의 한정은 되지 않고, 예를 들면 펩신이나 파파인 등을 예시할 수 있다.
본 발명은 인간 IgG(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)의 Fc영역에 대해 EU 넘버링 238번째 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변과, 하기의 (a) 내지 (k) 중 어느 하나에 기재된 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변을 조합한 아미노산 개변을 포함하는 Fc영역 개변체를 제공한다. 당해 개변을 Fc영역에 도입함으로써, 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성, 그 중에서도 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성이 감소된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 제공하는 것이 가능하다.
(a) Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산
(b) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산
(c) Fc영역의 EU 넘버링 241번째 아미노산
(d) Fc영역의 EU 넘버링 268번째 아미노산
(e) Fc영역의 EU 넘버링 295번째 아미노산
(f) Fc영역의 EU 넘버링 296번째 아미노산
(g) Fc영역의 EU 넘버링 298번째 아미노산
(h) Fc영역의 EU 넘버링 323번째 아미노산
(i) Fc영역의 EU 넘버링 324번째 아미노산
(j) Fc영역의 EU 넘버링 330번째 아미노산
(k) (a) 내지 (j)로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산
상기 (k)에서 선택되는 2개 이상의 아미노산의 조합으로서는, 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성에 대한 결합 활성이 감소되는 한 특별히 한정되지 않으나, 하기의 (1) 내지 (3)의 조합이 바람직하다.
(1) Fc영역의 EU 넘버링 241번째 아미노산, 268번째 아미노산, 296번째 아미노산 및 324번째 아미노산
(2) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산, 241번째 아미노산, 296번째 아미노산 및 330번째 아미노산
(3) Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산, 237번째 아미노산, 241번째 아미노산 및 296번째 아미노산
개변 후의 아미노산으로서 선택되는 아미노산은 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소되는 것이라면 특별히 한정되지 않으나, EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp, 235번째 아미노산이 Phe, 237번째 아미노산이 Gln 또는 Asp, 241번째 아미노산이 Met 또는 Leu, 268번째 아미노산이 Pro, 295번째 아미노산이 Met 또는 Val, 296번째 아미노산이 Glu, His, Asn 또는 Asp, 298번째 아미노산이 Ala 또는 Met, 323번째 아미노산이 Ile, 324번째 아미노산이 Asn 또는 His, 330번째 아미노산이 His 또는 Tyr인 것이 바람직하다. 또한 전술한 (1) 내지 (3)에서 개변 후의 아미노산으로서 선택되는 아미노산으로서는,
(1) Fc영역의 EU 넘버링 241번째 아미노산이 Met, 268번째 아미노산이 Pro, 296번째 아미노산이 Glu 및 324번째 아미노산이 His
(2) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산이 Gln 또는 Asp, 241번째 아미노산이 Met, 296번째 아미노산이 Glu 및 330번째 아미노산이 His
(3) Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산이 Phe, 237번째 아미노산이 Gln 또는 Asp, 241번째 아미노산이 Met 및 296번째 아미노산이 Glu
가 바람직하다.
또한 본 발명은 인간 IgG의 Fc영역에 대해 EU 넘버링 238번째 아미노산 및 271번째 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변과, 하기의 (a) 내지 (h) 중 어느 하나에 기재된 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변을 조합한 아미노산 개변을 포함하는 Fc영역 개변체를 제공한다. 당해 개변을 Fc영역에 도입함으로써, 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성, 그 중에서도 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성이 감소된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 제공하는 것이 가능하다.
(a) Fc영역의 EU 넘버링 234번째 아미노산
(b) Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산
(c) Fc영역의 EU 넘버링 236번째 아미노산
(d) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산
(e) Fc영역의 EU 넘버링 239번째 아미노산
(f) Fc영역의 EU 넘버링 265번째 아미노산
(g) Fc영역의 EU 넘버링 267번째 아미노산
(h) Fc영역의 EU 넘버링 297번째 아미노산
EU 넘버링 238번째 아미노산 및 271번째 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변과 조합하는 아미노산 개변으로서는, 상기 (a) 내지 (h)에 기재된 아미노산에 더하여 추가로 다른 아미노산을 조합시키는 것도 가능하다. 이러한 아미노산의 조합은 특별히 한정되지 않으나, 하기의 (1) 내지 (3)으로부터 선택되는 개변의 조합이 바람직하다.
(1) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 238번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산, 268번째 아미노산 및 271번째 아미노산
(2) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 237번째 아미노산, 238번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산, 296번째 아미노산, 297번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 396번째 아미노산
(3) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 238번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산 및 296번째 아미노산
개변 후의 아미노산으로서 선택되는 아미노산은 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소되는 것이라면 특별히 한정되지 않으나, EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp, 271번째 아미노산이 Gly, 234번째 아미노산이 Ala, His, Asn, Lys 또는 Arg, 235번째 아미노산이 Ala, 236번째 아미노산이 Gln, 237번째 아미노산이 Arg 또는 Lys, 239번째 아미노산이 Lys, 265번째 아미노산이 Lys, Asn, Arg, Ser 또는 Val, 267번째 아미노산이 Lys, Arg 또는 Tyr, 297번째 아미노산이 Ala인 것이 바람직하다.
또한 전술한 (1) 내지 (3)에서 개변 후의 아미노산으로서 선택되는 아미노산으로서는,
(1) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산이 Asp, 238번째 아미노산이 Asp, 264번째 아미노산이 Ile, 267번째 아미노산이 Arg, 268번째 아미노산이 Glu 및 271번째 아미노산이 Gly
(2) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산이 Asp, 237번째 아미노산이 Asp, 238번째 아미노산이 Asp, 264번째 아미노산이 Ile, 267번째 아미노산이 Ala, 268번째 아미노산이 Glu, 271번째 아미노산이 Gly, 296번째 아미노산이 Asp, 297번째 아미노산이 Ala, 330번째 아미노산이 Arg 및 396번째 아미노산이 Met
(3) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산이 Asp, 238번째 아미노산이 Asp, 264번째 아미노산이 Ile, 267번째 아미노산이 Arg, 268번째 아미노산이 Pro, 271번째 아미노산이 Gly 및 296번째 아미노산이 Glu
가 바람직하다.
또한 본 발명은 인간 IgG의 Fc영역에 대해 EU 넘버링 238번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변을 포함하는 Fc영역 개변체를 제공한다. 당해 개변체에는 추가로 하기의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변을 조합한 아미노산 개변을 포함하는 Fc영역 개변체를 제공한다. 당해 개변을 Fc영역에 도입함으로써, 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성, 그 중에서도 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성이 감소된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 제공하는 것이 가능하다.
(a) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산
(b) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산
(c) Fc영역의 EU 넘버링 264번째 아미노산
(d) Fc영역의 EU 넘버링 267번째 아미노산
(e) Fc영역의 EU 넘버링 268번째 아미노산
EU 넘버링 238번째 아미노산 및 271번째 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변과 조합하는 아미노산 개변으로서는, 상기 (a) 내지 (e)에 기재된 아미노산에 더하여 추가로 다른 아미노산을 조합시키는 것도 가능하다. 이러한 아미노산의 조합은 특별히 한정되지 않으나, 하기의 (1) 내지 (4)로부터 선택되는 개변의 조합이 바람직하다.
(1) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산, 238번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산
(2) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 237번째 아미노산, 238번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산
(3) Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산, 267번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산
(4) Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산
개변 후의 아미노산으로서 선택되는 아미노산은 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소되는 것이라면 특별히 한정되지 않으나, EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp, 271번째 아미노산이 Gly, 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser, 331번째 아미노산이 Ser, 233번째 아미노산이 Asp, 237번째 아미노산이 Asp, 264번째 아미노산이 Ile, 267번째 아미노산이 Ala, 268번째 아미노산이 Asp 또는 Glu인 것이 바람직하다.
또한 전술한 (1) 내지 (4)에서 개변 후의 아미노산으로서 선택되는 아미노산으로서는,
(1) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산이 Asp, 238번째 아미노산이 Asp, 268번째 아미노산이 Asp 또는 Glu, 271번째 아미노산이 Gly, 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser 및 331번째 아미노산이 Ser
(2) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산이 Asp, 237번째 아미노산이 Asp, 238번째 아미노산이 Asp, 268번째 아미노산이 Asp, 271번째 아미노산이 Gly, 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser 및 331번째 아미노산이 Ser
(3) Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp, 267번째 아미노산이 Ala, 268번째 아미노산이 Glu, 271번째 아미노산이 Gly, 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser 및 331번째 아미노산이 Ser
(4) Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp, 264번째 아미노산이 Ile, 267번째 아미노산이 Ala, 271번째 아미노산이 Gly, 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser 및 331번째 아미노산이 Ser
이 바람직하다.
본 발명은 이들 개변에 더하여 추가로 다른 하나 이상의 Fc영역에 대한 개변을 가하는 것이 가능하다. FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 활성형 FcγR에 대한 결합 활성을 감소시키는 것이라면 특별히 한정되지 않는다.
이러한 개변으로서는, 예를 들면 보체에 대한 결합 활성을 감소시키는 개변을 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 Fc영역의 EU 넘버링 322번째 아미노산 개변 또는 Fc영역의 EU 넘버링 327번째, 330번째 및 331번째 아미노산 개변의 조합을 들 수 있다. 개변 후의 아미노산으로서 선택되는 아미노산은 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되고, 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소되면서 보체에 대한 결합 활성을 감소시키는 것이라면 특별히 한정되지 않으나, EU 넘버링 322번째 아미노산이 Ala 또는 Glu, 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser, 331번째 아미노산이 Ser인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드 또는 Fc영역 개변체가 보체에 대한 결합 활성이 감소되었는지 여부는, 전술한 FcγR에 대한 결합 활성이 감소되었는지 여부를 확인하는 방법과 동일한 방법으로 확인할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 본 실시예에 나타내어지는 바와 같이, 표면 플라즈몬 공명(SPR) 현상을 이용한 상호작용 해석 기기인 BIACORE를 사용하여 평가하고자 하는 항체를 센서칩 상에 고정화 또는 Protein A, Protein L, Protein A/G, Protein G, 항lamda쇄 항체, 항kappa쇄 항체, 항원 펩티드, 항원 단백질 등으로 캡쳐한 센서칩에 대해 보체를 애널라이트로서 상호작용시킨 센서그램의 해석 결과로부터 얻어지는 해리상수(KD)의 값이 증가되었는지 여부로 판단 가능하다. 또는 센서칩 상에 고정화하였거나 또는 Protein A, Protein L, Protein A/G, Protein G, 항lamda쇄 항체, 항kappa쇄 항체, 항원 펩티드, 항원 단백질 등으로 캡쳐한 센서칩 상의 평가하고자 하는 항체에 대해 보체를 애널라이트로서 상호작용시킨 전후에서의 센서그램 상의 리조넌스 유닛(RU)값의 변하량을, 센서칩에 항체를 고정화 또는 캡쳐시킨 전후에서의 리조넌스 유닛(RU)의 변화량으로 나눈 값이 증가되었는지 여부로도 판단 가능하다. 또한 보체를 센서칩에 직접 고정화하였거나 또는 항태그 항체 등을 매개로 고정화한 센서칩을 사용하여, 평가하고자 하는 항체 등의 시료를 애널라이트로서 상호작용시킨 센서그램의 해석으로부터 얻어지는 해리상수(KD)의 값이 증가되었는지 여부로 판단 가능하다. 또는 보체를 센서칩에 직접 고정화하였거나 또는 항태그 항체 등을 매개로 고정화한 센서칩에 대해 평가하고자 하는 항체 등의 시료를 애널라이트로서 상호작용시킨 전후에서의 센서그램의 값의 변화량이 증가되었는지 여부로도 판단 가능하다. 또는 항원을 매개로 또는 직접 평가하고자 하는 항체를 고상화한 플레이트에 대해 보체를 첨가하고, 그 후 퍼옥시다아제 등으로 표지된 항인간 C1q 항체를 첨가하는 ELISA에 의해 결합량을 평가하는 것으로도 판단 가능하다.
또한 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드에는 다른 목적으로 행해지는 아미노산 개변을 조합시키는 것도 가능하다. 예를 들면 FcRn에 대한 결합 활성을 향상시키는 아미노산 치환(J Immunol. 2006 Jan 1;176(1):346-56, J Biol Chem. 2006 Aug 18;281(33):23514-24., Int Immunol. 2006 Dec;18(12):1759-69., Nat Biotechnol. 2010 Feb;28(2):157-9., WO/2006/019447, WO/2006/053301, WO/2009/086320), 항체의 헤테로제니티나 안정성을 향상시키기 위한 아미노산 치환(WO/2009/041613)을 가해도 된다. 또는 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드에 WO2011/122011, PCT/JP2011/072550에 기재된 항원의 소실을 촉진하기 위한 성질을 부여한 폴리펩티드나 WO2009/125825, PCT/JP2011/077619에 기재된 복수 분자의 항원에 반복해서 결합하기 위한 성질을 부여한 폴리펩티드도 본 발명에 포함된다. 또는 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드에 혈 중 체류성을 높일 목적으로 불변영역의 pI를 저하시키는 아미노산 개변(WO/2012/016227)을 조합시켜도 된다. 또는 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드에 사용하여 다른 항원에 대한 결합능을 부여할 목적으로 CH3에 EP1752471, EP1772465에 기재된 아미노산 개변을 조합시켜도 된다.
본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드가 항체와 같은 항원 결합 도메인을 포함하는 경우에는, 당해 폴리펩티드의 혈장 중으로부터의 항원 소실 효과를 높이기 위해 이온 농도 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성을 변화시키기 위한 아미노산 개변을 조합시킬 수 있다.
본 명세서에 있어서 「항원 결합 도메인」은 목적으로 하는 항원에 결합하는 한 어떠한 구조의 도메인도 사용될 수 있다. 이러한 도메인의 예로서, 예를 들면 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역, 생체 내에 존재하는 세포막 단백인 Avimer에 포함되는 35 아미노산 정도의 A 도메인이라 불리는 모듈(국제공개 WO2004/044011, WO2005/040229), 세포막에 발현하는 당단백질인 피브로넥틴(fibronectin) 중의 단백질에 결합하는 도메인인 10Fn3 도메인을 포함하는 Adnectin(국제공개 WO2002/032925), Protein A의 58 아미노산으로 이루어지는 3개의 헬릭스의 다발(bundle)을 구성하는 IgG 결합 도메인을 스캐폴드(scaffold)로 하는 Affibody(국제공개 WO1995/001937), 33 아미노산 잔기를 포함하는 턴과 2개의 역병행 헬릭스 및 루프의 서브유닛이 반복해서 겹쳐진 구조를 갖는 안키린 반복(ankyrin repeat：AR)의 분자 표면에 노출되는 영역인 DARPins(Designed Ankyrin Repeat proteins)(국제공개 WO2002/020565), 호중구 겔라티나제 결합 리포칼린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)) 등의 리포칼린 분자에 있어서 고도로 보존된 8개의 역병행 스트랜드가 중앙방향으로 비틀어진 배럴 구조의 한쪽을 지지하는 4개의 루프영역인 Anticalin 등(국제공개 WO2003/029462), 칠성장어, 먹장어 등 무악류의 획득 면역 시스템으로서 면역 글로불린의 구조를 갖지 않는 가변성 림프구 수용체(variable lymphocyte receptor(VLR))의 류신 잔기가 풍부한 리피트(leucine-rich-repeat(LRR)) 모듈이 반복해서 겹쳐진 말굽 구조 내부의 병행형 시트 구조의 움푹 들어간 영역(국제공개 WO2008/016854)을 적합하게 들 수 있다. 본 발명의 항원 결합 도메인의 적합한 예로서, 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역을 포함하는 항원 결합 도메인을 들 수 있다. 이러한 항원 결합 도메인의 예로서는 「scFv(single chain Fv)」, 「단일 사슬 항체(single chain antibody)」, 「Fv」, 「scFv2(single chain Fv 2)」, 「Fab」 또는 「F(ab')2」 등을 적합하게 들 수 있다.
본 명세서에 있어서의 「이온 농도」란, 예를 들면 금속 이온 농도를 들 수 있다. 「금속 이온」이란 수소를 제외한 알칼리금속 및 동족(銅族) 등의 제I족, 알칼리토류금속 및 아연족 등의 제II족, 붕소를 제외한 제III족, 탄소와 규소를 제외한 제IV족, 철족 및 백금족 등의 제VIII족, V, VI 및 VII족의 각 A아족에 속하는 원소와, 안티몬, 비스무트, 폴로늄 등의 금속 원소의 이온을 말한다. 금속 원자는 원자가 전자를 방출하여 양이온이 되는 성질을 가지고 있고, 이를 이온화 경향이라 한다. 이온화 경향이 큰 금속은 화학적으로 활성이 풍부한 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 적합한 금속 이온의 예로서 칼슘 이온을 들 수 있다. 칼슘 이온은 많은 생명현상의 조절에 관여하고 있어, 골격근, 평활근 및 심근 등의 근육의 수축, 백혈구의 운동 및 탐식 등의 활성화, 혈소판의 변형 및 분비 등의 활성화, 림프구의 활성화, 히스타민의 분비 등의 비만세포의 활성화, 카테콜아민 α 수용체나 아세틸콜린 수용체를 매개로 하는 세포의 응답, 세포외배출(exocytosis), 뉴론 종말로부터의 전달물질의 방출, 뉴론의 축삭류(axonal flow) 등에 칼슘 이온이 관여하고 있다. 세포 내의 칼슘 이온 수용체로서 복수 개의 칼슘 이온 결합 부위를 가져, 분자 진화상 공통의 기원으로부터 유래한 것으로 생각되는 트로포닌 C, 카모듈린, 파브알부민, 미오신 경쇄 등이 알려져 있고, 그 결합 모티브도 많이 알려져 있다. 예를 들면 카드헤린 도메인, 카모듈린에 포함되는 EF 핸드, Protein kinase C에 포함되는 C2 도메인, 혈액 응고 단백질 FactorIX에 포함되는 Gla 도메인, 아시알로당단백질 수용체나 만노오스 결합 수용체에 포함되는 C형 렉틴, LDL 수용체에 포함되는 A 도메인, 아넥신, 트롬보스폰딘 3형 도메인 및 EGF 유사 도메인이 잘 알려져 있다.
본 발명에 있어서는 금속 이온이 칼슘 이온인 경우에는, 칼슘 이온 농도의 조건으로서 저칼슘 이온 농도의 조건과 고칼슘 이온 농도의 조건을 들 수 있다. 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 결합 활성이 변화한다는 것은, 저칼슘 이온 농도와 고칼슘 이온 농도의 조건의 차이에 의해 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 것을 말한다. 예를 들면 저칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성보다도 고칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성 쪽이 높은 경우를 들 수 있다. 또한 고칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성보다도 저칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성 쪽이 높은 경우도 또한 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 고칼슘 이온 농도란 특별히 일의적인 수치에 한정되는 것은 아니나, 적합하게는 100 μM 내지 10 mM 사이에서 선택되는 농도일 수 있다. 또한 다른 태양에서는 200 μM 내지 5 mM 사이에서 선택되는 농도일 수도 있다. 또한 다른 태양에서는 400 μM 내지 3 mM 사이에서 선택되는 농도일 수도 있고, 다른 태양에서는 200 μM 내지 2 mM 사이에서 선택되는 농도일 수도 있다. 또한 400 μM 내지 1 mM 사이에서 선택되는 농도일 수도 있다. 특히 생체 내의 혈장 중(혈중)에서의 칼슘 이온 농도에 가까운 500 μM 내지 2.5 mM 사이에서 선택되는 농도를 적합하게 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 저칼슘 이온 농도란 특별히 일의적인 수치에 한정되는 것은 아니나, 적합하게는 0.1 μM 내지 30 μM 사이에서 선택되는 농도일 수 있다. 또한 다른 태양에서는 0.2 μM 내지 20 μM 사이에서 선택되는 농도일 수도 있다. 또한 다른 태양에서는 0.5 μM 내지 10 μM 사이에서 선택되는 농도일 수도 있고, 다른 태양에서는 1 μM 내지 5 μM 사이에서 선택되는 농도일 수도 있다. 또한 2 μM 내지 4 μM 사이에서 선택되는 농도일 수도 있다. 특히 생체 내의 조기 엔도솜 내에서의 이온화 칼슘 농도에 가까운 1 μM 내지 5 μM 사이에서 선택되는 농도를 적합하게 들 수 있다.
본 발명에 있어서 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮다는 것은, 항원 결합 분자의 0.1 μM 내지 30 μM 사이에서 선택되는 칼슘 이온 농도에서의 항원에 대한 결합 활성이 100 μM 내지 10 mM 사이에서 선택되는 칼슘 이온 농도에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미한다. 바람직하게는 항원 결합 분자의 0.5 μM 내지 10 μM 사이에서 선택되는 칼슘 이온 농도에서의 항원에 대한 결합 활성이 200 μM 내지 5 mM 사이에서 선택되는 칼슘 이온 농도에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미하고, 특히 바람직하게는 생체 내의 조기 엔도솜 내의 칼슘 이온 농도에 있어서의 항원 결합 활성이 생체 내의 혈장 중 칼슘 이온 농도에 있어서의 항원 결합 활성보다 약한 것을 의미하며, 구체적으로는, 항원 결합 분자의 1 μM 내지 5 μM 사이에서 선택되는 칼슘 이온 농도에서의 항원에 대한 결합 활성이 500 μM 내지 2.5 mM 사이에서 선택되는 칼슘 이온 농도에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미한다.
금속 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되어 있는지 여부는, 예를 들면 상기 결합 활성 부분에서 기재된 바와 같은 공지의 측정방법을 사용함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면 저칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성보다도 고칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성 쪽이 높게 변화되는 것을 확인하기 위해서는, 저칼슘 이온 농도 및 고칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 비교된다.
또한 본 발명에 있어서 「저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮다」는 표현은, 항원 결합 분자의 고칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 높다고 표현하는 것도 가능하다. 또한 본 발명에 있어서는 「저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮다」를 「저칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원 결합능이 고칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합능보다도 약하다」고 기재하는 경우도 있고, 또한 「저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 활성을 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 저하시킨다」를 「저칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원 결합능을 고칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합능보다도 약하게 한다」고 기재하는 경우도 있다.
항원으로의 결합 활성을 측정할 때의 칼슘 이온 농도 이외의 조건은 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 HEPES 버퍼, 37℃의 조건에 있어서 측정하는 것이 가능하다. 예를 들면 Biacore(GE Healthcare) 등을 사용하여 측정하는 것이 가능하다. 항원 결합 분자와 항원의 결합 활성의 측정은, 항원이 가용형 항원인 경우는 항원 결합 분자를 고정화한 칩으로 항원을 애널라이트로서 흐르게 함으로써 가용형 항원으로의 결합 활성을 평가하는 것이 가능하고, 항원이 막형 항원인 경우는 항원을 고정화한 칩으로 항원 결합 분자를 애널라이트로서 흐르게 함으로써 막형 항원으로의 결합 활성을 평가하는 것이 가능하다.
본 발명의 항원 결합 분자에 있어서 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 약한 한, 저칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성과 고칼슘 이온 농도 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성의 비는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 항원에 대한 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 KD(Dissociation constant：해리상수)와 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 KD의 비인 KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 2 mM)의 값이 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 2 mM)의 값이 10 이상이며, 더욱 바람직하게는 KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 2 mM)의 값이 40 이상이다. KD(Ca 3 μM)/KD(Ca 2 mM)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술에 있어서 제작 가능한 한 400, 1000, 10000 등 어떠한 값이어도 된다.
항원에 대한 결합 활성의 값으로서 항원이 가용형 항원인 경우는 KD(해리상수)를 사용하는 것이 가능하나, 항원이 막형 항원인 경우는 겉보기 KD(Apparent dissociation constant：겉보기 해리상수)를 사용하는 것이 가능하다. KD(해리상수) 및 겉보기 KD(겉보기 해리상수)는 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), 스캐차드 플롯, 플로우 사이토미터 등을 사용하는 것이 가능하다.
또한 본 발명의 항원 결합 분자의 저칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성과 고칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성의 비를 나타내는 다른 지표로서, 예를 들면 해리속도상수인 kd(Dissociation rate constant：해리속도상수)도 또한 적합하게 사용될 수 있다. 결합 활성의 비를 나타내는 지표로서 KD(해리상수) 대신에 kd(해리속도상수)를 사용하는 경우, 항원에 대한 저칼슘 농도의 조건에 있어서의 kd(해리속도상수)와 고칼슘 농도의 조건에 있어서의 kd(해리속도상수)의 비인 kd(저칼슘 농도의 조건)/kd(고칼슘 농도의 조건)의 값은 바람직하게는 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 5 이상이며, 더욱 바람직하게는 10 이상이고, 보다 바람직하게는 30 이상이다. Kd(저칼슘 농도의 조건)/kd(고칼슘 농도의 조건)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술 상식에 있어서 제작 가능한 한 50, 100, 200 등 어떠한 값이어도 된다.
항원 결합 활성의 값으로서 항원이 가용형 항원인 경우는 kd(해리속도상수)를 사용하는 것이 가능하고, 항원이 막형 항원인 경우는 겉보기 kd(Apparent dissociation rate constant：겉보기 해리속도상수)를 사용하는 것이 가능하다. kd(해리속도상수) 및 겉보기 kd(겉보기 해리속도상수)는 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), 플로우 사이토미터 등을 사용하는 것이 가능하다. 또한 본 발명에 있어서 상이한 칼슘 이온 농도에 있어서의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성을 측정할 때는 칼슘 농도 이외의 조건은 동일하게 하는 것이 바람직하다.
예를 들면 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는, 아래의 공정 (a) 내지 (c)를 포함하는 항원 결합 도메인 또는 항체의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.
(a) 저칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(b) 고칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(c) 저칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 선택하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는, 아래의 공정 (a) 내지 (c)를 포함하는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자 또는 그들의 라이브러리의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.
(a) 고칼슘 농도의 조건에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자 또는 그들의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 저칼슘 농도 조건하에 두는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 해리된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는, 아래의 공정 (a) 내지 (d)를 포함하는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자 또는 그들의 라이브러리의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.
(a) 저칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 선택된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 고칼슘 농도 조건하에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는, 아래의 공정 (a) 내지 (c)를 포함하는 스크리닝 방법에 의해 취득될 수 있다.
(a) 항원을 고정한 칼럼에 고칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 라이브러리를 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 칼럼에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 저칼슘 농도 조건하에서 칼럼으로부터 용출하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 용출된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는, 아래의 공정 (a) 내지 (d)를 포함하는 스크리닝 방법에 의해 취득될 수 있다.
(a) 항원을 고정한 칼럼에 저칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 라이브러리를 통과시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 칼럼에 결합되지 않고 용출된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 회수하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 회수된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 고칼슘 농도 조건하에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는, 아래의 공정 (a) 내지 (d)를 포함하는 스크리닝 방법에 의해 취득될 수 있다.
(a) 고칼슘 농도 조건하에서 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 취득한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 저칼슘 농도 조건하에 두는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원 결합 활성이 상기 공정 (b)에서 선택한 기준보다 약한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는 공정.
또한 상기 공정은 2회 아싱 반복되어도 된다. 따라서 본 발명에 의해 전술한 스크리닝 방법에 있어서 (a) 내지 (c) 또는 (a) 내지 (d)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가로 포함하는 스크리닝 방법에 의해 취득된 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자가 제공된다. (a) 내지 (c) 또는 (a) 내지 (d)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않으나, 통상 10회 이내이다.
상기 스크리닝 방법에 있어서 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 항원 결합 활성은 이온화 칼슘 농도가 0.1 μM 내지 30 μM 사이의 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 이온화 칼슘 농도로서 0.5 μM 내지 10 μM 사이의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 보다 바람직한 이온화 칼슘 농도로서 생체 내의 조기 엔도솜 내의 이온화 칼슘 농도를 들 수 있고, 구체적으로는 1 μM 내지 5 μM에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 또한 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 항원 결합 활성은 이온화 칼슘 농도가 100 μM 내지 10 mM 사이의 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 이온화 칼슘 농도로서 200 μM 내지 5 mM 사이의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 보다 바람직한 이온화 칼슘 농도로서 생체 내의 혈장 중에서의 이온화 칼슘 농도를 들 수 있고, 구체적으로는 0.5 mM~2.5 mM에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 스크리닝 방법으로서 WO2012/073992 등(예를 들면 단락 0200-0213)에 기재된 방법도 예시될 수 있다.
항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 항원 결합 활성은 당업자에게 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 이온화 칼슘 농도 이외의 조건에 대해서는 당업자가 적절히 결정하는 것이 가능하다. 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 항원 결합 활성은 KD(Dissociation constant：해리상수), 겉보기 KD(Apparent dissociation constant：겉보기 해리상수), 해리속도인 kd(Dissociation rate：해리속도상수) 또는 겉보기 kd(Apparent dissociation：겉보기 해리속도상수) 등으로서 평가하는 것이 가능하다. 이들은 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), 스캐차드 플롯, FACS 등을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 선택하는 공정은, 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 선택하는 공정과 동일한 의미이다.
고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 한, 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성과 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성의 차는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 고칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성이 저칼슘 농도 조건하에 있어서의 항원 결합 활성의 2배 이상이고, 더욱 바람직하게는 10배 이상이며, 보다 바람직하게는 40배 이상이다.
상기 스크리닝 방법에 의해 스크리닝되는 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는 어떠한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자여도 되고, 예를 들면 전술한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 스크리닝하는 것이 가능하다. 예를 들면 천연의 서열을 갖는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 스크리닝해도 되고, 아미노산 서열이 치환된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 스크리닝해도 된다.
예를 들면 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 저칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도의 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 스크리닝 방법으로서 WO2012/073992 등(예를 들면 단락 0200-0213)에 기재된 방법이 예시될 수 있다.
상기 스크리닝 방법에 의해 스크리닝되는 본 발명의 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성을 변화시키는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는 어떻게 조제되어도 되고, 예를 들면 금속 이온이 칼슘 이온 농도인 경우에는, 사전에 존재하고 있는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자, 사전에 존재하고 있는 라이브러리(파지라이브러리 등), 동물로의 면역으로부터 얻어진 하이브리도마나 면역동물로부터의 B세포로 제작된 항체 또는 라이브러리, 이들 항체나 라이브러리에 칼슘을 킬레이트 가능한 아미노산(예를 들면 아스파라긴산이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산 변이를 도입한 항체 또는 라이브러리(칼슘을 킬레이트 가능한 아미노산(예를 들면 아스파라긴산이나 글루타민산) 또는 비천연 아미노산의 함유율을 높게 한 라이브러리나 특정 개소에 칼슘을 킬레이트 가능한 아미노산(예를 들면 아스파라긴산이나 글루타민산) 또는 비천연 아미노산 변이를 도입한 라이브러리 등) 등을 사용하는 것이 가능하다.
상기와 같이 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산의 예로서, 예를 들면 금속 이온이 칼슘 이온인 경우에는, 칼슘 결합 모티브를 형성하는 아미노산이라면 그 종류는 불문한다. 칼슘 결합 모티브는 당업자에게 주지로서 상세하게 기재되어 있다(예를 들면 Springer 등(Cell (2000) 102, 275-277), Kawasaki 및 Kretsinger(Protein Prof. (1995) 2, 305-490), Moncrief 등(J. Mol. Evol. (1990) 30, 522-562), Chauvaux 등(Biochem. J. (1990) 265, 261-265), Bairoch 및 Cox(FEBS Lett. (1990) 269, 454-456), Davis(New Biol. (1990) 2, 410-419), Schaefer 등(Genomics (1995) 25, 638~643), Economou 등(EMBO J. (1990) 9, 349-354), Wurzburg 등(Structure. (2006) 14, 6, 1049-1058)). 즉, ASGPR, CD23, MBR, DC-SIGN 등의 C형 렉틴 등의 임의의 공지의 칼슘 결합 모티브가 본 발명의 항원 결합 분자에 포함될 수 있다. 이러한 칼슘 결합 모티브의 적합한 예로서, 상기 외에는 서열번호：45에 기재되는 항원 결합 도메인에 포함되는 칼슘 결합 모티브도 들 수 있다.
또한 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 항원 결합 도메인의 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성을 변화시키는 아미노산의 예로서, 금속 킬레이트 작용을 갖는 아미노산도 적합하게 사용될 수 있다. 금속 킬레이트 작용을 갖는 아미노산의 예로서, 예를 들면 세린(Ser(S)), 트레오닌(Thr(T)), 아스파라긴(Asn(N)), 글루타민(Gln(Q)), 아스파라긴산(Asp(D)) 및 글루타민산(Glu(E)) 등을 적합하게 들 수 있다.
상기의 아미노산이 포함되는 항원 결합 도메인의 위치는 특정 위치에 한정되지 않고, 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 한, 항원 결합 도메인을 형성하는 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역 중 어느 위치일 수도 있다. 비한정의 일태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산이 중쇄의 항원 결합 도메인에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 또한 비한정의 다른 일태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산이 중쇄의 CDR3에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 그 밖의 태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산이 중쇄의 CDR3의 Kabat 넘버링으로 표시되는 95번 위치, 96번 위치, 100a번 위치 및/또는 101번 위치에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다.
또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산이 경쇄의 항원 결합 도메인에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 또한 비한정의 다른 일태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산이 경쇄의 CDR1에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 그 밖의 태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산이 경쇄의 CDR1의 Kabat 넘버링으로 표시되는 30번 위치, 31번 위치 및/또는 32번 위치에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다.
또한 다른 비한정의 일태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR2에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 그 밖의 비한정의 일태양에서는 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR2의 Kabat 넘버링으로 표시되는 50번 위치에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리가 제공된다.
또 다른 태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR3에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다. 그 밖의 태양에서는 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR3의 Kabat 넘버링으로 표시되는 92번 위치에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다.
또한 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산 잔기가 상기에 기재된 경쇄의 CDR1, CDR2 및 CDR3로부터 선택되는 2개 또는 3개의 CDR에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 본 발명의 다른 태양으로서 취득될 수 있다. 또한 본 발명의 항원 결합 도메인은 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 Kabat 넘버링으로 표시되는 30번 위치, 31번 위치, 32번 위치, 50번 위치 및/또는 92번 위치 중 어느 하나 이상에 포함되어 있는 서로 서열이 다른 항원 결합 분자로 주로 이루어지는 라이브러리로부터 취득될 수 있다.
특히 적합한 실시형태에서는 항원 결합 분자의 경쇄 및/또는 중쇄 가변영역의 프레임워크 서열은 인간의 생식세포계 프레임워크 서열을 가지고 있는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 일태양에 있어서 프레임워크 서열이 완전히 인간의 서열이라면, 인간에게 투여(예를 들면 질병의 치료)된 경우, 본 발명의 항원 결합 분자는 면역원성 반응을 거의 또는 전혀 일으키지 않을 것으로 생각된다. 상기의 의미로부터, 본 발명에 있어서의 「생식세포계열의 서열을 포함한다」는 것은 본 발명에 있어서의 프레임워크 서열의 일부가 어느 하나의 인간의 생식세포계 프레임워크 서열의 일부와 동일한 것을 의미한다. 예를 들면 본 발명의 항원 결합 분자의 중쇄 FR2의 서열이 복수의 상이한 인간의 생식세포계 프레임워크 서열의 중쇄 FR2 서열이 조합된 서열인 경우도, 본 발명에 있어서의 「생식세포계열의 서열을 포함하는」 항원 결합 분자이다.
프레임워크의 예로서는, 예를 들면 V-Base(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) 등의 웹사이트에 포함되어 있는 현재 알려져 있는 완전히 인간형의 프레임워크 영역의 서열을 적합하게 들 수 있다. 이들 프레임워크 영역의 서열이 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 생식세포계열의 서열로서 적절히 사용될 수 있다. 생식세포계열의 서열은 그 유사성을 토대로 분류될 수 있다(Tomlinson 등(J. Mol. Biol. (1992) 227, 776-798) Williams 및 Winter(Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1456-1461) 및 Cox 등(Nat. Genetics (1994) 7, 162-168)). 7개의 서브그룹으로 분류되는 Vκ, 10개의 서브그룹으로 분류되는 Vλ, 7개의 서브그룹으로 분류되는 VH로부터 적합한 생식세포계열의 서열이 적절히 선택될 수 있다.
완전히 인간형의 VH 서열은 하기로만 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 VH1 서브그룹(예를 들면 VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58, VH1-69), VH2 서브그룹(예를 들면 VH2-5, VH2-26, VH2-70), VH3 서브그룹(VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73, VH3-74), VH4 서브그룹(VH4-4, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH4-61), VH5 서브그룹(VH5-51), VH6 서브그룹(VH6-1), VH7 서브그룹(VH7-4, VH7-81)의 VH서열 등을 적합하게 들 수 있다. 이들은 공지 문헌(Matsuda 등(J. Exp. Med. (1998) 188, 1973-1975)) 등에도 기재되어 있어, 당업자는 이들 서열 정보를 토대로 본 발명의 항원 결합 분자를 적절히 설계하는 것이 가능하다. 이들 이외의 완전히 인간형의 프레임워크 또는 프레임워크의 준영역도 적합하게 사용될 수 있다.
완전히 인간형의 Vκ 서열은 하기로만 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 Vk1 서브그룹으로 분류되는 A20, A30, L1, L4, L5, L8, L9, L11, L12, L14, L15, L18, L19, L22, L23, L24, O2, O4, O8, O12, O14, O18, Vk2 서브그룹으로 분류되는 A1, A2, A3, A5, A7, A17, A18, A19, A23, O1, O11, Vk3 서브그룹으로 분류되는 A11, A27, L2, L6, L10, L16, L20, L25, Vk4 서브그룹으로 분류되는 B3, Vk5 서브그룹으로 분류되는 B2(본 명세서에 있어서는 Vk5-2라고도 지칭된다)), Vk6 서브그룹으로 분류되는 A10, A14, A26 등(Kawasaki 등(Eur. J. Immunol. (2001) 31, 1017-1028), Schable 및 Zachau(Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374, 1001-1022) 및 Brensing-Kuppers 등(Gene (1997) 191, 173-181))을 적합하게 들 수 있다.
완전히 인간형의 Vλ 서열은 하기로만 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 VL1 서브그룹으로 분류되는 V1-2, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-20, V1-22, VL1 서브그룹으로 분류되는 V2-1, V2-6, V2-7, V2-8, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17, V2-19, VL3 서브그룹으로 분류되는 V3-2, V3-3, V3-4, VL4 서브그룹으로 분류되는 V4-1, V4-2, V4-3, V4-4, V4-6, VL5 서브그룹으로 분류되는 V5-1, V5-2, V5-4, V5-6 등(Kawasaki 등(Genome Res. (1997) 7, 250-261))을 적합하게 들 수 있다.
통상 이들 프레임워크 서열은 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 상위에 의해 서로 상이하다. 이들 프레임워크 서열은 본 발명에 있어서의 「이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」와 함께 사용될 수 있다. 본 발명에 있어서의 「이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」와 함께 사용되는 완전히 인간형의 프레임워크의 예로서는, 이들에만 한정되는 것은 아니나, 그 밖에도 KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY, POM 등을 들 수 있다(예를 들면 상기의 Kabat 등(1991) 및 Wu 등(J. Exp. Med. (1970) 132, 211-250)).
본 발명은 특정 이론에 구속되는 것은 아니나, 생식세포계 서열의 사용이 대부분의 개인에 있어서 유해한 면역반응을 배제할 것으로 기대되고 있는 하나의 이유는 아래와 같다고 생각되고 있다. 통상의 면역반응 중에 발생하는 친화성 성숙 스텝의 결과, 면역글로불린의 가변영역에 체세포의 돌연변이가 빈번하게 생긴다. 이들 돌연변이는 주로 그 서열이 초가변적인 CDR의 주변에 생기는데, 프레임워크 영역의 잔기에도 영향을 미친다. 이들 프레임워크의 돌연변이는 생식세포계의 유전자에는 존재하지 않고, 또한 환자의 면역원성이 될 가능성은 적다. 한편 통상의 인간의 집단은 생식세포계의 유전자에 의해 발현되는 프레임워크 서열의 대다수에 노출되어 있어, 면역관용의 결과, 이들 생식세포계의 프레임워크는 환자에게 있어서 면역원성이 낮거나 또는 비면역원성일 것으로 예상된다. 면역관용의 가능성을 최대로 하기 위해 가변영역을 코드화하는 유전자가 보통으로 존재하는 기능적인 생식세포계 유전자의 집합으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산이 상기 가변영역 서열의 서열, 중쇄 가변영역 또는 경쇄 가변영역의 서열, 또는 CDR서열 또는프레임워크 서열에 포함되는 항원 결합 분자를 제작하기 위해 부위 특이적 변이 유발법(Kunkel 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488-492))이나 Overlap extension PCR 등의 공지의 방법이 적절히 채용될 수 있다.
예를 들면 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 사전에 포함되어 있는 프레임워크 서열로서 선택된 경쇄 가변영역과, 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시킴으로써 본 발명의 복수의 서로 서열이 다른 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리가 제작될 수 있다. 이러한 비한정적인 예로서, 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는, 예를 들면 서열번호：45(Vk5-2)에 기재된 경쇄 가변영역 서열과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합한 라이브러리를 적합하게 들 수 있다.
또한 상기 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 사전에 포함되어 있는 프레임워크 서열로서 선택된 경쇄 가변영역의 서열에, 당해 아미노산 잔기 이외의 잔기로서 다양한 아미노산이 포함되도록 설계하는 것도 가능하다. 본 발명에 있어서 이러한 잔기는 플렉시블 잔기로 지칭된다. 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성이 이온 농도의 조건에 따라 변화되는 한, 당해 플렉시블 잔기의 수 및 위치는 특정 태양에 한정되지 않는다. 즉, 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR서열 및/또는 FR서열에 하나 또는 그 이상의 플렉시블 잔기가 포함될 수 있다. 예를 들면 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는, 서열번호：45(Vk5-2)에 기재된 경쇄 가변영역 서열에 도입되는 플렉시블 잔기의 비한정적인 예로서, 표 1 또는 표 2에 기재된 아미노산 잔기를 들 수 있다.
Figure pat00001
Figure pat00002
본 명세서에 있어서는 플렉시블 잔기란, 공지의 및/또는 천연 항체 또는 항원 결합 도메인의 아미노산 서열을 비교한 경우에, 그 위치에서 제시되는 몇 개의 상이한 아미노산을 갖는 경쇄 및 중쇄 가변영역 상의 아미노산이 매우 다양한 위치에 존재하는 아미노산 잔기의 변형을 말한다. 매우 다양한 위치는 일반적으로 CDR영역에 존재한다. 일태양에서는 공지의 및/또는 천연 항체의 매우 다양한 위치를 결정할 때는 Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health Bethesda Md.) (1987년 및 1991년)가 제공하는 데이터가 유효하다. 또한 인터넷 상의 복수의 데이터베이스(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/, http://www.bioinf.org.uk/abs/index.html)에서는 수집된 다수의 인간 경쇄 및 중쇄의 서열과 그 배치가 제공되어 있어, 이들 서열과 그 배치의 정보는 본 발명에 있어서의 매우 다양한 위치의 결정에 유용하다. 본 발명에 의하면, 아미노산이 어느 위치에서 바람직하게는 약 2 내지 약 20, 바람직하게는 약 3 내지 약 19, 바람직하게는 약 4 내지 약 18, 바람직하게는 5 내지 17, 바람직하게는 6 내지 16, 바람직하게는 7 내지 15, 바람직하게는 8 내지 14, 바람직하게는 9 내지 13, 바람직하게는 10 내지 12개의 가능한 상이한 아미노산 잔기의 다양성을 갖는 경우는 그 위치는 매우 다양하다고 할 수 있다. 몇 개의 실시태양에서는 어느 아미노산 위치는 바람직하게는 적어도 약 2, 바람직하게는 적어도 약 4, 바람직하게는 적어도 약 6, 바람직하게는 적어도 약 8, 바람직하게는 약 10, 바람직하게는 약 12의 가능한 상이한 아미노산 잔기의 다양성을 가질 수 있다.
또한 상기 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입된 경쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시킴으로써도 본 발명의 복수의 서로 서열이 다른 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리가 제작될 수 있다. 이러한 비한정적인 예로서, 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는, 예를 들면 서열번호：46(Vk1), 서열번호：47(Vk2), 서열번호：48(Vk3), 서열번호：49(Vk4) 등의 생식세포계열의 특정 잔기가 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기로 치환된 경쇄 가변영역 서열과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합한 라이브러리를 적합하게 들 수 있다. 당해 아미노산 잔기의 비한정의 예로서 경쇄의 CDR1에 포함되는 아미노산 잔기가 예시된다. 그 밖에도 당해 아미노산 잔기의 비한정의 예로서 경쇄의 CDR2에 포함되는 아미노산 잔기가 예시된다. 또한 당해 아미노산 잔기의 비한정의 다른 예로서 경쇄의 CDR3에 포함되는 아미노산 잔기도 또한 예시된다.
상기와 같이 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR1에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 경쇄 가변영역의 CDR1 중의 EU 넘버링으로 표시되는 30번 위치, 31번 위치 및/또는 32번 위치의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR2에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 경쇄 가변영역의 CDR2 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 50번 위치의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR3에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 경쇄 가변영역의 CDR3 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 92번 위치의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 이들 아미노산 잔기가 칼슘 결합 모티브를 형성 및/또는 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 한, 이들 아미노산 잔기가 단독으로 포함될 수 있고, 이들 아미노산이 둘 이상 조합되어 포함될 수 있다. 또한 복수 개의 칼슘 이온 결합 부위를 가져, 분자 진화상 공통의 기원으로부터 유래한 것으로 생각되는 트로포닌 C, 카모듈린, 파브알부민, 미오신 경쇄 등이 알려져 있고, 그 결합 모티브가 포함되도록 경쇄 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3를 설계하는 것도 가능하다. 예를 들면 상기 목적으로 카드헤린 도메인, 카모듈린에 포함되는 EF 핸드, Protein kinase C에 포함되는 C2 도메인, 혈액 응고 단백질 FactorIX에 포함되는 Gla 도메인, 아시알로당단백질 수용체나 만노오스 결합 수용체에 포함되는 C형 렉틴, LDL 수용체에 포함되는 A 도메인, 아넥신, 트롬보스폰딘 3형 도메인 및 EGF 유사 도메인이 적절히 사용될 수 있다.
상기 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입된 경쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시키는 경우에도, 상기와 동일하게 플렉시블 잔기가 당해 경쇄 가변영역의 서열에 포함되도록 설계하는 것도 가능하다. 본 발명의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성이 이온 농도의 조건에 따라 변화되는 한, 당해 플렉시블 잔기의 수 및 위치는 특정 태양에 한정되지 않는다. 즉, 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR서열 및/또는 FR서열에 하나 또는 그 이상의 플렉시블 잔기가 포함될 수 있다. 예를 들면 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는, 경쇄 가변영역 서열에 도입되는 플렉시블 잔기의 비한정적인 예로서, 표 1 또는 표 2에 기재된 아미노산 잔기를 들 수 있다.
조합되는 중쇄 가변영역의 예로서, 랜덤화 가변영역 라이브러리를 적합하게 들 수 있다. 랜덤화 가변영역 라이브러리의 제작방법은 공지의 방법이 적절히 조합된다. 본 발명의 비한정의 일태양에서는 특정 항원으로 면역된 동물, 감염증 환자나 백신 접종하여 혈중 항체가가 상승한 인간, 암환자, 자기면역 질환의 림프구 유래의 항체 유전자를 토대로 구축된 면역 라이브러리가 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 적합하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 게놈 DNA에 있어서의 V 유전자나 재구축되어 기능적인 V 유전자의 CDR서열이 적당한 길이의 코돈 세트를 코드하는 서열을 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드 세트로 치환된 합성 라이브러리도 또한 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 적합하게 사용될 수 있다. 이 경우, 중쇄의 CDR3의 유전자 서열의 다양성이 관찰되는 것으로부터, CDR3의 서열만을 치환하는 것도 또한 가능하다. 항원 결합 분자의 가변영역에 있어서 아미노산의 다양성을 만들어내는 기준은 항원 결합 분자의 표면에 노출된 위치의 아미노산 잔기에 다양성을 갖게 하는 것이다. 표면에 노출된 위치란 항원 결합 분자의 구조, 구조의 조화 및/또는 모델화된 구조에 기초하여 표면 노출이 가능 및/또는 항원과의 접촉이 가능하다고 판단되는 위치를 말하는데, 일반적으로는 그의 CDR이다. 바람직하게는 표면에 노출된 위치는 InsightII 프로그램(Accelrys)과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 항원 결합 분자의 3차원 모델로부터의 좌표를 사용하여 결정된다. 표면에 노출된 위치는 당 기술분야에서 공지의 알고리즘(예를 들면 Lee 및 Richards(J.Mol.Biol. (1971) 55, 379-400), Connolly(J.Appl.Cryst. (1983) 16, 548-558))을 사용하여 결정될 수 있다. 표면에 노출된 위치의 결정은 단백질 모델링에 적합한 소프트웨어 및 항체로부터 얻어지는 3차원 구조 정보를 사용하여 행해질 수 있다. 이러한 목적을 위해 이용할 수 있는 소프트웨어로서 SYBYL 생체 고분자 모듈 소프트웨어(Tripos Associates)를 적합하게 들 수 있다. 일반적으로 또한 바람직하게는 알고리즘이 유저의 입력 사이즈 파라미터를 필요로 하는 경우는, 계산에 있어서 사용되는 프로브의 「사이즈」는 반경 약 1.4 옹스트롬 이하로 설정된다. 또한 PC용 소프트웨어를 사용한 표면에 노출된 영역 및 구역의 결정법이 Pacios(Comput.Chem. (1994) 18 (4), 377-386 및 J.Mol.Model. (1995) 1, 46-53)에 기재되어 있다.
또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 건강한 정상인의 림프구 유래의 항체 유전자로부터 구축되고, 그 레퍼토리에 바이어스를 포함하지 않는 항체 서열인 나이브 서열로 이루어지는 나이브 라이브러리도 또한 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 특히 적합하게 사용될 수 있다(Gejima 등(Human Antibodies (2002) 11,121-129) 및 Cardoso 등(Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)). 본 발명에서 기재되는 나이브 서열을 포함하는 아미노산 서열이란 이러한 나이브 라이브러리로부터 취득되는 아미노산 서열을 말한다.
본 발명의 하나의 태양에서는 「이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」가 사전에 포함되어 있는 프레임워크 서열로서 선택된 중쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 경쇄 가변영역을 조합시킴으로써, 본 발명의 복수의 서로 서열이 다른 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리로부터 본 발명의 항원 결합 도메인이 취득될 수 있다. 이러한 비한정적인 예로서, 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는, 예를 들면 서열번호：50(6RL#9-IgG1) 또는 서열번호：51(6KC4-1#85-IgG1)에 기재된 중쇄 가변영역 서열과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 경쇄 가변영역을 조합한 라이브러리를 적합하게 들 수 있다. 또한 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 경쇄 가변영역 대신에 생식세포계열의 서열을 갖는 경쇄 가변영역 중에서 적절히 선택함으로써 제작될 수 있다. 예를 들면 서열번호：50(6RL#9-IgG1) 또는 서열번호：51(6KC4-1#85-IgG1)에 기재된 중쇄 가변영역 서열과 생식세포계열의 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 조합한 라이브러리를 적합하게 들 수 있다.
또한 상기 「이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」가 사전에 포함되어 있는 프레임워크 서열로서 선택된 중쇄 가변영역의 서열에 플렉시블 잔기가 포함되도록 설계하는 것도 가능하다. 본 발명의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성이 이온 농도의 조건에 따라 변화되는 한, 당해 플렉시블 잔기의 수 및 위치는 특정 태양에 한정되지 않는다. 즉, 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR서열 및/또는 FR서열에 하나 또는 그 이상의 플렉시블 잔기가 포함될 수 있다. 예를 들면 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는, 서열번호：50(6RL#9-IgG1)에 기재된 중쇄 가변영역 서열에 도입되는 플렉시블 잔기의 비한정적인 예로서, 중쇄 CDR1 및 CDR2의 모든 아미노산 잔기 외에 중쇄 CDR3의 95번 위치, 96번 위치 및/또는 100a번 위치 이외의 CDR3의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또는 서열번호：51(6KC4-1#85-IgG1)에 기재된 중쇄 가변영역 서열에 도입되는 플렉시블 잔기의 비한정적인 예로서, 중쇄 CDR1 및 CDR2의 모든 아미노산 잔기 외에 중쇄 CDR3의 95번 위치 및/또는 101번 위치 이외의 CDR3의 아미노산 잔기도 또한 들 수 있다.
또한 상기 「이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」가 도입된 중쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 경쇄 가변영역 또는 생식세포계열의 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 조합시킴으로써도, 복수의 서로 서열이 다른 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리가 제작될 수 있다. 이러한 비한정적인 예로서, 이온 농도가 칼슘 이온 농도인 경우에는, 예를 들면 중쇄 가변영역의 특정 잔기가 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기로 치환된 중쇄 가변영역 서열과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 경쇄 가변영역 또는 생식세포계열의 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 조합한 라이브러리를 적합하게 들 수 있다. 당해 아미노산 잔기의 비한정의 예로서 중쇄의 CDR1에 포함되는 아미노산 잔기가 예시된다. 그 밖에도, 당해 아미노산 잔기의 비한정의 예로서 중쇄의 CDR2에 포함되는 아미노산 잔기가 예시된다. 또한 당해 아미노산 잔기의 비한정의 다른 예로서 중쇄의 CDR3에 포함되는 아미노산 잔기도 또한 예시된다. 당해 아미노산 잔기가 중쇄의 CDR3에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 중쇄 가변영역의 CDR3 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 95번 위치, 96번 위치, 100a번 위치 및/또는 101번 위치의 아미노산을 들 수 있다. 또한 이들 아미노산 잔기가 칼슘 결합 모티브를 형성 및/또는 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 한, 이들 아미노산 잔기가 단독으로 포함될 수 있고, 이들 아미노산이 둘 이상 조합되어 포함될 수 있다.
상기의 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기가 도입된 중쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 경쇄 가변영역 또는 생식세포계열의 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 조합시키는 경우에도, 상기와 동일하게 플렉시블 잔기가 당해 중쇄 가변영역의 서열에 포함되도록 설계하는 것도 가능하다. 본 발명의 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성이 이온 농도의 조건에 따라 변화되는 한, 당해 플렉시블 잔기의 수 및 위치는 특정 태양에 한정되지 않는다. 즉, 중쇄의 CDR서열 및/또는 FR서열에 하나 또는 그 이상의 플렉시블 잔기가 포함될 수 있다. 또한 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산 잔기 이외의 중쇄 가변영역의 CDR1, CDR2 및/또는 CDR3의 아미노산 서열로서 랜덤화 가변영역 라이브러리도 적합하게 사용될 수 있다. 경쇄 가변영역으로서 생식세포계열의 서열이 사용되는 경우에는, 예를 들면 서열번호：46(Vk1), 서열번호：47(Vk2), 서열번호：48(Vk3), 서열번호：49(Vk4) 등의 생식세포계열의 서열을 비한정의 예로서 들 수 있다.
상기의 칼슘 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산으로서는, 칼슘 결합 모티브를 형성하는 한 어느 아미노산도 적합하게 사용될 수 있는데, 그러한 아미노산으로서는 구체적으로 전자 공여성을 갖는 아미노산을 들 수 있다. 이러한 전자 공여성을 갖는 아미노산으로서는 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 아스파라긴산 또는 글루타민산이 적합하게 예시된다.
또한 본 발명의 「이온 농도의 조건」으로서, 예를 들면 「pH의 조건」을 드는 것도 가능하다. pH의 조건은 수소이온 농도의 조건이라고도 할 수 있다. 본 발명에서 프로톤 즉 수소원자의 원자핵의 농도의 조건은 수소지수(pH)의 조건과도 같은 정의로 취급된다. 수용액 중의 수소이온의 활동량을 aH+로 나타내면, pH는 -log10aH+로 정의된다. 수용액 중의 이온 강도가 (예를 들면 10-3보다) 낮으면 aH+는 수소이온 강도와 거의 동등하다. 예를 들면 25℃, 1기압에 있어서의 물의 이온 곱(ionic product)은 Kw=aH+aOH=10-14이기 때문에, 순수(pure water)의 경우는 aH+=aOH=10-7이다. 이 경우의 pH=7이 중성으로, pH가 7보다 작은 수용액은 산성, pH가 7보다 큰 수용액은 알칼리성이다.
본 발명에 있어서는 이온 농도의 조건으로서 pH의 조건이 사용되는 경우에는, pH의 조건으로서 고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역의 조건과 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역의 조건을 들 수 있다. 본 발명의 항원 결합 분자에 포함되는 항원 결합 도메인의 항원에 대한 결합 활성이 pH의 조건에 따라 결합 활성이 변화된다는 것은, 고수소이온 농도 또는 저pH(pH 산성역)와 저수소이온 농도 또는 고pH(pH 중성역)의 조건의 차이에 의해 항원 결합 분자에 포함되는 항원 결합 도메인의 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 것을 말한다. 예를 들면 pH 산성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성보다도 pH 중성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성 쪽이 높은 경우를 들 수 있다. 또한 pH 중성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성보다도 pH 산성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성 쪽이 높은 경우도 또한 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 pH 중성역이란 특별히 일의적인 수치에 한정되는 것은 아니나, 적합하게는 pH 6.7 내지 pH 10.0 사이에서 선택될 수 있다. 또한 다른 태양에서는 pH 6.7 내지 pH 9.5 사이에서 선택될 수 있다. 또한 다른 태양에서는 pH 7.0 내지 pH 9.0 사이에서 선택될 수 있고, 다른 태양에서는 pH 7.0 내지 pH 8.0 사이에서 선택될 수 있다. 특히 생체 내의 혈장 중(혈중)에서의 pH에 가까운 pH 7.4를 적합하게 들 수 있다.
본 명세서에 있어서 pH 산성역이란 특별히 일의적인 수치에 한정되는 것은 아니나, 적합하게는 pH 4.0 내지 pH 6.5 사이에서 선택될 수 있다. 또한 다른 태양에서는 pH 4.5 내지 pH 6.5 사이에서 선택될 수 있다. 또한 다른 태양에서는 pH 5.0 내지 pH 6.5 사이에서 선택될 수 있고, 다른 태양에서는 pH 5.5 내지 pH 6.5 사이에서 선택될 수 있다. 특히 생체 내의 조기 엔도솜 내에서의 이온화 칼슘 농도에 가까운 pH 5.8을 적합하게 들 수 있다.
본 발명에 있어서 고수소이온 농도 또는 저pH(pH 산성역) 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소이온 농도 또는 고pH(pH 중성역) 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮다는 것은, 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 pH 4.0 내지 pH 6.5 사이에서 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 6.7 내지 pH 10.0 사이에서 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미한다. 바람직하게는 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 pH 4.5 내지 pH 6.5 사이에서 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 6.7 내지 pH 9.5 사이에서 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미하고, 보다 바람직하게는 항원 결합 분자의 pH 5.0 내지 pH 6.5 사이에서 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 7.0 내지 pH 9.0 사이에서 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미한다. 또한 바람직하게는 항원 결합 분자의 pH 5.5 내지 pH 6.5 사이에서 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 7.0 내지 pH 8.0 사이에서 선택되는 pH에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미한다. 특히 바람직하게는 생체 내의 조기 엔도솜 내의 pH에 있어서의 항원 결합 활성이 생체 내의 혈장 중 pH에 있어서의 항원 결합 활성보다 약한 것을 의미하고, 구체적으로는 항원 결합 분자의 pH 5.8에서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 7.4에서의 항원에 대한 결합 활성보다 약한 것을 의미한다.
pH의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인 또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되어 있는지 여부는, 예를 들면 상기 결합 활성의 부분에서 기재된 바와 같은 공지의 측정방법을 사용함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면 당해 측정 시에 상이한 pH의 조건하에서의 결합 활성이 측정된다. 예를 들면 pH 산성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 항원 결합 도메인 또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 결합 활성보다도 pH 중성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 상기 도메인 또는 상기 결합 활성 쪽이 높게 변화되는 것을 확인하기 위해서는, pH 산성역 및 pH 중성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 상기 도메인 또는 상기 분자의 결합 활성이 비교된다.
또한 본 발명에 있어서 「고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮다」고 하는 표현은, 항원 결합 도메인 또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 높다고 표현하는 것도 가능하다. 또한 본 발명에 있어서는 「고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮다」를 「고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합능보다도 약하다」고 기재하는 경우도 있고, 또한 「고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 저하시킨다」를 「고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합능보다도 약하게 한다」고 기재하는 경우도 있다.
항원에 대한 결합 활성을 측정할 때의 수소이온 농도 또는 pH 이외의 조건은 당업자가 적절히 선택하는 것이 가능하고, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 HEPES 버퍼, 37℃의 조건에 있어서 측정하는 것이 가능하다. 예를 들면 Biacore(GE Healthcare) 등을 사용하여 측정하는 것이 가능하다. 항원 결합 도메인 또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자와 항원의 결합 활성의 측정은, 항원이 가용형 항원인 경우는 항원 결합 도메인 또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 고정화한 칩으로 항원을 애널라이트로서 흐르게 함으로써 가용형 항원으로의 결합 활성을 평가하는 것이 가능하고, 항원이 막형 항원인 경우는 항원을 고정화한 칩으로 항원 결합 도메인 또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 애널라이트로서 흐르게 함으로써 막형 항원으로의 결합 활성을 평가하는 것이 가능하다.
본 발명의 항원 결합 분자에 있어서 고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 약한 한, 고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성과 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합 활성의 비는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 항원에 대한 고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 KD(Dissociation constant：해리상수)와 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 KD의 비인 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 10 이상이며, 더욱 바람직하게는 KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값이 40 이상이다. KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4)의 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술에 있어서 제작 가능한 한 400, 1000, 10000 등 어떠한 값이어도 된다.
또한 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성과 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성의 비를 나타내는 다른 지표로서, 예를 들면 해리속도상수인 kd(Dissociation rate constant：해리속도상수)도 또한 적합하게 사용될 수 있다. 결합 활성의 비를 나타내는 지표로서 KD(해리상수) 대신에 kd(해리속도상수)를 사용하는 경우, 항원에 대한 고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 kd(해리속도상수)와 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 kd(해리속도상수)의 비인 kd(pH 산성역 조건에 있어서의)/kd(pH 중성역 조건에 있어서의) 값은 바람직하게는 2 이상이고, 더욱 바람직하게는 5 이상이며, 더욱 바람직하게는 10 이상이고, 보다 바람직하게는 30 이상이다. Kd(pH 산성역 조건에 있어서의)/kd(pH 중성역 조건에 있어서의) 값의 상한은 특별히 한정되지 않고, 당업자의 기술 상식에 있어서 제작 가능한 한 50, 100, 200 등 어떠한 값이어도 된다.
항원 결합 활성의 값으로서 항원이 가용형 항원인 경우는 kd(해리속도상수)를 사용하는 것이 가능하고, 항원이 막형 항원인 경우는 겉보기 kd(Apparent dissociation rate constant：겉보기 해리속도상수)를 사용하는 것이 가능하다. kd(해리속도상수) 및 겉보기 kd(겉보기 해리속도상수)는 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), 플로우 사이토미터 등을 사용하는 것이 가능하다. 또한 본 발명에 있어서 다른 수소이온 농도 즉 pH에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 당해 도메인을 포함하는 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성을 측정할 때는 수소이온 농도 즉 pH 이외의 조건은 동일하게 하는 것이 바람직하다.
예를 들면 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는, 아래의 공정 (a) 내지 (c)를 포함하는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.
(a) pH 산성역 조건에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(b) pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 얻는 공정,
(c) pH 산성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 선택하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는, 아래의 공정 (a) 내지 (c)를 포함하는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자 또는 그들의 라이브러리의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.
(a) pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자 또는 그들의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 pH 산성역의 조건에 두는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 해리된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는, 아래의 공정 (a) 내지 (d)를 포함하는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자 또는 그들의 라이브러리의 스크리닝에 의해 취득될 수 있다.
(a) pH 산성역의 조건에서 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합하지 않는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 선택하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 선택된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 pH 중성역의 조건에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는, 아래의 공정 (a) 내지 (c)를 포함하는 스크리닝 방법에 의해 취득될 수 있다.
(a) 항원을 고정한 칼럼에 pH 중성역의 조건에서 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 라이브러리를 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 칼럼에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 pH 산성역의 조건에서 칼럼으로부터 용출하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 용출된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는, 아래의 공정 (a) 내지 (d)를 포함하는 스크리닝 방법에 의해 취득될 수 있다.
(a) 항원을 고정한 칼럼에 pH 산성역의 조건에서 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 라이브러리를 통과시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 칼럼에 결합되지 않고 용출된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 회수하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 회수된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 pH 중성역의 조건에서 항원에 결합시키는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는 공정.
또한 본 발명이 제공하는 하나의 태양인 고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는, 아래의 공정 (a) 내지 (d)를 포함하는 스크리닝 방법에 의해 취득될 수 있다.
(a) pH 중성역의 조건에서 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 라이브러리를 항원에 접촉시키는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 항원에 결합한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 취득하는 공정,
(c) 상기 공정 (b)에서 취득한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 pH 산성역의 조건에 두는 공정,
(d) 상기 공정 (c)에서 항원 결합 활성이 상기 공정 (b)에서 선택한 기준보다 약한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 단리하는 공정.
또한 상기 공정은 2회 이상 반복되어도 된다. 따라서 본 발명에 의해 전술한 스크리닝 방법에 있어서 (a) 내지 (c) 또는 (a) 내지 (d)의 공정을 2회 이상 반복하는 공정을 추가로 포함하는 스크리닝 방법에 의해 취득된 pH 산성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자가 제공된다. (a) 내지 (c) 또는 (a) 내지 (d)의 공정이 반복되는 횟수는 특별히 한정되지 않으나, 통상 10회 이내이다.
본 발명의 스크리닝 방법에 있어서 고수소이온 농도 조건 또는 저pH 즉 pH 산성역에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 항원 결합 활성은 pH가 4.0 내지 6.5 사이의 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 pH로서 pH가 4.5 내지 6.6 사이의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 다른 바람직한 pH로서 pH가 5.0 내지 6.5 사이의 항원 결합 활성, 더욱이 pH가 5.5 내지 6.5 사이의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 보다 바람직한 pH로서 생체 내의 조기 엔도솜 내의 pH를 들 수 있고, 구체적으로는 pH 5.8에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 또한 저수소이온 농도 조건 또는 고pH 즉 pH 중성역에 있어서의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 항원 결합 활성은 pH가 6.7 내지 10 사이의 항원 결합 활성이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직한 pH로서 pH가 6.7 내지 9.5 사이의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 다른 바람직한 pH로서 pH가 7.0 내지 9.5 사이의 항원 결합 활성, 더욱이 pH가 7.0 내지 8.0 사이의 항원 결합 활성을 들 수 있다. 보다 바람직한 pH로서 생체 내의 혈장 중에서의 pH를 들 수 있고, 구체적으로는 pH가 7.4에 있어서의 항원 결합 활성을 들 수 있다.
항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 항원 결합 활성은 당업자에게 공지의 방법에 의해 측정하는 것이 가능하고, 이온화 칼슘 농도 이외의 조건에 대해서는 당업자가 적절히 결정하는 것이 가능하다. 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 항원 결합 활성은 KD(Dissociation constant：해리상수), 겉보기 KD(Apparent dissociation constant：겉보기 해리상수), 해리속도인 kd(Dissociation rate：해리속도상수) 또는 겉보기 kd(Apparent dissociation：겉보기 해리속도상수) 등으로서 평가하는 것이 가능하다. 이들은 당업자 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 Biacore(GE healthcare), 스캐차드 플롯, FACS 등을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 선택하는 공정은, 고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 낮은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 선택하는 공정과 동일한 의미이다.
저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 한, 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성과 고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성의 차는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성의 2배 이상이고, 더욱 바람직하게는 10배 이상이며, 보다 바람직하게는 40배 이상이다.
상기 스크리닝 방법에 의해 스크리닝되는 본 발명의 수소이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성을 변화시키는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자는 어떻게 조제되어도 되고, 예를 들면 사전에 존재하고 있는 항원 결합 분자, 사전에 존재하고 있는 라이브러리(파지라이브러리 등), 동물로의 면역으로부터 얻어진 하이브리도마나 면역동물로부터의 B세포로부터 제작된 항체 또는 라이브러리, 이들 항체나 라이브러리에 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산 변이를 도입한 항체 또는 라이브러리(측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산) 또는 비천연 아미노산의 함유율을 높게 한 라이브러리나 특정 개소에 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산) 또는 비천연 아미노산 변이를 도입한 라이브러리 등) 등을 사용하는 것이 가능하다.
동물로의 면역으로부터 얻어진 하이브리도마나 면역동물로부터의 B세포로부터 제작된 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자로부터, 저수소이온 농도 또는 고pH 즉 pH 중성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성이 고수소이온 농도 또는 저pH 즉 pH 산성역 조건에 있어서의 항원 결합 활성보다 높은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 취득하는 방법으로서, 예를 들면 국제공개 WO2009/125825에서 기재된 바와 같은 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자 중의 아미노산의 하나 이상이 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산 변이로 치환되어 있거나 또는 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자 중에 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산이 삽입되어 있는 항원 결합 분자 또는 항원 결합 분자를 적합하게 들 수 있다.
측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이가 도입되는 위치는 특별히 한정되지 않고, 치환 또는 삽입 전과 비교하여 pH 산성역에 있어서의 항원 결합 활성이 pH 중성역에 있어서의 항원 결합 활성보다 약해지는 (KD(pH 산성역)/KD(pH 중성역)의 값이 커지거나 또는 kd(pH 산성역)/kd(pH 중성역)의 값이 커지는) 한 어떠한 부위여도 된다. 예를 들면 항원 결합 분자가 항체인 경우에는, 항체의 가변영역이나 CDR 등을 적합하게 들 수 있다. 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로 치환되는 아미노산의 수 또는 삽입되는 아미노산의 수는 당업자가 적절히 결정할 수 있고, 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 하나의 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산에 의해 치환될 수 있으며, 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 하나의 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산이 삽입될 수 있고, 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 2개 이상의 복수의 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산에 의해 치환될 수 있으며, 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 2개 이상의 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산이 삽입될 수 있다. 또한 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로의 치환 또는 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 삽입 이외에 다른 아미노산의 결실, 부가, 삽입 및/또는 치환 등이 동시에 행해질 수 있다. 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로의 치환 또는 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 삽입은 당업자에게 공지의 알라닌 scanning의 알라닌을 히스티딘 등으로 치환한 히스티딘 scanning 등의 방법으로 랜덤으로 행해질 수 있고, 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 치환 또는 삽입의 변이가 랜덤으로 도입된 항원 결합 도메인 또는 항체 중에서, 변이 전과 비교하여 KD(pH 산성역)/KD(pH 중성역) 또는 kd(pH 산성역)/kd(pH 중성역)의 값이 커진 항원 결합 분자가 선택될 수 있다.
상기와 같이 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로의 변이가 행해지고, 또한 pH 산성역에서의 항원 결합 활성이 pH 중성역에서의 항원 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 분자의 바람직한 예로서, 예를 들면 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로의 변이 후의 pH 중성역에서의 항원 결합 활성이 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로의 변이 전의 pH 중성역에서의 항원 결합 활성과 동등한 항원 결합 분자를 적합하게 들 수 있다. 본 발명에 있어서 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이 후의 항원 결합 분자가 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이 전의 항원 결합 분자와 동등한 항원 결합 활성을 갖는다는 것은, 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이 전의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성을 100%로 한 경우에, 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이 후의 항원 결합 분자의 항원 결합 활성이 적어도 10% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상인 것을 말한다. 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이 후의 pH 7.4에서의 항원 결합 활성이 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 변이 전의 pH 7.4에서의 항원 결합 활성보다 높아져도 된다. 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산으로의 치환 또는 삽입에 의해 항원 결합 분자의 항원 결합 활성이 낮아진 경우에는, 항원 결합 분자 중의 1 또는 복수의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 등에 의해 항원 결합 활성이 그 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 치환 또는 삽입 전의 항원 결합 활성과 동등해질 수 있다. 본 발명에 있어서는 이러한 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산(예를 들면 히스티딘이나 글루타민산)이나 비천연 아미노산의 치환 또는 삽입 후에 1 또는 복수의 아미노산의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입을 행함으로써 결합 활성이 동등해진 항원 결합 분자도 포함된다.
본 발명의 하나의 태양으로서 「수소이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」가 도입된 경쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시킴으로써도, 본 발명의 복수의 서로 서열이 다른 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자를 포함하는 라이브러리가 제작될 수 있다.
당해 아미노산 잔기의 비한정의 예로서 경쇄의 CDR1에 포함되는 아미노산 잔기가 예시된다. 그 밖에도 당해 아미노산 잔기의 비한정의 예로서 경쇄의 CDR2에 포함되는 아미노산 잔기가 예시된다. 또한 당해 아미노산 잔기의 비한정의 다른 예로서 경쇄의 CDR3에 포함되는 아미노산 잔기도 또한 예시된다.
상기와 같이, 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR1에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 경쇄 가변영역의 CDR1 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 24번 위치, 27번 위치, 28번 위치, 31번 위치, 32번 위치 및/또는 34번 위치의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR2에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 경쇄 가변영역의 CDR2 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 50번 위치, 51번 위치, 52번 위치, 53번 위치, 54번 위치, 55번 위치 및/또는 56번 위치의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 당해 아미노산 잔기가 경쇄의 CDR3에 포함되는 아미노산 잔기의 비한정의 예로서, 경쇄 가변영역의 CDR3 중의 Kabat 넘버링으로 표시되는 89번 위치, 90번 위치, 91번 위치, 92번 위치, 93번 위치, 94번 위치 및/또는 95A번 위치의 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 이들 아미노산 잔기가 수소이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성이 변화되는 한, 이들 아미노산 잔기가 단독으로 포함될 수 있고, 이들 아미노산이 둘 이상 조합되어 포함될 수 있다.
상기 「수소이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 하나 이상의 아미노산 잔기」가 도입된 경쇄 가변영역과 랜덤화 가변영역 서열 라이브러리로서 제작된 중쇄 가변영역을 조합시키는 경우에도, 상기와 동일하게 플렉시블 잔기가 당해 경쇄 가변영역의 서열에 포함되도록 설계하는 것도 가능하다. 본 발명의 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 항원에 대한 결합 활성이 수소이온 농도의 조건에 따라 변화되는 한, 당해 플렉시블 잔기의 수 및 위치는 특정 태양에 한정되지 않는다. 즉, 중쇄 및/또는 경쇄의 CDR서열 및/또는 FR서열에 하나 또는 그 이상의 플렉시블 잔기가 포함될 수 있다. 예를 들면 경쇄 가변영역 서열에 도입되는 플렉시블 잔기의 비한정적인 예로서, 표 3 또는 표 4에 기재된 아미노산 잔기를 들 수 있다. 또한 수소이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산 잔기나 플렉시블 잔기 이외의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열로서는, 비한정의 예로서 Vk1(서열번호：46), Vk2(서열번호：47), Vk3(서열번호：48), Vk4(서열번호：49) 등의 생식세포계열의 서열이 적합하게 사용될 수 있다.
Figure pat00003
Figure pat00004
상기의 수소이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 항원 결합 도메인 또는 항원 결합 분자의 결합 활성을 변화시키는 아미노산 잔기로서는 어느 아미노산 잔기도 적합하게 사용될 수 있으나, 이러한 아미노산 잔기로서는, 구체적으로 측쇄의 pKa가 4.0-8.0인 아미노산을 들 수 있다. 이러한 전자 공여성을 갖는 아미노산으로서는 히스티딘 또는 글루타민산 등의 천연의 아미노산 외에, 히스티딘 아날로그(US2009/0035836) 또는 m-NO2-Tyr(pKa 7.45), 3,5-Br2-Tyr(pKa 7.21) 또는 3,5-I2-Tyr(pKa 7.38) 등의 비천연의 아미노산(Bioorg. Med. Chem. (2003) 11 (17), 3761-3768이 적합하게 예시된다. 또한 당해 아미노산 잔기의 특히 적합한 예로서는 측쇄의 pKa가 6.0-7.0인 아미노산을 들 수 있다. 이러한 전자 공여성을 갖는 아미노산으로서는 히스티딘이 적합하게 예시된다.
조합되는 중쇄 가변영역의 예로서 랜덤화 가변영역 라이브러리를 적합하게 들 수 있다. 랜덤화 가변영역 라이브러리의 제작방법은 공지의 방법이 적절히 조합된다. 본 발명의 비한정의 일태양에서는 특정 항원으로 면역된 동물, 감염증 환자나 백신 접종하여 혈중 항체가가 상승한 인간, 암환자, 자기면역 질환의 림프구 유래의 항체 유전자를 토대로 구축된 면역 라이브러리가 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 적합하게 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 상기와 동일하게 게놈 DNA에 있어서의 V 유전자나 재구축되어 기능적인 V 유전자의 CDR서열이 적당한 길이의 코돈 세트를 코드하는 서열을 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드 세트로 치환된 합성 라이브러리도 또한 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 적합하게 사용될 수 있다. 이 경우, 중쇄의 CDR3의 유전자 서열의 다양성이 관찰되는 것으로부터, CDR3의 서열만을 치환하는 것도 또한 가능하다. 항원 결합 분자의 가변영역에 있어서 아미노산의 다양성을 만들어내는 기준은 항원 결합 분자의 표면에 노출된 위치의 아미노산 잔기에 다양성을 갖게 하는 것이다. 표면에 노출된 위치란 항원 결합 분자의 구조, 구조의 조화 및/또는 모델화된 구조에 기초하여 표면 노출이 가능 및/또는 항원과의 접촉이 가능하다고 판단되는 위치를 말하는데, 일반적으로는 그의 CDR이다. 바람직하게는 표면에 노출된 위치는 InsightII 프로그램(Accelrys)과 같은 컴퓨터 프로그램을 사용하여 항원 결합 분자의 3차원 모델로부터의 좌표를 사용하여 결정된다. 표면에 노출된 위치는 당 기술분야에서 공지의 알고리즘(예를 들면 Lee 및 Richards(J.Mol.Biol. (1971) 55, 379-400), Connolly(J.Appl.Cryst. (1983) 16, 548-558))을 사용하여 결정될 수 있다. 표면에 노출된 위치의 결정은 단백질 모델링에 적합한 소프트웨어 및 항체로부터 얻어지는 3차원 구조 정보를 사용하여 행해질 수 있다. 이러한 목적을 위해 이용할 수 있는 소프트웨어로서 SYBYL 생체 고분자 모듈 소프트웨어(Tripos Associates)를 적합하게 들 수 있다. 일반적으로 또한 바람직하게는 알고리즘이 유저의 입력 사이즈 파라미터를 필요로 하는 경우는, 계산에 있어서 사용되는 프로브의 「사이즈」는 반경 약 1.4 옹스트롬 이하로 설정된다. 또한 PC용 소프트웨어를 사용한 표면에 노출된 영역 및 구역의 결정법이 Pacios(Comput.Chem. (1994) 18 (4), 377-386 및 J.Mol.Model. (1995) 1, 46-53)에 기재되어 있다.
또한 본 발명의 비한정의 일태양에서는 건강한 정상인의 림프구 유래의 항체 유전자로부터 구축되고, 그 레퍼토리에 바이어스를 포함하지 않는 항체 서열인 나이브 서열로 이루어지는 나이브 라이브러리도 또한 랜덤화 가변영역 라이브러리로서 특히 적합하게 사용될 수 있다(Gejima 등(Human Antibodies (2002) 11,121-129) 및 Cardoso 등(Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)).
또한 추가로 pH 산성역 조건하에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 증강시키기 위한 아미노산 개변을 조합시킬 수 있다. 보다 구체적으로는 예를 들면 pH 산성역 조건하에 있어서의 인간 FcRn 결합 활성을 증강시키기 위해 사용되는 개변으로서는, IgG 항체의 EU 넘버링으로 표시되는 428번 위치의 Met를 Leu로 치환하고, 434번 위치의 Asn을 Ser로 치환하는 방법(Nat Biotechnol, 2010 28:157-159.), 434번 위치의 Asn을 Ala로 치환하는 방법(Drug Metab Dispos. 2010 Apr;38(4):600-5.), 252번 위치의 Met를 Tyr로 치환하고, 254번 위치의 Ser을 Thr로 치환하며, 256번 위치의 Thr을 Glu로 치환하는 방법(J Biol Chem, 2006, 281:23514-23524), 250번 위치의 Thr을 Gln으로 치환하고, 428번 위치의 Met를 Leu로 치환하는 방법(J Immunol. 2006, 176(1):346-56), 434번 위치의 Asn을 His로 치환하는 방법(Clinical Pharmacology & Therapeutics (2011) 89(2):283-290.), 및 WO2010106180, WO2010045193, WO2009058492, WO2008022152, WO2006050166, WO2006053301, WO2006031370, WO2005123780, WO2005047327, WO2005037867, WO2004035752, WO2002060919 등에 있어서 기재되는 바와 같은 개변을 사용함으로써도 실시가 가능할 것으로 생각된다.
또한 최근 들어 인간화 항CD4 항체에 대해 pH 산성역 조건하에 있어서 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 증강시키고 혈장 중 체류성을 향상시키기 위해, EU 넘버링으로 표시되는 434번 위치의 Asn을 His로 치환한 항체 분자가 류머티즘 인자(Rheumatiod factor, RF)에 대해 결합하는 것이 보고되었다(Clin Pharmacol Ther. 2011 Feb;89(2):283-90). 이 항체는 인간 IgG1의 Fc영역을 가지고 있는데, FcRn에 대한 결합 부위에 위치하는 434번 위치의 Asn을 His로 치환함으로써 그 치환 개소를 인식하는 류머티즘 인자가 결합하는 것이 나타내어져 있다.
전술한 바와 같이, pH 산성역 조건하에 있어서 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 증강시키기 위한 개변으로서 다양한 것이 보고되어 있는데, 이들 개변을 Fc영역 중의 FcRn 결합 부위에 도입함으로써 당해 부위를 인식하는 류머티즘 인자에 대한 결합성을 증강시켜버릴 가능성이 있다.
그러나 Fc영역의 당해 부위에 FcRn에 대한 결합 활성을 저하시키지 않고 류머티즘 인자에 대한 결합 활성만을 저하시키는 개변을 도입함으로써, 류머티즘 인자에 대한 결합성을 갖지 않고 pH 산성역 조건하에 있어서의 인간 FcRn에 대한 결합 활성을 증강시킨 항원 결합 분자를 제작하는 것이 가능하다.
그러한 류머티즘 인자에 대한 결합 활성을 저하시키는 개변으로서는, EU 넘버링으로 표시되는 248-257, 305-314, 342-352, 380-386, 388, 414-421, 423, 425-437, 439, 441-444번 위치로의 개변이 사용된다. 바람직하게는 387, 422, 424, 426, 433, 436, 438, 440번 위치로의 개변이 바람직하게 사용된다. 특히 바람직하게는 422번 위치의 Val을 Glu 또는 Ser로 치환하는 개변, 424번 위치의 Ser을 Arg로 치환하는 개변, 433번 위치의 His를 Asp로 치환하는 개변, 436번 위치의 Tyr을 Thr로 치환하는 개변, 438번 위치의 Gln을 Arg 또는 Lys로 치환하는 개변, 440번 위치의 Ser을 Glu 또는 Asp로 치환하는 개변이 사용된다. 이들 개변은 단독으로 사용되어도 되고, 복수 개소를 조합해서 사용해도 된다.
또는 류머티즘 인자에 대한 결합 활성을 저하시키기 위해 당해 부위에 N형 당쇄의 부가 서열을 도입해도 된다. 구체적으로는 N형 당쇄 부가 서열로서 Asn-Xxx-Ser/Thr(Xxx는 Pro를 제외한 임의의 아미노산)이 알려져 있는데, 이 서열을 Fc영역의 당해 부위에 도입함으로써 N형 당쇄를 부가시켜 N형 당쇄의 입체장애에 의해 RF와의 결합을 저해하는 것이 가능하다. N형 당쇄를 부가하기 위한 개변으로서 바람직하게는 248번 위치의 Lys를 Asn으로 치환하는 개변, 424번 위치의 Ser을 Asn으로 치환하는 개변, 436번 위치의 Tyr을 Asn으로 치환하고 438번 위치의 Gln을 Thr로 치환하는 개변, 438번 위치의 Gln을 Asn으로 치환하는 개변이 사용된다. 특히 바람직하게는 424번 위치의 Ser을 Asn으로 치환하는 개변이 사용된다.
본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 바람직한 예로서 IgG 항체와 같이 적어도 하나의 회합되어 있는 2개의 Fc영역 개변체가 포함되는 폴리펩티드를 들 수 있다. 항체로서 IgG 항체를 사용하는 경우, 그 불변영역의 종류는 한정되지 않고 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 등의 아이소타입(서브클래스)의 IgG를 사용하는 것이 가능하다. 본 발명의 IgG 항체는 바람직하게는 인간 IgG이고, 더욱 바람직하게는 인간 IgG1, 인간 IgG4이며, 인간 IgG1 및 인간 IgG4의 중쇄 불변영역의 아미노산 서열은 공지이다. 인간 IgG1 불변영역으로서는 유전자 다형에 의한 복수의 알로타입 서열이 Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242에 기재되어 있는데, 본 발명에 있어서는 그 중 어느 것이어도 된다.
본 발명에 있어서 아미노산의 개변이란, 치환, 결손, 부가, 삽입 또는 수식 중 어느 하나, 또는 그들의 조합을 의미한다. 본 발명에 있어서는 아미노산의 개변은 아미노산의 변이로 바꿔말하는 것이 가능하며, 동일한 의미로 사용된다.
아미노산 잔기를 치환하는 경우에는, 다른 아미노산 잔기로 치환함으로써 예를 들면 다음의 (a) 내지 (c)와 같은 점에 대해서 개변하는 것을 목적으로 한다.
(a) 시트 구조 또는 나선 구조의 영역에 있어서의 폴리펩티드의 백본 구조；
(b) 표적 부위에 있어서의 전하 또는 소수성, 또는
(c) 측쇄의 크기.
아미노산 잔기는 일반 측쇄의 특성을 토대로 아래의 그룹으로 분류된다：
(1) 소수성：노르로이신, met, ala, val, leu, ile；
(2) 중성 친수성：cys, ser, thr, asn, gln；
(3) 산성：asp, glu；
(4) 염기성：his, lys, arg；
(5) 사슬의 배향에 영향을 미치는 잔기：gly, pro；및
(6) 방향족성：trp, tyr, phe.
이들 각 그룹 내에서의 아미노산 잔기의 치환은 보존적 치환으로 불리는 한편, 타 그룹 간끼리에서의 아미노산 잔기의 치환은 비보존적 치환으로 불린다. 본 발명에 있어서의 치환은 보존적 치환이어도 되고 비보존적 치환이어도 되며, 또한 보존적 치환과 비보존적 치환의 조합이어도 된다.
아미노산 서열의 개변은 당분야에 있어서 공지의 각종 방법으로 조제된다. 이들 방법은 다음의 것으로 한정되는 것은 아니나, 부위 특이적 변이 유도법(Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, and Fritz, HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367, Kunkel, TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492), PCR 변이법, 카세트 변이법 등의 방법에 의해 행할 수 있다.
본 발명의 아미노산의 수식에는 번역 후 수식이 포함된다. 구체적인 번역 후 수식으로서 당쇄의 부가 또는 결손을 나타낼 수 있다. 예를 들면 서열번호：31에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 IgG1 불변영역에 있어서 EU 넘버링의 297번째 아미노산 잔기는 당쇄로 수식된 것일 수 있다. 수식되는 당쇄 구조는 한정되지 않는다. 일반적으로 진핵세포에서 발현되는 항체는 불변영역에 당쇄 수식을 포함한다. 따라서 아래와 같은 세포에서 발현되는 항체는 통상 어떠한 수식으로 수식된다.
·포유동물의 항체 생산 세포
·항체를 코드하는 DNA를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 진핵세포
여기에 나타낸 진핵세포에는 효모나 동물세포가 포함된다. 예를 들면 CHO 세포나 HEK293H 세포는 항체를 코드하는 DNA를 포함하는 발현 벡터로 형질전환하기 위한 대표적인 동물세포이다. 한편, 당해 위치에 당쇄 수식이 없는 것도 본 발명의 불변영역에 포함된다. 불변영역이 당쇄로 수식되어 있지 않은 항체는 항체를 코드하는 유전자를 대장균 등의 원핵 세포로 발현시켜서 얻을 수 있다.
보다 구체적으로는 예를 들면 Fc영역의 당쇄에 시알산을 부가한 것이어도 된다(MAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):519-27.).
또한 본 발명은 전술한 어느 하나에 기재된 Fc영역 개변체를 포함하는 항체를 제공한다.
본 발명에 있어서의 「항체」라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고, 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 한 단일클론 항체(전장 단일클론 항체를 포함한다), 다중클론 항체, 항체 변이체, 항체 단편, 다특이성 항체(다중 특이성 항체)(예를 들면 이특이성 항체(이중 특이성 항체)), 키메라 항체, 인간화 항체 등 어떠한 항체도 포함된다.
본 발명의 항체는 항원의 종류, 항체의 유래 등은 한정되지 않고, 어떠한 항체여도 된다. 항체의 유래로서는 특별히 한정되지 않으나, 인간 항체, 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체 등을 들 수 있다.
항체를 제작하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있는데, 예를 들면 단일클론 항체의 경우 하이브리도마법(Kohler and Milstein, Nature 256:495 (1975)), 재조합 방법(미국특허 제4,816,567호)에 의해 제조해도 된다. 또한 파지 항체 라이브러리로부터 단리해도 된다(Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) ; Marks et al., J.Mol.Biol. 222:581-597 (1991)).
인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체로도 불린다. 구체적으로는 인간 이외의 동물, 예를 들면 마우스 항체의 CDR을 인간 항체에 이식한 인간화 항체 등이 공지이다. 인간화 항체를 얻기 위한 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다. 구체적으로는 마우스의 항체의 CDR을 인간의 FR에 이식하기 위한 방법으로서 예를 들면 Overlap Extension PCR이 공지이다.
3개의 CDR과 4개의 FR이 연결된 항체 가변영역을 코드하는 DNA와 인간 항체 불변영역을 코드하는 DNA를 인프레임으로 융합하도록 발현 벡터 중에 삽입함으로써 인간화 항체 발현용 벡터를 제작할 수 있다. 그 삽입 벡터를 숙주에 도입하여 재조합 세포를 수립한 후에 그 재조합 세포를 배양하고, 그 인간화 항체를 코드하는 DNA를 발현시킴으로써 그 인간화 항체가 그 배양세포의 배양물 중에 생산된다(유럽 특허공개 EP 239400, 국제공개 WO1996/002576 참조).
필요에 따라 재구성 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하도록 FR의 아미노산 잔기를 치환하는 것도 가능하다. 예를 들면 마우스 CDR의 인간 FR로의 이식에 사용한 PCR법을 응용하여 FR에 아미노산 서열의 변이를 도입할 수 있다.
인간 항체 유전자의 모든 레퍼토리를 갖는 형질전환 동물(국제공개 WO1993/012227, WO1992/003918, WO1994/002602, WO1994/025585, WO1996/034096, WO1996/033735 참조)을 면역동물로 하여 DNA 면역에 의해 목적하는 인간 항체가 취득될 수 있다.
또한 인간 항체 라이브러리를 사용하여 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면 인간 항체의 V영역이 단일 사슬 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현된다. 항원에 결합하는 scFv를 발현하는 파지가 선택될 수 있다. 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써 항원에 결합하는 인간 항체의 V영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열을 결정한 후, 당해 V영역 서열을 목적하는 인간 항체 C영역의 서열과 인프레임으로 융합시킨 후에 적당한 발현 벡터에 삽입함으로써 발현 벡터가 제작될 수 있다. 당해 발현 벡터를 상기에 예로 든 바와 같은 적합한 발현 세포 중에 도입하고, 그 인간 항체를 코드하는 유전자를 발현시킴으로써 당해 인간 항체가 취득된다. 이들 방법은 이미 공지이다(국제공개 WO1992/001047, WO1992/020791, WO1993/006213, WO1993/011236, WO1993/019172, WO1995/001438, WO1995/015388 참조).
본 발명의 항체를 구성하는 가변영역은 임의의 항원을 인식하는 가변영역일 수 있다.
본 명세서에 있어서 항원은 특별히 한정되지 않고, 어떠한 항원이어도 된다. 항원의 예로서는, 예를 들면 리간드(사이토카인, 케모카인 등), 수용체, 암 항원, MHC 항원, 분화 항원, 면역 글로불린 및 면역 글로불린을 일부에 포함하는 면역 복합체를 적합하게 들 수 있다.
사이토카인의 예로서는 인터류킨 1~18, 콜로니 자극 인자(G-CSF, M-CSF, GM-CSF 등), 인터페론(IFN-α, IFN-β, IFN-γ 등), 성장인자(EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, TGF, HGF 등), 종양 괴사 인자(TNF-α, TNF-β), 림포톡신, 에리트로포이에틴, 렙틴, SCF, TPO, MCAF, BMP를 들 수 있다.
케모카인의 예로서는 CCL1~CCL28 등의 CC 케모카인, CXCL1~CXCL17 등의 CXC 케모카인, XCL1~XCL2 등의 C 케모카인, CX3CL1 등의 CX3C 케모카인을 들 수 있다.
수용체의 예로서는, 예를 들면 조혈 인자 수용체 패밀리, 사이토카인 수용체 패밀리, 티로신키나아제형 수용체 패밀리, 세린/트레오닌 키나아제형 수용체 패밀리, TNF 수용체 패밀리, G단백질 콘쥬게이트형 수용체 패밀리, GPI 앵커형 수용체 패밀리, 티로신 포스파타아제형 수용체 패밀리, 접착 인자 패밀리, 호르몬 수용체 패밀리 등의 수용체 패밀리에 속하는 수용체 등을 들 수 있다. 이들 수용체 패밀리에 속하는 수용체 및 그 특징에 관해서는 다수의 문헌, 예를 들면 Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehesive Biochemistry Vol.18B "Hormones and their Actions Part II" pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV., Patthy(Cell (1990) 61 (1), 13-14), Ullrich 등(Cell (1990) 61 (2), 203-212), Massague(e에는 양음 악센트 기호가 붙는다)(Cell (1992) 69 (6), 1067-1070), Miyajima 등(Annu. Rev. Immunol. (1992) 10, 295-331), Taga 등(FASEB J. (1992) 6, 3387-3396), Fantl 등(Annu. Rev. Biochem. (1993), 62, 453-481), Smith 등(Cell (1994) 76 (6) 959-962), Flower DR.(Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422 (3) 207-234) 등에 기재되어 있다.
상기 수용체 패밀리에 속하는 구체적인 수용체로서는, 예를 들면 인간 또는 마우스 에리트로포이에틴(EPO) 수용체(Blood (1990) 76 (1), 31-35, Cell (1989) 57 (2), 277-285), 인간 또는 마우스 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 수용체(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990) 87 (22), 8702-8706, mG-CSFR, Cell (1990) 61 (2), 341-350), 인간 또는 마우스 트롬보포이에틴(TPO) 수용체(Proc Natl Acad Sci U S A. (1992) 89 (12), 5640-5644, EMBO J. (1993) 12(7), 2645-53), 인간 또는 마우스 인슐린 수용체(Nature (1985) 313 (6005), 756-761), 인간 또는 마우스 Flt-3 리간드 수용체(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1994) 91 (2), 459-463), 인간 또는 마우스 혈소판 유래 증식 인자(PDGF) 수용체(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85 (10) 3435-3439), 인간 또는 마우스 인터페론(IFN)-α, β 수용체(Cell (1990) 60 (2), 225-234. 및 Cell (1994) 77 (3), 391-400), 인간 또는 마우스 렙틴 수용체, 인간 또는 마우스 성장 호르몬(GH) 수용체, 인간 또는 마우스 인터류킨(IL)-10 수용체, 인간 또는 마우스 인슐린 유사 증식 인자(IGF)-I 수용체, 인간 또는 마우스 백혈병 억제 인자(LIF) 수용체, 인간 또는 마우스 모양체 신경 영양 인자(CNTF) 수용체 등이 적합하게 예시된다.
암 항원은 세포의 악성화에 동반하여 발현하는 항원으로, 종양 특이성 항원으로도 불린다. 또한 세포가 암화되었을 때에 세포 표면이나 단백질 분자 상에 나타나는 이상한 당쇄도 암 항원으로, 암 당쇄 항원으로도 불린다. 암 항원의 예로서는, 예를 들면 상기 수용체로서 GPI 앵커형 수용체 패밀리에 속하는 간암을 비롯한 몇 가지 암에 있어서 발현되고 있는 GPC3(Int J Cancer. (2003) 103 (4), 455-65), 폐암을 비롯한 복수의 암에서 발현되는 EpCAM(Proc Natl Acad Sci U S A. (1989) 86 (1), 27-31), CA19-9, CA15-3, 시리얼 SSEA-1(SLX) 등을 적합하게 들 수 있다.
MHC 항원은 주로 MHC class I 항원과 MHC class II 항원으로 분류되며, MHC class I 항원에는 HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G, -H가 포함되고, MHC class II 항원에는 HLA-DR, -DQ, -DP가 포함된다.
분화 항원에는 CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD71, CD73, CD95, CD102, CD106, CD122, CD126, CDw130이 포함될 수 있다.
면역 글로불린에는 IgA, IgM, IgD, IgG, IgE가 포함된다. 또한 면역 복합체는 적어도 면역 글로불린 중 어느 하나의 성분을 포함한다.
그 밖의 항원으로서는 하기와 같은 분자；17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-케토-PGF1a, 8-이소-PGF2a, 8-옥소-dG, A1 아데노신 수용체, A33, ACE, ACE-2, 액티빈, 액티빈 A, 액티빈 AB, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 RIA, 액티빈 RIA ALK-2, 액티빈 RIB ALK-4, 액티빈 RIIA, 액티빈 RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, 아드레신(Addressins), aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7, 알파-1-안티트립신, 알파-V/베타-1 안타고니스트, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, 아르테민, 항Id, ASPARTIC, 심방성 나트륨 이뇨 인자, av/b3 인테그린, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, B-림프구 자극 인자(BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b-ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3 오스테오게닌(Osteogenin), BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP-7(OP-1), BMP-8(BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA(ALK-3), BMPR-IB(ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II(BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, 봄베신, 골 유래 신경 영양 인자(Bone-derived neurotrophic factor), BPDE, BPDE-DNA, BTC, 보체 인자 3(C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, 칼시토닌, cAMP, 암 태아성 항원(CEA), 암 관련 항원, 카텝신 A, 카텝신 B, 카텝신 C/DPPI, 카텝신 D, 카텝신 E, 카텝신 H, 카텝신 L, 카텝신 O, 카텝신 S, 카텝신 V, 카텝신 X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33(p67 단백질), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80(B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, 보툴리눔 독소(Botulinum toxin), 웰치균 독소(Clostridium perfringens toxin), CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C-Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, 사이토케라틴 종양 관련 항원, DAN, DCC, DcR3, DC-SIGN, 보체 제어 인자(Decay accelerating factor), des(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-1), Dhh, 디곡신, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR(ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, 엔도텔린 수용체, 엔케팔리나제, eNOS, Eot, 에오탁신 1, EpCAM, 에프린 B2/EphB4, EPO, ERCC, E-셀렉틴, ET-1, 팩터 IIa, 팩터 VII, 팩터 VIIIc, 팩터 IX, 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), Fas, FcR1, FEN-1, 페리틴, FGF, FGF-19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, 피브린, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, 난포 자극 호르몬, 프랙탈카인, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3(Vgr-2), GDF-5(BMP-14, CDMP-1), GDF-6(BMP-13, CDMP-2), GDF-7(BMP-12, CDMP-3), GDF-8(미오스타틴), GDF-9, GDF-15(MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-알파 1, GFR-알파 2, GFR-알파 3, GITR, 글루카곤, Glut4, 당단백질IIb/IIIa(GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, 성장 호르몬 방출 인자, 합텐(NP-cap 또는 NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCMV gB 엔벨로프 당단백질, HCMV gH 엔벨로프 당단백질, HCMV UL, 조혈 성장 인자(HGF), Hep B gp120, 헤파라나제, Her2, Her2/neu(ErbB-2), Her3(ErbB-3), Her4(ErbB-4), 단순 헤르페스 바이러스(HSV) gB 당단백질, HSV gD 당단백질, HGFA, 고분자량 흑색종 관련 항원(HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 V3 루프, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, 인간 심장 미오신, 인간 사이토메갈로바이러스(HCMV), 인간 성장 호르몬(HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, IgA 수용체, IgE, IGF, IGF 결합 단백질, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, 인터페론(INF)-알파, INF-베타, INF-감마, 인히빈, iNOS, 인슐린 A쇄, 인슐린 B쇄, 인슐린 유사 증식 인자 1, 인테그린 알파 2, 인테그린 알파 3, 인테그린 알파 4, 인테그린 알파 4/베타 1, 인테그린 알파 4/베타 7, 인테그린 알파 5(알파 V), 인테그린 알파 5/베타 1, 인테그린 알파 5/베타 3, 인테그린 알파 6, 인테그린 베타 1, 인테그린 베타 2, 인터페론 감마, IP-10, I-TAC, JE, 칼리크레인 2, 칼리크레인 5, 칼리크레인 6, 칼리크레인 11, 칼리크레인 12, 칼리크레인 14, 칼리크레인 15, 칼리크레인 L1, 칼리크레인 L2, 칼리크레인 L3, 칼리크레인 L4, KC, KDR, 케라티노사이트 증식 인자(KGF), 라미닌 5, LAMP, LAP, LAP(TGF-1), 잠재적 TGF-1, 잠재적 TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2, 레프티, 루이스-Y 항원, 루이스-Y 관련 항원, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, 리포단백질, LIX, LKN, Lptn, L-셀렉틴, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, 폐 표면, 황체 형성 호르몬, 림포톡신 베타 수용체, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALLOPROTEASES, MGDF 수용체, MGMT, MHC(HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-알파, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, 뮤신(Muc1), MUC18, 뮬러리안 억제 물질, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-C 아드헤린, NCA 90, NCAM, NCAM, 네프릴리신, 뉴로트로핀-3, -4, 또는 -6, 뉴르투린, 신경 성장 인자(NGF), NGFR, NGF-베타, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, 부갑상선 호르몬, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-카드헤린, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, 태반성 알칼리포스파타아제(PLAP), PlGF, PLP, PP14, 프로인슐린, 프로릴랙신(prorelaxin), 프로테인 C, PS, PSA, PSCA, 전립선 특이적 막항원(PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, 릴랙신 A쇄, 릴랙신 B쇄, 레닌, 호흡기 다핵체 바이러스(RSV) F, RSV Fgp, Ret, 류머티즘 인자, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, 혈청 알부민, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72(종양 관련 당단백질-72), TARC, TCA-3, T세포 수용체(예를 들면 T세포 수용체 알파/베타), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, 고환 PLAP 유사 알칼리포스파타아제, TfR, TGF, TGF-알파, TGF-베타, TGF-베타 Pan Specific, TGF-베타 RI(ALK-5), TGF-베타 RII, TGF-베타 RIIb, TGF-베타 RIII, TGF-베타 1, TGF-베타 2, TGF-베타 3, TGF-베타 4, TGF-베타 5, 트롬빈, 흉선 Ck-1, 갑상선 자극 호르몬, Tie, TIMP, TIQ, 조직 인자, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-알파, TNF-알파베타, TNF-베타 2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A(TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B(TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C(TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D(TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A(RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B(OPG OCIF, TR1), TNFRSF12(TWEAK R FN14), TNFRSF13B(TACI), TNFRSF13C(BAFF R), TNFRSF14(HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16(NGFR p75NTR), TNFRSF17(BCMA), TNFRSF18(GITR AITR), TNFRSF19(TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L(RELT), TNFRSF1A(TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B(TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26(TNFRH3), TNFRSF3(LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4(OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5(CD40 p50), TNFRSF6(Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B(DcR3 M68, TR6), TNFRSF7(CD27), TNFRSF8(CD30), TNFRSF9(4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21(DR6), TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23(DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25(DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10(TRAIL Apo-2 리간드, TL2), TNFSF11(TRANCE/RANK 리간드 ODF, OPG 리간드), TNFSF12(TWEAK Apo-3 리간드, DR3 리간드), TNFSF13(APRIL TALL2), TNFSF13B(BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14(LIGHT HVEM 리간드, LTg), TNFSF15(TL1A/VEGI), TNFSF18(GITR 리간드 AITR 리간드, TL6), TNFSF1A(TNF-a 코넥틴(Conectin), DIF, TNFSF2), TNFSF1B(TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3(LTb TNFC, p33), TNFSF4(OX40 리간드 gp34, TXGP1), TNFSF5(CD40 리간드 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6(Fas 리간드 Apo-1 리간드, APT1 리간드), TNFSF7(CD27 리간드 CD70), TNFSF8(CD30 리간드 CD153), TNFSF9(4-1BB 리간드 CD137 리간드), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRANCE, 트랜스페린 수용체, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, 종양 관련 항원 CA125, 종양 관련 항원 발현 루이스 Y 관련 탄수화물, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, 우로키나아제, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Cadherin, VE-cadherin-2, VEFGR-1(flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3(flt-4), VEGI, VIM, 바이러스 항원, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR 인테그린, 폰빌레브란트 인자, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Aβ, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL-20/IL-20R, 산화 LDL, PCSK9, prekallikrein, RON, TMEM16F, SOD1, Chromogranin A, Chromogranin B, tau, VAP1, 고분자 키니노겐, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, factor B, factor D, factor H, properdin, sclerostin, fibrinogen, fibrin, prothrombin, thrombin, 조직 인자, factor V, factor Va, factor VII, factor VIIa, factor VIII, factor VIIIa, factor IX, factor IXa, factor X, factor Xa, factor XI, factor XIa, factor XII, factor XIIa, factor XIII, factor XIIIa, TFPI, antithrombin III, EPCR, 트롬보모듈린, TAPI, tPA, plasminogen, plasmin, PAI-1, PAI-2, GPC3, Syndecan-1, Syndecan-2, Syndecan-3, Syndecan-4, LPA, S1P, 호르몬 및 성장인자를 위한 수용체가 예시될 수 있다.
가변영역을 구성하는 아미노산 서열은 그 항원 결합 활성이 유지되는 한, 1 또는 복수의 아미노산 잔기의 개변이 허용된다. 가변영역의 아미노산 서열을 개변하는 경우, 개변되는 부위나 개변되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 CDR 및/또는 FR에 존재하는 아미노산을 적절히 개변할 수 있다. 가변영역의 아미노산을 개변하는 경우, 특별히 한정되지 않으나 결합 활성이 유지되어 있는 것이 바람직하고, 예를 들면 개변 전과 비교하여 50% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 100% 이상의 결합 활성을 가지고 있는 것이 바람직하다. 또한 아미노산 개변에 의해 결합 활성이 상승되어 있어도 되고, 예를 들면 결합 활성이 개변 전과 비교하여 2배, 5배, 10배 등이 되어 있어도 된다. 본 발명의 항체에 있어서 아미노산 서열의 개변이란 아미노산 잔기의 치환, 부가, 결손 및 수식 중 하나 이상일 수 있다.
예를 들면 가변영역의 N말단의 글루타민의 피로글루타밀화에 의한 피로글루타민산으로의 수식은 당업자에게 잘 알려진 수식이다. 따라서 본 발명의 항체는 그 중쇄의 N말단이 글루타민인 경우에는 그것이 피로글루타민산에 수식된 가변영역을 포함한다.
본 발명의 항체의 가변영역은 임의의 서열이어도 되고, 마우스 항체, 랫트 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 낙타 항체, 및 이들 비인간 항체를 인간화한 인간화 항체 및 인간 항체 등, 어떠한 유래의 항체의 가변영역이어도 된다. 「인간화 항체」란, 재구성(reshaped) 인간 항체로도 불리는 인간 이외의 포유동물 유래의 항체, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR;complementarity determining region)을 인간 항체의 CDR로 이식한 것이다. CDR을 동정하기 위한 방법은 공지이다(Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877). 또한 그 일반적인 유전자 재조합 수법도 공지이다(유럽 특허출원 공개번호 EP 125023호 공보, WO 96/02576호 공보 참조). 또한 이들 항체의 가변영역에 대해 항원으로의 결합, 약물 동태, 안정성, 면역원성을 개선하기 위해 다양한 아미노산 치환을 도입한 것이어도 된다. 본 발명의 항체의 가변영역은 항원에 대한 결합에 pH 의존성을 가짐으로써 항원에 대해 반복 결합할 수 있어도 된다(WO2009/125825).
항체의 경쇄 불변영역에는 κ쇄와 λ쇄 타입의 불변영역이 존재하고 있는데, 어느 경쇄 불변영역이어도 된다. 또한 본 발명에 있어서 경쇄 불변영역은 아미노산의 치환, 결손, 부가 및/또는 삽입 등의 개변이 행해진 경쇄 불변영역이어도 된다.
본 발명의 항체의 중쇄 불변영역으로서는, 예를 들면 인간 IgG 항체의 중쇄 불변영역을 사용할 수 있고, 바람직하게는 인간 IgG1 항체, 인간 IgG4 항체의 중쇄 불변영역이다.
또한 본 발명의 Fc영역 개변체는 다른 단백질, 생리 활성 펩티드 등과 결합시켜 Fc 융합 단백질 분자로 하는 것이 가능하다. 여기서 융합 단백질이란 천연으로는 그것이 자연히 연결되지 않는 2개 이상의 상이한 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 말한다. 다른 단백질, 생리 활성 펩티드로서는, 예를 들면 수용체, 접착 분자, 리간드, 효소를 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 Fc 융합 단백질 분자의 바람직한 예로서, 표적에 결합하는 수용체 단백질에 Fc영역을 융합한 단백질을 들 수 있고, 예를 들면 TNFR-Fc 융합 단백, IL1R-Fc 융합 단백, VEGFR-Fc 융합 단백, CTLA4-Fc 융합 단백 등(Nat Med. 2003 Jan;9(1):47-52, BioDrugs. 2006;20(3):151-60.)을 들 수 있다. 또한 본 발명의 폴리펩티드에 융합시키는 단백질은 표적 분자에 결합하는 한 어떠한 분자여도 되고, 예를 들면 scFv 분자(WO2005/037989), 단일 도메인 항체 분자(WO2004/058821, WO2003/002609), 항체 유사 분자(Current Opinion in Biotechnology 2006, 17:653-658, Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:1-10, Current Opinion in Structural Biology 1997, 7:463-469, Protein Science 2006, 15:14-27), 예를 들면 DARPins(WO2002/020565), Affibody(WO1995/001937), Avimer(WO2004/044011, WO2005/040229), Adnectin(WO2002/032925) 등을 들 수 있다. 또한 항체 및 Fc 융합 단백질 분자는 복수 종류의 표적 분자 또는 에피토프에 결합하는 다중 특이성 항체여도 된다.
또한 본 발명의 항체에는 항체의 수식물도 포함된다. 항체의 수식물의 예로서는, 예를 들면 폴리에틸렌글리콜(PEG)이나 세포 장애성 물질 등의 각종 분자와 결합시킨 항체를 들 수 있다. 이러한 항체 수식물은 본 발명의 항체에 화학적인 수식을 행함으로써 얻을 수 있다. 항체의 수식방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.
또한 본 발명의 항체는 이중 특이성 항체(bispecific antibody)여도 된다. 이중 특이성 항체란, 상이한 에피토프를 인식하는 가변영역을 동일한 항체 분자 내에 갖는 항체를 말하는데, 당해 에피토프는 상이한 분자 중에 존재하고 있어도 되고 동일한 분자 중에 존재하고 있어도 된다.
본 발명의 폴리펩티드는 당업자에게 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면 항체는 아래의 방법으로 제작할 수 있는데, 이것에 한정되는 것은 아니다.
항체의 중쇄를 코드하는 DNA로서, Fc영역 중의 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 중쇄를 코드하는 DNA, 및 항체의 경쇄를 코드하는 DNA를 발현시킨다. Fc영역 중의 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 중쇄를 코드하는 DNA는, 예를 들면 천연형의 중쇄를 코드하는 DNA의 Fc영역 부분을 취득하고, 그 Fc영역 중의 특정 아미노산을 코드하는 코돈이 목적의 다른 아미노산을 코드하도록 적절히 치환을 도입함으로써 얻을 수 있다.
또한 사전에 천연형 중쇄의 Fc영역 중의 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 단백질을 코드하는 DNA를 설계하고, 그 DNA를 화학적으로 합성함으로써 Fc영역 중의 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 중쇄를 코드하는 DNA를 얻는 것도 가능하다. 아미노산의 치환 부위, 치환의 종류로서는 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한 치환에 한정되지 않고 결손, 부가, 삽입 중 어느 하나 또는 그들의 조합이어도 된다.
또한 Fc영역 중에 있어서 1 또는 복수의 아미노산 잔기가 목적의 다른 아미노산으로 치환된 중쇄를 코드하는 DNA는 부분 DNA로 나눠 제조할 수 있다. 부분 DNA의 조합으로서는, 예를 들면 가변영역을 코드하는 DNA와 불변영역을 코드하는 DNA, 또는 Fab영역을 코드하는 DNA와 Fc영역을 코드하는 DNA 등을 들 수 있는데, 이들 조합에 한정되는 것은 아니다. 경쇄를 코드하는 DNA도 또한 동일하게 부분 DNA로 나눠 제조할 수 있다.
상기 DNA를 발현시키는 방법으로서는 아래의 방법을 들 수 있다. 예를 들면 중쇄 가변영역을 코드하는 DNA를 중쇄 불변영역을 코드하는 DNA와 함께 발현 벡터에 삽입하여 중쇄 발현 벡터를 구축한다. 동일하게, 경쇄 가변영역을 코드하는 DNA를 경쇄 불변영역을 코드하는 DNA와 함께 발현 벡터에 삽입하여 경쇄 발현 벡터를 구축한다. 이들 중쇄, 경쇄의 유전자를 단일 벡터에 삽입하는 것도 가능하다.
목적으로 하는 항체를 코드하는 DNA를 발현 벡터로 삽입할 때, 발현 제어 영역, 예를 들면 인핸서, 프로모터의 제어하에서 발현하도록 발현 벡터에 삽입한다. 다음으로, 이 발현 벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하여 항체를 발현시킨다. 그때는 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다.
벡터의 예로서는, M13계 벡터, pUC계 벡터, pBR322, pBluescript, pCR-Script 등을 들 수 있다. 또한 cDNA의 서브 클로닝, 잘라내기를 목적으로 한 경우 상기 벡터 외에, 예를 들면 pGEM-T, pDIRECT, pT7 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 목적에 있어서 벡터를 사용하는 경우에는, 특히 발현 벡터가 유용하다. 발현 벡터로서는, 예를 들면 숙주를 JM109, DH5α, HB101, XL1-Blue 등의 대장균으로 한 경우에 있어서는 대장균에서 효율적으로 발현할 수 있는 프로모터, 예를 들면 lacZ 프로모터(Ward 등, Nature (1989) 341, 544-546；FASEB J. (1992) 6, 2422-2427, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함된다), araB 프로모터(Better 등, Science (1988) 240, 1041-1043, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함된다), 또는 T7 프로모터 등을 가지고 있는 것이 불가결하다. 이러한 벡터로서는 상기 벡터 외에 pGEX-5X-1(Pharmacia사 제조), 「QIAexpress system」(QIAGEN사 제조), pEGFP 또는 pET(이 경우, 숙주는 T7 RNA 폴리머라아제를 발현하고 있는 BL21이 바람직하다) 등을 들 수 있다.
또한 벡터에는 폴리펩티드 분비를 위한 시그널 서열이 포함되어 있어도 된다. 폴리펩티드 분비를 위한 시그널 서열로서는, 대장균의 페리플라즘으로 생산시키는 경우, pelB 시그널 서열(Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4397, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함된다)을 사용하면 된다. 숙주세포로의 벡터의 도입은, 예를 들면 리포펙틴법, 인산칼슘법, DEAE-Dextran법을 사용해서 행할 수 있다.
대장균 발현 벡터 외에, 예를 들면 본 발명의 폴리펩티드를 제조하기 위한 벡터로서는, 포유동물 유래의 발현 벡터(예를 들면 pcDNA3(Invitrogen사 제조)나, pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res.1990, 18(17), p5322, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함된다), pEF, pCDM8), 곤충세포 유래의 발현 벡터(예를 들면 「Bac-to-BAC baculovairus expression system」(GIBCO BRL사 제조), pBacPAK8), 식물 유래의 발현 벡터(예를 들면 pMH1, pMH2), 동물 바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면 pHSV, pMV, pAdexLcw), 레트로바이러스 유래의 발현 벡터(예를 들면 pZIPneo), 효모 유래의 발현 벡터(예를 들면 「Pichia Expression Kit」(Invitrogen사 제조), pNV11, SP-Q01), 고초균 유래의 발현 벡터(예를 들면 pPL608, pKTH50)를 들 수 있다
CHO 세포, COS 세포, NIH3T3 세포 등의 동물세포에서의 발현을 목적으로 한 경우에는, 세포 내에서 발현시키기 위해 필요한 프로모터, 예를 들면 SV40 프로모터(Mulligan 등, Nature (1979) 277, 108, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함된다), MMTV-LTR 프로모터, EF1α 프로모터(Mizushima 등, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함된다), CAG 프로모터(Gene. (1991) 108, 193, 참조로써 그 전체가 본 명세서에 포함된다), CMV 프로모터 등을 가지고 있는 것이 불가결하여, 형질전환 세포를 선발하기 위한 유전자(예를 들면 약제(네오마이신, G418 등)에 의해 판별할 수 있는 약제 내성 유전자)를 가지면 더욱 바람직하다. 이러한 특성을 갖는 벡터로서는, 예를 들면 pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, pOP13 등을 들 수 있다.
또한 유전자를 안정적으로 발현시키고 또한 세포 내에서의 유전자의 카피 수의 증폭을 목적으로 하는 경우에는, 핵산 합성 경로를 결손한 CHO 세포에 그것을 상보하는 DHFR 유전자를 갖는 벡터(예를 들면 pCHOI 등)를 도입하여 메토트랙세이트(MTX)에 의해 증폭시키는 방법을 들 수 있고, 또한 유전자의 일과성 발현을 목적으로 하는 경우에는, SV40 T항원을 발현하는 유전자를 염색체 상에 갖는 COS 세포를 사용하여 SV40의 복제 기점을 갖는 벡터(pcD 등)로 형질전환하는 방법을 들 수 있다. 복제 개시점으로서는 또한 폴리오마 바이러스, 아데노 바이러스, 소 유두종 바이러스(BPV) 등의 유래의 것을 사용하는 것도 가능하다. 또한 숙주세포계에서 유전자 카피 수 증폭을 위해 발현 벡터는 선택 마커로서 아미노글리코시드 트랜스페라아제(APH) 유전자, 티미딘 키나아제(TK) 유전자, 대장균 크산틴구아닌포스포리보실 트랜스페라아제(Ecogpt) 유전자, 디히드로엽산 환원효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.
항체의 회수는, 예를 들면 형질전환한 세포를 배양한 후, 분자 형질전환한 세포의 세포 내 또는 배양액으로부터 분리함으로써 행할 수 있다. 항체의 분리, 정제에는 원심분리, 황산암모늄 분획, 염석, 한외여과, 1q, FcRn, 프로테인 A, 프로테인 G 칼럼, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등의 방법을 적절히 조합해서 행할 수 있다.
또한 본 발명의 Fc영역 개변체와 혈장 중에 가용형으로 존재하여 병의 원인이 되는 항원에 대해 결합 활성을 갖고 이온 농도의 조건에 따라 당해 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 사용함으로써 혈장 중의 당해 항원의 소실을 촉진하는 방법을 제공한다.
국제공개 제WO2011/122011호에 기재되어 있는 바와 같이, pH 의존적 항원 결합 분자를 추가로 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서의 FcRn 결합을 증강시키도록 개변된 pH 의존적 항원 결합 분자는 항원에 반복해서 결합할 수 있는 효과 및 혈장 중으로부터 항원을 소실시키는 효과를 가지고 있기 때문에, 이러한 항원 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드의 투여에 의해 혈장 중으로부터 항원을 제거하는 것이 가능한 것이 보고되어 있다(국제공개 제WO2011/122011호). 그러나 지금까지 중성 조건하에서의 FcRn 결합을 증강시키는 이외의 방법으로 항원의 제거를 가속시키는 방법은 보고되어 있지 않다.
본 실시예에서는 pH의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 pH 중성역에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 증강시키고 있지 않은 천연형 IgG1 유래의 Fc영역을 포함함에도 불구하고, FcγR과의 결합을 매개로 혈장 중의 항원의 소실을 항원 단독보다도 가속시키는 것이 확인되었다. 특정 이론에 구속되는 것은 아니나, 이러한 것이 클론 278 등에 있어서 일어나는 이유로서 아래의 메커니즘이 예시된다.
sIL-6R 등과 같이 항원 결합 도메인을 결합할 수 있는 부위가 하나(즉 호모 단량체)인 경우, 2가의 항원 결합 도메인을 포함하는 1 분자의 항체에 대해 2 분자의 항원이 결합하고, 1 분자의 항sIL-6R 항체와 2 단위의 항원 결합 단위를 포함하는 2 분자의 항원 분자와 복합체를 형성한다. 이 때문에 이러한 항원과 항체의 복합체는 도 9에 나타내는 바와 같이 하나의 Fc영역(천연형 IgG1의 Fc영역)만 갖는다. 당해 복합체는 하나의 Fc영역을 매개로 1 분자의 FcγR 또는 2 분자의 FcRn에 결합하기 때문에, 이들 수용체에 대한 친화성은 통상의 IgG 항체와 동일하고, 세포 내로의 흡수는 주로 비특이적으로 일어나는 것으로 생각할 수 있다.
한편 항원이 인간 IgE 등과 같이 중쇄 및 경쇄의 헤테로 복합체의 이량체와 같이 항원 결합 도메인이 결합하는 에피토프가 2개소 존재하는 경우, 1 분자의 항IgE 항체에 포함되는 2가의 각각의 항원 결합 도메인이 1 분자의 IgE 분자에 존재하는 2 단위의 에피토프에 각각 결합하는 것은 에피토프의 배치 등의 측면에서 곤란할 것으로 생각된다. 그 결과, 1 분자의 항IgE 항체 중에 존재하는 2가의 항원 결합 도메인에 결합하는 2 분자의 IgE 중에 존재하는 2 단위의 항원 결합 단위에는 다른 항IgE 항체 분자가 결합함으로써, 적어도 4 분자(즉 항원 분자인 IgE의 2개의 분자와 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드인 항IgE 항체의 2개의 분자)를 포함하는 항원 항체 복합체(면역 복합체)를 형성하는 것으로 생각된다.
이 때문에 항원 결합 도메인이 결합할 수 있는 부위를 둘 이상 포함하는 항원 분자에 결합하는 항체 등의 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 적어도 사량체의 큰 면역 복합체를 형성하는 경우, 당해 면역 복합체는 FcγR, FcRn, 보체 수용체 등에 대해 적어도 2개 이상의 다가의 Fc영역을 매개로 어비디티(avidity)로 강고하게 결합하는 것이 가능하다. 그러나 항원 결합 도메인이 결합할 수 있는 부위가 하나인 항원 분자의 경우, 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드와 항원 분자의 면역 복합체는 이들 수용체에 대한 Fc영역을 매개로 한 친화성은 상기 면역 복합체를 형성하는 경우와 비교하면 충분하지 않다. 그러면 당해 면역 복합체는 이들 수용체를 발현하는 세포에 높은 효율로 흡수된다.
항원 분자가 둘 이상의 항원 결합 도메인에 결합하는 부위를 포함하는 경우, 본 발명의 폴리펩티드가 pH 의존적 결합 등과 같이 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합이 변화되는 항원 결합 도메인을 가짐으로써, 당해 폴리펩티드가 예를 들면 항체의 경우에는, 혈장 중에서 적어도 4 분자(2 분자의 항원 및 2 분자의 항체) 이상으로 이루어지는 항원 항체 복합체(면역 복합체)를 형성하고, 당해 면역 복합체가 세포 내에 흡수되면, 그 이온 농도의 조건이 혈장 중의 조건과는 상이한 것으로부터 엔도솜 내에서 항원이 당해 항체로부터 해리된다. 이 때문에 당해 면역 복합체가 흡수된 세포의 엔도솜 내에서는 당해 면역 복합체의 형성이 해소된다. 해리된 항원은 엔도솜 내에서 FcRn에 결합할 수 없기 때문에 리소좀으로 이행한 후에 분해된다. 한편 항원을 해리한 항체는 엔도솜 내에서 FcRn에 결합한 후에 혈장 중으로 리사이클되는 것으로 생각된다. 본 실시예의 pH 조건 이외의 이온 농도의 조건에 따라 동일한 리사이클은 가능하여, 참고 실시예 3~6에서는 pH 의존의 조건 대신에 칼슘 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 사용하여 혈장 중의 항원의 소실을 가속 가능한 것이 나타내어져 있다.
따라서 항원과 당해 항원에 대한 항원 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드가 형성하는 복합체가, 당해 면역 복합체는 FcγR, FcRn, 보체 수용체 등에 대해 둘 이상의 다가의 Fc영역을 가짐으로써 당해 항원의 소실을 가속시키는 것이 가능하다.
이에 더하여 참고 실시예 7~9의 검토로부터, FcγR을 매개로 한 항원의 제거에는 FcγR 중에서도 억제형 FcγR인 FcγRIIB의 기여가 가장 큰 것이 나타내어져 있다. 즉, 만약 FcγR에 대한 결합을 저하시켰다 하더라도 FcγRIIB에 대한 결합을 유지할 수 있다면, 항체의 FcγR을 매개로 한 항원의 소실능을 유지하는 것이 가능하다.
지금까지 몇 개의 항체 의약에 있어서는 IgG와 FcγR의 상호작용에 유래하는 부작용이 보고되어 있다. 예를 들면 VEGF에 대한 항체인 베바시주맙(bevacizumab)이 투여된 환자군에서는 혈전 색전증의 빈도가 상승하는 것이 알려져 있다(J. Natl. Cancer Inst. (2007) 99 (16), 1232-1239). 또한 CD40 리간드에 대한 항체의 임상 개발 시험에 있어서도 동일하게 혈전 색전증이 관찰되어 임상 시험이 중지되었다(Arthritis. Rheum. (2003) 48 (3), 719-727.). 혈소판의 세포 상에는 억제형 Fcγ 수용체인 FcγRIIb가 아니라 활성형 Fcγ 수용체인 FcγRIIa가 발현되고 있으나(J. Exp. Med. (2006) 203 (9), 2157-2164), 동물 모델 등을 사용한 그 후의 연구에 의해 투여된 어느 항체도 혈소판 상의 FcγRIIa에 대한 결합을 매개로 혈소판이 응집되어, 그 결과 혈전을 형성하는 것이 시사되어 있다(J. Thromb. Haemost. (2009) 7 (1), 171-181, J. Immunol. (2010) 185 (3), 1577-1583). 자기면역 질환의 하나인 전신성 에리테마토데스의 환자에 있어서는 FcγRIIa 의존적인 메커니즘에 의해 혈소판이 활성화되어, 혈소판의 활성화가 중증도와 상관하는 것으로 보고되어 있다(Sci. Transl. Med. (2010) 2 (47), 47-63).
또한 지금까지 동물 모델을 사용한 연구에 의해 항체와 다가 항원의 면역 복합체가 활성형 FcγR을 매개로 아나필락시스를 유도하는 것도 보고되어 있다(Bruhns P., Blood. (2012) 119(24):5640-9.).
이에 더하여 활성형의 FcγR을 매개로 다가 항원과 항체의 면역 복합체가 흡수됨으로써, 그 항원에 대한 항체가의 생산이 높아지는 것이 보고되어 있다(Scand J Immunol. (2006)64(3):177-84.; J Immunol. (1999) 163:618-22.). 다가 항원을 인식하는 항체 의약품의 경우, 항체 의약품 자신에 대한 항체가 생산되기 쉬워질 가능성을 시사하고 있다. 항체 의약품에 대한 항체가 생산된 경우, 그 혈중 동태가 악화되어 효과가 감약될 것으로 생각된다.
이와 같이, 항체가 다가 항원과 결합함으로써 면역 복합체를 형성하고, 그 면역 복합체가 활성형 FcγR과 상호작용함으로써 다양한 부작용을 유도하는 것으로 생각되어, 항체의 의약품으로서의 가치를 감소시켜 버린다. 다가 항원(다량체 항원)으로서는 GDF, GDF-1, GDF-3(Vgr-2), GDF-5(BMP-14, CDMP-1), GDF-6(BMP-13, CDMP-2), GDF-7(BMP-12, CDMP-3), GDF-8(미오스타틴), GDF-9, GDF-15(MIC-1), TNF, TNF-알파, TNF-알파베타, TNF-베타2, TNFSF10(TRAIL Apo-2 리간드, TL2), TNFSF11(TRANCE/RANK 리간드 ODF, OPG 리간드), TNFSF12(TWEAK Apo-3 리간드, DR3 리간드), TNFSF13(APRIL TALL2), TNFSF13B(BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14(LIGHT HVEM 리간드, LTg), TNFSF15(TL1A/VEGI), TNFSF18(GITR 리간드 AITR 리간드, TL6), TNFSF1A(TNF-a 커넥틴(Conectin), DIF, TNFSF2), TNFSF1B(TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3(LTb TNFC, p33), TNFSF4(OX40 리간드 gp34, TXGP1), TNFSF5(CD40 리간드 CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6(Fas 리간드 Apo-1 리간드, APT1 리간드), TNFSF7(CD27 리간드 CD70), TNFSF8(CD30 리간드 CD153), TNFSF9(4-1BB 리간드 CD137 리간드), VEGF, IgE, IgA, IgG, IgM, RANKL, TGF-알파, TGF-베타, TGF-베타 Pan Specific, 또는 IL-8 등을 예로서 들 수 있다.
이들 문제를 해결하기 위한 방법으로서는 FcγR에 대한 결합을 감약시키는 방법을 생각할 수 있다. 그러나 모든 FcγR에 대한 결합을 감소시켜 버린 경우, 그 항체를 사용해도 FcγR을 매개로 한 항원의 제거를 가속시키는 것은 불가능할 것으로 생각된다.
앞서 기술한 바와 같이, 항체의 FcγR을 매개로 한 항원의 제거에는 FcγR 중 FcγRIIB가 주된 역할을 담당하고 있는 것, FcγR과의 상호작용에 유래하는 부작용은 활성형 FcγR과의 상호작용에 기인하는 것으로부터, FcγRIIB에 대한 결합은 유지하면서 다른 활성형 FcγR에 대한 결합을 선택적으로 감약시킴으로써, 항원 소실능을 상실시키지 않고 활성형 FcγR에 유래하는 부작용을 저감시킨 우수한 항체를 제작 가능하다.
이 때문에 본 발명의 Fc영역 개변체와 이온 농도의 조건에 따라 당해 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 의해 혈장 중에 가용형으로 존재하여 병의 원인이 되는 항원의 혈장 중으로부터의 소실에 대해 우수한 촉진효과를 얻는 것이 가능하다.
또한 본 발명의 폴리펩티드를 이용함으로써 당해 폴리펩티드가 결합하는 항원이 항원 결합 도메인이 결합할 수 있는 부위를 하나만 갖는 항원(단량체 항원)이라도 동일한 효과를 얻을 수 있다.
이러한 예로서, 항원 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드의 칵테일을 사용한 단량체 항원의 혈장 중으로부터의 소실을 촉진시키는 방법을 들 수 있다.
전술한 바와 같이, 항원이 다량체 항원(예를 들면 비한정의 일례로서 IgA, IgE 등의 면역 글로불린 또는 TNF 또는 CD154 등의 TNF 슈퍼패밀리)일 때는, 둘 이상의 항원 결합 분자 및 둘 이상의 항원 결합 단위를 포함하는 큰 면역 복합체가 형성되는 경우가 있을 것으로 생각된다. 한편 항원이 단량체 항원인 경우에도, 당해 단량체 항원에 존재하는 상이한 에피토프에 각각 결합하는 적절한 둘 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드로서, (pH 또는 Ca 등의) 이온 농도의 조건에 따라 당해 에피토프에 대한 결합이 변화되는 폴리펩티드의 혼합물도 또한, 둘 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 및 둘 이상의 항원 결합 도메인에 대한 결합 부위(단량체 항원)를 포함하는 큰 면역 복합체를 형성하는 것이 가능할 것으로 생각된다. 본 명세서에 있어서 단량체 항원에 존재하는 상이한 에피토프에 각각 결합하는 적절한 둘 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드로서, (pH 또는 Ca 등의) 이온 농도의 조건에 따라 당해 에피토프에 대한 결합이 변화되는 항원 결합 분자의 혼합물을 항원 결합 분자 칵테일이라 부른다. 이 중 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 중 면역 복합체를 형성하는 하나 이상의 폴리펩티드(에 포함되는 항원 결합 도메인)가 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인이면 된다.
또한 그 밖의 예로서, 다중 특이성 또는 다중 파라토픽 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 사용한 단량체 항원의 혈장 중으로부터의 소실을 촉진하는 방법을 들 수 있다.
또한 항원이 단량체 항원인 경우에도, 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 포함되는 각 항원 결합 도메인이 당해 단량체 항원에 존재하는 상이한 에피토프에 각각 결합하는 특징을 갖고, 각각의 항원 결합 도메인의 에피토프에 대한 결합이 (pH 또는 Ca 등의) 이온 농도의 조건에 따라 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자도 또한, 둘 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 및 둘 이상의 항원 결합 단위(단량체 항원)를 포함하는 큰 면역 복합체를 형성하는 것이 가능할 것으로 생각된다. 상기와 같은 폴리펩티드의 비한정의 일태양으로서, 단량체 항원에 존재하는 서로 다른 에피토프에 결합하는 적절한 가변영역을 포함하는 다중 특이성(multispecific) 항체 또는 다중 파라토픽(multiparatopic) 항체가 예시된다. 이러한 다중 특이성(multispecific) 항체 또는 다중 파라토픽(multiparatopic) 항체의 비한정의 일태양으로서, 그 가변영역이 pH 또는 Ca 의존적인 결합 항체(도 19에 나타내는 바와 같은 에피토프 A를 인식하는 오른 팔의 가변영역과 에피토프 B를 인식하는 왼 팔의 가변영역을 포함하는, 이중 특이성(bispecific) 항체 또는 이중 파라토픽(biparatopic) 항체)도 또한, 둘 이상의 항체 및 둘 이상의 항원 결합 단위(단량체 항원)를 포함하는 큰 면역 복합체를 형성하는 것이 가능할 것으로 생각된다.
단량체 항원의 상이한 에피토프에 대한 항원 결합 도메인으로서, 당해 각 에피토프에 대한 결합 활성이 이온 농도의 조건에 따라 변화되고, 전술한 수용체에 대해 어비디티(avidity)로 결합하는 것이 가능한 항원 결합 도메인의 조합을 스크리닝함으로써, 단량체 항원의 혈장 중으로부터의 소실을 더욱 가속시키는 항원 결합 분자를 취득하는 것이 가능하다. 다중 특이성 또는 다중 파라토픽 항원 결합 도메인의 각 에피토프에 대한 결합 활성을 변화시키는 이온 농도의 조건은 동일한 이온 농도의 조건이어도 되고, 상이한 이온 농도의 조건이어도 된다. 예를 들면 이중 특이성 또는 이중 파라토픽 항원 결합 도메인의 한쪽 항원 결합 도메인의 에피토프에 대한 결합 활성이 pH의 조건, 또는 Ca 이온 농도 등의 금속 이온 농도의 조건에 따라 변화되는 이중 특이성 또는 이중 파라토픽 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자는 본 발명의 항원 결합 분자의 비한정의 일태양으로서 예시된다. 또한 예를 들면 이중 특이성 또는 이중 파라토픽 항원 결합 도메인의 한쪽 항원 결합 도메인의 에피토프에 대한 결합 활성이 pH의 조건에 따라 변화되고, 다른 한쪽 항원 결합 도메인의 에피토프에 대한 결합 활성이 Ca 이온 농도 등의 금속 이온 농도의 조건에 따라 변화되는, 이중 특이성 또는 이중 파라토픽 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자는 본 발명의 항원 결합 분자의 비한정의 일태양으로서 예시된다. 또한 이중 특이성 또는 이중 파라토픽 항원 결합 도메인의 한쪽 항원 결합 도메인의 에피토프에 대한 결합 활성이 pH의 조건에 따라 변화되고, 다른 한쪽 항원 결합 도메인의 에피토프에 대한 결합 활성도 pH의 조건에 따라 변화되는, 이중 특이성 또는 이중 파라토픽 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자도 또한 본 발명의 항원 결합 분자의 비한정의 일태양으로서 예시된다. 또한 이중 특이성 또는 이중 파라토픽 항원 결합 도메인의 한쪽 항원 결합 도메인의 에피토프에 대한 결합 활성이 Ca 이온 농도 등의 금속 이온 농도의 조건에 따라 변화되고, 다른 한쪽 항원 결합 도메인의 에피토프에 대한 결합 활성이 Ca 이온 농도 등의 금속 이온 농도의 조건에 따라 변화되는, 이중 특이성 또는 이중 파라토픽 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 항원 결합 분자도 또한 본 발명의 항원 결합 분자의 비한정의 일태양으로서 예시된다.
본 발명의 다중 특이성 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 또는 다중 파라토픽 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드 분자로서는, 그 하나 이상의 항원 결합 도메인이 항원 분자 중 제1 에피토프에 결합하고, 그 하나 이상의 다른 항원 결합 도메인이 항원 분자 중 제2 에피토프에 결합하는 특징을 갖는 2개 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드는, 그 반응의 특이성이라는 관점에서 다중 특이성 항원 결합 분자라 불린다. 1 분자의 항원 결합 분자에 포함되는 2종류의 항원 결합 도메인에 의해 당해 항원 결합 분자가 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 경우, 당해 항원 결합 분자는 이중 특이성 항원 결합 분자라 불린다. 또한 1 분자의 항원 결합 분자에 포함되는 3종류의 항원 결합 도메인에 의해 당해 항원 결합 분자가 3개의 상이한 에피토프에 결합하는 경우, 당해 항원 결합 분자는 삼중 특이성 항원 결합 분자라 불린다.
항원 분자 중 제1 에피토프에 결합하는 항원 결합 도메인 중의 파라토프와, 제1 에피토프와 구조가 상이한 제2 에피토프에 결합하는 항원 결합 도메인 중의 파라토프는 그 구조가 서로 상이하다. 그 때문에 그 하나 이상의 항원 결합 도메인이 항원 분자 중 제1 에피토프에 결합하고, 그 하나 이상의 다른 항원 결합 도메인이 항원 분자 중 제2 에피토프에 결합하는 특징을 갖는 2개 이상의 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자는 그 구조의 특이성이라는 관점에서 다중 파라토픽 항원 결합 분자라 불린다. 1 분자의 항원 결합 분자에 포함되는 2종류의 항원 결합 도메인에 의해 당해 항원 결합 분자가 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 경우, 당해 항원 결합 분자는 이중 파라토픽 항원 결합 분자라 불린다. 또한 1 분자의 항원 결합 분자에 포함되는 3종류의 항원 결합 도메인에 의해 당해 항원 결합 분자가 3개의 상이한 에피토프에 결합하는 경우, 당해 항원 결합 분자는 삼중 파라토픽 항원 결합 분자라 불린다.
하나 또는 복수의 항원 결합 도메인을 포함하는 다가의 다중 특이성 또는 다중 파라토픽 항원 결합 분자와 그의 조제방법은 Conrath 등(J.Biol.Chem. (2001) 276 (10) 7346-7350), Muyldermans(Rev. Mol. Biotech. (2001) 74, 277-302) 및 Kontermann R.E. (2011) Bispecific Antibodies(Springer-Verlag) 등의 비특허문헌 및 국제공개 WO1996/034103 또는 WO1999/023221 등의 특허문헌 등에도 기재되어 있다. 이들에 기재된 다중 특이성 또는 다중 파라토픽 항원 결합 분자와 그의 조제방법을 사용함으로써, 본 발명의 항원 결합 분자를 제작하는 것이 가능하다.
상기와 같은 다중 특이성 또는 다중 파라토픽 항원 결합 분자와 그의 조제방법의 일태양으로서 이중 특이성 항체의 그의 제작방법이 하기에 예시된다. 이중 특이성 항체란, 상이한 에피토프에 대해 특이적으로 결합하는 2종류의 가변영역을 포함하는 항체이다. IgG형의 이중 특이성 항체는 IgG 항체를 새산하는 하이브리도마 2종을 융합함으로써 생기는 hybrid hybridoma(quadroma)에 의해 분비시키는 것이 가능하다(Milstein 등(Nature (1983) 305, 537-540).
이중 특이성 항체를 상기 항체의 부분에서 기재한 바와 같은 재조합 수법을 사용하여 제조하는 경우, 목적의 2종의 가변영역을 포함하는 중쇄를 코드하는 유전자를 세포에 도입하고 그들을 공발현시키는 방법이 채용될 수 있다. 그러나 이러한 공발현시키는 방법에 있어서의 중쇄의 조합을 고려하는 것만으로도 (i) 제1 에피토프에 결합하는 가변영역을 포함하는 중쇄와 제2 에피토프에 결합하는 가변영역을 포함하는 중쇄가 한쌍이 된 중쇄의 조합, (ii) 제1 에피토프에 결합하는 가변영역을 포함하는 중쇄만이 한쌍이 된 중쇄의 조합, (iii) 제2 에피토프에 결합하는 가변영역을 포함하는 중쇄만이 한쌍이 된 중쇄의 조합이 2：1：1의 분자수의 비율로 존재하는 혼합물이 된다. 이들 3종류의 중쇄의 조합의 혼합물로부터 목적의 중쇄의 조합을 포함하는 항원 결합 분자를 정제하는 것은 곤란하다.
이러한 재조합 수법을 사용하여 이중 특이성 항체를 제조할 때, 중쇄를 구성하는 CH3 도메인에 적당한 아미노산 치환의 개변을 가함으로써 헤테로 조합의 중쇄를 포함하는 이중 특이성 항체가 우선적으로 분비될 수 있다. 구체적으로는, 한쪽 중쇄의 CH3 도메인에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄(knob(「돌기」의 의미))로 치환하고, 다른 한쪽 중쇄의 CH3 도메인에 존재하는 아미노산 측쇄를 보다 작은 측쇄(hole(「공극」의 의미))로 치환함으로써, 돌기가 공극 내에 배치될 수 있도록 하여 이종(異種)의 중쇄 형성의 촉진 및 동종(同種)의 중쇄 형성의 저해를 일으키는 방법이다(국제공개 WO1996/027011, Ridgway 등(Protein Engineering (1996) 9, 617-621), Merchant 등(Nat. Biotech. (1998) 16, 677-681)).
또한 폴리펩티드의 회합 또는 폴리펩티드에 의해 구성되는 이종 다량체의 회합의 제어방법을 중쇄의 회합에 이용함으로써 이중 특이성 항체를 제작하는 기술도 알려져 있다. 즉, 중쇄 내의 계면을 형성하는 아미노산 잔기를 개변함으로써 동일 서열을 갖는 중쇄의 회합이 저해되고, 서열이 상이한 2개의 중쇄가 형성되도록 제어하는 방법이 이중 특이성 항체의 제작에 채용될 수 있다(국제공개 WO2006/106905).
또한 2종류의 단일클론 항체를 각각 취득하고, 그들을 시험관 내(in vitro)에서 환원제 존재하 혼합함으로써 이중 특이성 항체를 취득하는 기술도 보고되어 있다(국제공개 WO2008/119353). 본 수법은 2종류의 단일클론 항체가 환원제에 의해 반 분자씩 개열되고, 이들이 재회합함으로써 일정 비율로 이중 특이성 항체를 얻는 것이다. 또한 CH3 도메인에 존재하는 아미노산을 치환함으로써 반 분자의 재회합을 제어하여 보다 효율적으로 이중 특이성 항체를 얻는 방법도 보고되어 있다(국제공개 WO2011/131746). 이러한 방법도 이중 특이성 항체를 제조할 때 채용될 수 있다.
본 발명에 있어서 「항원의 혈장 중으로부터의 소실을 촉진」이란, 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드(이하, 항원 결합 분자라고도 한다)가 생체 내에 투여되었거나 또는 항원 결합 분자의 생체 내로의 분비가 발생했을 때, 혈장 중에 존재하는 항원을 혈장 중으로부터 소실시키는 능력이 향상되는 것을 말한다. 따라서, 항원 결합 분자를 투여했을 때, 항원에 대한 결합 활성이 이온 농도에 따라 변화되지 않는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자, pH 산성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖지 않는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자, 또는 Fcγ 수용체에 대한 선택적인 결합 활성을 갖지 않는 Fcγ 수용체 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 투여했을 때와 비교하여 혈장 중으로부터 항원이 소실되는 속도가 빨라져 있으면 된다. 항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능이 증가되었는지 여부는, 예를 들면 가용형 항원과 항원 결합 분자를 생체 내에 투여하고, 투여 후의 가용형 항원의 혈장 중 농도를 측정함으로써 판단하는 것이 가능하다. 항원에 대한 결합 활성이 이온 농도의 조건에 따라 변화되는 항원 결합 도메인, pH 산성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인, 및 Fcγ 수용체에 대한 선택적인 결합 활성을 갖는 Fcγ 수용체 결합 도메인(선택적 FcγR 결합 도메인)을 포함하는 항원 결합 분자와 가용형 항원을 투여한 후의 혈장 중 가용형 항원의 농도가 저하되어 있는 경우에는, 항원 결합 분자의 혈장 중 항원 소실능이 증가된 것으로 판단할 수 있다. 여기서 선택적 FcγR 결합 도메인이란 FcγRIIb에 대한 결합은 유지하면서 활성형 FcγR에 대한 결합은 저감된 도메인을 말한다. 가용형 항원은 혈장 중에 있어서 항원 결합 분자에 결합하는 항원이어도 되고 또는 항원 결합 분자가 결합하지 않는 항원이어도 되며, 그 농도는 각각 「혈장 중 항원 결합 분자 결합 항원 농도」 및 「혈장 중 항원 결합 분자 비결합 항원 농도」로서 결정할 수 있다(후자는 「혈장 중 유리 항원 농도」와 동일한 정의이다). 「혈장 중 총 항원 농도」란, 항원 결합 분자 결합 항원과 항원 결합 분자 비결합 항원을 합계한 농도 또는 항원 결합 분자 비결합 항원 농도인 「혈장 중 유리 항원 농도」를 의미하는 것으로부터, 가용형 항원 농도는 「혈장 중 총 항원 농도」로서 결정할 수 있다. 「혈장 중 총 항원 농도」 또는 「혈장 중 유리 항원 농도」를 측정하는 다양한 방법이 본 명세서에 있어서 아래에 기재되는 바와 같이 당 기술분야에 있어서 주지이다.
본 발명에 있어서 「약물 동태의 향상」, 「약물 동태의 개선」 및 「우수한 약물 동태」는 「혈장 중(혈중) 체류성의 향상」, 「혈장 중(혈중) 체류성의 개선」, 「우수한 혈장 중(혈중) 체류성」, 「혈장 중(혈중) 체류성을 길게 한다」고 바꿔 말하는 것이 가능하고, 이들 어구는 동일한 의미로 사용된다.
본 발명에 있어서 「약물 동태가 개선된다」는 것은, 항원 결합 분자가 인간 또는 마우스, 랫트, 원숭이, 토끼, 개 등의 비인간 동물에 투여된 후부터 혈장 중으로부터 소실될 때까지(예를 들면 세포 내에서 분해되거나 하여 항원 결합 분자가 혈장 중으로 되돌아가는 것이 불가능한 상태가 될 때까지)의 시간이 길어지는 것뿐 아니라, 항원 결합 분자가 투여된 후부터 분해되어 소실될 때까지의 사이에 항원에 결합 가능한 상태(예를 들면 항원 결합 분자가 항원에 결합되어 있지 않은 상태)에서 혈장 중에 체류하는 시간이 길어지는 것도 포함한다. 천연형 Fc영역을 갖는 인간 IgG는 비인간 동물 유래의 FcRn에 결합할 수 있다. 예를 들면 천연형 Fc영역을 갖는 인간 IgG는 인간 FcRn보다 마우스 FcRn에 강하게 결합할 수 있는 것으로부터(Int. Immunol. (2001) 13 (12), 1551-1559), 본 발명의 항원 결합 분자의 특성을 확인할 목적으로 바람직하게는 마우스를 사용하여 투여를 행할 수 있다. 다른 예로서, 본래의 FcRn 유전자가 파괴되어 있어 인간 FcRn 유전자에 관한 도입유전자(transgene)를 가지고 발현하는 마우스(Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104)도 또한 아래에 기재되는 본 발명의 항원 결합 분자의 특성을 확인할 목적으로 투여를 행하기 위해 사용할 수 있다. 구체적으로는, 「약물 동태가 개선된다」는 것은 또한 항원에 결합되어 있지 않은 항원 결합 분자(항원 비결합형 항원 결합 분자)가 분해되어 소실될 때까지의 시간이 길어지는 것을 포함한다. 항원 결합 분자가 혈장 중에 존재하고 있더라도 그 항원 결합 분자에 이미 항원이 결합되어 있는 경우는, 그 항원 결합 분자는 새로운 항원에 결합할 수 없다. 이 때문에 항원 결합 분자가 항원에 결합되어 있지 않은 시간이 길어지면 새로운 항원에 결합할 수 있는 시간이 길어져(새로운 항원에 결합할 수 있는 기회가 많아져), 생체 내에서 항원이 항원 결합 분자에 결합되어 있지 않은 시간을 감소시킬 수 있어, 항원이 항원 결합 분자에 결합되어 있는 시간을 길게 하는 것이 가능해진다. 항원 결합 분자의 투여에 의해 혈장 중으로부터의 항원의 소실을 가속시킬 수 있다면, 항원 비결합형 항원 결합 분자의 혈장 중 농도가 증가하고, 또한 항원이 항원 결합 분자에 결합되어 있는 시간이 길어진다. 즉, 본 발명에 있어서의 「항원 결합 분자의 약물 동태의 개선」이란, 항원 비결합형 항원 결합 분자 중 어느 하나의 약물 동태 파라미터의 개선(혈장 중 반감기의 증가, 평균 혈장 중 체류시간의 증가, 혈장 중 클리어런스의 저하 중 어느 하나) 또는 항원 결합 분자 투여 후에 항원이 항원 결합 분자에 결합되어 있는 시간의 연장, 또는 항원 결합 분자에 의한 혈장 중으로부터의 항원의 소실이 가속되는 것을 포함한다. 항원 결합 분자 또는 항원 비결합형 항원 결합 분자의 혈장 중 반감기, 평균 혈장 중 체류시간, 혈장 중 클리어런스 등 중 어느 하나의 파라미터(파마코키네틱스 연습에 의한 이해(난잔도))를 측정함으로써 판단하는 것이 가능하다. 예를 들면 항원 결합 분자를 마우스, 랫트, 원숭이, 토끼, 개, 인간 등에 투여한 경우, 항원 결합 분자 또는 항원 비결합형 항원 결합 분자의 혈장 중 농도를 측정하고, 각 파라미터를 산출하여 혈장 중 반감기가 길어졌거나 또는 평균 혈장 중 체류시간이 길어진 경우 등에는 항원 결합 분자의 약물 동태가 개선되었다고 할 수 있다. 이들 파라미터는 당업자에게 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 약물 동태 해석 소프트웨어 WinNonlin(Pharsight)을 사용하여 부속의 절차서에 따라 비구획(Noncompartmental) 해석함으로써 적절히 평가할 수 있다. 항원에 결합되어 있지 않은 항원 결합 분자의 혈장 중 농도의 측정은 당업자 공지의 방법으로 실시하는 것이 가능하고, 예를 들면 Clin. Pharmacol. (2008) 48 (4), 406-417에 있어서 측정되어 있는 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 「약물 동태가 개선된다」는 것은, 항원 결합 분자 투여 후에 항원이 항원 결합 분자에 결합되어 있는 시간이 연장된 것도 포함한다. 항원 결합 분자 투여 후에 항원이 항원 결합 분자에 결합되어 있는 시간이 연장되었는지 여부는 유리 항원의 혈장 중 농도를 측정하여, 유리 항원의 혈장 중 농도 또는 총 항원 농도에 대한 유리 항원 농도의 비율이 상승될 때까지의 시간으로 판단하는 것이 가능하다.
항원 결합 분자에 결합되어 있지 않은 유리 항원의 혈장 중 농도 또는 총 항원 농도에 대한 유리 항원 농도의 비율은 당업자 공지의 방법으로 결정될 수 있다. 예를 들면 Pharm. Res. (2006) 23 (1), 95-103에 있어서 사용되고 있는 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 또한 항원이 어떠한 기능을 생체 내에서 나타내는 경우, 항원이 항원의 기능을 중화하는 항원 결합 분자(안타고니스트 분자)와 결합되어 있는지 여부는, 그 항원의 기능이 중화되어 있는지 여부로 평가하는 것도 가능하다. 항원의 기능이 중화되어 있는지 여부는 항원의 기능을 반영하는 어떠한 생체 내 마커를 측정함으로써 평가될 수 있다. 항원이 항원의 기능을 활성화하는 항원 결합 분자(아고니스트 분자)와 결합되어 있는지 여부는 항원의 기능을 반영하는 어떠한 생체 내 마커를 측정함으로써 평가될 수 있다.
유리 항원의 혈장 중 농도의 측정, 혈장 중의 총 항원량에 대한 혈장 중의 유리 항원량 비율의 측정, 생체 내 마커의 측정 등의 측정은 특별히 한정되지 않지만, 항원 결합 분자가 투여된 후부터 일정 시간이 경과한 후에 행해지는 것이 바람직하다. 본 발명에 있어서 항원 결합 분자가 투여된 후부터 일정 시간이 경과한 후란 특별히 한정되지 않고, 투여된 항원 결합 분자의 성질 등에 따라 당업자가 적절히 결정하는 것이 가능하며, 예를 들면 항원 결합 분자를 투여한 후부터 1일 경과 후, 항원 결합 분자를 투여한 후부터 3일 경과 후, 항원 결합 분자를 투여한 후부터 7일 경과 후, 항원 결합 분자를 투여한 후부터 14일 경과 후, 항원 결합 분자를 투여한 후부터 28일 경과 후 등을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 「혈장 중 항원 농도」란, 항원 결합 분자 결합 항원과 항원 결합 분자 비결합 항원을 합계한 농도인 「혈장 중 총 항원 농도」 또는 항원 결합 분자 비결합 항원 농도인 「혈장 중 유리 항원 농도」 모두 포함되는 개념이다.
혈장 중 총 항원 농도는 항원 결합 분자로서 항원에 대한 결합 활성이 이온 농도 비의존적인 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자 또는 FcγR에 대한 결합 활성이 손상된 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자를 투여한 경우와 비교하여, 또는 본 발명의 항원 결합 분자를 투여하지 않는 경우와 비교하여, 본 발명의 항원 결합 분자의 투여에 의해 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 200배, 500배, 1,000배 또는 그 이상 저감시킬 수 있다.
항원/항원 결합 분자 몰비는 아래에 나타내는 바와 같이 산출될 수 있다：
A값＝각 시점에서의 항원의 몰 농도
B값＝각 시점에서의 항원 결합 분자의 몰 농도
C값＝각 시점에서의 항원 결합 분자의 몰 농도당 항원의 몰 농도(항원/항원 결합 분자 몰비)
C＝A/B.
C값이 보다 작은 경우는 항원 결합 분자당 항원 소실 효율이 보다 높은 것을 나타내고, C값이 보다 큰 경우는 항원 결합 분자당 항원 소실 효율이 보다 낮은 것을 나타낸다.
항원/항원 결합 분자 몰비는 상기와 같이 산출될 수 있다.
항원/항원 결합 분자 몰비는 항원 결합 분자로서 항원에 대한 결합 활성이 이온 농도에 따라 변화되지 않는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자, pH 산성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖지 않는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자, 또는 Fcγ 수용체에 대한 선택적인 결합 활성을 갖지 않는 Fcγ 수용체 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자를 투여한 경우와 비교하여, 본 발명의 항원 결합 분자의 투여에 의해 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 200배, 500배, 1,000배 또는 그 이상 저감시킬 수 있다.
본 발명에 있어서 본 발명의 항원 결합 분자와 비교하는 참조 항원 결합 분자로서, 항원에 대한 결합 활성이 이온 농도에 따라 변화되지 않는 항원 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자, pH 산성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖지 않는 FcRn 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자, 또는 Fcγ 수용체에 대한 선택적인 결합 활성을 갖지 않는 Fcγ 수용체 결합 도메인을 포함하는 항원 결합 분자가 사용된다.
pH 산성역의 조건하에서 FcRn에 대한 결합 활성을 갖는 FcRn 결합 도메인의 영향을 평가하는 경우에 있어서, 혈장 중 총 항원 농도 또는 항원/항체 몰비의 감소는 항원 결합 분자가 마우스 카운터파트 항원과 교차반응하지 않을 때는, 인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 32 또는 계통 276(Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93-104)을 사용하여, 항원 항체 동시 주사 모델 또는 불변상태 항원 주입 모델 중 어느 하나에 의해 평가하는 것도 가능하다. 항원 결합 분자가 마우스 카운터파트와 교차반응할 때는, 인간 FcRn 형질전환 마우스 계통 32 또는 계통 276(Jackson Laboratories)에 항원 결합 분자를 단순히 주사함으로써 평가하는 것도 가능하다. 동시 주사 모델의 경우는 항원 결합 분자와 항원의 혼합물을 마우스에 투여한다. 불변상태 항원 주입 모델의 경우는 일정 혈장 중 항원 농도를 달성하기 위해 마우스에 항원 용액을 충전한 주입 펌프를 매입하고, 다음으로 항원 결합 분자를 마우스에 주사한다. 시험 항원 결합 분자를 같은 용량으로 투여한다. 혈장 중 총 항원 농도, 혈장 중 유리 항원 농도 및 혈장 중 항원 결합 분자 농도를 당업자 공지의 방법을 사용하여 적절한 시점에서 측정한다.
Fcγ 수용체에 대한 선택적인 결합 활성을 갖는 Fcγ 수용체 결합 도메인의 영향을 평가하는 경우에 있어서, 혈장 중 총 항원 농도 또는 항원/항체 몰비의 감소는 항원 결합 분자가 마우스 카운터파트 항원과 교차반응하지 않는 경우는, 통상 사용되는 C57BL/6J 마우스(Charles River Japan)를 사용하여 항원 항체 동시 주사 모델 또는 불변상태 항원 주입 모델 중 어느 하나에 의해 평가하는 것도 가능하다. 항원 결합 분자가 마우스 카운터파트와 교차반응하는 경우는, 통상 사용되는 C57BL/6J 마우스(Charles River Japan)에 항원 결합 분자를 단순히 주사함으로써 평가하는 것도 가능하다.
동시 주사 모델의 경우는 항원 결합 분자와 항원의 혼합물을 마우스에 투여한다. 불변상태 항원 주입 모델의 경우는 일정 혈장 중 항원 농도를 달성하기 위해 마우스에 항원 용액을 충전한 주입 펌프를 매입하고, 다음으로 항원 결합 분자를 마우스에 주사한다. 시험 항원 결합 분자를 같은 용량으로 투여한다. 혈장 중 총 항원 농도, 혈장 중 유리 항원 농도 및 혈장 중 항원 결합 분자 농도를 당업자 공지의 방법을 사용하여 적절한 시점에서 측정한다.
투여 2일 후, 4일 후, 7일 후, 14일 후, 28일 후, 56일 후 또는 84일 후에 혈장 중의 총 항원 농도 또는 유리 항원 농도 및 항원/항원 결합 분자 몰비를 측정하여 본 발명의 장기 효과를 평가할 수 있다. 바꿔 말하면, 본 발명의 항원 결합 분자의 특성을 평가할 목적으로 장기간의 ?l장 중 항원 농도가 항원 결합 분자의 투여 2일 후, 4일 후, 7일 후, 14일 후, 28일 후, 56일 후 또는 84일 후에 혈장 중의 총 항원 농도 또는 유리 항원 농도 및 항원/항원 결합 분자 몰비를 측정함으로써 결정된다. 본 발명에 기재된 항원 결합 분자에 의해 혈장 중 항원 농도 또는 항원/항원 결합 분자 몰비의 감소가 달성되는지 여부는 앞서 기재한 임의의 하나 또는 복수의 시점에서 그 감소를 평가함으로써 결정될 수 있다.
투여 15분 후, 1시간 후, 2시간 후, 4시간 후, 8시간 후, 12시간 후 또는 24시간 후에 혈장 중의 총 항원 농도 또는 유리 항원 농도 및 항원/항원 결합 분자 몰비를 측정하여 본 발명의 단기 효과를 평가할 수 있다. 바꿔 말하면, 본 발명의 항원 결합 분자의 특성을 평가할 목적으로 단기간의 혈장 중 항원 농도가 항원 결합 분자의 투여 15분 후, 1시간 후, 2시간 후, 4시간 후, 8시간 후, 12시간 후 또는 24시간 후에 혈장 중의 총 항원 농도 또는 유리 항원 농도 및 항원/항원 결합 분자 몰비를 측정함으로써 결정된다.
본 발명의 항원 결합 분자의 투여 경로는 피내 주사, 정맥내 주사, 유리체내 주사, 피하 주사, 복강내 주사, 비경구 주사 및 근육내 주사로부터 선택할 수 있다.
본 발명에 있어서는 인간에 있어서의 항원 결합 분자의 약물 동태가 개선되는 것이 바람직하다. 인간에서의 혈장 중 체류성을 측정하는 것이 곤란한 경우에는, 마우스(예를 들면 정상 마우스, 인간 항원 발현 형질전환 마우스, 인간 FcRn 발현 형질전환 마우스, 등) 또는 원숭이(예를 들면 게잡이원숭이 등)에서의 혈장 중 체류성을 토대로 인간에서의 혈장 중 체류성을 예측할 수 있다.
본 발명에 있어서의 「항원 결합 분자의 약물 동태의 개선, 혈장 중 체류성의 향상」이란 항원 결합 분자를 생체에 투여했을 때의 어느 하나의 약물 동태 파라미터가 개선되어 있는 것(혈장 중 반감기의 증가, 평균 혈장 중 체류시간의 증가, 혈장 중 클리어런스의 저하, 생체이용률 중 어느 하나) 또는 투여 후의 적절한 시간에 있어서의 항원 결합 분자의 혈장 중 농도가 향상되어 있는 것을 의미한다. 항원 결합 분자의 혈장 중 반감기, 평균 혈장 중 체류시간, 혈장 중 클리어런스, 생체이용률 등 중 어느 하나의 파라미터(파마코키네틱스 연습에 의한 이해(난잔도))를 측정함으로 판단하는 것이 가능하다. 예를 들면 항원 결합 분자를 마우스(정상 마우스 및 인간 FcRn 형질전환 마우스), 랫트, 원숭이, 토끼, 개, 인간 등에 투여한 경우, 항원 결합 분자의 혈장 중 농도를 측정하여 각 파라미터를 산출하고, 혈장 중 반감기가 길어졌거나 또는 평균 혈장 중 체류시간이 길어진 경우 등에는 항원 결합 분자의 약물 동태가 개선되었다고 할 수 있다. 이들 파라미터는 당업자에게 공지의 방법으로 측정하는 것이 가능하고, 예를 들면 약물 동태 해석 소프트웨어 WinNonlin(Pharsight)를 사용하여 부속의 절차서에 따라 비구획(Noncompartmental) 해석함으로써 적절히 평가할 수 있다.
마우스에 있어서 FcγRI, FcγRIIb, FcγRIII, FcγRIV의 4종류의 FcγR이 지금까지 발견되어 있다. 인간에 있어서도 그들에 대응하는 FcγR로서, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIa, FcγRIIIb가 발견되어 있다. 이들 FcγR 중에서 유일하게 억제형으로 생각되고 있는 FcγRIIb는 인간, 마우스 어느 것에 있어서도 보존되어 있다. 다른 FcγR은 FcγRIIIb를 제외하고 Immunoreceptor tyrosine-based activating motif(ITAM)를 매개로 활성화 시그널을 전달하는데, FcγRIIb는 세포 내에 갖는 imunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif(ITIM)를 매개로 억제 시그널을 전달하고 있다(Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34-47).
FcγRIIb의 스플라이싱 배리언트로서 FcγRIIb1과 FcγRIIb2가 보고되어 있다. 인간 및 마우스 어느 것에 있어서도 FcγRIIb1은 FcγRIIb2에 비해 긴 세포 내 도메인을 가지고 있고, FcγRIIb1은 B세포에서 발현되는 것이 확인되며, FcγRIIb2는 마크로파지, 비만 세포, 수상 세포, 호염기구, 호중구, 호산구에서 발현되는 것이 확인되어 있다(J. Clin. Immunol. (2005) 25 (1), 1-18).
지금까지 인간에 있어서 FcγRIIb의 기능 부전, 발현 저하는 자기면역 질환의 발증과 상관이 있는 것이 보고되어 있다. 예를 들면 SLE 환자 중에는 FcγRIIb의 발현 프로모터 영역에 있는 유전자 다형의 영향으로 전사활성화 인자의 결합이 약해져, FcγRIIb의 발현이 저하되어 있는 예가 보고되어 있다(Hum. Genet. (2005) 117, 220-227, J. Immunol. (2004) 172, 7192-7199, J. Immunol. (2004) 172, 7186-7191). 또한 SLE 환자 중에는 FcγRIIb의 233번째 아미노산이 Ile 또는 Thr이라는 2종류의 유전자 다형이 보고되어 있다. 이 부위는 FcγRIIb의 세포막 관통 영역에 존재하고, 233번째 아미노산이 Thr인 경우, Ile인 경우와 비교하여 FcγRIIb가 지질 뗏목(lipid raft)에 존재하기 어려워져, 그 결과 FcγRIIb의 시그널 전달 기능이 저하되는 것이 보고되어 있다(Nat. Med. (2005) 11, 1056-1058, Hum. Mol. Genet., (2005) 14, 2881-2892). 마우스에 있어서도 C57BL/6 마우스의 FcγRIIb 유전자가 파괴된 녹아웃 마우스는 자기 항체의 생산이나 사구체 신염 등의 SLE 유사 증상을 나타내는 것이 보고되어 있다(Immunity 13 (2000) 277-285, J. Exp. Med. (2002) 195, 1167-1174). 또한 지금까지 SLE의 자연 발증 모델로 생각되어 오고 있는 마우스에 있어서도 FcγRIIb의 발현량의 저하 등이 보고되어 있다(Immunogenetics (2000) 51, 429-435, Int. Immunol. (1999) 11, 1685-1691, Curr. Biol. (2000) 10, 227-230, J. Immunol. (2002) 169, 4340-4346). 이들 사실로부터 마우스에 있어서도 인간과 마찬가지로 FcγRIIb는 액성 면역을 제어하고 있는 것으로 생각된다.
본 발명의 Fc를 갖는 항체가 FcγRIIb를 매개로 항원을 소실시킬 때는 FcγRIIb의 기능 중 FcγRIIb의 엔도시토시스의 기능이 가장 중요한 기여를 하고 있는 것으로 생각된다. 전술한 바와 같이 FcγRIIb의 스플라이싱 배리언트로서 FcγRIIb1과 FcγRIIb2가 존재하는데, 항체와 항원의 면역 복합체의 엔도시토시스에는 후자가 주로 관여하고 있는 것이 보고되어 있다(J. Immunol. (1994), 152 574-585, Science (1992) 256, 1808-1812, Cell (1989) 58, 317-327). 지금까지 마우스의 FcγRIIb2는 클라트린 피복 홈(clathrin-coated pit)에 흡수되어 엔도시토시스를 일으키는 것이 보고되어 있다(Cell (1989) 58, 317-327). 또한 FcγRIIb2를 매개로 한 엔도시토시스에는 디류신 모티브(dileucine motif)가 필요한 것으로 보고되어 있는데, 인간 및 마우스 어느 것에 있어서도 디류신 모티브(dileucine motif)는 보존되어 있다(EMBO J. (1994) 13 (13), 2963-2969). 이 사실로부터도 인간에 있어서도 마우스와 동일하게 FcγRIIb2는 엔도시토시스능을 갖는 것으로 생각된다.
한편으로 FcγRIIb1은 FcγRIIb2와 달리 엔도시토시스를 일으키지 않는 것이 보고되어 있다. FcγRIIb1은 FcγRIIb2에는 보이지 않는 세포 내 도메인 중의 삽입 서열이 존재한다. 이 서열이 FcγRIIb1의 클라트린 피복 홈으로의 흡수를 저해하여, 그 결과 엔도시토시스가 저해되는 것으로 생각되고 있다(J. Cell. Biol. (1992) 116, 875-888, J. Cell. Biol. (1989) 109, 3291-3302). 인간에 있어서도 마우스와 동일하게 FcγRIIb1에는 FcγRIIb2의 동일 부분에 삽입 서열이 존재하기 때문에, 유사 메커니즘으로 FcγRIIb1과 FcγRIIb2의 엔도시토시스능의 차이가 생긴 것으로 예상된다. 또한 인간에 있어서도 마우스에 있어서도 20분간에 세포 표면 상의 약 40%의 면역 복합체가 세포 내로 흡수되는 것이 보고되어 있다(Mol. Immunol. (2011) 49, 329-337, Science (1992) 256, 1808-1812). 이 사실로부터 인간에 있어서도 FcγRIIb2는 마우스와 동일한 속도로 면역 복합체를 세포 내로 흡수하고 있는 것으로 예상된다.
FcγR family 중 FcγRIIb는 인간의 경우도 마우스의 경우도 유일하게 세포 내에 ITIM을 갖고, 발현 세포의 분포도 동일한 것으로부터, 면역의 제어에 있어서의 기능도 동일할 것으로 추측할 수 있다. 또한 인간의 경우도 마우스의 경우도 동일한 속도로 면역 복합체가 세포 내로 흡수된다는 사실을 고려하면, 마우스를 사용함으로써 인간에 있어서의 FcγRIIb를 매개로 한 항체에 의한 항원의 소실 효과가 예측 가능할 것으로 생각된다. 실제로, 참고 실시예 7에 있어서 pH 의존적으로 가용성 항원에 결합하는 성질을 갖는 항원 결합 분자인 mIgG1과 비교하여, pH 의존적으로 가용성 항원에 결합하는 성질을 가져 마우스 FcγRIIb 및 FcγRIII에 대한 어피니티(affinity)가 증강된 항원 결합 분자인 mF44 및 mF46이 정상 마우스에 투여되었을 때에 mIgG1이 투여된 경우와 비교하여 항원의 클리어런스를 증강시키는 것이 나타내어졌다.
또한 후술되는 참고 실시예 8에 있어서 Fc 수용체 γ쇄 결손 마우스를 사용하여 동일한 실험이 실시되었다. 마우스의 경우, FcγRIIb 이외의 FcγR은 gamma chain의 공존재하에서만 발현하는 것이 보고되어 있기 때문에, Fc 수용체 γ쇄 결손 마우스의 경우는 FcγRIIb만 발현하고 있다. Fc 수용체 γ쇄 결손 마우스에 pH 의존적으로 가용성 항원에 결합하는 성질을 갖는 항원 결합 분자인 mF44, mF46을 투여함으로써, FcγRIIb 선택적으로 결합을 증강시켰을 때의 항원 소실을 가속시키는 효과를 고찰하는 것이 가능하다. 참고 실시예 8의 결과로부터, Fc 수용체 γ쇄 결손 마우스에 투여된 pH 의존적으로 가용성 항원에 결합하는 성질을 갖는 항원 결합 분자인 mF44 및 mF46은 동 마우스에 투여된 pH 의존적으로 가용성 항원에 결합하는 성질을 갖는 항원 결합 분자인 mIgG1과 비교하여, 항원의 클리어런스를 증가시키는 것이 나타내어졌다. 또한 참고 실시예 8의 결과로부터, mF44 및 mF46은 Fc 수용체 γ쇄 결손 마우스에 투여된 경우라도 정상 마우스에 투여된 경우와 거의 같은 정도로 항원을 소실시키는 것이 명확해졌다.
참고 실시예 8에 있어서 FcγRIII 결손 마우스를 사용하여 동일한 실험이 실시되었다. mIgG1 및 mF44, mF46은 mFcγR 중 FcγRIIb 및 FcγRIII에만 결합하는 것으로부터, FcγRIII 결손 마우스에 이들 항체를 투여함으로써 FcγRIIb 선택적으로 결합을 증강시켰을 때의 항원 소실을 가속시키는 효과를 고찰하는 것이 가능하다. 참고 실시예 8의 결과로부터, FcγRIII 결손 마우스에 투여된 mF44 및 mF46은 동 마우스에 투여된 mIgG1과 비교하여 항원의 클리어런스를 증가시키는 것이 나타내어졌다. 또한 참고 실시예 8의 결과로부터, mF44 및 mF46은 FcγRIII 결손 마우스에 투여된 경우라도 정상 마우스에 투여된 경우 및 Fc 수용체 γ쇄 결손 마우스에 투여된 경우와 거의 같은 정도로 항원을 소실시키는 것이 명확해졌다.
이들 결과로부터, 활성형 FcγR에 대한 결합은 증강시키지 않고 FcγRIIb에만 선택적으로 결합을 증강시킴으로써 항원 소실을 가속시키는 것이 가능한 것이 명확해졌다. 즉 FcγR을 매개로 한 면역 복합체의 제거에는 주로 FcγRIIb가 관여하고 있는 것을 나타내고 있어, FcγR 중 FcγRIIb에 대한 결합을 유지해 두기만 하면 그 항체의 FcγR을 매개로 한 면역 복합체의 제거 효율도 유지될 것으로 추찰되었다.
앞서 고찰한 지금까지의 문헌 보고에 더하여 상기 마우스를 사용한 검증 결과로부터, 인간의 생체 중에 있어서도 마우스와 동일하게 FcγRIIb를 매개로 한 면역 복합체의 세포 내로의 흡수가 생기고, 그 결과 인간 FcγRIIb에 대해 선택적으로 결합을 증강시킨 Fc를 갖는 항체는 그 항원의 소실을 가속시키는 것이 가능할 것으로 생각된다. 또한 앞서 고찰한 바와 같이, 마우스와 인간의 경우는 FcγRIIb를 매개로 한 면역 복합체의 세포 내로의 흡수가 같은 정도의 소도로 생길 것으로 생각되는 것으로부터, 마우스 FcγRIIb에 대한 어피니티(affinity)를 증강시킨 Fc를 갖는 항체의 항원 소실을 가속시키는 효과와 같은 정도의 효과가, 인간 FcγRIIb에 대한 어피니티(affinity)를 같은 정도로 증강시킨 Fc를 사용함으로써 인간의 생체 내에 있어서도 달성하는 것이 가능할 것으로 생각되었다.
또한 본 발명은 항체 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드에 있어서 그 Fc영역 개변체에 하나 이상의 아미노산 개변을 가하는 것을 포함하는, 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다.
예를 들면 아래의 공정을 포함하는 제조방법을 들 수 있다；
(a) Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 그 Fc영역에 하나 이상의 아미노산 개변을 가하는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 개변된 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 결합 활성 및 활성형 Fcγ에 대한 결합 활성을 측정하는 공정, 및
(c) 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 활성형 Fcγ에 대한 결합 활성이 감소된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 선택하는 공정.
바람직한 태양으로서는 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법으로서,
(a) 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 활성형 Fcγ에 대한 결합 활성이 감소되도록 당해 폴리펩티드를 코드하는 핵산을 개변하는 공정,
(b) 숙주세포에 당해 핵산을 도입하여 발현하도록 배양하는 공정,
(c) 숙주세포 배양물로부터 당해 폴리펩티드를 회수하는 공정을 포함하는 방법이다.
또한 당해 제조방법에 의해 제조되는 항체 및 Fc 융합 단백질 분자도 본 발명에 포함된다.
또한 본 발명은 항체 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드에 있어서, 그 Fc영역 개변체에 하나 이상의 아미노산 개변을 가하는 것을 포함하는, 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 모든 활성형 FcγR, 그 중에서도 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성을 저감시키는 방법 또는 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다.
예를 들면 아래의 공정을 포함하는 제조방법을 들 수 있다；
(a) Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 그 Fc영역에 하나 이상의 아미노산 개변을 가하는 공정,
(b) 상기 공정 (a)에서 개변된 폴리펩티드의 FcγRIIa에 대한 결합 활성 및 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 측정하는 공정, 및
(c) 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성이 감소된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 선택하는 공정.
바람직한 태양으로서는 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγR에 대한 결합 활성을 유지하면서 모든 활성형 FcγR, 그 중에서도 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성을 저감시키는 방법 또는 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법으로서,
(a) 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성이 감소되도록 당해 폴리펩티드를 코드하는 핵산을 개변하는 공정,
(b) 숙주세포에 당해 핵산을 도입하여 발현하도록 배양하는 공정,
(c) 숙주세포 배양물로부터 당해 폴리펩티드를 회수하는 공정을 포함하는 방법이다.
또한 당해 제조방법에 의해 제조되는 항체 및 Fc 융합 단백질 분자도 본 발명에 포함된다.
또한 본 발명은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 그 Fc영역에 하나 이상의 아미노산 개변을 가하는 것을 포함하는 생체에 투여된 경우에 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 그 폴리펩티드에 대한 항체의 생산을 억제하는 방법 또는 그 폴리펩티드에 대한 항체의 생산이 억제된 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다.
예를 들면 아래의 공정을 포함하는 방법을 들 수 있다；
(a) Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 그 Fc영역에 하나 이상의 아미노산 개변을 가하는 공정, 및
(b) 상기 공정 (a)에서 개변된 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드가 생체에 투여된 경우에 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 항체의 생산이 억제되는 것을 확인하는 공정.
이러한 폴리펩티드는 활성형 FcγR을 활성화하지 않고 항체의 생산을 억제할 수 있기 때문에, 의약품으로서 유용할 것으로 생각된다.
상기 방법에 있어서는 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 모든 활성형 FcγR, 그 중에서도 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성을 감소시키도록 하는 것이 바람직하다.
상기 방법에 있어서의 바람직한 태양으로서는, 예를 들면 인간 IgG의 Fc영역에 있어서 EU 넘버링 238번째 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변과, Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산, 237번째 아미노산, 241번째 아미노산, 268번째 아미노산, 295번째 아미노산, 296번째 아미노산, 298번째 아미노산, 323번째 아미노산, 324번째 아미노산 및 330번째 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변이 도입되도록 당해 Fc영역을 개변한다. EU 넘버링 238번째 아미노산 개변과 조합되는 다른 아미노산 개변으로서는, 상기 중에서 2 이상의 아미노산을 선택하여 조합시켜도 된다. 바람직한 조합으로서는 하기의 (1) 내지 (3)을 들 수 있다.
(1) Fc영역의 EU 넘버링 241번째 아미노산, 268번째 아미노산, 296번째 아미노산 및 324번째 아미노산
(2) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산, 241번째 아미노산, 296번째 아미노산 및 330번째 아미노산
(3) Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산, 237번째 아미노산, 241번째 아미노산 및 296번째 아미노산
개변 후의 아미노산으로서 선택되는 아미노산은 개변 전과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 모든 활성형 FcγR, 그 중에서도 FcγRIIa(R)에 대한 결합 선택성이 감소되는 것이라면 특별히 한정되지 않으나, EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp이고, 또한 EU 넘버링 235번째 아미노산이 Phe, 237번째 아미노산이 Gln 또는 Asp, 241번째 아미노산이 Met 또는 Leu, 268번째 아미노산이 Pro, 295번째 아미노산이 Met 또는 Val, 296번째 아미노산이 Glu, His, Asn 또는 Asp, 298번째 아미노산이 Ala 또는 Met, 323번째 아미노산이 Ile, 324번째 아미노산이 Asn 또는 His, 330번째 아미노산이 His 또는 Tyr인 것이 바람직하다.
또한 상기 방법에 있어서의 바람직한 태양으로서는, 예를 들면 인간 IgG의 Fc영역에 있어서 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역과 비교하여 2배 이상이 되는 아미노산 개변이 도입된 Fc영역 개변체와, 모든 FcγR에 대한 결합 활성을 저감시키는 아미노산 개변이 조합되어 도입되도록 당해 Fc영역을 개변한다.
본 발명에 있어서 「FcγRIIb에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역과 비교하여 2배 이상이 되는 아미노산 개변」으로서는 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 표 11에 기재된 아미노산 개변을 들 수 있다.
또한 본 발명에 있어서 「모든 FcγR에 대한 결합 활성을 저감시키는 아미노산 개변」으로서는 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 Fc영역의 EU 넘버링 234번째 아미노산, 235번째 아미노산, 236번째 아미노산, 237번째 아미노산, 239번째 아미노산, 265번째 아미노산, 267번째 아미노산 및 297번째 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 들 수 있다.
바람직한 조합으로서는, 예를 들면 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역과 비교하여 2배 이상이 되는 아미노산 개변이 Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산 및 271번째 아미노산이고, 모든 FcγR에 대한 결합 활성을 저감시키는 아미노산 개변이 Fc영역의 EU 넘버링 234번째 아미노산, 235번째 아미노산, 236번째 아미노산, 237번째 아미노산, 239번째 아미노산, 265번째 아미노산, 267번째 아미노산 및 297번째 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 들 수 있다.
구체적으로는, 하기의 (1) 내지 (3)에 기재된 아미노산 개변의 조합을 바람직한 개변의 조합으로서 들 수 있다.
(1) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 238번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산, 268번째 아미노산 및 271번째 아미노산
(2) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 237번째 아미노산, 238번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산, 296번째 아미노산, 297번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 396번째 아미노산
(3) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 238번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산 및 296번째 아미노산
개변 후의 아미노산으로서 선택되는 아미노산은 개변 전과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 모든 활성형 FcγR, 그 중에서도 FcγRIIa(R)에 대한 결합 선택성이 감소되는 것이라면 특별히 한정되지 않으나, EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp, 271번째 아미노산이 Gly이고, EU 넘버링 234번째 아미노산이 Ala, His, Asn, Lys 또는 Arg, 235번째 아미노산이 Ala, 236번째 아미노산이 Gln, 237번째 아미노산이 Arg 또는 Lys, 239번째 아미노산이 Lys, 265번째 아미노산이 Lys, Asn, Arg, Ser 또는 Val, 267번째 아미노산이 Lys, Arg 또는 Tyr, 297번째 아미노산이 Ala인 것이 바람직하다.
또한 상기 방법에 있어서의 바람직한 태양으로서는, 예를 들면 인간 IgG의 Fc영역에 있어서 EU 넘버링 238번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변이 도입되도록 당해 Fc영역을 개변한다. 또한 233번째 아미노산, 237번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산 및 268번째 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변이 도입되도록 당해 Fc영역을 개변한다. 조합되는 다른 아미노산 개변으로서는, 상기 중에서 2 이상의 아미노산을 선택하여 조합시켜도 된다. 바람직한 조합으로서는, 하기의 (1) 내지 (4)를 들 수 있다.
(1) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산, 238번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산
(2) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 237번째 아미노산, 238번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산
(3) Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산, 267번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산
(4) Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산
개변 후의 아미노산으로서 선택되는 아미노산은 개변 전과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 모든 활성형 FcγR, 그 중에서도 FcγRIIa(R)에 대한 결합 선택성이 감소되는 것이라면 특별히 한정되지 않으나, EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp, 271번째 아미노산이 Gly, 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser, 331번째 아미노산이 Ser, 233번째 아미노산이 Asp, 237번째 아미노산이 Asp, 264번째 아미노산이 Ile, 267번째 아미노산이 Ala, 268번째 아미노산이 Asp 또는 Glu인 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 비해 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 활성형 FcγR, 특히 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성이 감소된 폴리펩티드를 제작하기 위한 폴리펩티드를 개변하는 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 비해 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 활성형 FcγR, 특히 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성이 감소된 폴리펩티드를 제작하기 위한 폴리펩티드를 개변하는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 생체에 투여된 경우에 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 항체의 생산이 억제된 폴리펩티드를 제작하기 위한 폴리펩티드를 개변하는 방법을 제공한다.
바람직한 태양으로서는, 예를 들면 전술한 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 활성형 FcγR, 특히 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성이 감소된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법에 기재된 아미노산 개변의 조합을 들 수 있다.
또한 전술한 각종 방법에는 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되고 또한 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소되어 있으면 다른 아미노산 개변을 조합해서 사용할 수 있다. 이러한 개변으로서는, 예를 들면 보체에 대한 결합 활성을 감소시키는 개변을 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 Fc영역의 EU 넘버링 322번째 아미노산 개변 또는 Fc영역의 EU 넘버링 327번째, 330번째 및 331번째 아미노산 개변의 조합을 들 수 있다. 개변 후의 아미노산으로서 선택되는 아미노산은 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되고, 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소되면서, 보체에 대한 결합 활성을 감소시키는 것이라면 특별히 한정되지 않으나, EU 넘버링 322번째 아미노산이 Ala 또는 Glu, 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser, 331번째 아미노산이 Ser인 것이 바람직하다.
또한 본 발명은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드로서, 하나 이상의 아미노산이 개변되고, 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 활성형 FcγR, 특히 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성이 감소된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 핵산을 제공한다. 또한 본 발명은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드로서, 하나 이상의 아미노산이 개변되고, 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 활성형 FcγR, 특히 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성에 대한 결합 활성이 감소된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 코드하는 핵산을 제공한다. 본 발명의 상기 핵산은 DNA, RNA 등 어떠한 형태여도 된다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터의 종류는 벡터가 도입되는 숙주세포에 따라 당업자가 적절히 선택할 수 있고, 예를 들면 전술한 벡터를 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 벡터에 의해 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다. 숙주세포는 당업자가 적절히 선택할 수 있고, 예를 들면 전술한 숙주세포를 사용할 수 있다. 구체적으로는 예를 들면 아래와 같은 숙주세포를 들 수 있다.
진핵세포가 숙주세포로서 사용되는 경우, 동물세포, 식물세포 또는 진균세포가 적절히 사용될 수 있다. 구체적으로는 동물세포로서는 다음과 같은 세포가 예시될 수 있다.
(1) 포유류세포：CHO(Chinese hamster ovary cell line), COS(Monkey kidney cell line), 골수종(Sp2/0, NS0 등), BHK(baby hamster kidney cell line), Hela, Vero 등, HEK293(human embryonic kidney cell line with sheared adenovirus (Ad)5 DNA), Freestyle 293, PER.C6 cell(human embryonic retinal cell line transformed with the Adenovirus Type 5 (Ad5) E1A and E1B genes) 등(Current Protocols in Protein Science(May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1))
(2) 양서류세포：아프리카 발톱개구리 난모세포 등
(3) 곤충세포：sf9, sf21, Tn5 등
또는 식물세포로서는, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 등의 니코티아나(Nicotiana)속 유래의 세포에 의한 항체 유전자의 발현계가 공지이다. 식물세포의 형질전환에는 캘러스 배양한 세포가 적당히 이용될 수 있다.
또한 진균세포로서는, 다음과 같은 세포를 이용할 수 있다.
-효모：사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces serevisiae) 등의 사카로미세스(Saccharomyces)속, 메탄올 자화 효모(Pichia pastoris) 등의 Pichia속
-사상균：아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 등의 아스퍼질러스(Aspergillus)속
또한 본 발명은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 그 Fc영역에 하나 이상의 아미노산 개변을 가하는 것을 포함하는, 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 활성형 FcγR, 특히 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 그 Fc영역에 하나 이상의 아미노산 개변을 가하는 것을 포함하는, 생체에 투여된 경우에 모체 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 그 폴리펩티드에 대한 항체의 생산을 억제하는 방법을 제공한다.
바람직한 태양으로서는, 예를 들면 전술한 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서 활성형 FcγR, 특히 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성이 감소된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법에 기재된 아미노산 개변의 조합을 들 수 있다.
또한 상기 중 어느 한 방법에 의해 제조된 폴리펩티드도 본 발명에 포함된다.
본 발명은 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 함유하는 의약 조성물을 제공한다.
본 발명의 의약 조성물은 본 발명의 상기 항체 또는 Fc 융합 단백질 분자에 더하여 의약적으로 허용 가능한 담체를 도입하고, 공지의 방법으로 제제화하는 것이 가능하다. 예를 들면 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용 가능한 액과의 무균성 용액 또는 현탁액제의 주사제 형태로 비경구적으로 사용할 수 있다. 예를 들면 약리학상 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클, 방부제, 결합제 등과 적절히 조합하여 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화함으로써 제제화하는 것을 생각할 수 있다. 구체적으로는 경질 무수 규산, 젖당, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카르멜로오스칼슘, 카르멜로오스나트륨, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 지방산 트리글리세라이드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 백당, 카르복시메틸셀룰로오스, 콘스타치, 무기 염류 등을 담체로서 들 수 있다. 이들 제제에 있어서의 유효 성분량은 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어지도록 하는 것이다.
주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 사용하여 통상의 제제 실시에 따라 처방할 수 있다.
주사용 수용액으로서는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 기타 보조제를 포함하는 등장액, 예를 들면 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨을 들 수 있고, 적당한 용해 보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리알코올, 예를 들면 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴리소르베이트 80(TM), HCO-50과 병용해도 된다.
유성액으로서는 참기름, 대두유를 들 수 있고, 용해 보조제로서 안식향산벤질, 벤질알코올과 병용해도 된다. 또한 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 초산나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면 염산프로카인, 안정제, 예를 들면 벤질알코올, 페놀, 산화방지제와 배합해도 된다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전시킨다.
투여는 바람직하게는 비경구투여이고, 구체적으로는 주사제형, 경비 투여제형, 경폐 투여제형, 경피 투여제형 등을 들 수 있다. 주사제형은, 예를 들면 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다.
또한 본 발명의 의약 조성물은 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. 항체 또는 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 의약 조성물의 투여량으로서는, 예를 들면 1회에 대해 체중 1 ㎏당 0.0001 ㎎ 내지 1,000 ㎎의 범위에서 선택하는 것이 가능하다. 또는 예를 들면 환자당 0.001 내지 100,000 ㎎/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있는데, 이들 수치에 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량, 투여방법은 환자의 체중이나 연령, 증상 등에 따라 변동되는데 당업자라면 적절히 선택하는 것이 가능하다.
상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 B 세포, 마스트 세포, 수상 세포 및/또는 호염기구의 활성화를 억제하는 약제의 유효 성분으로서 유용하다. 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 활성형 FcγR을 활성화하지 않고 FcγRIIb에 선택적으로 작용하여 B 세포, 마스트 세포, 수상 세포 및/또는 호염기구의 활성화를 억제하는 것이 가능하다. B 세포의 활성화란 증식, IgE 생산, IgM 생산, IgA 생산 등을 포함한다. 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 FcγRIIb와 IgE를 가교함으로써 B 세포의 IgE 생산을 억제하고, IgM과 가교함으로써 B 세포의 IgM 생산을 억제하며, IgA와 가교함으로써 IgA 생산을 억제한다. 그 이외에도 BCR, CD19, CD79b 등의 B 세포 상에 발현하고 있는 분자로 ITAM 도메인을 세포 내에 포함하거나 또는 ITAM 도메인과 상호작용하는 분자와 FcγRIIb를 직접적 또는 간접적으로 가교함으로써 상기와 동일한 억제작용을 발휘한다. 또한 마스트 세포의 활성화란 증식, IgE 등에 의한 활성화, 탈과립 등을 포함한다. 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 마스트 세포에 있어서는 IgE 수용체인 FcεRI, DAP12, CD200R3 등의 마스트 세포 상에 발현하고 있는 ITAM 도메인을 포함하거나 또는 ITAM 도메인과 상호작용하는 분자와 FcγRIIb를 직접적, 간접적으로 가교함으로써 증식, IgE 등에 의한 활성화, 탈과립을 억제하는 것이 가능하다. 또한 호염기구의 활성화란 증식, 탈과립 등을 포함한다. 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 호염기구에 있어서도 FcγRIIb와 세포막 상의 분자로 ITAM 도메인을 세포 내에 포함하거나 또는 ITAM 도메인과 상호작용하는 분자를 직접적 또는 간접적으로 가교함으로써 활성화, 탈과립, 증식을 억제하는 것이 가능하다. 또한 수상 세포의 활성화란 증식, 탈과립 등을 포함한다. 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 수상 세포에 있어서도 세포막 상의 분자로 ITAM 도메인을 세포 내에 포함하거나 또는 ITAM 도메인과 상호작용하는 분자와 FcγRIIb를 직접적 또는 간접적으로 가교함으로써 활성화, 탈과립, 증식을 억제하는 것이 가능하다.
본 발명에 있어서는 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 면역 염증성 질환의 치료제 또는 예방제의 유효 성분으로서 유용하다. 전술한 바와 같이, 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 B 세포, 마스트 세포, 수상 세포 및/또는 호염기구의 활성화를 억제할 수 있기 때문에, 그 결과로서 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 투여함으로써 면역 염증성 질환을 치료 또는 예방하는 것이 가능하다. 「면역 염증성 질환」은 다음의 것을 포함하는데, 단 그것들에만 한정되지 않는다：류마티스성 관절염, 자기면역성 간염, 자기면역성 갑상선염, 자기면역성 수포증, 자기면역성 부신피질염, 자기면역성 용혈성 빈혈, 자기면역성 혈소판 감소성 자반증, 거적혈구성 빈혈, 자기면역성 위축성 위염, 자기면역성 호중구 감소증, 자기면역성 정소염, 자기면역성 뇌척수염, 자기면역성 수용체병(receptor disease), 자기면역 불임, 만성 활동형 간염, 사구체신염, 간질성 폐섬유증, 다발성 경화증, 파제트병(Paget's disease), 골다공증(osteoporosis), 다발성 골수종, 포도막염, 급성 및 만성 척추염, 통풍성 관절염, 염증성 장질환, 성인 호흡 촉진 증후군(ARDS), 건선, 크론병, 바세도우병(Basedow disease), 약년성 당뇨병, 애디슨병, 중증 근무력증, 수정체성 포도막염, 전신성 에리테마토데스, 알레르기성 비염, 알레르기성 피부염, 궤양성 대장염, 과민증, 근육 변성, 악액질, 전신성 경피증, 국한성 경피증, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 베체트병(Behcet disease), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), I형 및 II형 당뇨병, 골흡수 질환, 이식편대 숙주 반응, 허혈성 재관류 외상, 아테롬 경화증, 뇌 트라우마, 대뇌 말라리아, 패혈증, 패혈성 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 발열, 염색에 의한 말기아스(malgias), 재생 불량성 빈혈, 용혈성 빈혈, 돌발성 혈소판 감소증, 굿파스처 증후군(Goodpasture's syndrome), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barr syndrome), 하시모토병, 천포창(pemphigus), IgA 신증, 화분증, 항인지질 항체 증후군, 다발성 근염, 베게너육아종증(Wegener's granulomatosis), 결절성 동맥염, 혼합성 결합 조직병, 섬유근통증, 천식, 아토피성 피부염, 만성 위축성 위염, 원발성 담즙성 간경변, 원발성 경화성 담관염, 자기면역성 췌장염, 대동맥염 증후군, 급속 진행성 사구체신염, 거적혈구성 빈혈, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 원발성 갑상선 기능 저하증, 특발성 애디슨병, 인슐린 의존성 당뇨병, 만성 원판상 에리테마토데스, 유천포창(pemphigoid), 임신성 포진, 선상 IgA 수포성 피부염, 후천성 표피 수포증, 원형 탈모증, 심상성 백반, 수톤 후천성 원심성 백반, 하라다병, 자기면역성 시신경증, 특발성 무정자증, 습관성 유산, 저혈당증, 만성 두드러기, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 장질환성 관절염, 반응성 관절염, 척추 관절증, 건부착부염(enthesitis), 과민성 장증후군, 만성피로 증후군, 피부근염, 봉입체 근염, 쉬미트 증후군(Schmidt's syndrome), 그레이브스병(Graves' disease), 악성 빈혈, 루포이드간염(lupoid hepatitis), 초로기 치매, 알츠하이머병, 탈수성 질환(demyelinating disease), 근위축성 측색 경화증, 부갑상선 기능 저하증, 드레슬러 증후군(Dressler syndrome), 이튼-람버트 증후군(Eaton-Lambert syndrome), 포진상 피부염, 탈모증, 진행성 전신성 경화증, CREST 증후군(석회 침착증, 레이노 현상, 식도 운동 장애, 강지증 및 모세혈관 확장증), 사르코이드증(sarcoidosis), 류마티스열, 다형성 홍반, 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 수혈 반응, 한센병, 다카야스 동맥염, 류마티스성 다발 근통증, 측두 동맥염, 거세포 동맥염, 습진, 림프종 유사 육아종증, 가와사키병, 심내막염, 심내막 심근 섬유증, 안내염, 태아 적아구증, 호산구성 근막염, 펠티 증후군(Felty's Syndrome), 헤노호-쉔라인 자반병(Henoch-Schonlein purpura), 이식 거부반응, 유행성 이하선염, 심근증, 화농성 관절염, 가족성 지중해열, 머클-웰스 증후군(Muckle-Wells Syndrome), 고IgD 증후군.
또한 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 자기항원에 대한 항체(자기항체)의 생산이 질환의 원인으로 생각되는 자기면역 질환에 있어서, 그 자기항체의 생산을 억제하여 당해 자기면역 질환을 치료 또는 예방하는 약제의 유효 성분으로서 유용하다. 중증 근무력증의 자기항원인 AchR과 항체의 Fc부분을 융합한 분자를 사용함으로써, AchR을 인식하는 BCR을 발현하는 B 세포의 증식을 억제하여 아포토시스를 유도하는 것이 보고되어 있다(J Neuroimmunol, 227, 35-43, 2010). 자기항체가 인식하는 항원과 본 발명에 기재된 항체 Fc영역의 융합 단백질을 사용함으로써 그 자기항원에 대한 BCR을 발현하는 B 세포의 BCR과 FcγRIIb를 가교하여 자기항원에 대한 BCR을 발현하는 B 세포의 증식을 억제하고 아포토시스를 유도하는 것이 가능하다. 이러한 자기면역 질환에는 길랑-바레 증후군, 중증 근무력증, 만성 위축성 위염, 자기면역성 간염, 원발성 담증성 간경변, 원발성 경화성 담관염, 자기면역성 췌장염, 대동맥염 증후군, 굿파스처 증후군, 급속 진행성 사구체신염, 거적아구성 빈혈, 자기면역성 용혈성 빈혈, 자기면역성 호중구 감소중, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 바세도우병, 하시모토병, 원발성 갑상선 기능 저하증, 특발성 애디슨병, 인슐린 의존성 당뇨병, 만성 원판상 에리테마토데스, 국한성 경피증, 천포창, 유천포창, 임신성 포진, 선상 IgA 수포성 피부증, 후천성 표피 수포증, 원형 탈모증, 심상성 백반, 수톤 후천성 원심성 백반, 하라다병, 자기면역성 시신경증, 특발성 무정자증, 습관성 유산, 2형 당뇨병, 저혈당증, 만성 두드러기가 포함되는데, 이것들에만 한정되지 않는다.
또한 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 생체에 필요한 단백질을 결손하는 질환의 치료제의 유효 성분으로서 유용하다. 생체에 필요한 단백질을 결손하는 질환에 대해 그 단백질을 약제로서 투여하여 보충하는 치료법이 사용되는데, 환자는 원래 그 단백질을 결손하고 있기 때문에 외부로부터 보충된 그 단백질은 이물질로서 인식되어 그 단백질에 대한 항체가 생산되어 버린다. 그 결과로서, 그 단백질이 제거되기 쉬워지게 되어 약제로서의 효과가 감약되어 버린다. 그러한 단백질과 본 발명에 기재된 항체 Fc영역의 융합 단백질을 사용함으로써 당해 단백질을 인식하는 B 세포 상에 있어서 BCR과 FcγRIIb를 가교하여 당해 단백질에 대한 항체 생산을 억제하는 것이 가능하다. 보충하는 단백질로서는 Factor VIII, Factor IX, TPO, EPO, α-iduronidase, iduronate sulfatase, A형 heparan N-sulfatase，B형 α-N-acetylglucosaminidase, C형 acetyl CoA：α-glucosaminidase acetyltransferase，D형 N-acetylglucosamine 6-sulfatase, galactose 6-sulfatase, N-acetylgalactosamine 4-sulfatase, β-glucuronidase, α-galactosidase, acidic α-galactosidase, glucocerebrosidase가 포함된다. 또한 이들 단백질을 보충하는 질환으로서는, 혈우병, 특발성 혈소판 감소성 자반병, 신성 빈혈(renal anemia), 리소좀병(뮤코다당증, 파브리병, 폼페병, 고쉐병) 등이 포함된다. 단 이들에 한정되지 않는다.
또한 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 항바이러스제의 유효 성분으로서 유용하다. 바이러스에 대한 항체로서 본 발명에 기재된 Fc영역을 포함하는 항체는 바이러스에 대한 항체에 보이는 항체 의존성 감염 증강(antibody-dependent enhancement)을 억제하는 것이 가능하다. 항체 의존성 감염 증강이란, 바이러스가 그 바이러스에 대한 중화 항체를 이용하여 활성형 FcγR을 매개로 탐식되어 FcγR 발현세포에 감염시킴으로써 감염을 확대하는 현상이다. 뎅기 바이러스(dengue virus)에 대한 중화 항체의 FcγRIIb에 대한 결합이 항체 의존성 감염 증강을 억제하는 데 중요한 역할을 하고 있는 것이 보고되어 있다(Proc Natl Acad Sci USA, 108, 12479-12484, 2011). 뎅기 바이러스에 대한 중화 항체가 형성하는 뎅기 바이러스와의 면역 복합체가 FcγRIIb를 가교함으로써 FcγR을 매개로 한 탐식을 저해하여, 그 결과로서 항체 의존성 감염 증강을 억제한다. 바이러스에는 뎅기 바이러스(DENV1, DENV2, DENV4)나 HIV가 포함된다. 단 이들에만 한정되지 않는다.
또한 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 동맥경화 예방제 또는 치료제의 유효 성분으로서 유용하다. 동맥경화의 원인인 산화 LDL에 대한 항체로서, 본 발명에 기재된 Fc영역을 포함하는 항체는 FcγRIIa 의존적인 염증성 세포의 접착을 방지하는 것이 가능하다. 항산화 LDL 항체는 산화 LDL과 CD36의 상호작용을 저해하는데, 항산화 LDL 항체가 내피세포에 대해 결합하여 그 Fc부분을 모노사이트가 FcγRIIa나 FcγRI 의존적으로 인식하여 접착하는 것이 보고되어 있다(Immunol Lett, 108, 52-61, 2007). 이러한 항체에 본 발명에 기재된 Fc영역을 포함하는 항체를 이용함으로써 FcγRIIa 의존적인 결합은 저해되고, 또한 FcγRIIb를 매개로 한 억제 시그널에 의해 모노사이트의 접착을 억제하는 것을 생각할 수 있다.
본 발명에 있어서는 상기 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드는 암에 대한 치료제 또는 예방제의 유효 성분으로서 유용하다. 전술한 바와 같이, FcγRIIb에 대한 결합을 유지하고 또한 모든 활성형 FcγR에 대한 결합을 저감시킴으로써 아고니스트 항체의 아고니스트 활성을 유지하면서 FcγRIIa에 의존적인 메커니즘에 대한 혈소판의 활성화를 억제하여 혈전 색전증 등의 리스크를 저감시키는 것이 가능하다. 이 때문에 본 발명에 기재된 Fc영역 개변체를 사용한 아고니스트 항체는 암의 치료 또는 예방에 유용하다. 구체적으로는 본 발명에 기재된 Fc영역 개변체는, 예를 들면 Aliases, CD120a, CD120b, Lymphotoxin β receptor, CD134, CD40, FAS, TNFRSF6B, CD27, CD30, CD137, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF10C, TNFRSF10D, RANK, Osteoprotegerin, TNFRSF12A, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF14, Nerve growth factor receptor, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19, TNFRSF21, TNFRSF25, Ectodysplasin A2 receptor 등의 TNF 수용체 패밀리에 대한 아고니스트 항체의 아고니스트 활성을 증강시켜, 암의 치료 또는 예방에 이용할 수 있다. 또한 상기 이외에도 그 아고니스트 활성에 FcγRIIb와의 상호작용이 필요시되는 분자에 대한 아고니스트 항체의 아고니스트 활성도 증강된다. 이에 더하여 Receptor Tyrosine kinase(RTK)의 하나인 Kit와 같이 FcγRIIb와 가교됨으로써 세포의 증식이 억제되는 분자에 대해 결합 활성을 갖는 폴리펩티드에 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함시킴으로써 당해 분자를 발현한 세포에 대한 억제 작용을 증강시키는 것이 가능해진다. 암은 다음의 것을 포함하는데, 단 그것들에만 한정되지 않는다：폐암(소세포폐암, 비소세포폐암, 폐선암 및 폐편평상피암을 포함한다), 대장암, 직장암, 결장암, 유방암, 간암, 위암, 췌장암, 신장암, 전립선암, 난소암, 갑상선암, 담관암, 복막암, 중피종, 편평상피암, 자궁경부암, 자궁체암, 방광암, 식도암, 두경부암, 비인두암, 타액선종양, 흉선종, 피부암, 기저세포종, 악성 흑색종, 항문암, 음경암, 정소암, 윌름스종양, 급성 골수성 백혈병(급성 골수구성 백혈병, 급성 골수아구성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수단구성 백혈병 및 급성 단구성 백혈병을 포함한다), 만성 골수성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 호지킨림프종, 비호지킨림프종(버킷 림프종, 만성 림프구성 백혈병, 균상 식육종, 맨틀세포 림프종, 여포성 림프종, 비만성 대세포형 림프종, 변연대 림프종(marginal zone lymphoma), 모양세포 백혈병 형질 세포종, 말초성 T세포 림프종 및 성인 T세포 백혈병/림프종), 랑게르한스세포 조직구증, 다발성 골수종, 골수 이형성 증후군, 뇌종양(신경교종, 별세포종, 신경교아세포종(glioblastoma), 수막종 및 상의종을 포함한다), 신경아세포종, 망막아세포종, 골육종, 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 유잉 육종(Ewing sarcoma), 혈관 육종, 혈관 외피 세포종.
또한 본 발명은 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드를 대상(환자)에 투여하는 공정을 포함하는 면역 염증성 질환의 치료방법 또는 예방방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 적어도 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드 또는 본 발명의 의약 조성물을 포함하는, 본 발명의 치료방법 또는 예방방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 그 키트에는 그 밖에 약학적으로 허용되는 담체, 매체, 사용방법을 기재한 지시서 등을 팩키징해 두는 것도 가능하다. 또한 본 발명은 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 면역 염증성 질환의 치료제 또는 예방제의 제조에 있어서의 사용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 치료방법 또는 예방방법에 사용하기 위한 본 발명의 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드 또는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다.
또한 본 명세서에서 사용되고 있는 아미노산의 3문자 표기와 1문자 표기의 대응은 아래와 같다.
알라닌：Ala：A
아르기닌：Arg：R
아스파라긴：Asn：N
아스파라긴산：Asp：D
시스테인：Cys：C
글루타민：Gln：Q
글루타민산：Glu：E
글리신：Gly：G
히스티딘：His：H
이소류신：Ile：I
류신：Leu：L
리신：Lys：K
메티오닌：Met：M
페닐알라닌：Phe：F
프롤린：Pro：P
세린：Ser：S
트레오닌：Thr：T
트립토판：Trp：W
티로신：Tyr：Y
발린：Val：V
또한 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로써 본 명세서에 포함된다.
실시예
본 발명은 아래의 실시예에 의해 추가적으로 예시되는데, 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
〔실시예 1〕pH 의존적 항IgE 항체의 취득
(1-1) 항인간 IgE 항체의 취득
pH 의존적 항인간 IgE 항체를 취득하기 위해, 항원인 인간 IgE(중쇄 서열번호：13, 경쇄 서열번호：14)(가변영역은 항인간 Glypican3 항체로 이루어진다)를 FreeStyle293(Life Technologies)을 사용하여 발현시켰다. 발현된 인간 IgE는 당업자 공지의 일반적인 칼럼 크로마토그래피법으로 정제하여 조제되었다.
취득된 다수의 항체 중에서 인간 IgE에 pH 의존적으로 결합하고, 또한 2 분자의 항IgE 항체 및 2 분자의 IgE 이상으로 이루어지는 큰 면역 복합체를 형성하는 항체가 선발되었다. 선발된 항인간 IgE 항체를 인간 IgG1 중쇄 불변영역 및 인간 경쇄 불변영역을 사용하여 발현, 정제하였다. 제작된 항체는 클론 278(IgG1)(중쇄 서열번호：10, 경쇄 서열번호：11)로 명명되었다.
(1-2) 항인간 IgE 항체의 결합 활성 및 pH 의존적 결합 활성의 평가
엔도솜 내에서 항원을 해리할 수 있는 항체는 항원에 대해 pH 의존적으로 결합할 뿐 아니라, Ca 의존적으로 결합하는 항원에 결합함으로써도 창제하는 것이 가능하다. 이에 클론 278 및 대조가 되는 pH 의존적 IgE 결합능을 갖지 않는 Xolair(omalizumab, Novartis)의 인간 IgE(hIgE)에 대한 pH 의존적 결합능 및 pH/Ca 의존적 결합능이 평가되었다.
즉, Biacore T200(GE Healthcare)을 사용하여 클론 278 및 Xolair의 hIgE에 대한 결합 활성(해리상수 KD(M))이 평가되었다. 러닝 버퍼로서 아래의 3종을 사용하여 측정이 행해졌다.
·1.2 mmol/l CaCl2/0.05% tween20, 20 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl, pH 7.4
·1.2 mmol/l CaCl2/0.05% tween20, 20 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl, pH 5.8
·3 μmol/l CaCl2/0.05% tween20, 20 mmol/l ACES, 150 mmol/l NaCl, pH 5.8
적당량 첨가된 화학 합성된 인간 글리피칸3 단백질 유래 서열(서열번호：12)의 C말단에 존재하는 Lys에 비오틴이 부가된 펩티드(이하 「비오틴화 GPC3 펩티드」로 기재한다)가, 스트렙토아비딘과 비오틴의 친화성을 이용하여 Sensor chip SA(GE Healthcare) 상에 고정화되었다. 적절한 농도의 인간 IgE를 인젝트하여 비오틴화 GPC3 펩티드에 포착시킴으로써 인간 IgE가 칩 상에 고정화되었다. 애널라이트로서 적절한 농도의 클론 278을 인젝트하여 센서칩 상의 인간 IgE와 상호작용시켰다. 이때 10 mmol/L Glycine-HCl, pH 1.5를 인젝트하여 센서칩이 재생되었다. 상호작용은 모두 37℃에서 측정되었다. Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용한 커브 피팅에 의한 측정 결과의 해석에 의해, 결합속도상수 ka(1/Ms) 및 해리속도상수 kd(1/s)가 산출되었다. 이들 상수를 토대로 해리상수 KD(M)가 산출되었다. 또한 pH 5.8, 1.2 mM Ca 조건과 pH 7.4, 1.2 mM Ca 조건하에서의 각 항체의 KD비를 산출하여 pH 의존성 결합이 pH 5.8, 3 μM Ca 조건과 pH 7.4, 1.2 mM Ca 조건하에서의 각 항체의 KD비를 산출하여 pH/Ca 의존성 결합이 평가되었다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.
Figure pat00005
(1-3) 클론 278, Xolair의 면역 복합체의 형성 평가
클론 278이 인간 IgE와 중성 조건하(pH 7.4)에 있어서 2 분자의 항IgE 항체 및 2 분자의 IgE 이상으로 이루어지는 큰 면역 복합체를 형성하는 것, 또한 그 면역 복합체가 산성 조건하(pH 5.8)에 있어서 해리되는 것이 겔 여과 크로마토그래피에 의해 평가되었다. 100 mM NaCl에 투석 처리된 클론 278은 중성 조건하의 샘플로서 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, pH 7.4의 버퍼, 산성 조건하의 샘플로서 20 mM Bis-tris-HCl, 150 mM NaCl, 3 μM CaCl2, pH 5.8의 버퍼를 사용하여 희석되었다. 인간 IgE인 hIgE(Asp6) 100 ㎍/mL(0.60 μM)와 클론 278이 1:1, 1:6의 몰비로 혼합된 혼합액이 실온 또는 25℃ 오토샘플러 중에서 2시간 이상 방치 후 겔 여과 크로마토그래피로 분석되었다. 중성 조건하에서는 20 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, pH 7.4의 이동상, 산성 조건하에서는 20 mM Bis-tris-HCl, 300 mM NaCl, 3 μM CaCl2, pH 5.8의 이동상이 각각 사용되었다. 칼럼은 G4000SWxl(TOSOH)을 사용하고, 유속 0.5 mL/min, 25℃의 조건하에서 분석되었다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타내는 바와 같이, 클론 278과 인간 IgE는 중성 조건하에 있어서 겉보기 분자량 670 kDa 정도로 이루어지는(항체 1 분자를 일량체로 가정한 경우에 있어서의) 사량체 및 그 이상의 다량체로 이루어지는 큰 면역 복합체를 형성한 것이 확인되었다. 또한 산성 조건하에 있어서는 이러한 면역 복합체는 확인되지 않은 것으로부터, 전술한 Biacore를 사용한 결합의 평가와 마찬가지로 pH 의존적으로 이들 면역 복합체는 해리되는 것이 확인되었다.
〔실시예 2〕클론 278과 Xolair의 생체 내(in vivo) 평가
(2-1) 생체 내(in vivo) 평가용 인간 IgE(hIgE(Asp6))의 조제
중쇄(서열번호：15) 및 경쇄(서열번호：14)로 이루어지는 생체 내(in vivo) 평가용 인간 IgE인 hIgE(Asp6)(가변영역은 항인간 Glypican3 항체)는 실시예 1과 동일한 방법으로 조제되었다. hIgE(Asp6)는 인간 IgE의 N형 당쇄의 헤테로제니티가 항원인 인간 IgE의 혈장 중 농도 추이의 영향을 받지 않도록 하기 위해, 인간 IgE의 6개소의 N형 당쇄 결합 사이트의 아스파라긴이 아스파라긴산으로 개변된 분자이다.
(2-2) 정상 마우스를 사용한 클론 278과 Xolair의 인간 IgE의 소실 가속 효과의 검증
C57BL/6J 마우스(Charles river Japan)에 hIgE(Asp6)를 단독 투여 또는 hIgE(Asp6) 및 항hIgE 항체(클론 278 또는 Xolair)를 동시 투여한 후의 hIgE(Asp6) 및 항인간 IgE 항체의 체내 동태가 평가되었다. hIgE(Asp6)(20 ㎍/mL) 또는 hIgE(Asp6) 및 항인간 IgE 항체의 혼합용액(농도는 표 6에 기재)이 꼬리 정맥으로부터 10 mL/㎏로 단회 투여되었다. 이?? hIgE(Asp6)에 대해 각 항체는 충분량 과잉으로 존재하는 것으로부터, hIgE(Asp6)는 거의 모든 항체에 결합하고 있는 것으로 생각된다. 투여 후 5분간, 2시간, 7시간, 1일간, 2일간, 4일간 또는 5일간, 7일간, 14일간, 21일간, 28일간에서 당해 마우스로부터 혈액이 채혈되었다. 채취된 혈액을 바로 4℃, 15,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 혈장이 얻어졌다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존되었다.
Figure pat00006
(2-3) 정상 마우스의 혈장 중 hIgE(Asp6) 농도의 측정
마우스 혈장 중 hIgE(Asp6) 농도는 ELISA법으로 측정되었다. 혈장 중 농도로서 192, 96, 48, 24, 12, 6, 3 ng/mL의 검량선 시료가 조제되었다. hIgE(Asp6)와 항hIgE 항체의 면역 복합체를 균일하게 하기 위해 검량선 및 마우스 혈장 측정 시료에는 10 ㎍/mL가 되도록 Xolair(Novartis)를 첨가하고, 실온에서 30분 정치시켰다. 정치 후의 검량선 및 마우스 혈장 측정 시료를 anti-human IgE가 고상화된 이뮤노 플레이트(MABTECH) 또는 anti-human IgE(clone 107, MABTECH)가 고상화된 이뮤노 플레이트(Nunc F96 MicroWell Plate(Nalge nunc International))에 분주하고, 실온에서 2시간 정치 또는 4℃에서 하룻밤 정치시켰다. 그 후, human GPC3 core protein(서열번호：16), NHS-PEG4-Biotin(Thermo Fisher Scientific)으로 biotin화된 항GPC3 항체(사내 조제), Sterptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)을 각각 1시간 순차 반응시켰다. TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용한 발색 반응을 1 N-Sulfuric acid(Showa Chemical)로 반응 정지 후, 당해 발색을 마이크로 플레이트 리더로 450 nm의 흡광도를 측정하는 방법, 또는 SuperSignal(r) ELISA Pico Chemiluminescent Substrate(Thermo Fisher Scientific)를 기질로서 발광 반응을 행하여 마이크로 플레이트 리더로 발광 강도를 측정하는 방법으로 마우스 혈장 중 농도가 측정되었다. 마우스 혈장 중 농도는 검량선의 흡광도 또는 발광 강도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용하여 산출되었다. 이 방법으로 측정된 정맥내 투여 후의 혈장 중 hIgE(Asp6) 농도 추이를 도 2에 나타내었다. 도면 중에서 클론 278은 278-IgG1, Xolair는 Xolair-IgG1으로 표기되었다.
(2-4) 정상 마우스의 혈장 중 항인간 IgE 항체 농도의 측정
마우스 혈장 중의 항hIgE 항체 농도는 ELISA법으로 측정되었다. 혈장 중 농도로서 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, 0.00625 ㎍/mL의 검량선 시료가 조제되었다. hIgE(Asp6)와 항hIgE 항체의 면역 복합체를 균일하게 하기 위해 검량선 및 마우스 혈장 측정 시료는 1 ㎍/mL가 되도록 hIgE(Asp6)가 첨가된 후, 실온에서 30분 정치하였다. 정치 후의 검량선 및 마우스 혈장 측정 시료를 Anti-Human Kappa Light Chain Antibody(Bethyl Laboratories)가 고상화된 이뮤노 플레이트(Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp(Nalge nunc International))에 분주하고, 실온에서 2시간 정치 또는 4℃에서 하룻밤 정치시켰다. 그 후, Rabbit anti-Human IgG (Fc) Secondary antibody, Biotin conjugate(Pierce Biotechnology) 및 Streptavidin-Poly HRP80(Stereospecific Detection Technologies)을 각각 1시간 순차 반응시켰다. TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용한 발색 반응을 1 N-Sulfuric acid(Showa Chemical)로 반응 정지 후, 당해 발색을 마이크로 플레이트 리더로 450 nm의 흡광도를 측정하는 방법으로 마우스 혈장 중 농도가 측정되었다. 마우스 혈장 중 농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용하여 산출되었다. 이 방법으로 측정된 정맥내 투여 후의 혈장 중 IgE 항체 농도 추이를 도 3에 나타내었다. 도면 중에서 클론 278은 278-IgG1, Xolair는 Xolair-IgG1으로 표기되었다.
그 결과, 인간 IgE 단독의 소실에 대해 인간 IgE와 대조 항IgE 항체인 Xolair를 동시에 투여한 경우는, 인간 IgE의 소실은 느려졌다. 이에 반하여 인간 IgE에 대해 pH 의존적인 결합 활성을 갖는 클론 278을 동시에 투여한 경우는 인간 IgE의 소실을 인간 IgE 단독과 비교하여 대폭으로 가속시키는 것이 확인되었다.
국제공개 제WO2011/122011호에 있어서 인간 IL-6 수용체(hsIL-6R)에 대해 결합하는 항체와 hsIL-6R을 사용하여 동일한 실험이 실시되고 있으나, 그 결과는 본 실시예의 결과와 상이하였다. 국제공개 제WO2011/122011호의 실시예 3에 있어서는 인간 IL-6 수용체(hsIL-6R)에 대해 결합하나, 그 결합이 pH 의존적이지 않은 항체(H54L28-IgG1)의 IgG1 항체를 항원과 동시에 정상 마우스(C57BL/6J 마우스)에 투여한 경우에는, 항원 단독을 투여한 경우와 비교하여 항원인 인간 IL-6 수용체의 소실은 가속되어 있지 않고, 오히려 느려져 있었다. pH 의존적으로 항원에 결합하는 항체(Fv4-IgG1)를 항원과 동시에 투여한 경우도, H54L28-IgG1을 투여한 경우와 비교하여 항원의 소실은 가속되어 있으나, 항원 단독으로 투여한 경우보다는 항원의 소실은 느려져 있었다. 이는 항체를 투여함으로써 항체가 항원에 결합한 결과, 항원이 항체와 함께 거동함으로써 항체와 동일하게 FcRn을 매개로 리사이클되어 혈중으로부터 소실되기 어려워지기 때문이라고 생각된다.
본 실시예에서 얻어진 결과는, 항원과 동시에 항체를 투여함으로써 항원 단독을 투여한 경우보다도 항원의 소실이 가속된다는 결과로, 과거의 보고와 일견 모순되는 듯 하다. 그러나 본 실시에서 사용한 항원인 IgE는 2가 항원이고, hsIL-6R은 1가 항원이라는 점이 상이하다. IgE에 대해 항IgE 항체를 첨가하면 하나의 항원에 대해 2개의 항체가 결합하는 것이 가능하여, 실시예 (1-3)에서 관찰된 바와 같은 복수의 항원과 항체로 이루어지는 면역 복합체를 형성한다. 항체 단독의 경우는 IgG의 수용체인 FcγR에 대해 1가(affinity)로 결합하는 것만 가능하나, 전술한 바와 같은 복수의 항원과 항체로 이루어지는 면역 복합체의 경우에는, FcγR에 대해 복수 가(avidity)로 결합하는 것이 가능하다. 한편 hsIL-6R의 경우는 하나의 항원에 대해 하나의 항체만 결합 가능하고, 따라서 그 항원과 항체로 이루어지는 면역 복합체는 FcγR과 1가(affinity)로만 결합 가능하여, 어비디티(avidity)로 결합한 경우와 비교하여 그 상호작용은 매우 약하다. 즉, IgE와 그의 항체로 형성되는 면역 복합체는 FcγR에 대해 어비디티(avidity)로 강하게 결합하여, 그 결과 FcγR이 발현하는 간장 등을 매개로 혈중으로부터 신속하게 제거된 것으로 생각되었다.
또한 항체가 pH 의존적으로 항원인 IgE에 결합하는 경우는, 항원과 항체의 면역 복합체가 세포 내에 흡수된 후에 엔도솜 내에서 항원이 해리된다. 그 후, 항원은 항체와 함께 FcRn을 매개로 리사이클되지 않고 해리된 항원은 리소좀 내에서 분해된다. 그 결과, 항체가 항원에 대한 결합이 pH 의존적이지 않은 경우와 비교하여 항원이 신속하게 소실된 것으로 생각되었다.
〔실시예 3〕FcγR 결합을 저감시킨 클론 278과 Xolair의 생체 내(in vivo) 평가
(3-1) FcγR 결합을 저감시킨 항인간 IgE 항체의 취득
다음으로 실시예 2에서 고찰된 항원 소실의 가속이 면역 복합체와 FcγR의 상호작용에 유래하는 것인지 검증하기 위해, pH 의존적으로 인간 IgE에 결합하는 278-IgG1에 대해 마우스 FcγR에 대한 결합이 저감된 개변체가 제작되었다. 마우스 FcγR에 대한 결합을 저감시키는 것을 목적으로 278-IgG1의 EU 넘버링으로 표시되는 235번 위치의 Leu가 Arg로, 239번 위치의 Ser이 Lys로 치환된 278-F760(경쇄 서열번호：11)이 제작되었다. 이들 유전자를 코드하는 DNA 서열이 당업자에게 공지의 방법으로 동물 발현용 플라스미드에 삽입되었다. 당해 플라스미드가 도입된 동물세포를 사용하여 전술한 방법으로 발현한 이들 항체 개변체의 농도가 그 정제 후에 측정되었다.
(3-2) 정상 마우스를 사용한 FcγR 결합을 저감시킨 클론 278과 Xolair의 인간 IgE의 소실 가속 효과의 검증
(2-2)와 동일한 방법으로 정상 마우스를 사용하여, 마우스 FcγR에 대한 결합을 저감시킨 278-F760(경쇄 서열번호：11)을 투여했을 때의 IgE의 소실 효과를 검증하였다.
(3-3) 정상 마우스의 혈장 중 hIgE(Asp6) 농도의 측정
(2-3)과 동일한 방법으로 정상 마우스의 혈장 중 hIgE 농도를 측정하였다. 이 방법으로 측정된 정맥내 투여 후의 혈장 중 hIgE 농도 추이를 도 4에 나타내었다. 비교를 위해 도면 중에는 (2-3)에서 얻어진 278-IgG1 투여 시의 혈장 중 hIgE 농도 추이도 나타내었다.
(3-4) 정상 마우스의 혈장 중 항인간 IgE 항체 농도의 측정
(2-4)와 동일한 방법으로 정상 마우스의 혈장 중 항hIgE 항체 농도를 측정하였다.
이 방법으로 측정된 정맥내 투여 후의 혈장 중 항체 농도 추이를 도 5에 나타내었다. 비교를 위해 도면 중에는 (2-3)에서 얻어진 278-IgG1의 혈장 중 항체 농도 추이도 나타내었다.
본 실시예의 결과에서는, 항체와 FcγR의 결합을 저감시킴으로써 혈장 중 항체 농도의 추이에 커다란 변화는 관찰되지 않았으나, 실시예 2에서 관찰된 클론 278의 IgG1 항체 투여 시의 항원의 소실을 가속시키는 효과가 현저히 감약되는 것이 나타내어졌다. 즉, 실시예 2에서 관찰된 항IgE 항체의 동시 투여 시에 관찰된 IgE 소실의 가속은 투여한 항체와 FcγR의 상호작용에 유래하는 것이 나타내어졌다.
이들 사실로부터 항체를 사용하여 표적으로 하는 항원을 효율적으로 제거시키기 위해서는 복수의 항원과 항체로 이루어지는 면역 복합체를 형성시키는 것, 그 항체의 FcγR 결합이 천연형 IgG1 항체와 같은 정도로 유지되어 있는 것, 바람직하게는 항체가 항원에 대해 pH 의존적으로 결합하는 것(pH 산성 조건하에 있어서의 항원에 대한 결합이 중성 조건하에 있어서의 결합보다도 저하되어 있는 것)이 필요할 것으로 생각된다.
〔실시예 4〕FcgRIIb로의 결합을 천연형과 같은 정도로 유지하고, 그 밖의 FcgR로의 결합을 감약시킨 개변체의 제작
(4-1) P238D 개변과 조합시킴으로써 FcgRIIb로의 결합을 유지하고, FcgRIIaR로의 결합을 저감시키는 개변의 검토
FcgRIIb로의 결합을 천연형 IgG1의 그것과 같은 정도로 유지하면서 활성형 FcgR로의 결합만을 선택적으로 저감시킨 항체를 제작하는 데 있어서 가장 곤란하다고 생각되는 과제는, 아미노산 서열의 상동성이 매우 높은 FcgRIIa를 FcgRIIb와 구별하여 선택적으로 결합 활성을 저감시키는 것이라고 생각되었다. FcgRIIa에는 131번째 아미노산이 Arg인 유전자 다형과 His인 유전자 다형이 존재한다. 이 잔기에 대응하는 잔기가 FcgRIIb에서는 Arg이기 때문에 FcgRIIb는 FcgRIIa R형에 의해 서열이 유수하다. 이 때문에 FcgRIIa 중에서도 FcgRIIa R형을 FcgRIIb와 구별하는 것이 특히 곤란한 과제로 생각되었다. 이 FcgRIIaR에 대한 FcgRIIb로의 결합 선택성을 향상시키기 위한 개변으로서, EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환하는 개변이 WO2012/115241에 있어서 보고되어 있다. 본 검토에서는 이 개변을 포함하는 항체를 주형으로 하여 FcgRIIb로의 결합을 천연형 IgG1과 같은 정도로 유지한 채로 다른 FcgR로의 결합을 가능한 한 감약시킨 개변체의 제작을 목표로 하였다.
WO2012/115241의 실시예 5에서 얻어진 Fc(P238D)와 FcγRIIb 세포외영역의 복합체의 X선 결정구조 해석 결과를 토대로, EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 개변 Fc 상에서 FcγRIIb와의 상호작용에 영향을 미칠 것이 예측되는 부위(EU 넘버링 233번째, 234번째, 235번째, 236번째, 237번째, 239번째, 240번째, 241번째, 263번째, 265번째, 266번째, 267번째, 268번째, 271번째, 273번째, 295번째, 296번째, 298번째, 300번째, 323번째, 325번째, 326번째, 327번째, 328번째, 330번째, 332번째, 334번째의 잔기)에 대해 망라적인 개변을 도입하여, 각 FcγR과의 상호작용을 평가하였다.
항체 H쇄 가변영역으로서 WO2009/125825에 개시되어 있는 인간 인터류킨 6 수용체에 대한 항체의 가변영역인 IL6R-H의 가변영역(서열번호：17)을, 항체 H쇄 불변영역으로서 인간 IgG1의 C말단의 Gly 및 Lys를 제거한 G1d를 갖는 IL6R-G1d(서열번호：3)를 제작하였다. 다음으로 참고 실시예 1의 방법에 따라 IL6R-G1d의 EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 IL6R-F648을 제작하였다. 망라적인 개변을 도입하는 주형 H쇄로서는, IL6R-F648에 대해 M252Y 및 N434Y를 도입한 IL6R-F652(서열번호：1)와 IL6R-F648에 대해 K439E를 도입한 IL6R-BF648(서열번호：2) 2종류를 준비하였다. IL6R-F652 또는 IL6R-BF648의 상기 부위에 대해 원래의 아미노산과 Cys를 제외한 18종류의 아미노산을 도입하였다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L(서열번호：6)을 공통으로 사용하여 각각의 H쇄와 함께 참고 실시예 1의 방법에 따라 항체를 발현, 정제하였다. 이들 개변체를 참고 실시예 1의 방법에 따라 항체를 발현, 정제하고, 참고 실시예 2의 방법으로 각 FcγR(FcγRIa, FcγRIIa H형, FcγRIIa R형, FcγRIIb, FcγRIIIa V형)에 대한 결합을 망라적으로 평가하였다.
그 결과, 이 중에서 L235F, G237Q, F241M, F241L, H268P, Q295M, Q295V, Y296E, Y296H, Y296N, Y296D, S298A, S298M, V323I, S324N, S324H, A330H, A330Y를 P238D 개변과 조합시킴으로써 FcgRIIb로의 결합을 크게 저하시키지 않고 FcgRIIaR에 대한 결합을 저감시키는 개변으로서 발견되었다(표 7 및 표 8).
표 7은 IL6R-F652/IL6R-L에 대해 표 8은 IL6R-BF648/IL6R-L에 대해 행한 망라적 개변 도입에 의해 발견된 개변의 FcgRIIaR 및 FcgRIIb로의 상대적 결합 활성을 나타내었다. 이는 각 개변체의 FcgRIIaR 또는 FcgRIIb에 대한 결합량의 값을 IL6R-F652/IL6R-L 또는 IL6R-BF648/IL6R-L의 각 FcgR로의 결합량의 값으로 나누고 100배한 값이다.
Figure pat00007
Figure pat00008
표 7 및 표 8에 나타낸 결과로부터 이들 개변은 모두 개변 도입 전과 비교하여 FcgRIIb로의 결합을 적어도 55.5% 이상으로 유지하면서도 FcgRIIaR로의 결합을 저감시키는 개변인 것이 발견되었다.
이에 본 검토에서는 추가로 이들 개변을 조합시킴으로써 FcgRIIb로의 결합을 IgG1과 같은 정도로 유지한 채로 FcgRIIaR로의 결합을 가능한 저감시킨 개변체의 제작을 검토하였다. 구체적으로는, 표 7 및 표 8 중에서 개변 도입 전과 비교하여 활성형 FcgR에 대한 결합을 선택적으로 저감시키고 있는 것으로 생각되는 개변 또는 그들을 조합시켜 IL6R-F648에 도입하였다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L(서열번호：6)을 공통으로 사용하여 각각의 H쇄와 함께 참고 실시예 1의 방법에 따라 항체를 발현, 정제하였다. 얻어진 개변체의 FcgRIa, FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIIaV에 대한 결합은 참고 실시예 2의 방법에 따라 평가하였다. 여기서 표 9에는 각 개변체의 FcgRIIaR 및 FcgRIIb에 대한 상대적 결합 활성을 나타내었다. 이는 각 개변체의 FcgRIIaR 또는 FcgRIIb에 대한 결합량의 값을 IL6R-G1d/IL6R-L의 FcgRIIaR 또는 FcgRIIb로의 결합량의 값으로 나누고 100배한 값이다.
Figure pat00009
표 9에 나타낸 개변체 중에서 FcgRIIb로의 결합이 IL6R-G1d/IL6R-L의 그것과 비교하여 80% 이상을 유지하고, FcgRIIaR로의 결합이 30% 이하로 저감되어 있는 개변체에 대해서 각 FcgR로의 KD값을 표 10에 나타내었다. 표 중의 상대적 결합 활성이란 IL6R-G1d/IL6R-L의 KD값을 각 개변체의 KD값으로 나눈 값으로, IL6R-G1d/IL6R-L의 각 FcgR에 대한 KD값을 1로 했을 때의 각 개변체의 상대적 결합 활성을 나타낸다. 표 중의 KD값 중 회색으로 칠해진 값은 FcgR의 각 개변체에 대한 결합이 미약하여 속도론적인 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단되었기 때문에, 참고 실시예 2에 기재된
〔식 2〕
Figure pat00010
를 이용하여 산출한 값이다.
Figure pat00011
Figure pat00012
본 검토에서 도입된 개변 중 Y296E를 도입한 P589, F241M을 도입한 P590, F241L을 도입한 P594, Q295V를 도입한 P595, Y296H를 도입한 P597, S298A를 도입한 P600, S298M을 도입한 P601, H268P를 도입한 P718, S324N을 도입한 P719, S324H를 도입한 P720, A330H를 도입한 P721, A330Y를 도입한 P722, L235F를 도입한 P723, G237Q를 도입한 P724, Y296D를 도입한 P725는 FcgRIIb로의 결합을 G1d와 같은 정도나 그 이상으로 유지한 채로 FcgRIIaR로의 결합을 개변 도입 전의 F648보다도 저감시키는 효과가 있는 것이 나타내어졌다. 이들 중에서 가장 FcgRIIaR로의 결합을 저감시키고 있었던 것은 S298A를 도입한 P600으로, FcgRIIb로의 결합을 G1d의 1.2배로 유지한 채로 FcgRIIaR로의 결합을 0.026배로 저감시키고 있었다.
활성형 FcgR에 대한 결합을 선택적으로 저감시키는 효과가 있었던 개변끼리를 조합시켜서 검토한 결과, FcgRIIb로의 결합이 G1d와 비교하여 1.0배 이상이고, 또한 FcgRIIaR로의 결합이 가장 저감되어 있었던 것은 P727이었다. P727은 FcgRIIb로의 결합이 G1d의 1.1배로 유지되고, FcgRIIaR로의 결합이 0.012배로 감약되어 있었다. 또한 FcgRIa에 대한 결합이 G1d의 0.0014배로, FcgRIIaH로의 결합이 0.007배로, FcgRIIIaV로의 결합이 0.005배로 감약되어 있어, FcgRIIb 이외의 활성형 FcgR에 대해 매우 선택적으로 결합을 감약시키는 우수한 개변체였다.
(4-2) FcgRIIb로의 결합을 증강시킨 개변체에 대한 FcgRIIaR로의 결합 저감 검토
다음으로 FcgRIIb로의 결합을 선택적으로 증강시키고 다른 FcgR에 대한 결합은 증강시키지 않거나 또는 저감된 개변체를 주형으로 하여 FcgRIIb도 포함하는 전체 FcgR에 대한 결합을 저감시키는 개변을 도입함으로써, FcgRIIb에 대한 결합은 IgG1과 같은 정도로 유지하는 한편, 다른 FcgR에 대한 결합이 IgG1과 비교하여 저감되어 있는 개변체가 얻어질 것이 기대되었다.
이에 먼저 IL6R-G1d(서열번호：3)에 대해 K439E를 도입한 IL6R-B3(서열번호：4)가 제작되었다. IL6R-B3에 대해 FcgRIIb 선택적 결합을 조합하여 도입함으로써 FcgRIIb로의 결합을 선택적으로 증강시킨 개변체가 제작되었다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L(서열번호：6)을 공통으로 사용하여 각각의 H쇄와 함께 참고 실시예 1의 방법에 따라 항체를 발현, 정제하였다. 얻어진 개변체의 FcgRIa, FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIIaV에 대한 결합은 참고 실시예 2의 방법에 따라 평가하였다. 제작된 개변체의 각 FcgR에 대한 결합 활성을 표 11에 나타낸다. 표 중의 상대적 결합 활성이란, IL6R-B3/IL6R-L의 KD값을 각 개변체의 KD값으로 나눈 값으로, IL6R-B3/IL6R-L의 각 FcgR에 대한 KD값을 1로 했을 때의 각 개변체의 상대적 결합 활성을 나타낸다. 「KD(IIaR)/KD(IIb)」란, 각 개변체의 FcgRIIaR에 대한 KD값을 FcgRIIb에 대한 KD값으로 나눈 값으로, 이 값이 크면 클수록 FcgRIIb에 대한 선택성이 높은 것을 나타낸다. 표 중의 KD값 중 회색으로 칠해진 값은 FcgR의 각 개변체에 대한 결합이 미약하여 속도론적인 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단되었기 때문에, 참고 실시예 2에 기재된
〔식 2〕
Figure pat00013
를 이용하여 산출한 값이다.
Figure pat00014
Figure pat00015
Figure pat00016
Figure pat00017
표 11에 기재한 개변체는 모두 FcgRIIb로의 결합이 IL6R-B3/IL6R-L과 비교하여 증강되어 있고, 그 FcgRIIb로의 결합 증강의 정도는 IL6R-B3/IL6R-L의 2.6배 내지 3090배였다. 또한 IL6R-B3/IL6R-L의 KD(IIaR)/KD(IIb)가 0.3이었던 것에 대해 표 11에 기재한 개변체는 8.7 내지 64.4로 어느 개변체도 FcgRIIb에 대한 선택성(KD(IIaR)/KD(IIb))이 IL6R-B3/IL6R-L과 비교하여 향상되어 있었다.
이들 FcgRIIb에 대해 선택적으로 결합 증강된 개변체에 대해 전체 FcgR에 대한 결합을 저감시키는 개변을 도입함으로써 FcgRIIb에 대한 결합은 IgG1과 같은 정도로 유지되는 한편으로, 다른 활성형 FcgR에 대한 결합이 IgG1과 비교하여 선택적으로 저감되어 있는 개변체가 얻어질 것으로 예측되었다. 이에 실제로 IL6R-BP568/IL6R-L 및 IL6R-BP489/IL6R-L에 도입된 2종류의 FcgRIIb 선택적 결합 증강 개변체를 사용하여 전술한 예측대로의 개변체가 얻어지는지를 확인하였다. 구체적으로는 상기 2개의 FcgRIIb 선택적 결합 증강 개변을 도입한 개변체를 주형으로서 사용하여 FcgRIIb에 대한 결합은 IgG1과 같은 정도로 유지되는 한편으로, 다른 활성형 FcgR에 대한 결합이 IgG1과 비교하여 선택적으로 저감되어 있는 개변체를 얻는 것이 가능한 것을 확인하였다. 구체적으로는, IL6R-BP568/IL6R-L 및 IL6R-BP489/IL6R-L에 사용된 FcgRIIb 결합 증강 개변을 IL6R-G1d에 도입함으로써 2종류의 FcgRIIb에 대한 결합을 선택적으로 증강시키는 개변체 IL6R-P577 및 IL6R-P587이 제작되었다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L(서열번호：6)을 공통으로 사용하여 각각의 H쇄와 함께 참고 실시예 1의 방법에 따라 항체를 발현, 정제하였다. 이들 2개의 개변체의 각 FcgR에 대한 KD값을 표 12에 나타낸다.
Figure pat00018
P577의　FcgRIIaR로의 결합은 G1d와 비교하여 21.9배, FcgRIIb로의 결합은 3370.7배였다．또한 P587의 FcgRIIaR로의 결합은 G1d와 비교하여 1.4배, FcgRIIb로의 결합은 255.6배였다.
제작된 2종류의 FcgRIIb 결합 증강 개변체에 대해 전체 FcgR에 대한 결합을 저감시키는 개변을 도입함으로써 FcgRIIb로의 결합을 천연형 IgG1과 같은 정도로 유지하면서, 다른 FcgR, 특히 FcgRIIaR에 대한 결합을 가능한 한 감약시킨 개변체의 제작을 검토하였다. FcgRIIaR에 대한 결합을 대폭 저감시키는 개변은 FcgR과의 상호작용 잔기에 망라적으로 개변을 도입하는 검토를 실시함으로써 발견되었다. 실시예 4-1에서 나타낸 IL6R-F652/IL6R-L의 EU 넘버링 234번째, 235번째, 236번째, 237번째, 239번째에 대한 망라적 개변 도입에 더하여 FcgRIIb 선택적 증강 개변체에 대한 망라적 개변 도입이 실시되었다.
WO2012/115241에 있어서 보고되어 있는 FcgRIIb 증강 개변(E233D/G237D/H268E/P271G)을 IL6R-BF648(서열번호：2)에 도입하여 IL6R-BP267(서열번호：5)이 제작되었다. IL6R-BP267의 EU 넘버링 265번째, 266번째, 267번째, 269번째를 원래의 아미노산과 Cys를 제외한 18종류의 아미노산으로 치환한 개변체가 제작되었다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L(서열번호：6)을 공통으로 사용하여 각각의 H쇄와 함께 참고 실시예 1의 방법에 따라 항체를 발현, 정제하였다. 이들 개변체를 참고 실시예 1의 방법에 따라 항체를 발현, 정제하고, 참고 실시예 2의 방법으로 각 FcγR(FcγRIa, FcγRIIa H형, FcγRIIa R형, FcγRIIb, FcγRIIIa V형)에 대한 결합을 망라적으로 평가하였다. 표 13은 IL6R-F652/IL6R-L에 대해, 표 14는 IL6R-BP267/IL6R-L에 대해 행한 망라적 개변 도입에 의해 발견된 개변의 FcgRIIaR 및 FcgRIIb로의 상대적 결합 활성을 나타내었다. 이는 각 개변체의 FcgRIIaR 또는 FcgRIIb에 대한 결합량의 값을 IL6R-F652/IL6R-L 또는 IL6R-BP267/IL6R-L의 각 FcgR로의 결합량의 값으로 나누고 100배한 값이다.
Figure pat00019
Figure pat00020
표 13 및 표 14의 결과로부터, 이들 개변은 개변 도입 전과 비교하여 FcgRIIaR로의 결합을 적어도 67% 이하로 저감시키고, 그 중에는 그 결합을 완전히 상실시키는 개변도 포함되는 것이 나타내어졌다.
다음으로 이들 개변을 FcgRIIb 선택적 결합 증강 개변체에 도입하고 검토하였다. 구체적으로는, 표 13 및 표 14에 나타낸 17 개변이 참고 실시예 1의 방법에 따라 IL6R-P577, IL6R-P587에 대해 도입되었다. 또한 항체는 Fc영역의 EU 넘버링 297번째의 Asn에 부가된 N형 당쇄를 제거함으로써, FcgR에 대한 결합이 현저히 저감되는 것이 보고되어 있다(The Journal of Biological Chemistry, 2000, 276, 6591-6604). 이 때문에 본 실시예에서는 전술한 17 개변에 더하여 Asn297에 부가되어 있는 N형 당쇄를 제거하기 위해 N297A가 참고 실시예 1의 방법에 따라 IL6R-P577, IL6R-P587에 대해 도입되었다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L(서열번호：6)을 공통으로 사용하여 각각의 H쇄와 함께 참고 실시예 1의 방법에 따라 항체를 발현, 정제하였다. 얻어진 개변체의 FcgRIa, FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb, FcgRIIIaV에 대한 결합은 참고 실시예 2의 방법에 따라 평가하였다. 여기서 표 15에는 각 개변체의 FcgRIIaR 및 FcgRIIb에 대한 상대적 결합 활성을 나타내었다. 이는 각 개변체의 FcgRIIaR 또는 FcgRIIb에 대한 결합량의 값을 IL6R-G1d/IL6R-L의 FcgRIIaR 또는 FcgRIIb로의 결합량의 값으로 나누고 100배한 값이다.
Figure pat00021
표 15에 나타내는 바와 같이 S239K를 도입한 개변체 P606, P607, D265K를 도입한 P630, P645, D265R을 도입한 P632, P647, D265V를 도입한 P634, P649는 FcgRIIaR, FcgRIIb로의 결합이 거의 확인되지 않았다. 즉 이들 개변은 FcgRIIb에 대한 결합을 증강시킨 개변체에 도입되었다 하더라도 FcgRIIb에 대한 결합 활성도 현저히 감소되어 버리는 개변이다. 한편 P587에 대해 S267R을 도입한 P636이나 P577에 대해 N297A를 도입한 P665는 FcgRIIb로의 결합이 G1d와 거의 같은 정도인 한편, FcgRIIaR에 대한 결합이 대폭 저감되어 있었다.
표 15에 나타낸 개변체 중 FcgRIIb로의 결합이 G1d의 80% 이상을 유지하고, FcgRIIaR로의 결합이 G1d의 30% 이하로 억제되어 있는 개변체의 각 FcgR로의 KD를 표 16에 나타내었다. 표 중의 상대적 결합 활성이란 IL6R-G1d/IL6R-L의 KD값을 각 개변체의 KD값으로 나눈 값으로, IL6R-G1d/IL6R-L의 각 FcgR에 대한 KD값을 1로 했을 때의 각 개변체의 상대적 결합 활성을 나타낸다. 표 중의 KD값 중 회색으로 칠해진 값은 FcgR의 각 개변체에 대한 결합이 미약하여 속도론적인 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단되었기 때문에, 참고 실시예 2에 기재된
〔식 2〕
Figure pat00022
를 이용하여 산출한 값이다.
Figure pat00023
이들 개변체 중에서 FcgRIIaR로의 결합이 가장 저감되어 있었던 것은 P587에 대해 S267R을 도입한 P636이었다. P636은 FcgRIIaR에 대한 KD가 G1d의 0.023배였으나, FcgRIIb로의 KD는 G1d의 1.8배를 유지하고 있었다. 또한 FcgRIa에 대한 결합이 G1d의 0.0007배로, FcgRIIaH에 대한 결합이 0.006배로, FcgRIIIaV로의 결합이 0.008배로 억제되어 있었다. 이상의 결과로부터 FcgRIIb에 대해 선택적으로 결합 증강된 개변체에 대해 전체 FcgR로의 결합을 저감시키는 개변을 도입함으로써 FcgRIIb에 대한 결합은 IgG1과 같은 정도를 유지하면서, 다른 FcgR에 대한 결합을 IgG1보다도 저감시킨 개변체가 얻어지는 것이 나타내어졌다.
(4-3) FcgRIIaR로의 결합 저감 효과가 있는 개변의 조합 검토
4-1, 4-2에 있어서 발견된 FcgRIIb로의 결합을 G1d와 같은 정도로 유지하면서 FcgRIIaR로의 결합이 저감된 개변을 조합시켜 보다 우수한 개변체의 제작을 검토하였다.
표 17에 조합 검토 결과를 나타낸다. 표 중의 상대적 결합 활성이란 IL6R-G1d/IL6R-L의 KD값을 각 개변체의 KD값으로 나눈 값으로, IL6R-G1d/IL6R-L의 각 FcgR에 대한 KD값을 1로 했을 때의 각 개변체의 상대적 결합 활성을 나타낸다. 표 중의 KD값 중 회색으로 칠해진 값은 FcgR의 각 개변체에 대한 결합이 미약하여 속도론적인 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단되었기 때문에, 참고 실시예 2에 기재된
〔식 2〕
Figure pat00024
를 이용하여 산출한 값이다.
Figure pat00025
표 17에 기재한 개변체 중 FcgRIIaR에 대한 결합을 가장 저감시키고 있었던 것은 FcgRIIb 선택적 결합 증강 개변체 P587에 대해 S267R, H268P, Y296E를 조합하여 도입한 P712로, FcgRIIb로의 결합이 G1d와 비교하여 1.5배로 유지된 채로 FcgRIIaR로의 결합이 G1d와 비교하여 0.017배로 저감되어 있었다. 또한 FcgRIa에 대한 결합은 G1d와 비교하여 0.0005배로, FcgRIIaH에 대한 결합이 0.003배로, FcgRIIIaV에 대한 결합이 0.004배로 억제되어 있었다.
〔실시예 5〕FcgRIIb로의 결합을 천연형과 같은 정도로 유지하고, 그 밖의 FcgR로의 결합을 감약시키며, 또한 보체로의 결합을 감약시킨 개변체의 제작
CDC(complement-dependent cytotoxicity)는 ADCC와 마찬가지로 면역 반응을 야기하는 이펙터 기능이다. 지금까지 제작한 개변체는 모두 FcgRIIb 이외의 활성형 수용체에 대한 결합 활성이 크게 저감되어 있어 ADCC 활성은 크게 감약되어 있을 것으로 생각된다. 그러나 항체와 보체의 결합 부위는 항체와 FcgR의 결합 부위와는 다르기 때문에, 보체에 대한 결합 활성은 유지되어 있을 가능성이 있다. 이에 각 개변체의 보체로의 결합 활성을 평가하고 보체로의 결합을 저감시키는 개변을 조합함으로써, 보체로의 결합에 대해서도 감약시킨 개변체를 제작하는 것으로 하였다.
항체와 인간 C1q의 상호작용 해석은 Biacore T200(GE 헬스케어)을 사용해서 행하였다. 러닝 버퍼에는 HBS-EP+(GE 헬스케어)를 사용하고, 측정 온도는 25℃로 하였다. Series S sensor Chip CM4(GE 헬스케어)에 아민 커플링법으로 Protein L(ACTIGEN 또는 BioVision)을 고정화한 칩을 사용하였다.
이들 센서칩에 목적의 항체를 캡쳐시키고 러닝 버퍼로 희석한 human complement C1q(PROSPEC 또는 Calbiochem)를 상호작용시켜 항체에 대한 결합량을 측정하여 항체 간에 비교하였다. 단, C1q의 결합량은 캡쳐한 항체의 양에 의존하기 때문에 각 항체의 캡쳐량으로 C1q의 결합량을 나눈 보정값으로 비교하였다. 또한 10 mM glycine-HCl, pH 1.5를 반응시킴으로써 센서칩에 캡쳐한 항체를 세정하고 센서칩을 재생하여 반복해서 사용하였다.
C1q로의 결합을 저감시키는 개변으로서는 선행기술(J. Immunol, 2003, 164, 4178-4184)에 기재된 K322A를 사용하였다. 또한 EU 넘버링 322번째의 Lys를 반대의 전하를 갖는 Glu로 치환하는 것으로도 C1q와의 결합이 저감될 것으로 기대되었기 때문에 K322E에 대해서도 검토하였다. 또한 IgG4는 IgG1과 비교하여 CDC 활성이 현저히 낮고, 이는 CH2 도메인 C말단의 서열의 차이에 기인하는 것이 보고되어 있다(J. Exp. Med., 1991, 173, 1025-1028). 이에 IgG1의 EU 넘버링 327번째의 Ala를 Gly로, 330번째의 Ala를 Ser로, 331번째의 Pro를 Ser로 하여 IgG4형의 서열로 함으로써 C1q로의 결합을 저감시키는 검토에 대해서도 함께 행하였다.
구체적으로는, FcgRIIb로의 결합을 증강시킨 개변체 또는 FcgRIIb로의 결합을 유지한 채로 다른 FcgR로의 결합을 저감시킨 개변체의 인간 C1q로의 결합을 평가하였다. 또한 이들에 대해 C1q로의 결합을 저감시키는 개변을 조합한 개변체를 제작하여 평가하였다. 또한 모든 개변체에 대해 참고 실시예 2의 방법에 따라 제작한 개변체의 각 FcgR로의 결합을 평가하였다. C1q로의 결합 평가에 있어서의 음성 대조로서 인간 IgG4를 사용하였다. 인간 IgG4의 EU 넘버링 228번째의 Ser을 Pro로 치환하고, C말단의 Gly 및 Lys를 제거한 G4d를 갖는 IL6R-G4d(서열번호：52)를 제작하였다. 항체 L쇄로서는 IL6R-L(서열번호：6)을 공통으로 사용하였다.
표 18은 제작한 개변체와 인간 C1q로의 결합을 평가한 결과이다. 표 중의 「G1d를 100으로 했을 때의 C1q에 대한 결합량」이란 각 개변체에 대한 C1q의 결합량을 각 개변체의 캡쳐량으로 나눈 것으로, 이를 IL6R-G1d/IL6R-L의 C1q로의 결합량을 IL6R-G1d/IL6R-L의 캡쳐량으로 나눈 값으로 나누고 100배한 값이다. 즉, IL6R-G1d/IL6R-L과 비교하여 어느 정도 C1q에 결합하는지를 나타내는 것이다.
Figure pat00026
천연형의 서열을 갖는 G1d를 100으로 한 경우, 음성 대조인 G4d는 15.5였다. 또한 C1q로의 결합을 저감시키는 개변을 G1d에 도입한 G1dK322A, G1dK322E, G1dGSS의 C1q로의 결합은 각각 20.5, 2.3, 15.2로 G4d와 동등 이하이고, 개변 도입 전과 비교하여 C1q로의 결합이 크게 저감되어 있는 것을 알 수 있었다. 또한 FcgRIIB에 대해 선택적으로 결합을 증강시키는 P238D 개변을 도입한 F648은 C1q로의 결합 저감 개변을 사용하지 않고도 C1q로의 결합이 G4d와 같은 정도인 것이 명확해졌다. 또한 이에 대해 추가로 C1q 결합 저감 개변을 도입한 P741, P742, P743의 C1q로의 결합능은 모두 G4d와 동등 이하였다.
FcgRIIb로의 결합을 천연형과 같은 정도로 유지하고, 그 밖의 FcgR로의 결합능을 감약시킨 개변체인 P600, P691, P727, P729, P733, P737 중 P600, P691, P729, P733은 모두 G4d와 같은 정도의 C1q 결합 활성이었다. 한편으로 P727, P737은 G1d와 비교하면 크게 감약되어 있으나, G4d와 비교하여 2배 이상의 결합능을 나타내었다. 양 개변체에는 공통적으로 A330H의 개변이 도입되어 있어 이로 인해 C1q로의 결합이 증강된 것으로 생각된다. 그러나 어느 개변체에 있어서도 C1q 결합 저감 개변인 K322A 또는 K322E를 도입함으로써 C1q로의 결합 활성이 G4d 이하로 억제되었다.
FcgRIIb로의 결합을 증강시킨 개변체인 P587, P588, P769, P112, P555, P556, P559, P562, P763, P764, P765 중 P587 및 P588은 C1q로의 결합이 G1d와 동등 이상인 것이 명확해졌다. 또한 P769, P556, P559, P562, P763, P765는 G1d와 비교하면 크게 감약되어 있으나, G4d와 비교하여 2배 정도의 결합능을 나타내었다. 한편으로 P112, P764는 G4d와 같은 정도의 C1q 결합 활성이었다. 또한 어느 개변체에 있어서도 C1q 결합 저하 개변을 도입함으로써 C1q로의 결합 활성이 G4d와 동등 이하로 억제되는 것이 나타내어졌다.
표 19에는 각 개변체의 FcgRIIaR 및 FcgRIIb에 대한 상대적 결합 활성을 나타내었다. 이는 각 개변체의 FcgRIIaR 또는 FcgRIIb에 대한 결합량의 값을 IL6R-G1d/IL6R-L의 FcgRIIaR 또는 FcgRIIb로의 결합량의 값으로 나누고 100배한 값이다.
Figure pat00027
표 19에 나타내어진 보체로의 결합을 저감시키는 개변을 포함하는 개변체는 FcgRIIaR에 대한 상대적 결합 활성이 G1d와 비교하여 105% 이하로, 또한 FcgRIIb로의 상대적 결합 활성이 G1d와 비교하여 48% 이상을 유지하고 있었다.
표 20에는 이들 개변체의 각 FcgR로의 결합을 나타내었다. 표 중의 상대적 결합 활성이란 IL6R-G1d/IL6R-L의 KD값을 각 개변체의 KD값으로 나눈 값으로, IL6R-G1d/IL6R-L의 각 FcgR에 대한 KD값을 1로 했을 때의 각 개변체의 상대적 결합 활성을 나타낸다. 표 중의 KD값 중 회색으로 칠해진 값은 FcgR의 각 개변체에 대한 결합이 미약하여 속도론적인 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단되었기 때문에, 참고 실시예 2에 기재된
〔식 2〕
Figure pat00028
를 이용하여 산출한 값이다.
Figure pat00029
Figure pat00030
C1q 결합 저감 개변의 FcgRIIb에 대한 결합능에 대한 영향을 비교하면, G1d에 대해 K322A를 도입한 G1dK322A의 경우는 G1d와 비교하여 1.0배, K322E를 도입한 G1dK322E의 경우는 1.1배, A327G/A330S/P331S를 도입한 G1dGSS의 경우는 0.9배로, 어느 C1q 결합 저감 개변도 FcgRIIb로의 결합에 거의 영향을 미치지 않는다. FcgRIIb로의 결합을 선택적으로 증강시키는 P238D 개변을 포함하는 F648에 대해 K322A를 도입한 P741 또는 K322E를 도입한 P742의 경우는, 개변 도입 전의 F648과 비교하여 hFcgRIIb로의 결합이 거의 변하지 않는 것에 대해, A327G/A330S/P331S를 도입한 P743의 경우는 FcgRIIb로의 결합능이 약간 저하되어 G1d의 0.6배가 되었다. 이상의 결과로부터 P238D 개변과 조합시킨 경우, K322A나 K322E 개변은 FcgRIIb로의 결합능을 저하시키지 않고 C1q로의 결합능을 감약시키나, A327G/A330S/P331S 개변은 FcgRIIb로의 결합능을 약간 저하시키는 것이 명확해졌다. 이 결과는 그 밖의 P238D 개변을 포함하는 개변체에 대해 도입한 경우에도 동일하다. 예를 들면 P600에 대해 K322A를 도입한 P744의 경우는 FcgRIIb로의 결합은 G1d와 비교하여 0.7배, K322E를 도입한 P745의 경우는 0.7배이나, A327G/A330S/P331S를 도입한 P781의 경우는 0.2배로 약간 저하되어 있다.
한편으로 면역원성이라는 관점에서는 K322A나 K322E를 도입하기보다도 천연형 인간 IgG4의 서열인 A327G/A330S/P331S를 도입하는 편이 바람직할 것으로 생각된다. 이 때문에 FcgRIIb로의 결합을 증강시키는 개변이 도입된 개변체에 C1q 결합을 저감시키기 위한 개변을 도입하는 경우는, A327G/A330S/P331S 개변이 보다 바람직한 경우가 있다. 예를 들면 P781에 대해 E233D와 G237D를 조합한 P787의 경우는, A327G/A330S/P331S 개변의 도입에 의해 C1q 결합이 저감되어 있는 한편으로, 활성형 FcgR로의 결합은 크게 증강되지 않고 FcgRIIb로의 결합이 0.2배 내지 0.5배로 향상되어 있다.
본 검토에서 제작한 FcgRIIb로의 결합을 증강 또는 유지하고, 또한 보체로의 결합을 저감시킨 개변체는 모두 FcgRIIb로의 결합이 G1d의 0.2배 이상으로 FcgRIIaR로의 결합이 G1d의 1.0배 이하로 억제되어 있었다. 또한 FcgRIa로의 결합은 G1d의 0.85배 이하로, FcgRIIaH로의 결합은 0.036배 이하로, FcgRIIIaV로의 결합은 0.012배 이하로 억제되어 있었다. 이들 중에서도 A327G/A330S/P331S 개변을 도입한 개변체 중 P756, P757, P758, P759, P760, P761, P762, P766, P767, P768, P770, P784는 모두 FcgRIIb로의 결합이 G1d보다도 증강되어 있고, FcgRIIaR로의 결합이 G1d의 1.0배 이하였다.
이상의 결과로부터, FcgRIIb로의 결합을 증강 또는 FcgRIIb로의 결합을 천연형과 같은 정도로 유지하고, 다른 FcgR로의 결합을 감약시킨 개변체에 보체로의 결합을 저감시키는 개변을 도입함으로써 FcgRIIb로의 결합 선택성이 우수하고, 또한 C1q로의 결합이 감약된 개변체가 제작 가능한 것이 나타내어졌다.
〔실시예 6〕Fc 개변체의 수상 세포(DC)의 활성화능의 평가
(6-1) Fc 개변체의 수상 세포(DC)의 활성화능의 평가
지금까지 항체의 Fc 부분을 매개로 세포 표면 상에 발현되고 있는 활성형 FcγR, 특히 FcγRIIa가 가교됨으로써 수상 세포가 활성화되는 것이 보고되어 있다(The Journal of Clinical Investigation, 2005, 115, 2914-2923, The Journal of Immunology, 2003, 170, 3963-3970). 실시예 4에서 제작한 활성형 FcγR에 대한 결합을 선택적으로 저감시킨 Fc 개변체에 대해서 항체의 Fc 부분을 매개로 한 수상 세포 활성화능이 저감되어 있는지를 검증하였다.
(6-2) Fc 개변체의 조제
참고 실시예 1의 방법에 따라 XolairH-G1d(서열번호：18)，XolairH-G1d의 EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로 치환한 XolairH-F648, XolairH-G1d의 EU 넘버링 238번째의 Pro를 Asp로, 298번째의 Ser을 Ala로 치환한 XolairH-P600을 제작하였다. 항체 L쇄로서는 XolairL-k0(서열번호：7)를 공통으로 사용하여 각각의 H쇄와 함께 참고 실시예 1의 방법에 따라 항체를 발현, 정제하였다. 각 Fc 개변체는 각각 G1d，F648，P600으로 표기한다.
(6-3) 단핵세포(monocyte)의 단리와 수상 세포로의 분화 유도
인간 전혈과 등량의 RPMI 배지를 혼합하고 피콜(ficol)로 백혈구층을 분리한다. 백혈구층으로부터 Monocyte Isolation Kit II(Miltenyi Biotec)를 사용하여 단핵세포(monocyte)를 단리하였다. 단핵세포(monocyte)를 RPMI 배지(10% FBS, 100 ng/ml hIL-4(R&D systems), 250 ng/ml hGM-CSF (R&D systems))에서 5×105 cells/mL로 조제하고, 37도에서 7일간 배양하여 DC로 분화 유도하였다.
(6-4) 플레이트 코트와 DC의 자극
96 well plate(maxisorp, nunc)에 PBS로 희석한 각 Fc 개변체(G1d，F648，P600)가 포함되는 용액(50 ㎍/ml) 또는 PBS를 100 ㎕/well로 첨가하고, 실온에서 1시간 진탕하였다. PBS로 3회 세정하고, DC를 2×105 cells/well로 파종하였다. 37도에서 4시간 인큐베이트한 후에 세포를 회수하고, RNeasy 96 Kit(QIAGEN)를 사용하여 RNA를 추출하였다.
(6-5) IL-8 발현의 평가
QuantiTect Probe RT-PCR(QIAGEN)을 사용하여 GAPDH 및 IL-8의 mRNA의 발현량을 real-time PCR(Applied Biosystems 7900HT Fast Real Time PCR System)로 측정하였다. IL-8의 발현량은 GAPDH의 발현량으로 보정하였다. 이 평가계에 있어서 양성 대조인 G1d를 사용한 경우에는 IL-8의 발현량이 8.2로 올라가고, 항체용액 대신에 PBS를 첨가한 경우에는 IL-8의 발현량이 0.03인 것이 확인되었다.
본 평가계에 있어서 Fc 개변체인 F648과 P600을 각각 첨가한 경우의 DC의 IL-8의 발현량을 비교한 바 도 6의 결과가 얻어졌다.
이 결과로부터, P600은 F648과 비교하여 DC의 IL-8 발현량을 억제하는 것, 즉 DC를 활성화하는 성질이 저감되는 것이 발견되었다. P600은 F648과 비교하여 활성형 FcγR인 FcγRIIa에 대한 결합이 저감되어 있다. 이들 사실로부터 P600은 특히 FcγRIIa에 대한 결합이 저감된 결과로서 DC의 IL-8 발현량을 저감, DC의 활성화를 억제한 것으로 생각되었다.
즉, FcγRIIa를 포함하는 활성형 FcγR에 대해 보다 선택적으로 결합을 저감시킨 본 발명의 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자는, 항원의 혈장 중 농도를 신속하게 저감시킨다는 천연형 IgG1의 성질을 손상시키지 않고 면역세포를 활성화한다는 문제점을 극복한 우수한 분자일 가능성이 시사되었다.
〔실시예 7〕FcγRIIb에 대한 결합을 증강시키는 기존의 개변이 가해진 Fc영역을 포함하는 항체의 혈소판 응집능의 평가
(7-1) IgG1 항체의 혈소판 활성화, 응집의 배경
지금까지 몇 개의 IgG1 항체가 FcγR과의 상호작용을 매개로 혈소판 활성화를 유도하여 부작용을 나타내는 것이 보고되어 있다. 예를 들면 VEGF에 대한 항체인 베바시주맙(bevacizumab)이 투여된 환자군에서는 혈전 색전증의 리스크가 상승되는 것이 알려져 있다(J. Natl. Cancer Inst. (2007) 99 (16), 1232-1239). 또한 CD40 리간드(CD154)에 대한 항체의 임상 개발 시험에 있어서도 마찬가지로 혈전 색전증이 관찰되어 임상 시험이 중지되었다(Arthritis. Rheum. (2003) 48 (3), 719-727.). 혈소판의 세포 상에는 억제형 Fcγ 수용체인 FcγRIIb가 아닌 활성형 Fcγ 수용체인 FcγRIIa가 발현되고 있는데(J. Exp. Med. (2006) 203 (9), 2157-2164), 동물 모델 등을 사용한 그 후의 연구에 의해, 투여된 어느 항체도 혈소판 상의 FcγRIIa에 대한 결합을 매개로 혈소판이 응집되고, 그 결과 혈전을 형성하는 것이 시사되어 있다(J. Thromb. Haemost. (2009) 7 (1), 171-181, J. Immunol. (2010) 185 (3), 1577-1583). 자기면역 질환의 하나인 전신성 에리테마토데스의 환자에 있어서는 FcγRIIa 의존적인 메커니즘에 의해 혈소판이 활성화되어 혈소판의 활성화가 중증도와 상관하는 것이 보고되어 있다(Sci. Transl. Med. (2010) 2 (47), 47-63). 이와 같이 천연에 존재하는 IgG1 항체라도 혈소판을 활성화하여 심각한 부작용을 나타낼 가능성이 있다.
(7-2) 항CD154 항체를 사용한 혈소판 활성화의 평가
혈소판의 활성화는 혈소판 상에 발현되는 FcγRIIa와 IgG1의 Fc의 상호작용에 유래한다는 보고가 있는 것으로부터, IgG1의 FcγRIIa에 대한 결합을 저감시킨 항체를 사용함으로써 이 혈소판 활성화를 회피할 수 있는지를 검증하였다.
참고 실시예 2의 방법을 사용하여 CD40 리간드에 대한 IgG1 항체인 5c8-G1d(중쇄 서열번호：8, 경쇄 서열번호：9)를 준비하였다. 다음으로 참고 실시예 2의 방법을 사용하여 FcγRIIa에 대한 결합을 저감시킨 기존의 기술인 5c8-G1d의 Fc영역에 있어서의 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Asp로 치환된 Fc영역을 포함하는 항체 5c8-F648(경쇄 서열번호：9)을 준비하였다. 이에 더하여 참고 실시예 2의 방법을 사용하여 기존 기술보다도 더욱 FcγRIIa에 대한 결합을 저감시킨 5c8-G1d의 Fc영역에 있어서의 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Glu로, 298번 위치의 Ser이 Ala로 치환된 Fc영역을 포함하는 항체 5c8-P600(경쇄 서열번호：9)을 준비하였다. 5c8-G1d, 5c8-F648, 5c8-P600은 각각 아래에서 G1d, F648, P600으로서 나타내었다. 이들 Fc 개변체의 혈소판 응집능이 평가되었다.
혈소판의 활성화는 아래의 방법으로 평가하였다. 먼저, FcγRIIa의 유전자 다형(R131/R131)의 도너 유래의 약 50 mL의 전혈을 0.5 mL의 3.2% 구연산나트륨을 포함하는 4.5 mL 진공 채혈관에 일정 분량씩 채취된 약 50 mL의 전혈을 200 g으로 15분간 원심분리함으로써 회수된 상청이 Platelet Rich Plasma(PRP)로서 사용되었다. 완충액 A(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 0.42 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 5.55 mM dextrose, 1.5 U/mL apyrase, 0.35 % BSA)를 사용하여 세정된 PRP은, 추가로 완충액 B(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 0.42 mM NaH2PO4, 2 mM MgCl2, 5 mM HEPES, 5.55 mM dextrose, 2 mM CaCl2, 0.35 % BSA)로 치환되었다. 그 결과, 약 300,000/μL 밀도의 세정 혈소판이 조제되었다. 혈소판 응집능 측정장치에 설치된 교반봉을 포함하는 측정용 큐벳에 168 μL의 세정 혈소판이 분주되었다. 당해 장치 내에서 37.0℃로 유지된 큐벳 내에서 혈소판은 교반봉에 의해 1000 rpm으로 교반되었다. 거기에 최종 농도가 항체 120 ㎍/mL, 항원 111 ㎍/mL가 되도록 조제된 각 항체와 항원의 면역 복합체를 42 μL 첨가하고, 혈소판과 당해 면역 복합체를 5분간 반응시켰다. 또한 2차 응집을 일으키지 않는 농도의 아데노신 2인산(ADP, SIGMA)이 반응액에 첨가되어 활성화가 증강되는지가 확인되었다.
혈소판의 활성화는 CD62p(p-selectin) 또는 활성형 인테그린(PAC-1) 등의 활성화 마커의 혈소판 막 표면에 있어서의 발현 증가에 의해 측정할 수 있다. 전술한 방법으로 조제된 세정 혈소판 8 μL의 세정 혈소판에 면역 복합체를 2 μL 첨가하고 실온에서 5분간 반응시킨 후, 추가로 경미한 활성화를 유도하는 농도의 ADP를 첨가하여 활성화가 야기되고, 면역 복합체에 의해 ADP에 의한 활성화가 증강되는지가 확인되었다. 음성 대조에는 면역 복합체 대신에 인산 완충액(pH 7.4)(Gibco)을 첨가한 샘플이 사용되었다. 반응 후의 각 샘플에 PE 표지 항CD62 항체(BECTON DICKINSON), PerCP 표지 항CD61 항체, FITC 표지 PAC-1 항체(BD bioscience)를 첨가함으로써 염색되었다. 각 염색의 형광 강도가 플로우 사이토미터(FACS CantoII, BD bioscience)를 사용하여 측정되었다. 이 어세이계에서 양성 대조인 5c8-G1d를 첨가한 경우, 혈소판의 CD62p 및 PAC-1의 발현이 항진되는 것이 확인되었다.
이 어세이계를 사용하여 F648 및 P600의 혈소판 활성화능을 비교하였다. 각 Fc 개변체 첨가 시의 CD62p 발현의 결과를 도 7에, 활성화 인테그린 발현의 결과를 도 8에 나타내었다. ADP 자극에 의해 혈소판 막 표면에 발현 유도되는 CD62p 및 활성형 인테그린은 F648을 첨가한 경우에서는 발현의 항진이 관찰되었으나, P600을 첨가한 경우에서는 관찰되지 않았다.
이들 결과로부터, IgG1의 Fc영역의 EU 넘버링으로 표시되는 238번 위치의 Pro가 Asp, 298번 위치의 Ser이 Ala로 치환된 인간 FcγRIIa에 대한 결합을 저감시킨 개변이 가해진 Fc영역을 포함하는 항체는 기존 기술의 FcγRIIb에 대한 결합을 선택적으로 증강시킨 Fc 개변체와 비교하여 억제되는 것이 명확해졌다.
즉, FcγRIIa에 대해 보다 선택적으로 결합을 저감시킨 본 발명의 Fc영역을 포함하는 항원 결합 분자는, 항원의 혈장 중 농도를 신속하게 저감시킨다는 천연형 IgG1의 성질을 손상시키지 않고 혈소판을 활성화한다는 문제점을 극복한 우수한 분자일 가능성이 나타내어졌다.
〔참고 실시예 1〕항체의 발현 벡터의 제작 및 항체의 발현과 정제
항체의 가변영역의 H쇄 및 L쇄의 염기서열을 코드하는 전장 유전자의 합성은 Assemble PCR 등을 사용하여 당업자 공지의 방법으로 제작하였다. 아미노산 치환의 도입은 PCR 등을 사용하여 당업자 공지의 방법으로 행하였다. 얻어진 플라스미드 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입하고, H쇄 발현 벡터 및 L쇄 발현 벡터를 제작하였다. 얻어진 발현 벡터의 염기서열은 당업자 공지의 방법으로 결정하였다. 제작한 플라스미드를 인간 태아 신장암 세포 유래 HEK293H주(Invitrogen사) 또는 FreeStyle293세포(Invitrogen사)에 일과성으로 도입하고, 항체의 발현을 행하였다. 얻어진 배양상청을 회수한 후, 0.22 ㎛ 필터 MILLEX(R)-GV(Millipore) 또는 0.45 ㎛ 필터 MILLEX(R)-GV(Millipore)를 통과시켜 배양상청을 얻었다. 얻어진 배양상청으로부터 rProtein A Sepharose Fast Flow(GE 헬스케어) 또는 Protein G Sepharose 4 Fast Flow(GE 헬스케어)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 항체를 정제하였다. 정제 항체 농도는 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하고, 얻어진 값으로부터 PACE 등의 방법으로 산출된 흡광계수를 사용하여 항체 농도를 산출하여다(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423).
〔참고 실시예 2〕FcγR의 조제방법 및 개변 항체와 FcγR의 상호작용 해석방법
FcγR의 세포외 도메인을 아래의 방법으로 조제하였다. 먼저 FcγR의 세포외 도메인의 유전자 합성을 당업자 공지의 방법으로 실시하였다. 그때 각 FcγR의 서열은 NCBI에 등록되어 있는 정보를 토대로 제작하였다. 구체적으로는 FcγRI에 대해서는 NCBI의 액세션번호 NM_000566.3의 서열, FcγRIIa에 대해서는 NCBI의 액세션번호 NM_001136219.1의 서열, FcγRIIb에 대해서는 NCBI의 액세션번호 NM_004001.3의 서열, FcγRIIIa에 대해서는 NCBI의 액세션번호 NM_001127593.1의 서열, FcγRIIIb에 대해서는 NCBI의 액세션번호 NM_000570.3의 서열을 토대로 제작하고, C말단에 His 태그를 부가하였다. 또한 FcγRIIa, FcγRIIIa, FcγRIIIb에 대해서는 다형이 알려져 있는데, 다형 부위에 대해서는 FcγRIIa에 대해서는 J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25, FcγRIIIa에 대해서는 J. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070, FcγRIIIb에 대해서는 J. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691을 참고로 하여 제작하였다.
얻어진 유전자 단편을 동물세포 발현 벡터에 삽입하여 발현 벡터를 제작하였다. 제작한 발현 벡터를 인간 태아 신장암 세포 유래 FreeStyle293세포(Invitrogen사)에 일과성으로 도입하여 목적 단백질을 발현시켰다. 또한 결정 구조 해석용으로 사용한 FcγRIIb에 대해서는 최종농도 10 ㎍/mL의 Kifunesine 존재하에서 목적 단백질을 발현시켜 FcγRIIb에 부가되는 당쇄가 고만노오스형이 되도록 하였다. 배양하고, 얻어진 배양상청을 회수한 후, 0.22 ㎛ 필터를 통과시켜 배양상청을 얻었다. 얻어진 배양상청은 원칙으로서 다음 4단계로 정제하였다. 제1 단계는 양이온 교환 칼럼크로마토그래피(SP Sepharose FF), 제2 단계는 His 태그에 대한 친화성 칼럼크로마토그래피(HisTrap HP), 제3 단계는 겔여과 칼럼크로마토그래피(Superdex200), 제4 단계는 무균 여과를 실시하였다. 단 FcγRI에 대해서는 제1 단계에 Q sepharose FF를 사용한 음이온 교환 칼럼크로마토그래피를 실시하였다. 정제한 단백질에 대해서는 분광광도계를 사용하여 280 nm에서의 흡광도를 측정하고, 얻어진 값으로부터 PACE 등의 방법으로 산출된 흡광계수를 사용하여 정제 단백질의 농도를 산출하였다(Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423).
Biacore T100(GE 헬스케어), Biacore T200(GE 헬스케어), Biacore A100, Biacore 4000을 사용하여 각 개변 항체와 상기에서 조제한 Fcγ 수용체의 상호작용 해석을 행하였다. 러닝 버퍼에는 HBS-EP+(GE 헬스케어)를 사용하고 측정온도는 25℃로 하였다. Series S Sensor Chip CM5(GE 헬스케어) 또는 Series S sensor Chip CM4(GE 헬스케어)에 아민 커플링법으로 항원 펩티드, Protein A(Thermo Scientific), Protein A/G(Thermo Scientific), Protein L(ACTIGEN 또는 BioVision)을 고정화한 칩 또는 Series S Sensor Chip SA(certified)(GE 헬스케어)에 대해 사전에 비오틴화해 둔 항원 펩티드를 상호작용시켜 고정화한 칩을 사용하였다.
이들 센서칩에 목적의 항체를 캡쳐시키고, 러닝 버퍼로 희석한 Fcγ 수용체를 상호작용시켜 항체에 대한 결합량을 측정하고 항체 간에 비교하였다. 단 Fcγ 수용체의 결합량은 캡쳐한 항체의 양에 의존하기 때문에 각 항체의 캡쳐량으로 Fcγ 수용체의 결합량을 나눈 보정값으로 비교하였다. 또한 10 mM glycine-HCl, pH 1.5를 반응시킴으로써 센서칩에 캡쳐한 항체를 세정하고, 센서칩을 재생하여 반복해서 사용하였다.
또한 각 개변 항체의 FcγR에 대한 KD값을 산출하기 위해 속도론적인 해석은 아래의 방법에 따라 실시하였다. 먼저, 상기 센서칩에 목적의 항체를 캡쳐시키고, 러닝 버퍼로 희석한 Fcγ 수용체를 상호작용시켜 얻어진 센서그램에 대해 Biacore Evaluation Software에 의해 측정결과를 1:1 Langmuir binding model로 global fitting시킴으로써 결합속도상수 ka(L/mol/s), 해리속도상수 kd(1/s)를 산출하고, 그 값으로부터 해리상수 KD(mol/L)를 산출하였다.
또한 각 개변 항체와 FcγR의 상호작용이 미약하여 상기 속도론적인 해석으로는 바르게 해석할 수 없다고 판단된 경우, 그 상호작용에 대해서는 Biacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edition AE에 기재된 아래의 1:1 결합 모델식을 이용하여 KD를 산출하였다.
1:1 binding model에서 상호작용하는 분자의 Biacore 상에서의 거동은 아래의 식 1로 나타낼 수 있다.
〔식 1〕
Figure pat00031
Req:a plot of steady state binding levels against analyte concentration
C: concentration
RI:bulk refractive index contribution in the sample
Rmax:analyte binding capacity of the surface
이 식을 변형하면 KD는 아래의 식 2와 같이 나타낼 수 있다.
〔식 2〕
Figure pat00032
이 식에 Rmax, RI, C의 값을 대입함으로써 KD를 산출하는 것이 가능하다. RI, C에 대해서는 측정결과의 센서그램, 측정조건으로부터 값을 구할 수 있다. Rmax의 산출에 대해서는 아래의 방법에 따랐다. 그 측정시에 동시에 평가한 비교대상이 되는 상호작용이 충분히 강한 항체에 대해서, 상기 1:1 Langmuir binding model로 global fitting시켰을 때 얻어진 Rmax의 값을 비교대상이 되는 항체의 센서칩에 대한 캡쳐량으로 나누고, 평가하고자 하는 개변 항체의 캡쳐량으로 곱하여 얻어진 값을 Rmax로 하였다.
〔참고 실시예 3〕칼슘 의존적으로 인간 IgA에 결합하는 항체의 조제
(3-1) 인간 IgA(hIgA)의 조제
항원인 인간 IgA(이하 hIgA라고도 불린다)는 아래와 같은 재조합 기술을 사용하여 조제되었다. H(WT)-IgA1(서열번호：19)과 L(WT)(서열번호：20)를 포함하는 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 배양함으로써 발현된 hIgA가 당업자 공지의 방법으로 이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 정제되었다.
(3-2) 칼슘 의존적 결합 항체에 대해서
국제공개 WO2009/125825에 기재되어 있는 H54/L28-IgG1은 인간화 항IL-6 수용체 항체로, Fv4-IgG1은 H54/L28-IgG1에 대해 가용형 인간 IL-6 수용체에 대해 pH 의존적으로 결합하는(중성 조건하에 있어서 결합하고 산성 조건하에 있어서 해리되는) 특성을 갖는 인간화 항IL-6 수용체 항체이다. 국제공개 WO2009/125825에 기재되어 있는 마우스의 생체 내(in vivo) 시험에서는, H54/L28-IgG1과 항원인 가용형 인간 IL-6 수용체의 혼합물을 투여한 군과 비교하여, Fv4-IgG1과 항원인 가용형 인간 IL-6 수용체의 혼합물을 투여한 군에 있어서 가용형 인간 IL-6 수용체의 소실이 대폭 가속되어 있는 것이 나타내어졌다.
통상의 가용형 인간 IL-6 수용체에 결합하는 항체에 결합한 가용형 인간 IL-6 수용체는 항체와 함께 FcRn에 의해 혈장 중으로 리사이클된다. 이에 대해 pH 의존적으로 가용형 인간 IL-6 수용체에 결합하는 항체는 엔도솜 내의 산성 조건하에 있어서 항체에 결합한 가용형 인간 IL-6 수용체를 해리한다. 해리된 가용형 인간 IL-6 수용체는 리소좀에 의해 분해되기 때문에 가용형 인간 IL-6 수용체의 혈장 중으로부터의 소실을 대폭 가속시키는 것이 가능해지고, 또한 pH 의존적으로 가용형 인간 IL-6 수용체에 결합하는 항체는 가용형 인간 IL-6 수용체를 해리한 후 FcRn에 의해 혈장 중으로 리사이클되며, 리사이클된 항체는 재차 가용형 인간 IL-6 수용체에 결합할 수 있다. 상기 사이클(항원을 결합한 항체의 세포 내로의 흡수＞항체로부터의 항원의 해리＞항원의 분해와 항체의 혈장 중으로의 재순환)이 반복됨으로써 하나의 항체 분자가 복수 회 반복되어 가용형 인간 IL-6 수용체에 결합하는 것이 가능해진다(도 9).
또한 국제공개 WO2011/122011에 기재되어 있는 바와 같이, H54/L28-IgG1은 인간화 항IL-6 수용체 항체로, Fv4-IgG1은 H54/L28-IgG1에 대해 가용형 인간 IL-6 수용체로 pH 의존적으로 결합하는(중성 조건하에 있어서 결합하고 산성 조건하에 있어서 해리되는) 특성을 갖는 인간화 항IL-6 수용체 항체이고, Fv4-IgG1-v2는 Fv4-IgG1에 대해 pH 중성의 조건하에 있어서 FcRn으로의 결합이 증강된 인간화 항IL-6 수용체 항체이다. 국제공개 WO2011/122011에 기재되어 있는 마우스의 생체 내(in vivo) 시험에서는, Fv4-IgG1과 항원인 가용형 인간 IL-6 수용체의 혼합물을 투여한 군과 비교하여 Fv4-IgG1-v2와 항원인 가용형 인간 IL-6 수용체의 혼합물을 투여한 군에 있어서 가용형 인간 IL-6 수용체의 소실이 대폭 가속되어 있는 것이 나타내어졌다. 즉, pH 의존적으로 항원에 결합하는 항체의 pH 중성의 조건하(pH 7.4)에 있어서의 FcRn에 대한 결합을 증강시킴으로써, 증강된 개변 항체가 항원에 반복해서 결합할 수 있는 효과 및 항원의 혈장 중으로부터의 소실을 촉진시키는 효과가 더욱 향상되어, 당해 항체를 투여함으로써 혈장 중으로부터의 항원을 소실시키는 것이 가능한 것이 보고되었다(도 10).
도 9 및 도 10에 나타내어진 pH 의존적으로 항원에 결합하는 항체에 의한 작용의 경우는, 혈장 중과 엔도솜 내의 환경의 상위, 즉 pH의 상위(혈장 중：pH 7.4, 엔도솜 내：pH 6.0)를 이용하여, 혈장 중에서는 항원에 강하게 결합시키고 엔도솜 내에서는 항원을 해리하는 항체의 성질이 활용되고 있다. 혈장 중과 엔도솜 내에서 pH 의존적으로 결합하는 항체의 항원으로의 결합능에 이러한 차이를 활용하기 위해서는, 혈장 중과 엔도솜 내의 환경 인자의 성질과 그 상위의 크기가 중요하다. pH의 상위는 즉 수소이온 농도의 상위이다. 즉, pH 7.4의 혈장 중 수소이온 농도는 약 40 nM인 한편, pH 6.0의 엔도솜 내의 수소이온 농도는 약 1000 nM인 것으로부터, 혈장 중과 엔도솜 내에서의 환경 인자 중 하나로서 생각되는 수소이온 농도의 상위는 약 25배의 크기이다.
또한 도 9 및 도 10에 나타낸 작용을 다른 태양으로 달성하기 위해 또는 이들 태양을 함께 달성하기 위해, 혈장 중과 엔도솜 내의 수소이온 농도의 상위 이외에, 그 상위가 큰 환경 인자에 의존하여 항원에 결합하는 항체를 사용하면 될 것으로 생각되었다. 혈장 중과 엔도솜 내에서 농도의 상위가 큰 환경 인자가 탐색된 결과 칼슘이 발견되었다. 혈장 중의 이온화 칼슘 농도는 1.1-1.3 mM 정도인 한편 엔도솜 내의 이온화 칼슘 농도는 3 μM 정도인 것으로부터, 혈장 중과 엔도솜 내에서의 환경 인자의 하나로서 생각되는 칼슘 이온 농도의 상위는 약 400배의 크기로서, 그 크기는 수소이온 농도 차(25배)보다도 큰 것이 발견되었다. 즉, 고칼슘 농도 조건하(1.1-1.3 mM)에서 항원에 결합하고 저칼슘 농도 조건하(3 μM)에서 항원을 해리하는 이온화 칼슘 농도 의존적으로 항원에 결합하는 항체를 사용함으로써, pH 의존적으로 항원에 결합하는 항체와 동등 또는 그 이상으로 엔도솜 내에서 항원을 항체로부터 해리하는 것이 가능할 것으로 생각되었다.
(3-3) hIgA에 결합하는 항체의 발현과 정제
GA1-IgG1(중쇄 서열번호：21, 경쇄 서열번호：22), GA2-IgG1(중쇄 서열번호：23, 경쇄 서열번호：24)은 hIgA에 결합하는 항체이다. GA1-IgG1(중쇄 서열번호：21, 경쇄 서열번호：22) 및 GA2-IgG1(중쇄 서열번호：23, 경쇄 서열번호：24)을 코드하는 DNA 서열이 동물세포 발현용 플라스미드에 당업자 공지의 방법으로 삽입되었다. 항체의 발현은 아래의 방법을 사용해여 행해졌다. 인간 태아 신장 세포 유래 FreeStyle 293-F주(Invitrogen)를 FreeStyle 293 Expression Medium 배지(Invitrogen)에 현탁시킨 세포 현탁액이 1.33×106개/mL의 세포밀도로 6 well plate의 각 웰로 3 mL씩 파종되었다. 다음으로 리포펙션법에 의해 조제된 플라스미드가 세포로 도입되었다. 당해 세포는 CO2 인큐베이터(37℃, 8% CO2, 90 rpm)에서 4일간 배양되어, 단리된 그 배양상청으로부터 rProtein A SepharoseTM Fast Flow(Amersham Biosciences)를 사용하여 당업자 공지의 방법으로 항체가 정제되었다. 정제된 항체용액의 흡광도(파장：280 nm)가 분광광도계를 사용하여 측정되었다. 얻어진 측정값으로부터 PACE법에 의해 산출된 흡광계수를 사용하여 항체 농도가 산출되었다(Protein Science (1995) 4, 2411-2423).
(3-4) 취득된 항체의 hIgA에 대한 칼슘 의존적 결합능의 평가
Biacore T200(GE Healthcare)을 사용하여 (1-3)에서 단리된 항체의 hIgA 결합 활성(해리상수 KD(M))이 평가되었다. 러닝 버퍼로서 3 μM 또는 1.2 mM CaCl2를 함유하는 0.05% tween20, 20 mmol/L ACES, 150 mmol/L NaCl(pH 7.4 또는 pH 5.8), 또는 0.1 μM 또는 10 mM CaCl2를 함유하는 0.05% tween20, 20 mmol/L ACES, 150 mmol/L NaCl, pH 8.0을 사용하여 측정이 행해졌다.
아미노 커플링법으로 적절한 양의 재조합형 프로테인 A/G(Thermo Scientific)가 적당량 고정화된 Sensor chip CM5(GE Healthcare)에 항체를 결합시켰다. 다음으로 애널라이트로서 적절한 농도의 hIgA((1-1)에 기재)를 인젝트함으로써 hIgA와 센서칩 상의 항체를 상호작용시켰다. 측정은 37℃에서 행해졌다. 측정 후, 10 mmol/L Glycine-HCl, pH 1.5를 인젝트함으로써 센서칩이 재생되었다. Biacore T200 Evaluation Software(GE Healthcare)를 사용하여 커브 피팅에 의한 해석 및 평형값 해석에 의해 측정 결과로부터 해리상수 KD(M)가 산출되었다. 그 결과를 표 21에 나타내었다. 또한 얻어진 센서그램을 도 11에 나타내었다. GA2-IgG1은 Ca2+ 농도가 1.2 mM에 있어서는 hIgA에 강하게 결합하나, Ca2+ 농도가 3 μM에 있어서는 hIgA에 약하게 결합하는 것이 나타내어졌다. 또한 GA2-IgG1은 Ca2+ 농도가 1.2 mM의 조건하에서 pH 7.4에 있어서는 인간 IgA에 강하게 결합하나, pH 5.8에 있어서는 인간 IgA에 약하게 결합하는 것이 나타내어졌다. 즉, GA2-IgG1은 인간 IgA에 대해 pH 의존적 및 칼슘 의존적으로 결합하는 것이 명확해졌다.
Figure pat00033
〔참고 실시예 4〕칼슘 의존적으로 hIgA에 결합하는 항체의 개변체의 조제
또한 혈장 중으로부터의 항원(hIgA)의 소실을 더욱 증대시키기 위해, 칼슘 의존적으로 hIgA에 결합하는 GA2-IgG1에 대해 마우스 FcRn에 대한 pH 7.4에 있어서의 결합을 증강시키기 위해 N434W의 아미노산 치환을 도입한 GA2-N434W(경쇄 서열번호：24)를 제작하였다. 또한 GA2-IgG1에 대해 FcγR에 대한 결합을 결손시키기 위해 L235R, S239K의 아미노산 치환을 도입한 GA2-FcγR(-)(경쇄 서열번호：24)를 제작하였다. GA2-N434W(경쇄 서열번호：24) 및 GA2-FcγR(-)(경쇄 서열번호：24)를 코드하는 DNA 서열이 당업자에게 공지의 방법으로 삽입된 동물 발현용 플라스미드를 사용하여, 전술한 방법으로 발현된 이들 항체 개변체의 농도가 정제 후에 측정되었다. GA2-FcγR(-)의 각종 마우스 FcγR(mFcγRI, mFcγRII, mFcγRIII, mFcγRIV)에 대한 결합을 평가한 결과, 어느 수용체에 대해서도 결합이 확인되지 않았다.
〔참고 실시예 5〕칼슘 의존적으로 hIgA에 결합하는 항체의 개변체의 조제
다음으로 혈장 중으로부터의 항원(hIgA)의 소실을 더욱 증대시키는 것을 목적으로, 칼슘 의존적으로 hIgA에 결합하는 GA2-IgG1에 대해 마우스 FcγR에 대한 결합을 증강시키기 위해 GA2-IgG1의 EU 넘버링으로 표시되는 328번 위치의 Leu가 Tyr로 치환된 GA2-F1087이 제작되었다. GA2-F1087(경쇄 서열번호：24)을 코드하는 DNA 서열이 당업자에게 공지의 방법으로 삽입된 동물 발현용 플라스미드를 사용하여, 전술한 방법으로 발현된 이들 항체 개변체의 농도가 정제 후에 측정되었다. 이 개변을 포함하는 항체는 참고 실시예 5에 나타내어지는 바와 같이, 마우스 FcγR에 대한 결합이 대폭 증강되어 있었다.
〔참고 실시예 6〕Ca 의존성 hIgA 결합 항체가 투여된 정상 마우스에 있어서의 항원의 혈장 중 체류성에 대한 영향의 평가
(6-1) 정상 마우스가 사용된 생체 내(in vivo) 시험
정상 마우스(C57BL/6J mouse, Charles River Japan)에 대해 hIgA(인간 IgA：참고 실시예 (3-1)에서 제작)가 단독으로 투여되었거나 또는 hIgA 및 항hIgA 항체가 동시에 투여된 후의 hIgA 및 항hIgA 항체의 체내 동태가 평가되었다. hIgA 용액(80 ㎍/mL) 또는 hIgA와 항hIgA 항체의 혼합용액이 꼬리 정맥에 10 mL/㎏의 용량으로 단회 투여되었다. 항hIgA 항체로서는 전술한 GA2-IgG1 및 GA2-F1087이 사용되었다.
혼합용액 중의 hIgA 농도는 모두 80 ㎍/mL이고, 항hIgA 항체 농도는 2.69 mg/mL였다. 이때 hIgA에 대해 항hIgA 항체는 충분량 과잉으로 존재하는 것으로부터, hIgA는 대부분이 항체에 결합되어 있는 것으로 생각되었다. GA-IgG1이 투여된 군에서는 투여 후 5분간, 7시간, 1일간, 2일간, 3일간, 7일간에서 마우스로부터 채혈이 행해졌다. 또한 GA-F1087이 투여된 군에서는 투여 후 5분간, 30분간, 1시간, 2시간, 1일간, 3일간, 7일간에서 마우스로부터 채혈이 행해졌다. 채취된 혈액을 바로 4℃, 12,000 rpm으로 15분간 원심분리함으로써 혈장이 얻어졌다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존되었다.
(6-2) ELISA법에 의한 정상 마우스 혈장 중의 항hIgA 항체 농도 측정
마우스 혈장 중의 항hIgA 항체 농도는 ELISA법으로 측정되었다. 먼저 Anti-Human IgG(γ-chain specific) F(ab')2 Fragment of Antibody(SIGMA)가 그의 각 웰에 분주된 Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp(Nalge nunc International)를 4℃에서 하룻밤 정치함으로써 Anti-Human IgG 고상화 플레이트가 제작되었다. 혈장 중 농도의 표준액으로서 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625, 0.03125, 0.01563, 0.007813 ㎍/mL로 조제된 항hIgA 항체의 검량선 시료와 100배 이상 희석된 마우스 혈장 측정 시료가 상기 Anti-Human IgG 고상화 플레이트에 분주된 후, 당해 플레이트가 25℃에서 1시간 인큐베이션되었다. 그 후, Goat Anti-Human IgG(γ chain specific) Biotin(BIOT) Conjugate(Southern Biotechnology Associats Inc.)가 상기 플레이트의 각 웰에 분주된 후, 당해 플레이트를 25℃에서 1시간 반응시켰다. 추가로 Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)이 상기 플레이트의 각 웰에 분주된 후, 당해 플레이트를 25℃에서 1시간 반응시켰다. TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용한 발색 반응이 1 N-Sulfuric acid(Showa Chemical)를 사용하여 정지된 후, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 반응액의 450 nm의 흡광도가 측정되었다. 마우스 혈장 중의 항hIgA 항체 농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용하여 산출되었다. 이 방법으로 측정된 정맥내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 GA2-IgG1 및 GA2-F1087의 혈장 중 항체 농도 추이를 도 12에 나타내었다. 그 결과, hIgA와 강한 pH 및 Ca 의존적인 결합 활성을 갖는 클론 GA2-IgG1은 FcγR과의 결합을 증강시켰더 하더라도 그 혈장 중 항체 농도가 크게 저하되지 않는 것이 확인되었다.
(6-3) ELISA법에 의한 혈장 중 hIgA 농도 측정
마우스의 혈장 중 hIgA 농도는 ELISA법으로 측정되었다. 먼저 Goat anti-Human IgA Antibody(BETHYL)가 그의 각 웰에 분주된 Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup(Nalge nunc International)를 4℃에서 하룻밤 정치함으로써 Anti-Human IgA 고상화 플레이트가 제작되었다. 혈장 중 농도의 표준액으로서 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, 0.00625 ㎍/mL로 조제된 hIgA의 검량선 시료가 사용되었다. 검량선 시료 및 100배 이상 희석된 마우스 혈장 측정 시료의 각 100 μL에 대해 500 ng/mL hsIL6R을 200 μL 첨가하여 혼합하고, 실온에서 1시간 정치하였다. 그 후, 혼합용액 100 μL가 분주된 상기 Anti-Human IgA 고상화 플레이트는 실온에서 1시간 정치되었다. 다음으로 Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody(R&D)가 상기 플레이트의 각 웰에 분주된 후, 당해 플레이트를 실온에서 1시간 반응시켰다. 추가로 Streptavidin-PolyHRP80(Stereospecific Detection Technologies)이 상기 플레이트의 각 웰에 분주된 후, 당해 플레이트를 실온에서 1시간 반응시켰다. TMB One Component HRP Microwell Substrate(BioFX Laboratories)를 기질로서 사용한 발색 반응이 1 N-Sulfuric acid(Showa Chemical)를 사용하여 정지된 후, 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 각 웰의 반응액의 450 nm의 흡광도가 측정되었다. 마우스 혈장 중 농도는 검량선의 흡광도로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용하여 산출되었다. 이 방법으로 측정한 정맥 내 투여 후의 정상 마우스에 있어서의 혈장 중 hIgA 농도 추이를 도 13에 나타내었다.
그 결과, hIgA 단독의 소실에 대해 hIgA와 100배 이상의 Ca 의존적인 결합 활성을 갖는 GA2-IgG1이 동시에 투여된 마우스의 경우는, hIgA의 소실이 hIgA 단독과 비교하여 가속되었다. 또한 hIgA와 FcγR에 대해 결합이 증강된 GA2-F1087이 투여된 마우스의 혈장 중에서는 투여 1일 후에 측정범위(0.006 ㎍/mL 이상)보다 hIgA의 농도가 저하되고, GA-IgG1이 투여된 마우스의 혈장 중보다도 대폭으로 hIgA의 소실이 가속되었다. 이상으로부터 면역 복합체를 형성하는 hIgA와 항hIgA 항체가 투여된 마우스에 있어서 FcγR에 대한 결합이 증강된 항체에 의한 항원(hIgA)의 혈장 중으로부터의 제거 효과가, FcγR에 대한 결합이 증강된 항체의 기초가 되는 항체에 의한 항원(hIgA)의 제거 효과와 비교하여 증강되어 있는 것이 나타내어졌다.
〔참고 실시예 7〕FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 마우스 IgG의 Fc영역의 결합 활성보다 높은 항원 결합 분자의 혈장 중으로부터의 항원 소실 효과
(7-1) FcγR에 대한 결합 활성을 증강시킨 마우스 항체의 항원 소실 효과
마우스 FcRn을 갖는 정상 마우스에 있어서 마우스 항체의 Fc영역을 갖고 pH 의존적으로 인간 IL-6 수용체에 결합하는 성질을 갖는 항원 결합 분자가 당해 마우스의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체의 소실을 가속시키는 효과를 갖는지 여부가 아래에 나타내는 방법으로 검증되었다.
(7-2) FcγR에 대한 결합 활성을 증강시킨 마우스 항체의 제작
pH 의존적으로 인간 IL-6 수용체에 결합하는 성질을 갖는 마우스 IgG1 항체의 중쇄로서 VH3-mIgG1(서열번호：25), 경쇄로서 VL3-mk1(서열번호：26)이 참고 실시예 1의 방법을 사용하여 제작되었다. 또한 VH3-mIgG1의 마우스 FcγR에 대한 결합 활성을 증강시키기 위해 EU 넘버링으로 표시되는 327번 위치의 Ala가 Asp로 치환된 VH3-mIgG1-mF44가 제작되었다. 마찬가지로, VH3-mIgG1의 EU 넘버링으로 표시되는 239번 위치의 Ser이 Asp로 치환되고, 327번 위치의 Ala가 Asp로 치환된 VH3-mIgG1-mF46이 제작되었다. VH3-mIgG1, VH3-mIgG1-mF44 또는 VH3-mIgG1-mF46을 중쇄로서 포함하고, VL3-mk1을 경쇄로서 포함하는 Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 또는 Fv4-mIgG1-mF46이 참고 실시예 1의 방법을 사용하여 제작되었다.
(7-3) 마우스 FcγR에 대한 결합 활성의 확인
VH3-mIgG1, VH3-mIgG1-mF44 또는 VH3-mIgG1-mF46을 중쇄로서 포함하고, L(WT)-CK(서열번호：27)를 경쇄로서 포함하는 VH3/L(WT)-mIgG1, VH3/L(WT)-mIgG1-mF44 또는 VH3/L(WT)-mIgG1-mF46이 참고 실시예 1의 방법으로 제작되었다. 이들 항체의 마우스 FcγR에 대한 결합 활성이 참고 실시예 2의 방법으로 평가되었다. 그 결과를 표 22에 나타내었다. 또한 각각의 개변체의 마우스 FcγR에 대한 결합 활성이 개변을 가하기 전의 mIgG1과 비교하여 몇배 증강되어 있는지를 표 23에 나타내었다. 또한 표 중에서는 VH3/L(WT)-mIgG1은 mIgG1, VH3/L(WT)-mIgG1-mF44는 mF44, VH3/L(WT)-mIgG1-mF46은 mF46으로 표기하였다.
Figure pat00034
Figure pat00035
천연형 마우스 IgG1 항체의 Fc영역을 갖는 VH3/L(WT)-mIgG1은 마우스 FcγRI 및 마우스 FcγRIV에 대해서는 결합을 나타내지 않고, 마우스 FcγRIIb 및 마우스 FcγRIII에 대해서만 결합을 나타낸 실시예 4의 검토 결과로부터, 항원 농도를 저하시키는 데 중요한 마우스 FcγR은 마우스 FcγRII 및/또는 마우스 FcγRIII인 것이 시사되어 있다. 또한 VH3/L(WT)-mIgG1의 FcγR에 대한 결합 활성을 증강시킬 것으로 생각되는 개변이 도입된 VH3/L(WT)-mIgG-mF44 및 VH3/L(WT)-mIgG1-mF46의 마우스 FcγRIIb 및 마우스 FcγRIII에 대한 결합 활성은 모두 증강되어 있는 것이 나타내어졌다.
(7-4) 정상 마우스에 있어서의 혈장 중 가용형 IL-6 수용체 농도의 저감 효과의 확인
항인간 IL-6 수용체 항체로서 Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 또는 Fv4-mIgG1mF46이 투여된 정상 마우스의 혈장 중 가용형 IL-6 수용체의 소실 효과가 아래와 같이 검증되었다.
정상 마우스(C57BL/6J mouse, Charles River Japan)의 배부(背部) 피하에 가용형 인간 IL-6 수용체가 충전된 infusion pump(MINI-OSMOTIC PUMP MODEL2004, alzet)를 매입함으로써, 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도가 불변상태로 유지되는 동물 모델이 제작되었다. 그 동물 모델에 항인간 IL-6 수용체 항체를 투여한 후의 가용형 인간 IL-6 수용체의 체내 동태가 평가되었다. 가용형 인간 IL-6 수용체에 대한 항체의 생산을 억제하기 위해 단일클론 항마우스 CD4 항체가 꼬리 정맥에 20 mg/㎏으로 단회 투여되었다. 그 후, 92.8 ㎍/mL의 가용형 인간 IL-6 수용체가 충전된 infusion pump가 마우스 배부 피하로 매입되었다. Infusion pump가 매입된 3일 후에 항인간 IL-6 수용체 항체가 1 mg/㎏으로 꼬리 정맥에 단회 투여되었다. 항인간 IL-6 수용체 항체 투여 후 15분, 7시간, 1일, 2일, 4일, 7일, 14일(또는 15일), 21일(또는 22일)이 경과한 후에 당해 마우스로부터 채혈되었다. 채취된 혈액을 바로 4℃, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리함으로써 혈장이 얻어졌다. 분리된 혈장은 측정을 실시할 때까지 -20℃ 이하로 설정된 냉동고에 보존되었다.
혈장 중의 가용형 인간 IL-6 수용체 농도는 마우스의 혈장 중 hsIL-6R 가용형 인간 IL-6 수용체 농도는 전기화학 발광법으로 측정되었다. 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25 pg/mL로 조제된 hsIL-6R 가용형 인간 IL-6 수용체 검량선 시료 및 50배 이상 희석된 마우스 혈장 측정 시료를 SULFO-TAG NHS Ester(Meso Scale Discovery)로 루테늄화한 Monoclonal Anti-human IL-6R Antibody(R&D) 및 Biotinylated Anti-human IL-6 R Antibody (R&D) 및 토실리주맙(Tocilizumab)과 혼합함으로써 37℃에서 하룻밤 반응시켰다. 토실리주맙(Tocilizumab)의 최종 농도는 333 ㎍/mL가 되도록 조제되었다. 그 후, 반응액이 MA400 PR Streptavidin Plate(Meso Scale Discovery)에 분주되었다. 추가로 실온에서 1시간 반응시킨 반응액을 세정 후, Read Buffer T(×4)(Meso Scale Discovery)가 분주되었다. 그 후 바로 SECTOR PR 400 reader(Meso Scale Discovery)에서 측정이 행해졌다. hsIL-6R 가용형 인간 IL-6 수용체 농도는 검량선의 리스폰스로부터 해석 소프트웨어 SOFTmax PRO(Molecular Devices)를 사용하여 산출되었다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.
놀랍게도 mIgG1(천연형 마우스 IgG1)의 마우스 FcγRIIb 및 마우스 FcγRIII에 대한 결합 활성을 증강시키는 개변이 도입된 mF44 및 mF46이 투여된 마우스의 경우는, mIgG1이 투여된 마우스와 비교하여 혈장 중 IL-6 수용체 농도의 현저한 저하가 모두 확인되었다. 특히 mF44의 투여 후 21일째에 있어서도 mF44 투여군의 혈장 중 IL-6 수용체 농도는 항체 비투여군의 혈장 중 IL-6 수용체 농도에 비해 약 6배, mIgG1 투여군과 비교하면 약 10배 저하되어 있었다. 한편 mF46의 투여 후 7일째에 있어서 mF46 투여군의 혈장 중 IL-6 수용체 농도는 항체 비투여군의 혈장 중 IL-6 수용체 농도에 비해 약 30배, mIgG1 투여군과 비교하면 약 50배로 현저히 저하되어 있었다.
이상의 사실로부터, 인간 IgG1 항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자의 마우스 FcγR에 대한 결합 활성이 증강되어 있는 항체와 마찬가지로, 마우스 IgG1 항체의 Fc영역을 갖는 항원 결합 분자의 마우스 FcγR에 대한 결합 활성이 증강되어 항체가 투여된 마우스에 있어서도 혈장 중 가용형 IL-6 수용체의 소실이 가속되어 있는 것이 나타내어졌다. 특정 이론에 구속되는 것은 아니나, 여기서 보인 현상은 아래와 같이 설명하는 것도 가능하다.
pH 의존적으로 가용형 항원에 결합하고, 또한 FcγR에 대한 결합 활성을 증강시키고 있는 항체가 마우스에 투여되면, 주로 세포막 상에 FcγR을 발현하고 있는 세포에 적극적으로 흡수된다. 흡수된 항체는 엔도솜 내의 산성 pH의 조건하에 있어서 가용형 항원을 해리한 후에 FcRn을 매개로 혈장 중으로 리사이클된다. 이 때문에 이러한 항체에 의한 혈장 중의 가용형 항원을 소실시키는 효과를 초래하는 요소 중 하나로서는 당해 항체의 FcγR에 대한 결합 활성의 강함을 들 수 있다. 즉, FcγR에 대한 결합 활성이 강할수록 보다 적극적으로 FcγR 발현 세포로 흡수되어, 혈장 중의 가용형 항원을 빠르게 소실시키는 것이 가능할 것으로 생각된다. 또한 이러한 효과는 항체에 포함되는 Fc영역의 유래가 인간 IgG1이던지 마우스 IgG1이던지, FcγR에 대한 결합 활성이 증강되어 있는 한 동일하게 검증할 수 있을 것으로 생각된다. 즉, 인간 IgG1, 인간 IgG2, 인간 IgG3, 인간 IgG4, 마우스 IgG1, 마우스 IgG2a, 마우스 IgG2b, 마우스 IgG3, 랫트 IgG, 원숭이 IgG, 토끼 IgG 등 어떠한 동물종의 Fc영역이라도, 투여되는 동물종의 FcγR에 대한 결합 활성이 증강되어 있는 한 어느 것을 사용해도 검증하는 것이 가능할 것으로 생각된다.
〔참고 실시예 8〕FcγRIIb 선택적으로 결합을 증강시킨 항체에 의한 항원 소실 효과
(8-1) FcγRIIb에 대한 결합 활성을 선택적으로 증강시킨 항체의 항원 소실 효과
FcγRIII 결손 마우스(B6.129P2-FcgrR3tm1Sjv/J mouse, Jackson Laboratories)는 마우스 FcγRI, 마우스 FcγRIIb, 마우스 FcγRIV를 발현하고 있으나 마우스 FcγRIII를 발현하지 않는 마우스이다. 한편 Fc 수용체 γ쇄 결손 마우스(Fcer1g mouse, Taconic, Cell (1994) 76, 519-529)는 마우스 FcγRIIb만을 발현하고 마우스 FcγRI, 마우스 FcγRIII, 마우스 FcγRIV를 발현하지 않는 마우스이다.
참고 실시예 7에 있어서 천연형 마우스 IgG1에 대해 FcγR로의 결합 활성을 증강시킨 mF44 및 mF46은 마우스 FcγRIIb 및 마우스 FcγRIII에 대해 선택적으로 결합이 증강되어 있는 것이 나타내어졌다. 이 선택적으로 증강된 항체의 결합 활성을 이용하여 마우스 FcγRIII를 발현하지 않는, 마우스 FcγRIII 결손 마우스 또는 Fc 수용체 γ쇄 결손 마우스에 mF44 및 mF46을 투여함으로써 마우스 FcγRIIb에 대한 결합이 선택적으로 증강된 항체를 투여하는 상황을 모방하는 것이 가능할 것으로 생각되었다.
(8-2) FcγRIII 결손 마우스를 사용한 마우스 FcγRIIb 선택적 결합 증강에 의한 항원 소실 효과의 검증
항인간 IL-6 수용체 항체로서 Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 또는 Fv4-mIgG1-mF46이 투여된 FcγRIII 결손 마우스의 혈장 중 가용형 IL-6 수용체의 소실 효과가 실시예 5의 방법과 동일하게 검증되었다. 당해 마우스의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도는 상기 참고 실시예 (7-4)의 방법으로 측정되었다. 그 결과를 도 15에 나타내었다.
놀랍게도 mIgG1(천연형 마우스 IgG1)의 마우스 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 선택적으로 증강된 상황이 모방된 mF44 및 mF46이 투여된 FcγRIII 결손 마우스의 혈장 중 IL-6 수용체 농도는 모두 mIgG1이 투여된 마우스의 혈장 중 IL-6 수용체 농도와 비교하여 모두 현저히 저하된 것이 확인되었다. 특히 mF44의 투여군의 혈장 중 IL-6 수용체 농도는 mIgG1 투여군의 그것과 비교하여 약 3배 정도로 저하시키고, 항체 투여에 의해 일어나는 항원 농도의 축적이 억제되어 있었다. 한편 mF46의 투여군의 혈장 중 IL-6 수용체 농도는 투여 후 3일째에 있어서 항체 비투여군의 혈장 중 IL-6 수용체 농도에 비해 약 6배, mIgG1 투여군의 혈장 중 IL-6 수용체 농도와 비교하면 약 25배로 현저히 저하되었다. 이 결과로부터, pH 의존적으로 항원에 결합하는 항인간 IL-6 수용체 항체의 마우스 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 높을수록, 그것이 투여되었을 때에 마우스의 혈장 중 IL-6 수용체 농도를 보다 저하시키는 것이 가능한 것이 나타내어졌다.
(8-3) Fc 수용체 γ쇄 결손 마우스를 사용한 마우스 FcγRIIb 선택적 결합 증강에 의한 항원 소실 효과의 검증
항인간 IL-6 수용체 항체로서 Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 또는 Fv4-mIgG1mF46이 투여된 Fc 수용체 γ쇄 결손 마우스의 혈장 중 가용형 IL-6 수용체의 소실 효과가 실시예 6의 방법과 동일하게 검증되었다. 당해 마우스의 혈장 중 가용형 인간 IL-6 수용체 농도는 상기 참고 실시예 (7-4)의 방법으로 측정되었다. 그 결과를 도 16에 나타내었다.
FcγRIII 결손 마우스에 mF44 및 mF46이 투여되었을 때와 마찬가지로, mIgG1(천연형 마우스 IgG1)에 대해 마우스 FcγRIIb에 대한 결합 활성만이 선택적으로 증강된 상황이 모방된 mF44 및 mF46이 투여된 Fc 수용체 γ쇄 결손 마우스의 혈장 중 IL-6 수용체 농도는 모두 mIgG1이 투여된 Fc 수용체 γ쇄 결손 마우스의 혈장 중 IL-6 수용체 농도와 비교하여 현저히 저하된 것이 확인되었다. 특히 mF44의 투여군의 혈장 중 IL-6 수용체 농도는 mIgG1 투여군의 혈장 중 IL-6 수용체 농도와 비교하여 약 3배 정도로 저하되어 항체 투여에 의해 일어나는 항원 농도의 축적이 억제되어 있었다. 한편 mF46의 투여군의 혈장 중 IL-6 수용체 농도는 투여 후 3일째에 있어서 항체 비투여군의 혈장 중 IL-6 수용체 농도에 비해 약 5배, mIgG1 투여군의 혈장 중 IL-6 수용체 농도와 비교하면 약 15배로 현저히 저하되었다.
참고 실시예 (8-2) 및 (8-3)의 결과로부터, pH 의존적으로 가용형 항원에 결합하여 마우스 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 선택적으로 증강된 항체의 투여군의 혈장 중 가용형 항원 농도는 대폭 저하될 가능성이 나타내어졌다.
〔참고 실시예 9〕FcγRIII 선택적으로 결합을 증강시킨 항체에 의한 항원 소실 효과
(9-1) FcγRIII에 대한 결합 활성을 선택적으로 증강시킨 항체의 항원 소실 효과
FcγRIIb 결손 마우스(Fcgr2b(FcγRII) mouse, Taconic)(Nature (1996) 379 (6563), 346-349)는 마우스 FcγRI, 마우스 FcγRIII, 마우스 FcγRIV는 발현하나 마우스 FcγRIIb를 발현하지 않는 마우스이다. 실시예 5에 있어서 천연형 마우스 IgG1의 FcγR로의 결합 활성을 증강시킨 mF44 및 mF46은 마우스 FcγRIIb 및 마우스 FcγRIII에 대해 선택적으로 결합이 증강되어 있는 것이 나타내어졌다. 이 선택적으로 증강된 항체의 결합 활성을 이용하여 마우스 FcγRIIb를 발현하지 않는 마우스 FcγRIIb 결손 마우스에 mF44 및 mF46을 투여함으로써 마우스 FcγRIII에 대한 결합이 선택적으로 증강된 항체를 투여하는 상황을 모방하는 것이 가능할 것으로 생각되었다.
참고 실시예 8에 있어서 마우스 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 선택적으로 증강된 항체가 투여된 상황이 모방된 FcγRIII 결손 마우스의 혈장 중 가용형 항원 농도가 저하되는 것이 나타내어졌다. 한편 마우스 FcγRIII에 대한 결합 활성이 선택적으로 증강된 항체가 투여된 상황이 모방된 FcγRIIb 결손 마우스의 혈장 중 가용형 항원 농도가 저하되는지 여부가 아래의 시험에 의해 확인되었다.
(9-2) FcγRIIb 결손 마우스를 사용한 마우스 FcγRIII 선택적 결합 증강에 의한 항원 소실 효과의 검증
FcγRIIb 결손 마우스에 항인간 IL-6 수용체 항체로서 Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 또는 Fv4-mIgG1mF46이 투여된 FcγRIIb 결손 마우스의 혈장 중 가용형 IL-6 수용체의 소실 효과가 실시예 5의 방법과 동일하게 검증되었다. 혈장 중의 가용형 인간 IL-6 수용체 농도는 상기 참고 실시예 (7-4)의 방법으로 측정되었다. 그 결과를 도 17에 나타내었다.
놀랍게도 mIgG1(천연형 마우스 IgG1)의 마우스 FcγRIII에 대한 결합 활성이 선택적으로 증강된 것이 모방된 mF44 및 mF46의 투여군에서는, 혈장 중 IL-6 수용체 농도는 저하되었으나 참고 실시예 8에서 나타내어진 정도의 현저한 저하는 확인되지 않았다.
특정 이론에 구속되는 것은 아니나, 참고 실시예 7, 8 및 9의 결과로부터 아래와 같이 고찰하는 것도 가능하다. mIgG1(천연형 마우스 IgG1)의 마우스 FcγRIIb 및 마우스 FcγRIII에 대한 결합 활성이 선택적으로 증강된 mF44 및 mF46이 투여된 마우스 FcγRIIb 및 마우스 FcγRIII 양쪽을 발현하는 정상 마우스의 혈장 중 가용형 IL-6 수용체의 소실은 현저히 가속되는 것이 확인되었다. 또한 마우스 FcγRIIb는 발현하나 마우스 FcγRIII를 발현하고 있지 않은 마우스(FcγRIII 결손 마우스 및 Fc 수용체 γ쇄 결손 마우스)에, mF44 및 mF46이 투여된 경우라도 당해 마우스의 혈장 중 가용형 IL-6 수용체의 소실은 현저히 가속되는 것이 확인되었다. 한편 마우스 FcγRIII는 발현하나 마우스 FcγRIIb를 발현하고 있지 않은 마우스(FcγRII 결손 마우스)에 mF44 및 mF46이 투여된 경우에는 당해 마우스의 혈장 중 가용형 IL-6 수용체의 소실은 현저히 가속되지는 않았다.
이상의 사실로부터, mIgG1(천연형 마우스 IgG1)의 마우스 FcγRIIb 및 마우스 FcγRIII에 대한 결합 활성이 선택적으로 증강된 항체인 mF44 및 mF46은 주로 마우스 FcγRIIb를 매개로 FcγR을 발현하는 세포에 흡수됨으로써, 당해 항체에 결합하는 혈장 중의 가용형 항원이 소실되어 있는 것으로 생각된다. 한편 FcγRIII를 매개로 한 항체 항원 복합체의 FcγR 발현 세포로의 흡수는 혈장 중 가용형 항원의 소실에 대해 크게 기여하고 있지 않은 것으로 생각된다.
또한 마우스 FcγRIIb 및 마우스 FcγRIII에 대한 결합 활성이 향상되어 있는 Fv4-IgG1-F1087(중쇄 서열번호：28, 경쇄 서열번호：29)이 투여된 마우스의 혈장 중 가용형 IL-6 수용체 농도는 현저히 저하된 한편, 마우스 FcγRI 및 마우스 FcγRIV에 대한 결합 활성이 향상되어 있는 Fv4-IgG1-F1182가 투여된 마우스의 혈장 중 가용형 IL-6 수용체의 소실 효과는 Fv4-IgG1-F1087의 그것과 비교하면 작은 것도 확인되었다.
또한 저푸코오스형 당쇄를 갖기 때문에 마우스 FcγRIV에 대한 결합 활성이 대폭 증강되어 있는(Science (2005) 310 (5753) 1510-1512) Fv4-IgG1-Fuc(푸코오스 트랜스포터 유전자를 결손시킨 CHO 세포(WO2006/067913)를 숙주세포로서 사용하여 Fv4-IgG1(중쇄 서열번호：30, 경쇄 서열번호：29)을 발현함으로써 제작)이 투여된 마우스의 혈장 중 가용형 IL-6 수용체 농도는 Fv4-IgG1이 투여된 마우스의 혈장 중 가용형 IL-6 수용체 농도와 비교하면 저하되었으나, 그 저하 효과는 2배 정도로 작은 것이 확인되었다. 이 때문에 마우스 FcγRIV를 매개로 한 항체의 FcγR 발현 세포로의 흡수는 혈장 중 가용형 항원의 소실에 대해 크게 기여하고 있지 않은 것으로 생각된다.
이들 사실로부터, 마우스에 있어서 항체의 FcγR 발현 세포로의 흡수에는 복수 있는 마우스 FcγR 중에서 마우스 FcγRIIb가 주된 역할을 발휘하고 있는 것이 발견되었다. 이 때문에 특별히 한정되는 것은 아니나, 마우스 FcγR 결합 도메인에 도입되는 변이로서는 마우스 FcγRIIb에 대한 결합을 증강시키는 변이가 특히 바람직하다고도 생각될 수 있다.
본 검토에 의해 pH 의존적으로 가용형 항원에 결합하여 FcγR에 대한 결합 활성이 증강된 항원 결합 분자를 투여함으로써, 항체가 투여된 생체의 혈장 중 가용형 항원의 소실을 가속시키는 것이 가능한 것이 나타내어졌다. 이 FcγR을 매개로 한 혈장 중 가용형 항원의 소실이 FcγR 중에서도 주로 FcγRIIb를 매개로 일어나고 있는 것이 마우스에 있어서 나타내어졌다. 즉, 항체와 항원의 복합체와 FcγR의 상호작용을 이용하여 혈장 중 가용형 항원의 소실을 가속시키기 위해서는 FcγR 중에서도 FcγRIIb가 특히 중요하여, FcγRIIb에 대한 결합을 유지만 하면 그 소실 효과는 유지된다. 이로 인해 pH 의존적으로 가용형 항원에 결합하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 증강시킨 항원 결합 분자는 생체 내에 투여된 경우에, 혈장 중 가용형 항원의 소실을 가속시켜 혈장 중의 가용형 항원 농도를 효과적으로 저하시키는 것이 가능하여, 매우 유효한 작용을 나타내는 것이 명확해졌다.
본 발명에 의해, 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 유지하면서, 또한 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성, 특히 FcγRIIa(R형)에 대한 결합 활성이 저감된 Fc영역 개변체, 그 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드가 제공되었다. 그 폴리펩티드를 사용함으로써 FcγRIIb의 ITIM의 인산화를 매개로 한 염증성 면역반응의 억제성 시그널을 전달하는 것이 가능해진다. 또한 FcγRIIb에 선택적으로 결합하는 성질을 항체의 Fc에 부여함으로써, FcγRIIb를 매개로 한 면역 억제적인 작용을 통해 항항체의 생산을 억제할 수 있을 가능성이 있다.
SEQUENCE LISTING <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> Fc region variants <130> C1-A1302P <150> JP 2013-077239 <151> 2013-04-02 <160> 52 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 447 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp 20 25 30 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 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Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Asp Pro Gly Gly Gly Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 51 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Glu Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Ala Pro Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Thr Asp Ala 100 105 110 Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 52 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> an artificially synthesized peptide sequence <400> 52 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly His Ser Ile Ser His Asp 20 25 30 His Ala Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Ile Gly Phe Ile Ser Tyr Ser Gly Ile Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Leu Ala Arg Thr Thr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Glu Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro 210 215 220 Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe 225 230 235 240 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val 260 265 270 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 275 280 285 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val 290 295 300 Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser 325 330 335 Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350 Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 355 360 365 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415 Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 420 425 430 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu 435 440

Claims (59)

  1. Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산 및 하기의 (a) 내지 (k) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 개변을 포함하는 Fc영역 개변체로서, 천연형 IgG의 Fc영역과 비교한 경우에 그 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되고 또한 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소되어 있는 개변체.
    (a) Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산
    (b) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산
    (c) Fc영역의 EU 넘버링 241번째 아미노산
    (d) Fc영역의 EU 넘버링 268번째 아미노산
    (e) Fc영역의 EU 넘버링 295번째 아미노산
    (f) Fc영역의 EU 넘버링 296번째 아미노산
    (g) Fc영역의 EU 넘버링 298번째 아미노산
    (h) Fc영역의 EU 넘버링 323번째 아미노산
    (i) Fc영역의 EU 넘버링 324번째 아미노산
    (j) Fc영역의 EU 넘버링 330번째 아미노산
    (k) (a) 내지 (j)로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산
  2. 제1항에 있어서,
    제1항의 (k)에서 선택되는 2개 이상의 아미노산이 하기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 아미노산의 조합인 개변체.
    (1) Fc영역의 EU 넘버링 241번째 아미노산, 268번째 아미노산, 296번째 아미노산 및 324번째 아미노산
    (2) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산, 241번째 아미노산, 296번째 아미노산 및 330번째 아미노산
    (3) Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산, 237번째 아미노산, 241번째 아미노산 및 296번째 아미노산
  3. Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp이고, 또한 하기의 (a) 내지 (k) 중 어느 하나에 기재된 아미노산을 갖는 Fc영역 개변체로서, 천연형 IgG의 Fc영역과 비교한 경우에 그 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되고 또한 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소되어 있는 개변체.
    (a) Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산이 Phe
    (b) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산이 Gln 또는 Asp
    (c) Fc영역의 EU 넘버링 241번째 아미노산이 Met 또는 Leu
    (d) Fc영역의 EU 넘버링 268번째 아미노산이 Pro
    (e) Fc영역의 EU 넘버링 295번째 아미노산이 Met 또는 Val,
    (f) Fc영역의 EU 넘버링 296번째 아미노산이 Glu, His, Asn 또는 Asp,
    (g) Fc영역의 EU 넘버링 298번째 아미노산이 Ala 또는 Met,
    (h) Fc영역의 EU 넘버링 323번째 아미노산이 Ile,
    (i) Fc영역의 EU 넘버링 324번째 아미노산이 Asn 또는 His
    (j) Fc영역의 EU 넘버링 330번째 아미노산이 His 또는 Tyr
    (k) (a) 내지 (j)로부터 선택되는 2개 이상의 아미노산
  4. Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp이고, 또한 하기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 아미노산을 갖는 Fc영역 개변체.
    (1) Fc영역의 EU 넘버링 241번째 아미노산이 Met, 268번째 아미노산이 Pro, 296번째 아미노산이 Glu 및 324번째 아미노산이 His
    (2) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산이 Gln 또는 Asp, 241번째 아미노산이 Met, 296번째 아미노산이 Glu 및 330번째 아미노산이 His
    (3) Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산이 Phe, 237번째 아미노산이 Gln 또는 Asp, 241번째 아미노산이 Met 및 296번째 아미노산이 Glu
  5. Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산 및 271번째 아미노산, 및 하기의 (a) 내지 (h) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 개변을 포함하는 Fc영역 개변체로서, 천연형 IgG의 Fc영역과 비교한 경우에 그 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되고 또한 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소되어 있는 개변체.
    (a) Fc영역의 EU 넘버링 234번째 아미노산
    (b) Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산
    (c) Fc영역의 EU 넘버링 236번째 아미노산
    (d) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산
    (e) Fc영역의 EU 넘버링 239번째 아미노산
    (f) Fc영역의 EU 넘버링 265번째 아미노산
    (g) Fc영역의 EU 넘버링 267번째 아미노산
    (h) Fc영역의 EU 넘버링 297번째 아미노산
  6. 제5항에 있어서,
    상기 아미노산 개변이 하기의 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 개변의 조합인 개변체.
    (1) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 238번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산, 268번째 아미노산 및 271번째 아미노산
    (2) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 237번째 아미노산, 238번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산, 296번째 아미노산, 297번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 396번째 아미노산
    (3) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 238번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산 및 296번째 아미노산
  7. Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp 및 271번째 아미노산이 Gly이고, 또한 하기의 (a) 내지 (h) 중 어느 하나에 기재된 아미노산을 갖는 Fc영역 개변체로서, 천연형 IgG의 Fc영역과 비교한 경우에 그 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되고 또한 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소되어 있는 개변체.
    (a) Fc영역의 EU 넘버링 234번째 아미노산이 Ala, His, Asn, Lys 또는 Arg
    (b) Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산이 Ala
    (c) Fc영역의 EU 넘버링 236번째 아미노산이 Gln
    (d) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산이 Arg 또는 Lys
    (e) Fc영역의 EU 넘버링 239번째 아미노산이 Lys
    (f) Fc영역의 EU 넘버링 265번째 아미노산이 Lys, Asn, Arg, Ser 또는 Val
    (g) Fc영역의 EU 넘버링 267번째 아미노산이 Lys, Arg 또는 Tyr
    (h) Fc영역의 EU 넘버링 297번째 아미노산이 Ala
  8. Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp 및 271번째 아미노산이 Gly이고, 또한 하기의 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 기재된 아미노산을 포함하는 Fc영역 개변체.
    (1) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산이 Asp, 238번째 아미노산이 Asp, 264번째 아미노산이 Ile, 267번째 아미노산이 Arg, 268번째 아미노산이 Glu 및 271번째 아미노산이 Gly
    (2) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산이 Asp, 237번째 아미노산이 Asp, 238번째 아미노산이 Asp, 264번째 아미노산이 Ile, 267번째 아미노산이 Ala, 268번째 아미노산이 Glu, 271번째 아미노산이 Gly, 296번째 아미노산이 Asp, 297번째 아미노산이 Ala, 330번째 아미노산이 Arg 및 396번째 아미노산이 Met
    (3) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산이 Asp, 238번째 아미노산이 Asp, 264번째 아미노산이 Ile, 267번째 아미노산이 Arg, 268번째 아미노산이 Pro, 271번째 아미노산이 Gly 및 296번째 아미노산이 Glu
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    또한 보체로의 결합이 감소되어 있는 Fc영역 개변체.
  10. 제9항에 있어서,
    보체로의 결합이 감소되어 있는 Fc영역 개변체가 Fc영역의 EU 넘버링 322번째 아미노산 개변 또는 Fc영역의 EU 넘버링 327번째, 330번째 및 331번째 아미노산 개변을 포함하는 Fc영역 개변체.
  11. 제9항에 있어서,
    Fc영역의 EU 넘버링 322번째 아미노산이 Ala 또는 Glu, 또는 Fc영역의 EU 넘버링 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser 및 331번째 아미노산이 Ser인 Fc영역 개변체.
  12. Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산의 아미노산 개변을 포함하는 Fc영역 개변체로서, 천연형 IgG의 Fc영역과 비교한 경우에 그 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되고 또한 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소되어 있는 개변체.
  13. 제12항에 있어서,
    추가로 하기의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 개변을 포함하는 개변체.
    (a) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산
    (b) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산
    (c) Fc영역의 EU 넘버링 264번째 아미노산
    (d) Fc영역의 EU 넘버링 267번째 아미노산
    (e) Fc영역의 EU 넘버링 268번째 아미노산
  14. 제13항에 있어서,
    상기 아미노산 개변이 하기의 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 아미노산 개변의 조합인 개변체.
    (1) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산, 238번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산
    (2) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 237번째 아미노산, 238번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산
    (3) Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산, 267번째 아미노산, 268번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산
    (4) Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산
  15. Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp, 271번째 아미노산이 Gly, 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser 및 331번째 아미노산이 Ser인 Fc영역 개변체로서, 천연형 IgG의 Fc영역과 비교한 경우에 그 개변체의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되고 또한 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 감소되어 있는 개변체.
  16. 제15항에 있어서,
    추가로 하기의 (a) 내지 (e) 중 어느 하나에 기재된 아미노산을 갖는 개변체.
    (a) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산이 Asp
    (b) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산이 Asp
    (c) Fc영역의 EU 넘버링 264번째 아미노산이 Ile
    (d) Fc영역의 EU 넘버링 267번째 아미노산이 Ala
    (e) Fc영역의 EU 넘버링 268번째 아미노산이 Asp 또는 Glu
  17. Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp 및 271번째 아미노산이 Gly이고, 또한 하기의 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 아미노산을 포함하는 Fc영역 개변체.
    (1) Fc영역의 EU 넘버링 237번째 아미노산이 Asp, 238번째 아미노산이 Asp, 268번째 아미노산이 Asp 또는 Glu, 271번째 아미노산이 Gly, 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser 및 331번째 아미노산이 Ser
    (2) Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산이 Asp, 237번째 아미노산이 Asp, 238번째 아미노산이 Asp, 268번째 아미노산이 Asp, 271번째 아미노산이 Gly, 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser 및 331번째 아미노산이 Ser
    (3) Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp, 267번째 아미노산이 Ala, 268번째 아미노산이 Glu, 271번째 아미노산이 Gly, 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser 및 331번째 아미노산이 Ser
    (4) Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산이 Asp, 264번째 아미노산이 Ile, 267번째 아미노산이 Ala, 271번째 아미노산이 Gly, 327번째 아미노산이 Gly, 330번째 아미노산이 Ser 및 331번째 아미노산이 Ser
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    FcγRIIb에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역 결합량의 적어도 80%를 갖고, FcγRIIaR에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역 결합량의 30% 이하인 Fc영역 개변체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 결합 활성과 비교한 상대적인 결합 활성의 비가 적어도 0.75이고, 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성의 비가 0.2 이하인 Fc영역 개변체.
  20. 제19항에 있어서,
    추가로 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIa R에 대한 결합 활성과 비교한 상대적인 결합 활성의 비가 0.1 이하인 Fc영역 개변체.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 기재된 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드가 IgG 항체인 폴리펩티드.
  23. 제21항에 있어서,
    상기 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드가 Fc 융합 단백질 분자인 폴리펩티드.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 및 의학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 의약 조성물.
  25. 제21항에 있어서,
    추가로 이온 농도의 조건에 따라 항원에 대한 결합 활성이 변화되는 항원 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드.
  26. 제25항에 있어서,
    이온 농도의 조건이 칼슘 이온 농도의 조건인 폴리펩티드.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 항원 결합 도메인이, 저칼슘 이온 농도 조건하에서의 항원에 대한 결합 활성이 고칼슘 이온 농도 조건하에서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인인 폴리펩티드.
  28. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    이온 농도의 조건이 pH의 조건인 폴리펩티드.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 항원 결합 도메인이, pH 산성역에 있어서의 항원에 대한 결합 활성이 pH 중성역 조건에 있어서의 항원에 대한 결합 활성보다도 낮은 항원 결합 도메인인 폴리펩티드.
  30. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드가 IgG 항체인 폴리펩티드.
  31. 제25항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드가 Fc 융합 단백질 분자인 폴리펩티드.
  32. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 및 의학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 의약 조성물.
  33. 제32항에 있어서,
    의약용 조성물이 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드의 항원 결합 도메인과 결합하는 혈장 중의 항원으로서, 당해 항원의 혈장 중으로부터의 소실을 촉진시키기 위한 의약 조성물.
  34. 제25항 내지 제31항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드의 항원 결합 도메인과 결합하는 혈장 중의 항원으로서, 당해 항원의 혈장 중으로부터의 소실을 촉진시키기 위한 상기 폴리펩티드의 사용.
  35. Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산 및 Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산, 237번째 아미노산, 241번째 아미노산, 268번째 아미노산, 295번째 아미노산, 296번째 아미노산, 298번째 아미노산, 323번째 아미노산, 324번째 아미노산 및 330번째 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 개변하는 것에 의한, 상기 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합을 저감시키는 방법.
  36. 제35항에 있어서,
    Fc영역의 아미노산의 개변이 EU 넘버링 238번째 아미노산의 Asp로의 치환, 235번째 아미노산의 Phe로의 치환, 237번째 아미노산의 Gln으로의 치환, 241번째 아미노산의 Met 또는 Leu로의 치환, 268번째 아미노산의 Pro로의 치환, 295번째 아미노산의 Met 또는 Val로의 치환, 296번째 아미노산의 Glu, His, Asn 또는 Asp로의 치환, 298번째 아미노산의 Ala 또는 Met로의 치환, 323번째 아미노산의 Ile로의 치환, 324번째 아미노산의 Asn 또는 His로의 치환, 330번째 아미노산의 His 또는 Tyr로의 치환인 방법.
  37. Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산 및 Fc영역의 EU 넘버링 235번째 아미노산, 237번째 아미노산, 241번째 아미노산, 268번째 아미노산, 295번째 아미노산, 296번째 아미노산, 298번째 아미노산, 323번째 아미노산, 324번째 아미노산 및 330번째 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 개변하는 것에 의한, 개변 전과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합이 저감되어 있는 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법.
  38. 제37항에 있어서,
    Fc영역의 아미노산의 개변이 EU 넘버링 238번째 아미노산의 Asp로의 치환, 235번째 아미노산의 Phe로의 치환, 237번째 아미노산의 Gln으로의 치환, 241번째 아미노산의 Met 또는 Leu로의 치환, 268번째 아미노산의 Pro로의 치환, 295번째 아미노산의 Met 또는 Val로의 치환, 296번째 아미노산의 Glu, His, Asn 또는 Asp로의 치환, 298번째 아미노산의 Ala 또는 Met로의 치환, 323번째 아미노산의 Ile로의 치환, 324번째 아미노산의 Asn 또는 His로의 치환, 330번째 아미노산의 His 또는 Tyr로의 치환인 방법.
  39. Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서, FcγRIIb에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역과 비교하여 2배 이상이 되는 아미노산 개변과 모든 FcγR에 대한 결합 활성을 저감시키는 아미노산 개변을 조합해서 도입하는 것에 의한, 천연형 IgG와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 같은 정도로 유지하면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성을 저감시키는 방법.
  40. 제39항에 있어서,
    FcγRIIb에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역과 비교하여 2배 이상이 되는 아미노산 개변이 표 11에 기재된 아미노산 개변인 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서,
    모든 FcγR에 대한 결합 활성을 저감시키는 아미노산 개변이 Fc영역의 EU 넘버링 234번째 아미노산, 235번째 아미노산, 236번째 아미노산, 237번째 아미노산, 239번째 아미노산, 265번째 아미노산, 267번째 아미노산 및 297번째 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변인 방법.
  42. 제39항 또는 제41항에 있어서,
    Fc영역의 아미노산의 개변이 EU 넘버링 234번째 아미노산의 Ala, His, Asn, Lys 또는 Arg로의 치환, 235번째 아미노산의 Ala로의 치환, 236번째 아미노산의 Gln으로의 치환, 237번째 아미노산의 Arg 또는 Lys로의 치환, 239번째 아미노산의 Lys로의 치환, 265번째 아미노산의 Lys, Asn, Arg, Ser 또는 Val로의 치환, 267번째 아미노산의 Lys, Arg 또는 Tyr로의 치환, 297번째 아미노산의 Ala로의 치환인 방법.
  43. 제35항, 제36항 및 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,　
    FcγRIIb에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역 결합량의 적어도 80%를 유지하고, FcγRIIaR에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역 결합량의 30% 이하로 저감되는 방법.
  44. 제35항, 제36항 및 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서,
    천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 결합 활성과 비교한 상대적인 결합 활성의 비가 적어도 0.75를 유지하고, 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성의 비가 0.2 이하로 저감되는 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    추가로 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIa R에 대한 결합 활성과 비교한 상대적인 결합 활성의 비가 0.05 이하로 저감되는 방법.
  46. FcγRIIb에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역과 비교하여 2배 이상이 되는 아미노산 개변과 모든 FcγR에 대한 결합 활성을 저감시키는 아미노산 개변을 조합해서 도입하는 것에 의한, 천연형 IgG와 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성을 같은 정도로 유지하면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 저감되어 있는 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법.
  47. 제46항에 있어서,
    FcγRIIb에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역과 비교하여 2배 이상이 되는 아미노산 개변이 표 11에 기재된 아미노산 개변인 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서,
    모든 FcγR에 대한 결합 활성을 저감시키는 아미노산 개변이 Fc영역의 EU 넘버링 234번째 아미노산, 235번째 아미노산, 236번째 아미노산, 237번째 아미노산, 239번째 아미노산, 265번째 아미노산, 267번째 아미노산 및 297번째 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로의 개변인 방법.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서,
    Fc영역의 아미노산의 개변이 EU 넘버링 234번째 아미노산의 Ala, His, Asn, Lys 또는 Arg로의 치환, 235번째 아미노산의 Ala로의 치환, 236번째 아미노산의 Gln으로의 치환, 237번째 아미노산의 Arg 또는 Lys로의 치환, 239번째 아미노산의 Lys로의 치환, 265번째 아미노산의 Lys, Asn, Arg, Ser 또는 Val로의 치환, 267번째 아미노산의 Lys, Arg 또는 Tyr로의 치환, 297번째 아미노산의 Ala로의 치환인 방법.
  50. 제37항, 제38항 및 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서,
    FcγRIIb에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역 결합량의 적어도 80%를 유지하고, 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성이 천연형 IgG의 Fc영역 결합량의 30% 이하로 저감되는 방법.
  51. 제37항, 제38항 및 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
    천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 결합 활성과 비교한 상대적인 결합 활성의 비가 적어도 0.75를 유지하고, 모든 활성형 FcγR에 대한 결합 활성의 비가 0.2 이하로 저감되는 방법.
  52. 제51항에 있어서,
    추가로 천연형 IgG의 Fc영역을 포함하는 폴리펩티드의 FcγRIIa R에 대한 결합 활성과 비교한 상대적인 결합 활성의 비가 0.1 이하로 저감되는 방법.
  53. 제37항, 제38항 및 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로 보체로의 결합을 감소시키는 개변을 조합해서 도입하는 방법.
  54. 제53항에 있어서,
    보체로의 결합을 감소시키는 개변이 Fc영역의 EU 넘버링 322번째 아미노산 개변 또는 Fc영역의 EU 넘버링 327번째, 330번째 및 331번째 아미노산 개변인 방법.
  55. 제53항에 있어서,
    보체로의 결합을 감소시키는 개변이 Fc영역의 EU 넘버링 322번째 아미노산의 Ala 또는 Glu로의 치환, 또는 Fc영역의 EU 넘버링 327번째 아미노산의 Gly로의 치환, 330번째 아미노산의 Ser로의 치환 및 331번째 아미노산의 Ser로의 치환인 방법.
  56. Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산, 또는 추가로 Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 237번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산 및 268번째 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 개변하는 것에 의한, 상기 폴리펩티드의 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되면서 모든 활성형 FcγR에 대한 결합을 저감시키는 방법.
  57. 제56항에 있어서,
    Fc영역의 아미노산의 개변이 Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산의 Asp로의 치환, 271번째 아미노산의 Gly로의 치환, 327번째 아미노산의 Gly로의 치환, 330번째 아미노산의 Ser로의 치환, 331번째 아미노산의 Ser로의 치환, 233번째 아미노산의 Asp로의 치환, 237번째 아미노산의 Asp로의 치환, 264번째 아미노산의 Ile로의 치환, 267번째 아미노산의 Ala로의 치환, 268번째 아미노산의 Asp 또는 Glu로의 치환인 방법.
  58. Fc영역을 포함하는 폴리펩티드에 있어서 Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산, 271번째 아미노산, 327번째 아미노산, 330번째 아미노산 및 331번째 아미노산, 또는 추가로 Fc영역의 EU 넘버링 233번째 아미노산, 237번째 아미노산, 264번째 아미노산, 267번째 아미노산 및 268번째 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산을 다른 아미노산으로 개변하는 것에 의한, 개변 전과 비교하여 FcγRIIb에 대한 결합 활성이 유지되고 모든 활성형 FcγR에 대한 결합이 저감되면서, 또한 보체로의 결합이 저감되어 있는 Fc영역 개변체를 포함하는 폴리펩티드의 제조방법.
  59. 제58항에 있어서,
    Fc영역의 아미노산의 개변이 Fc영역의 EU 넘버링 238번째 아미노산의 Asp로의 치환, 271번째 아미노산의 Gly로의 치환, 327번째 아미노산의 Gly로의 치환, 330번째 아미노산의 Ser로의 치환, 331번째 아미노산의 Ser로의 치환, 233번째 아미노산의 Asp로의 치환, 237번째 아미노산의 Asp로의 치환, 264번째 아미노산의 Ile로의 치환, 267번째 아미노산의 Ala로의 치환, 268번째 아미노산의 Asp 또는 Glu로의 치환인 방법.
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