BR112015024587B1 - Variante de região fc de igg1 humana, polipeptídeo compreendendo a mesma, seu método de produção e composição farmacêutica - Google Patents

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Abstract

VARIANTE DE REGIÃO Fc. A presente invenção refere-se a um polipeptídeo que contém uma variante de região Fc de anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos composta por uma combinação de uma alteração de um resíduo de aminoácido situado na posição 238 conforme numerado em conformidade com o índice de EU e uma alteração de outro resíduo de aminoácido específico, que tem uma atividade de ligação reduzida para todos os Fc(Gama)Rs ativos, especialmente para Fc(Gama)RIIa (tipo R), em comparação aos polipeptídeos, cada um, que contém uma região Fc de IgG de ocorrência natural, enquanto mantém a atividade de ligação do mesmo para Fc(Gama)RIIb.

Description

CAMPO DA TÉCNICA
[0001] A presente invenção refere-se a variantes de região Fc em que as alterações de aminoácido foram introduzidas em uma região Fc de anticorpo para reduzir as atividades de ligação para todos os FcyRs de ativação, em particular, FcyRIIa (tipo R), enquanto mantém uma atividade de ligação ao FcyRIIb, em comparação com um polipeptídeo que contém uma região Fc de IgC humano de ocorrência natural; poli- peptídeos que compreendem as variantes de região Fc; e composições farmacêuticas que compreendem os polipeptídeos.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA
[0002] Os anticorpos têm chamado atenção como produtos farma cêuticos devido ao fato de que os mesmos são altamente estáveis no plasma e têm poucos efeitos colaterais. Diversos produtos farmacêuticos de anticorpos do tipo IgC estão disponíveis agora no mercado e muitos produtos farmacêuticos de anticorpos estão atualmente em desenvolvimento (Documentos Não Patente 1 e 2). Entretanto, várias tecnologias aplicáveis aos produtos farmacêuticos de anticorpos de segunda geração foram relatadas, inclusive aquelas que acentuam a função efetora, a habilidade de ligação de antígeno, a farmacocinética e a estabilidade e as que reduzem o risco de imunogenicidade (Documento Não Patente 3). Em geral, a dose necessária de um produto farmacêutico de anticorpo é muito alta. Por sua vez, isso levou a problemas tais como um alto custo de produção, bem como uma dificuldade na produção de formulações subcutâneas. Em teoria, a dose de um produto farmacêutico de anticorpo pode ser reduzida aprimorando- se a farmacocinética de anticorpo ou aprimorando-se a afinidade entre os anticorpos e antígenos.
[0003] Relata-se na Literatura métodos para aprimorar a farmaco- cinética de anticorpo com o uso de substituição artificial de aminoáci- dos em regiões constantes (Documentos Não Patente 4 e 5). De modo similar, a maturação de afinidade foi relatada como uma tecnologia para acentuar a habilidade de ligação de antígeno ou atividade de neutralização de antígeno (Documento Não Patente 6). Essa tecnologia possibilita a acentuação da atividade de ligação de antígeno através da introdução de mutações de aminoácido na CDR de uma região variável ou semelhante. A acentuação da habilidade de ligação de antí- geno possibilita o aprimoramento de atividade biológica in vitro ou redução de dosagem e possibilita adicionalmente o aprimoramento da eficácia in vivo (Documento Não Patente 7).
[0004] A capacidade de neutralização de antígeno de uma única molécula de anticorpo depende de sua afinidade. Aumentando-se a afinidade, um antígeno pode ser neutralizado por uma quantidade menor de um anticorpo. Vários métodos podem ser usados para acentuar a afinidade de anticorpo (Documento Não Patente 6). Ademais, se a afinidade puder se tornar infinita através da ligação covalente de um anticorpo a um antígeno, uma única molécula de anticorpo pode neutralizar uma molécula de antígeno (um anticorpo divalente pode neutralizar duas moléculas de antígeno). Entretanto, nos métodos atuais, para uma única molécula de anticorpo, a ligação a uma molécula de antígeno (dois antígenos, se forem bivalentes) é o limite. Por outro lado, foi recentemente relatado que o uso da ligação de moléculas de antígeno que se liga a antígenos de uma maneira dependente de pH permite que uma ligação de única molécula de antígeno se ligue a múltiplas moléculas de antígeno (Documento de Patente 1 e Documento Não Patente 8). Na condição neutra no plasma, a ligação de moléculas de antígeno dependente de pH se liga fortemente a antíge- nos e libera os antígenos nas condições ácidas em endossomos. Ademais, a ligação de moléculas de antígeno pode se ligar a um antí- geno novamente quando os mesmos são reciclados no plasma através de FcRn após a liberação dos antígenos; assim, uma única ligação de molécula de antígeno dependente de pH pode se ligar repetidamente a múltiplos antígenos.
[0005] Ademais, foi relatado que devido ao fato de que a ligação de moléculas de antígeno dependente de pH alterada para acentuar a ligação de FcRn sob uma condição neutra (pH 7,4) tem um efeito de poder se ligar repetidamente a antígenos e um efeito de eliminar antí- genos do plasma, a administração de tal ligação de moléculas de antí- geno possibilita a eliminação de antígeno do plasma (Documento de Patente 2). Uma ligação de molécula de antígeno dependente de pH que compreende uma região Fc de anticorpo de IgC comum não mostrou nenhuma ligação ao FcRn em condições neutras. Portanto, a captação de complexos formados entre a ligação de molécula de antígeno e o antígeno no interior de células pode ser principalmente através da captação não específica. De acordo com esse relato, a ligação de moléculas de antígeno dependente de pH que foi alterada para acentuar a ligação de FcRn sob uma condição neutra (pH 7,4) pode acelerar mais a eliminação de antígeno do que a ligação de molécula de antí- geno dependente de pH que compreende uma região Fc de anticorpo de IgC comum (Documento de Patente 2).
[0006] Devido ao fato de que a retenção de plasma de antígenos é muito curta em comparação com os anticorpos que têm um mecanismo de reciclagem mediada por FcRn, a ligação de um antígeno no plasma aos anticorpos que têm um mecanismo de reciclagem (em que a ligação não é dependente de pH), em geral, prolonga seu período de retenção no plasma e aumenta a concentração de antígeno no plasma. Por exemplo, no caso de antígenos de plasma com múltiplos tipos de funções fisiológicas, até mesmo se um tipo de atividade fisiológica for bloqueado através da ligação de anticorpo, os sintomas causados por outras funções fisiológicas podem ser exacerbados pela concentração de plasma dos antígenos devido à ligação de anticorpo. Devido ao fato de que há casos em que eliminar os antígenos de plasma é favorável de tal ponto de vista, os métodos similares aos descritos acima para aplicar alterações à região Fc para acentuar a ligação de FcRn com o objetivo de acelerar a eliminação de antígeno foram relatados, porém, até o presente momento, não há relatos a respeito de outros métodos para acelerar a eliminação de antígeno.
[0007] Além disso, os efeitos colaterais de diversos anticorpos te rapêuticos originários da interação entre IgG e FCYR foram relatados. Por exemplo, sabe-se que um grupo de pacientes aos quais administrou-se bevacizumab, um anticorpo anti-VEGF, têm uma taxa aumentada de desenvolvimento de tromboembolismo (Documento Não Patente 9). Ademais, o tromboembolismo foi similarmente observado em testes de desenvolvimento clínico de um anticorpo contra o ligante de CD40 e o teste clínico foi descontinuado (Documento Não Patente 10). O FcyRIIa, um receptor FCY de ativação, é expressado em células de plaqueta (Documento Não Patente 11) e, em seguida, os estudos com o uso de modelos animais e semelhantes sugeriram que ambos os anticorpos administrados fazem com que as plaquetas se agreguem através de ligação ao FcyRIIa nas plaquetas e formem coágulos de sangue como um resultado (Documentos Não Patente 12 e 13). Foi relatado que, nos pacientes com lúpus eritematoso sistêmico, que é uma doença autoimune, as plaquetas são ativadas através de um mecanismo dependente de FcyRIIa e que a ativação de plaqueta está correlacionada à gravidade dos sintomas (Documento Não Patente 14).
[0008] Ademais, foi relatado a partir de estudos com o uso de mo delos animais que complexos imunes de antígeno e anticorpo multiva- lente induzem anafilaxia através de FCYRS de ativação (Documento Não Patente 15).
[0009] Além disso, há relatos sobre o fato de que a incorporação de complexos imunes de antígeno e anticorpo multivalente através de FCYRS de ativação gera um aumento na produção de título de anticorpo contra o antígeno (Documentos Não Patente 16 e 17). O resultado sugere a possibilidade de que os anticorpos contra um anticorpo terapêutico em si podem ser mais facilmente produzidos quando são anticorpos terapêuticos que reconhecem antígenos multivalentes. Se os anticorpos contra um anticorpo terapêutico forem produzidos, a cinética de sangue do anticorpo terapêutico se torna pior ou os anticorpos de neutralização podem enfraquecer os efeitos dos elementos terapêuticos.
[00010] Dessa forma, um anticorpo se liga um antígeno multivalente para formar um complexo imune e a interação do complexo com FcyRs de ativação pode induzir vários efeitos colaterais e isso irá reduzir o valor do anticorpo como um produto farmacêutico.
DOCUMENTOS DE TÉCNICA ANTERIOR DOCUMENTOS DE PATENTE
[00011] [Documento de Patente 1] WO2009/125825
[00012] [Documento de Patente 2] WO2011/122011
DOCUMENTOS NÃO PATENTE
[00013] [Documento Não Patente 1] Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1.073 a 1.078
[00014] [Documento Não Patente 2] Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur. J. Pharm. Biopharm. (2005) 59 (3), 389 a 396
[00015] [Documento Não Patente 3] Kim SJ, Park Y, Hong HJ., Antibody engineering for the development of therapeutic antibodies., Mol. Cells. (2005) 20 (1), 17 a 29
[00016] [Documento Não Patente 4] Hinton PR, Xiong JM, Johlfs MG, Tang MT, Keller S, Tsurushita N, J. Immunol. (2006) 176 (1), 346 a 356
[00017] [Documento Não Patente 5] Ghetie V, Popov S, Borvak J, Radu C, Matesoi D, Medesan C, Ober RJ, Ward ES., Nat. Biotechnol. (1997) 15 (7), 637 a 640
[00018] [Documento Não Patente 6] Rajpal A, BeYaz N, Haber L, Cappuccilli G, Yee H, Bhatt RR, Takeuchi T, Lerner RA, Crea R., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2005) 102 (24), 8.466 a 8.471
[00019] [Documento Não Patente 7] Wu H, Pfarr DS, Johnson S, Brewah YA, Woods RM, Patel NK, White WI, Young JF, Kiener PA., J. Mol. Biol. (2007) 368, 652 a 665
[00020] [Documento Não Patente 8] Igawa T, et al., Nat. Biotechnol. (2010) 28, 1.203 a 1.207
[00021] [Documento Não Patente 9] Scappaticci FA, Skillings JR, Holden SN, Gerber HP, Miller K, Kabbinavar F, Bergsland E, Ngai J, Holmgren E, Wang J, Hurwitz H., Arterial thromboembolic events in patients with metastatic carcinoma treated with chemotherapy and be- vacizumab., J. Natl. Cancer Inst. (2007) 99 (16), 1.232 a 1.239
[00022] [Documento Não Patente 10] Boumpas DT, Furie R, Manzi S, Illei GG, Wallace DJ, Balow JE, Vaishnaw A, A short course of BG9588 (anti-CD40 ligand antibody) improves serologic activity and decreases hematuria in patients with proliferative lupus glomerulonephritis., Arthritis. Rheum. (2003) 48 (3), 719 a 727.
[00023] [Documento Não Patente 11] MackaY M, StanevskY A, Wang T, Aranow C, Li M, Koenig S, Ravetch JV, Diamond B., Selective dYsregulation of the FcgammaIIB receptor on memory B cells in SLE., J. Exp. Med. (2006) 203 (9), 2.157 a 2.164
[00024] [Documento Não Patente 12] MeYer T, Robles-Carrillo L, Robson T, Langer F, Desai H, Davila M, AmaYa M, Francis JL, Amirkhosravi A., Bevacizumab immune complexes activate platelets and induce thrombosis in FCGR2A transgenic mice., J. Thromb. Haemost. (2009) 7 (1), 171 a 181
[00025] [Documento Não Patente 13] Robles-Carrillo L, MeYer T, Hatfield M, Desai H, Davila M, Langer F, AmaYa M, Garber E, Francis JL, Hsu rM, Amirkhosravi A., Anti-CD40L immune complexes potentlY activate platelets in vitro and cause thrombosis in FCGR2A transgenic mice., J. Immunol. (2010) 185 (3), 1.577 a 1.583
[00026] [Documento Não Patente 14] Duffau P, Seneschal J, Nicco C, Richez C, Lazaro E, Douchet I, Bordes C, Viallard JF, Goulvestre C, Pellegrin JL, Weil B, Moreau JF, Batteux F, Blanco P., Platelet CD154 potentiates interferon-alpha secretion bY plasmacYtoid dendritic cells in sYstemic lupus erYthematosus., Sci. Transl. Med. (2010) 2 (47), 47 a 63
[00027] [Documento Não Patente 15] Bruhns P., Properties of mouse and human IgG receptors and their contribution to disease models. Blood. (2012) 119, 5640 a 5649.
[00028] [Documento Não Patente 16] Hjelm F, Carlsson F, Getahun A, HeYman B., AntibodY-mediated regulation of the immune response. Scand J Immunol. (2006) 64(3), 177 a 184.
[00029] [Documento Não Patente 17] Wernersson S, Karlsson MC, Dahlstrom J, Mattsson R, Verbeek JS, HeYman B., IgG-mediated enhancement of antibodY responses is low in Fc receptor gamma chaindeficient mice and increased in Fc gamma RII-deficient mice. J Immunol. (1999) 163, 618 a 622.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO PROBLEMAS A SEREM SOLUCIONADOS PELA INVENÇÃO
[00030] A presente invenção foi alcançada em vista das circunstâncias acima. Um objetivo da presente invenção é fornecer moléculas que supera o defeito originado da ligação aos FCYRS de ativação, através da introdução de uma alteração de aminoácido em uma região Fc de anticorpo para acelerar a eliminação de antígeno. Mais especificamente, um objetivo da presente invenção é fornecer variantes de região Fc cujas atividades de ligação a todos os FCYRS de ativação, em particular ao FcyRIIa (tipo R), possam ser reduzidas enquanto sua atividade de ligação ao FcyRIIb é mantida, em comparação com as de um polipeptídeo que contém uma região Fc de anticorpo de região Fc de IgG de ocorrência natural de ocorrência natural; os polipeptídeos que compreendem as variantes de região Fc; e as composições farmacêuticas que compreendem os polipeptídeos.
MEIOS PARA SOLUCIONAR OS PROBLEMAS
[00031] Os presentes inventores conduziram uma pesquisa dedicada sobre variantes de região Fc cujas atividades de ligação a todos os FCYRS de ativação, em particular ao FcyRIIa (tipo R), podem ser diminuídas enquanto sua atividade de ligação ao FcyRIIb é mantida, em comparação com um polipeptídeo que contém uma região Fc de IgG de ocorrência natural, através da introdução de alterações de aminoá- cido em uma região Fc; e polipeptídeos que compreendem as variantes de região Fc. Como um resultado, os presentes inventores constataram que as atividades de ligação a todos os FcyRs de ativação, em particular ao FcyRIIa (tipo R), podem ser diminuídas enquanto se mantém a atividade de ligação ao FcyRIIb através da combinação de outras alterações de aminoácido em uma variante de região Fc com alteração do aminoácido na posição 238 na região Fc de acordo com a numeração de EU.
[00032] Mais especificamente, a presente invenção se refere ao seguinte: [1] uma variante de região Fc, em que a variante compreende alteração de aminoácido na posição 238 da região Fc de em con- formidade com a numeração de EU e qualquer um dos aminoácidos de (a) a (k) abaixo, em que uma atividade de ligação de FcyRIIb da variante é mantida e as atividades de ligação da variante para todos os FCYRS de ativação são diminuídas em comparação àquelas de uma região Fc de nativa: (a) aminoácido na posição 235 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (b) aminoácido na posição 237 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (c) aminoácido na posição 241 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (d) aminoácido na posição 268 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (e) aminoácido na posição 295 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (f) aminoácido na posição 296 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (g) aminoácido na posição 298 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (h) aminoácido na posição 323 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (i) aminoácido na posição 324 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (j) aminoácido na posição 330 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (k) pelo menos dois aminoácidos selecionados dentre (a) a (j); [2] a variante de [1] acima, em que pelo menos dois amino- ácidos selecionados em (k) de [1] acima, são qualquer uma dentre as combinações de aminoácidos a seguir (1) a (3): (1) aminoácidos nas posições 241, 268, 296 e 324 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (2) aminoácidos nas posições 237, 241, 296 e 330 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; e (3) aminoácidos nas posições 235, 237, 241 e 296 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; [3] uma variante de região Fc, em que o aminoácido na posição 238 da região Fc de em conformidade com a numeração de EU é Asp e em que a variante compreende qualquer um dos aminoácidos de (a) a (k) abaixo, em que uma atividade de ligação de FcyRIIb da variante é mantida e as atividades de ligação da variante para todos os FCYRS de ativação são diminuídas em comparação àquelas de uma região Fc de nativa: (a) Phe na posição de aminoácido 235 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (b) Gln ou Asp na posição de aminoácido 237 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (c) Met ou Leu na posição de aminoácido 241 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (d) Pro na posição de aminoácido 268 da região Fc em con-formidade com a numeração de EU; (e) Met ou Val na posição de aminoácido 295 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (f) Glu, His, Asn ou Asp na posição de aminoácido 296 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (g) Ala ou Met na posição de aminoácido 298 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (h) Ile na posição de aminoácido 323 da região Fc em con-formidade com a numeração de EU; (i) Asn ou His na posição de aminoácido 324 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (j) His ou TYr na posição de aminoácido 330 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (k) pelo menos dois aminoácidos selecionados dentre (a) a (j); [4] uma variante de região Fc em que o aminoácido na posição 238 da região Fc em conformidade com a numeração de EU é Asp e em que a variante compreende os aminoácidos de qualquer um dentre (1) a (3) abaixo: (1) Met na posição de aminoácido 241, Pro na posição de aminoácido 268, Glu na posição de aminoácido 296 e His na posição de aminoácido 324 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (2) Gln ou Asp na posição de aminoácido 237, Met na posição de aminoácido 241, Glu na posição de aminoácido 296 e His na posição de aminoácido 330 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; e (3) Phe na posição de aminoácido 235, Gln ou Asp na posição de aminoácido 237, Met na posição de aminoácido 241 e Glu na posição de aminoácido 296 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; [5] uma variante de região Fc em que a variante compreende alterações de aminoácidos nas posições 238 e 271 da região Fc de em conformidade com a numeração de EU e qualquer um dos amino- ácidos de (a) a (h) abaixo, em que uma atividade de ligação de FcyRIIb da variante é mantida e as atividades de ligação da variante para todas as FcYRs de ativação são diminuídas em comparação àquelas de uma região Fc de nativa: (a) aminoácido na posição 234 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (b) aminoácido na posição 235 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (c) aminoácido na posição 236 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (d) aminoácido na posição 237 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (e) aminoácido na posição 239 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (f) aminoácido na posição 265 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (g) aminoácido na posição 267 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (h) aminoácido na posição 297 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; [6] a variante de [5] acima, em que a alteração é uma combinação de alterações de aminoácido de qualquer um dentre (1) a (3) abaixo: (1) aminoácidos nas posições 233, 238, 264, 267, 268 e 271 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (2) aminoácidos nas posições 233, 237, 238, 264, 267, 268, 271, 296, 297, 330 e 396 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (3) aminoácidos nas posições 233, 238, 264, 267, 268, 271 e 296 da região Fc em conformidade com a numeração de EU. [7] uma variante de região Fc em que o aminoácido na posição 238 é Asp e o aminoácido na posição 271 é Gly na região Fc de em conformidade com a numeração de EU e em que a variante compreende qualquer um dos aminoácidos de (a) a (h) abaixo, em que uma atividade de ligação de FcyRIIb da variante é mantida e as atividades de ligação da variante para todas as FCYRS de ativação são di- minuídas em comparação àquelas de uma região Fc de nativa: (a) Ala, His, Asn, LYS ou Arg na posição de aminoácido 234 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (b) Ala na posição de aminoácido 235 da região Fc em con-formidade com a numeração de EU; (c) Gln na posição de aminoácido 236 da região Fc em con-formidade com a numeração de EU; (d) Arg ou Lys na posição de aminoácido 237 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (e) Lys na posição de aminoácido 239 da região Fc em con-formidade com a numeração de EU; (f) Lys, Asn, Arg, Ser ou Val na posição de aminoácido 265 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (g) Lys, Arg ou Tyr na posição de aminoácido 267 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; e (h) Ala na posição de aminoácido 297 da região Fc em con-formidade com a numeração de EU. [8] uma variante de região Fc em que o aminoácido na posição 238 é Asp e o aminoácido na posição 271 é Gly na região Fc em conformidade com a numeração de EU e em que a variante compreende os aminoácidos de qualquer um dentre (1) a (3) abaixo: (1) Asp na posição de aminoácido 233, Asp na posição de aminoácido 238, Ile na posição de aminoácido 264, Arg na posição de aminoácido 267, Glu na posição de aminoácido 268 e Gly na posição de aminoácido 271 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (2) Asp na posição de aminoácido 233, Asp na posição de aminoácido 237, Asp na posição de aminoácido 238, Ile na posição de aminoácido 264, Ala na posição de aminoácido 267, Glu na posição de aminoácido 268, Gly na posição de aminoácido 271, Asp na posição de aminoácido 296, Ala na posição de aminoácido 297, Arg na posição de aminoácido 330 e Met na posição de aminoácido 396 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; e (3) Asp na posição de aminoácido 233, Asp na posição de aminoácido 238, Ile na posição de aminoácido 264, Arg na posição de aminoácido 267, Pro na posição de aminoácido 268, Gly na posição de aminoácido 271 e Glu na posição de aminoácido 296 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; [9] a variante de região Fc de qualquer um dentre [1] a [8] acima, em que sua ligação complementar também é diminuída; [10] a variante de região Fc de [9] acima, em que a variante de região Fc com ligação complementar diminuída compreende uma alteração de aminoácido na posição 322 da região Fc em conformidade com a numeração de EU ou alterações de aminoácido nas posições 327, 330 e 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; [11] a variante de região Fc de [9] acima, em que o aminoá- cido na posição 322 é Ala ou Glu na região Fc em conformidade com a numeração de EU; ou o aminoácido na posição 327 é Gly, o aminoáci- do na posição 330 é Ser e o aminoácido na posição 331 é Ser na região Fc em conformidade com a numeração de EU. [12] uma variante de região Fc, em que a variante compreende alterações de aminoácidos nas posições 238, 271, 327, 330 e 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU, em que uma atividade de ligação de FcyRIIb da variante é mantida e as atividades de ligação da variante a todos os FCYRS de ativação são diminuídas em comparação àquelas de uma região Fc de IgG nativa; [13] a variante de [12] acima, em que a variante compreende, ainda, uma alteração de aminoácido de qualquer um dentre (a) a (e) abaixo: (a) o aminoácido na posição 233 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (b) o aminoácido na posição 237 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (c) o aminoácido na posição 264 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (d) o aminoácido na posição 267 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; e (e) o aminoácido na posição 268 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; [14] a variante de [13] acima, em que a alteração é uma combinação de alterações de aminoácido de qualquer um dentre (1) a (4) abaixo: (1) aminoácidos nas posições 237, 238, 268, 271, 327, 330 e 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (2) aminoácidos nas posições 233,0237, 238, 268, 271, 327, 330 e 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (3) aminoácidos nas posições 238, 267, 268, 271, 327, 330 e 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; e (4) aminoácidos nas posições 238, 264, 267, 271, 327, 330 e 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; [15] um regiã variante Fcem que o aminoácido na posição 238 é Asp, o aminoácido na posição 271 é Gly, o aminoácido na posição 327 é Gly, o aminoácido na posição 330 é Ser e o aminoácido na posição 331 é Ser na região Fc em conformidade com a numeração de EU, em que a atividade de ligação de FcyRIIb da variante é mantida e as atividades de ligação da variante para todas as FCYRS de ativação são diminuídas em comparação àquelas de uma região Fc de IgG nativa; [16] a variante de [15] acima, em que a variante compreende, ainda, qualquer um dos aminoácidos de (a) a (e) abaixo: (a) Asp na posição de aminoácido 233 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (b) Asp na posição de aminoácido 237 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (c) Ile na posição de aminoácido 264 da região Fc em con-formidade com a numeração de EU; (d) Ala na posição de aminoácido 267 da região Fc em con-formidade com a numeração de EU; e (e) Asp ou Glu na posição de aminoácido 268 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; [17] uma variante de região Fc, em que o aminoácido na posição 238 é Asp e o aminoácido na posição 271 é Gly na região Fc em conformidade com a numeração de EU, em que a variante também compreende os aminoácidos de qualquer um dentre (1) a (4) abaixo: (1) Asp na posição de aminoácido 237, Asp na posição de aminoácido 238, Asp ou Glu na posição de aminoácido 268, Gly na posição de aminoácido 271, Gly na posição de aminoácido 327, Ser na posição de aminoácido 330 e Ser na posição de aminoácido 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (2) Asp na posição de aminoácido 233, Asp na posição de aminoácido 237, Asp na posição de aminoácido 238, Asp na posição de aminoácido 268, Gly na posição de aminoácido 271, Gly na posição de aminoácido 327, Ser na posição de aminoácido 330 e Ser na posição de aminoácido 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (3) Asp na posição de aminoácido 238, Ala na posição de aminoácido 267, Glu na posição de aminoácido 268, Gly na posição de aminoácido 271, Gly na posição de aminoácido 327, Ser na posição de aminoácido 330 e Ser na posição de aminoácido 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; e (4) Asp na posição de aminoácido 238, Ile na posição de aminoácido 264, Ala na posição de aminoácido 267, Gly na posição de aminoácido 271, Gly na posição de aminoácido 327, Ser na posição de aminoácido 330 e Ser na posição de aminoácido 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; [18] a variante de região Fc de qualquer um dentre [1] a [17] acima, em que a variante tem uma atividade de ligação de FcyRIIb que é pelo menos 80% da quantidade de ligação de uma região Fc de IgG nativa e tem uma atividade de ligação de FcyRIIaR que é 30% ou menos da quantidade de ligação da região Fc de IgG nativa. [19] a variante de região Fc de qualquer um dentre [1] a [18] acima, em que uma razão da atividade de ligação de FcyRIIb da variante em relação à atividade de ligação de um polipeptídeo que compreende a região Fc de IgG nativa é pelo menos 0,75 e as razões das atividades de ligação para todas as FCYRS de ativação são 0,2 ou menos. [20] a variante de região Fc de [19] acima, adicionalmente, uma razão de uma atividade de ligação de FcyRIIaR da variante em relação à atividade de ligação de um polipeptídeo que compreende a região Fc de IgG nativa é 0,1 ou menos. [21] uma polipeptídeo que compreende a variante de região Fc de qualquer um dentre [1] a [20] acima; [22] o polipeptídeo de [21] acima, em que o polipeptídeo compreende a variante de região Fc é um anticorpo de IgG; [23] o polipeptídeo de [21] acima, em que o polipeptídeo compreende a variante de região Fc é uma molécula de proteína de fusão Fc; [24] uma composição farmacêutica que compreende o poli- peptídeo de qualquer um dentre [21] a [23] acima e um veículo medicamente aceitável; [25] o polipeptídeo de [21] acima, que compreende adicionalmente um domínio de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno é alterada dependendo de uma condição de concentração de íon; [26] o polipeptídeo de [25] acima, em que a condição de concentração de íon é uma condição de concentração de íon de cálcio; [27] o polipeptídeo de [26] acima, em que o domínio de ligação de antígeno mencionado anteriormente tem uma atividade de ligação de antígeno mais baixa sob uma condição de concentração iônica de cálcio baixa do que sob uma condição de concentração iôni- ca de cálcio alta. [28] o polipeptídeo de qualquer um dentre [25] a [27] acima, em que a condição de concentração de íon é uma condição de pH; [29] o polipeptídeo de [28] acima, em que o domínio de ligação de antígeno tem uma atividade de ligação de antígeno mais baixa em uma condição de faixa de pH ácida do que sob uma condição de faixa de pH neutra. [30] o polipeptídeo de qualquer um dentre [25] a [29] acima, em que o polipeptídeo compreende a variante de região Fc é um anticorpo de IgG; [31] o polipeptídeo de qualquer um dentre [25] a [29] acima, em que o polipeptídeo que compreende a variante de região Fc é uma molécula de proteína de fusão Fc; [32] uma composição farmacêutica que compreende o poli- peptídeo de qualquer um dentre [25] a [31], acima e um veículo medicamente aceitável; [33] a composição farmacêutica de [32] acima para promo ver a eliminação de um antígeno de plasma, em que o antígeno se liga ao domínio de ligação de antígeno do polipeptídeo de qualquer um dentre [25] a [31] acima e está no plasma; [34] uso do polipeptídeo de qualquer um dentre [25] a [31] acima, para promover a eliminação de um antígeno do plasma, em que o antígeno se liga ao domínio de ligação de antígeno do polipeptí- deo e está no plasma. [35] um método para reduzir ligações de um polipeptídeo que compreende uma região Fc para todas as FCYRS de ativação enquanto mantém uma atividade de ligação de FcyRIIb do polipeptídeo que compreende alterar o aminoácido na posição 238 da região Fc em conformidade com a numeração de EU e pelo menos um aminoácido selecionado dentre os aminoácidos nas posições 235, 237, 241, 268, 295, 296, 298, 323, 324 e 330 da região Fc em conformidade com a numeração de EU a outros aminoácidos; [36] o método de [35] acima, em que a alteração de amino- ácido da região Fc é uma substituição do aminoácido na posição 238 por Asp, uma substituição do aminoácido na posição 235 por Phe, uma substituição do aminoácido na posição 237 por Gln, uma substituição do aminoácido na posição 241 por Met ou Leu, uma substituição do aminoácido na posição 268 por Pro, uma substituição do aminoáci- do na posição 295 por Met ou Val, uma substituição do aminoácido na posição 296 por Glu, His, Asn ou Asp, uma substituição do aminoácido na posição 298 por Ala ou Met, uma substituição do aminoácido na posição 323 por Ile, uma substituição do aminoácido na posição 324 por Asn ou His e uma substituição do aminoácido na posição 330 por His ou TYr em conformidade com a numeração de EU; [37] um método para produzir um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc, em que o método compreende alterar o aminoácido na posição 238 da região Fc em conformidade com a numeração de EU e pelo menos um aminoácido selecionado dentre os aminoácidos nas posições 235, 237, 241, 268, 295, 296, 298, 323, 324 e 330 da região Fc em conformidade com a numeração de EU a outros aminoácidos, em que as ligações para todas as FCYRS de ativação são diminuídas enquanto uma atividade de ligação de FcyRIIb é mantida em comparação àquelas do polipeptídeo antes da alteração; [38] o método de [37] acima, em que aalteração de aminoá- cido da região Fc é substituição do aminoácido na posição 238 por Asp, substituição do aminoácido na posição 235 por Phe, substituição do aminoácido na posição 237 por Gln, substituição do aminoácido na posição 241 por Met ou Leu, substituição do aminoácido na posição 268 por Pro, substituição do aminoácido na posição 295 por Met ou Val, substituição do aminoácido na posição 296 por Glu, His, Asn ou Asp, substituição do aminoácido na posição 298 por Ala ou Met, substituição do aminoácido na posição 323 por Ile, substituição do aminoá- cido na posição 324 por Asn ou His e substituição do aminoácido na posição 330 por His ou Tyr em conformidade com a numeração de EU; [39] um método para reduzir atividades de ligação de um polipeptídeo que compreende uma região Fc para todas as FcyRs de ativação enquanto mantém uma atividade de ligação de FcyRIIb em um nível similar em comparação àquela de uma IgG nativa, em que o método é compreende combinar e introduzir uma alteração(ões) de aminoácido que aumenta(m) a atividade de ligação de FcyRIIb em duas vezes ou mais em comparação àquela de uma região Fc de IgG nativa e uma alteração(ões) de aminoácido que diminui(em) as atividades de ligação para todas as FcyRs; [40] o método de [39] acima, em que a(s) alteração(ões) de aminoácido que aumenta(m) a atividade de ligação de FcyRIIb em duas vezes ou mais em comparação àquela da região Fc de IgG nativa é uma alteração(ões) de aminoácido da Tabela 11; [41] o método de [39] ou [40] acima, em que a(s) altera- ção(ões) de aminoácido que diminui(em) as atividades de ligação para todas as FCYRS é uma alteração(ões) de pelo menos um aminoácido selecionado dentre os aminoácidos nas posições 234, 235, 236, 237, 239, 265, 267 e 297 da região Fc em conformidade com a numeração de EU para outro aminoácido; [42] o método de qualquer um dentre [39] a [41] acima, em que a(s) alteração(ões) de aminoácido da região Fc é(são) uma substituição do aminoácido na posição 234 por Ala, His, Asn, Lys ou Arg, uma substituição do aminoácido na posição 235 por Ala, uma substituição do aminoácido na posição 236 por Gln, uma substituição do aminoácido na posição 237 por Arg ou Lys, uma substituição do ami- noácido na posição 239 por Lys, uma substituição do aminoácido na posição 265 por Lys, Asn, Arg, Ser ou Val, uma substituição do amino- ácido na posição 267 por Lys, Arg ou Tyr e uma substituição do ami- noácido na posição 297 por Ala em conformidade com a numeração de EU; [43] o método de qualquer um dentre [35], [36] e [39] a [42] acima, em que a atividade de ligação de FcyRIIb é mantida com pelo menos 80% da quantidade de ligação de uma região Fc de IgG nativa e uma atividade de ligação de FcyRIIaR é reduzida a 30% ou menos da quantidade de ligação da região Fc de IgG nativa. [44] o método de qualquer um dentre [35], [36] e [39] a [43] acima, em que uma razão da atividade de ligação de FcyRIIb em relação à atividade de ligação de um polipeptídeo que compreende a região Fc de IgG nativa é mantida a 0,75 pelo menos, e as razões das atividades de ligação para todas as FcyRs de ativação são reduzidas a 0,2 ou menos; [45] o método de [44] acima, em que, adicionalmente, uma razão de uma atividade de ligação de FcyRIIaR em relação à atividade de ligação de um polipeptídeo que compreende a região Fc de IgG nativa é reduzida a 0,05 ou menos; [46] um método para produzir um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc em que as atividades de ligação para todas as FCYRS de ativação são diminuídas enquanto uma atividade de ligação de FcyRIIb é mantida em um nível similar em comparação àquelas de uma IgG nativa, em que o método compreende combinar e introduzir uma alteração(ões) de aminoácido que aumenta(m) a atividade de ligação de FcyRIIb em duas vezes ou mais em comparação àquela de uma região Fc de IgG nativa e uma alteração(ões) de ami- noácido que diminui(em) as atividades de ligação para todas as FcyRs; [47] o método de [46] acima, em que a(s) alteração(ões) de aminoácido que aumenta(m) a atividade de ligação de FcyRIIb em duas vezes ou mais em comparação àquela da região Fc de IgG nativa é uma alteração de aminoácido da Tabela 11; [48] o método de [46] ou [47] acima, em que a alteração de aminoácido que diminui as atividades de ligação para todas as FcyRs é uma alteração(ões) de pelo menos um aminoácido selecionado dentre os aminoácidos nas posições 234, 235, 236, 237, 239, 265, 267 e 297 da região Fc em conformidade com a numeração de EU para outro aminoácido; [49] o método de qualquer um dentre [46] a [48] acima, em que a(s) alteração(ões) de aminoácido da região Fc é(são) uma substituição do aminoácido na posição 234 por Ala, His, Asn, Lys ou Arg, uma substituição do aminoácido na posição 235 por Ala, uma substituição do aminoácido na posição 236 por Gln, uma substituição do aminoácido na posição 237 por Arg ou Lys, uma substituição do ami- noácido na posição 239 por Lys, uma substituição do aminoácido na posição 265 por Lys, Asn, Arg, Ser ou Val, uma substituição do amino- ácido na posição 267 por LYS, Arg ou TYr e uma substituição do ami- noácido na posição 297 por Ala em conformidade com a numeração de EU; [50] o método de qualquer um dentre [37], [38] e [46] a [49] acima, em que a atividade de ligação de FcyRIIb é mantida com pelo menos 80% da quantidade de ligação de uma região Fc de IgG nativa e as atividades de ligação para todas as FCYRS de ativação são reduzidas a 30% ou menos da quantidade de ligação da região Fc de IgG nativa; [51] o método de qualquer um dentre [37], [38] e [46] a [50] acima, em que uma razão da atividade de ligação de FcyRIIb em relação à atividade de ligação de um polipeptídeo que compreende a região Fc de IgG nativa é mantida a 0,75 pelo menos, e as razões das atividades de ligação para todas as FCYRS de ativação são diminuídas para 0,2 ou menos; [52] o método de [51] acima, em que, adicionalmente, uma razão da atividade de ligação de FcyRIIaR em relação à atividade de ligação de um polipeptídeo que compreende a região Fc de IgG nativa é reduzida a 0,1 ou menos; [53] o método de qualquer uma dentre [37], [38] e [46] to [52] acima, em que o método compreende, ainda, combinar e introduzir uma alteração que diminui a ligação complementar. [54] o método de [53] acima, em que a(s) alteração(ões) que diminui(em) a ligação complementar é(são) uma alteração de aminoácido na posição 322 da região Fc em conformidade com a numeração de EU ou alterações de aminoácido nas posições 327, 330 e 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; [55] o método de [53] acima, em que a(s) alteração(ões) que diminui(em) a ligação complementar é uma substituição do ami- noácido na posição 322 por Ala ou Glu na região Fc em conformidade com a numeração de EU ou, alternativamente, uma substituição do aminoácido na posição 327 por Gly, uma substituição do aminoácido na posição 330 por Ser e uma substituição do aminoácido na posição 331 por Ser na região Fc em conformidade com a numeração de EU; [56] um método para reduzir ligações de um polipeptídeo que compreende uma região Fc para todas as FCYRS de ativação enquanto mantém uma atividade de ligação de FcyRIIb do polipeptídeo que compreende alterar os aminoácidos nas posições 238, 271, 327, 330 e 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU a outros aminoácidos ou compreende, ainda, alterar pelo menos um aminoácido selecionado dentre os aminoácidos nas posições 233, 237, 264, 267 e 268 da região Fc em conformidade com a numeração de EU para outro aminoácido; [57] o método de [56] acima, em que a alteração de amino- ácido da região Fc é uma substituição do aminoácido na posição 238 por Asp, uma substituição do aminoácido na posição 271 por Gly, uma substituição do aminoácido na posição 327 por Gly, uma substituição do aminoácido na posição 330 por Ser, uma substituição do aminoáci- do na posição 331 por Ser, uma substituição do aminoácido na posição 233 por Asp, uma substituição do aminoácido na posição 237 por Asp, uma substituição do aminoácido na posição 264 por Ile, uma substituição do aminoácido na posição 267 por Ala e uma substituição do aminoácido na posição 268 por Asp ou Glu na região Fc em conformidade com a numeração de EU; [58] um método para produzir um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc, em que o método compreende alterar os aminoácidos nas posições 238, 271, 327, 330 e 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU a outros aminoácidos ou que compreende, ainda, alterar pelo menos um aminoácido selecionado dentre os aminoácidos nas posições 233, 237, 264, 267 e 268 da região Fc em conformidade com a numeração de EU para outro ami- noácido, em que as ligações para todas as FCYRS de ativação são diminuídas e a ligação complementar é diminuída enquanto uma atividade de ligação de FcyRIIb é mantida em comparação àquelas do po- lipeptídeo antes da alteração; e [59] o método de [58] acima, em que a alteração de amino- ácido da região Fc é uma substituição do aminoácido na posição 238 por Asp, uma substituição do aminoácido na posição 271 por Gly, uma substituição do aminoácido na posição 327 por Gly, uma substituição do aminoácido na posição 330 por Ser, uma substituição do aminoáci- do na posição 331 por Ser, uma substituição do aminoácido na posição 233 por Asp, uma substituição do aminoácido na posição 237 por Asp, uma substituição do aminoácido na posição 264 por Ile, uma substituição do aminoácido na posição 267 por Ala e uma substituição do aminoácido na posição 268 por Asp ou Glu na região Fc em conformidade com a numeração de EU.
[00033] Ademais, a presente invenção se refere a métodos para diminuir as atividades de ligação de uma região Fc a todos os FcyRs de ativação, em particular FcyRIIa (tipo R), enquanto mantém sua atividade de ligação ao FcyRIIb através da introdução das alterações de aminoácido de região Fc da presente invenção. A presente invenção também se refere aos métodos para suprimir a produção de anticorpos contra polipeptídeos que compreendem a região Fc através da introdução das alterações de aminoácido de região Fc da presente invenção.
[00034] Ademais, a presente invenção se refere aos métodos para promover a eliminação de um antígeno de causa de doença no plasma, que são alcançados por uma variante de região Fc produzida através da introdução das alterações de aminoácido de região Fc da presente invenção e um polipeptídeo que tem uma atividade para se ligar ao antígeno presente sob forma solúvel em plasma e que compreende um domínio de ligação de antígeno cuja atividade de ligação em relação ao antígeno que altera de acordo com a condição de concentração de íon. A presente invenção também se refere ao uso de uma variante de região Fc produzida através da introdução das alterações de aminoácido de região Fc da presente invenção e um polipep- tídeo que tem uma atividade para se ligar a um antígeno de causa de doença presente na forma solúvel em plasma e que compreende um domínio de ligação de antígeno cuja atividade de ligação em direção ao antígeno é alterado de acordo com a condição de concentração de íon, em que o uso é para promover a eliminação do antígeno em plasma.
[00035] Uma presente invenção da mesma forma refere-se a um agente terapêutico ou preventivo para doenças imunoinflamatórias que compreendem um polipeptídeo da presente invenção. Além disso, a presente invenção refere-se a um método para tratar ou prevenir doenças imunoinflamatórias, que compreende a etapa de administrar um polipeptídeo da presente invenção a um indivíduo. Além disso, a presente invenção refere-se a um kit para uso no método da presente invenção para tratar ou prevenir doenças imunoinflamatórias, que compreende um polipeptídeo da presente invenção. A presente invenção da mesma forma refere-se ao uso de um polipeptídeo da presente invenção na produção de um agente terapêutico ou preventivo para doenças imunoinflamatórias. Além disso, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo da presente invenção para uso no método para tratar ou prevenir doenças imunoinflamatórias da presente invenção.
[00036] A presente invenção refere-se a um inibidor de ativação para células B, mastócitos, células dendríticas, e/ou basófilos, que compreende um polipeptídeo da presente invenção. Além disso, a presente invenção refere-se a um método de inibir a ativação de células B, mastócitos, células dendríticas, e/ou basófilos, que compreende administrar um polipeptídeo da presente invenção a um indivíduo. A presente invenção da mesma forma refere-se a um kit para uso no método de inibir a ativação de células B, mastócitos, células dendríticas e/ou basófilos, que compreende um polipeptídeo da presente invenção. A presente invenção refere-se ao uso de um polipeptídeo da presente invenção na produção de inibidores de ativação para células B, mastócitos, células dendríticas, e/ou basófilos. A presente invenção da mesma forma refere-se a um polipeptídeo da presente invenção para uso no método da presente invenção de inibir a ativação de células B, mastócitos, células dendríticas, e/ou basófilos.
[00037] Além disso, a presente invenção refere-se a um agente terapêutico para doenças em que uma proteína necessária para um organismo é deficiente, em que o agente compreende um polipeptídeo da presente invenção. A presente invenção da mesma forma refere-se a um método para tratar doenças em que uma proteína necessária para um organismo é deficiente, que compreende administrar um poli- peptídeo da presente invenção a um indivíduo. Além disso, a presente invenção refere-se a um kit para uso no método da presente invenção para tratar doenças em que uma proteína necessária para um organismo é deficiente, em que o kit compreende um polipeptídeo da presente invenção. A presente invenção refere-se ao uso de um polipep- tídeo da presente invenção na produção de um agente terapêutico para doenças em que uma proteína necessária para um organismo é deficiente. A presente invenção da mesma forma refere-se a um polipep- tídeo da presente invenção para uso no método da presente invenção para tratar doenças em que uma proteína necessária para um organismo é deficiente.
[00038] Além disso, a presente invenção refere-se a um agente para suprimir a proliferação do vírus, que compreende um polipeptídeo da presente invenção. A presente invenção da mesma forma refere-se a um método de suprimir a proliferação do vírus, que compreende administrar um polipeptídeo da presente invenção a um indivíduo. Além disso, a presente invenção refere-se a um kit da presente invenção para uso no método de suprimir a proliferação do vírus, em que o kit compreende um polipeptídeo da presente invenção. A presente invenção refere-se ao uso de um polipeptídeo da presente invenção na produção de um agente para suprimir a proliferação do vírus. A presente invenção da mesma forma se refere a um polipeptídeo da presente invenção para uso no método da presente invenção de suprimir a proliferação do vírus.
EFEITOS DA INVENÇÃO
[00039] A presente invenção fornece variantes de região Fc cujas atividades de ligação para todos os FCYRS de ativação, em particular ao FcyRIIa (tipo R), foram reduzidas, enquanto sua atividade de ligação de FcyRIIb é mantida, em comparação com as da região Fc de IgG de ocorrência natural. Através do uso de polipeptídeos que contêm as variantes de região Fc, é possível acentuar os sinais de supressão de resposta imunológica inflamatória produzidos através de fosforilação de ITIM de FcyRIIb, sob as condições em que a propriedade de eliminação de complexos imunes através de FcyRIIb são mantidas a um grau similar como em uma IgG de ocorrência natural. Ademais, conferindo-se uma região Fc com a propriedade de se ligar seletivamente ao FcyRIIb, é possível suprimir uma produção de anti- anticorpo. Ademais, reduzindo-se a ligação aos FcyRs de ativação, a ativação de plaqueta mediada através da interação entre o FcyRIIa na plaqueta e o complexo imune e a ativação de célula dendrítica através da reticulação de FcyRs de ativação pode ser evitada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00040] A Figura 1 mostra os resultados de análise através de cro- matografia de filtração em gel que confirma a formação dependente de pH de um grande complexo imune através de IgE humano e um anticorpo anti-IgE dependente de pH, clone 278.
[00041] A Figura 2 mostra alterações na concentração de IgE humano em um plasma de camundongo normal para o grupo ao qual o IgE humano sozinho foi administrado, o grupo administrado com anticorpo de IgE humano + clone 278 e o grupo administrado com anticorpo de IgE humano + Xolair.
[00042] A Figura 3 mostra alterações na concentração de anticorpo no plasma de camundongo normal para o grupo administrado com IgE humano + clone 278 e o grupo administrado com anticorpo de IgE humano + Xolair.
[00043] A Figura 4 mostra alterações na concentração de IgE humano no plasma de camundongo normal para o grupo ao qual o IgE humano sozinho foi administrado, o grupo administrado com anticorpo de IgE humano + 278-IgG1 e o grupo administrado com anticorpo de IgE humano + 278-F760.
[00044] A Figura 5 mostra alterações na concentração de anticorpo do camundongo normal para o grupo administrado com anticorpo de IgE humano + 278-IgG1 e o grupo administrado com anticorpo de IgE humano + 278-F760.
[00045] Figura 6 mostra resultados do uso no nível de expressão de IL-8 como um indicador para avaliar a ativação de DC através de uma variante Fc.
[00046] A Figura 7 confirma a expressão de CD62p (p-selectina) na superfície e uma membrana de plaqueta lavada à qual as variantes Fc foram adicionados. O caso de adição de 5c8-F648 e estímulo de ADP é mostrado através de uma linha sólida e a área preenchida mostra o caso de adição de 5c8-F600 e estímulo de ADP.
[00047] A Figura 8 confirma a expressão de integrina ativada (PAC- 1) sobre a superfície de uma membrana de plaqueta de lavagem à qual as variantes Fc foram adicionadas. O caso de adição de 5c8- F648 e estímulo de ADP é mostrado através de uma linha sólida e a área preenchida mostra o caso de adição de 5c8-F600 e estímulo de ADP.
[00048] A Figura 9 mostra como os anticorpos com uma propriedade de ligação dependente de pH se ligam repetidamente a antígenos solúveis: (i) um anticorpo se liga a antígenos solúveis; (ii) o anticorpo é absorvido não especificamente para o interior da célula através de pi- nocitose; (iii) o anticorpo se liga ao FcRn no endossomo e, em seguida, os antígenos solúveis se desassociam do anticorpo; (iv) os antíge- nos solúveis são translocados para o lisossomo e, em seguida, são degradados; (v) o anticorpo do qual os antígenos solúveis se desasso- ciaram é reciclado no plasma através de FcRn; e (vi) o anticorpo reciclado pode se ligar novamente aos antígenos solúveis.
[00049] A Figura 10 mostra como acentuar a ligação de FcRn sob condições neutras aprimora adicionalmente os efeitos de anticorpos com uma propriedade de ligação dependente de pH para se ligar repetidamente a antígenos: (i) um anticorpo se liga aos antígenos solúveis; (ii) o anticorpo é absorvido para o interior das células através de pino- citose através de FcRn; (iii) os antígenos solúveis se desassociam do anticorpo para dentro do endossomo; (iv) os antígenos solúveis são degradados mediante a translocação para o lisossomo; (v) o anticorpo do qual os antígenos solúveis se desassociaram é reciclado para o interior do plasma através de FcRn; e (iv) o anticorpo reciclado pode se ligar novamente aos antígenos solúveis.
[00050] A Figura 11 mostra sensogramas obtidos com o uso de Bi- acore, que demonstra a interação de anticorpos de LgA anti-humano com IgA humano em um pH 7,4 ou pH 5,8 e Ca2+ 1,2 mM ou Ca2+ 3 μM.
[00051] A Figura 12 mostra alterações nas concentrações de plasma dos anticorpos GA2-IgG1 e GA2-F1087 em camundongos normais.
[00052] A Figura 13 mostra alterações na concentração de hIgA de plasma em camundongos normais administrados com hIgA sozinho, GA2-IgG1 ou GA2-F1087.
[00053] A Figura 14 mostra alterações na concentração de receptor de IL-6 humano em plasma de camundongo quando Fv4-mIgG1, Fv4- mIgG1-mF44 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com uma ligação acentuada ao FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo e Fv4-mIgG1-mF46 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com uma ligação adicionalmente acentuada ao FcyRIIb de camundongo e o FcyRIII de camundongo foram administradas aos camundongos normais.
[00054] A Figura 15 mostra alterações na concentração de receptor de IL-6 humano em plasma de camundongo quando Fv4-mIgG1, Fv4- mIgG1-mF44 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com uma ligação acentuada ao FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo e Fv4-mIgG1-mF46 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com uma ligação adicionalmente acentuada ao FcyRIIb de camundongo e o FcyRIII de camundongo foram administradas aos camundongos com deficiência de FcyRIII.
[00055] A Figura 16 mostra alterações na concentração de receptor de IL-6 humano em plasma de camundongo quando Fv4-mIgG1, Fv4- mIgG1-mF44 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com uma ligação acentuada ao FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo e Fv4-mIgG1-mF46 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com uma ligação adicionalmente acentuada ao FcyRIIb de camundongo e o FcyRIII de camundongo foram administradas aos camundongos com deficiência de cadeia Y de receptor Fc.
[00056] A Figura 17 mostra alterações na concentração de receptor de IL-6 humano em plasma de camundongo quando Fv4-mIgG1, Fv4- mIgG1-mF44 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com uma ligação acentuada ao FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo e Fv4-mIgG1-mF46 que é uma variante de Fv4-mIgG1 com uma ligação adicionalmente acentuada ao FcyRIIb de camundongo e o FcyRIII de camundongo foram administradas aos camundongos com deficiência de FcyRIIb.
[00057] A Figura 18 mostra a relação entre os resíduos de aminoá- cido que constituem as regiões constantes de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 e a numeração de EU (neste documento, também chamada de ÍNDICE de EU).
[00058] A Figura 19 é uma Figura exemplificativa da eficácia de eliminação de antígeno através de uma única molécula de um anticorpo dependente de Ca/pH multiespecífico que reconhece dois ou mais epítopos presentes em um monômero antígeno e é adequada para formar grandes complexos imunes.
MODO PARA EXECUTAR A INVENÇÃO
[00059] A presente invenção fornece variantes de região Fc que podem diminuir as atividades de ligação a todos os FCYRS de ativação, em particular ao FcyRIIa (tipo R), enquanto mantêm a atividade de ligação ao FcyRIIb, em comparação com um polipeptídeo que contêm uma região Fc de anticorpo de lgC nativa e polipeptídeos que compreendem as variantes de região Fc.
[00060] Mais especificamente, a invenção fornece variantes de região Fc que compreendem uma sequência de aminoácido em que a alteração de aminoácido na posição 238 de acordo com a numeração de EU é combinada com outras alterações de aminoácido específicas e os polipeptídeos que compreendem as variantes de região Fc. Ademais, a presente invenção fornece métodos para introduzir as alterações de aminoácido em uma região Fc para diminuir suas atividades de ligação a todos os FcyRs de ativação, em particular ao FcyRIIa (tipo R), enquanto mantém sua atividade de ligação ao FcyRIIb em comparação às do polipeptídeo que contém uma região Fc de anticorpo de lgC nativa; e métodos para introduzir as alterações de aminoácido em uma região Fc para produzir polipeptídeos que compreendem um variante de região Fc com atividades de ligação reduzidas a todos os FCYRS de ativação, em particular ao FcyRIIa (tipo R), e mantendo a atividade de ligação ao FcyRIIb em comparação com as dos polipeptí- deos que contêm a região Fc de lgG nativa. A invenção também fornece variantes de região Fc em que as alterações de aminoácido foram introduzidas na região Fc e os polipeptídeos que têm atividade de ligação a um antígeno de causa de doença presente no plasma na forma solúvel e compreendem um domínio de ligação de antígeno cuja ativi-dade de ligação ao antígeno é alterada de acordo com a condição de concentração de íon e os métodos para usar os polipeptídeos para promover a eliminação do antígeno no plasma.
[00061] Os "polipeptídeos" da presente invenção geralmente se referem a peptídeos ou proteínas de aproximadamente dez aminoácidos ou mais no comprimento. Além disso, eles são geralmente polipeptí- deos derivados de organismos, porém não estão particularmente limitados e, por exemplo, eles podem ser polipeptídeos compreendendo uma sequência projetada artificialmente. Além disso, eles podem ser qualquer um dentre polipeptídeos de ocorrência natural, polipeptídeos sintéticos, polipeptídeos recombinantes, ou similares.
[00062] Os exemplos preferidos dos polipeptídeos da presente invenção incluem anticorpos. Os exemplos mais preferidos incluem IgGs de ocorrência natural, particularmente IgGs seres-humanos de ocorrência natural. "IgGs de ocorrência natural (nativos)" referem-se a poli- peptídeos pertencentes a uma classe de anticorpos praticamente codificados por genes de gama imunoglobulina e compreendendo uma sequência de aminoácido idêntica àquelas de IgGs encontrados na natu- reza. Por exemplo, um IgG humano de ocorrência natural significa um IgG1 humana de ocorrência natural, IgG2 humana de ocorrência natural, IgG3 humano de ocorrência natural, IgG4 humano de ocorrência natural, ou similares. IgGs de ocorrência natural da mesma forma incluem mutantes espontaneamente produzidos deles.
[00063] Enquanto uma região constante tipo IgK (Capa, cadeia □), IgL1, IgL2, IgL3, IgL6 e IgL7 (Lambda, cadeia □) está presente na região constante de cadeia leve de anticorpo, pode ser qualquer região constante de cadeia leve. Para a região constante de IgK humana (Capa) e região constante de IgL7 humana (Lambda), uma pluralidade de sequências de alótipo devido ao polimorfismo genético é descrito em "Sequences of proteins of immunological interest", Publicação de NIH No. 91-3242, e qualquer uma delas podem ser usadas na presente invenção. Além disso, na presente invenção, uma região constante de cadeia leve pode ser uma região constante de cadeia leve que foi alterada com substituições, adições, deleções, inserções, e/ou modificações de aminoácido ou similares. Para a região Fc de anticorpo, por exemplo, regiões de Fc dos tipos IgA1, IgA2, IgD, IgE, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, e IgM existem. Por exemplo, uma região Fc de anticorpo IgG humano pode ser usada como a região Fc de anticorpo da presente invenção, e região Fc de anticorpo IgG1 humana são preferidas. As regiões de Fc que podem ser usadas como uma região Fc da presente invenção são, por exemplo, aquelas derivadas de regiões constantes de IgG de ocorrência natural, ou especificamente, uma região constante derivada de IgG1 humana de ocorrência natural (SEQ ID NO: 31), uma região constante derivada de IgG2 humana de ocorrência natural (SEQ ID NO: 32), uma região constante derivada de IgG3 humano de ocorrência natural (SEQ ID NO: 33), e uma região constante derivada de IgG4 humano de ocorrência natural (SEQ ID NO: 34). A Figura 18 mostra as sequências da região constante de IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4 de ocorrência natural. Regiões constantes de IgGs de ocorrência natural da mesma forma incluem mutantes espontaneamente produzidos deles. Para as regiões constantes de anticorpos de IgG1 humana, IgG2 humana, IgG3 humana, e IgG4 humana, uma pluralidade de sequências de alótipo devido ao polimorfismo genético é descrita em "Sequences of proteins of immunological interest", Publicação de NIH No. 91-3242, e qualquer uma delas pode ser usada da presente invenção. Em particular, para a sequência de IgG1 humana, a sequência de aminoácido nas posições 356 a 358 (numeração de EU) podem ser DEL ou EEM.
[00064] "Receptores FCY" (aqui, referidos como receptores FCY, FCYR ou FCYR) referem-se a receptores que podem ligar-se a uma região Fc de anticorpos monoclonais de IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4, e praticamente significa qualquer membro da família de proteínas codificadas pelos genes de receptor FCY. Em seres-humanos, esta família inclui FCYRI (CD64) incluindo isoformas FcYRIa, FcYRIb, e FCYRIC; FcyRII (CD32) incluindo isoformas FcyRIIa (incluindo alótipos H131 (tipo H) e R131 (tipo R)), FcyRIIb (incluindo FcyRIIb-1 e FcyRIIb-2), e FcyRIIc; e FcyRIII (CD16) incluindo isoformas FcyRIIIa (incluindo alóti- pos V158 e F158), e FcyRIIIb (incluindo alótipos FcyRIIIb-NA1 e FcyRIIIb-NA2), e quaisquer isoformas ou alótipos de FcyRs, FcyR se- res-humanos ainda a serem descobertos, porém não estão limitados a estes. FcyRIIb1 e FcyRIIb2 foram relatadas como variantes de ligação FcyRIIb humanas. Além disso, uma variante de ligação denominada FcyRIIb3 foi relatada (J. Exp. Med, 1989, 170: 1369). Além destas variantes de ligação, FcyRIIb humana inclui todas as va-riantes de ligação registradas em NCBI, que são NP_001002273.1, NP_001002274.1, NP_001002275.1, NP_001177757.1, e NP_003992.3. Além disso, FcyRIIb humana inclui cada polimorfismo genético previamente relatado, bem como FcyRIIb (Arthritis Rheum, 2003, 48: 3242 a 3252; Hum Mol Genet, 2005, 14: 2881 a 2892; e Arthritis Rheum. 2002 MaY; 46(5): 1242 a 1254), e cada polimorfismo genético que será relatado no futuro.
[00065] A FcYR inclui FcYRs derivada de humano, camundongo, rato, coelho e macaco porém não está limitada a estes, e pode ser derivada de qualquer organismo. FcYRs de camundongo incluem FcYRI (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII (CD16), e FcyRIII-2 (CD16-2), e quaisquer isoformas ou alótipos FcYRs, ou FcYR de camundongo ainda a serem descobertos, porém não estão limitados a estas. Exemplos favoráveis de tais receptores de FCY incluem FCYRI (CD64), FcyRIIA (CD32), FcyRIIB (CD32), FcyRIIIA (CD16), e/ou FcyRIIIB (CD16) humana.
[00066] A sequência de polinucleotídeo e sequência de aminoácido de FcYRI são mencionadas em SEQ ID NOs: 35 (NM_000566.3) e 36 (NP_000557.1), respectivamente; a sequência de polinucleotídeo e sequência de aminoácido de FcyRIIA são mencionadas em SEQ ID NOs: 37 (BC020823.1) e 38 (AAH20823.1), respectivamente; a sequência de polinucleotídeo e sequência de aminoácido de FcyRIIB são mencionadas em SEQ ID NOs: 39 (BC146678.1) e 40 (AAI46679.1), respectivamente; a sequência de polinucleotídeo e sequência de aminoácido de FcyRIIIA são mencionadas em SEQ ID NOs: 7 (BC033678.1) e 8 (AAH33678.1), respecti-vamente; e a sequência de polinucleotídeo e sequência de aminoácido de FcyRIIIB são mencionadas em SEQ ID NOs 9 (BC128562.1) e 10 (AAI28563.1), respecti-vamente (o número de registro RefSeq é indicado dentro dos parênteses).
[00067] Em FcyRIIa, há dois alótipos, um onde o aminoácido na posição 131 de FcyRIIa é histidina (tipo H) e o outro onde este aminoáci- do é substituído com arginina (tipo R) (J. Exp. Med, 172: 19 a 25, 1990).
[00068] No FCYRI (CD64) inclusive FcYRIa, FcYRIb e FCYRIC e em FcyRIII (CD16), inclusive a isoforma FcyRIIIa (inclusive alotipos V158 e F158), a cadeia Y que se liga à porção Fc de IgG é associada à cadeia Y comum que tem ITAM responsável para transduzir os sinais de ativação no interior das células. O FcyRIIIb (inclusive os alotipos FcyRIIIb-NA1 e FcyRIIIb-NA2) é uma proteína âncora de GPI. Entretanto, o domínio citoplásmico de FcyRII (CD32) em si que inclui as isoformas FcyRIIa (inclusive os alotipos H131 e R131) e FcyRIIc, contém ITAM. Tais receptores são expressados em muitas células imunes, tais como macrófagos, mastócitos e células de apresentação de antígeno. Os sinais de ativação transduzidos quando tais receptores se ligam à porção Fc de IgG acentuam a habilidade fagocítica de macrófagos, produção de citocina inflamatória, desgranulação de mastócito e promoção da função de células de apresentação de antígeno. Os receptores de Fcy que têm a habilidade para transduzir os sinais de ativação conforme descrito acima também são chamados de receptores de Fcy de ativação na presente invenção.
[00069] Entretanto, o domínio intracitoplásmico de FcyRIIb (que incluem FcyRIIb-1 e FcyRIIb-2) em si contém ITIM responsável para a transdução de sinais inibidores. A reticulação entre FcyRIIb e o receptor de célula B (BCR) em células B suprime os sinais de ativação do BCR, que resulta na supressão da produção de anticorpo através do BCR. A reticulação de FcyRIII e FcyRIIb em macrófagos suprime a habilidade fagocítica e a habilidade de produzir citocinas inflamatórias. Os receptores de Fcy que têm a habilidade de transduzir os sinais inibidores conforme descrito acima também são chamados de receptores de Fcy inibidor na presente invenção.
[00070] Na presente invenção, uma "variante de região Fc" se refe- re a uma região Fc em que pelo menos um aminoácido da presente invenção foi alterado para outro aminoácido em uma região Fc não introduzida com a alteração de aminoácido da presente invenção. Neste documento, uma região Fc em que "pelo menos um aminoácido foi alterado para outro aminoácido" inclui uma região Fc em que a alteração de aminoácido foi introduzida e uma região Fc que compreende uma sequência de aminoácido idêntica à da região Fc que compreende a alteração de aminoácido.
[00071] "IgGs de ocorrência natural (IgGs nativas)" se refere a poli- peptídeos que pertencem a uma classe de anticorpos substancialmente codificada através de genes de imunoglobulina gama e que compreende uma sequência de aminoácido idêntica às das IgGs encontradas na natureza. Por exemplo, uma IgG humana nativa se refere a uma IgG1 humana nativa, IgG2 humana nativa, IgG3 humana nativa, IgG4 humana nativa ou similar. As IgGs nativas também incluem mu- tantes produzidos espontaneamente a partir das mesmas e IgGs introduzidas com alterações que não afetam substancialmente as atividades de ligação ao FCYR.
[00072] A região Fc de uma IgG nativa significa uma região Fc que compreende uma sequência de aminoácido idêntica à da região Fc derivada de uma IgG encontrada na natureza. A região constante de cadeia pesada da IgG nativa é mostrada na Figura 18 (SEQ ID NOs: 31 a 34) e, por exemplo, se refere às regiões Fc nas regiões constantes de cadeia pesada derivadas da IgG1 humana nativa, regiões Fc nas regiões constantes de cadeia pesada derivadas da IgG2 humana nativa, regiões Fc nas regiões constantes de cadeia pesada derivadas da IgG3 humana nativa e regiões Fc nas regiões constantes de cadeia pesada derivadas da IgG4 humana nativa. As regiões Fc de IgGs nativas também incluem mutantes espontaneamente produzidos a partir das mesmas e as regiões Fc introduzidas com alterações que não afe- tam substancialmente as atividades de ligação ao FCYR.
[00073] Na presente invenção, se ou não a atividade de ligação para cada tipo de FCYR é realçada, ou mantida ou diminuída em um poli- peptídeo compreendendo uma variante da região Fc ou uma variante da região Fc da presente invenção pode ser determinada, por exemplo, observando-se se há uma diminuição ou um aumento no valor da constante de dissociação (KD) obtido dos resultados da análise do sensógrafo, onde vários FcyRs são submetidos à interação como um analito com anticorpos imobilizados sobre os chips de sensor ou capturada sobre os chips de sensor usando Proteína A, Proteína L, Proteína A/G, Proteína G, anticorpos de cadeia anti-lamda, anticorpos de cadeia anti-capa, peptídeos antigênicos, proteínas antigênicas, ou similares usando BIACORE que é um analisador de interação que utiliza o fenômeno de ressonância de plasmônio superficial (SPR), como mostrado nos Exemplos ou nos Exemplos de Referência. Alternativamente, pode da mesma forma ser determinado observando-se se há um aumento ou uma diminuição no valor obtido dividindo-se a quantidade da mudança no valor da unidade de ressonância (RU) no sensó- grafo antes e após vários tipos de FcyRs serem submetidos à interação como um analito com anticorpos imobilizados sobre os chips de sensor ou capturados sobre os chips de sensor usando Proteína A, Proteína L, Proteína A/G, Proteína G, anticorpos de cadeia anti-lamda, anticorpos de cadeia anti-capa, peptídeos antigênicos, proteínas anti- gênicas, ou similares, pela quantidade de mudança das unidades de ressonância (RU) antes e após os anticorpos serem imobilizados ou capturados sobre o chip do sensor. Além disso, pode ser determinado observando-se um aumento ou uma diminuição nos valores da constante de dissociação (KD) obtidos da análise de sensógrafo, onde uma amostra tal como um anticorpo a ser avaliado é submetida à interação como um analito usando um chip do sensor em que o FcyR é imobili- zado diretamente ou por meio de um anticorpo antirrótulo. Alternativamente, pode ser determinado observando-se se a quantidade de mudança nos valores de sensógrafo aumenta ou diminui antes ou após uma amostra tal como um anticorpo a ser avaliado ser submetida à interação como um analito com o chip do sensor em que FCYR é imobilizado diretamente ou por meio do anticorpo antirrótulo.
[00074] Especificamente, a atividade de ligação de uma variante da região Fc a um receptor FCY pode ser medida pela avaliação do Ensaio Homogêneo de Proximidade Luminescente Amplificado (ALPHA), o método BIACORE que utiliza o fenômeno de ressonância de plas- mônio superficial (SPR), ou similares, além do ELISA ou classificação de célula ativada por fluorescência (FACS) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103 (11): 4005 a 4010).
[00075] A avaliação por ALPHA é realizada por tecnologias de ALPHA que usam duas contas, um doador e um aceptor, com base nos seguintes princípios. Sinais luminescentes são detectados apenas quando as moléculas ligadas às contas de doador fisicamente interagem com moléculas ligadas ás contas aceptoras, e as duas contas estão em proximidade íntima para cada outro. Fotossensibilizador estimulado por laser nas contas doadoras converte o oxigênio ambiente ao oxigênio de singleto em estado estimulado. O oxigênio de singleto é disperse em torno das contas doadoras, e quando alcança as contas aceptoras adjacentes, a reação quimioluminescente é induzida nas contas e a luz é finalmente emitida. Quando as moléculas ligadas às contas doadoras não interagem com as moléculas ligadas às contas aceptoras, a região quimioluminescente não ocorre porque o oxigênio de singleto produzido pelas contas doadoras não alcança as contagens aceptoras.
[00076] Por exemplo, um complexo de polipeptídeo biotinilado é ligado às contas doadoras, e o receptor FCY rotulado com glutationa S transferase (GST) é ligado às contas aceptoras. Na ausência de um complexo de polipeptídeo competidor compreendendo uma variante da região Fc, o complexo de polipeptídeo compreendendo uma região Fc tipo selvagem interage com o receptor FCY e produz sinais de 520 a 620 nm. O complexo de polipeptídeo compreendendo uma região Fc mutante não rotulada compete com o complexo de polipeptídeo compreendendo a região Fc tipo selvagem para interação com o receptor Fcy. As atividades de ligação relativa podem ser determinadas quantificando-se a diminuição na fluorescência observada como um resultado da competição. A biotinilação dos complexos de polipeptídeo tais como anticorpos usando Sulfo-NHS-biotina e similares é bem conhecida. O método de expressar o receptor Fcy e GST em uma célula car-regando um gene de fusão produzido fundindo-se um polinucleotídeo codificando o receptor Fcy na estrutura com um polinucleotídeo codificando GST em um vetor expressível, e realizando a purificação usando uma coluna de glutationa é apropriadamente adotado como um método para rotular um receptor Fcy com GST. Os sinais obtidos são preferivelmente analisados, por exemplo, ajustando-os a um modelo de competição de um sítio usando uma análise de regressão não linear usando o software tal como GRAPHPAD PRISM (GraphPad, San Diego).
[00077] Uma das substâncias (o ligante) na observação de uma interação é imobilizada em uma película fina de ouro em um chip do sensor, e abrilhantando-se luz da lateral reversa do chip do sensor para que a reflexão total ocorra na interface entre a película fina de ouro e vidro, uma porção da intensidade de reflexão reduzida é formada em parte da luz refletida (sinal de SPR). Quando a outra dentre as substâncias (o analito) na observação de uma interação é colocada para fluir sobre a superfície do chip do sensor e o ligante liga-se ao analito, a massa da molécula de ligante imobilizada aumenta e o índice refrati- vo do solvente na superfície chip do sensor muda. A posição do sinal de SPR muda como um resultado desta mudança no índice refrativo (por outro lado, a posição de sinal retorna quando esta ligação é de- sassociada). O sistema Biacore indica a quantidade de mudança mencionada acima, ou mais especificamente a variável de tempo de massa plotando-se a mudança em massa sobre a superfície do chip de sensor na ordenada conforme os dados de medição (sensógrafo). A quantidade do analito ligado ao ligante capturado na superfície do chip do sensor é determinada a partir do sensógrafo. Parâmetros cinéticos tais como constantes de taxa de associação (ka) e constantes de taxa de dissociação (kd) são determinados a partir das curvas do sensógra- fo e as constantes de dissociação (KD) são determinadas em relação a tais constantes. No método BIACORE, um método para medir a ini-bição é preferivelmente usado. Um exemplo do método para medir a inibição é descrito em Proc. Natl. Acad. Sci USA (2006) 103 (11): 4005 a 4010.
[00078] Uma região Fc cuja atividade de ligação ao FcyRIIb é mantida ou um polipeptídeo que compreende tal região Fc se refere a um polipeptídeo que se liga ao FcyRIIb com uma atividade de ligação equivalente a ou substancialmente inalterada em relação ao polipeptí- deo precursor quando o ensaio é realizado com substancialmente a mesma quantidade de um polipeptídeo que contém a região Fc da IgG nativa (também chamado de polipeptídeo que contém a região Fc precursora ou um polipeptídeo precursor) e um polipeptídeo que compreende as alterações de aminoácido da presente invenção na região Fc (um polipeptídeo que contém a variante de região Fc). Especificamente, se refere a uma variável de região Fc que mantém pelo menos 55,5% da propriedade de ligação ao FcyRIIb do polipeptídeo que con-tém a região Fc precursora.
[00079] Uma região Fc cujas atividades de ligação a FCYRS de ati vação foram diminuídas, reduzidas ou atenuadas ou um polipeptídeo que contém tal região Fc se refere a uma variante de região Fc ou um polipeptídeo que contém a variante de região Fc que se liga a FCYRS de ativação com atividades de ligação substancialmente mais fracas do que as dos polipeptídeos que contêm a região Fc precursora quando o ensaio é realizado com substancialmente a mesma quantidade de um polipeptídeo que contém a região Fc da IgG nativa (também chamado de polipeptídeo que contém a região Fc precursora ou um poli- peptídeo precursor) e um polipeptídeo que inclui alterações de amino- ácido da presente invenção na região Fc (um polipeptídeo que contém uma variante de região Fc).
[00080] É possível determinar se uma variante de região Fc da presente invenção mantém a atividade de ligação ao FcyRIIb da região Fc de uma IgG nativa através da comparação do valor de KD para FcyRIIb do polipeptídeo que compreende a variante de região Fc da presente invenção com o valor de KD para FcyRIIb do polipeptídeo que contém a região Fc de uma IgG nativa, que pode ser determinada, por exemplo, de acordo com os exemplos mencionados acima. Especificamente, quando o valor de KD para o polipeptídeo que contém uma variante de região Fc da presente invenção é um valor equivalente ou menor do que o de um polipeptídeo que contém a região Fc precursora, pode ser determinado que o polipeptídeo que contém a variante de região Fc da presente invenção manteve sua atividade de ligação ao FcyRIIb em comparação com um polipeptídeo que contém a região Fc precursora. É possível determinar se a atividade de ligação de FcyR de ativação de uma variante de região Fc da presente invenção é diminuída em comparação com a de uma região Fc de lgG nativa de uma maneira similar, por exemplo, através da comparação do valor de KD para um FcyR de ativação do polipeptídeo que compreende a variante de região Fc da presente invenção com o valor de KD para o FCYR de ativação do polipeptídeo que contém a região Fc de uma IgG nativa, conforme determinado de acordo com os exemplos mencionados acima. Especificamente, quando o valor de KD do poli- peptídeo que compreende a variante de região Fc da presente invenção é acentuado em comparação com o do polipeptídeo que compreende a região Fc precursora, pode ser determinado que o polipeptídeo que compreende a variante de região Fc da presente invenção tem uma atividade de ligação reduzida para FcyR de ativação em comparação com a do polipeptídeo que compreende a região Fc precursora. Em particular, devido ao fato de que a atividade de ligação de FcyRIIa (tipo R) é mais facilmente correlacionada com a atividade de ligação ao FcyRIIb do que com as atividades de ligação para outros FcyRs de ativação, encontrar alterações de aminoácido que podem diminuir a atividade de ligação para FcyRs de ativação diferentes de FcyRIIb.
[00081] Uma atividade de ligação ao FcyRIIb equivalente ou mantida significa que, por exemplo, nos valores de KD determinados pelo método de medição descrito acima, a razão de KD de [valor de KD para FcyRIIb do polipeptídeo que compreende a região Fc precursora] / [valor de KD para FcyRIIb do polipeptídeo que compreende a variante de região Fc] é preferencialmente, pelo menos 0,75, mais preferencialmente, pelo menos 0,8, ainda mais preferencialmente, pelo menos 0,9. Ademais, um valor de cerca de 5 é suficiente para a razão de KD e um valor superior não é necessário para determinar que a atividade de ligação ao FcyRIIb é equivalente ou mantida.
[00082] A diminuição, redução ou atenuação de atividades de ligação para FcyRs de ativação significam que, por exemplo, no valor de KD determinado pelo método de medição mencionado acima, a razão de KD para [valor de KD para um FcyR de ativação do polipeptídeo que compreende a região Fc precursora] / [valor de KD para o FcyR de ativação do polipeptídeo que compreende a variante de região Fc] é preferencialmente 0,2 ou menos, mais preferencialmente, 0,15 ou menos ou, mais preferencialmente, 0,1 ou menos.
[00083] Em particular, devido ao fato de que as sequências de região extracelular de FcyRIIa e FcyRIIb têm 93% de identidade e suas estruturas são extremamente similares, para a atividade de ligação de FcyRIIaR, que é difícil diminuir enquanto mantêm a atividade de ligação ao FcyRIIb, a razão de KD para [valor de KD para FcyRIIaR do po- lipeptídeo que compreende a região Fc precursora] / [valor de KD para FcyRIIaR do polipeptídeo que compreende a variante de região Fc] é preferencialmente 0,1 ou menos e mais preferencialmente 0,05.
[00084] Além disso, se ou não as atividades de ligação dos polipep- tídeos da presente invenção para várias FCYRS foram mantidas, realçadas ou diminuídas pode ser determinado a partir do aumento ou diminuição na quantidade de ligação das várias FcyRs aos polipeptídeos da presente invenção, os quais foram determinados de acordo com os exemplos descritos acima. Aqui, a quantidade de ligação das várias FcyRs aos polipeptídeos refere-se aos valores obtidos determinando- se a diferença nos valores de RU de sensógrafos que mudaram antes e depois da interação de várias FcyRs com o analito com cada poli- peptídeo, e dividindo-os pelas diferenças nos valores de RU de sensó- grafos que mudaram antes e depois de capturar os polipeptídeos aos chips de sensor.
[00085] Ademais, uma região Fc cuja seletividade para FcyRIIb foi aprimorada ou um polipeptídeo que compreende tal região Fc ou uma região Fc cujas atividades de ligação aos FcyRs de ativação foram seletivamente reduzidas ou um polipeptídeo que compreende tal região Fc se referem a uma região Fc cujas atividades de ligação aos FcyRs de ativação foram diminuídas, reduzidas ou atenuadas, enquanto é mantida a atividade de ligação ao FcyRIIb ou um polipeptídeo que compreende tal região Fc.
[00086] As variantes de região Fc da presente invenção não são particulamente limitadas em termos de seus valores de KD (mol/l) para FcyRIIb e FCYRS de ativação; entretanto, por exemplo, o valor para FcyRIIb pode ser 7,0 x 10-6 ou menos, preferencialmente 6,0 x 10-6 ou menos ou, mais preferencialmente, 5,0 x 10-6 ou menos e os valores para FcyRs de ativação podem ser 2,5 x 10-9 ou superior, preferencialmente, 3,0 x 10-9 ou superior ou, mais preferencialmente, 3,5 x 10-9 ou superior e o valor para FcyRIIa (tipo R), em particular, é preferencialmente 2,0 x 10-5 ou superior.
[00087] Uma "região Fc" se refere a um fragmento que consiste em uma porção articulada ou uma parte da mesma e domínios de CH2 e CH3 em uma molécula de anticorpo. De acordo com a numeração de EU (neste documento, também chamada de ÍNDICE de EU) (consulte a Figura 18), uma região Fc de classe de IgG se refere, por exemplo, à região da cisteína na posição 226 até o terminal C ou a partir da prolina na posição 230 até o terminal C, mas sem limitação aos mesmos.
[00088] A região Fc pode ser obtida adequadamente através da reeluição da fração adsorvida em uma coluna A de proteína e uma coluna G de proteína após diferir parcialmente anticorpos monoclonais IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ou similares com o uso de uma protease tal como pepsina. Tal protease não é particularmente limitada, contanto que possa digerir um anticorpo de comprimento completo, de modo a produzir restritamente Fab e F(ab’)2 definindo-se, adequadamente, as condições de reação de enzima, tais como pH e os exemplos incluem pepsina e papaína.
[00089] A presente invenção fornece uma variante de região Fc que compreende alterações de aminoácido que combinam uma alteração do aminoácido na posição 238 de acordo com a numeração de EU para outro aminoácido com alteração de qualquer um dentre os aminoá- cidos de (a) a (k) abaixo para outro aminoácido na região Fc de IgG humana (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4). A introdução das alterações em uma região Fc pode fornecer um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc com atividades de ligação diminuídas para todos os FCYRS de ativação, em particular o FcyRIIa (tipo R), enquanto é mantida a atividade de ligação ao FcyRIIb em comparação com as de um polipeptídeo que compreende a região Fc de uma IgG nativa: (a) aminoácido na posição 235 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (b) aminoácido na posição 237 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (c) aminoácido na posição 241 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (d) aminoácido na posição 268 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (e) aminoácido na posição 295 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (f) aminoácido na posição 296 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (g) aminoácido na posição 298 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (h) aminoácido na posição 323 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (i) aminoácido na posição 324 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (j) aminoácido na posição 330 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (k) pelo menos dois aminoácidos selecionados dentre (a) a (j).
[00090] Uma combinação de pelo menos dois amino- ácidos selecionados em (k) mencionado acima não é especificamente limitada, contanto que as atividades de ligação a todos os FCYRS de ativação sejam diminuídas enquanto a atividade de ligação ao FcyRIIb é mantida em comparação com as de um polipeptídeo que compreende a região Fc de lgG nativa, porém, as seguintes combinações (1) a (3) são preferenciais: (l) aminoácidos nas posições 241, 268, 296 e 324 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (m) aminoácidos nas posições 237, 241, 296 e 330 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; e (n) aminoácidos nas posições 235, 237, 241 e 296 da região Fc em conformidade com a numeração de EU;
[00091] Os aminoácidos selecionados para estarem presentes após a alteração não são especificamente limitados, contanto que as atividades de ligação a todos os FcyRs de ativação sejam diminuídas enquanto a atividade de ligação ao FcyRIIb é mantida em comparação com as de um polipeptídeo que compreende a região Fc de uma IgG nativa, mas são, preferencialmente, Asp na posição de aminoácido 238, Phe na posição de aminoácido 235, Gln ou Asp na posição de aminoácido 237, Met ou Leu na posição de aminoácido 241, Pro na posição de aminoácido 268, Met ou Val na posição de aminoácido 295, Glu, His, Asn ou Asp na posição de aminoácido 296, Ala ou Met na posição de aminoácido 298, Ile na posição de aminoácido 323, Asn ou His na posição de aminoácido 324 e His ou Tyr na posição de ami- noácido 330 de acordo com numeração de EU. Ademais, os aminoáci- dos selecionados para estarem presentes após a alteração em relação aos itens (1) a (3) descritos acima são, preferencialmente: (1) Met na posição de aminoácido 241, Pro na posição de aminoácido 268, Glu na posição de aminoácido 296 e His na posição de aminoácido 324 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (2) Gln ou Asp na posição de aminoácido 237, Met na posição de aminoácido 241, Glu na posição de aminoácido 296 e His na posição de aminoácido 330 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; e (3) Phe na posição de aminoácido 235, Gln ou Asp na posição de aminoácido 237, Met na posição de aminoácido 241 e Glu na posição de aminoácido 296 da região Fc em conformidade com a numeração de EU.
[00092] Ademais, a presente invenção fornece uma variante de região Fc que compreende alterações de aminoácido que combinam alterações dos aminoácidos nas posições 238 e 271 da região Fc de IgG humana de acordo com a numeração de EU para outros aminoácidos, com a alteração de qualquer um dentre os aminoácidos de (a) a (h) para baixo de outro aminoácido. A introdução das alterações na região Fc pode fornecer um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc com atividades de ligação diminuídas para todos os FCYRS de ativação, em particular o FcyRIIa (tipo R), enquanto é mantida a atividade de ligação ao FcyRIIb em comparação com as de um poli- peptídeo que compreende a região Fc de uma IgG nativa. (a) aminoácido na posição 234 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (b) aminoácido na posição 235 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (c) aminoácido na posição 236 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (d) aminoácido na posição 237 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (e) aminoácido na posição 239 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (f) aminoácido na posição 265 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (g) aminoácido na posição 267 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (h) aminoácido na posição 297 da região Fc em conformidade com a numeração de EU.
[00093] As alterações de aminoácido a serem combinadas com as alterações dos aminoácidos nas posições 238 e 271 de acordo com a numeração de EU a outros aminoácidos podem incluir, adicionalmente, alterações de outros aminoácidos além dos aminoácidos de (a) a (h) descritos acima. Tais combinações de aminoácido não são especificamente limitadas, porém, uma combinação de alterações selecionadas dentre (1) a (3) abaixo é preferencial: (1) aminoácidos nas posições 233, 238, 264, 267, 268 e 271 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (2) aminoácidos nas posições 233, 237, 238, 264, 267, 268, 271, 296, 297, 330 e 396 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (3) aminoácidos nas posições 233, 238, 264, 267, 268, 271 e 296 da região Fc em conformidade com a numeração de EU.
[00094] Os aminoácidos selecionados para estarem presentes após a alteração não são particularmente limitados, contanto que as atividades de ligação a todos os FCYRS de ativação sejam diminuídas enquanto a atividade de ligação ao FcyRIIb é mantida em comparação com aquelas de um polipeptídeo que compreende a região Fc de uma IgG nativa, mas não, preferencialmente, Asp na posição de aminoáci- do 238, Gly na posição de aminoácido 271, Ala, His, Asn, Lys ou Arg em aminoácido na 234, Ala na posição de aminoácido 235, Gln na posição de aminoácido 236, Arg ou Lys na posição de aminoácido 237, Lys na posição de aminoácido 239, Lys, Asn, Arg, Ser ou Val na posi ção de aminoácido 265, LYS, Arg, ou TYr na posição de aminoácido 267 e Ala na posição de aminoácido 297 de acordo com numeração de EU.
[00095] Ademais, os aminoácidos selecionados para estarem presentes após as alterações de (1) a (3) descritas acima são, preferencialmente: (1) Asp na posição de aminoácido 233, Asp na posição de aminoácido 238, Ile na posição de aminoácido 264, Arg na posição de aminoácido 267, Glu na posição de aminoácido 268 e Gly na posição de aminoácido 271 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (2) Asp na posição de aminoácido 233, Asp na posição de aminoácido 237, Asp na posição de aminoácido 238, Ile na posição de aminoácido 264, Ala na posição de aminoácido 267, Glu na posição de aminoácido 268, Gly na posição de aminoácido 271, Asp na posição de aminoácido 296, Ala na posição de aminoácido 297, Arg na posição de aminoácido 330 e Met na posição de aminoácido 396 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; e (3) Asp na posição de aminoácido 233, Asp na posição de aminoácido 238, Ile na posição de aminoácido 264, Arg na posição de aminoácido 267, Pro na posição de aminoácido 268, Gly na posição de aminoácido 271 e Glu na posição de aminoácido 296 da região Fc em conformidade com a numeração de EU.
[00096] Ademais, a presente invenção fornece uma variante de região Fc que compreende alterações dos aminoácidos nas posições 238, 271, 327, 330 e 331 da região Fc de IgG humana de acordo com a numeração de EU para outros aminoácidos. A presente invenção fornece, ainda, uma variante de região Fc que compreende alterações de aminoácido, em que a variante compreende, adicionalmente, a alteração de uma combinação dos aminoácidos de qualquer um dentre (a) a (e) abaixo para outros aminoácidos. A introdução das alterações na região Fc pode fornecer um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc com atividades de ligação diminuídas para todos os FCYRS de ativação, em particular o FcyRIIa (tipo R), enquanto é mantida a atividade de ligação ao FcyRIIb em comparação com as de um polipeptídeo que compreende a região Fc de uma IgG nativa. (a) o aminoácido na posição 233 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (b) o aminoácido na posição 237 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (c) o aminoácido na posição 264 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (d) o aminoácido na posição 267 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; e (e) o aminoácido na posição 268 da região Fc em conformidade com a numeração de EU.
[00097] As alterações de aminoácido a serem combinadas com as alterações dos aminoácidos nas posições 238 e 271 de acordo com a numeração de EU a outros aminoácidos podem incluir alterações de outros aminoácidos além dos aminoácidos de (a) a (e) descritos acima. Tais combinações de aminoácido não são especificamente limitadas, porém, uma combinação de alterações selecionadas dentre (1) a (4) abaixo é preferencial. (1) aminoácidos nas posições 237, 238, 268, 271, 327, 330 e 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (2) aminoácidos nas posições 233,0237, 238, 268, 271, 327, 330 e 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (3) aminoácidos nas posições 238, 267, 268, 271, 327, 330 e 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; e (4) aminoácidos nas posições 238, 264, 267, 271, 327, 330 e 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU.
[00098] Os aminoácidos selecionadas para estarem presentes após as alterações não são particularmente limitadas, contanto que as atividades de ligação a todos os FCYRS de ativação sejam diminuídas enquanto a atividade de ligação ao FcyRIIb é mantida em comparação com as de um polipeptídeo que compreende a região Fc de uma IgG nativa, porém, são preferencialmente, Asp na posição de aminoácido 238, Gly na posição de aminoácido 271, Gly na posição de aminoácido 327, Ser na posição de aminoácido 330, Ser na posição de aminoáci- do 331, Asp na posição de aminoácido 233, Asp na posição de amino- ácido 237, Ile na posição de aminoácido 264, Ala na posição de ami- noácido 267 e Asp ou Glu na posição de aminoácido 268 de acordo com a numeração de EU.
[00099] Além disso, os aminoácidos selecionados presentes após as alterações em (1) a (4) descritos acima são preferencialmente: (1) Asp na posição de aminoácido 237, Asp na posição de aminoácido 238, Asp ou Glu na posição de aminoácido 268, Gly na posição de aminoácido 271, Gly na posição de aminoácido 327, Ser na posição de aminoácido 330 e Ser na posição de aminoácido 331 da região Fc de acordo com a numeração de EU; (2) Asp na posição de aminoácido 233, Asp na posição de aminoácido 237, Asp na posição de aminoácido 238, Asp na posição de aminoácido 268, Gly na posição de aminoácido 271, Gly na posição de aminoácido 327, Ser na posição de aminoácido 330 e Ser na posição de aminoácido 331 da região Fc de acordo com a numeração de EU; (3) Asp na posição de aminoácido 238, Ala na posição de aminoácido 267, Glu na posição de aminoácido 268, Gly na posição de aminoácido 271, Gly na posição de aminoácido 327, Ser na posição de aminoácido 330 e Ser na posição de aminoácido 331 da região Fc de acordo com a numeração de EU; e (4) Asp na posição de aminoácido 238, Ile na posição de aminoácido 264, Ala na posição de aminoácido 267, Gly na posição de aminoácido 271, Gly na posição de aminoácido 327, Ser na posição de aminoácido 330 e Ser na posição de aminoácido 331 da região Fc de acordo com a numeração de EU.
[000100] Na presente invenção, pelo menos uma outra alteração diferente pode ser feita para a região Fc além dessas alterações. A alteração não é particularmente limitada desde que diminua as atividades de ligação para ativar FCYRS enquanto mantém a atividade de ligação de FcyRIIb.
[000101] Os exemplos de tal alteração incluem aqueles que diminuem a atividade de ligação complementar. Os exemplos específicos incluem alteração de aminoácido na posição 322 da região Fc de acordo com a numeração de EU ou uma combinação de alterações de amino- ácido nas posições 327, 330 e 331 da região Fc de acordo com a numeração de EU. Os aminoácidos selecionados a estar presentes após a alteração não são particularmente limitados desde que a atividade de ligação complementar seja diminuída enquanto as atividades de ligação para todas as FcyRs de ativação são diminuídas e a atividade de ligação de FcyRIIb é mantida em comparação àquelas de um poli- peptídeo que compreende a região Fc de uma IgG nativa, mas são preferencialmente Ala ou Glu na posição de aminoácido 322, Gly na posição de aminoácido 327, Ser na posição de aminoácido 330 e Ser na posição de aminoácido 331 de acordo com numeração de EU.
[000102] Na presente invenção, se a atividade de ligação complementar da variante de região Fc ou o polipeptídeo que compreende a variante de região Fc da presente invenção for diminuído, pode ser confirmado por um método similar ao método descrito acima para con firmas se as atividades de ligação de FCYR foram diminuídas. Especifi-camente, por exemplo, a determinação pode ser feita observando-se se há uma diminuição no valor da constante de dissociação (KD) obtido a partir dos resultados de análise de sensorgrama, em que o complemento interage como um analito com anticorpos a ser avaliados que são imobilizados nos chips de sensor ou capturados nos chips de sensor com uso de Proteína A, Proteína L, Proteína A/G, Proteína G, anticorpos de cadeia anti-lambda, anticorpos de cadeia anti-kappa, peptídeos de antígeno, proteínas de antígeno ou tais com uso de BIA- CORE, que é um analisador de interação que utiliza o fenômeno de ressonância de plasma de superfície (SPR), conforme conhecido nos exemplos. Alternativamente, também pode ser determinado observando-se se há uma diminuição no valor obtido dividindo-se a quantidade de alteração no valor de unidade de ressonância (RU) no sensorgrama antes e após o complemento ser submetido a interação, como um ana- lito com anticorpos a ser avaliados, imobilizados nos chips de sensor ou capturados nos chips de sensor com uso de Proteína A, Proteína L, Proteína A/G, Proteína G, anticorpos de cadeia anti-lambda, anticorpos de cadeia anti-kappa, peptídeos de antígeno, proteínas de antíge- no ou tais, pela quantidade de alteração de unidades de ressonância (RU) antes e após os anticorpos serem imobilizados ou capturados no chip de sensor. Além disso, pode-se determinar observando-se se há uma diminuição nos valores de constante de dissociação (KD) obtidos a partir da análise de sensorgrama, em que uma amostra tal como um anticorpo a ser avaliado é submetido a interação como um analito com uso de um chip de sensor sobre o qual um complemento foi imobilizado diretamente ou através de um anticorpo anti-tag. Alternativamente, pode-se determinar observando-se se a quantidade de alteração nos valores de sensorgrama diminui ou não antes e após uma amostra tal como um anticorpo a ser avaliado é submetida a interação como um analito com o chip de sensor sobre o qual um complemento é imobilizado diretamente ou através de um anticorpo anti-tag. De outro modo, pode-se determinar avaliando-se a quantidade de ligações através de ELISA que envolve adicionar o complemento a uma placa na qual um anticorpo a ser avaliado foi imobilizado diretamente ou através de um antígeno e, então, adicionando-se um anticorpo C1q de anti-humano classificado com peroxidase ou similar.
[000103] As alterações de aminoácido executadas para outros propósitos também podem ser combinadas no polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc da presente invenção. Por exemplo, as substituições de aminoácido que aprimoram a atividade de ligação de FcRn (J. Immunol. 2006, 41, 1761: 346 a 356; J Biol Chem. 2006, 418, 28133: 23514 a 23524; Int. Immunol. dezembro de 2006 18;12(l):55 a 59. 1759 a 1769; Nat Biotechnol. fevereiro de 2010; 28(2): 157 a 159; WO 2006/019447; WO 2006/053301 e WO 2009/086320), e as substituições de aminoácido para aprimoramento de estabilidade ou heterogeneidade de anticorpo (WO 2009/041613) podem ser introduzidas. Alternativamente, os polipeptídeos produzidos conferindo-se os polipeptídeos que compreendem uma variante de região Fc da presente invenção com a propriedade de estimular a eliminação de antígeno, que são descritos no documento WO 2011/122011 ou PCT/JP2011/072550 e polipeptídeos conferidos com a propriedade para se ligar repetidamente às múltiplas moléculas de antígeno, que são descritos no documento WO 2009/125825 ou PCT/JP2011/077619, também são incluídos na presente invenção. Alternativamente, com o objetivo de aumentar a retenção de plasma, as alterações de aminoácido que diminuem o pI da região constante (WO 2012/016227) podem ser combinadas em um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc da presente invenção. De outro modo, com o objetivo de conferir a capacidade de ligação a outros an- tígenos, as alterações de aminoácido em CH3 descritas em EP1752471 e EP1772465 podem ser combinadas em um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc da presente invenção.
[000104] Quando um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc da presente invenção compreende um domínio de ligação de antígeno tal como em um anticorpo, a alteração de aminoácido para carregar sua atividade de ligação de antígeno de acordo com a condição de concentração de íon pode ser combinada para melhorar o efeito do polipeptídeo para eliminar os antígenos do plasma.
[000105] No presente documento, um "domínio de ligação de antíge- no" pode ser de qualquer estrutura desde que o mesmos se ligue a um antígeno de interesse. Tais domínios incluem preferencialmente, por exemplo: cadeia pesada de anticorpo e regiões variáveis de cadeia leve; uma molécula de cerca de 35 aminoácidos denominada domínio A que está contida na proteína Avimer de membrana de célula in vivo (WO 2004/044011, WO 2005/040229);
[000106] Adnectina que contém o domínio 10Fn3 que se liga à porção química de proteína de fibronectina, uma glicoproteína expressa na membrana de célula (WO 2002/032925);
[000107] Affibody que é composto por um agrupamento de 58 ami- noácidos com três hélices com base no arcabouço do domínio de ligação de IgG de proteína A (WO 1995/001937);
[000108] As proteínas de repetição de anquirina projetadas (DARPins) que são uma região exposta na superfície molecular de repetições de anquirina (AR) que têm uma estrutura em que uma subu- nidade que consiste em, por sua vez, compreender resíduos de 33 aminoácidos, duas hélices antiparalelas e um laço é repetidamente empilhado (WO 2002/020565);
[000109] Anticalinas e similares, que são domínios que consistem em quatro laços que sustentam um lado de uma estrutura de cilindro composta por oito filamentos antiparalelos circularmente dispostos que são altamente conservados dentre as moléculas de lipocalina tal como lipocalina associada a gelatinase neutrofílica (NGAL) (WO 2003/029462); e a região côncava formada pela estrutura de lâmina paralela dentro da estrutura em formato de ferradura constituída por repetições empilhadas da molécula de repetição rica em leucina (LRR) do receptor de limfócito variável (VLR) que não tem a estrutura de imunoglobu- lina e é usado no sistema de imunidade adquirida no vertebrado sem mandíbulas tais como lampreia e peixe-bruxa (WO 2008/016854). Os domínios de ligação de antígeno preferenciais da presente invenção incluem, por exemplo, aqueles que têm cadeia pesada de anticorpo e regiões variáveis de cadeia leve. Os exemplos preferencias dos domínios de ligação de antígeno incluem "Fv de cadeia única (scFv)", "anticorpo de cadeia única", "Fv", "Fv de cadeia única 2 (scFv2)", "Fab" e "F(ab’)2".
[000110] A "concentração iônica" conforme usado no presente documento inclui, por exemplo, a concentração iônica de metal. Os "íons metálicos" se referem a íons dos elementos do grupo I exceto o hidrogênio tais como metais alcalinos e elementos do grupo de cobre, os elementos do grupo II tais como metais alcalinos terrosos e elementos do grupo do zinco, os elementos do grupo III exceto boro, os elementos do grupo IV exceto carbono e silício, elementos do grupo VIII tais como grupo do ferro e elementos do grupo da platina, elementos que pertencem ao subgrupo A dos grupos V, VI e VII e elementos metálicos tais como antimônio, bismuto e polônio. Os átomos de metal têm a propriedade de liberação dos elétrons de valência para tornar cátions. Isso é chamado de tendência à ionização. Considera-se que os metais com forte tendência à ionização sejam quimicamente ativos.
[000111] Na presente invenção, os íons metálicos preferenciais incluem, por exemplo, íon de cálcio. O íon de cálcio é envolvido na modulação de muitos fenômenos biológicos, que incluem concentração de músculos tais como músculos esqueléticos, músculos lisos e músculos cardíacos; ativação de movimento, fagositose e similares de leucócitos; ativação de alteração de formato, secreção e similares de plaquetas; ativação de linfócitos; ativação de mastócitos que inclui a secreção de histamina; respostas celulares mediadas por receptor de catecolamina ou receptor de acetilcolina; exocitose; liberação de substâncias transmissoras de terminais de neurônio; e fluxo axoplásmico em neurônios. Os receptores de íon de cálcio intracelular conhecidos incluem cadeia leve de troponina C, calmodulina, parvalbumina e mio- sina, que têm diversos sítios de ligação de íon de cálcio e acredita-se ser derivados de uma origem comum em termos de evolução molucu- lar. Também há diversos motivos de ligação de cálcio conhecidos. Tais motivos bem conhecidos incluem, por exemplo, domínios de caderina, mão EF de calmodulina, domínio de C2 de proteína quinase C, domínio Gla de fator IX de proteína de coagulação sanguínea, lectinas de tipo C de receptor de aciaroglicoproteína e receptor de ligação de ma- nose, domínios A de receptores de LDL, anexina, domínio 3 do tipo trombospondina e domínios similar a EGF.
[000112] Na presente invenção, quando o íon metálico é o íon de cálcio, as condições da concentração iônica de cálcio incluem as baixas condições de concentração de íon de cálcio e altas condições de concentração de íon de cálcio. "A atividade de ligação varia dependendo das condições de concentração de íon de cálcio" significa que a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antí- geno varia devido à diferença nas condições entre baixa e alta concentrações iônicas de cálcio. Por exemplo, a atividade de ligação de antí- geno de uma molécula de ligação de antígeno pode ser maior sob uma condição de alta concentração de íon de cálcio que sob uma condição de baixa concentração de íon de cálcio. Alternativamente, a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno pode ser maios que sob uma condição de baixa concentração de íon de cálcio que sob uma condição de alta concentração de íon de cálcio.
[000113] No presente documento, a alta concentração iônica de cálcio não á particularmente limitada a um valor específico; no entanto, a concentração pode ser preferencialmente selecionada entre 100 μM e 10 mM. Em uma outra modalidade, a concentração pode ser selecionada entre 200 μM e 5 mM. Em uma modalidade alternativa, a concentração pode ser selecionada entre 400 μM e 3 mM. Em ainda uma outra modalidade, a concentração pode ser selecionada entre 200 μM e 2 mM. Além disso, a concentração pode ser selecionada entre 400 μM e 1 mM. Em particular, uma concentração selecionada entre 500 μM e 2,5 mM, que está próxima à concentração de plasma (sanguínea) de íon de cálcio in vivo, é preferencial.
[000114] No presente documento, a baixa concentração iônica de cálcio não é particularmente limitada a um valor específico; no entanto, a concentração pode preferencialmente ser selecionada entre 0,1 μM e 30 μM. Em uma outra modalidade, a concentração pode ser selecionada entre 0,2 μM e 20 μM. Em ainda uma outra modalidade, a concentração pode ser selecionada entre 0,5 μM e 10 μM. Em uma modalidade alternativa, a concentração pode ser selecionada entre 1 μM e 5 μM. Além disso, a concentração pode ser selecionada entre 2 μM e 4 μM. Em particular, uma concentração selecionada entre 1 μM e 5 μM, que está próxima à concentração do cálcio ionizado em endossomos precoces in vivo, é preferencial.
[000115] Na presente invenção, "a atividade de ligação de antígeno é menor em uma condição de baixa concentração de íon de cálcio que em uma condição de alta concentração de íon de cálcio" significa que a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de an- tígeno é mais fraca em uma concentração iônica de cálcio selecionada entre 0,1 μM e 30 μM que em uma concentração iônica de cálcio selecionada entre 100 μM e 10 mM. Preferencialmente, significa que a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antíge- no é mais fraca em uma concentração iônica de cálcio selecionada entre 0,5 μM e 10 μM que em uma concentração iônica de cálcio selecionada entre 200 μM e 5 mM. Particularmente, significa, de preferência, que a atividade de ligação de antígeno na concentração iônica de cálcio no endossomo precoce in vivo é mais fraca que aquela na con-centração iônica de cálcio de plasma in vivo; e, especificamente, significa que a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno é mais fraca em uma concentração iônica de cálcio selecionada entre 1 μM e 5 μM que em uma concentração iônica de cálcio selecionada entre 500 μM e 2,5 mM.
[000116] Se a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno for alterada com a condição em que as concentrações iônicas de metal podem ser determinadas, por exemplo, pelo uso de métodos de medição conhecidos tais como aquelas descritas na seção de "atividade de ligação" acima. Por exemplo, a fim de confirmar que a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno se torne maior sob uma condição de alta concentração de íon de cálcio que sob uma condição de baixa concentração de íon de cálcio, a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antí- geno sob condições de baixa e alta concentrações de íon de cálcio é comparada.
[000117] Na presente invenção, a expressão "a atividade de ligação de antígeno é menor em uma condição de baixa concentração de íon de cálcio que em uma condição de alta concentração de íon de cálcio" também pode ser expressada como "a atividade de ligação de antíge- no de uma molécula de ligação de antígeno é maior sob uma condição de alta concentração de íon de cálcio que sob uma condição de baixa concentração de íon de cálcio". Na presente invenção, "a atividade de ligação de antígeno é menor em uma condição de baixa concentração de íon de cálcio que em uma condição de alta concentração de íon de cálcio" é muitas vezes escrita como "a capacidade de ligação de antí- geno é mais fraca sob uma condição de baixa concentração de íon de cálcio que sob uma condição de alta concentração de íon de cálcio". Também, "a atividade de ligação de antígeno em uma condição de baixa concentração de íon de cálcio é reduzida para ser menor que em uma condição de alta concentração de íon de cálcio" pode ser escrita como "a capacidade de ligação de antígeno sob uma condição de baixa concentração de íon de cálcio é feita mais fraca que aquela sob uma condição de alta concentração de íon de cálcio".
[000118] Ao determinar a atividade de ligação de antígeno, as condições além da concentração iônica de cálcio podem ser selecionadas de maneira apropriada pelo indivíduo versado na técnica e não são particularmente limitadas. Por exemplo, a atividade pode ser determinada a 37 °C no tampão HEPES. Por exemplo, Biacore (GE Healthcare) ou similares pode ser usada para a determinação. Quando o antí- geno é um antígeno solúvel, a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno pode ser avaliada através do fluxo do antígeno como um analito sobre um chip no qual a molécula de ligação de antígeno é imobilizada. Quando o antígeno é um antíge- no de membrana, a atividade de ligação de uma molécula de ligação de antígeno para o antígeno de membrana pode ser avaliada através do fluxo da molécula de ligação de antígeno como um analito sobre um chip no qual o antígeno é imobilizado.
[000119] Desde que a atividade de ligação de antígeno de uma mo- lécula de ligação de antígeno da presente invenção em uma condição de baixa concentração de íon de cálcio seja mais fraca que aquela em uma condição de alta concentração de íon de cálcio, a razão da atividade de ligação de antígeno entre aquela sob uma condição de baixa concentração de íon de cálcio e sob uma condição de alta concentração de íon de cálcio não é particularmente limitada; e o valor de KD (Ca 3μM) / KD (Ca 2 mM), que é a razão entre a constante de dissoci-ação (KD) para um antígeno em uma condição de baixa concentração de íon de cálcio e a KD em uma condição de alta concentração de íon de cálcio, é preferencialmente 2 ou mais; mais preferencialmente, o valor de KD (Ca 3μM) / KD (Ca 2 mM) é 10 ou mais; e ainda, mais preferencialmente, o valor de KD (Ca 3μM) / KD (Ca 2 mM) é 40 ou mais. O limite superior do valor de KD (Ca 3μM) / KD (Ca 2 mM) não é particularmente limitado e pode ser qualquer valor tal como 400, 1.000 ou 10.000, desde que a molécula possa ser produzida pelas técnicas de um indivíduo versado na técnica.
[000120] Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a KD (constante de dissociação) pode ser usada para representar a atividade de ligação de antígeno. Entretanto, quando o antígeno é um antígeno de membrana, a KD evidente (constante de dissociação evidente) pode ser usada para representar a atividade. A KD (constante de dissociação) e a KD evidente (constante de dissociação evidente) podem ser determinadas pelos métodos conhecidos por um indivíduo versado na técnica, por exemplo, com uso de Biacore (GE healthcare), plotagem de Scatchard ou citometria de fluxo.
[000121] Alternativamente, por exemplo, a constante de taxa de dissociação (kd) também pode ser preferencialmente usada como um índice para representar a razão da atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno da presente invenção entre as condições de baixa e alta concentrações de cálcio. Quando a constan- te de taxa de dissociação (kd) for usada em vez da constante de dissociação (KD) como um índice para representar a razão de atividade de ligação, a razão da constante de taxa de dissociação (kd) entre as condições de baixa e alta concentrações de cálcio, isto é, o valor de kd (condição de baixa concentração de cálcio)/kd (condição de alta concentração de cálcio) é, preferencialmente, 2 ou mais, mais preferencialmente, 5 ou mais, ainda mais preferencialmente, 10 ou mais e ainda mais preferencialmente, 30 ou mais. O limite superior do valor de Kd (condição de baixa concentração de cálcio)/kd (condição de alta con-centração de cálcio) não é particularmente limitada e pode ser qualquer valor tal como 50, 100 ou 200 desde que a molécula possa ser produzida pelas técnicas conhecidas por um indivíduo versado na técnica.
[000122] Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a kd (constante de taxa de dissociação) pode ser usada para representar a atividade de ligação de antígeno. Entretanto, quando o antígeno é um antígeno de membrana, a KD evidente (constante de taxa de dissociação evidente) pode ser usada para representar a atividade de ligação de antí- geno. A kd (constante de taxa de dissociação) e a KD evidente (constante de taxa de dissociação evidente) pode ser determinada pelos métodos conhecidos por um indivíduo versado na técnica, por exemplo, com uso de Biacore (GE healthcare) ou citometria de fluxo. Na presente invenção, quando a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno for determinada em diferentes con-centrações iônicas de cálcio, é preferencial usar as mesmas condições exceto para as concentrações de cálcio.
[000123] Por exemplo, um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno é menor em uma condição de baixa concentração de íon de cálcio que em uma condição de alta concentração de íon de cálcio, que é uma modalidade da presente invenção, pode ser obtido através de triagem dos domínios de ligação de antígeno ou anticorpos que incluem as etapas de (a) a (c) abaixo: (a) determinar a atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno em uma condição de baixa concentração de cálcio; (b) determinar a atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno em uma condição de alta concentração de cálcio; e (c) selecionar um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno é menor em uma condição de baixa concentração de cálcio que em uma condição de alta concentração de cálcio.
[000124] Ademais, um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno é menor em uma condição de baixa concentração de íon de cálcio que em uma condição de alta concentração de íon de cálcio, que é uma modalidade da presente invenção, pode ser obtido através da triagem de domínios de ligação de antígeno ou moléculas de ligação de antígeno, ou uma biblioteca do(a) mesmo(a), incluindo as etapas de (a) a (c) abaixo: (a) contatar um antígeno com um domínio de ligação de an- tígeno ou molécula de ligação de antígeno, ou uma biblioteca do(a) mesmo(a) em uma condição de alta concentração de cálcio; (b) incubar sob uma condição de baixa concentração de cálcio um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno que tem se ligado ao antígeno na etapa (a); e (c) isolar um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno dissociado(a) na etapa (b).
[000125] Além disso, um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno é me- nor em uma condição de baixa concentração de íon de cálcio que em uma condição de alta concentração de íon de cálcio, que é uma modalidade da presente invenção, pode ser obtido através da triagem de domínios de ligação de antígeno ou moléculas de ligação de antígeno, ou uma biblioteca do(a) mesmo(a), incluindo as etapas de (a) a (d) abaixo: (a) contatar um antígeno com uma biblioteca de domínios de ligação de antígeno ou moléculas de ligação de antígeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio; (b) selecionar um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno que não se liga ao antígeno na etapa (a); (c) permitir que o domínio de ligação de antígeno ou a molécula de ligação de antígeno selecionado(a) na etapa (b) se ligue ao antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio; e (d) isolar um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno que tem se ligado ao antígeno na etapa (c).
[000126] Além disso, um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno é menor em uma condição de baixa concentração de íon de cálcio que em uma condição de alta concentração de íon de cálcio, que é uma modalidade da presente invenção, pode ser obtido(a) através de um método de triagem que compreende as etapas de (a) a (c) abaixo: (a) contatar, sob uma condição de alta concentração de cálcio, uma biblioteca de domínios de ligação de antígeno ou moléculas de ligação de antígeno com uma coluna sobre a qual um antígeno é imobilizado; (b) eluir um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno que tem se ligado à coluna na etapa (a) a partir da coluna sob uma condição de baixa concentração de cálcio; e (c) isolar o domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno eluído(a) na etapa (b).
[000127] Além disso, um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno é menor em uma condição de baixa concentração de íon de cálcio que em uma condição de alta concentração de íon de cálcio, que é uma modalidade da presente invenção, pode ser obtido(a) através de um método de triagem que compreende as etapas de (a) a (d) abaixo: (a) permitir que, sob uma condição de baixa concentração de cálcio, uma biblioteca de domínios de ligação de antígeno ou moléculas de ligação de antígeno passe através de uma coluna sobre a qual um antígeno é imobilizado; (b) coletar um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno que foi eluído(a) sem se ligar à coluna na etapa (a); (c) permitir que o domínio de ligação de antígeno ou a molécula de ligação de antígeno coletado(a) na etapa (b) se ligue ao antí- geno sob uma condição de alta concentração de cálcio; e (d) isolar um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno que tem se ligado ao antígeno na etapa (c).
[000128] Além disso, um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno é menor em uma condição de baixa concentração de íon de cálcio que em uma condição de alta concentração de íon de cálcio, que é uma modalidade da presente invenção, pode ser obtido(a) através de um método de triagem que compreende as etapas de (a) a (d) abaixo: (a) contatar um antígeno com uma biblioteca de domínios de ligação de antígeno ou moléculas de ligação de antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio; (b) obter um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno que tem se ligado ao antígeno na etapa (a). (c) incubar, sob uma condição de baixa concentração de cálcio, o domínio de ligação de antígeno ou a molécula de ligação de antígeno obtido(a) na etapa (b); e (d) isolar um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno na etapa (c) é mais fraca que o critério para a seleção da etapa (b).
[000129] As etapas descritas acima podem ser repetidas duas ou mais vezes. Desse modo, a presente invenção fornece os domínios de ligação de antígeno ou as moléculas de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno é menor em uma condição de baixa concentração de íon de cálcio que em uma condição de alta concentração de íon de cálcio, nos(as) qual são obtidos(a) através do métodos de triagem que compreende adicionalmente a etapa de repetir duas ou mais vezes as etapas (a) a (c) ou (a) a (d) nos métodos de triagem descritos acima. O número de ciclos de etapas (a) a (c) ou (a) a (d) não é particularmente limitado, mas geralmente é 10 ou menos.
[000130] Nos métodos de triagem mencionados acima, a atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno sob uma condição de baixa concentração de cálcio não é particularmente limitada desde que seja a atividade de ligação de antígeno em uma concentração de cálcio ionizado de entre 0,1 μM a 30 μM, mas, preferencialmente, seja a atividade de ligação de antígeno em uma concentração de cálcio ionizado de entre 0,5 μM e 10 μM. Mais preferencialmente, é a atividade de ligação de antígeno na concentração de cálcio ionizado no endossomo precoce in vivo, especificamente, entre 1 μM e 5 μM. Entretanto, a atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio não é particularmente limitada, desde que seja a atividade de ligação de antígeno em uma concentração de cálcio ionizado de entre 100 μM e 10 mM, mas, preferencialmente, seja a atividade de ligação de antígeno em uma concentração de cálcio ionizado de entre 200 μM e 5 mM. Mais preferencialmente, é a atividade de ligação de antígeno na concentração de cálcio ionizado no plasma in vivo, especificamente, entre 0,5 mM e 2,5 mM.
[000131] O método descrito em WO 2012/073992 (por exemplo, parágrafos 0200 a 0213) e similar pode ser exemplificado como um método de triagem para uma molécula de ligação de antígeno ou um domínio de ligação de antígeno que tem menor atividade de ligação de antígeno sob as condições de baixa concentração de íon de cálcio que sob as condições de alta concentração de íon de cálcio, que é uma modalidade fornecida pela presente invenção.
[000132] A atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno pode ser medida pelos métodos conhecidos por um indivíduo versado na técnica. As condições além da concentração de cálcio ionizado podem ser determinadas pelo indivíduo versado na técnica. A atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno pode ser avaliada como uma constante de dissociação (KD), constante de dissociação evidente (KD evidente), constante de taxa de dissociação (kd), constante de dissociação evidente (KD evidente) e similares. Essas podem ser determinadas pelos métodos conhecidos por um indivíduo versado na técnica, por exemplo, com uso de Biacore (GE healthcare), plotagem de Scatchard ou FACS.
[000133] Na presente invenção, a etapa de seleção de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno é maior sob uma condição de alta concentração de cálcio que sob uma condição de baixa concentração de cálcio que é sinônimo da etapa de seleção de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de liga- ção de antígeno é menor sob uma condição de baixa concentração de cálcio que sob uma condição de alta concentração de cálcio.
[000134] Desde que a atividade de ligação de antígeno seja maior sob uma condição de alta concentração de cálcio que sob uma condição de baixa concentração de cálcio, a diferença na atividade de ligação de antígeno entre as condições de alta e baixa concentrações de cálcio não é particularmente limitada; no entanto, a atividade de ligação de antígeno sob uma condição de alta concentração de cálcio é, preferencialmente, duas ou mais, mais preferencialmente, 10 vezes ou mais e, ainda mais preferencialmente, 40 vezes ou mais que aquela sob uma condição de baixa concentração de cálcio.
[000135] Os domínios de ligação de antígeno ou moléculas de ligação de antígeno da presente invenção a ser exibidos(as) pelos métodos de triagem descritos acima podem ser quaisquer domínios de ligação de antígeno e moléculas de ligação de antígeno. Por exemplo, é possível exibir os domínios de ligação de antígeno ou moléculas de ligação de antígeno descritos(as) acima. Por exemplo, os domínios de ligação de antígeno ou as moléculas de ligação de antígeno que têm sequências naturais ou sequências de aminoácido substituídas podem ser exibidos.
[000136] Por exemplo, em uma modalidade fornecida pela presente invenção, o método descrito no documento WO 2012/073992 (por exemplo, parágrafos 0200 a 0213) e similares pode ser exemplificado como um método de triagem para uma molécula de ligação de antíge- no ou um domínio de ligação de antígeno quq tem menor atividade de ligação de antígeno sob uma condição de baixa concentração de íon de cálcio que sob uma condição de alta concentração de íon de cálcio.
[000137] Os domínios de ligação de antígeno ou as moléculas de ligação de antígeno da presente invenção nos(as) quais as atividades de ligação de antígeno alteram de acordo com a condição de concen- tração de íon de cálcio, que são exibidas pelos métodos de triagem descritos acima, podem ser preparados(as) qualquer maneira. Por exemplo, quando a concentração iônica de metal se refere à concentração iônica de cálcio, é possível usar os domínios de ligação de antí- geno ou as moléculas de ligação de antígeno pré-existentes, as bibliotecas pré-existentes (biblioteca de fago, etc.), anticorpos ou bibliotecas preparados(as) a partir de hibridomas obtidas através da imunização de animais ou de células B de animais imunizados, os anticorpos ou bibliotecas obtidos(as) introduzindo-se os aminoácidos com capacidade para quelar o cálcio (por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmi- co) ou introduzindo-se as mutações de aminoácido não natural nos anticorpos ou bibliotecas descritos(as) acima (bibliotecas produzidas através do aumento do teor de aminoácidos com capacidade para quelar o cálcio (tais como ácido aspártico e ácido glutâmico) ou ami- noácidos não naturais, as bibliotecas preparadas introduzindo-se os aminoácidos com capacidade para quelar o cálcio (tais como ácido aspártico e ácido glutâmico) ou as mutações de aminoácido não natural em posições particulares ou similares).
[000138] Os exemplos dos aminoácidos que alteram a atividade de ligação de antígeno das moléculas de ligação de antígeno de acordo com a condição de concentração de íon conforme descrito acima podem ser quaisquer tipos de aminoácidos desde que os aminoácidos formem um motivo de ligação de cálcio. Os motivos de ligação de cálcio são bem conhecidos por um indivíduo versado na técnica e foram descritos em detalhes (por exemplo, Springer et al. (Cell (2000) 102, 275-277); Kawasaki and Kretsinger (Protein Prof. (1995) 2, 305 a 490); Moncrief et al. J. Mol. Evol. (1990) 30, 522 a 562); Chauvaux et al. Bi- ochem. J. (1990) 265, 261 a 265); Bairoch and Cox (FEBS Lett. (1990) 269, 454 a 456); Davis (New Biol. (1990) 2, 410 a 419); Schaefer et al. (Genomics (1995) 25, 638 a 643); Economou et al. (EMBO J. (1990) 9, 349 a 354); Wurzburg et al. (Structure: 14 de julho de 2006, 1049 a 1058. Especificamente, quaisquer motivos de ligação de cálcio conhecidos, que incluem lectinas do tipo C tais como ASGPR, CD23, MBR e DC-SIGN, podem ser incluídos em moléculas de ligação de antígeno da presente invenção. Os exemplos preferencias de tais motivos de ligação de cálcio preferenciais também incluem, além de daqueles descritos acima, por exemplo, o motivo de ligação de cálcio no domínio de ligação de antígeno de SEQ ID NO: 45.
[000139] Além disso, como os aminoácidos que alteram a atividade de ligação de antígeno de domínios de ligação de antígeno incluídos nas moléculas de ligação de antígeno da presente invenção dependendo condições de concentração de íon de cálcio, por exemplo, os aminoácidos que têm a atividade de quelação de metal também podem ser preferencialmente usados. Os exemplos de tais aminoácidos de quelação de metal incluem, por exemplo, serina (Ser (S)), treonina (Thr (T)), asparagina (Asn (N)), glutamina (Gln (Q)), ácido aspártico (Asp (D)) e ácido glutâmico (Glu (E)).
[000140] As posições nos domínios de ligação de antígeno nos quais os aminoácidos descritos acima estão contidos não são particularmente limitadas às posições particulares e podem ser quaisquer posições dentro da região variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia leve que formam um domínio de ligação de antígeno, desde que as mesmas alterem a atividade de ligação de antígeno de moléculas de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon de cálcio. Em uma modalidade não limitante, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca principalmente composta por moléculas de ligação de antígeno nas quais as sequências são diferentes entre si e nas quais os domínios de ligação de antígeno de cadeia pesada contêm os aminoácidos que alteram a atividade de ligação de antígeno das molé- culas de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon de cálcio. Em uma outra modalidade não limitante, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção pode ser obtidos a partir da biblioteca principalmente composta por moléculas de ligação de antígeno nas quais as sequências são diferentes entre si e nas quais os domínios de CDR3 de cadeia pesada contêm os aminoá- cidos mencionados acima. Em ainda uma outra modalidade, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca principalmente composta por moléculas de ligação de antígeno nas quais as sequências são diferentes umas das outras e nas quais os domínios de CDR3 de cadeia pesada contêm os aminoácidos mencionados acima nas posições 95, 96, 100a e/ou 101 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração de Kabat.
[000141] Entretanto, em uma modalidade não limitante da presente invenção, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtido a partir de uma biblioteca principalmente composta por moléculas de ligação de antígeno nas quais as sequências são diferentes umas das outras e nas quais os domínios de ligação de an- tígeno de caia leve contêm os aminoácidos que alteram a atividade de ligação de antígeno de moléculas de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon de cálcio. Em uma outra modalidade não limitante, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca principalmente composta por moléculas de ligação de antígeno nas quais as sequências são diferentes umas das outras e nas quais os domínios de CDR1 de cadeia leve contêm os aminoácidos mencionados acima. Em ainda uma outra modalidade, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca principalmente composta por moléculas de ligação de antígeno nas quais as sequências são diferentes umas das outras e nas quais os domínios de CDR1 de cadeia leve contêm os aminoácidos mencionados acima nas posições 30, 31 e/ou 32 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração de Kabat.
[000142] Em uma outra modalidade não limitante, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca principalmente composta por moléculas de ligação de antígeno nas quais as sequências são diferentes umas das outras e nais quais os domínios de CDR2 de cadeia leve contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima. Em ainda uma outra modalidade não limitante, a presente invenção fornece as bibliotecas principalmente compostas por moléculas de ligação de antígeno nas quais as sequências são diferentes entre si e nas quais os domínios de CDR2 de cadeia leve contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima na posição 50 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração de Kabat.
[000143] Em ainda uma outra modalidade da presente invenção, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca principalmente composta por moléculas de ligação de antígeno nas quais as sequências são diferentes entre si e nas quais os domínios de CDR3 de cadeia leve contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima. Em uma modalidade alternativa, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca principalmente composta por moléculas de ligação de antígeno nas quais as sequências são diferentes entre si e nas quais os domínios de CDR3 de cadeia leve contêm os resíduos de aminoácido mencionados acima na posição 92 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração de Kabat.
[000144] Além disso, em uma modalidade diferente da presente invenção, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca principalmente composta por moléculas de ligação de antígeno nas quais as sequências são diferentes entre si e nas quais duas ou três CDRs selecionadas a partir das CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeia leve descritas acima contêm os resíduos de aminoácidos anteriormente mencionados. Ademais, os domínios de ligação de antígeno da presente invenção podem ser obtidos a partir de uma biblioteca principalmente composta por moléculas de ligação de antígeno nas quais as sequências são diferentes entre si e nas quais as cadeias leves contêm os resíduos de aminoácidos anteriormente mencionados em qualquer uma ou mais dentre as posições 30, 31, 32, 50 e/ou 92 conforme indicado de acordo com o sistema de numeração de Kabat.
[000145] Em uma modalidade particularmente preferencial, as sequências de estrutura da região variável de cadeia pesada e/ou cadeia leve de uma molécula de ligação de antígeno contêm preferencialmente sequências de estrutura de linhagem germinativa de humano. Desse modo, em uma modalidade da presente invenção, quando as sequências de estrutura são sequências completamente humanas, espera-se que quando tal molécula de ligação de antígeno da presente invenção for administrada aos seres-humanos (por exemplo, para tratar doenças), a mesma induz pouca ou nenhuma resposta imunogênica. Na captação acima, a frase "que contém uma sequência de linhagem germinativa" na presente invenção significa que uma parte das sequências de estrutura na presente invenção é idêntica a uma parte de quaisquer sequências de estrutura de linhagem germinativa de humano. Por exemplo, quando a sequência de FR2 de cadeia pesada de uma molécula de ligação de antígeno na presente invenção for uma combinação de sequências de FR2 de cadeia pesada de diferentes sequências de estrutura de linhagem germinativa de humano, tal molécula também é uma molécula de ligação de antígeno na presente invenção "que contém uma sequência de linhagem germinativa".
[000146] Os exemplos preferencias das estruturas incluem, por exemplo, sequências de região estrutural completamente humana atualmente conhecida, que estão incluídas no sítio da web de V-Base (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) ou outros. Aquelas sequências de região estrutural podem ser usadas de maneira apropriada como uma sequência de linhagem germinativa contida em uma molécula de ligação de antígeno da presente invenção. As sequências de linhagem germinativa podem ser categorizadas de acordo com sua similaridade (Tomlinson et al. J. Mol. Biol. (1992) 227, 776 a 798); Williams and Winter (Eur. J. Immunol. (1993) 23, 1456 a 1461); Cox et al. (Nat. Genetics (1994) 7, 162 a 168)). As sequências de linhagem germinativa adequadas podem ser selecionadas a partir de V que é agrupado em sete subgrupos; VÀ, que é agrupado em dez subgrupos; e VH, que é agrupado em sete subgrupos.
[000147] As sequências de VH completamente humanas incluem, de preferência, mas não são limitadas a, por exemplo, sequências de VH de: subgrupo VH1 (por exemplo, VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1- 18, VH1-24, VH1-45, VH1-46, VH1-58 e VH1-69); subgrupo VH2 (por exemplo, VH2-5, VH2-26 e VH2-70); subgrupo VH3 (VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-16, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-35, VH3-38, VH3-43, VH3-48, VH3-49, VH3-53, VH3-64, VH3-66, VH3-72, VH3-73 e VH3-74); subgrupo VH4 (VH4-4, VH4-28, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59 e VH4-61); subgrupo VH5 (VH5-51); subgrupo VH6 (VH6-1); e subgrupo VH7 (VH7-4 e VH7-81).
[000148] Esses também são descritos em documentos conhecidos (Matsuda et al. (J. Exp. Med. (1998) 188, 1973 a 1975)) e similares e, desse modo, as pessoas versadas na técnica podem projetar de maneira apropriada moléculas de ligação de antígeno da presente invenção com base nas informações dessas sequências. Também é preferencial usar outras subregiões de estrutura ou estruturas completamente humanas.
[000149] As sequências de V completamente humanas incluem pre-ferencialmente, mas não são limitadas a, por exemplo: A20, A30, L1, L4, L5, L8, L9, L11, L12, L14, L15, L18, L19, L22, L23, L24, O2, O4, O8, O12, O14 e O18 agrupadas no subgrupo Vk1; A1, A2, A3, A5, A7, A17, A18, A19, A23, O1 e O11, agrupadas no subgrupo Vk2; A11, A27, L2, L6, L10, L16, L20 e L25, agrupadas no subgrupo Vk3; B3, agrupada no subgrupo Vk4; B2 (também referenciada no presente documento como Vk5-2), agrupada no subgrupo Vk5; e A10, A14 e A26, agrupadas no subgrupo Vk6 (Kawasaki et al. Eur. J. Immunol. (2001) 31, 1017 a 1028); Schable and Zachau (Biol. Chem. Hoppe Seyler (1993) 374, 1001 a 1022); Brensing-Kuppers et al. (Gene (1997) 191, 173 a 181)).
[000150] As sequências de V completamente humanas incluem pre-ferencialmente, mas não são limitadas a, por exemplo: V 1-2, V1-3, V1-4, V1-5, V1-7, V1-9, V1-11, V1-13, V1-16, V1-17, V1-18, V1-19, V1-20 e V1-22, agrupadas no subgrupo VL1; V 2-1, V2-6, V2-7, V2-8, V2-11, V2-13, V2-14, V2-15, V2-17 e V2-19, agrupadas no subgrupo VL1; V 3-2, V3-3 e V3-4, agrupadas no subgrupo VL3; V 4-1, V4-2, V4-3, V4-4 e V4-6, agrupadas no subgrupo VL4; e V5-1, V5-2, V5-4 e V5-6, agrupadas no subgrupo VL5 (Kawasaki et al. (Genome Res. 1997, 7, 250 a 261).
[000151] Normalmente, essas sequências de estrutura são diferentes entre si em um ou mais resíduos de aminoácido. Essas sequências de estrutura podem ser usadas em combinação com "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon" na presente invenção. Outros exemplos das estruturas completamente humanas usadas em combinação com "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon" na presente invenção include, mas não limitadas a, por exemplo, KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY e POM (por exemplo, Kabat et al. (1991) supra; Wu et al. (J. Exp. Med. 1970, 132, 211 a 250).
[000152] Sem ater se a uma teoria particular, acredita-se que uma razão para a expectativa de que o uso de sequências de linhagem germinativa exclui as respostas imunológicas adversas na maioria dos indivíduos seja conforme a seguir. Como um resultado do processo de maturação de afinidade durante as respostas imunológicas normais, a mutação somática ocorre frequentemente nas regiões variáveis da imunoglobulina. Tais mutações ocorrem principalmente em torno das CDRs nas quais as sequências são hipervariáveis, mas também afetam os resíduos das regiões de estrutura. Tais mutações de estrutura não existem nos genes de linhagem germinativa e também as mesmas são menos prováveis para ser imunogénicas nos pacientes. Por outro lado, a população humana normal é exposta a maioria das sequências de estrutura expressas a partir dos genes de linhagem germinativa. Como um resultado da imunotolerância, espera-se que essas estrutu- ras de linhagem germinativa tenham baixa ou nenhuma imunogenici- dade nos pacientes. Para maximizar a possibilidade de imunotolerân- cia, os genes de codificação de região variável podem ser selecionados a partir de um grupo de genes de linhagem germinativa funcionais de ocorrência comum.
[000153] Os métodos conhecidos tais como mutagênese sítio-dirigida (Kunkel et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82, 488 a 492)) e a PCR de extensão sobreposta pode ser empregada de maneira apropriada para produzir as moléculas de ligação de antígeno da presente invenção nas quais as sequências de região variável descrita acima, sequências de região variável de cadeia leve ou pesada, sequências de CDR ou sequências de estrutura contêm aminoácidos que alteram a atividade de ligação de antígeno das moléculas de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon de cálcio.
[000154] Por exemplo, uma biblioteca que contém uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno da presente invenção nas quais as sequências são diferentes entre si pode ser construída através da combinação de regiões variáveis de cadeia pesada preparadas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatória com uma região variável de cadeia leve selecionada como uma sequência de estrutura que contém originalmente pelo menos um resíduo de aminoá- cido que altera a atividade de ligação de antígeno da molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon de cálcio. Como um exemplo não limitante, quando a concentração iônica for a concentração iônica de cálcio, tais bibliotecas preferenciais incluem, por exemplo, aquelas construídas através da combinação da sequência da região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 45 (Vk5-2) e a região variável de cadeia pesada produzida como uma biblioteca de sequência de região variável aleatória.
[000155] Alternativamente, uma sequência de região variável de ca- deia leve selecionada como uma região de estrutura que contém originalmente pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno ou uma molécula de ligação de antígeno de acordo com a condição de concentração de íon de cálcio conforme mencionado acima pode ser projetada para conter vários resíduos de aminoácido além dos resíduos de aminoácido acima. Na presente invenção, tais resíduos são deno-minados como resíduos flexíveis. O número e a posição dos resíduos flexíveis não são limitados às modalidades particulares desde que a atividade de ligação de antígeno do domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno da presente invenção varie dependendo da condição de concentração de íon. Especificamente, as sequências de CDR e/ou as sequências de FR da cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Por exemplo, quando a concentração iônica é a concentração iônica de cálcio, os exemplos não limitantes dos resíduos flexíveis a ser introduzidos na sequência de região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 45 (Vk5-2) incluem os resíduos de aminoácido listados nas Tabelas 1 ou 2.
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(posição indicates numeração de Kabat)
[000156] No presente documento, os resíduos flexíveis se referem às variações de resíduo de aminoácido presentes nas posições hipervari- áveis nas quais diversos aminoácidos diferentes estão presentes na cadeia leve e nas regiões variáveis de cadeia pesada quando as sequências de aminoácido dos domínios de ligação de antígeno ou anticorpos nativos e/ou conhecidos são comparadas. As posições hiperva- riáveis estão geralmente localizadas na CDR. Em uma modalidade, os dados fornecidos por Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute of Health Bethesda Md.) (1987 e 1991) é útil para determinas as posições hipervariáveis em anticorpos nativos e/ou conhecidos. Além disso, as diversas bases de dados na Internet (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/, http://www.bioinf.org.uk/abs/índice.html) fornecem as sequências coletadas de muitas cadeias leves e cadeias pesadas humanas e suas localizações. As informações nas sequências e localizações são úteis para determinar as posições hipervariáveis na presente invenção. De acordo com a presente invenção, quando uma certa posição de ami- noácido tem preferencialmente cerca de 2 a cerca de 20 variações de resíduo de aminoácido possíveis, preferencialmente, cerca de 3 a cerca de 19, preferencialmente, cerca de 4 a cerca de 18, preferencialmente, 5 a 17, preferencialmente, 6 a 16, preferencialmente, 7 a 15, preferencialmente, 8 a 14, preferencialmente, 9 a 13 e, preferencialmente, 10 a 12 diferentes variações de resíduo de aminoácido possíveis, a posição é hipervariável. Em algumas modalidades, uma certa posição de aminoácido pode ter, preferencialmente, pelo menos cerca de 2, preferencialmente, pelo menos cerca de 4, preferencialmente, pelo menos cerca de 6, preferencialmente, pelo menos cerca de 8, preferencialmente, cerca de 10 e, preferencialmente, cerca de 12 diferentes variações de resíduo de aminoácido possíveis.
[000157] Alternativamente, uma biblioteca que contém uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno da presente invenção na qual as sequências são diferentes entre si podem ser construídas através da combinação de regiões variáveis de cadeia pesada produzidas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatória com regiões variáveis de cadeia leve nas quais pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno de moléculas de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon conforme mencionado acima é introduzida. Quando a concentração iônica for a concentração iônica de cálcio, os exemplos não limitantes de tais bibliotecas incluem preferencialmente, por exemplo, as bibliotecas nas quais as regiões variáveis de cadeia pesada produzidas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatória são combinadas com as sequências de região variável de cadeia leve nas quais um resíduo(s) particular(es) em uma sequência de linhagem germinativa tais como SEQ ID NO: 46 ou SEQ ID NO: 47 ou SEQ ID NO: 48 e/ou SEQ ID NO: 49 (Vk4) foi substituído por pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon de cálcio. Os exemplos não limitan- tes de tais resíduos de aminoácido incluem os resíduos de aminoácido na CDR1 de cadeia leve. Além disso, os exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido incluem resíduos de aminoácido na CDR2 de cadeia leve. Além disso, outros exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido também incluem resíduos de aminoácido na CDR3 de cadeia leve.
[000158] Os exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido contidos na CDR1 de cadeia leve incluem aqueles nas posições 30, 31 e/ou 32 no CDR1 de região variável de cadeia leve conforme indicado pela numeração de EU. Além disso, os exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido contidos na CDR2 de cadeia leve incluem um resíduo de aminoácido na posição 50 na CDR2 de região variável de cadeia leve conforme indicado pela numeração de Kabat. Ademais, os exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido contidos na CDR3 de cadeia leve incluem um resíduo de aminoácido na posição 92 na CDR3 de região variável de cadeia leve conforme indicado pela numeração de Kabat. Esses resíduos de aminoácido podem estar contidos sozinhos ou em combinação desde que os mesmos formem um motivo de ligação de cálcio e/ou desde que a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno varie dependendo das condições de concentração de íon de cálcio. Entretanto, como a cadeia leve de troponina C, calmodulina, parvalbumina e miosina, que têm diversos sítios de ligação de íon de cálcio e acredita-se que sejam derivadas de uma origem comum em termos de evolução molucular, são conhecidas, a CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de cadeia leve podem ser projetadas para ter seus motivos de ligação. Por exemplo, é possível usar os domínios de caderina, mão EF de calmodulina, domínio de C2 de proteína quinase C, domínio Gla de fator IX de proteína de coagulação sanguínea, lectinas do tipo C de receptor de aciaroglicoproteína e receptor de ligação de manose, domínios A de receptores de LDL, anexina, domínio do tipo trombospondina e domínios similar a EGF de uma maneira adequada para os propósitos acima.
[000159] Quando as regiões variáveis de cadeia pesada produzidas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatória e regiões variáveis de cadeia leve nas quais pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno dependendo da concentração iônicas foi introduzido são combinadas conforme descrito acima, as sequências das regiões variáveis de cadeia leve podem ser projetadas para conter os resíduos flexíveis da mesma maneira conforme descrito acima. O número e a posição de tais resíduos flexíveis não são limitados às modalidades particulares desde que a atividade de ligação de antígeno de moléculas de ligação de antígeno da presente invenção varie dependendo das condições de concentração de íon. Especificamente, as sequências de CDR e/ou sequências de FR de cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Por exemplo, quando a concentração iônica for concentração iônica de cálcio, os exemplos não limitantes dos resíduos flexíveis a serem introduzidos na sequência de região variável de cadeia leve incluem os resíduos de aminoácido listados nas Tabelas 1 e 2.
[000160] As regiões variáveis de cadeia pesada preferenciais a ser combinadas incluem, por exemplo, bibliotecas de região variável aleatória. Os métodos conhecidos são combinados conforme for adequado para produzir uma biblioteca de região variável aleatória. Em uma modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca imune construída a base de genes de anticorpo derivados dos linfócitos de animais imunizados com um antígeno específico, pacientes com infecções, pessoas com um título de anticorpo elevado no sangue como um resultado da vacinação, pacientes com câncer ou pacientes com doenças autoimunes, pode ser preferencialmente usada como uma biblioteca de região variável aleatória.
[000161] Em uma outra modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca sintética produzida substituindo-se as sequências de CDR de genes V nos genes V conformados novamente funcionais ou DNA genômico com um conjunto de oligonucleotídeos sintéticos que contêm sequências que codificam conjuntos de códons de um comprimento apropriado também pode ser preferencialmente usada como uma biblioteca de região variável aleatória. Nesse caso, visto que a diversidade de sequência é observada na sequência de CDR3 de cadeia pesada, também é possível substituir apenas a sequência de CDR3. Um critério de dar origem a diversidade nos aminoácidos na região variável de uma molécula de ligação de antígeno é de que a diversidade é dada aos resíduos de aminoácido nas posições de superfície exposta na molécula de ligação de antígeno. A posição de superfície exposta se refere a uma posição que é considerada como tendo capacidade para ser exposta na superfície e/ou contatada com um antígeno, com base na estrutura, ajuntamento de estruturas e/ou estrutura modeladas de uma molécula de ligação de antígeno. Em geral, tais posições são CDRs. Preferencialmente, as posições de superfície exposta são determinadas com uso de coordenadas de um modelo tridimensional de uma molécula de ligação de antígeno com uso de um programa de computador tal como programa InsightII (Accelrys). As posições de superfície exposta podem ser determinadas com uso de algoritmos conhecidos na técnica (por exemplo, Lee and Richards (J. Mol. Biol. (1971) 55, 379 a 400); Connolly (J. Appl. Crist. 1983, 16, 548 a 558). A determinação de posições de superfície exposta pode ser realizada com uso de software adequado para a modelagem de proteína e informações estruturais tridimensionais obtidas a partir de um anticorpo. O software que pode ser usado para esses propósitos, inclui preferencialmente software de molécula de biopolímero SYBYL (Tripos Associates). Em geral ou de preferência, quando um algoritmo exige um parâmetro de tamanho de entrada de usuário, o "tamanho" de uma sonda que é usada no cálculo é ajustada em cerca de 1,4 Angstrom ou menos de raio. Além disso, os métodos para determinar as regiões de superfície exposta e áreas com uso de software para computadores pessoais são descritas por Pacios (Comput. Chem. (1994) 18 (4), 377 a 386; J. Mol. Model. 1995, 1, 46 a 53)
[000162] Em uma outra modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca simplista, que é construída a partir de genes de anticorpo derivados dos linfócitos de pessoas saudáveis e cujo reper- tório compreende sequências simplistas, que são sequências de anticorpo sem tendência, também pode ser particular preferencialmente usada como uma biblioteca de região variável aleatória (Gejima et al. (Human anticorpos (2002) 11, 121 a 129); Cardoso et al. Scand. J. Immunol. 2000, 51, 337 a 344). No presente documento, uma sequência de aminoácidos que compreende uma sequência simplista se refere a uma sequência de aminoácidos obtida a partir de tal biblioteca simplista.
[000163] Em uma modalidade da presente invenção, um domínio de ligação de antígeno da presente invenção pode ser obtido a partir de uma biblioteca que contém uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno da presente invenção na qual as sequências são diferentes entre si, preparado combinando-se as regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatória com uma região variável de cadeia pesada selecionada como uma sequência de estrutura que contém originalmente "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antíge- no de uma molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon". Quando a concentração iônica é a con-centração iônica de cálcio, os exemplos não limitantes de tais bibliotecas incluem preferencialmente aqueles construídos combinando-se as regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatória com a sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 (6RL#9-IgG1) ou SEQ ID NO: 51 (6KC4-1#85-IgG1). Alternativamente, tal biblioteca pode ser construída através da seleção de regiões variáveis de cadeia leve apropriadas a partir daquelas que têm as sequências de linhagem germinativa, em vez de regiões variáveis de cadeia leve construídas como umas biblioteca de sequência de região variável aleatória. Tais bibliotecas preferenciais incluem, por exemplo, aquelas nas quais a sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 (6RL#9-IgG1) ou SEQ ID NO: 51 (6KC4-1#85-IgG1) é combinada com as regiões variáveis de cadeia leve que têm sequências de linhagem germinativa.
[000164] Alternativamente, a sequência de uma região variável de cadeia pesada selecionada como uma sequência de estrutura que contém originalmente "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno dependendo da condição de concentração de íon" conforme mencionado acima pode ser projetada para conter resíduos flexíveis. O número e a posição dos resíduos flexíveis não são particularmente limitados desde que a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno da presente invenção varie dependendo das condições de concentração de íon. Especificamente, as sequências de CDR e/ou de FR de cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Quando a concentração iônica for concentração iônica de cálcio, os exemplos não limitantes de resíduos flexíveis a ser introduzidos na sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 50 (6RL#9-IgG1) incluem todos os resíduos de aminoácido de cadeia pesada CDR1 e CDR2 e os resíduos de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada exceto aqueles nas posições 95, 96 e/ou 100a. Alternativamente, os exemplos não limitantes de resíduos flexíveis a ser introduzidos na sequência de região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 51 (6KC4-1#85-IgG1) incluem todos os resíduos de aminoácido de CDR1 e CDR2 de cadeia pesada e os resíduos de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada exceto aqueles nas posições de aminoácido 95 e/ou 101.
[000165] Alternativamente, uma biblioteca que contém uma pluralidade de moléculas de ligação de antígeno na qual as sequências são diferentes entre si pode ser construída através da combinação de regi- ões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatória ou regiões variáveis de cadeia leve que têm sequências de linhagem germinativa com regiões variáveis de cadeia pesada nas quais "pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno dependendo da condição de concentração de íon" foi introduzido conforme mencionado acima. Quando a concentração iôni- ca for concentração iônica de cálcio, os exemplos não limitantes de tais bibliotecas incluem preferencialmente aqueles nos quais as regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatória ou regiões variáveis de cadeia leve que têm sequências de linhagem germinativa são combinados com a sequência de uma região variável de cadeia pesada na qual um re- síduo(s) particular foi substituído por pelo menos um resíduo de ami- noácido que altera a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon de cálcio. Os exemplos não limitantes de tais resíduos de ami- noácido incluem resíduos de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada. Os exemplos adicionais não limitantes de tais resíduos de aminoácido incluem resíduos de aminoácido da CDR2 de cadeia pesada. Além disso, os exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido também incluem os resíduos de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada. Os exemplos não limitantes de tais resíduos de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada incluem os aminoácidos das posições 95, 96, 100a e/ou 101 na CDR3 da região variável de cadeia pesada conforme indicado pela numeração de Kabat. Além disso, esses resíduos de amino- ácido podem estar contidos isoladamente ou em combinação desde que os mesmos formem um motivo de ligação de cálcio e/ou a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno varie dependendo das condições de concentração de íon de cálcio.
[000166] Quando as regiões variáveis de cadeia leve construídas como uma biblioteca de sequência de região variável aleatória ou regiões variáveis de cadeia leve que têm sequência de linhagem germina- tiva são combinadas com uma região variável de cadeia pesada na qual pelo menos um resíduo de aminoácido que altera a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon conforme mencionado acima foi introduzido, a sequência da região variável de cadeia pesada também pode ser projetada para conter resíduos flexíveis da mesma maneira conforme descrito acima. O número e a posição de resíduos flexíveis não são particularmente limitados desde que a atividade de ligação de antígeno de um molécula de ligação de antígeno da presente invenção varie dependendo das condições de concentração de íon. Especificamente, a CDR de cadeia pesada e/ou sequências de FR podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Além disso, as bibliotecas de região variável aleatória podem ser preferencialmente usadas como sequências de aminoácido de CDR1, CDR2 e/ou CDR3 da região variável de cadeia pesada além dos resíduos de aminoácido que alteram a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de an- tígeno. Quando as sequências de linhagem germinativa são usadas como regiões variáveis de cadeia leve, os exemplos não limitantes de tais sequências incluem aqueles de SEQ ID NO: 46 ou SEQ ID NO: 47 ou SEQ ID NO: 48) e SEQ ID NO: 49 (Vk4).
[000167] Qualquer um dos aminoácidos descritos acima que alteram a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de an- tígeno dependendo das condições de concentração de íon de cálcio pode ser preferencialmente usado, desde que os mesmos formem um motivo de ligação de cálcio. Especificamente, tais aminoácidos incluem aminoácidos doadores de elétrons. Os exemplos preferencias de tais aminoácidos doadores de elétrons incluem serina, treonina, aspa- ragina, ácido glutâmico, ácido aspártico e ácido glutâmico.
[000168] Um exemplo da "condição de concentração de íon" da presente invenção inclui uma "condição de pH". Uma condição de pH também pode ser referenciada como uma condição de concentração de íon de hidrogênio. Na presente invenção, a condição de concentração de próton, isto é, os núcleos de átomo de hidrogênio, é tratada como sinônimos de uma condição de índice de hidrogênio (pH). Quando a atividade de íon de hidrogênio em uma solução aquosa é representada como aH+, o pH é definido como -log10aH+. Quando a resistência iônica da solução aquosa for baixa (por exemplo, menor que 103), aH+ é quase igual à resistência a íon de hidrogênio. Por exemplo, o produto iônico de água a 25 °C e 1 atmosfera é Kw = aH + aOH = 10-14 e, portanto, em água pura, aH+ = aOH = 10-7. Nesse caso, o pH = 7 é neutro; uma solução aquosa cujo pH é menor que 7 é ácida ou cujo pH é maior que 7 é alcalina.
[000169] Na presente invenção, quando a condição de pH for usada como a condição de concentração de íon, as condições de pH incluem as condições de alta concentração iônica de hidrogênio ou baixos pHs, isto é, uma condição de faixa de pH ácido e as condições de baixa concentração iônica de hidrogênio ou altos pHs, isto é, uma condição de faixa de pH neutro. "A atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno contido na molécula de ligação de antí- geno da presente invenção varia dependendo da condição de pH" significa que a atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno contido em uma molécula de ligação de antígeno varia devido à diferença nas condições de uma alta concentração iônica de hidrogênio ou baixo pH (uma faixa de pH ácido) e uma baixa concen-tração iônica de hidrogênio ou alto pH (uma faixa de pH neutra). Isso inclui, por exemplo, o caso em que a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno é maior sob uma condição de faixa de pH neutro que sob uma condição de faixa de pH ácido e o caso em que a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno é maior sob uma condição de faixa de pH ácido que sob uma condição de faixa de pH neutro.
[000170] No presente documento, a faixa de pH neutro não é limitada a um valor específico e é preferencialmente selecionada a partir do pH entre 6,7 e 10,0. Em uma outra modalidade, o pH pode ser selecionado a partir do pH entre 6,7 e 9,5. Em ainda uma outra modalidade, o pH pode ser selecionado a partir do pH entre 7,0 e 9,0. Em ainda uma outra modalidade, o pH pode ser selecionado a partir do pH entre 7,0 e 8,0. Em particular, o pH preferencial inclui o pH 7,4, que está próximo ao pH de plasma (sangue) in vivo.
[000171] No presente documento, uma faixa de pH ácido não é limitada a um valor específico e é preferencialmente selecionada a partir do pH entre 4,0 e 6,5. Em uma outra modalidade, o pH pode ser selecionado a partir do pH entre 4,5 e 6,5. Em ainda uma outra modalidade, o pH pode ser selecionado a partir do pH entre 5,0 e 6,5. Em ainda uma outra modalidade, o pH pode ser selecionado a partir do pH entre 5,5 e 6,5. Em particular, o pH preferencial inclui o pH 5,8, que é próximo à concentração de cálcio ionizado no endossomo precoce in vivo.
[000172] Na presente invenção, "a atividade de ligação de antígeno sob uma condição de uma alta concentração iônica de hidrogênio ou baixo pH (uma faixa de pH ácido) é menor que aquela sob uma condição de uma baixa concentração iônica de hidrogênio ou alto pH (uma faixa de pH neutro)" significa que a atividade de ligação de antígeno de domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno que compreende o domínio da presente invenção em um pH selecionado a partir do pH entre 4,0 e 6,5 é mais fraca que aquela em um pH selecionado a partir do pH entre 6,7 e 10,0; que significa preferencialmente que a atividade de ligação de antígeno de um domínio de liga- ção de antígeno ou molécula de ligação de antígeno que compreende o domínio em um pH selecionado a partir do pH entre 4,5 e 6,5 é mais fraca que aquela em um pH selecionado a partir do pH entre 6,7 e 9,5; mais preferencialmente, significa que a atividade de ligação de antíge- no de uma molécula de ligação de antígeno em um pH selecionado a partir do pH entre 5,0 e 6,5 é mais fraca que aquela em um pH selecionado a partir do pH entre 7,0 e 9,0; ainda mais preferencialmente, significa que a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno em um pH selecionado a partir do pH entre 5,5 e 6,5 é mais fraca que aquela em um pH selecionado a partir do pH entre 7,0 e 8,0; de modo particular preferencialmente, significa que a atividade de ligação de antígeno no pH no endossomo precoce in vivo é mais fraca que a atividade de ligação de antígeno no pH de plasma in vivo; e, especificamente, significa que a atividade de ligação de antí- geno de uma molécula de ligação de antígeno no pH 5,8 é mais fraca que a atividade de ligação de antígeno no pH 7,4.
[000173] A determinação de se a atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antíge- no que compreende o domínio tiver alterado através da condição de pH, por exemplo, pelo uso de métodos de medição conhecidos tais como aqueles descritos na seção "atividade de ligação" acima. Por exemplo, a atividade de ligação é medida sob condições de pH diferentes com uso dos métodos de medição descritos acima. Por exemplo, a atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno que compreende o domínio é comparada sob a condições de faixa de pH ácido e faixa de pH neutro para confirmar que a atividade de ligação do domínio ou a molécula altera para ser maior sob a condição de faixa de pH neutro que aquela sob a condição de faixa de pH ácido.
[000174] Além disso, na presente invenção, a expressão "a atividade de ligação de antígeno sob uma condição de alta concentração iônica de hidrogênio ou baixo pH, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, é menor que aquela sob uma condição de baixa concentração iônica de hidrogênio ou alto pH, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro" também pode ser expressa como "a atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno que compreende o domínio sob uma condição de baixa concentração iônica de hidrogênio ou alto pH, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro, é maior que aquele sob uma condição de alta concentração iônica de hidrogênio ou baixo pH, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido". Na presente invenção, "a atividade de ligação de antígeno sob uma condição de alta concentração iônica de hidrogênio ou baixo pH, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, é menor que aquela sob uma condição de baixa concentração iônica de hidrogênio ou alto pH, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro" pode ser descrita como "a atividade de ligação de antígeno sob uma condição de alta concentração iônica de hidrogênio ou baixo pH, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, é mais fraca que a capacidade de ligação de antígeno sob uma condição de baixa concentração iônica de hidrogênio ou alto pH, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro". Alternativamente, "a atividade de ligação de antí- geno sob uma condição de alta concentração iônica de hidrogênio ou baixo pH, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, é reduzida para ser menor que aquela sob uma condição de baixa concentração iônica de hidrogênio ou alto pH, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro" pode ser descrita como "a atividade de ligação de antígeno sob uma condição de alta concentração iônica de hidrogênio ou baixo pH, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido, é reduzida para ser mais fraca que a capacidade de ligação de antígeno sob uma condição de baixa concentração iônica de hidrogênio ou alto pH, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro".
[000175] As condições além da concentração iônica de hidrogênio ou pH para medição da atividade de ligação de antígeno podem ser adequadamente selecionadas pelo indivíduo versado na técnica e não são particularmente limitadas. As medições pode ser executadas, por exemplo, a 37 °C com uso de tampão HEPES. As medições podem ser executadas, por exemplo, com uso de Biacore (GE Healthcare). Quando o antígeno é um antígeno solúvel, a atividade de ligação de antígeno de domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno que compreende o domínio pode ser determinada através da avaliação da atividade de ligação para o antígeno solúvel fluindo-se o antígeno como um analito em um chip imobilizado com o domínio de ligação de antígeno ou a molécula de ligação de antígeno que compreende o domínio. Quando o antígeno é um antígeno de membrana, a atividade de ligação para o antígeno de membrana pode ser avaliada através do fluxo do domínio de ligação de antígeno ou da molécula de ligação de antígeno que compreende o domínio como um analito em um chip imobilizado com o antígeno.
[000176] Desde que a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno da presente invenção em uma condição de alta concentração iônica de hidrogênio ou baixo pH, isto é, em uma condição de faixa de pH ácido seja mais fraca que aquela em uma condição de baixa concentração iônica de hidrogênio ou alto pH, isto é, em uma condição de faixa de pH neutro, a razão da atividade de ligação de antígeno entre aquela sob uma condição de alta concentração iônica de hidrogênio ou baixo pH, isto é, sob uma condição de faixa de pH ácido e sob uma condição de baixa concentração iônica de hidrogênio ou alto pH, isto é, sob uma condição de faixa de pH neutro não é particularmente limitada e o valor de KD (pH 5,8) / KD (pH 7,4), que é a razão da constante de dissociação (KD) para um antígeno em uma condição de alta concentração iônica de hidrogênio ou baixo pH, isto é, em uma condição de faixa de pH ácido com a KD em uma condição de baixa concentração iônica de hidrogênio ou alto pH, isto é, em uma condição de faixa de pH neutro, é, preferencialmente, 2 ou mais; mais preferencialmente, o valor de KD (pH 5,8) / KD (pH 7,4) é 10 ou mais; e, ainda mais preferencialmente, o valor de KD (pH 5,8) / KD (pH 7,4) é 40 ou mais. O valor de limite superior de KD (pH 5,8) / KD (pH 7,4) não é particularmente limitado e pode ser qualquer valor tal como 400, 1.000 ou 10.000, desde que a molécula possa ser produzida pelas técnicas do indivíduo versado na técnica.
[000177] Alternativamente, por exemplo, a constante de taxa de dissociação (kd) pode ser usada adequadamente como um índice para indicar a razão da atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno que compreende o domínio da presente invenção entre aquele em uma condição de alta concentração iônica de hidrogênio ou baixo pH, isto é, em uma condição de faixa de pH ácido e em uma condição de baixa concentração iônica de hidrogênio ou alto pH, isto é, em uma condição de faixa de pH neutro. Quando a kd (constante de taxa de dissociação) for usada como um índice para indicar a razão de atividade de ligação em vez da KD (constante de dissociação), o valor de kd (em uma condição de faixa de pH ácido)/kd (em uma condição de faixa de pH neutro), que é a razão entre kd (constante de taxa de dissociação) para o antí- geno em uma condição de alta concentração iônica de hidrogênio ou baixo pH, isto é, em uma condição de faixa de pH ácido com a kd (constante de taxa de dissociação) em uma condição de baixa concentração iônica de hidrogênio ou alto pH, isto é, em uma condição de faixa de pH neutro, é, preferencialmente, 2 ou mais, mais preferencialmente, 5 ou mais, ainda mais preferencialmente, 10 ou mais e ainda mais preferencialmente de modo particular, 30 ou mais. O valor de li- mite superior da kd (em uma condição de faixa de pH ácido)/kd (em uma condição de faixa de pH neutro) não é particularmente limitado e pode ser qualquer valor tal como 50, 100 ou 200, desde que a molécula possa ser produzida pelas técnicas do indivíduo versado na técnica.
[000178] Quando o antígeno for um antígeno solúvel, a constante de taxa de dissociação (kd) pode ser usada como o valor para a atividade de ligação de antígeno e quando o antígeno for um antígeno de membrana, a constante de taxa de dissociação evidente (kd) pode ser usada. A constante de taxa de dissociação (kd) e a constante de taxa de dissociação evidente (kd) podem ser determinadas pelos métodos conhecidos por um indivíduo versado na técnica e Biacore (GE healthcare), citometria de fluxo e similares podem ser usados. Na presente in-venção, quando a atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno que compreende o domínio for medida em diferentes concentrações iônicas de hidrogênio, isto é, pHs, as condições além da concentração iônica de hidrogênio, isto é, pH, são preferencialmente as mesmas.
[000179] Por exemplo, um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno em uma condição de alta concentração iônica de hidrogênio ou baixo pH, isto é, em uma condição de faixa de pH ácido é menor que aquela em uma condição de baixa concentração iônica de hidrogênio ou alto pH, isto é, em uma condição de faixa de pH neutro, que é uma modalidade fornecida pela presente invenção, pode ser obtido através da triagem de domínios de ligação de antígeno ou moléculas de ligação de antí- geno, que compreende as seguintes etapas (a) a (c): (a) obter a atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno em uma condição de faixa de pH ácido; (b) obter a atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno em uma condição de faixa de pH neutro; e (c) selecionar um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno na condição de faixa de pH ácido é menor que aquela na condição de faixa de pH neutro.
[000180] Alternativamente, um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno em uma condição de alta concentração iônica de hidrogênio ou baixo pH, isto é, em uma condição de faixa de pH ácido, é menor que aquela em uma condição de baixa concentração iônica de hidrogênio ou alto pH, isto é, em uma condição de faixa de pH neutro, que é uma modalidade fornecida pela presente invenção, pode ser obtido através da triagem de domínios de ligação de antígeno ou moléculas de ligação de antígeno ou uma biblioteca do(a) mesmo(a), que compreende as seguintes etapas (a) a (c): (a) contatar um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno ou uma biblioteca do(a) mesmo(a), em uma condição de faixa de pH neutro com um antígeno; (b) colocar, em uma condição de faixa de pH ácido, o domínio de ligação de antígeno ou a molécula de ligação de antígeno ligado(a) ao antígeno na etapa (a); e (c) isolar o domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno dissociado(a) na etapa (b).
[000181] Um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno em uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou baixo pH, isto é, em uma condição de faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma condição de baixa concentração de íon de hidrogênio ou alto pH, isto é, em uma condição de faixa de pH neutro, que é outra modalidade fornecida pela presente invenção, pode ser obtida através de triagem de domínios de ligação de antígeno ou moléculas de ligação de antígeno, ou uma biblioteca dos mesmos, que compreende as etapas a seguir (a) a (d): (a) colocar, em uma condição de faixa de pH ácido, um an- tígeno em contato com uma biblioteca de domínios de ligação de antí- geno ou moléculas de ligação de antígeno; (b) selecionar o domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno que não se liga ao antígeno na etapa (a); (c) permitir que o domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno selecionada na etapa (b) se ligue com o antígeno em uma condição de faixa de pH neutro; e (d) isolar o domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno ligada ao antígeno na etapa (c).
[000182] Um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno em uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou baixo pH, isto é, em uma condição de faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma condição de baixa concentração de íon de hidrogênio ou alto pH, isto é, em uma condição de faixa de pH neutro, que é ainda outra modalidade fornecida pela presente invenção, pode ser obtido por um método de triagem que compreende as etapas a seguir (a) a (c): (a) colocar, em uma condição de faixa de pH neutro, uma biblioteca de domínios de ligação de antígeno ou moléculas de ligação de antígeno em contato com uma coluna imobilizada com um antíge- no; (b) eluir em uma condição de faixa de pH ácido a partir da coluna o domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno ligada à coluna na etapa (a); e (c) isolar o domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno eluída na etapa (b).
[000183] Um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno em uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou baixo pH, isto é, em uma condição de faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma condição de baixa concentração de íon de hidrogênio ou alto pH, isto é, em uma condição de faixa de pH neutro, que é ainda outra modalidade fornecida pela presente invenção, pode ser obtido por um método de triagem que compreende as etapas a seguir (a) a (d): (a) permitir que, em uma condição de faixa de pH ácido, uma biblioteca de domínios de ligação de antígeno ou moléculas de ligação de antígeno passe uma coluna imobilizada com um antígeno; (b) coletar o domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno eluída sem ligar à coluna na etapa (a); (c) permitir que o domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno coletada na etapa (b) se ligue com o antí- geno em uma condição de faixa de pH neutro; e (d) isolar o domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno ligada ao antígeno na etapa (c).
[000184] Um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno em uma alta concentração de íon de hidrogênio ou baixo pH, isto é, em uma condição de faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma baixa concentração de íon de hidrogênio ou alto pH, isto é, em uma condição de faixa de pH neutro, que é ainda outra modalidade fornecida pela presente invenção, pode ser obtido por um método de triagem que compreende as etapas a seguir (a) a (d): (a) colocar um antígeno em contato com uma biblioteca de domínios de ligação de antígeno ou moléculas de ligação de antígeno em uma condição de faixa de pH neutro; (b) obter o domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno ligada ao antígeno na etapa (a); (c) colocar em uma condição de faixa de pH ácido o domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno obtida na etapa (b); e (d) isolar o domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno na etapa (c) é mais fraca do que o padrão selecionado na etapa (b).
[000185] As etapas descritas acima podem ser repetidas duas vezes ou mais vezes. Desse modo, a presente invenção fornece domínios de ligação de antígeno e moléculas de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno em uma condição de faixa de pH ácido é menor do que aquela em uma condição de faixa de pH neutro, que são obtidos por um método de triagem que compreende adicionalmente as etapas de repetir etapas (a) a (c) ou (a) a (d) nos métodos de triagem descritos acima. O número de vezes que as etapas (a) a (c) ou (a) a (d) é repetida não é particularmente limitado; entretanto, o número é 10 ou menos em geral.
[000186] Nos métodos de triagem da presente invenção, a atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno em uma condição de uma alta concentração de íon de hidrogênio ou baixo pH, isto é, em uma faixa de pH ácido, não é particularmente limitado, desde que seja a atividade de ligação de antígeno em um pH de entre 4,0 e 6,5, e inclua a atividade de ligação de antígeno em um pH de entre 4,5 e 6,6 conforme o pH preferencial. A atividade de ligação de antígeno também inclui aquela em um pH de entre 5,0 e 6,5, e aquela em um pH de entre 5,5 e 6,5 conforme outro pH preferencial. A atividade de ligação de antígeno também inclui aquela no pH no endossomo precoce in vivo conforme o pH mais preferencial, e especificamente, aquela em pH 5,8. Enquanto isso, a atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno em uma condição de uma baixa concentração de íon de hidrogênio ou alto pH, isto é, em uma faixa de pH neutro, não é particularmente limitado, desde que seja a atividade de ligação de antígeno em um pH de entre 6,7 e 10, e inclua a atividade de ligação de antígeno em um pH de entre 6,7 e 9,5 conforme o pH preferencial. A atividade de ligação de antígeno também inclui aquela em um pH de entre 7,0 e 9,5 e aquela em um pH de entre 7,0 e 8,0 conforme outro pH preferencial. A atividade de ligação de antígeno também inclui aquela no pH de plasma in vivo conforme o pH mais preferencial, e especificamente, aquela em pH 7,4.
[000187] A atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno pode ser medida por métodos conhecidos àqueles versados na técnica. Aqueles versados na técnica podem determinar, de modo adequado, as condições diferentes de concentração de cálcio ionizado. A atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno pode ser estimada com base na constante de dissociação (KD), constante de dissociação aparente (KD), constante de taxa de dissociação (kd), constante de taxa de dissociação aparente (kd), e similares. Esses podem ser determinados por métodos conhe-cidos àqueles versados na técnica, por exemplo, com o uso de Biacore (GE healthcare), Scatchard plot, ou FACS.
[000188] Na presente invenção, a etapa de selecionar um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno em uma condição de baixa concentração de íon de hidrogênio ou alto pH, isto é, em uma condição de faixa de pH neutro, é maior do que aquela em uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou baixo pH, isto é, em uma condição de faixa de pH ácido, é sinônima com a etapa de selecionar um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno em uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou baixo pH, isto é, em uma condição de faixa de pH ácido, é menor do que aquela em uma condição de baixa concentração de íon de hidrogênio ou alto pH, isto é, em uma condição de faixa de pH neutro.
[000189] Desde que a atividade de ligação de antígeno em uma condição de baixa concentração de íon de hidrogênio ou alto pH, isto é, em uma condição de faixa de pH neutro, é maior do que aquela em uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou baixo pH, isto é, em uma condição de faixa de pH ácido, a diferença entre a atividade de ligação de antígeno em uma condição de baixa concentração de íon de hidrogênio ou alto pH, isto é, em uma condição de faixa de pH neutro, e aquela em uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou baixo pH, isto é, em uma condição de faixa de pH ácido, não é particularmente limitado; entretanto, a atividade de ligação de antígeno em uma condição de baixa concentração de íon de hidrogênio ou alto pH, isto é, em uma condição de faixa de pH neutro, é preferencialmente o dobro ou mais, mais preferencialmente 10 vezes ou mais, e ainda mais preferencialmente 40 vezes ou mais do que aquela em uma condição de alta concentração de íon de hidrogênio ou baixo pH, isto é, em uma condição de faixa de pH ácido.
[000190] O domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno varia dependendo de condições de concentração de íon de hidrogênio da presente invenção a serem exibidas pelos métodos de triagem descritos acima pode ser preparado de qualquer modo. Por exemplo, moléculas de ligação de antígeno convencionais, bibliotecas convencionais (biblioteca de fago, etc.), anticorpos ou bibliotecas preparadas a partir de células B de animais imunizados ou de hibridomas obtidos imunizando-se animais, anticorpos ou bibliotecas (bibliotecas com teor aumentado de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais, bibliotecas introduzidas com aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou mutações de aminoá- cido não natural em posições específicas, etc.) obtido introduzindo-se aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou mutações de aminoácido não natural nos anticorpos descritos acima ou bibliotecas podem ser usados.
[000191] Os métodos para obter um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antí- geno em uma baixa concentração de íon de hidrogênio ou alto pH, isto é, em uma condição de faixa de pH neutro, é maior do que aquela em uma alta concentração de íon de hidrogênio ou baixo pH, isto é, em uma condição de faixa de pH ácido, a partir de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno preparada de hibri- domas obtidos imunizando-se animais ou de células B de animais imunizados preferencialmente incluem, por exemplo, a molécula de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno em que pelo menos um dentre os aminoácidos do domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno é substituído por um aminoácido com um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou uma mutação de aminoácido não natural, ou o domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno inserida com um aminoácido com um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácido não natural, tal como aqueles descritos no documento no WO 2009/125825.
[000192] Os sítios de introdução de mutações de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais não são particularmente limi- tados, e podem ser qualquer posição desde que a atividade de ligação de antígeno em uma faixa de pH ácido se torne mais fraca do que aquela em uma faixa de pH neutro (o valor de KD (em uma faixa de pH ácido) / KD (em uma faixa de pH neutro) ou kd (em uma faixa de pH ácido) / kd (em uma faixa de pH neutro) é aumentado) quando comparado a antes de substituição ou inserção. Por exemplo, quando a molécula de ligação de antígeno é um anticorpo, região variável de anticorpo e CDRs são adequados. Aqueles versados na técnica podem determinar de maneira apropriada, o número de aminoácidos a serem substituídos por ou o número de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou ami- noácidos não naturais a serem inseridos. É possível substituir por um único aminoácido que tem um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou um único aminoácido não natural; é possível inserir um único aminoácido que tem um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou um único aminoácido não natural; é possível substituir por dois ou mais aminoácidos que tem um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou dois ou mais aminoácidos não naturais; e é possível inserir dois ou mais aminoácidos que tem um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glu- tâmico) ou dois ou mais aminoácidos não naturais. Alternativamente, outros aminoácidos podem ser excluídos, adicionados, inseridos e/ou substituídos de modo concomitante, à parte da substituição em amino- ácidos que tem um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais, ou a inserção de aminoácidos que tem um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais. A substituição em ou inserção de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais pode ser realizada de modo aleatório por métodos tal como varredura de histidina, em que a alanina de varredura de alanina conhecida àqueles versados na técnica é substituída por histidina. As moléculas de ligação de antígeno que exibem um valor maior de KD (em uma faixa de pH ácido) / KD (em uma faixa de pH neutro) ou kd (em uma faixa de pH ácido) / kd (em uma faixa de pH neutro) quando comparado a antes da mutação podem ser selecionadas a partir de domínios de ligação de antígeno ou anticorpos introduzidos com inserções aleatórias ou mutações de substituição de amino- ácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histi- dina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais.
[000193] Exemplos preferenciais de moléculas de ligação de antíge- no contendo a mutação em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais conforme descrito acima e cuja atividade de ligação de antígeno em uma faixa de pH ácido é menor do que aquela em uma faixa de pH neutro incluem moléculas de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno na faixa de pH neutro após a mutação em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais é comparável àquela de antes da mutação em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmi- co) ou aminoácidos não naturais. No presente documento, "uma molécula de ligação de antígeno após a mutação com aminoácidos que tem um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais tem uma atividade de ligação de antígeno comparável àquela antes da mutação com aminoácidos que tem um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais" significa que, ao obter a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de an- tígeno antes da mutação com aminoácidos que tem um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou ami- noácidos não naturais como 100%, a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno após a mutação com amino- ácidos que tem um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais é pelo menos 10% ou mais, preferencialmente 50% ou mais, mais preferencialmente 80% ou mais, e ainda mais preferencialmente 90% ou mais. A atividade de ligação de antígeno após a mutação de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glu- tâmico) ou aminoácidos não naturais em pH 7,4 pode ser maior do que aquela antes da mutação de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoá- cidos não naturais em pH 7,4. Se a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno for diminuída devido à inserção de ou substituição em aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais, a atividade de ligação de antígeno pode ser feita para ser comparável àquela antes da inserção de ou substituição em aminoáci- dos com um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais, introduzindo-se uma substituição, exclusão, adição e/ou inserção de um ou mais aminoáci- dos da molécula de ligação de antígeno. A presente invenção também inclui moléculas de ligação de antígeno cuja atividade de ligação foi ajustada para ser comparável por substituição, exclusão, adição e/ou inserção de um ou mais aminoácidos após substituição ou inserção de aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0 (por exemplo, histidina e ácido glutâmico) ou aminoácidos não naturais.
[000194] Em uma modalidade da presente invenção, uma biblioteca contendo múltiplos domínios de ligação de antígeno ou moléculas de ligação de antígeno da presente invenção cujas sequências são diferentes uma da outra também pode ser construída combinando-se regiões variáveis de cadeia pesada, produzidas como uma biblioteca de sequência de região variável randomizada, com regiões variáveis de cadeia leve introduzidas com "pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação de antígeno de domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno dependendo da condição de concentração de íon de hidrogênio".
[000195] Tais resíduos de aminoácido incluem, mas sem limitação, por exemplo, resíduos de aminoácido contido na cadeia leve CDR1. Os resíduos de aminoácido também incluem, mas sem limitação, por exemplo, resíduos de aminoácido contido na cadeia leve CDR2. The resíduos de aminoácido também incluem, mas sem limitação, por exemplo, resíduos de aminoácido contido na cadeia leve CDR3.
[000196] Os resíduos de aminoácido descritos acima contidos na cadeia leve CDR1 incluem, mas sem limitação, por exemplo, resíduo(s) de aminoácido de posição(s) 24, 27, 28, 31, 32 e/ou 34 de acordo com numeração de Kabat na CDR1 de região variável de cadeia leve. Enquanto isso, os resíduos de aminoácido contidos na cadeia leve CDR2 incluem, mas sem limitação, por exemplo, resíduo(s) de aminoácido de posição(s) 50, 51, 52, 53, 54, 55 e/ou 56 de acordo com a numeração Kabat na CDR2 de região variável de cadeia leve. Além disso, os resíduos de aminoácido na cadeia leve CDR3 incluem, mas sem limitação, por exemplo, resíduos de aminoácido de posição(s) 89, 90, 91, 92, 93, 94 e/ou 95A de acordo com a numeração de Kabat na CDR3 de região variável de cadeia leve. Ademais, os resíduos de aminoácido podem estar contidos sozinhos ou podem estar contidos em combinação de dois ou mais aminoácidos desde que os mesmos permitam a mudança na atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno dependendo da condição de concentração de íon de hidro- gênio.
[000197] Até mesmo quando a região variável de cadeia pesada produzida como uma biblioteca de sequência de região variável ran- domizada é combinada com a região variável de cadeia leve descrita acima introduzida com "pelo menos um resíduo de aminoácido que muda a atividade de ligação de antígeno de uma molécula de ligação de antígeno dependendo da condição de concentração de íon de hidrogênio", é possível projetar de modo que os resíduos flexíveis estejam contidos na sequência da região variável de cadeia leve do mesmo modo conforme descrito acima. O número e posição dos resíduos flexíveis não são particularmente limitados a uma modalidade específica, desde que a atividade de ligação de antígeno de domínio de liga-ção de antígeno ou molécula de ligação de antígeno da presente invenção mude dependendo da condição de concentração de íon de hidrogênio. Especificamente, as sequências de CDR e/ou FR de cadeia pesada e/ou cadeia leve podem conter um ou mais resíduos flexíveis. Por exemplo, resíduos flexíveis a ser introduzidos nas sequências da região variável de cadeia leves incluem, mas sem limitação, por exemplo, os resíduos de aminoácido listados nas Tabelas 3 e 4. Enquanto isso, sequências de aminoácido de regiões variáveis de cadeia leve diferentes dos resíduos flexíveis e resíduos de aminoácido que mudam a atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antí- geno ou molécula de ligação de antígeno dependendo da condição de concentração de íon de hidrogênio incluem, de modo adequado, mas sem limitação, sequências de linhagem germinativa tal como Vk1 (SEQ ID NO: 46), Vk2 (SEQ ID NO: 47), Vk3 (SEQ ID NO: 48), e Vk4 (SEQ ID NO: 49).
Figure img0004
(Posição indica numeração de Kabat)
Figure img0005
Figure img0006
(Posição indica numeração Kabat)
[000198] \Qualquer resíduo de aminoácido pode ser usado de modo adequado como os resíduos de aminoácido descritos acima que mudam a atividade de ligação de antígeno de um domínio de ligação de antígeno ou molécula de ligação de antígeno dependendo das condições de concentração de íon de hidrogênio. Especificamente, tais resíduos de aminoácido incluem aminoácidos com um pKa de cadeia lateral de 4,0 a 8,0. Tais aminoácidos de liberação de elétron preferencialmente incluem, por exemplo, aminoácidos que ocorrem naturalmente tais como histidina e ácido glutâmico, bem como aminoácidos não naturais tais como análogos de histidina (US2009/0035836), m- NO2-Tyr (pKa 7.45), 3,5-Br2-Tyr (pKa 7.21), e 3,5-I2-Tyr (pKa 7.38) (Bioorg. Med. Chem. (2003) 11 (17), 3761-3768). Os resíduos de ami- noácido particularmente preferenciais incluem, por exemplo, aminoáci- dos com um pKa de cadeia lateral de 6,0 a 7,0. Tais resíduos de ami- noácido de liberação de elétron preferencialmente incluem, por exemplo, histidina.
[000199] A região variável de cadeia pesada preferencial que é usada em combinação inclui, por exemplo, bibliotecas de região variável randomizadas. Os métodos conhecidos são combinados de modo apropriado como um método para produzir uma biblioteca de região variável randomizada. Em uma modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca imunológica construída com base em genes de anticorpo derivados de animais imunizados com antígenos específicos, pacientes com infecção ou pessoas com um título de anticorpo elevado no sangue como resultado de vacinação, pacientes com câncer, ou linfócitos de doenças autoimunes pode ser usada de modo adequado como uma biblioteca de região variável randomizada.
[000200] Em outra modalidade não limitante da presente invenção, do mesmo modo conforme descrito acima, uma biblioteca sintética em que as sequências de CDR de genes V de DNA genômico ou genes de V reconstruídos funcionais são substituídos por um conjunto de oli- gonucleotídeos sintéticos contendo os grupos de códon de codificação de sequências de um comprimento apropriado também pode ser usada de modo adequado como uma biblioteca de região variável rando- mizada. Nesse caso, a sequência de CDR3 sozinha pode ser substituída porque a variedade na sequência de gene de cadeia pesada CDR3 é observada. A base para causar variações de aminoácido na região variável de uma molécula de ligação de antígeno é gerar variações de resíduos de aminoácido de posições expostas de superfície da molécula de ligação de antígeno. A posição exposta de superfície se refere a uma posição em que um aminoácido é exposto na superfície e/ou colocado em contato com um antígeno com conformação de base, agrupamento estrutural e/ou estrutura modelada de uma molécula de ligação de antígeno e, em geral, tais posições são os CDRs. As posições expostas de superfície são preferencialmente determinadas com o uso das coordenadas derivadas de um modelo tridimensional da molécula de ligação de antígeno com o uso de programas de computador tais como o programa InsightII (Accelrys). As posições expostas de superfície podem ser determinadas com o uso de algoritmos conhecidos na técnica (por exemplo, Lee e Richards (J. Mol. Biol. (1971) 55, 379-400); Connolly (J. Appl. Cryst. (1983) 16, 548-558)). As posições expostas de superfície podem ser determinadas com base nas informações das três estruturas dimensionais de anticorpos com o uso de software adequado para modelagem de proteína. O software que é usado de modo adequado para esse propósito inclui o software de módulo de biopolímero SYBYL (Tripos Associates). Quando o algoritmo exige o parâmetro de tamanho de entrada do usuário, o "tamanho" de sonda para uso em computação é geralmente ou preferencialmente determinado a cerca de 1,4 angstrom ou menos em raio. Além disso, um método para determinar a área e região exposta de superfície com o uso de software de computador pessoal é descrito por Pacios (Com- put. Chem. (1994) 18 (4), 377-386; e J. Mol. Model. (1995) 1, 46-53).
[000201] Em ainda outra modalidade não limitante da presente invenção, uma biblioteca virgem construída de genes de anticorpo derivados de linfócitos de pessoas saudáveis e que compreendem sequências virgens, que são repertórios não influenciados de sequências de anticorpo, também pode ser usada de modo particularmente adequado como uma biblioteca de região variável randomizada (Gejima et al. (Human Anticorpos (2002) 11, 121-129); e Cardoso et al. (Scand. J. Immunol. (2000) 51, 337-344)). Além disso, alterações de aminoácido para aprimorar a atividade de ligação de FcRn humano sob uma condição de faixa de pH ácido podem ser combinadas adicionalmente.
[000202] Ademais, alterações de aminoácidos para aumentar a atividade de ligação FcRn sob condição de faixa de pH ácido podem ser combinadas em adição. Mais especificamente, alterações usadas para aumentar atividade de ligação FcRn humana sob condição de faixa de pH ácido podem ser realizadas em anticorpo IgG, por exemplo, por um método de substituir Met por Leu na posição 428, e substituir Asn por Ser na posição 434, de acordo com a numeração EU (Nat Biotechnol, 2010 28: 157-159); método de substituir Asn por Ala na posição 434 (Drug Metab Dispos. 2010 Apr; 38(4): 600-5); método de substituir Met por Tyr na posição 252, substituindo Ser por Thr na posição 254, e substituir Thr por Glu na posição 256 (J Biol Chem, 2006, 281: 2351423524); método para substituir Thr por Gln na posição 250, e substituindo Met por Leu na posição 428 (J Immunol. 2006, 176(1): 346-56); método de substituir Asn por His na posição 434 (Clinical Pharmacology & Therapeutics (2011) 89(2): 283-290), ou usando alterações tais como aquelas descritas em WO2010106180, WO2010045193, WO2009058492, WO2008022152, WO2006050166, WO2006053301, WO2006031370, WO2005123780, WO2005047327, WO2005037867, WO2004035752, WO2002060919, ou semelhante.
[000203] Ademais, uma molécula de anticorpo produzida substituindo Asn por His na posição 434 (numeração EU) em anticorpo anti-CD4 humanizado para aumentar a atividade de ligação FcRn humana sob condição de faixa de pH ácido e para melhorar as propriedades de retenção de plasma foi apresentada recentemente como ligando-se a fatores reumatóides (RF) (Clin Pharmacol Ther. 2011 Feb; 89(2): 28390). Este anticorpo tem uma região IgG1 Fc humana, mas substituindo Asn por His na posição 434 que está posicionado no sítio de ligação FcRn, foi mostrado que se liga a fatores reumáticos que reconhecem este sítio substituído.
[000204] Como descrito acima, várias alterações foram relatadas como alterações para aumentar a atividade de ligação FcRn, sob condição de faixa de pH ácido. Entretanto, introduzindo essas alterações no sítio de ligação FcRn em uma região Fc, afinidade para fatores reumáticos que reconhecem este sítio pode ficar aumentada.
[000205] Entretanto, introduzindo alterações que não reduzem atividade de ligação de FcRn e reduzem somente atividade de ligação pa ra fatores reumatoides no sítio na região Fc, moléculas de ligação de antígeno com atividade de ligação FcRn humana aumentada em condição de faixa de pH ácido e com afinidade para fatores reumatoides podem ser produzidas.
[000206] Para alterações que reduzem atividade de ligação para fatores reumatoides, alterações para as posições 248-257, 305-314, 342-352, 380-386, 388, 414-421, 423, 425-437, 439, e 441-444 de acordo com a numeração EU são utilizadas. Preferivelmente, alterações nas posições 387, 422, 424, 426, 433, 436, 438, e 440 são usadas. De maneira particularmente preferível, alteração de substituir Val por Glu ou Ser na posição 422, alteração de substituir Ser por Arg na posição 424, alteração de substituir His por Asp na posição 433, alteração de substituir Tyr por Thr na posição 436, alteração de substituir Gln por Arg ou Lys na posição 438, e alteração de substituir Ser por Glu ou Asp na posição 440 são usadas. Essas alterações podem ser isoladas ou combinadas em posições múltiplas.
[000207] Alternativamente, para diminuir a atividade de ligação a fatores reumatoides, uma sequência glicosilação tipo N pode ser introduzida neste sítio. Especificamente Asn-Xxx-Ser/Thr (Xxx é qualquer aminoácido diferente de Pro) é conhecido como uma sequência de gli- cosilação tipo N. Acrescentar uma cadeia de açúcar tipo N introduzindo esta sequência no sítio na região Fc possibilita a inibição de ligação a RF por obstáculo estérico devido à cadeia de açúcar tipo N. Alterações usadas para adicionar uma cadeia de substituem Lys por Asn na posição 248, alteração que substitui Ser por Asn na posição 436 e substitui Gln por Thr na posição 438, e alteração que substitui Gln por Asn na posição 438. Particularmente, a alteração que substitui Ser por Asn na posição 424 é usada.
[000208] Um exemplo preferido de um polipeptídio compreendendo uma variante da região Fc da presente invenção inclui pelo menos um dos polipeptídios compreendendo duas variantes da região Fc associadas, como um anticorpo IgG. Quando um anticorpo IgG é usado como o anticorpo, o tipo de região constante não é limitado, e um isotipo IgG (subclasses) tal como IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4 pode ser usado. Anticorpos IgG da presente invenção são preferivelmente igGs humanos, e mais preferivelmente IgG1 humano e IgG4 humano. A sequência de aminoácidos das regiões constantes de cadeia pesada do IgGe humano e do igG4 humano são conhecidas. Uma pluralidade de sequências de alotipo devido a polimorfismos genéticos foi descrita nas Sequências de Proteínas de Interesse Immunológico, NIH Publication No. 91-3242 para a região constante de IgG 1 humano, e qualquer das sequências pode ser usada na presente invenção.
[000209] Na presente invenção, a alteração de aminoácido significa qualquer dentre substituição, deleção, adição, inserção e modificação, ou uma combinação destas. Na presente invenção, a alteração de aminoácido pode ter a fase reformulada como mutação de aminoácido e eles são os termos são usados como sinônimo.
[000210] Quando se substituem resíduos de aminoácidos, a substituição para um resíduo de aminoácido diferente é realizada sem o objetivo de alterar aspectos tais como (a)-(c) descritos abaixo: (a) estrutura principal de polipeptídio na estrutura de folha ou região de estrutura helicoidal; (b) carga elétrica ou hidrofobicidade no sítio alvo; ou (c) tamanho da cadeia lateral;
[000211] Resíduos de aminoácidos são classificados nos seguintes grupos, com base em suas propriedades gerais de cadeia lateral: (1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, e ile; (2) hidrofílicos neutors: cys, ser, thr, asn, e gln; (3) ácidos: asp e glu; (4) básicos: his, lys, e arg; (5) resíduos que afetam a orientação da cadeia: gly e pro; e (6) aromáticos: trp, tyr, e phe.
[000212] Substituição entre resíduos de aminoácidos dentro de cada um destes grupos de aminoácidos é chamada de substituição conservadora, e substituição de resíduo de aminoácido entre diferentes grupos é chamada de substituição não-conservadora. Substituições na presente invenção podem ser substituições conservadoras ou substituições não-conservadoras, ou uma combinação de substituições conservadoras e substituições não-conservadoras.
[000213] Alterações de sequências de aminoácidos são produzidas por vários métodos conhecidos da técnica. Tais métodos incluem o seguinte método de mutagênese direcionada por sítio (Hashimoto- Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152: 271-275; Zoller, MJ, e Smith, M. (1983) Oli- gonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors. Methods Enzymol. 100: 468-500; Kramer, W, Drutsa, V, Jansen, HW, Kramer, B, Pflugfelder, M, and Fritz, HJ (1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12: 9441-9456; Kramer W, and Fritz HJ (1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367; and Kunkel, TA (1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82: 488-492), método de mutação por PCR, e o método de cassete, mas não limitados a estes.
[000214] Modificação de aminoácidos da presente invenção inclui modificação pós-translacional. Uma modificação pós-translacional específica pode ser adição ou remoção de uma cadeia de açúcar. Por exemplo, na região constante IgG1 compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 31,o resíduo de aminoácido na posição 297 (numeração EU) pode ser modificada com orientação de cadeia. A estrutura de cadeia de açúcar para a modificação não é limitada. Geralmente, anticorpos expressos em células eucarióticas compreendem glicosilação na região constante. Portanto, anticorpos expressos em células tais como aquelas abaixo normalmente são modificadas por algum tipo de cadeia de açúcar: - células de mamíferos produtoras de anticorpos; - células eucarióticas transformadas com um vetor de expressão compreendendo um DNA codificando um anticorpo.
[000215] Células eucarióticas apresentadas aqui incluem fermento e células animais. Por exemplo, células CHO e células HEK293H são =células animais representativas em transformação com um vetor de expressão compreendendo um DNA codificando anticorpo. Por outro lado, aquelas sem glicosilação neste sítio também estão incluídas na região constante da presente invenção. Anticorpos cuja região constante não é glicosilada podem ser obtidos por expressão de um gene codificando anticorpo em células procarióticas tais como Escherichia coli.
[000216] Especificamente, por exemplo, ácido siálico pode ser adicionado à cadeia de açúcar de uma região Fc (MAbs. 2010 Sep-Oct; 2(5): 519-27).
[000217] Ademais, a presente invenção proporciona anticorpos com-preendendo qualquer variante de região Fc descrita acima.
[000218] O termo “anticorpo/anticorpos” na presente invenção é usado no sentido mais amplo, e como que a atividade biológica desejada é apresentada, ele compreende qualquer anticorpo tal como anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, variantes de anticorpo, fragmentos de anticorpo, anticorpos poliespecíficos (anticorpos multiespecíficos) (por exemplo, anticorpos bi-específicos (diacorpos), anticorpos quiméricos, e anticorpos humanizados.
[000219] Com relação a anticorpos da presente invenção, o tipo de antígeno e a origem do anticorpo não são limitados, e eles podem ser qualquer tipo de anticorpos. A origem dos anticorpos não é particularmente limitada, mas exemplos incluem anticorpos humanos, anticorpos de camundongo, anticorpos de rato, e anticorpos de coelho.
[000220] Métodos para produzir os anticorpos são bem conhecidos dos técnicos no assunto, e, por exemplo, anticorpos monoclonais podem ser produzidos pelo método de hibridoma (Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975)), ou o método de recombinação (U.S. Patent No. 4,816,567). Alternativamente, eles podem ser isolados de uma biblioteca de anticorpo de fase (Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J.Mol.Biol. 222: 581-597 (1991)).
[000221] Um anticorpo humanizado é chamado também de anticorpo humano reformulado. Especificamente, anticorpos humanizados preparados por enxerto dos CDRs de um anticorpo de animal não- humano tal como um anticorpo de camundongo a um anticorpo humano e semelhante são conhecidos. Técnicas de engenharia genética para obter anticorpos humanizados são conhecidas também. Especificamente, por exemplo, sobrepor extensão PCR é conhecido como um método para enxergar anticorpo de camundongo CDRs em FRs humanos.
[000222] Um vetor para expressão um anticorpo humanizado pode ser produzido inserindo um DNA que codifica uma região variável de anticorpo em que três CDRs e quatro FRs são ligados e um DNA que codifica uma região constante de anticorpo humano em um vetor de expressão, de modo que esses DNAs sejam fundidos na estrutura. Depois que este vetor de integração é transferido para um hospedeiro, para estabelecer células recombinantes, essas células são cultivadas, e o DNA que codifica anticorpo humanizado é expressa para produzir o anticorpo humanizado na cultura das células (vide European Patent Publication No. EP 239,400, and International Patent Publication No. WO 1996/002576).
[000223] Conforme necessário, um resíduo de aminoácido em um FR pode ser trocado, de modo que os CDRs de um anticorpo humano reformulado formam sítio de ligação de antígeno apropriado. Por exemplo, uma mutação pode ser introduzida na sequência de aminoá- cido de um FR aplicando o método PCR usado para enxertar CDRs de camundongo em FRs humanos.
[000224] Um anticorpo humano desejado pode ser obtido por imunização DNA usando um animal transgênico tendo o repertório completo de genes de anticorpo humano (vide International Publication Nos. WO 1993/012227, WO 1992/003918, WO 1994/002602, WO 1994/025585, WO 1996/034096, e WO 1996/033735) como animal para imunização.
[000225] Ademais, técnicas para obter um anticorpo humano pano- ramizando uma biblioteca de anticorpos humanos são conhecidas. Por exemplo, uma região V de anticorpo humano é expressa na superfície de uma fase como um anticorpo de cadeia única (scFv) pelo método de exibição de fago. O fago de expressão scFv que se liga ao antíge- no pode ser selecionado. A sequência de que codifica a região V do anticorpo humano ligado a um antígeno pode ser determinado analisando os genes do fago selecionado. Após determinar a sequência de DNA do scFv que se liga ao antígeno um fator de expressão pode ser preparado fundindo-se a estrutura de sequência de região V com a sequência de uma região C de anticorpo humano desejada, e depois inserindo esta em um vetor de expressão adequado. O vetor de expressão é introduzido em células de expressão apropriadas, tais como aquelas descritas acima, e o anticorpo humano pode ser obtido expressando o gene que codifica anticorpo humano. Estes métodos já são conhecidos (vide International Publication Nos. WO 1992/001047, WO 1992/020791, WO 1993/006213, WO 1993/011236, WO 1993/019172, WO 1995/001438, e WO 1995/15388).
[000226] Regiões variáveis que constituem os anticorpos da presente invenção podem ser regiões variáveis que reconheçam qualquer antígeno.
[000227] Aqui, não há limitação particular do antígeno, e ele pode ser qualquer antígeno. Exemplos de tais antígenos preferivelmente incluem ligantes (citocinas, quimioquinas, e semelhantes), receptores, antí- genos de câncer, antígenos MHC, antígenos de diferenciação, imuno- globulinas, e complexos imunes parcialmente contendo imunoglobuli- nas.
[000228] Exemplos de citocinas incluem interleucinas 1 a 18, fatores estimulantes de colônias (G-CSF, M-CSF, GM-CSF, etc.), interferons (IFN-α, IFN-β, IFN-y etc.), fatores do crescimento (EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, TGF, HGF, etc.), fatores de necrose tumoral (TNF-α e TNF-β), linfotoxina, eritropoietina, leptina, SCF, TPO, MCAF, e BMP.
[000229] Exemplos de quimiocinas incluem quimiocinas CC e semelhantes como CCL1 a CCL28, CXC quimiocinas como CXCL1 a CXCL17, C quimiocinas como XCL1 a XCL2, a CX3C quimiocinas como CX3CL1.
[000230] Exemplos de receptores incluem receptores pertencentes a famílias de receptores tais como a família de receptor do fator do crescimento hematopoiético, família do receptor de citocina, família do receptor de tipo tirosina quinase, família do receptor do tipo seri- na/treonina quinase, família do receptor TNF, família do receptor acoplado a proteína G, família do receptor do tipo âncora GPI, família do receptor do tipo tirosina fosfatase, e família do receptor de hormônio. Esses receptores pertencem a essas famílias de receptor e suas características foram descritas em muitos documentos tais como Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehesive Biochemis- try Vol.18B "Hormones and their Actions Part II" pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV; Patthy (Cell (1990) 61 (1): 13-14); Ullrich et al. (Cell (1990) 61 (2): 203-212); Massagué (Cell (1992) 69 (6): 1067-1070); Miyajima et al. (Annu. Rev. Immunol. (1992) 10: 295-331); Taga et al. (FASEB J. (1992) 6, 3387-3396); Fantl et al. (Annu. Rev. Biochem. (1993), 62: 453-481); Smith et al. (Cell (1994) 76 (6): 959962); e Flower DR. Flower (Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422 (3): 207-234).
[000231] Exemplos de receptores específicos pertencentes às famílias de receptores mencionadas acima incluem preferivelmente receptores de eritropoetina (EPO) humanos ou de camundongo (Blood (1990) 76 (1): 31-35; and Cell (1989) 57 (2): 277-285), receptores de fator estimulante de colônia de granulócito humanos ou de camundongo (G-CSF) CSF) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990) 87 (22): 87028706, mG-CSFR; Cell (1990) 61 (2): 341-350), receptores de trombo- poietina humanos ou de camundongo (TPO) (Proc Natl Acad Sci U S A. (1992) 89 (12): 5640-5644; EMBO J. (1993) 12(7): 2645-53), receptores de insulina humanos ou de camundongo (Nature (1985) 313 (6005): 756-761), receptores de ligante Flt humanos ou de camundongo (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1994) 91 (2): 459-463), receptores de fator do crescimento derivado de plaqueta humanos ou de camundongo (PDGF (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85 (10): 3435-3439), receptores de interferon (IFN)-α e β humanos ou de camundongo (Cell (1990) 60 (2): 225-234; e Cell (1994) 77 (3): 391-400), receptores lep- tina humanos ou de camundongo, receptores do hormônio do crescimento (GH) humanos ou de camundongo, Receptores de interleucina (IL)-10 humanos ou de camundongo, receptores do fator semelhante a insulina (IGF)-I humanos ou de camundongo, receptores do fator inibidor de leucemia humanos ou de camundongo (LIF) e receptores do fator neutófico ciliar humanos ou de camundongos (CNTF).
[000232] Antígenos de câncer são antígenos que são expressos como células, tornam-se malignos, e eles são chamados também de an- tígenos específicos de tumor. Cadeias de açúcar anormais que aparecem em superfícies de células ou moléculas de proteína, quando células se tornam cancerígenas, são chamadas também de antígenos, e elas são chamadas também de antígenos de câncer de cadeia de açúcar. Exemplos de antígenos de câncer incluem, preferivelmente, GPC3, que é um receptor pertencente à família de receptores do tipo âncora GPI mencionada acima, é expresso também em vários cânceres, incluindo o câncer de fígado. (Int J Cancer. (2003) 103 (4): 45565), as well as EpCAM which is expressed in several cancers including lung cancer (Proc Natl Acad Sci USA. (1989) 86 (1): 27-31), CA19-9, CA15-3, and sialyl SSEA-1 (SLX).
[000233] Antígenos MHC são classificados, grosso modo, em classe antígenos MHC I e antígenos MHC classe II. Antígenos MHC classe I incluem HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G, e -H, e antígenos MHC classe II incluem HLA-DR, -DQ, e -DP.
[000234] Antígenos de diferenciação podem incluir CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD71, CD73, CD95, CD102, CD106, CD122, CD126, e CDw130.
[000235] Imunoglobulinas incluem IgA, IgM, IgD, IgG, e IgE. Complexos imunes incluem um componente e pelo menos qualquer das imunoglobulinas.
[000236] Outros antígenos incluem, por exemplo, as moléculas abaixo: 17-IA, 4-1BB, 4Dc, 6-keto-PGF1a, 8-iso-PGF2a, 8-oxo-dG, recep- tor de adenosina A1, A33, ACE, ACE-2, activina, activina A, activina AB, activina B, activina C, activina RIA, activina RIA ALK-2, activina RIB ALK-4, activina RIIA, activina RIIB, ADAM, ADAM10, ADAM12, ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5, adressina, aFGF, ALCAM, ALK, ALK-1, ALK-7,alpha-1- antitripsina, alpha-V/beta-1 antagonista, ANG, Ang, APAF-1, APE, APJ, APP, APRIL, AR, ARC, ART, artemina, anti-Id, ASPARTIC, atrial peptídeo natriurético atrial av/b3 integrina, Axl, b2M, B7-1, B7-2, B7-H, fator estimulante de B-limfócito (BlyS), BACE, BACE-1, Bad, BAFF, BAFF-R, Bag-1, BAK, Bax, BCA-1, BCAM, Bcl, BCMA, BDNF, b- ECGF, bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM, BLK, BMP, BMP-2 BMP- 2a, BMP-3 Osteogenina, BMP-4 BMP-2b, BMP-5, BMP-6 Vgr-1, BMP- 7 (OP-1), BMP-8 (BMP-8a, OP-2), BMPR, BMPR-IA (ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-1, BMPR-II (BRK-3), BMP, b-NGF, BOK, bom- besina, fator neurotrófico derivado de osso, BPDE, BPDE-DNA, BTC, fator de componente 3 (C3), C3a, C4, C5, C5a, C10, CA125, CAD-8, calcitonina cAMP, antígeno carcinoembriônico (CEA), antígeno associado ao câncer, catepsina A, catepsina B, catepsina C/DPPI, catepsi- na D, catepsina E, catepsina H, catepsina L, catepsina O, catepsina S, catepsina V, catepsina X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCL1, CCL11, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17, CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21, CCL22, CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3, CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCR1, CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CD1, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (p67 proteína), CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46, CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80 (B7-1), CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC, toxina Botulinum, toxina Clostridium perfringens, CKb8-1, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-1, COX, C- Ret, CRG-2, CT-1, CTACK, CTGF, CTLA-4, CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5, CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13, CXCL14, CXCL15, CXCL16, CXCR, CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CXCR6, antígeno associado a tumor citoqueratina, DAN, DCC, DcR3, DC- SIGN, fator regulador de complemento (Decay fator acelerador), des (1-3)-IGF-I (IGF-1 de cérebro), Dhh, digoxina, DNAM-1, Dnase, Dpp, DPPIV/CD26, Dtk, ECAD, EDA, EDA-A1, EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB-1), EMA, EMMPRIN, ENA, receptor de endotelina, enquefali- nase, eNOS, Eot, eotaxina 1, EpCAM, efrina B2/EphB4, EPO, ERCC, E-selectina, ET-1, fator IIa, fator VII, fator VIIIc, fator IX, proteína de ativação de fibroblasto (FAP), Fas, FcR1, FEN-1, ferritina, FGF, FGF- 19, FGF-2, FGF3, FGF-8, FGFR, FGFR-3, fibrina, FL, FLIP, Flt-3, Flt-4, hormônio estimulante de folículo, fractalquina, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas6, GCP-2, GCSF, GD2, GD3, GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), GDNF, GDNF, GFAP, GFRa-1, GFR-alpha1, GFR-alpha2, GFR-alpha3, GITR, glucagon, Glut4, glicoproteina IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), GM-CSF, gp130, gp72, GRO, hormônio que libera o hormônio do crescimento, hapteno (NP-cap ou NIP-cap), HB-EGF, HCC, HCMV gB envelope glicoproteína, HCMV gH envelope glicoproteina, HCMV UL, fator do crescimento hematopoiéti- co (HGF), Hep B gp120, heparanase, Her2, Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB-4), herpes simplex virus (HSV) gB glicoproteina, HSV gD glicoproteina, HGFA, antígeno associado a melanoma de alto peso molecular (HMW-MAA), HIV gp120, HIV IIIB gp 120 V3 loop, HLA, HLA-DR, HM1.24, HMFG PEM, HRG, Hrk, miosina cardíaca humana, citomegalovírus cardíaco humano (HCMV), hormônio do crescimento humano (HGH), HVEM, I-309, IAP, ICAM, ICAM-1, ICAM-3, ICE, ICOS, IFNg, Ig, IgA receptor, proteína de ligação de IgE, IGF, IGF, IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL- 4R, IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-18R, IL-23, interferon (INF)-alpha, INF-beta, INF-gama, inibina, iNOS, cadeia de insulina A, cadeia de insulin B, fator1 do crescimento semelhante à insulina, integrina alpha2, integrina alpha3, integrina al- pha4, integrina alpha4/beta1, integrina alpha4/beta7, integrina alpha5 (alpha V), integrina alpha5/beta1, integrina alpha5/beta3, integrina al- pha6, integrina beta1, integrina beta2,interferon gama, IP-10, I-TAC, JE, kallikrein 2, kallikrein 5, kallikrein 6, kallikrein 11, kallikrein 12, kal- likrein 14, kallikrein 15, kallikrein L1, kallikrein L2, kallikrein L3, kal- likrein L4, KC, KDR, fator do crescimento queratinócito (KGF), laminina 5, LAMP, LAP, LAP (TGF-1), TGF-1 latente, TGF-1 bp1, LBP, LDGF, LECT2 latentes, lefty, antígeno Lewis-Y, antígeno associado a Lewis- Y, LFA-1, LFA-3, Lfo, LIF, LIGHT, lipoproteina, LIX, LKN, Lptn, L- selectin, LT-a, LT-b, LTB4, LTBP-1, superfície de pulmão, hormônio luteinizante, receptor limfotoxina beta, Mac-1, MAdCAM, MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2, MCP, M-CSF, MDC, Mer, METALLOPROTEASES, MGDF receptor, MGMT, MHC (HLA-DR), MIF, MIG, MIP, MIP-1-alpha, MK, MMAC1, MMP, MMP-1, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP, mucina (Muc1), MUC18, substância inibidora de Mullerian, Mug, MuSK, NAIP, NAP, NCAD, N-C aderina, NCA 90, NCAM, NCAM, neprilisina, neurotrophin- 3, -4, or -6, neurturina, fator do crescimento de nervo (NGF), NGFR, NGF-beta, nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3, NT, NTN, OB, OGG1, OPG, OPN, OSM, OX40L, OX40R, p150, p95, PADPr, hormônio paratiróide, PARC, PARP, PBR, PBSF, PCAD, P-caderina, PCNA, PDGF, PDGF, PDK-1, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2, PIN, PLA2, fos- fotase placental alcalina (PLAP), PlGF, PLP, PP14, proinsulina, prore- laxina, proteina C, PS, PSA, PSCA, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL, RANTES, RANTES, cadeia relaxina A , cadeia relaxin B, renina, vírus sincitial respiratório (RSV) F, RSV Fgp, Ret, fator Rheumatoid, RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-1, SERINE, serum albumin, sFRP-3, Shh, SIGIRR, SK-1, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE, TACI, TAG-72 (glico- proteína-72 associada a tumor), TARC, TCA-3, receptor de célula-T (por exemplo, receptor de célula-T alpha/beta), TdT, TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT, fosfatase alcalina semelhante a testis PLAP, TfR, TGF, TGF-alpha, TGF-beta, TGF-beta Pan Specific, TGF- betaRI (ALK-5), TGF-betaRII, TGF-betaRIIb, TGF-betaRIII, TGF-beta1, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta4, TGF-beta5, trombina, thymus Ck- 1, hormônio estimulante da tireóide, Tie, TIMP, TIQ, fator de teciso, TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-alpha, TNF-alphabeta, TNF- beta2, TNFc, TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF10A (TRAIL R1 Apo-2, DR4), TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A, TRICK-B), TNFRSF10C (TRAIL R3 DcR1, LIT, TRID), TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD), TNFRSF11A (RANK ODF R, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF, TR1), TNFRSF12 (TWEAK R FN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R), TNFRSF14 (HVEM ATAR, HveA, LIGHT R, TR2), TNFRSF16 (NGFR p75NTR), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF18 (GITR AITR), TNFRSF19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF1A (TNF RI CD120a, p55-60), TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3 ) , TNFRSF3 (LTbR TNF RIII, TNFC R), TNFRSF4 (OX40 ACT35, TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40 p50), TNFRSF6 (Fas Apo-1, APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68, TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30), TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2), TNFRST23 (DcTRAIL R1 TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (TRAIL Apo-2 ligante, TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK li- gante ODF, OPG ligante), TNFSF12 (TWEAK Apo-3 ligante, DR3 li- gante), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT HVEM ligante, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (GITR ligante AITR ligante, TL6), TNFSF1A (TNF-a Conectina, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (OX40 ligante gp34, TXGP1), TNFSF5 (CD40 ligante CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (Fas ligante Apo-1 ligante, APT1 ligante), TNFSF7 (CD27 ligante CD70), TNFSF8 (CD30 ligante CD153), TNFSF9 (4-1BB ligante CD137 ligante), TP-1, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-R1, TRAIL- R2, TRANCE, receptor transferrina, TRF, Trk, TROP-2, TSG, TSLP, antígeno associado a tumor CA125, tumor antígeno associado a tumor expressando, carboidratos associados a Lewis-Y, TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1, urokinase, VCAM, VCAM-1, VECAD, VE-Caderina, VE-cadherin-2, VEFGR-1 (flt-1), VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM, antígeno de vírus, VLA, VLA-1, VLA-4, VNR integrina, fator von Willebrand, WIF-1, WNT1, WNT2, WNT2B/13, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16, XCL1, XCL2, XCR1, XCR1, XEDAR, XIAP, XPD, HMGB1, IgA, Ad, CD81, CD97, CD98, DDR1, DKK1, EREG, Hsp90, IL-17/IL-17R, IL- 20/IL-20R, LDL oxidado, PCSK9, prekallikrein, RON, TMEM16F, SOD1, Chromogranin A, Chromogranin B, tau, VAP1, cinogênio de alto peso molecular, IL-31, IL-31R, Nav1.1, Nav1.2, Nav1.3, Nav1.4, Nav1.5, Nav1.6, Nav1.7, Nav1.8, Nav1.9, EPCR, C1, C1q, C1r, C1s, C2, C2a, C2b, C3, C3a, C3b, C4, C4a, C4b, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, factor B, fator D, fator H, properdina, esclerostina, fibrinogena, fibrina, protrombina, trombina, fator de tecido, fator V, fator Va, fator VII, fator VIIa, fator VIII, fator VIIIa, fator IX, fator IXa, fator X, fator Xa, fator XI, fator XIa, fator XII, fator XIIa, fator XIII, fator XIIIa, TFPI, anti- trombina III, EPCR, trombomodulina, TAPI, tPA, plasminogênio, plas- mina, PAI-1, PAI-2, GPC3, Syndecan-1, Syndecan-2, Syndecan-3, Syndecan-4, LPA, e S1P; e receptores para hormônio e fatores do crescimento.
[000237] Uma ou mais alterações de resíduo de aminoácido são permitidas nas sequências de aminoácido que constituem as regiões variáveis, desde que suas atividades de ligação a antígeno sejam mantidas. Quando se altera a sequência de aminoácido de região variável, não há limitação particular no sítio de alteração e número de aminoácidos alterado. Por exemplo, aminoácidos presentes no CDR e/ou FR podem ser alterados apropriadamente. Quando se alteram aminoácidos em uma região variável, a atividade de ligação é preferivelmente mantida sem limitação particular; e, por exemplo, em comparação com alteração anterior, a atividade de ligação é 50% ou mais, preferivelmente 80% ou mais, e mais preferivelmente 100% ou mais. Além disso, a atividade de ligação pode ser aumentada por alterações de aminoácidos. Por exemplo, a atividade de ligação pode ser 2, 5, 10 vezes mais alta do que a alteração anterior. Nos anticorpos da presente invenção, alteração da sequência de aminoácido pode ser pelo menos uma dentre substituição de resíduo de aminoácido, adição, remoção e modificação.
[000238] Por exemplo, a modificação da glutamina de terminal N de uma região variável em ácido piroglutâmico por piroglutamilação é uma modificação bem conhecida dos técnicos no assunto. Assim, quando a o terminal N de cadeia pesada é glutamina, os anticorpos da presente invenção compreendem as regiões variáveis em que a glu- tamina é modificada para ácido piroglutâmico.
[000239] Regiões variáveis de anticorpos da presente invenção podem ter quaisquer sequências, e elas podem ser regiões variáveis de anticorpos, tais como anticorpos de camundongo, anticorpos de rato, anticorpos de coelho, anticorpos de cabra, anticorpos de camelo, anticorpos humanizados produzidos por esses anticorpos não humanos, e anticorpos humanos. “Anticorpos humanizados”, também chamados de “anticorpos humanos re-formulados”, são anticorpos em que as regiões determinantes de complementariedade (CDRs) de um anticorpo derivado de um mamífero não-humano, pro exemplo um anticorpo de camundongo, são transplantadas para as CDRs de um anticorpo humano. Métodos para identificar CDRs são conhecidos (Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877). Suas técnicas de recombinação genética também são conhecidas (vide, European Patent Application Publication No. EP 125023 e WO 96/02576). Ademais, esses anticorpos podem ter várias substituições de aminoácido introduzidas em suas regiões variáveis para melhorar sua ligação a antígeno, farmacocinética, estabilidade e antigenicidade. Regiões variáveis dos anticorpos da presente invenção podem ser capazes de se ligarem a antígenos repetidamente, devido a sua confiabilidade de Ph na ligação de antígeno (WO 2009/125825).
[000240] Regiões constantes do tipo cadeia K e cadeia À estão presentes em regiões constantes de cadeia leve de anticorpos, mas qualquer uma das regiões constantes de cadeia leve é aceitável. Ademais, regiões constantes de cadeia leve da presente invenção podem ser regiões constantes de cadeia leve com alterações de aminoácidos, tais como substituições, remoções, adições e/ou inserções.
[000241] Por exemplo, para as regiões constantes de cadeia pesada de um anticorpo da presente invenção, regiões constantes de cadeia pesada de anticorpos IgG humanos podem ser usadas e regiões constantes de cadeia pesada de anticorpos IgG1 humanos e aquelas de anticorpos IgG4 humanos são preferidas.
[000242] Ademais, variantes da região Fc da presente invenção podem ser convertidas em moléculas de proteína de fusão Fc por ligação a outras proteínas, peptídeos fisiologicamente ativos, e semelhantes. Aqui, proteína de fusão refere-se a um polipeptídio quimérico compreendendo pelo menos dois polipeptídios diferentes, os quais não se lingam espontaneamente entre si ao natural, Exemplos das outras proteínas e peptídeos biologicamente ativos incluem receptores, moléculas de adesão, ligantes, e enzimas, mas não se limitam a estes.
[000243] Exemplos preferidos de moléculas de proteína de fusão Fc da presente invenção incluem proteínas com região Fc fundidas a uma proteína receptora que se liga a um alvo, e tais exemplos incluem proteína de fusão TNFR-Fc, proteína de fusão IL1R-Fc, proteína de fusão VEGFR-Fc e proteína de fusão CTLA4-Fc (Nat Med. 2003 Jan; 9(1): 47-52; BioDrugs. 2006; 20(3): 151-60). Ademais, uma proteína a ser fundida a um polipeptídio da presente invenção pode ser qualquer molécula, desde que ela se ligue a uma molécula alvo, e exemplos incluem moléculas scFv (WO 2005/037989), moléculas de anticorpo de domínio único (WO 2004/058821; WO 2003/002609), moléculas semelhantes a anticorpos (Current Opinion in Biotechnology 2006, 17: 653658; Current Opinion in Biotechnology 2007, 18: 1-10; Current Opinion in Structural Biology 1997, 7: 463-469; and Protein Science 2006, 15: 14-27) tais como DARPins (WO 2002/020565), Affibody (WO 1995/001937), Avimer (WO 2004/044011; WO 2005/040229), e Adnec- tin (WO 2002/032925). Ademais, anticorpos e moléculas de proteína de fusão Fc podem ser anticorpos multiespecíficos que se ligam a múltiplos tipos de moléculas alvo ou epítopos.
[000244] Ademais, anticorpos da presente invenção incluem produtos de modificação de anticorpos. Tais produtos de modificação de anticorpos incluem, por exemplo, anticorpos ligados a várias moléculas, tais como polietileno glicol (PEG) e substâncias citotóxicas. Tais produtos de modificação de anticorpos podem ser obtidos por modificação química de anticorpos da presente invenção. Métodos para modificar anticorpos já estão estabelecidos neste campo.
[000245] Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos bi-específicos também. Anticorpo bi-específico refere-se a um anticorpo que tem em uma única molécula regiões variáveis que reconhecem diferentes epitopos. Os epitopos podem estar presentes em uma única molécula ou em diferentes moléculas.
[000246] Os polipeptídios da presente invenção podem ser preparados pelos métodos conhecidos dos técnicos no assunto. Por exemplo, os anticorpos podem ser preparados pelos métodos descritos abaixo, mas não limitados a estes.
[000247] Um DNA codificando uma cadeia pesada de anticorpos em que um ou mais resíduos de aminoácido na região Fc foram substituídos por outros aminoácidos de interesse, e DNA codificando uma cadeia leve de aminoácidos, são expressos. Um DNA codificando uma cadeia pesada em que um ou mais resíduos de aminoácidos na região Fc são substituídos pro outros aminoácidos de interesse podem ser preparados, por exemplo, obtendo-se um DNA que codifique a região Fc de uma cadeia pesada natural, e introduzindo uma substituição apropriada, de modo que um códon codificando um aminoácido particular na região Fc codifica outro aminoácido de interesse.
[000248] Alternativamente, um DNA que codifica uma cadeia pesada em que um ou mais resíduos de aminoácido na região Fc são substituídos por outros aminoácidos de interesse podem ser preparados designando-se e depois sintetizando quimicamente um DNA que codifi- que uma proteína em que um ou mais resíduos de aminoácido na região Fc da cadeia pesada natural são substituídos por outros aminoá- cidos de interesse. A posição e o tipo de substituição de aminoácido não são particularmente limitados. Ademais, a alteração não se limita à substituição, e a alteração pode ser qualquer de remoção, adição ou inserção ou combinação das mesmas.
[000249] Alternativamente, um DNA que codifique uma cadeia pesada em que um ou mais resíduos de aminoácido na região Fc são substituídos por outros aminoácidos de interesse pode ser preparado como uma combinação de DNAs parciais. Tais combinações de DNAs parciais incluem, por exemplo, a combinação de um DNA que codifique uma região variável a um DNA que codifique uma região constante, e a combinação de um DNA que codifique uma região Fab e um DNA que codifique uma região Fc, mas não limitados a esses. Ademais, um DNA que codifique uma cadeia leve pode, similarmente, ser preparado como uma combinação de DNAs parciais.
[000250] Métodos para expressar os DNAs descritos acima incluem os métodos descritos abaixo. Por exemplo, um vetor de expressão de cadeia pesada é construído inserindo-se um DNA que codifique uma região de cadeia variável em um vetor de expressão juntamente com um DNA que codifica uma região constante de cadeia pesada. De modo igual, um vetor de expressão de cadeia leve é construído inserindose um DNA que codifica uma região variável de cadeia leve em um vetor de expressão juntamente com um DNA que codifica uma região constante de cadeia leve. Alternativamente, esses genes de cadeia pesada e de cadeia leve podem ser inseridos em um único vetor.
[000251] Quando inserir um DNA codificando um anticorpo de interesse em um vetor de expressão, o DNA é inserido de forma que o anticorpo é expresso sob o controle de uma região de regulação de expressão tal como um potencializador ou um promotor. Em seguida, células hospedeiras são transformadas com esse vetor de expressão para expressarem o anticorpo. Em tais casos, uma combinação apropriada de hospedeiro e vetor de expressão pode ser utilizada.
[000252] Exemplos de vetores incluem vetores M13, vetores UC, pBR322, pBluescript, e pCR-Script. Alternativamente, quando se visa subclone e se corta cDNA, além dos vetores descritos acima, pGEM-T, pDIRECT, pT7, e semelhantes podem ser usados.
[000253] Vetores de expressão são particularmente úteis quando se usam vetores para produzir os polipeptídios da presente invenção. Por exemplo, quando uma célula hospedeira é E. coli , tal como JM109, DH5D, HB101, e XL1-Blue, os vetores de expressão têm que portar um promotor que permita expressão eficiente em E. coli, por exemplo, promotor lacZ (Ward et al., Nature (1989) 341: 544-546; FASEB J. (1992) 6: 2422-2427; sua totalidade é incorporada aqui por referência), promotor araB (Better et al., Science (1988) 240: 1041-1043; sua totalidade é incorporada aqui por referência), promotor T7 promoter, ou semelhantes. Tais vetores incluem pGEX-5X-1 (Pharmacia), “QIAex- press system” (QIAGEN), pEGFP, ou pET (neste caso, o hospedeiro é preferivelmente BL21 que expressa T7 RNA polimerase) além dos vetores descritos acima.
[000254] Os vetores podem conter sequências de sinal para secreção de polipeptídio. Como sequência de sinal para secreção de poli- peptídio, uma sequência de sinal pelB (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169: 4397; sua totalidade é incorporada aqui por referência) pode ser usada quando um polipeptídio é secretado no periplasma de E. coli. O veto pode ser introduzido nas células hospedeiras por método de lipofrectina, método de fosfato de cálcio, e método de DEAE- Dextran , por exemplo.
[000255] Além devetores de expressão E. coli, os vetores para produzir os polipeptídios da presente invenção incluem vetores de ex pressão de mamíferos (por exemplo, pcDNA3 (Invitrogen), pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res. 1990, 18(17): p5322; sua totalidade é incorporada aqui por referência), pEF, e pCDM8), vetores de expressão derivados de células de inseto. (pro exemplo, o "Bac-to-BAC baculovirus expression system" (GIBCO-BRL) e pBacPAK8), vetores de expressão derivados de planta (por exemplo, pMH1 e pMH2), vetores de expressão derivados de víros de animal (por exemplo, pHSV, pMV, e pAdexLcw), vetores de expressão retroviral (por exemplo, pZIPneo), vetores de expressão de fermento (por exemplo, "Pichia Expression Kit" (Invitro- gen), pNV11, e SP-Q01), e vetores de expressão de Bacillus subtilis (por exemplo, pPL608 e pKTH50), por exemplo.
[000256] Quando se visa expressão em células de animais tais como células CHO, COS e NIH3T3, os vetores devem ter um promotor essencial para expressão nas células, por exemplo, promotor SV40 (Mulligan et al., Nature (1979) 277: 108; sua totalidade é incorporada aqui por referência), promotor MTV-LTR r, promotor EF1D (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18: 5322; sua totalidade é incorporada aqui por referência), promotor CAG (Gene. (1990) 18: 5322; sua totalidade é incorporada aqui por referência), e promotor CMV, e mais preferivelmente eles têm um gene para selecionar células transformadas (por exemplo, um gene resistente a droga que permite avaliação usando um agente (neomina, G418, ou semelhante). Vetores com tais características incluem pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, e pOP13, por exemplo.
[000257] Além disso, o seguinte método pode ser usado para expressão de gene estável e amplificação de número de cópias em células: células CHO deficientes em uma via de síntese de ácido nucleico são introduzidas com um vetor que porta um gene DHFR que compensa a deficiência (por exemplo, pCHOI), e o vetor é amplificado usando metotrexato (MTX). Alternativamente, o seguinte método pode ser usado para expressão de gene transiente: células COS com um gene expressando antígeno SV40 T em seu cromossoma são transformadas com um vetor com uma origem de replicação SV40 (pcD e such). Origens de replicação derivadas de polyoma vírus, adenovirus, bovine papilloma virus (BPV), e semelhantes podem ser usados. Para amplificar número de cópia de gene em células hospedeiras, vetores de expressão podem ainda portar marcadores de seleção tais como gene aminoglicosidio transferase (APH), gene timidina quinase (TK), gene de E. coli xanthine-guanina phosphoribosiltransferase (Ecogpt) e o gene de di-idrofolate reductase (dhfr).
[000258] Anticorpos podem ser recolhidos, por exemplo, cultivando células transformadas, e depois separando os anticorpos do interior das células transformadas ou dos meios de cultura. Anticorpos podem ser separados e purificados usando se uma combinação apropriada de métodos tais como centrifugação, fracionamento de sulfato de amónio, salgamento, ultrafiltragem, 1q, FcRn, proteína A, coluna de proteína, cromatografia de afinidade, cromatografia de troca de íons, e cromato- grafia de filtragem de gel.
[000259] Além disso, a presente invenção fornece métodos para promover a eliminação de um antígeno causador de doença no plasma usando-se um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc da presente invenção e um domínio de ligação de antígeno que tem uma atividade de ligação com o antígeno e cuja atividade de ligação com o antígeno muda dependendo da condição de concentração de íon, em que o antígeno existe em uma forma solúvel em plasma.
[000260] Conforme descrito no documento no WO2011/122011, uma molécula de ligação de antígeno dependente de pH produzida modificando-se adicionalmente uma molécula de ligação de antígeno dependente de pH para aprimorar a ligação de FcRn da mesma sob uma condição neutra (pH 7,4) teve relatada sua capacidade de eliminar an- tígenos do plasma através de administração de um polipeptídeo que compreende tal domínio de ligação de antígeno, visto que a molécula tem um efeito de possibilitar ligação de antígeno repetida e um efeito de eliminar antígenos do plasma (WO2011/122011). Entretanto, como não há relatos de métodos para acelerar eliminação de antígeno além do método de aprimorar ligação de FcRn sob condições neutras.
[000261] Nos Exemplos, um polipeptídeo que compreende um domínio de ligação de antígenos cuja atividade de ligação de antígeno muda dependendo da condição de pH teve constatado que mostra a eliminação acelerada de antígenos no plasma através de ligação de FCYR quando comparado a quando apenas o antígeno existe, embora o polipeptídeo compreenda uma região Fc derivada de IgG1 nativa cuja ligação com FcRn na faixa de pH neutro não é aprimorada. Sem se restringir a uma teoria particular, o mecanismo a seguir é um exemplo da razão pela qual tais fenômenos ocorrem no clone 278 e similares.
[000262] Quando o sítio ao qual o domínio de ligação de antígeno pode ligar é um (ou seja, um homo-monômero) tal como em sIL-6R, duas moléculas de antígenos se ligam a uma molécula de anticorpo que compreende domínios de ligação de antígeno divalentes, e uma molécula de anticorpo anti-sIL-6R e duas moléculas de antígeno que compreendem duas unidades de ligação de antígeno formam um complexo. Portanto, esse tipo de complexo de antígeno-anticorpo tem apenas uma região Fc (região Fc IgG1 nativa) conforme mostrado na Figura 9. Visto que o complexo liga a duas moléculas de FcRn ou uma molécula de FcyR através de uma única região Fc, afinidades para esses receptores são as mesmas daquelas de anticorpos de IgG normais, e captação em células pode ser considerado ocorrer na maioria das vezes de modo não específico.
[000263] Por outro lado, quando epítopos aos quais o domínio de ligação de antígeno se liga estão presentes em dois sítios em um antí- geno tal como quando um antígeno é um complexo heterodimérico de cadeias pesadas e leves, por exemplo, IgE humano, ligação de cada um dos domínios de ligação de antígeno bivalentes em uma única molécula de anticorpo anti-IgE com cada uma das duas unidades de epí- topos em uma única molécula de IgE pode ser difícil em termos de colocação de epítopo e similares. Como resultado, considera-se que um complexo de antígeno-anticorpo (complexo imunológico) que compreende pelo menos quatro moléculas (ou seja, duas moléculas de IgE, que são moléculas de antígeno, e duas moléculas de anticorpos de anti-IgE, que são polipeptídeos que compreendem o domínio de ligação de antígeno) é formado pela ligação de uma molécula de anticorpo de anti-IgE separada com duas unidades de ligação de antígeno presentes em duas moléculas de IgE que ligam ao domínio de ligação de antígeno bivalente presente em uma única molécula de anticorpo de anti-IgE.
[000264] Quando um polipeptídeo que compreende um domínio de ligação de antígeno tal como um anticorpo que se liga a uma molécula de antígeno que compreende dois ou mais sítios aos quais um domínio de ligação de antígeno pode se ligar forma um grande complexo imunológico que é pelo menos um tetramer, tal complexo imunológico pode ligar fortemente com avidez através de pelo menos duas ou mais regiões de Fc multivalentes a FCYR, FcRn, receptor complementar, e similares. Por outro lado, quando uma molécula de antígeno tem um sítio ao qual o domínio de ligação de antígeno pode ligar, a afinidade mediada por região Fc de complexos imunológicos formados entre a molécula de antígeno e o polipeptídeo que compreendem um domínio de ligação de antígeno para esses receptores é insuficiente quando comparado a quando os complexos imunológicos mencionados acima são formados. Mais especificamente, o complexo imunológico é incorporado de modo muito eficiente por células que expressam esses re- ceptores.
[000265] Quando uma molécula de antígeno compreende dois ou mais sítios que se ligam a um domínio de ligação de antígeno, um po- lipeptídeo da presente invenção, no caso em que o polipeptídeo é, por exemplo, um anticorpo, forma complexos de antígeno-anticorpo (complexos imunológicos) que compreendem pelo menos quatro moléculas (duas moléculas de antígeno e duas moléculas de anticorpo) no plasma, e quando os complexos imunológicos são incorporados em células, os antígenos dissociam dos anticorpos no endossomo em que a condição de concentração de íon é diferente daquela no plasma conforme o polipeptídeo da presente invenção tem um domínio de ligação de antígeno cuja ligação de antígeno varia dependendo da condição de concentração de íon tal como ligação dependente de pH. Portanto, os complexos imunológicos formados são eliminados no endossomo de células nas quais os complexos imunológicos foram incorporados. Visto que os antígenos dissociados não podem ligar a FcRn no endos- somo, os mesmos são degradados após serem transferidos para o li- sossomo. Por outro lado, os anticorpos que dissociam do antígeno podem ser reciclados no plasma após ligar a FcRn no endossomo. A reciclagem similar é possível com o uso de uma condição de concentração de íon diferente da condição de pH conforme descrito na Exemplos, e Exemplos de Referência 3 a 6 mostram que a eliminação de antígenos no plasma pode ser acelerada com o uso de um domínio de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno muda dependendo da condição de concentração de cálcio em vez da condição dependente de pH.
[000266] Portanto, quando um complexo imunológico formado por antígenos e polipeptídeos que compreende um domínio de ligação de antígeno para o antígeno é um complexo que compreende duas ou mais regiões de Fc multivalentes para FCYR, FcRn, receptor comple- mentar, e similares, o complexo pode acelerar a eliminação dos antí- genos.
[000267] Além disso, os exames de Exemplos de Referência 7 a 9 mostram que entre os FCYRS, FcyRIIB que é um FCYR inibitório faz a maior contribuição para a eliminação de antígenos através de FCYR. Mais especificamente, até mesmo se a ligação de FcyR é diminuída, a capacidade de um anticorpo eliminar antígenos através de FcyR pode ser mantida desde que a ligação de FcyRIIB possa ser mantida.
[000268] Atualmente, os efeitos colaterais devido a interações entre IgG e FcyR têm sido relatados para diversos anticorpos terapêuticos. Por exemplo, no grupo de pacientes que foram administrados com be- vacizumab, um anticorpo contra VEGF, frequência para desenvolvimento de tromboembolismo é conhecido por aumentar (J. Natl. Cancer Inst. (2007) 99 (16), 1232-1239). Além disso, tromboembolismo tem sido observado de modo similar em testes de desenvolvimento clínicos de anticorpos contra o ligante CD40, e o teste clínico foi interrompido (Arthritis. Rheum. (2003) 48 (3), 719-727). FcyRIIa, um receptor FCY de ativação, é expresso em células de plaqueta, enquanto FcyRIIb, um receptor Fcy inibitório, não é expresso (J. Exp. Med. (2006) 203 (9), 2157-2164); e estudos recentes com o uso de modelos de animal e similares sugeriram que ambos os anticorpos administrados agregam plaquetas através de ligação com FcyRIIa nas plaquetas, resultando na formação de coágulos de sangue (J. Thromb. Haemost. (2009) 7 (1), 171-181; e J. Immunol. (2010) 185 (3), 1577-1583). Em pacientes com lupus eritematoso sistêmico que é uma doença autoimune, as plaquetas são ativadas através de um mecanismo dependente de FcyRIIa, e ativação de plaqueta foi relatada correlacionar com a severidade de sintomas (Sci. Transl. Med. (2010) 2 (47), 47-63).
[000269] Adicionalmente, foi relatado atualmente que através de estudos com o uso de modelos de animal, um complexo imunológico se formado entre um anticorpo e um antígeno multivalente induziu anafi- laxia através de FCYRS de ativação (Bruhns P., Blood. (2012) 119(24): 5640-9).
[000270] A captação de complexos imunológicos formados entre um antígeno multivalente e um anticorpo através de FcyR de ativação tem sido relatada aumentar produção de título de anticorpo para o antígeno (Scand J Immunol. (2006) 64(3): 177-84.; J Immunol. (1999) 163: 61822). Isso sugere a possibilidade de que os anticorpos contra o anticorpo terapêutico por si são prováveis de serem produzidos para anticorpos terapêuticos que reconhecem antígenos multivalentes. Quando anticorpos contra um anticorpo terapêutico são produzidos, cinética no sangue piora e os efeitos podem ser enfraquecidos.
[000271] Desse modo, através da ligação de anticorpos com antíge- nos multivalentes para formar complexos imunológicos, esses complexos imunológicos podem induzir vários efeitos colaterais interagindo-se com FcyR de ativação, e diminuir o valor do anticorpo como produto farmacêutico. Exemplos de antígenos multivalentes (antígenos multi- méricos) incluem GDF, GDF-1, GDF-3 (Vgr-2), GDF-5 (BMP-14, CDMP-1), GDF-6 (BMP-13, CDMP-2), GDF-7 (BMP-12, CDMP-3), GDF-8 (miostatina), GDF-9, GDF-15 (MIC-1), TNF, TNF-alfa, TNF- alfa/beta, TNF-beta 2, TNFSF10 (TRAIL Apo-2 ligante, TL2), TNFSF11 (TRANCE/RANK ligante ODF, OPG ligante), TNFSF12 (TWEAK Apo-3 ligante, DR3 ligante), TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF13B (BAFF BLYS, TALL1, THANK, TNFSF20), TNFSF14 (LIGHT HVEM ligante, LTg), TNFSF15 (TL1A/VEGI), TNFSF18 (GITR ligante AITR ligante, TL6), TNFSF1A (TNF-a Conectina, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-b LTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTb TNFC, p33), TNFSF4 (OX40 ligante gp34, TXGP1), TNFSF5 (CD40 ligante CD154, gp39, HIGM1, IMD3, TRAP), TNFSF6 (Fas ligante Apo-1 ligante, APT1 ligante), TNFSF7 (CD27 ligante CD70), TNFSF8 (CD30 ligante CD153), TNFSF9 (4-1BB ligante CD137 ligante), VEGF, IgE, IgA, IgG, IgM, RANKL, TGF-alfa, TGF-beta, TGF-beta Pan Specific, e IL-8.
[000272] Os métodos para solucionar essas questões podem ser métodos de atenuar ligação de FCYR. Entretanto, se a ligação com todos FCYRS for atenuada, aceleração de eliminação de antígeno através de FcyRs pode não ser possível com o uso daquele anticorpo.
[000273] Conforme descrito anteriormente, visto que dentre os FCYRS, FcyRIIB desempenha uma função principal em eliminação de antígeno mediada por FcyR através de anticorpos e efeitos colaterais devido a interações de FcyR são causados por interações com FcyRs de ativação, é possível produzir excelentes anticorpos com efeitos colaterais diminuídos ativando-se FcyRs sem perder a capacidade de eliminar antígenos atenuando-se de modo seletivo ligação com outros FCYRS de ativação enquanto mantém a ligação de FcyRIIB.
[000274] Portanto, um efeito excelente para promover a eliminação de antígenos solúveis que causam doença do plasma pode ser alcançado através de polipeptídeos que compreendem uma variante de região Fc da presente invenção e um domínio de ligação de antígeno cuja atividade de ligação com o antígeno muda de acordo com a condição de concentração de íon.
[000275] Além disso, usando-se os polipeptídeos da presente invenção, efeitos similares podem ser alcançados até mesmo se os antíge- nos aos quais os polipeptídeos se ligam tiverem apenas um sítio que pode se ligar a um domínio de ligação de antígeno (antígeno monomé- rico).
[000276] Tal exemplo inclui o método para promover a eliminação de antígenos monoméricos do plasma com o uso de um coquetel de poli- peptídeos que compreendem domínios de ligação de antígeno.
[000277] Conforme descrito acima, quando um antígeno é um antí- geno multimérico (um exemplo não limitante é uma imunoglobulina tal como IgA ou IgE, ou um membro da superfamília de TNF tal como TNF ou CD154), um grande complexo imunológico que compreende duas ou mais moléculas de ligação de antígeno e duas ou mais unidades de ligação de antígeno podem ser formadas. Por outro lado, até mesmo quando um antígeno é um antígeno monomérico, uma mistura de polipeptídeos que compreende dois ou mais domínios de ligação de antígeno apropriados que se ligam individualmente a diferentes epíto- pos presentes no antígeno monomérico, em que a ligação com os epí- topos varia dependendo da condição de concentração de íon (tal como pH ou Ca), também pode ter a capacidade de formar grandes complexos imunológicos que compreendem um polipeptídeo que tem dois ou mais domínios de ligação de antígeno, e dois ou mais sítios de ligação para domínios de ligação de antígeno (antígenos monoméricos). No presente documento, uma mistura de polipeptídeos que compreende dois ou mais domínios de ligação de antígeno apropriados que se ligam individualmente a diferentes epítopos presentes no antígeno mo- nomérico, em que ligação das moléculas de ligação de antígeno aos epítopos varia dependendo da condição de concentração de íon (tal como pH ou Ca) é chamada um coquetel de molécula de ligação de antígeno. Entre esses polipeptídeos que compreendem domínio de ligação de antígeno, pelo menos um dentre (domínios de ligação de antígeno contidos em) os polipeptídeos que formam o complexo imu- nológico tem que ser um domínio de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno varia de acordo a condição de concentração de íon.
[000278] Outros exemplos incluem métodos para promover a eliminação de antígenos monoméricos de plasma com o uso de um poli- peptídeo que compreende domínios de ligação de antígeno multiespe- cíficos ou multiparatópicos.
[000279] Alternativamente, até mesmo quando o antígeno é um antí- geno monomérico, cada domínio de ligação de antígeno contido em um polipeptídeo que compreende domínios de ligação de antígeno que se ligam individualmente a diferentes epítopos presentes no antígeno monomérico, e moléculas de ligação de antígeno que compreendem domínios de ligação de antígeno em que a ligação de epítopo dos domínios de ligação de antígeno individuais varia de acordo com a con-dição de concentração de íon (tal como pH ou Ca), também pode ter a capacidade de formar um grande complexo imunológico que compreende um polipeptídeo contendo dois ou mais domínios de ligação de antígeno e duas ou mais unidades de ligação de antígeno (antígenos monoméricos). Exemplos de uma modalidade não limitante de tal poli- peptídeo incluem anticorpos multiespecíficos ou multiparatópicos que compreendem regiões variáveis apropriadas que ligam individualmente a diferentes epítopos presentes em um antígeno monomérico. Como uma modalidade não limitante de tais anticorpos multiespecíficos ou anticorpos multiparatópicos, anticorpos cujas regiões variáveis mostram ligação dependente de pH ou Ca (anticorpos bisepecíficos ou anticorpos biparatópicos que compreendem uma região variável de lado direito que reconhece epítopo A e uma região variável de lado esquerdo que reconhece epítopo B, conforme mostrado na Figura 19) também podem ter a capacidade de formar grandes complexos imunológi- cos que compreendem dois ou mais anticorpos e duas ou mais unidades de ligação de antígeno (antígenos monoméricos).
[000280] Uma molécula de ligação de antígeno que acelera adicionalmente a eliminação de antígenos monoméricos do plasma pode ser obtida realizando-se triagem de combinações de domínios de ligação de antígeno que alvejam diferentes epítopos de um antígeno monomé- rico, em que a atividade para ligar com cada um dos epítopos varia dependendo da condição de concentração de íon, e os domínios de ligação de antígeno podem ligar com avidez aos receptores mencio- nados acima. A condição de concentração de íon que muda a atividade de ligação do domínio de ligação de antígeno multiespecífico ou multiparatópico com cada um dos epítopos pode ser a mesma condição de concentração de íon ou uma condição de concentração de íon diferente. Por exemplo, uma molécula de ligação de antígeno que compreende domínios de ligação de antígeno biespecíficos ou bipara- tópicos, em que a atividade de ligação de epítopo de um dos domínios de ligação de antígeno varia dependendo da condição de pH ou condição de concentração de íon de metal tal como concentração de íon de Ca, pode ser exemplificado como uma modalidade não limitante da molécula de ligação de antígeno da presente invenção. Além disso, por exemplo, uma molécula de ligação de antígeno que compreende domínios de ligação de antígeno biespecíficos ou biparatópicos, em que a atividade de ligação de epítopo de um dos domínios de ligação de antígeno varia dependendo da condição de pH e a atividade de ligação de epítopo do outro domínio de ligação de antígeno varia dependendo da condição de concentração de íon de metal tal como concentração de íon de Ca, também ser exemplificada como uma modalidade não limitante da molécula de ligação de antígeno da presente invenção. Uma molécula de ligação de antígeno que compreende domínios de ligação de antígeno biespecíficos ou biparatópicos, em que a atividade de ligação de epítopo de um dos domínios de ligação de antígeno varia dependendo da condição de pH e a atividade de ligação de epítopo do outro domínio de ligação de antígeno também varia dependendo da condição de pH, também pode ser exemplificada como uma modalidade não limitante da molécula de ligação de antígeno da presente invenção. Uma molécula de ligação de antígeno de polipeptí- deo que compreende domínios de ligação de antígeno biespecíficos ou biparatópicos, em que a atividade de ligação de epítopo de um dos domínios de ligação de antígeno varia dependendo da condição de concentração de íon de metal tal como concentração de íon de Ca, e a atividade de ligação de epítopo do outro domínio de ligação de antíge- no também varia dependendo da condição de concentração de íon de metal tal como concentração de íon de Ca, também pode ser exemplificada como uma modalidade não limitante da molécula de ligação de antígeno da presente invenção.
[000281] Como para um polipeptídeo que compreende domínios de ligação de antígeno multiespecíficos ou uma molécula de polipeptídeo que compreende domínios de ligação de antígeno multiparatópicos da presente invenção, um polipeptídeo que compreende pelo menos dois domínios de ligação de antígeno, em que pelo menos um dos domínios de ligação de antígeno se liga a um primeiro epítopo em uma molécula de antígeno, e pelo menos outro um dos domínios de ligação de antígeno se liga a um segundo epítopo na molécula de antígeno, é chamado de uma molécula de ligação de antígeno multiespecífica a partir do ponto de vista da especificidade de reação da mesma. Quando uma única molécula de ligação de antígeno se liga a dois epítopos diferentes através de dois tipos de domínios de ligação de antígeno compreendidos na molécula de ligação de antígeno, essa molécula é chamada de uma molécula de ligação de antígeno biespecífica. Quando uma única molécula de ligação de antígeno se liga a três diferentes epítopos através de três tipos de domínios de ligação de antígeno compreendidos na molécula de ligação de antígeno, essa molécula é chamada de uma molécula de ligação de antígeno triespecífica.
[000282] Um paratopo no domínio de ligação de antígeno que liga ao primeiro epítopo na molécula de antígeno e um paratopo no domínio de ligação de antígeno que liga ao segundo epítopo estruturalmente diferente do primeiro epítopo são paratopos que têm estruturas diferentes. Portanto, uma molécula de ligação de antígeno que compreende pelo menos dois domínios de ligação de antígeno, em que pelo menos um dos domínios de ligação de antígeno se liga a um primeiro epítopo em uma molécula de antígeno, e pelo menos outro um dentre os domínios de ligação de antígeno se liga a um segundo epítopo na molécula de antígeno, é chamada de uma molécula de ligação de an- tígeno multiparatópica a partir do ponto de vista da especificidade estrutural da mesma. Quando uma única molécula de ligação de antíge- no se liga a dois diferentes epítopos através de dois tipos de domínios de ligação de antígeno compreendidos na molécula de ligação de an- tígeno, essa molécula é chamada de uma molécula de ligação de antí- geno biparatópica. Quando uma única molécula de ligação de antíge- no se liga a três epítopos diferentes através de três tipos de domínios de ligação de antígeno compreendidos na molécula de ligação de an- tígeno, essa molécula é chamada de uma molécula de ligação de antí- geno triparatopica.
[000283] As moléculas de ligação de antígeno multivalentes multies- pecíficas ou multiparatópicas que compreendem um ou mais domínios de ligação de antígeno e os métodos de preparação das mesmas são descritos em documentos Não Patente tal como Conrath et al., (J. Biol. Chem. (2001) 276 (10) 7346-7350), Muyldermans (Rev. Mol. Biotech. (2001) 74, 277-302), e Kontermann R.E. (2011) Bispecific Antibodies (Springer-Verlag), e nos Documentos de Patente tais como no WO1996/034103 e no WO1999/023221. As moléculas de ligação de antígeno da presente invenção podem ser produzidas com o uso de moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas ou multiparatópicas e métodos de preparação descritos nesses documentos.
[000284] Os anticorpos biespecíficos e métodos para produzir os mesmos são apresentados abaixo como exemplos de uma modalidade das moléculas de ligação de antígeno multiespecíficas ou multiparató- picas supramencionadas e os métodos de preparação das mesmas. Os anticorpos biespecíficos são anticorpos que compreendem dois tipos de regiões variáveis que se ligam especificamente a diferentes epítopos. Os anticorpos biespecíficos do tipo IgG podem ser secreta- dos de uma hibridoma híbrida (quadroma) produzida fundindo-se dois tipos de hibridomas que produzem anticorpos IgG (Milstein et al., Nature (1983) 305, 537-540).
[000285] Quando um anticorpo biespecífico é produzido usando-se técnicas de recombinação tais como aquelas descritas na seção mencionada acima de anticorpos, pode-se adotar um método que introduz cadeias pesadas de codificação de genes contendo os dois tipos de regiões variáveis de interesse em células para co-expressar as mesmas. Entretanto, até mesmo quando apenas a cadeia pesada de combinação é considerada, tal método de co-expressão produzirá uma mistura de (i) uma combinação de um par de cadeias pesadas em que uma das cadeias pesadas contém uma região variável que se liga a um primeiro epítopo e a outra cadeia pesada contém uma região vari-ável que se liga a um segundo epítopo, (ii) uma combinação de um par de cadeias pesadas que incluem apenas cadeias pesadas contendo uma região variável que se liga ao primeiro epítopo, e (iii) uma combinação de um par de cadeias pesadas que incluem apenas cadeias pesadas contendo uma região variável que se liga ao segundo epítopo, que estão presentes a uma razão molecular de 2:1:1. É difícil purificar moléculas de ligação de antígeno contendo a combinação desejada de cadeias pesadas a partir da mistura de três tipos de combinações de cadeia pesada.
[000286] Ao produzir anticorpos biespecíficos com o uso de técnicas de recombinação tais como descritas acima, os anticorpos biespecífi- cos que compreendem a hetero combinação de cadeias pesadas podem ser preferencialmente secretados alterando-se o domínio de CH3 que constitui uma cadeia pesada com o uso de substituições de ami- noácido apropriadas. Especificamente, é um método para aprimorar a formação de cadeia pesada heterogênea e inibir a formação de cadeia pesada homogênea substituindo-se cadeia lateral de aminoácido em um domínio de CH3 de cadeia pesada com uma cadeia lateral mais volumosa (knob (que significa "projeção")) enquanto substitui cadeia lateral de aminoácido no outro domínio de CH3 de cadeia pesada com uma cadeia lateral menor (orifício (que significa "folga")) de modo que o "knob" seja colocado no "orifício" (no WO 1996/027011, Ridgway et al. (Protein Engineering (1996) 9, 617-621), Merchant et al. (Nat. Biotech. (1998) 16, 677-681)).
[000287] Adicionalmente, as técnicas conhecidas para produzir anticorpos biespecíficos incluem aquelas em que um meio para regular associação de polipeptídeo ou associação para formar multimeros he- teroméricos constituído por polipeptídeos é aplicado à associação de cadeias pesadas. Especificamente, para produzir anticorpos biespecí- ficos, pode-se usar métodos para regular associação de cadeia pesada alterando-se resíduos de aminoácido que formam interface entre cadeias pesadas de modo a formar duas cadeias pesadas com diferentes sequências, enquanto inibe a associação de cadeias pesadas que tem uma sequência idêntica (WO 2006/106905). Tais métodos podem ser usados para produzir anticorpos biespecíficos.
[000288] Além disso, uma técnica para obter anticorpos biespecíficos obtendo-se individualmente dois tipos de anticorpos monoclonais, e combinando os mesmos in vitro na presença de um agente de redução foi relatado no documento no (WO2008/119353). Nessa técnica, dois tipos de anticorpos monoclonais são clivados em meias moléculas pelo agente de redução, e reagrupando-se os mesmos, os anticorpos biespecíficos são obtidos em uma determinada taxa. Além disso, os métodos para obter anticorpos biespecíficos de modo mais eficiente substituindo-se aminoácidos presentes no domínio de CH3 para regular o reagrupamento das meias moléculas foram relatados no docu- mento no (WO2011/131746). Tais métodos também podem ser empregados ao produzir anticorpos biespecíficos.
[000289] Na presente invenção, "promover a eliminação de antíge- nos do plasma" se refere ao aperfeiçoamento da capacidade de eliminar antígenos do plasma quando um polipeptídeo que compreende os domínios de ligação de antígeno (doravante também denominado molécula de ligação de antígeno) é administrada in vivo ou quando uma molécula de ligação de antígeno é secretada in vivo. Assim, significa que quando as moléculas de ligação de antígeno são administradas, a taxa de eliminação de antígeno do plasma é acelerada quando comparada a quando uma molécula de ligação de antígeno que compreende um domínio de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antí- geno não varia dependendo de concentrações de íon, uma molécula de ligação de antígeno que compreende um domínio de ligação de FcRn sem atividade de ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido, ou uma molécula de ligação de antígeno que compreende um domínio de ligação de receptor FCY sem atividade de ligação seletiva a um receptor FCY é administrada. Se a capacidade ou não de uma molécula de ligação de antígeno para eliminar antígenos no plasma aumentou pode ser determinado, por exemplo, administrando- se antígenos solúveis e a molécula de ligação de antígeno in vivo e, então, medindo a concentração de plasma do antígeno solúvel após a administração. Quando a concentração dos antígenos solúveis no plasma é diminuída após administração dos antígenos solúveis e a molécula de ligação de antígenos que compreende um domínio de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno varia dependendo de condições de concentração de íon, o domínio de ligação de FcRn que tem atividade de ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido, e um domínio de ligação de receptor Fcy que tem atividade de ligação seletiva a um receptor Fcy (um domínio de ligação de FCYR seletivo), a capacidade de a molécula de ligação de antíge- nos eliminar antígenos no plasma é julgada ser aumentada. Aqui, o domínio de ligação de FCYR seletivo se refere a um domínio cuja ligação para FCYRS de ativação é diminuída enquanto a ligação com FcyRIIb é mantida. O antígeno solúvel pode ser um antígeno que é ligado a uma molécula de ligação de antígeno ou um antígeno que não é ligado a uma molécula de ligação de antígeno no plasma, e its concentração pode ser determinada como uma "concentração de plasma do antígeno ligado à molécula de ligação de antígeno" ou como uma "concentração de plasma do antígeno não ligado à molécula de ligação de antígeno", respectivamente (o último é sinônimo com "concentração de antígeno livre no plasma"). A "concentração de antígeno to-tal no plasma" significa a soma de concentrações do antígeno ligado à molécula de ligação de antígeno e o antígeno não ligado por uma molécula de ligação de antígeno, ou a "concentração de antígeno livre no plasma" que é a concentração do antígeno não ligado por uma molécula de ligação de antígeno. Desse modo, a concentração de antígeno solúvel pode ser determinada como a "concentração de antígeno total no plasma". Vários métodos para medir a "concentração total de antí- geno no plasma" ou a "concentração de antígeno livre no plasma" são bem conhecidos na técnica conforme descrito doravante.
[000290] Na presente invenção, "aprimoramento de farmacocinética", "aperfeiçoamento de farmacocinética" e "farmacocinética superior" podem ser reestabelecidos como "aprimoramento de retenção de plasma (sangue) ", "aperfeiçoamento de retenção de plasma (sangue) ", "retenção de plasma superior (sangue)", e "retenção de plasma prolongado (sangue)". Esses termos são sinônimos.
[000291] Na presente invenção, "aperfeiçoamento de farmacocinéti- ca" significa não só o prolongamento do período até a eliminação do plasma (por exemplo, até a molécula de ligação de antígeno ser de- gradada de modo intracelular ou similar e não pode retornar para o plasma) após administração da molécula de ligação de antígeno em seres-humanos, ou animais não seres-humanos tais como camundongos, ratos, macacos, coelhos e cães, mas também prolongamento da retenção de plasma da molécula de ligação de antígeno em uma forma que permita ligação de antígeno (por exemplo, em uma forma livre de antígeno da molécula de ligação de antígeno) durante o período de administração para eliminação devido à degradação. IgG humano que tem região Fc nativa pode ligar a FcRn de animais não seres- humanos. Por exemplo, os camundongos podem ser preferencialmente usados para serem administrados a fim de confirmar a propriedade da molécula de ligação de antígeno da invenção visto que IgG humano que tem região Fc nativa pode ligar a FcRn de camundongo mais forte do que a FcRn de humano (Int Immunol. (2001) 13(12): 1551-1559). Conforme outro exemplo, o camundongo em que os genes de FcRn nativos do mesmo são rompidos e um transgene para gene de FcRn humano é abrigado para ser expresso (Métodos Mol Biol. 2010; 602: 93-104) também pode ser preferencialmente usado para ser administrado a fim de confirmar a propriedade da molécula de ligação de antí- geno da invenção descrita doravante. Especificamente, "aperfeiçoamento de farmacocinética" também inclui prolongamento do período até eliminação devido à degradação da molécula de ligação de antíge- no não ligada a antígenos (a forma livre de antígeno de molécula de ligação de antígeno). A molécula de ligação de antígeno no plasma não pode se ligar a um novo antígeno se a molécula de ligação de an- tígeno já tiver ligado a um antígeno. Desse modo, quanto mais longo o período que a molécula de ligação de antígeno não é ligada a um antí- geno, mais longo o período que a mesma pode ligar a um novo antí- geno (maior a chance de ligar a outro antígeno). Isso possibilita a redução do período de tempo que um antígeno é livre da molécula de ligação de antígeno in vivo e prolongamento do período que um antí- geno é ligado à molécula de ligação de antígeno. A concentração de plasma da forma livre de antígeno de molécula de ligação de antígeno pode ser aumentada e o período que o antígeno é ligado à molécula de ligação de antígeno pode ser prolongado acelerando-se a eliminação de antígeno do plasma através de administração da molécula de ligação de antígeno. Especificamente, "aperfeiçoamento da farmacoci- nética de molécula de ligação de antígeno" na presente invenção inclui o aperfeiçoamento de um parâmetro farmacocinético da forma livre de antígeno da molécula de ligação de antígeno (qualquer um dentre prolongamento da meia vida no plasma, prolongamento de tempo de re-tenção médio no plasma, e dano de depuração de plasma), prolongamento do período que o antígeno é ligado à molécula de ligação de antígeno após administração da molécula de ligação de antígeno, e aceleração de eliminação de antígeno mediado por molécula de ligação de antígeno a partir do plasma. O aperfeiçoamento de farmacoci- nética de molécula de ligação de antígeno pode ser estimado determinando-se qualquer um dos parâmetros, meia vida no plasma, tempo e retenção de plasma médio, e depuração de plasma para a molécula de ligação de antígeno ou a forma livre de antígeno da mesma ("Farma- cocinética: Enshu-niyoru Rikai (Understanding through practice)" Nan- zando). Por exemplo, a concentração de plasma da molécula de ligação de antígeno ou forma livre de antígeno da mesma é determinada após administração da molécula de ligação de antígeno em camundongos, ratos, macacos, coelhos, cachorro ou seres-humanos. Então, cada parâmetro é determinado. Quando a meia vida de plasma ou tempo de retenção médio de plasma é prolongado, a farmacocinética da molécula de ligação de antígeno pode ser julgada ser aperfeiçoada. Os parâmetros podem ser determinados por métodos conhecidos àqueles versados na técnica. Os parâmetros podem ser estimados de modo apropriado, por exemplo, através de análise não compartimental com o uso do software de análise de farmacocinética WinNonlin (Pharsight) de acordo com o manual de instrução anexo. A concentração de plasma de molécula de ligação de antígeno livre de antígeno pode ser determinada por métodos conhecidos àqueles versados na técnica, por exemplo, com o uso do método de ensaio descrito em Clin Pharmacol. 2008 Apr; 48 (4): 406-417.
[000292] Na presente invenção, "aperfeiçoamento de farmacocinéti- ca" também inclui prolongamento do período que um antígeno é ligado a uma molécula de ligação de antígeno após administração da molécula de ligação de antígeno. Se o período que um antígeno é ligado à molécula de ligação de antígeno após a administração da molécula de ligação de antígeno é prolongado pode ser estimado determinando-se a concentração de plasma de antígeno livre. O prolongamento pode ser julgado com base na concentração determinada de plasma de an- tígeno livre ou o período de tempo exigido para um aumento na razão de concentração de antígeno livre para a concentração de antígeno total.
[000293] A concentração de plasma de antígeno livre não ligado à molécula de ligação de antígeno ou a razão de concentração de antí- geno livre para a concentração total pode ser determinada por métodos conhecidos àqueles versados na técnica, por exemplo, pelo método usado em Pharm Res. 2006 Jan; 23 (1): 95-103. Alternativamente, quando um antígeno exibe uma função particular in vivo, se o antígeno é ligado ou não a uma molécula de ligação de antígeno que neutraliza a função de antígeno (molécula antagonística) pode ser estimado testando-se se a função de antígeno é neutralizada. Se a função de antí- geno é neutralizada ou não pode ser estimado ensaiando-se um mar-cador in vivo que reflete a função de antígeno. Se o antígeno é ligado ou não a uma molécula de ligação de antígeno que ativa a função de antígeno (molécula agonística) pode ser estimado ensaiando-se um marcador in vivo que reflete a função de antígeno.
[000294] A determinação da concentração de plasma de antígeno livre e razão da quantidade de antígeno livre no plasma para a quantidade de antígeno total no plasma, ensaio de marcador in vivo, e tais medições não são particularmente limitadas; entretanto, os ensaios são preferencialmente realizados após um determinado período de tempo ter passado após a administração da molécula de ligação de antígeno. Na presente invenção, o período após a administração da molécula de ligação de antígeno não é particularmente limitado; aqueles versados na técnica podem determinar o período apropriado dependendo das propriedades e similar da molécula de ligação de antí- geno administrada. Tais períodos incluem, por exemplo, um dia após a administração da molécula de ligação de antígeno, três dias após a administração da molécula de ligação de antígeno, sete dias após a administração da molécula de ligação de antígeno, 14 dias após a ad-ministração da molécula de ligação de antígeno, e 28 dias após a ad-ministração da molécula de ligação de antígeno. Na presente invenção, o conceito "concentração de antígeno de plasma" compreende tanto "concentração total de antígeno no plasma" que é a soma de an- tígeno ligado à molécula de ligação de antígeno e concentração de antígeno não ligado ou "concentração de antígeno livre no plasma" que é concentração de antígeno não ligado à molécula de ligação de antígeno.
[000295] A concentração de antígeno total no plasma pode ser diminuída através de administração, como molécula de ligação de antíge- no, da molécula de ligação de antígeno da presente invenção por 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes, 1.000 vezes, ou até mais quando comparado à administração de uma molécula de ligação de antígeno contendo um domínio de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno é independente de concentração de íon ou uma molécula de ligação de antígeno contendo uma região Fc com uma atividade de ligação de FCYR prejudicada, ou comparado a quando a molécula de domínio de ligação de antígeno da presente invenção não é administrada.
[000296] A razão molar de antígeno/molécula de ligação de antígeno pode ser calculada conforme mostrado abaixo: valor A: concentração molar de antígeno em cada ponto de tempo valor B: concentração molar de molécula de ligação de an- tígeno em cada ponto de tempo valor C: concentração molar de antígeno por concentração molar de molécula de ligação de antígeno (razão molar de antíge- no/molécula de ligação de antígeno) em cada ponto de tempo C = A/B.
[000297] Um valor menor de C indica maior eficiência de eliminação de antígeno por molécula de ligação de antígeno enquanto um valor maior de C indica menor eficiência de eliminação de antígeno por molécula de ligação de antígeno.
[000298] A razão molar entre antígeno/molécula de ligação de antí- geno pode ser calculada conforme descrito acima.
[000299] Uma redução de 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 50 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 500 vezes, 1.000 vezes ou mesmo maior de razão molar entre antígeno/molécula de ligação de antígeno pode ser alcançada pela administração de uma molécula de ligação de antígeno da presente invenção quando comparada com quando uma molécula de ligação de antígeno que compreende um domínio de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno não varia dependendo das concentrações iônicas, uma molécula de ligação de an- tígeno que compreende um domínio de ligação de FcRn sem atividade de ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido, ou uma molécula de ligação de antígeno que compreende um receptor de domínio de ligação de FCY sem atividade de ligação seletiva para um receptor FCY é administrada como a molécula de ligação de antígeno.
[000300] Na presente invenção, uma molécula de ligação de antíge- no que compreende um domínio de ligação de antígeno cuja atividade de ligação de antígeno não varia dependendo das concentrações iôni- cas, uma molécula de ligação de antígeno que compreende um domínio de ligação de FcRn sem atividade de ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido, ou uma molécula de ligação de antíge- no que compreende um receptor de domínio de ligação de FCY sem atividade de ligação seletiva para um receptor FCY é usada como uma molécula de ligação de antígeno de referência para ser comparada com a molécula de ligação de antígenos da presente invenção.
[000301] Quando se avalia o efeito de um domínio de ligação de FcRn que tem uma atividade de ligação de FcRn sob uma condição de faixa de pH ácido, a redução de concentração de antígeno total em razão plasmática ou molar entre antígeno/anticorpo pode ser estimada tanto pelo modelo de coinjeção de antígeno e anticorpo ou modelo de infusão de antígeno em estado estacionário com o uso de linhagem 32 ou linhagem 276 de camundongo transgênico com FcRn humano (Jackson Laboratories, Methods Mol. Biol. (2010) 602, 93 a 104), quando a molécula de ligação de antígeno não sofre reação cruzada com o antígeno complemento de camundongo. Quando uma molécula de ligação de antígeno sofre reação cruzada com o complemento de camundongo, a mesma pode ser estimada simplesmente pela injeção de molécula de ligação de antígeno em linhagem 32 ou linhagem 276 de camundongo transgênico com FcRn humano (Jackson Laboratories). No modelo de coinjeção, a mistura de molécula de ligação de an- tígeno e antígeno é administrada ao camundongo. No modelo de infu são de antígeno em estado estacionário, uma bomba de infusão contendo solução de antígeno é implantada no camundongo para alcançar concentração de antígeno plasmática constante e, então, a molécula de ligação de antígeno é injetada no camundongo. A molécula de ligação de antígeno de teste é administrada na mesma dosagem. A concentração de antígeno total em plasma, a concentração de antígeno livre em plasma e a concentração de molécula de ligação de antígeno plasmática são medidas em ponto de momento adequado com o uso de método conhecido por aqueles versados na técnica.
[000302] Para avaliar os efeitos de um receptor de domínio de ligação de FCY que tem atividade de ligação seletiva a receptores de FCY, quando uma molécula de ligação de antígeno não sofre reação cruzada com um antígeno complemento de camundongo, a concentração de antígeno total em plasma ou diminui em razão molar entre antíge- no/anticorpo pode ser estimada tanto pelo modelo de injeção simultânea de antígeno-anticorpo ou pelo modelo de injeção de antígeno em estado estacionário com o uso dos camundongos C57BL/6J convencionalmente usados (Charles River Japão). Quando uma molécula de ligação de antígeno sofre reação cruzada com o complemento de camundongo, a molécula de ligação de antígeno pode simplesmente ser injetada nos camundongos C57BL/6J convencionalmente usados (Charles River Japão) para realizar a avaliação.
[000303] No modelo de coinjeção, uma mistura da molécula de ligação de antígeno e antígeno é administrada aos camundongos. Na modelo de infusão de antígeno em estado estacionário, uma bomba de infusão preenchida com uma solução de antígeno é embutida nos camundongos para alcançar uma concentração de antígeno plasmática constante e, então, a molécula de ligação de antígeno é injetada nos camundongos. Moléculas de ligação de antígeno de teste são administradas na mesma dose. A concentração de antígeno total em plasma, a concentração de antígeno livre em plasma e a concentração de molécula de ligação de antígeno em plasma são medidas em pontos de momento adequados com o uso de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica.
[000304] A concentração de antígeno total ou livre em plasma e a razão molar entre antígeno/molécula de ligação de antígeno podem ser medidas em 2 dias, 4 dias, 7 dias, 14 dias, 28 dias, 56 dias ou 84 dias após a administração para avaliar o efeito em longo prazo da presente invenção. Em outras palavras, uma concentração de antígeno plasmática em longo prazo é determinada pela medição da concentração de antígeno total ou livre em plasma e da razão molar entre antí- geno/molécula de ligação de antígeno em 2 dias, 4 dias, 7 dias, 14 dias, 28 dias, 56 dias ou 84 dias após a administração de uma molécula de ligação de antígeno a fim de avaliar a propriedade da molécula de ligação de antígeno da presente invenção. Se a redução de concentração de antígeno plasmática ou a razão molar entre antíge- no/molécula de ligação de antígeno é alcançada pela molécula de ligação de antígeno descrita na presente invenção, pode ser determinada pela avaliação da redução a quaisquer um ou mais dos pontos de tempo descritos acima.
[000305] A concentração de antígeno total ou livre em plasma e a razão molar entre antígeno/molécula de ligação de antígeno podem ser medidas em 15 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas ou 24 horas após a administração para avaliar o efeito em curto prazo da presente invenção. Em outras palavras, uma concentração de antígeno plasmática em curto prazo é determinada pela medição da concentração de antígeno total ou livre em plasma e da razão molar entre antígeno/molécula de ligação de antígeno em 5 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 8 horas, 12 horas ou 24 horas após a administração de uma molécula de ligação de antígeno a fim de avaliar a propriedade da molécula de ligação de antígeno da presente invenção.
[000306] A via de administração de uma molécula de ligação de an- tígeno da presente invenção pode ser selecionada dentre injeção in- tradérmica, intravenosa, intravítrea, subcutânea, intraperitoneal, parenteral e intramuscular.
[000307] Na presente invenção, o aperfeiçoamento de farmacocinéti- ca de molécula de ligação de antígeno em humano é preferencial. Quando a retenção plasmática em humano é difícil de determinar, a mesma pode ser prevista com base na retenção plasmática em camundongos (por exemplo, camundongos normais, camundongos transgênicos com expressão de antígeno humano, camundongos transgênicos com expressão de FcRn humano) ou macacos (por exemplo, macacos-cinomolgo).
[000308] "O aperfeiçoamento da farmacocinética e da retenção plasmática prolongada de uma molécula de ligação de antígeno" na presente invenção significa o aperfeiçoamento de qualquer parâmetro farmacocinético (qualquer dentre o prolongamento da meia vida em plasma, o prolongamento do tempo de retenção médio em plasma, redução de depuração plasmática e biodisponibilidade) após administração da molécula de ligação de antígeno in vivo ou um aumento na concentração da molécula de ligação de antígeno no plasma em um tempo apropriado após a administração. Isso pode ser determinado pela medição de qualquer parâmetro tal como meia vida em plasma, tempo de retenção médio em plasma, depuração plasmática e biodis- ponibilidade da molécula de ligação de antígeno (Farmacocinética: Enshu-niyoru Rikai (Understanding through practice), (Nanzando)). Por exemplo, quando uma molécula de ligação de antígeno é administrada a camundongos (camundongos normais e camundongos transgênicos com FcRn humano), ratos, macacos, coelhos, cachorros, seres- humanos e assim por diante, e a concentração da molécula de ligação de antígeno na plasma é determinada e cada um dos parâmetros é calculado, a farmacocinética da molécula de ligação de antígeno pode ser definida como aprimorada quando a meia vida plasmática ou o tempo de retenção médio no plasma é prolongado. Esses parâmetros podem ser determinados por métodos conhecidos àqueles versados na técnica. Por exemplo, os parâmetros podem ser estimados de modo apropriado por análise não compartimentada com o uso de software de análise farmacocinética WinNonlin (Pharsight) de acordo o manual de instruções anexo.
[000309] Quatro tipos de FCYRS, FcyRI, FcyRIIb, FcyRIII e FCYRIV, foram identificados em camundongos. Igualmente em seres-humanos, como os FcyRs correspondentes, FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIIa, FcyRIIIa e FcyRIIIb, foram identificados. O FcyRIIb, que é considerado ser o único tipo inibitório dentre esses FcyRs é conservado tanto em seres-humanos quanto em camundongos. Os outros FcyRs, exceto o FcyRIIIb, transmitem sinais de ativação através do motivo de ativação com base em tirosina de imunoreceptor (ITAM), enquanto o FcyRIIb transmite sinais inibitórios através do motivo de inibição com base em tirosina de imunoreceptor (ITIM) presentes no interior das células (Nat. Rev. Immunol. (2008) 8, 34 a 47).
[000310] O FcyRIIb1 e o FcyRIIb2 foram relatados como variantes de emenda do FcyRIIb. Tanto em seres-humanos quanto em camundongos, o FcyRIIb1 tem um domínio intracelular mais longo do que o FcyRIIb2. O FcyRIIb1 foi confirmado como sendo expresso em células B e o FcyRIIb2 foi confirmado como sendo expresso em macrófagos, mastócitos, células dendríticas, basófilos, neutrófilos e eosinófilos (J. Clin. Immunol. (2005) 25 (1), 1 a 18).
[000311] Até agora, em seres-humanos, a disfunção e a expressão diminuída de FcyRIIb foram relatadas como correlacionadas com o início de doenças autoimunes. Por exemplo, foi relatado que, em alguns pacientes de SLE, a ligação de ativadores transcricionais é atenuada devido ao polimorfismo em uma região promotora de expressão de FcyRIIb, o que resulta em expressão de FcyRIIb diminuída (Hum. Genet. (2005) 117, 220 a 227; J. Immunol. (2004) 172, 7192 a 7199; e J. Immunol. (2004) 172, 7186 a 7191). Além disso, dentre os pacientes de SLE, dois tipos de alótipos foram relatados, onde o aminoácido na posição 233 é Ile ou Thr em FcyRIIb. Essa posição existe na região transmembranar de FcyRIIb e é relatado que o FcyRIIb é menos propenso de existir na jangada lipídica (lipid raft) quando o aminoácido na posição 233 é Thr comparado a quando esse aminoácido é Ile e, como resultado, a função de transdução de sinal de FcyRIIb diminui (Nat. Med. (2005) 11, 1056 a 1058; Hum. Mol. Genet., (2005) 14, 2881 a 2892). Igualmente em camundongos, os camundongos knockout produzidos pela ruptura do gene FcyRIIb nos camundongos C57BL/6 foram relatados como apresentando sintomas similares a SLE, tais como autoprodução de anticorpo e glomerulonefrite (Immunity 13 (2000) 277 a 285; J. Exp. Med. (2002) 195, 1167 a 1174). Além disso, até agora, o nível de expressão reduzido de FcyRIIb e tais foram relatados em camundongos considerados como modelos com início natural de SLE (Immunogenetics (2000) 51, 429 a 435; Int. Immunol. (1999) 11, 1685 a 1691; Curr. Biol. (2000) 10, 227 a 230; J. Immunol. (2002) 169, 4340 a 4346). A partir desses relatos, o FcyRIIb é considerado como regulador de imunidade humoral em camundongos assim como em seres- humanos.
[000312] Quando um anticorpo que transporta um Fc da presente invenção elimina antígenos através de FcyRIIb, a função de endocitose de FcyRIIb é considerada como a que tem a contribuição mais importante dentre as funções de FcyRIIb. Conforme descrito acima, o FcyRIIb1 e o FcyRIIb2 existem como variantes de emenda de FcyRIIb, mas é relatado que o último está sobretudo envolvido na endocitose de um complexo imunológico de um anticorpo e antígeno (J. Immunol. (1994), 152 574 a 585; Science (1992) 256, 1808 a 1812; Cell (1989) 58, 317 a 327). Até agora, o FcyRIIb2 de camundongo foi relatado como estando incorporado em um caroço revestido de clatrato e endoci- tosado (Cell (1989) 58, 317 a 327). Além disso, foi relatado que um motivo de dileucina é necessário para a endocitose mediada por FcyRIIb2 e o motivo de dileucina é conservado tanto em seres humanos quanto em camundongos (EMBO J. (1994) 13 (13), 2963 a 2969). A partir disso, o FcyRIIb2 pode ter uma capacidade endocitótica em seres humanos assim como em camundongos.
[000313] Por outro lado, ao contrário do FcyRIIb2, foi relatado que o FcyRIIb1 não causa endocitose. O FcyRIIb1 tem uma sequência inserida no domínio intracelular do mesmo que não é encontrada no FcyRIIb2. É considerado que essa sequência inibe a absorção do FcyRIIb1 por um caroço revestido de clatrato e, como resultado, a en- docitose é inibida (J. Cell. Biol. (1992) 116, 875 a 888; J. Cell. Biol. (1989) 109, 3291 a 3302). Igualmente em seres humanos, o FcyRIIb1 tem uma sequência de inserção em um sítio similar ao do FcyRIIb2 em camundongos; portanto, a diferença na capacidade endocitótica entre o FcyRIIb1 e o FcyRIIb2 é presumida como sendo causada por um mecanismo similar. Além disso, tanto em seres humanos quanto em camundongos, aproximadamente 40% dos complexos imunológicos na superfície celular é relatado como absorvido pela célula em 20 minutos (Mol. Immunol. (2011) 49, 329 a 337; Science (1992) 256, 1808 a 1812). Portanto, igualmente em seres humanos, o FcyRIIb2 é presumido de absorver complexos imunológicos pelas células a taxas similares às encontradas em camundongos.
[000314] Uma vez que o FcyRIIb é o único que tem ITIM dentro da célula tanto em seres humanos quanto em camundongos dentre a família de FCYR e a distribuição de células de expressão é a mesma, é presumido que a função do mesmo em controle imunológico é similar. Além disso, considerando o fato de que os complexos imunológicos são absorvidos pelas células a taxas similares em seres humanos e em camundongos, os efeitos de eliminação de antígeno de anticorpos mediados por FcyRIIb em seres humanos pode ser previsível com o uso de camundongos. As moléculas de ligação de antígenos mF44 e mF46 têm propriedades de ligação a antígenos solúveis de uma maneira dependente de pH e têm aprimorado a afinidade a FcyRIIb e FcyRIII de camundongo comparadas à mIgG1, que é uma molécula de ligação de antígeno que tem a propriedade de ligação a um antígeno solúvel de uma maneira dependente de pH. De fato, isso é mostrado no Exemplo de Referência 7 em que a depuração plasmática de antí- geno aumentou quando mF44 ou mF46 foi administrada aos camundongos normais comparado com quando mIgG1 foi administrada.
[000315] Além disso, no Exemplo de Referência 8 descrito a seguir, um experimento similar foi executado com o uso de camundongos deficientes de cadeia Y de receptor Fc. Foi relatado que os FCYRS que não o FcyRIIb são expressos apenas na copresença de uma cadeia gama em camundongos. Dessa forma, apenas o FcyRIIb é expresso nos camundongos deficientes de cadeia y de receptor Fc. A administração de mF44 ou mF46, que é molécula de ligação de antígenos que têm a propriedade de ligação a antígenos solúveis de uma maneira dependente de pH, a camundongos deficientes de cadeia y de receptor Fc permite a avaliação de efeitos de eliminação-aceleração de an- tígeno quando a ligação de FcyRIIb é seletivamente aprimorada. A partir dos resultados do Exemplo de Referência 8, quando mF44 ou mF46 (que são molécula de ligação de antígenos que têm a propriedade de ligação a antígenos solúveis de uma maneira dependente de pH) foi administrada aos camundongos deficientes de cadeia y de receptor Fc, a depuração plasmática de antígeno foi mostrada como aumen- tando comparada a quando a mIgG1 (que é uma molécula de ligação de antígeno que tem a propriedade de ligação a antígenos solúveis de uma maneira dependente de pH) foi administrada ao camundongos. Além disso, os resultados do Exemplo de Referência 8 mostraram que, quando administrada a camundongos deficientes de cadeia Y de receptor Fc, a mF44 ou a mF46 causa graus de eliminação de antígeno similares a quando administrada a camundongos normais.
[000316] No Exemplo de Referência 8, um experimento similar foi executar com o uso de camundongos deficientes de FcyRIII. Uma vez que mIgG1, mF44 e mF46 se ligam apenas a FcyRIIb e FcyRIII dentre os mFcyRs, a administração de anticorpos aos camundongos deficientes de FcyRIII permite a avaliação de efeitos de eliminação-aceleração de antígeno quando a ligação FcyRIIb é seletivamente aprimorada. Os resultados do Exemplo de Referência 8 indicam que quando mF44 ou mF46 foi administrada aos camundongos deficientes de FcyRIII, a depuração plasmática de antígeno aumentou comparada a quando mIgG1 foi administrada aos camundongos. Além disso, os resultados do Exemplo de Referência 8 mostraram que, quando administrada a camundongos deficientes de FcyRIII, a mF44 ou a mF46 causa graus de eliminação de antígeno similares a quando administrada a camun-dongos deficientes de cadeia y de receptor Fc e quando administrada a camundongos normais.
[000317] Esses resultados revelaram que a eliminação de antígeno pode ser acelerada pelo aprimoramento seletivo de apenas a ligação ao FcyRIIb sem aprimorar a ligação aos FcyRs ativadores. Mais especificamente, isso mostra que o FcyRIIb está sobretudo envolvido na eliminação mediada por FcyR de complexos imunológicos e, desde que a ligação ao FcyRIIb dentre os FcyRs seja mantida, a eficiência de eliminação mediada por FcyR de complexos imunológicos pelo anticorpo pode também ser mantida.
[000318] Em adição aos documentos relatados mencionados até agora, com base nos resultados de avaliação acima mencionados com o uso de camundongos, é considerado que a absorção de complexos imunológicos pelas células através de FcyRIIb ocorre in vivo em seres humanos assim como em camundongos e, como resultado, os anticorpos que têm Fc com ligação aprimorada seletivamente ao FcyRIIb humano podem acelerar a eliminação dos antígenos. Além disso, conforme discutido acima, uma vez que a absorção de complexos imuno- lógicos pelas células através de FcyRIIb é considerada ocorrer a taxas similares em camundongos e humanos, os efeitos da aceleração da eliminação de antígeno comparável aos de anticorpos que tem Fc com afinidade aprimorada ao FcyRIIb de camundongo podem ser alcançados in vivo em seres humanos com o uso de um Fc no qual a afinidade ao FcyRIIb humano é aprimorada em uma medida similar.
[000319] A presente invenção também fornece um método para produzir um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc de anticorpo com atividades de ligação diminuídas para FCYRS de ativação enquanto mantém sua atividade de ligação de FcyRIIb, em comparação àquelas de um polipeptídeo que compreende uma região Fc precursora, em que o método compreende adicionar pelo menos uma alteração de aminoácido à variante de região Fc em um polipeptídeo que compreende variante de região Fc.
[000320] Os exemplos incluem um método de produção que compreende as etapas a seguir: (a) adicionar pelo menos uma alteração de aminoácido a uma região Fc em um polipeptídeo que compreende a região Fc; (b) medir a atividade de ligação de FcyRIIb e as atividades de ligação a FcyRs de ativação do polipeptídeo alterado na etapa (a); e (c) selecionar um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc com atividades de ligação diminuídas a FcyRs de ativação en- quanto mantém sua atividade de ligação de FcyRIIb em comparação àquelas de um polipeptídeo que compreende a região Fc precursora.
[000321] Uma modalidade preferencial é um método para produzir um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc, que compreende as etapas de: (a) alterar um ácido nucleico que codificar um polipeptídeo que compreende uma região Fc precursora de modo que as atividades de ligação a FCYRS de ativação sejam diminuídas enquanto a atividade de ligação de FcyRIIb é mantida em comparação àquelas do polipeptídeo; (b) introduzir o ácido nucleico em uma célula hospedeira e cultivar a célula para expressar um polipeptídeo; e (c) coletar o polipeptídeo da cultura de célula hospedeira.
[000322] Os anticorpos e moléculas de proteína de fusão Fc produzidos por esse método de produção estão também incluídos nesta invenção.
[000323] Além disso, a presente invenção fornece métodos para diminuir as atividades de ligação a todos os FcyRs de ativação, em particular FcyRIIa (tipo R), enquanto mantém a atividade de ligação de FcyRIIb em comparação àquelas da região Fc precursora, em que o método compreende a etapa de adicionar pelo menos uma alteração de aminoácido a uma variante de região Fc de anticorpo em um poli- peptídeo que compreende a variante de região Fc de anticorpo; ou um método para produzir um polipeptídeo que compreende a variante de região Fc da presente invenção.
[000324] Um exemplo inclui um método que compreende as etapas a seguir de: (a) adicionar pelo menos uma alteração de aminoácido a uma região Fc em um polipeptídeo que compreende a região Fc; (b) medir a atividade de ligação de FcyRIIa e a atividade de ligação de FcyRIIb do polipeptídeo alterado na etapa (a); e (c) selecionar um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc com uma atividade de ligação diminuída a FcyRIIa (tipo R) enquanto mantém sua atividade de ligação de FcyRIIb em comparação àquelas de um polipeptídeo que compreende a região Fc precursora.
[000325] Uma modalidade preferencial é um método para diminuir as atividades de ligação a todos os FCYRS, em particular FcyRIIa (tipo R), enquanto mantém a atividade de ligação de FcyRIIb de um polipeptí- deo que compreende uma região Fc precursora ou um método para produzir um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc, que compreende as etapas de: (a) alterar um ácido nucleico que codificar um polipeptídeo que compreende uma região Fc precursora de modo que sua atividade de ligação a FcyRIIa (tipo R) seja diminuída enquanto sua atividade de ligação de FcyRIIb é mantida em comparação àquelas do polipeptídeo; (b) introduzir o ácido nucleico em uma célula hospedeira e cultivar a célula para expressar um polipeptídeo; e (c) coletar o polipeptídeo da cultura de célula hospedeira.
[000326] Ademais, os anticorpos e moléculas de proteína de fusão Fc produzidos pelo método de produção estão também incluídos na presente invenção.
[000327] Além disso, a presente invenção fornece um método para suprimir a produção de anticorpos contra um polipeptídeo em comparação a um polipeptídeo que compreende uma região Fc precursora quando o polipeptídeo é administrado in vivo, em que o método compreende adicionar pelo menos uma alteração de aminoácido a uma região Fc em um polipeptídeo que compreende a região Fc ou um método para produzir polipeptídeos, em que a produção de anticorpos contra o polipeptídeo é suprimida.
[000328] Um exemplo inclui um método que compreende as etapas a seguir de: (a) adicionar pelo menos uma alteração de aminoácido a uma região Fc em um polipeptídeo que compreende a região Fc; e (b) confirmar que a administração do polipeptídeo que compreende a região Fc alterada na etapa (a) in vivo suprime a produção de anticorpo em comparação a quando um polipeptídeo que compreende a região Fc precursora é administrado.
[000329] Tais polipeptídeos podem ser úteis como produtos farmacêuticos já que podem suprimir a produção de anticorpo sem ativação de FCYRS de ativação.
[000330] No método mencionado acima, é preferencial que as atividades de ligação a todos os FCYRS de ativação, em particular FcyRIIa (tipo R), sejam diminuídas enquanto a atividade de ligação de FcyRIIb é mantida.
[000331] Em uma modalidade preferencial do método mencionado acima, por exemplo, em uma região Fc de IgG humana, a região Fc é alterada de modo que o aminoácido na posição 238 em conformidade com a numeração de EU seja alterado para outro aminoácido e pelo menos um aminoácido selecionado dentre os aminoácidos nas posições 235, 237, 241, 268, 295, 296, 298, 323, 324 e 330 da região Fc, em conformidade com a numeração de EU, seja alterado para outro aminoácido. Dois ou mais aminoácidos podem ser selecionados a partir do anterior e combinados conforme as outras alterações de aminoá- cido para serem combinados com a alteração de aminoácido na posição 238 em conformidade com a numeração de EU. As combinações preferenciais incluem (1) a (3) abaixo: (1) aminoácidos nas posições 241, 268, 296 e 324 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (2) aminoácidos nas posições 237, 241, 296 e 330 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; e (3) aminoácidos nas posições 235, 237, 241 e 296 da região Fc em conformidade com a numeração de EU.
[000332] Os aminoácidos selecionados para estarem presentes após a alteração não são particularmente limitados contanto que a seletividade de ligação para todos os FCYRS de ativação, em particular FcyRIIa(R), seja diminuída enquanto a atividade de ligação de FcyRIIb é mantida em comparação àquela antes da alteração e são, preferência, Asp na posição de aminoácido 238 em conformidade com a numeração de EU, e também Phe na posição de aminoácido 235, Gln ou Asp na posição de aminoácido 237, Met ou Leu na posição de amino- ácido 241, Pro na posição de aminoácido 268, Met ou Val na posição de aminoácido 295, Glu, His, Asn ou Asp na posição de aminoácido 296, Ala ou Met na posição de aminoácido 298, Ile na posição de ami- noácido 323, Asn ou His na posição de aminoácido 324 e His ou Tyr na posição de aminoácido 330 em conformidade com a numeração de EU.
[000333] Além disso, em uma modalidade preferencial do método mencionado acima, por exemplo, uma região Fc em uma região Fc de IgG humana é alterada de modo que a(s) alteração(ões) de aminoáci- do que aumenta(m) a atividade de ligação de FcyRIIb em duas vezes ou mais em comparação àquela de uma região Fc de IgG nativa se- ja(m) introduzida(s) em combinação com a(s) alteração(ões) de ami- noácido que diminui(em) as atividades de ligação para todos os FcyRs.
[000334] Na presente invenção, "alterações de aminoácido que aumentam a atividade de ligação de FcyRIIb em duas vezes ou mais em comparação àquela de uma região Fc de IgG nativa" não é particularmente limitado, mas os exemplos incluem as alterações de aminoácido mostradas na Tabela 11.
[000335] Além disso, na presente invenção, "alterações de aminoá- cido que diminuem as atividades de ligação para todos os FCYRS" não é particularmente limitado, mas os exemplos incluem pelo menos um aminoácido selecionado dentre os aminoácidos nas posições 234, 235, 236, 237, 239, 265, 267 e 297 da região Fc em conformidade com a numeração de EU.
[000336] Uma combinação preferencial inclui, por exemplo, uma combinação de alterações dos aminoácidos nas posições 238 e 271 da região Fc em conformidade com a numeração de EU que aumentam a atividade de ligação de FcyRIIb em duas vezes ou mais em comparação àquela de uma região Fc de IgG nativa, com alteração de pelo menos um aminoácido selecionado dentre os aminoácidos nas posições 234, 235, 236, 237, 239, 265, 267 e 297 da região Fc em conformidade com a numeração de EU que reduz as atividades de ligação para todos os FcyRs.
[000337] Especificamente, as combinações preferenciais de alterações incluem as combinações de aminoácidos (1) a (3) abaixo: (1) aminoácidos nas posições 233, 238, 264, 267, 268 e 271 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (2) aminoácidos nas posições 233, 237, 238, 264, 267, 268, 271, 296, 297, 330 e 396 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (3) aminoácidos nas posições 233, 238, 264, 267, 268, 271 e 296 da região Fc em conformidade com a numeração de EU;
[000338] Os aminoácidos selecionados para estarem presentes após a alteração não são particularmente limitados contanto que as seletividades de ligação para todos os FcyRs de ativação, em particular FcyRIIa(R), sejam diminuídas enquanto a atividade de ligação de FcyRIIb é mantida em comparação àquela antes da alteração e são, de preferência, Asp na posição de aminoácido 238, Gly na posição de aminoácido 271, Ala, His, Asn, Lys ou Arg em aminoácido 234, Ala na posição de aminoácido 235, Gln na posição de aminoácido 236, Arg ou Lys na posição de aminoácido 237, Lys na posição de aminoácido 239, Lys, Asn, Arg, Ser ou Val na posição de aminoácido 265, Lys, Arg ou Tyr na posição de aminoácido 267 e Ala na posição de aminoácido 297 em conformidade com a numeração de EU.
[000339] Alternativamente, em uma modalidade preferencial do método mencionado acima, por exemplo, a região Fc é alterada de modo que as alterações dos aminoácidos nas posições 238, 271, 327, 330 e 331 em conformidade com a numeração de EU para outros aminoáci- dos sejam introduzidas na região Fc de IgG humana. Além disso, a região Fc é alterada de modo que as alterações de pelo menos um aminoácido selecionado dentre os aminoácidos nas posições 233, 237, 264, 267 e 268 para outros aminoácidos sejam introduzidas. Para outras alterações de aminoácido ser combinadas, dois ou mais amino- ácidos dentre os anteriores podem ser selecionados e combinados. Os exemplos da combinação preferencial incluem (1) a (4) abaixo: (1) aminoácidos nas posições 237, 238, 268, 271, 327, 330 e 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (2) aminoácidos nas posições 233,0237, 238, 268, 271, 327, 330 e 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; (3) aminoácidos nas posições 238, 267, 268, 271, 327, 330 e 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU; e (4) aminoácidos nas posições 238, 264, 267, 271, 327, 330 e 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU.
[000340] Os aminoácidos selecionados para estarem presentes após a alteração não são particularmente limitados contanto que as seletividades para todos os FCYRS de ativação, em particular FcyRIIa(R), sejam diminuídas enquanto a atividade de ligação de FcyRIIb é mantida em comparação a antes da alteração e sejam, de preferência, Asp na posição de aminoácido 238, Gly na posição de aminoácido 271, Gly na posição de aminoácido 327, Ser na posição de aminoácido 330, Ser na posição de aminoácido 331, Asp na posição de aminoácido 233, Asp na posição de aminoácido 237, Ile na posição de aminoácido 264, Ala na posição de aminoácido 267 e Asp ou Glu na posição de amino- ácido 268 em conformidade com a numeração de EU.
[000341] Além disso, a presente invenção fornece métodos para alterar polipeptídeos para produzir polipeptídeos cujas atividades de ligação a FCYRS de ativação, em particular FcyRIIa (tipo R), são diminuídas enquanto a atividade de ligação de FcyRIIb é mantida em comparação àquelas de um polipeptídeo que compreende a região Fc precursora. Alternativamente, a presente invenção fornece métodos para alterar polipeptídeos para produzir polipeptídeos cujas atividades de ligação a FcyRs de ativação, em particular FcyRIIa (tipo R), são diminuídas enquanto a atividade de ligação de FcyRIIb é mantida em comparação àquelas de um polipeptídeo que compreende a região Fc precursora.
[000342] A presente invenção também fornece métodos para alterar polipeptídeos para produzir um polipeptídeo que resulta em produção de anticorpo suprimida quando o polipeptídeo é administrado in vivo, em comparação a quando um polipeptídeo que compreende a região Fc precursora é administrado.
[000343] Um exemplo de uma modalidade preferencial inclui uma combinação de alterações de aminoácido descrita no método descrito acima para produzir um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc com atividades de ligação diminuídas para FcyRs de ativação, em particular FcyRIIa (tipo R), enquanto mantém sua atividade de ligação de FcyRIIb.
[000344] Para os vários tipos de métodos descritos acima, outras alterações de aminoácido podem ser usadas em combinação contanto que as atividades de ligação para todos os FCYRS de ativação sejam diminuídas e a atividade de ligação de FcyRIIb seja mantida em comparação àquelas de um polipeptídeo que compreende a região Fc de IgG nativa. Os exemplos de tais alterações incluem alterações que diminuem a atividade de ligação complementar. Os exemplos específicos incluem alteração do aminoácido na posição 322 da região Fc em conformidade com a numeração de EU ou uma combinação de alterações de aminoácido nas posições 327, 330 e 331 da região Fc em conformidade com a numeração de EU. Os aminoácidos selecionados para estarem presentes após a alteração não são particularmente limitados contanto que a atividade de ligação complementar seja diminuída, enquanto as atividades de ligação par todos os FcyRs de ativação são diminuídas e a atividade de ligação de FcyRIIb é mantida em comparação àquelas de um polipeptídeo que compreende a região Fc de uma IgG nativa e são, de preferência, Ala ou Glu na posição de ami- noácido 322, Gly na posição de aminoácido 327, Ser na posição de aminoácido 330 e Ser na posição de aminoácido 331 em conformidade com a numeração de EU.
[000345] Além disso, a presente invenção fornece um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc com atividades de ligação diminuídas para FcyRs de ativação, em particular FcyRIIa (tipo R), enquanto mantém a atividade de ligação de FcyRIIb em comparação àquelas de um polipeptídeo que compreende a região Fc precursora, em que o polipeptídeo que contém região Fc tem pelo menos um aminoácido alterado. A presente invenção também fornece um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc com atividades de ligação diminuídas para FcyRs de ativação, em particular FcyRIIa (tipo R), enquanto mantém a atividade de ligação de FcyRIIb em comparação àquelas de um polipeptídeo que compreende a região Fc precursora, em que o polipeptídeo que contém região Fc tem pelo menos um aminoácido alterado. Os ácidos nucleicos da presente invenção podem estar em qualquer forma, tal como DNA ou RNA.
[000346] A presente invenção da mesma forma fornece vetores transportando os ácidos nucleicos acima descritos da presente invenção. O tipo de vector pode ser apropriadamente selecionado por aqueles versados na técnica dependendo das células hospedeiras a serem introduzidas com o vector. Os vetores incluem, por exemplo, aqueles descritos acima.
[000347] Além disso, a presente invenção refere-se às células hospedeiras transformadas com os vetores acima mencionados da presente invenção. Células hospedeiras apropriadas podem ser selecionadas por aqueles versados na técnica. As células hospedeiras incluem, por exemplo, aquelas descritas acima. Exemplos específicos incluem as seguintes células hospedeiras.
[000348] Quando as células eucarióticas são usadas, as células hospedeiras, células animais, células de planta, ou células fúngicas podem ser apropriadamente usadas. Especificamente, as células animais incluem, por exemplo, as seguintes células. células mamíferas: CHO (Linhagem de célula de ovário Chinês), COS (Linhagem de rim de macaco), mieloma (Sp2/O, NS0, e similares), BHK (linhagem de célula de rim de hamster bebê), Hela, Vero, HEK293 (linhagem de célula de rim embriônico humana com adenoví- rus cisalhado (Ad)5 DNA), Freestyle293, célula PER.C6 (linhagem celular retinal embriônica humana transformada com os genes de Ade- novírus Tipo 5 (Ad5) E1A e E1B), e tais (Current Protocols in Protein Science (May, 2001, Unit 5.9, Table 5.9.1)); células de anfíbio: o-ócitos de Xenopus, ou tais; e células de inseto: sf9, sf21, Tn5, ou tais.
[000349] Além disso, como uma célula de planta, um sistema de ex- pressão de gene de anticorpo usando células derivadas do gênero Ni- cotiana tal como Nicotiana tabacum é conhecido. Células cultivadas de calo podem ser apropriadamente usadas para transformar células de planta.
[000350] Além disso, as seguintes células podem ser usadas como células fúngicas: - leveduras: o gênero Saccharomyces tal como Saccha- romyces serevisiae, e o gênero Pichia tal como Pichia pastoris; e - fungos filamentosos: o gênero Aspergillus tal como Aspergillus niger.
[000351] Além disso, a presente invenção fornece um método para diminuir as atividades de ligação para FCYRS de ativação, em particular FcyRIIa (tipo R), enquanto mantém sua atividade de ligação de FcyRIIb em comparação àquelas de um a polipeptídeo que compreende a região Fc precursora, que compreende adicionar pelo menos uma alteração de aminoácido à região Fc em um polipeptídeo que compreende a região Fc.
[000352] A presente invenção fornece, ainda, um método que compreende a etapa de adicionar pelo menos uma alteração de aminoáci- do a uma região Fc em um polipeptídeo que compreende a região Fc, que é um método que resulta em produção suprimida de anticorpos contra o polipeptídeo quando o polipeptídeo é administrado in vivo, em comparação a quando um polipeptídeo que compreende região Fc precursora é administrado.
[000353] Uma modalidade preferencial inclui, por exemplo, uma combinação de alterações de aminoácido descrita no método descrito acima para produzir um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc com atividades de ligação diminuídas para FcyRs de ativação, em particular FcyRIIa (tipo R), enquanto mantém sua atividade de ligação de FcyRIIb.
[000354] Polipeptídeos produzidos por qualquer dentre os métodos acima mencionados são da mesma forma incluídos na presente invenção.
[000355] A presente invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo o polipeptídeo compreendendo uma variante da região Fc da presente invenção.
[000356] As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas, além do anticorpo ou moléculas de proteína de fusão Fc da presente invenção descritos acima, com veículos farma- ceuticamente aceitáveis por métodos conhecidos. Por exemplo, as composições podem ser usadas parenteralmente, quando os anticorpos são formulados em uma solução estéril ou suspensão para injeção usando água ou qualquer outro líquido farmaceuticamente aceitável. Por exemplo, as composições podem ser formuladas apropriadamente combinando-se os anticorpos ou moléculas de proteína de fusão Fc com veículos farmaceuticamente aceitáveis ou meios, especificamente, água estéril ou solução salina fisiológica, óleos vegetais, emulsifi- cantes, agentes de suspensão, tensoativos, estabilizantes, agentes flavorizantes, excipientes, veículos, preservativos, agentes de ligação, e tais, misturando-os em uma dose unitária e forma requerida por implementações farmacêuticas geralmente aceitas. Exemplos específicos dos veículos incluem ácido silícico anidroso leve, lactose, celulose cristalina, manitol, amido, carmelose cálcica, carmelose sódica, hidro- xipropil celulose, hidroxipropil metilcelulose, dietilaminoacetato de poli- vinilacetal, polivinilpirrolidona, gelatina, triglicéride de cadeia média, óleo de rícino endurecido de polioxietileno 60, sacarose, carboximetil celulose, amido de milho, sal inorgânico, e tais. O teor do ingrediente ativo em uma tal formulação é ajustado de modo que uma dose apropriada dentro da faixa requerida possa ser obtida.
[000357] Composições estéreis para injeção podem ser formuladas usando veículos tal como água destilada para injeção, de acordo com os protocolos padrão.
[000358] Soluções aquosas usadas para injeção incluem, por exemplo, solução salina fisiológica e soluções isotônicas contendo glicose ou outros adjuvantes tais como D-sorbitol, D-manose, D-manitol, e cloreto de sódio. Estas podem ser usadas juntamente com solubilizado- res adequados tal como álcool, especificamente etanol, poliálcoois tais como propileno glicol e polietileno glicol, e tensaotivos não iônicos tal como Polissorbato 80(TM) e HCO-50.
[000359] Óleos incluem óleos de gergelim e óleos de soja, e podem ser combinados com solubilizantes tal como benzoato de benzila ou álcool benzílico. Estes podem ser formulados da mesma forma com tampões, por exemplo, tampões de fosfato ou tampões de acetato de sódio; analgésicos, por exemplo, cloridrato de procaóna; estabilizadores, por exemplo, álcool benzílico ou fenol; ou antioxidantes. As injeções preparadas são tipicamente aliquotados em ampolas apropriadas.
[000360] A administração é preferivelmente realizada parenteralmen- te, e especificamente inclui injeção, administração intranasal, administração intrapulmonar, e administração percutânea. Por exemplo, as injeções podem ser administradas sistemicamente ou localmente por injeção intravenosa, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, ou injeção subcutânea.
[000361] Além disso, o método de administração pode ser selecionado adequadamente de acordo com a idade e sintomas do paciente. Uma única dosagem da composição farmacêutica que contém um anticorpo ou um polinucleotídeo codificando um anticorpo pode ser selecionada, por exemplo, a partir da faixa de 0,0001 mg a 1000 mg por kg de peso corporal. Alternativamente, a dosagem pode ser, por exemplo, na faixa de 0,001 a 100000 mg/corpo. Entretanto, a dosagem não está limitada a estes valores. A dosagem e método de administração variam, dependendo do peso corporal do paciente, idade, e sintomas, e pode ser selecionada adequadamente por aqueles versados na técnica.
[000362] Os polipeptídeos supracitados compreendendo uma variante de região Fc da presente invenção são úteis como ingredientes ativos de agentes farmacêuticos que suprimem a ativação de células B, mastócitos, células dendríticas e/ou basófilos. Polipeptídeos compreendendo uma variante de região Fc da presente invenção pode suprimir a ativação de células B, mastócitos, células dendríticas e/ou basó- filos, seletivamente processando-se FcyRIIb sem ativar FCYRS ativado- res. A ativação da célula B inclui proliferação, produção de IgE, produção de IgM, e produção de IgA. Os polipeptídeos acima mencionados compreendendo uma variante de região Fc da presente invenção reti- culam FcyRIIb com IgE para suprimir a produção de IgE de células B, com IgM para suprimir a produção de IgM de células B, e com IgA para suprimir a produção de IgA. Diferente dos anteriores, os efeitos supressivos similares àqueles mencionados acima são exibidos reticu- lando-se FcyRIIb diretamente ou indiretamente com moléculas que são expressas em células B e compreendem o domínio ITAM dentro da célula ou interagem com o domínio ITAM tais como BCR, CD19, e CD79b. Além disso, a ativação dos mastócitos inclui a proliferação, ativação por IgE e tais, e desgranulação. Em mastócitos, os polipeptí- deos acima mencionados compreendendo uma variante de região Fc da presente invenção podem suprimir a proliferação, ativação por IgE e tais, e desgranulação reticulando-se FcyRIIb diretamente ou indiretamente com moléculas receptoras de IgE que são expressas em mas- tócitos e compreendem o domínio ITAM ou interagem com o domínio ITAM tais como FcyRI, DAP12, e CD200R3. A ativação de basófilos inclui a proliferação e desgranulação de basófilos. Da mesma forma nos basófilos, os polipeptídeos acima mencionados compreendendo uma variante de região Fc da presente invenção podem suprimir a proliferação, ativação, e desgranulação reticulando-se FcyRIIb diretamente ou indiretamente com moléculas na membrana celular, que compreendem o domínio ITAM dentro da célula ou interagem com o domínio ITAM. A ativação de células dendríticas inclui a proliferação e desgra- nulação de células dendríticas. Da mesma forma em células dendríti- cas, os polipeptídeos acima mencionados que compreendem uma variante de região Fc da presente invenção podem suprimir a ativação, desgranulação, e proliferação reticulando-se FcyRIIb diretamente ou indiretamente com moléculas na membrana de célula que compreendem o domínio ITAM dentro da célula ou interagem com o domínio ITAM.
[000363] Na presente invenção, os polipeptídeos compreendendo uma variante de região Fc da presente invenção mencionados acima são úteis como um ingrediente ativo de agentes terapêuticos ou os agentes preventivos para doenças inflamatórias imunológicas. Como descrito acima, desde que os polipeptídeos compreendendo uma variante de região Fc da presente invenção possam suprimir a ativação das células B, mastócitos, células dendríticas e/ou basófilos, a administração dos polipeptídeos compreendendo uma variante da região Fc da presente invenção como resultado pode tratar ou prevenir doenças inflamatórias imunológicas. Sem estar limitadas a estes, o termo "doenças inflamatórias imunológicas" compreendem, artrite reumatoide, hepatite autoimune, tireoidite autoimune, doenças de vesiculação au- toimunes, doença adrenocortical autoimune, anemia hemolítica autoi- mune, púrpura trombocitopênica autoimune, anemia megalocítica, gastrite atrófica autoimune, neutropenia autoimune, orquite autoimune, encefalomielite autoimune, doença do receptor autoimune, infertilidade autoimune, hepatite ativa crônica, glomerulonefrite, fibrose pulmonar intersticial, esclerose múltipla, doença de Paget, osteoporose, mieloma múltiplo, uveíte, espondilite aguda e crônica, artrite gotosa, doença intestinal inflamatória, síndrome da angústia respiratória do adulto (ARDS), psoríase, doença de Crohn, doença de Basedow, diabetes juvenil, doença de Addison, miastenia grave, uveíte induzida por lente, lúpus eritematoso sistêmico, rinite alérgica, dermatite alérgica, colite ulcerativa, hipersensibilidade, degeneração muscular, caquexia, escleroderma sistêmico, escleroderma localizado, síndrome de Sjogren, doença de Behchet, síndrome de Reiter, diabetes tipo I e tipo II, distúrbio de reabsorção óssea, reação de enxerto-versus-hospedeiro, lesão de isquemia-reperfusão, aterosclerose, trauma cerebral, malária cerebral, sepse, choque séptico, síndrome de choque tóxico, febre, malgias devido à coloração, anemia aplásica, anemia hemolítica, trombocitopenia idiopática, síndrome de Goodpasture, síndrome de Guillain-Barre, tire- oidite de Hashimoto, pênfigo, nefropatia de IgA, polinose, síndrome do anticorpo antifosfolipídico, polimiosite, granulomatose de Wegener, arterite nodosa, doença do tecido conjuntivo mista, fibromialgia, asma, dermatite atópica, gastrite atrófica crônica, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, pancreatite autoimune, síndrome de aor- tite, glomerulonefrite rapidamente progressiva, anemia megaloblástica, púrpura trombocitopênica idiopática, hipotireoidismo primário, doença de Addison idiopática, diabetes melito dependente de insulina, lúpus eritematoso discoide crônico, penfigoide, herpes gestacional, dermato- se bolhosa de IgA linear, epidermólise bolhosa adquirida, alopecia em áreas, vitiligo vulgar, leucoderma adquirido centrífugo de Sutton, doença de Harada, neuropatia ótica autoimune, azoospermia idiopática, aborto comum, hipoglicemia, urticária crônica, espondilite ancilosante, artrite psoriática, artrite enteropática, artrite reativa, espondiloartropa- tia, entesopatia, síndrome do intestino irritável, síndrome da fadiga crônica, dermatomiosite, miosite dos corpúsculos de inclusão, síndro- me de Schmidt, doença de Grave, anemia perniciosa, hepatite lupoide, demência pré-sênil, doença de Alzheimer, distúrbio desmielinizante, esclerose lateral amiotrófica, hipoparatireoidismo, síndrome de Dress- ler, síndrome de Eaton-Lambert, dermatite herpetiforme, alopecia, esclerose sistêmica progressiva, síndrome de CREST (calcinose, fenômeno de Rainaud, dismotilidade esofágica, esclerodactilia, e telangiectasia), sarcoidose, febre reumática, eritema multiforme, síndrome de Cushing, reação de transfusão, doença de Hansen, arterite de Takayasu, polimialgia reumática, arterite temporal, artrite de células gigantes, eczema, granulomatose linfomatoide, doença de Kawasaki, endo- cardite, fibrose endomiocardíaca, endoftalmite, eritroblastose fetal, fasciite eosinofílica, síndrome de Felti, púrpura de Henoch-Schonlein, rejeição de transplante, caxumba, cardiomiopatia, artrite purulenta, febre familiar do Mediterrâneo, síndrome de Muckle-Wells, e síndrome de hiper-IgD.
[000364] Além disso, nas doenças autoimunes que podem ser causadas por produção de anticorpos junto aos autoantígenos (autoanti- corpos), os polipeptídeos que compreendem uma variante de região Fc da presente invenção mencionados acima são úteis como um ingrediente ativo de agentes farmacêuticos para tratar ou prevenir as doenças autoimunes suprimindo-se a produção daqueles autoanticor- pos. O uso de uma molécula produzida fundindo-se uma porção de Fc de anticorpo com AchR (um autoantígeno de miastenia grave) foi relatado para suprimir a proliferação de células B que expressam BCR de reconhecimento de AchR, e induzem a apoptose (J. Neuroimmunol, 227: 35-43, 2010). O uso de uma proteína de fusão formada entre um antígeno reconhecido por uma região Fc de anticorpo e uma de auto- anticorpo da presente invenção permite a reticulação de FcyRIIb com BCR de uma célula de B expressando BCR para aquele autoantígeno, supressão de proliferação de células B expressando BCR para o auto- antígeno, e indução de apoptose. Tais doenças autoimunes incluem síndrome de Guillain-Barre, miastenia grave, gastrite atrófica crônica, hepatite autoimune, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, pancreatite autoimune, síndrome de aortite, síndrome de Goodpasture, glomerulonefrite rapidamente progressiva, anemia megalo- blástica, anemia hemolítica autoimune, neutropenia autoimune, púrpura trombocitopênica idiopática, doença de Basedow, tireoidite de Hashimoto, hipotireoidismo primário, doença de Addison idiopático, diabetes melito dependente de insulina, lúpus eritematoso discoide crônico, escleroderma localizado, pênfigo, penfigoide, herpes gestaci- onal, dermatose bolhosa de IgA linear, epidermólise bolhosa adquirida, alopecia em áreas, vitiligo vulgar, leucoderma adquirido centrífugo de Sutton, doença de Harada, neuropatia ótica autoimune, azoospermia idiopática, aborto comum, diabetes tipo II, hipoglicemia, e urticária crônica; porém não estão limitadas a estas.
[000365] Além disso, os polipeptídeos acima mencionados compreendendo uma Variante de Região de Fc da presente invenção são úteis como um ingrediente ativo em agentes terapêuticos para doenças com deficiência de uma proteína biologicamente essencial. Para doenças com deficiência de uma proteína biologicamente essencial, métodos terapêuticos que administram e suplementam a proteína como um agente farmacêutico são usados. Entretanto, visto que o paciente necessita da proteína desde o princípio, a proteína externamente suplementar é reconhecida como uma substância estranha e anticorpos junto àquela proteína são produzidos. Como resultado, a proteína torna-se removida facilmente, e o efeito como um produto farmacêuti-co é reduzido. O uso de uma proteína de fusão compreendendo tal proteína e uma região Fc de anticorpo da presente invenção permite a reticulação entre FcyRIIb e BCR em células B que reconhecem a proteína, e permite a supressão da produção de anticorpo junto à proteí- na. As proteínas a ser suplementadas incluem Fator VIII, Fator IX, TPO, EPO, α-iduronidase, iduronato sulfatase, heparan N -sulfatase tipo A, α-N-acetilglicosaminidase tipo B, acetil CoA: α-glicosaminidase acetiltransferase tipo C, N-acetilglicosamina 6-sulfatase tipo D, galactose 6-sulfatase, N-acetilgalactosamina 4-sulfatase, β-glicuronidase, α- galactosidase, α-galactosidase ácida e glicocerebrosidase. Estas proteínas podem ser suplementadas para doenças tais como hemofilia, púrpura trombocitopênica idiopática, anemia renal, e doença lisossô- mica (mucopolissacaridose, doença de Fabry, doença de Pompe e doença de Gaucher), sem estar limitadas a estas.
[000366] Além disso, os polipeptídeos acima mencionados compreendendo uma variante de região Fc da presente invenção são úteis como um ingrediente ativo para agentes antivirais. Anticorpos que compreendem uma região Fc da presente invenção e são anticorpos antivirais podem suprimir o realce dependente de anticorpo observado com anticorpos antivirais. O realce dependente de anticorpo é um fenômeno onde um vírus usa anticorpos neutralizadores junto ao vírus para tornar-se fagocitosado por meio de FCYRS de ativação, e infecta células de expressão de FCYR de forma que a infecção expande. A ligação de anticorpos neutralizadores do vírus antidengue em FcyRIIb foi relatada desempenhar um papel importante na supressão do realce dependente de anticorpo (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 108: 1247912484, 2011). A reticulação de FcyRIIb com um complexo imune com vírus da dengue, que é formado pelos anticorpos neutralizadores do vírus anti-dengue inibe a fagocitose mediada por FcyR, resultando na supressão do realce dependente de anticorpo. Exemplos de tais vírus incluem vírus da dengue (DENV1, DENV2, e DENV4) e HIV, porém não estão limitados a estes.
[000367] Além disso, os polipeptídeos compreendendo uma variante de região Fc da presente invenção descritos acima são úteis como um ingrediente ativo em agentes preventivos ou agentes terapêuticos para arteriosclerose. Anticorpos contra LDL oxidado, isto é, uma causa para arteriosclerose, que são anticorpos compreendendo uma região Fc da presente invenção pode prevenir a adesão dependente de FcyRIIa de células inflamatórias. Foi relatado que ao mesmo tempo em que anticorpos de LDL antioxidados inibem a interação entre LDL oxidado e CD36, anticorpos de LDL antioxidados ligam-se às células endoteliais, e monócitos reconhecem sua porção de Fc de uma maneira dependente de FcyRIIa ou dependente de FCYRI; e isto leva à adesão (Immunol. Lett., 108: 52-61, 2007). O uso de anticorpos compreendendo uma região Fc da presente invenção para tais anticorpos pode inibir a ligação dependente de FcyRIIa e pode suprimir a adesão de monóci- to por sinais inibidores mediados por FcyRIIb.
[000368] Na presente invenção, os polipeptídeos mencionados acima que compreendem as variantes de região Fc da presente invenção são úteis como ingredientes ativos para agentes terapêuticos ou agentes profiláticos contra câncer. Conforme descrito acima, diminuindo-se a ligação a todos os FCYRS de ativação e mantendo-se a ligação a FcyRIIb, a ativação de plaqueta através do mecanismo depedente de FcyRIIa pode ser suprimida enquanto mantém a atividade agonística de anticorpos agonistas e o risco de tromboembolismo e similares pode ser reduzido. Portanto, os anticorpos agonistas usando a variante de região Fc da presente invenção são úteis para o tratamento ou prevenção do câncer. Especificamente, a variante de região Fc da presente invenção realça a atividade agonísticas de anticorpos agonistas junto a, por exemplo, receptores da família do receptor de TNF tais como Aliases, CD120a, CD120b, receptor de Linfotoxina β, CD134, CD40, FAS, TNFRSF6B, CD27, CD30, CD137, TNFRSF10A, TNFRSF10B, TNFRSF10C, TNFRSF10D, RANK, Osteoprotegerina, TNFRSF12A, TNFRSF13B, TNFRSF13C, TNFRSF14, Receptor do fator de cresci- mento do nervo, TNFRSF17, TNFRSF18, TNFRSF19, TNFRSF21, TNFRSF25, e receptor de Ectodisplasina A2 e pode ser usada para tratar ou prevenir o câncer. Além disso, além dos anteriores, atividade agonística é realçada da mesma forma para anticorpos agonistas junto às moléculas que precisam interagir com FcyRIIb para exibir sua atividade agonística. Além disso, a incorporação da variante da região Fc da presente invenção em um polipeptídeo tendo atividade de ligação a uma molécula tal como Kit, um tipo de tirosina cinase receptora (RTK), que suprime a proliferação celular na reticulação com FcyRIIb, o efeito inibidor junto às células expressando tal molécula pode ser realçado. Sem estar limitado a isto, o câncer inclui câncer de pulmão (incluindo câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma pulmonar, e carcinoma de célula escamosa do pulmão), câncer do intestino grosso, câncer retal, câncer de cólon, câncer de mama, câncer de fígado, câncer gástrico, câncer pancreático, câncer renal, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer da tireoide, colangiocarcinoma, câncer peritoneal, mesotelioma, carcinoma de célula escamosa, câncer cervical, câncer endometrial, câncer de bexiga, câncer esofágico, câncer de cabeça e pescoço, câncer na- sofaríngeo, tumor da glândula salivar, timoma, câncer de pele, tumor de célula basal, melanoma maligno, câncer anal, câncer de pênis, câncer testicular, tumor de Wilms, leucemia mieloide aguda (incluindo mieloleucemia aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia promi- elocítica aguda, leucemia mielomonocítica aguda, e leucemia monocí- tica aguda), leucemia mielogenosa crônica, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfática crônica, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin (linfoma de Burkitt, leucemia linfocítica crônica, micose fungoide, linfoma de células de revestimento, linfoma de folicular, linfoma células grandes difusos, linfoma de zona marginal, plasmacitoma de leucemia pilocítica, linfoma células T periférico, e leucemia/linfoma de célula T de adulto), histiocitose de célula de Langerhans, mieloma múltiplo, síndrome mielodisplásica, tumor cerebral (incluindo glioma, astroglioma, glioblastoma, meningioma, e ependimoma), neuroblastoma, retinoblastoma, osteossarcoma, sarcoma de Kaposi, sarcoma de Ewing, angiossarcoma, e hemangiopericitoma.
[000369] Além disso, a presente invenção refere-se a métodos para tratar ou prevenir doenças inflamatórias imunológicas, que compreendem a etapa de administrar a um indivíduo (paciente) um polipeptídeo que compreende uma variante de região Fc da presente invenção ou um polipeptídeo compreendendo uma variante de região Fc produzido por métodos de produção da presente invenção.
[000370] A presente invenção também fornece kits para uso nos métodos terapêuticos ou métodos preventivos da presente invenção, que compreendem pelo menos um polipeptídeo compreendendo uma variante de região Fc da presente invenção ou um polipeptídeo compreendendo uma variante de região Fc produzido por métodos de produção da presente invenção, ou uma composição farmacêutica da presente invenção. Além disso, veículos farmaceuticamente aceitáveis, meios, instruções no método de uso, e tais podem ser incluídos no kit. Além disso, a presente invenção refere-se ao uso de um polipeptídeo compreendendo uma variante de região Fc da presente invenção ou um polipeptídeo compreendendo uma variante de região Fc produzido por métodos de produção da presente invenção na produção de agentes para tratar ou prevenir doenças inflamatórias imunológicas. A pre-sente invenção também se refere aos polipeptídeos compreendendo uma variante de região Fc da presente invenção ou polipeptídeos compreendendo uma variante de região Fc produzidas por métodos de produção da presente invenção para uso nos métodos terapêuticos ou métodos preventivos da presente invenção.
[000371] Quando aqui usado, um código de três letras e de única letra codifica aminoácidos respectivos é como segue: Alanina: Ala (A) Arginina: Arg (R) Asparagina: Asn (N) Ácido Aspártico: Asp (D) Cisteína: Cis (C) Glutamina: Gln (Q) Ácido Glutâmico: Glu (E) Glicina: Gly (G) Histidina: His (H) Isoleucina: Ile (I) Leucina: Leu (L) Lisina: Lis (K) Metionina: Met (M) Fenilalanina: Phe (F) Prolina: Pro (P) Serina: Ser (S) Treonina: Thr (T) Triptofano: Trp (W) Tirosina: Tyr (Y) Valina: Val (V)
[000372] Todos os documentos da técnica anterior citados aqui estão incorporados por referência em sua totalidade.
EXEMPLOS
[000373] Aqui abaixo, a presente invenção especificamente será descrita também com referência aos Exemplos, porém não será interpretada como estando limitada a isto.
EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO DE UM ANTICORPO ANTI-IGE DEPENDENTE DE PH (1-1) PREPARAÇÃO DE UM ANTICORPO IGE ANTI-HUMANO
[000374] A fim de preparar um anticorpo IgE anti-humano dependente de pH, IgE humana (cadeia pesada, SEQ ID NO: 13; cadeia leve, SEQ ID NO: 14) (sua região variável é de um anticorpo glipicano 3 anti-humano) foi expressa como um antígeno com o uso de FreeStyle293 (Life Technologies). A IgE humana expressa foi preparada e purificada por um método cromatográfico de coluna geral conhecido por aqueles versados na técnica.
[000375] Os anticorpos que formam complexos imunológicos grandes que compreendem duas ou mais moléculas de anticorpo anti-IgE e duas ou mais moléculas de IgE, que mostram ligação dependente de pH a IgE humana, foram selecionados dentre os múltiplos anticorpos obtidos. A expressão e a purificação dos anticorpos IgE anti-humanos foram executadas com o uso de regiões constantes de cadeia leve de IgG1 humana e as regiões constantes de cadeia leve. O anticorpo produzido foi chamado de clone 278 (IgG1) (cadeia pesada SEQ ID NO: 10, cadeia leve SEQ ID NO: 11).
(1-2) AVALIAÇÃO DE ATIVIDADES DE LIGAÇÃO E ATIVIDADES DE LIGAÇÃO DEPENDENTES DE PH DE ANTICORPOS IGE ANTI- HUMANOS
[000376] Os anticorpos que podem liberar antígenos no endossomo podem ser produzidos com o uso não apenas de ligação de antígeno dependente de pH, mas também de ligação dependente de Ca. Dessa forma, a capacidade dependente de pH e a capacidade dependente de pH/Ca de ligar-se à IgE humana (hIgE) foram avaliadas para o clone 278 e Xolair (omalizumab, Novartis) usado como um controle que não tem capacidade de ligação de IgE dependente de pH.
[000377] Mais especificamente, as atividades de ligação de hIgE (constante de dissociação KD (M)) de clone 278 e Xolair foram avaliadas com o uso de Biacore T200 (GE Healthcare). As medições foram executadas com o uso dos três tipos a seguir de tampão contínuo: - 1,2 mmol/l de CaCl2 /0,05% de tween20, 20 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCl, pH 7,4 - 1,2 mmol/l de CaCl2 /0,05% de tween20, 20 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCl, pH 5,8 - 3 μMol/l de CaCh /0,05% de tween20, 20 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCl, pH 5,8
[000378] Um peptídeo produzido por adição de biotina a Lys presente no terminal C de uma sequência derivada de proteína glipicano 3 humana sintetizada quimicamente (SEQ ID NO: 12) (doravante referida como "peptídeo GPC3 biotinilado") adicionado em uma quantidade apropriada foi imobilizado em Chip de sensor SA (GE Healthcare) utilizando a afinidade entre estreptavidina e biotina. Uma concentração apropriada de IgE humana foi injetada e capturada com o peptídeo GPC3 biotinilado para imobilizar a IgE humana no chip. Uma concentração apropriada de clone 278 foi injetada como um analito e deixada interagir com IgE humana no chip de sensor. Então, 10 mmol/l de gli- cina-HCl (pH 1,5) foram injetados para regenerar o chip de sensor. Todo o ensaio para a interação foi realizado a 37 °C. Com o uso do Software de Avaliação Biacore T200 (GE Healthcare), os resultados do ensaio foram analisados por ajuste de curvas para determinar a constante de taxa de ligação ka (1/Ms) e a constante de taxa de dissociação kd (1/s). A constante de dissociação KD (M) foi calculada a partir das constantes acima. Então, a ligação dependente de pH foi avaliada por cálculo da razão KD de cada anticorpo entre as condições de pH 5,8/1,2 mM de Ca e pH 7,4/1,2 mM de Ca. Então, a ligação dependente de pH/Ca foi avaliada por cálculo da razão KD de cada anticorpo entre as condições de pH 5,8/3 μM de Ca e pH 7,4/1,2 mM de Ca. Os resultados são mostrados na Tabela 5.
Figure img0007
(1-3) AVALIAÇÃO DA F( DRMAÇÃO DE COMPLEXOS MUNOLÓGI- COS COM CLONE 278 E XOLAIR
[000379] A formação de um complexo imunológico grande que compreende duas ou mais moléculas de anticorpo anti-IgE e duas ou mais moléculas de IgE sob uma condição neutra (pH 7,4) pelo clone 278 e pela IgE humana e a dissociação desse complexo imunológico sob uma condição ácida (pH 5,8) foram avaliadas por cromatografia de filtração em gel. Clone 278 dializado contra 100 mM de NaCl foi diluído com o uso de tampão 20 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl, 1,2 mM de CaCl2, pH 7,4 para preparar amostras sob condições neutras ou um tampão 20 mM de Bis-tris-HCl, 150 mM de NaCl, 3 μM de CaCh, pH 5,8 para preparar amostras sob condições ácidas. As soluções misturadas produzidas por mistura de 100 μg/ml (0,06 μM) de hIgE (Asp6), que é uma IgE humana e clone 278 a razões molares de 1:1 e 1:6 foi deixadas em repouso à temperatura ambiente ou em um autoamostra- dor a 25 °C por duas horas ou maios e, então, foram analisadas por cromatografia de filtração em gel. Para a fase móvel, 20 mM de Tris- HCl, 300 mM de NaCl, 1,2 mM de CaCl2, pH 7,4 e 20 mM de Bis-tris- HCl, 300 mM de NaCI, 3 μM de CaCh, pH 5,8 foram usados sob uma condição neutra, respectivamente. G4000SWxl (TOSOH) foi usado para a colina e análises foram executadas a uma taxa de fluxo de 0,5 ml/min a 25 °C. Os resultados são mostrados na Figura 1. Conforme mostrado na Figura 1, o clone 278 e a IgE humana mostraram formar complexos imunológicos grandes que compreende um tetrâmero que tem um peso molecular aparente de aproximadamente 670 kDa (supondo-se que uma molécula de anticorpo única seja um monômero) e multímeros maiores sob condição neutra. Tais complexos imunológi- cos não foram observados sob condições ácidas. Portanto, de uma maneira similar à avaliação mencionada acima de ligação com o uso de Biacore, esses complexos imunológicos mostraram dissociação dependente de pH.
EXEMPLO 2 AVALIAÇÃO IN VIVO DE CLONE 278 E XOLAIR (2-1) PREPARAÇÃO DE IGE HUMANA (HIGE (ASP6)) PARA AVALIAÇÃO IN VIVO
[000380] hIgE (Asp6) (sua região variável é de um anticorpo glipica- no 3 anti-humano), que é uma IgE humana para avaliação in vivo, que compreende a cadeia pesada (SEQ ID NO: 15) e cadeia leve (SEQ ID NO: 14), foi preparada pelo mesmo método conforme descrito no Exemplo 1. hIgE (Asp6) é uma molécula em que asparagina foi substituída por ácido aspártico nos seis sítios de N-glicosilação em IgE humana, de modo que mudanças dependentes de tempo na concentração de IgE humana como um antígeno no plasma não afetem a heterogeneidade de cadeias de açúcar N-ligadas de IgE humana.
(2-2) VERIFICAÇÃO DOS EFEITOS DE CLONE 278 E XOLAIR PARA ACELERAR ELIMINAÇÃO DE IGE HUMANA COM O USO DE CAMUNDONGOS NORMAIS
[000381] A camundongos C57BL/6J (Charles river Japão), hIgE (Asp6) sozinha foi administrada ou hIgE (Asp6) e um anticorpo anti- hIgE (clone 278 ou Xolair) foram administrados simultaneamente e, então, a cinética in vivo de hIgE (Asp6) e anticorpos IgE anti-humanos foi avaliada. hIgE (Asp6) (20 μg/ml) ou uma solução misturada de hIgE (Asp6) e o anticorpo IgE anti-humano (as concentrações são mostradas na Tabela 6) foi administrada uma vez a 10 ml/kg a partir da veia da cauda. Como cada anticorpo está presente o suficiente em excesso em relação a hIgE (Asp6) nesse ponto, a maior parte da hIgE (Asp6) é considerada como estando ligada ao anticorpo. Sangue foi coletado dos camundongos 5 minutos, 2 horas, 7 horas, 1 dia, 2 dias, 4 dias ou 5 dias, 7 dias, 14 dias, 21 dias e 28 dias após a administração. As amostras de sangue coletadas foram imediatamente submetidas à centrifugação a 15.000 rpm por 5 minutos a 4 °C para obter o plasma. As amostras de plasma separadas foram armazenadas em um congelador ajustado em -20 °C ou menos até as medições serem realizadas.
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(2-3) MEDIÇÃO DE CONCENTRAÇÃO DE HIGE (ASP6) EM PLAS MA EM CAMUNDONGOS NORMAIS
[000382] As concentrações de hIgE (Asp6) em plasma em camundongos foram medidas por ELISA. As amostras de curva de calibração foram preparadas em concentrações plasmáticas de 192, 96, 48, 24, 12, 6 e 3 ng/ml. Para tornar os complexos imunológicos formados entre hIgE (Asp6) e em anticorpo anti-hIgE homogêneos, Xolair (Novartis) foi adicionado às amostras de curva de calibração e às amostras de medição de plasma de camundongo a 10 μg/ml e essas foram dei- xadas em repouso à temperatura ambiente por 30 minutos. Subse-quentemente, as amostras de curva de calibração e as amostras de medição de plasma de camundongo foram distribuídas em uma imu- noplaca imobilizada com IgE anti-humana (MABTECH) ou uma imuno- placa imobilizada com IgE anti-humana (clone 107, MABTECH) (Nunc F96 MicroWell Plate (Nalge nunc International)) e a mesma foi deixada em repouso por duas horas à temperatura ambiente ou de um dia para o outro a 4 °C. Em seguida, a proteína núcleo GPC3 humana (SEQ ID NO: 16), um anticorpo anti-GPC3 (preparado internamente) biotinilado com NHS-PEG4-Biotin (Thermo Fisher Scientific), e Sterptavidin- PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foram reagidos individualmente por uma hora de uma maneira sequencial. As concentrações em plasma de camundongo foram medidas com o uso de um método para medir a absorbância a 450 nm com um leitor de micro- placa para corpo desenvolvido em uma reação de coloração que usa TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) como um substrato após a reação ser interrompida com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical) ou um método para medir a intensidade de luminescência com um leitor de microplaca após uma reação lumines- cente realizada com o uso de SuperSignal(r) ELISA Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Fisher Scientific) como o substrato. As concentrações em plasma de camundongo foram calculadas a partir de uma curva de calibração de intensidade de luminescência ou valores de absorbância com o uso do software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). A mudança na concentração de hIgE (Asp6) em plasma após a administração intravenosa medida por esse método é mostrada na Figura 2. Na figura, o clone 278 é citado como 278-IgG1 e Xolair como Xolair-IgG1.
(2-4) MEDIÇÃO DE CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPO IGE ANTI- HUMANO EM PLASMA EM CAMUNDONGOS NORMAIS
[000383] A concentração de anticorpo hIgE em plasma de camundongo foi medida por ELISA. As amostras de curva de calibração foram preparadas em concentrações plasmáticas de 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 e 0,00625 μg. Para homogeneizar os complexos imuno- lógicos formados entre hIgE (Asp6) e um anticorpo anti-hIgE, as amostras de curva de calibração e as amostras de medição em plasma de camundongo foram deixadas em repouso à temperatura ambiente por 30 minutos após a adição de hIgE (Asp6) a 1 μg/ml. Subsequentemente, as amostras de curva de calibração e as amostras de medição de plasma de camundongo foram distribuídas em uma imunoplaca imobilizada com anticorpo de cadeia leve kappa anti-humano (Bethyl Labo-ratories) (Nunc F96 MicroWell Plate (Nalge nunc International)) e a mesma foi deixada em repouso por duas horas à temperatura ambiente ou de um dia para o outro a 4 °C. Portanto, um anticorpo secundário (Fc) IgG anti-humano de coelho, conjugado de biotina (Pierce Biotechnology) e Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foram individualmente reagidos por uma hora de uma maneira sequencial. As concentrações em plasma de camundongo foram determinadas com o uso de um método para medir a absorbân- cia a 450 nm com um leitor de microplaca para cor desenvolvida em uma reação de coloração que usa TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories) como substrato após a reação ser interrompida com ácido sulfúrico 1N (Showa Chemical). As concentrações em plasma de camundongo foram calculadas a partir de uma curva de calibração de valores de absorbância com o uso do software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). A mudança na concentração de anticorpo IgE em plasma após a administração intravenosa medida por esse método é mostrada na Figura 3. Na figura, o clone 278 é citado como 278-IgG1 e Xolair como Xolair-IgG1.
[000384] Como resultado, quando IgE humana e Xolair que é o anti- corpo anti-IgE de controle foram administrados simultaneamente, a eliminação de IgE humana tornou-se lenta em comparação à eliminação quando IgE humana foi administrada sozinha. Por outro lado, com administração simultânea de clone 278 que tem atividade de ligação dependente de pH para IgE humana, a eliminação de IgE humana mostrou ser grandemente acelerada em comparação a quando IgE humana foi administrada sozinha.
[000385] No documento WO2011/122011, um experimento similar foi realizado com o uso de receptor de IL-6 humano (hsIL-6R) e anticorpos que se ligam a hsIL-6R, mas os resultados foram diferentes dos resultados dos presentes Exemplos. No Exemplo 3 do documento WO2011/122011, quando um anticorpo IgG1 que é um anticorpo (H54L28-IgG1) que se liga ao receptor de IL-6 humano (hsIL-6R), mas não de uma maneira dependente de pH, foram administrados simultaneamente com um antígeno a um camundongo normal (camundongo C57BL/6J), a eliminação do receptor de IL-6 humano (o antígeno) não foi acelerada e foi de fato retardada em comparação ao caso em que o antígeno sozinho foi administrado. Quando um anticorpo (Fv4-IgG1) que mostra ligação de antígeno dependente de pH foi administrado simultaneamente com um antígeno, a eliminação de antígeno foi retardada em comparação a quando o antígeno sozinho foi administrado enquanto a eliminação de antígeno foi acelerada em comparação a quando H54L28-IgG1 foi administrado. Isso pode ocorrer já que a administração de anticorpo resultou em ligação do anticorpo ao antígeno, que fez com que o antígeno se movesse com o anticorpo, fosse reciclado através de FcRn da mesma forma que o anticorpo e fez com que a eliminação do sangue se tornasse difícil.
[000386] O resultado obtido a partir dos presentes Exemplos é que a administração simultânea de um antígeno com um anticorpo acelera a eliminação de antígeno em comparação a quando o antígeno é admi- nistrado sozinho e parece contrariar os relatos anteriores. No entanto, a IgE usada nos Exemplos como o antígeno é um antígeno bivalente e é diferente no aspecto de que hsIL-6R é um antígeno monovalente. Quando um anticorpo anti-IgE é adicionado a IgE, um antígeno único pode ser ligado por dois anticorpos e isso leva à formação de um complexo imunológico que compreende múltiplos antígenos e anticorpos conforme observado no Exemplo (1-3). Por si próprio, o anticorpo pode ligar-se apenas de modo monovalente (com afinidade) a FCYR que é um receptor de IgG, mas no caso do complexo imunológico descrito acima que compreende múltiplos antígenos e anticorpos, é possível ligar-se de modo multivalente (com avidez) a FcyR. Por outro lado, no caso de hsIL-6R, um antígeno único pode ser ligado por apenas um anticorpo; portanto, um complexo imunológico que compreende esse antígeno e anticorpo pode apenas ligar-se a FcyR de modo monovalente (com afinidade), e a interação é muito fraca em comparação a quando a ligação ocorre com avidez. Mais especificamente, um complexo imunológico formado por IgE e seu anticorpo se liga fortemente a FcyR com avidez e como resultado, poderia ser removido rapidamente do sangue através do fígado ou de modo que expresse FcyR.
[000387] Além disso, quando um anticorpo se liga ao antígeno, IgE, de uma maneira dependente de pH, o complexo imunológico antígeno- anticorpo é recolhido em células e, então, o antígeno dissocia no en- dossomo. Então, o antígeno não é reciclado com o anticorpo através de FcRn e o antígeno dissociado é degradado no lisossomo. Como resultado, o antígeno é considerado como eliminado mais rapidamente em comparação a quando a ligação antígeno-anticorpo não é dependente de pH.
EXEMPLO 3 AVALIAÇÃO IN VIVO DE XOLAIR E CLONE 278 QUE TEM LIGAÇÃO DE FCrR REDUZIDA (3-1) OBTENÇÃO DE ANTICORPO IGE ANTI-HUMANO COM LIGA- ÇÃO DE FCrR REDUZIDA
[000388] Em seguida, para verificar se a aceleração de eliminação de antígeno observada no Exemplo 2 surge da interação entre o complexo imunológico e FCYR, uma variante que tem ligação reduzida a FCYRS de camundongos foi produzida a partir de 278-IgG1 que se liga a IgE humana de uma maneira dependente de pH. Para reduzir a ligação a FcyRs de camundongo, Leu na posição 235 foi substituída por Arg e Ser na posição 239 foi substituída por Lys em 278-IgG1, em conformidade com a numeração de EU, para produzir 278-F760 (cadeia leve SEQ ID NO: 11). As sequências de DNA que codificam esses genes foram inseridas em plasmídeos para expressão em animais por um método conhecido por aqueles versados na técnica. Essas variantes de anticorpo expressas pelo método descrito acima com o uso de células de animal introduzidas com os plasmídeos foram purificadas e, então, suas concentrações foram determinadas.
(3-2) VERIFICAÇÃO DO EFEITO DE XOLAIR E CLONE 278 QUE TEM LIGAÇÃO DE FCrR REDUZIDA PARA ACELERAR A ELIMINAÇÃO DE IGE HUMANA COM O USO DE CAMUNDONGOS NORMAIS
[000389] Por um método similar àquele de (2-2), camundongos normais foram usados para verificar o efeito de eliminação de IgE obtido quando 278-F760 (cadeia leve SEQ ID NO: 11) que tem ligação reduzida a FcyR de camundongo foi administrado.
(3-3) MEDIÇÃO DE CONCENTRAÇÃO DE HIGE (ASP6) EM PLASMA EM CAMUNDONGOS NORMAIS
[000390] As concentrações de hIgE emplasma em camundongos normais foram medidas por um método similar àquele de (2-3). A mudança na concentração de hIgE em plasma após a administração intravenosa medida por esse método é mostrada na Figura 4. Para comparação, a mudança em concentração de hIgE em plasma medi- ante administração de 278-IgG1 obtido em (2-3) é também mostrada na figura.
(3-4) MEDIÇÃO DE CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPO IGE ANTI- HUMANO EM PLASMA EM CAMUNDONGOS NORMAIS
[000391] A concentração de anticorpo anti-IgE em plasma em camundongos normais foi medida por um método similar àquele de (2-4).
[000392] A mudança na concentração de anticorpo em plasma após a administração intravenosa medida por esse método é mostrada na Figura 5. Para comparação, a mudança em concentração de anticorpo em plasma em relação a 278-IgG1 obtido em (2-3) é também mostrada na figura.
[000393] Nos resultados dos presentes Exemplos, nenhuma mudança principal troca de concentração de anticorpo em plasma foi observada reduzindo-se a ligação de anticorpo a FCYR; no entanto, o efeito de aceleração de eliminação de antígeno de clone 278 mediante administração de anticorpo IgG1 observada no Exemplo 2 foi consideravelmente atenuado. Mais especificamente, a aceleração de eliminação de IgE observada mediante administração simultânea com um anticorpo anti-IgE no Exemplo 2 mostrou ser derivada da interação entre o anticorpo administrado e FcyR.
[000394] Dessa forma, para remover de modo eficaz antígenos alvo com o uso de anticorpos, pode ser necessário formar um complexo imunológico que compreende múltiplos antígenos e anticorpos, manter a ligação de FcyR do anticorpo em um grau similar àquele de um anticorpo IgG1 nativo e, de preferência, ter ligação dependente de pH do anticorpo ao antígeno (ligação de antígeno sob condições de pH ácido é reduzida em comparação à ligação sob condições neutras).
EXEMPLO 4 PRODUÇÃO DE VARIANTES CUJA LIGAÇÃO A FcgRIIb É MANTIDA A UM NÍVEL SIMILAR ÀQUELE DO TIPO NATIVO ENQUANTO A LIGAÇÃO A OUTROS FcgRs FOI ATENUADA (4-1) PESQUISA DE ALTERAÇÕES A SEREM COMBINADAS COM A ALTERAÇÃO DE P238D PARA MANTER A LIGAÇÃO A FCGRIIB E REDUZIR A LIGAÇÃO A FcgRIIaR
[000395] Na produção de um anticorpo com ligação seletivamente reduzida apenas para FcgRs de ativação e enquanto a ligação a FcgRIIb é mantida em um nível similar àquele de uma IgG1 nativa, o problema mais difícil é diferenciar entre FcgRIIa e FcgRIIb que têm homologia de sequência de aminoácidos muito alta a fim de reduzir seletivamente a atividade de ligação. FcgRIIa tem formas polimórficas, uma em que o aminoácido na posição 131 é Arg e a outra em que esse aminoácido é His. O resíduo em FcgRIIb correspondente a esse resíduo é Arg e, portanto, a sequência de FcgRIIb é mais similar à sequência do tipo R de FcgRIIa. Portanto, entre os FcgRIIas, diferenciar o tipo R de FcgRIIa de FcgRIIb foi considerado como sendo um problema particularmente difícil. Como uma alteração para aprimorar a seletividade de ligação para FcgRIIb em relação a FcgRIIaR, a alteração de substituição de Asp por Pro na posição 238 em conformidade com a numeração de EU foi relatada no documento WO2012/115241. A presente pesquisa visa usar um anticorpo que contém essa alteração como o modelo para produzir variantes cuja ligação a FcgRIIb é mantida a um nível similar àquele da IgG1 nativa enquanto a ligação a outros FcgRs é atenuada o máximo possível.
[000396] Com base nos resultados de análise de estrutura de cristal de raios X de um complexo formado entre Fc(P238D) e a região extra- celular de FcyRIIb obtida no Exemplo 5 do documento WO2012/115241, alterações foram introduzidas de modo abrangente em um Fc alterado com substituição de Asp por Pro na posição 238 em conformidade com a numeração de EU em sítios que se prevê que afetem a interação com FcyRIIb (os resíduos nas posições 233, 234, 235, 236, 237, 239, 240, 241, 263, 265, 266, 267, 268, 271, 273, 295, 296, 298, 300, 323, 325, 326, 327, 328, 330, 332 e 334 em conformidade com a numeração de EU); e a interação com cada FCYR foi avaliada.
[000397] A região variável de IL6R-H (SEQ ID NO: 17), que é a região variável do anticorpo contra o receptor de interleucina 6 humano revelado no documento WO 2009/125825, foi produzida como a região variável de cadeia H de anticorpo, e IL6R-G1d (SEQ ID NO: 3), que compreende G1d preparado por deleção das Gly e Lys C-terminais de IgG1 humana, foi produzida como a região constante de cadeia H de anticorpo. Em seguida, o método do Exemplo de Referência 1 foi seguido usando-se Asp em lugar de Pro na posição 238 em IL6R-G1d, em conformidade com a numeração de EU, para produzir IL6R-F648. Dois tipos de cadeias H foram preparadas como a cadeia G de modelo para introduzir alterações abrangentes: IL6R-F652 (SEQ ID NO: 1) produzida por introdução de M252Y e N434Y a IL6R-F648; e IL6R- BF648 (SEQ ID NO: 2) produzida por introdução de K439E a IL6R- F648. O sítio mencionado acima de IL6R-F652 ou IL6R-BF648 foi introduzido com 18 tipos de aminoácidos, excluindo o aminoácido original e Cys. IL6R-L (SEQ ID NO: 6) foi utilizada como uma cadeia L de anticorpo comum e, juntamente com a respectiva cadeia H, os anticorpos foram expressos e purificados de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. Essas variantes de anticorpo foram expressas e purificadas de acordo com o método do Exemplo de Referência 1, e a ligação de cada um dos FCYRS (FcYRIa, FcyRIIa tipo H, FcyRIIa tipo R, FcyRIIb, FcyRIIIa tipo V) foi avaliada de modo abrangente pelo método do Exemplo de Referência 2.
[000398] Como resultado, L235F, G237Q, F241M, F241L, H268P, Q295M, Q295V, Y296E, Y296H, Y296N, Y296D, S298A, S298M, V323I, S324N, S324H, A330H e A330Y mostraram ter alterações que reduzem a ligação a FcgRIIaR sem diminuir grandemente a ligação a FcgRIIb quando combinados com a alteração de P238D (Tabelas 7 e 8).
[000399] A Tabela 7 e a Tabela 8 mostram respectivamente as atividades de ligação de FcgRIIaR e FcgRIIb de variantes reveladas por alterações de introdução abrangente em IL6R-F652/IL6R-L e em IL6R- BF648/IL6R-L. Esses valores são obtidos por divisão de valores pela quantidade de cada variante ligada a FcgRIIaR ou FcgRIIb pelos valores pela quantidade de IL6R-F652/IL6R-L ou IL6R-BF648/IL6R-L ligada à respectiva FcgR e, então, multiplicar esses valores por 100.
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[000400] A partir d os resultados mostrados nas Tabe as 7 e 8, todas essas alterações mostraram ser aquelas que reduzem a ligação de FcgRIIaR enquanto mantêm a ligação de FcgRIIb em pelo menos 55,5% ou mais em comparação a antes da introdução da alteração.
[000401] Portanto, a presente pesquisa examinou a produção de variantes cuja ligação de FcgRIIaR é reduzida o máximo possível enquanto a ligação de FcgRIIb é mantida em um nível similar àquele de IgG1 por combinação adicional dessas alterações. Especificamente, as alterações consideradas para reduzir seletivamente a ligação a FcgRs de ativação em comparação a antes da introdução das alterações nas Tabelas 7 e 8 ou combinações das mesmas foram introduzidas em IL6R-F648. IL6R-L (SEQ ID NO: 6) foi utilizada como uma cadeia L de anticorpo comum e, juntamente com a respectiva cadeia H, os anticorpos foram expressos e purificados de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. A ligação das variantes obtidas a FcgRIa, FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb e FcgRIIIaV foi avaliada de acordo com o método do Exemplo de Referência 2. A Tabela 9 mostra as atividades de ligação relativas de cada variante para FcgRIIaR e FcgRIIb. Esses são valores obtidos por divisão de valores pela quantidade de cada variante ligada a FcgRIIaR ou FcgRIIb por valores pela quantidade de IL6R-G1d/IL6R-L ligada a FcgRIIaR ou FcgRIIb e, então, multiplicar esses valores por 100.
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[000402] Dentre as variantes mostradas na Tabela 9, as variantes cuja ligação de FcgRIIaR foi reduzida em 30% ou menos e a ligação de FcgRIIb foi mantida em 80% ou mais em comparação àquelas de IL6R- G1d/IL6R-L são mostradas na Tabela 10 juntamente com seus valores KD para cada FcgR. A atividade de ligação relativa na Tabela é um valor obtido por divisão do valor KD de IL6R-G1d/IL6R-L pelo valor KD de cada variante e representa a atividade de ligação relativa de cada variante quando o valor KD de IL6R-G1d/IL6R-L para cada FcgR é definido em 1. Entre os valores KD mostrados na tabela, os valores nas caixas cinza sólidas são valores calculados utilizando-se a Equação 2 do Exemplo de Referência 2, já que a ligação der FcgR a cada variante é muito fraca e não pode ser analisada precisamente por análise cinética. EQUAÇÃO 2
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[000403] Entre as alterações introduzidas nesse exame, foi mostrado que P589 produzido por introdução de Y296E, P590 produzido por introdução de F241M, P594 produzido por introdução de F241L, P595 produzido por introdução de Q295V, P597 produzido por introdução de Y296H, P600 produzido por introdução de S298A, P601 produzido por introdução de S298M, P718 produzido por introdução de H268P, P719 produzido por introdução de S324N, P720 produzido por introdução de S324H, P721 produzido por introdução de A330H, P722 produzido por introdução de A330Y, P723 produzido por introdução de L235F, P724 produzido por introdução de G237Q e P725 produzido por introdução de Y296D têm um efeito de redução de ligação de FcgRIIaR em comparação à ligação por F648 antes da introdução da alteração, enquanto mantêm a ligação de FcgRIIb até o mesmo nível que ou mais forte do que a ligação por G1d. Entre esses, P600 produzido por introdução de S298A teve a ligação de FcgRIIaR mais reduzida. A ligação de FcgRIIaR foi reduzida em 0,026 vezes enquanto a ligação de FcgRIIb foi mantida em 1,2 vezes aquela de G1d.
[000404] Como resultado de exame de combinações de alterações que mostraram um efeito de redução seletiva de ligação a FcgRs de ativação, P727 mostrou ter 1,0 vez ou mais a ligação de FcgRIIb em comparação àquela de G1d e a ligação de FcgRIIaR mais reduzida. Em P727, a ligação de FcgRIIb foi mantida a 1,1 vez aquela de G1d e a ligação de FcgRIIaR foi atenuada a 0,012 vez. Além disso, como sua ligação de FcgRIa foi 0,0014 vez aquela de G1d, a ligação de FcgRIIaH foi atenuada a 0,007 vez e a ligação de FcgRIIIaV foi atenuada a 0,005 vez, essa mostrou ser uma variante excelente que tem ligação seletivamente atenuada a FcgRs de ativação além de FcgRIIb.
(4-2) EXAME DE REDUÇÃO DE LIGAÇÃO DE FCGRIIAR DE VARIANTES COM LIGAÇÃO DE FcgRIIB ACENTUADA
[000405] Em seguida, esperava-se que as variantes cuja ligação de FcgRIIb é mantida em um nível similar àquele de IgG1 enquanto a ligação a outros FcgRs é reduzida em comparação àquelas de IgG1 fossem obteníveis por introdução de alterações que reduzem a ligação a todos os FcgRs, incluindo FcgRIIb, em uma variante de modelo com ligação de FcgRIIb seletivamente acentuada, mas cuja ligação a outros FcgRs não foi acentuada ou foi reduzida.
[000406] Primeiramente, IL6R-B3 (SEQ ID NO: 4) foi produzida por introdução de K439E em IL6R-G1d (SEQ ID NO: 3). A introdução de ligação seletiva de FcgRIIb em combinação em IL6R-B3 produziu variantes com ligação de FcgRIIb acentuada seletivamente. IL6R-L (SEQ ID NO: 6) foi utilizada como uma cadeia L de anticorpo comum e, juntamente com a respectiva cadeia H, os anticorpos foram expressos e purificados de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. A ligação das variantes obtidas a FcgRIa, FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb e FcgRIIIaV foi avaliada de acordo com o método do Exemplo de Referência 2. As atividades de ligação das variantes produzidas para cada FcgR são mostradas na Tabela 11. As atividades de ligação relativas na Tabela são valores obtidos por divisão do valor KD de IL6R- B3/IL6R-L pelo valor KD de cada variante e representam as atividades de ligação relativas para cada variante quando o valor KD de IL6R- B3/IL6R-L para cada FcgR é definido em 1. "KD(IIaR)/KD(IIb)" é um valor obtido por divisão do valor KD de cada variante para FcgRIIaR pelo valor KD da variante para FcgRIIb; e quanto maior esse valor, mais alta a seletividade para FcgRIIb. Entre os valores KD mostrados na tabela, os valores nas caixas cinza sólidas são valores calculados utilizando-se a Equação 2 do Exemplo de Referência 2, já que a ligação der FcgR a cada variante é muito fraca e não pode ser analisada precisamente por análise cinética. EQUAÇÃO 2
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[000407] Todas as variantes na Tabela 11 tiveram ligação de FcgRIIb acentuada em comparação àquela de IL6R-B3/IL6R-L, e o grau de acentuação de ligação de FcgRIIb em comparação àquele de IL6R-B3/IL6R-L foi 2,6 vezes a 3.090 vezes. Além disso, enquanto KD(IIaR)/KD(IIb) para IL6R-B3/IL6R-L foi 0,3, aqueles para as variantes mostradas na Tabela 11 estavam na faixa de 8,7 a 64,4, e as seletividades (KD(IIaR)/KD(IIb)) de todas as variantes para FcgRIIb foram aprimoradas em comparação àquelas de IL6R-B3/IL6R-L.
[000408] A introdução de alterações que reduzem a ligação a todos os FcgRs nessas variantes com ligações de FcgRIIb seletivamente acentuada para render variantes cuja ligação de FcgRIIb é mantida em um nível similar àquele de IgG1 enquanto a ligação a outros FcgRs de ativação é reduzida seletivamente em comparação àquelas de IgG1. Então, foi verificado se as variantes podem ser obtidas conforme previsto acima, usando- se na verdade dois tipos de alterações introduzidas em IL6R-BP568/IL6R- L e IL6R-BP489/IL6R-L que acentual seletivamente a ligação de FcgRIIb. Especificamente, as variantes introduzidas com as duas alterações men-cionadas acima que acentual seletivamente a ligação de FcgRIIb foram usadas como modelos para confirmar que é possível obter variantes com ligação de FcgRIIb mantida em um nível similar àquele de IgG1, mas cuja ligação a outros FcgRs de ativação é reduzida seletivamente em comparação àquelas de IgG1. Mais especificamente, introduzindo-se em IL6R- G1d alterações que acentual a ligação de FcgRIIb conforme usado em IL6R-BP568/IL6R-L e IL6R-BP489/IL6R-L, dois tipos de variantes com ligação de FcgRIIb seletivamente acentuada, IL6R-P577 e IL6R-P587, foram produzidos. IL6R-L (SEQ ID NO: 6) foi utilizada como uma cadeia L de anticorpo comum e, juntamente com a respectiva cadeia H, os anticorpos foram expressos e purificados de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. Os valores KD dessas duas variantes para cada FcgR são mostradas na Tabela 12.
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[000409] A ligação de P577 a FcgRIIaR foi 21,9 vezes aquela de G1d, e sua ligação a FcgRIIb foi 3.370,7 vezes aquela de G1d. A ligação de P587 a FcgRIIaR foi 1,4 vezes aquela de G1d, e sua ligação a FcgRIIb foi 255,6 vezes aquela de G1d.
[000410] Introduzindo-se alterações que reduzem a ligação a todos os FcgRs nos dois tipos preparados de variantes com ligação acentuada a FcgRIIb, foi examinada a produção de variantes cuja ligação de FcgRIIb é mantida em um nível similar àquele de uma IgG1 nativa enquanto a ligação a outros FcgRs, em particular FcgRIIaR, é atenuada o máximo possível. As alterações que reduzem grandemente a ligação de FcgRIIaR foram encontradas através de uma pesquisa que envolve introdução abrangente de alterações aos resíduos de interação de FcgR. Adicionalmente à introdução abrangente de alterações nas posições 234, 235, 236, 237 e 239 de IL6R-F652/IL6R-L em conformidade com a numeração de EU conforme mostrado no Exemplo 4-1, a introdução abrangente de alterações foi executada com ligação de FcgRIIb seletivamente acentuada.
[000411] As alterações que acentual a ligação de FcgRIIb (E233D/G237D/H268E/P271G) conforme relatado no documento WO2012/115241 foram introduzidas em IL6R-BF648 (SEQ ID NO: 2) para produzir IL6R-BP267 (SEQ ID NO: 5). As variantes com substituições nas posições 265, 266, 267 e 269 de IL6R-BP267, em conformidade com a numeração de EU, com 18 tipos de aminoácidos, excluindo o aminoácido original e Cys, foram produzidas. IL6R-L (SEQ ID NO: 6) foi utilizada como uma cadeia L de anticorpo comum e, juntamente com a respectiva cadeia H, os anticorpos foram expressos e purificados de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. Essas variantes de anticorpo foram expressas e purificadas de acordo com o método do Exemplo de Referência 1, e a ligação de cada um dos FCYRS (FcYRIa, FcyRIIa tipo H, FcyRIIa tipo R, FcyRIIb, FcyRIIIa tipo V) foi avaliada de modo abrangente pelo método do Exemplo de Referência 2. As atividades de ligação relativas de FcgRIIaR e FcgRIIb de variantes reveladas por introdução abrangente de alterações em IL6R- F652/IL6R-L e IL6R-BP267/IL6R-L são mostradas na Tabela 13 e na Tabela 14, respectivamente. Esses valores são obtidos por divisão de valores pela quantidade de cada variante ligada a FcgRIIaR ou FcgRIIb por valores pela quantidade de IL6R-F652/IL6R-L ou IL6R- BF267/IL6R-L ligada à respectiva FcgR e, então, multiplicar esses valores por 100.
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[000412] A partir dos resultados mostrados nas Tabelas 13 e 14, as alterações mostraram reduzir a ligação de FcgRIIaR a pelo menos 67% ou menos em comparação a antes da introdução das alterações e incluíram algumas que levam à perda completa de ligação de FcgRIIaR.
[000413] Em seguida, essas alterações foram introduzidas em variantes com ligação de FcgRIIb seletivamente acentuada e, então, examinadas. Especificamente, 17 alterações mostradas nas Tabelas 13 e 14 foram introduzidas em IL6R-P577 e IL6R-P587 de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. Foi relatado que remover a cadeia de açúcar tipo N ligada a Asn na posição 297 da região Fc, em conformidade com a numeração de EU, reduz consideravelmente a ligação de FcgR por anticorpos (The Journal of Biological Chemistry, 2000, 276, 6.591 a 6.604). Portanto, nesse exemplo, adicionalmente às 17 alterações descritas acima, N297A foi introduzido em IL6R-P577 e IL6R-P587 de acordo com o método do Exemplo de Referência 1 para remover a cadeia de açúcar do tipo N ligada a Asn297. IL6R-L (SEQ ID NO: 6) foi utilizada como uma cadeia L de anticorpo comum e, juntamente com a respectiva cadeia H, os anticorpos foram expressos e purificados de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. A ligação das variantes obtidas a FcgRIa, FcgRIIaR, FcgRIIaH, FcgRIIb e FcgRIIIaV foi avaliada de acordo com o método do Exemplo de Referência 2. A Tabela 15 mostra as atividades de ligação relativas de cada variante a FcgRIIaR e FcgRIIb. Esses valores são obtidos por divisão de valores pela quantidade de cada variante ligada a FcgRIIaR ou FcgRIIb por valores pela quantidade de IL6R-G1d/IL6R-L ligada a FcgRIIaR ou FcgRIIb e, então, multiplicar esses valores por 100.
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[000414] Conforme mostrado na Tabela 15, as variantes P606 e P607 produzidas por introdução de S239K, P630 e P645 produzidas por introdução de D265K, P632 e P647 produzidas por introdução de D265R e P634 e P649 produzidas por introdução de D265V dificilmente mostraram qualquer ligação a FcgRIIaR e FcgRIIb. Isso significa que essas alterações reduzirão consideravelmente a atividade de ligação de FcgRIIb mesmo se forem introduzidas em variantes com ligação de FcgRIIb acentuada. Por outro lado, P636 produzido por introdução de S267R em P587 e P665 produzido por introdução de N297A em P577 mostraram quase a mesma ligação de FcgRIIb que aquela de G1d e reduziu grandemente a ligação de FcgRIIaR.
[000415] Dentre as variantes mostradas na Tabela 15, as variantes com ligação de FcgRIIb mantiveram 80% ou mais da atividade de ligação de G1d, e a ligação de FcgRIIaR suprimida a 30% ou menos da atividade de ligação de G1d, e seus valores KD para cada FcgR são mostrados na Tabela 16. A atividade de ligação relativa na Tabela é um valor obtido por divisão do valor KD de IL6R-G1d/IL6R-L pelo valor KD de cada variante e representa a atividade de ligação relativa de cada variante quando o valor KD de IL6R-G1d/IL6R-L para cada FcgR é definido em 1. Entre os valores KD mostrados na tabela, os valores nas caixas cinza sólidas são valores calculados utilizando-se a Equação 2 do Exemplo de Referência 2, já que a ligação der FcgR a cada variante é muito fraca e não pode ser analisada precisamente por análise cinética. EQUAÇÃO 2
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[000416] Entre essas variantes, aquela que mostrou a ligação de FcgRIIaR mais reduzida foi P636 produzida por introdução de S267R em P587. A KD de P636 para FcgRIIaR foi 0,023 vez aquela de G1d, mas a KD para FcgRIIb foi mantida a 1,8 vez aquela de G1d. Além disso, a ligação de FcgRIa foi suprimida a 0,0007 vezes aquela de G1d, a ligação de FcgRIIaH foi suprimida a 0,006 vez, e a ligação de FcgRIIIaV foi suprimida a 0,008 vez. Os resultados mencionados acima mostraram que é possível obter variantes cuja ligação de FcgRIIb é mantida em um nível similar àquele de IgG1 enquanto a ligação a outros FcgRs é reduzida em comparação àquelas de IgG1 por introdução de alterações que reduzem a ligação a todos os FcgRs em uma variante com ligação de FcgRIIb seletivamente acentuada.
(4-3) EXAME DE UMA COMBINAÇÃO DE ALTERAÇÕES QUE TEM UM EFEITO DE REDUÇÃO DE LIGAÇÃO DE FCGRIIAR
[000417] A produção de variantes melhores foi examinada por combinação de alterações encontradas em 4-1 e 4-2 que mantêm a ligação de FcgRIIb em um nível similar àquele de G1d enquanto reduzem a ligação de FcgRIIaR.
[000418] Os resultados de exame das combinações são mostrados na Tabela 17. As atividades de ligação relativas na Tabela são valores obtidos por divisão do valor KD de IL6R-G1d/IL6R-L pelo valor KD de cada variante e representam as atividades de ligação relativas para cada variante quando o valor KD de IL6R-G1d/IL6R-L para cada FcgR é definido em 1. Entre os valores KD mostrados na tabela, os valores nas caixas cinza sólidas são valores calculados utilizando-se a Equação 2 do Exemplo de Referência 2, já que a ligação der FcgR a cada variante é muito fraca e não pode ser analisada precisamente por análise cinética. EQUAÇÃO 2
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[000419] Entre as variantes mostradas na Tabela 17, aquela que mostra a ligação de FcgRIIaR mais reduzida foi P712 produzida por introdução de uma combinação de S267R, H268P e Y296E em P587, que é uma variante com ligação de FcgRIIb seletivamente acentuada; e sua ligação de FcgRIIb foi mantida em 1,5 vez aquela de G1d enquanto sua ligação de FcgRIIaR foi reduzida a 0,017 vez aquela de G1d. Além disso, sua ligação de FcgRIa foi suprimida a 0,0005 vezes aquela de G1d, a ligação de FcgRIIaH foi suprimida a 0,003 vez, e a ligação de FcgRIIIaV foi suprimida a 0,004 vez.
EXEMPLO 5 PRODUÇÃO DE VARIANTES CUJA LIGAÇÃO DE FCGRIIB É MANTIDA EM UM NÍVEL SIMILAR ÀQUELE DO TIPO NATIVO, COM LIGAÇÃO ATENUADA A OUTROS FCGRS ASSIM COMO LIGAÇÃO COMPLEMENTAR ATENUADA
[000420] Similarmente a ADCC, a citotoxicidade dependente de complemento (CDC) é uma função efetora que inicia a resposta imu- nológica. Todas as variantes produzidas até o momento têm atividades de ligação grandemente reduzidas para receptores de ativação, exceto para FcgRIIb, e suas atividades de ADCC são consideradas como sendo grandemente atenuadas. No entanto, como o sítio de ligação entre um anticorpo e um complemento é diferente do sítio de ligação entre um anticorpo e um FcgR, é possível que a atividade de ligação complementar seja mantida. Portanto, a atividade de ligação comple-mentar de cada variante foi avaliada, e as variantes com ligação com-plementar atenuada foram produzidas por combinação de alterações que reduzem a ligação complementar.
[000421] A interação entre um anticorpo e C1q humano foi analisada com o uso de Biacore T200 (GE Healthcare). HBS-EP+ (GE Healthcare) foi usado como o tampão contínuo e a temperatura de medição foi ajustada a 25 °C. Chips produzidos por imobilização de Proteína L (ACTIGEN ou BioVision) em Chip de sensor de Série S CM4 (GE Healthcare) por acoplamento de amina foram usados.
[000422] Os anticorpos de interesse foram capturados nesses chips de sensor e deixados interagir com o complemento humano C1q (PROSPEC ou Calbiochem) diluído no tampão contínuo. A quantidade de anticorpo ligação foi determinada, e as comparações forma feitas entre os anticorpos. No entanto, como a quantidade de C1q ligado depende da quantidade de anticorpos capturados, os valores corrigidos obtidos por divisão da quantidade de C1q ligado pela quantidade de cada anticorpo capturado foram comparados. Além disso, por reação com 10 mM de glicina-HCl, pH 1,5, os anticorpos capturados nos chips de sensor foram lavados e os chips sensor foram reciclados e reutilizados.
[000423] Para a alteração reduzir a ligação de C1q, K322A descrito e um documento anterior (J. Immunol, 2003, 164, 4.178 a 4.184) foi usado. Além disso, como era também esperado que o uso de Glu com carga oposta no lugar de Lys na posição 322 em conformidade com a numeração de EU reduzisse a ligação de C1q, K322E foi também examinado. Além disso, a atividade de CDC consideravelmente baixa de IgG4 em comparação a IgG1 foi relatada como sendo causada pela diferença nas sequências C-terminais dos domínios CH2 (J. Exp. Med., 1991, 173, 1.025 a 1.028). Portanto, a redução da ligação de C1q com o uso de Gly no lugar de Ala na posição 327, Ser no lugar de Ala na posição 330 e Ser no lugar de Pro na posição 331 de IgG1, em conformidade com a numeração de EU, para produzir uma sequência do tipo IgG4 foi também examinada.
[000424] A ligação de C1q humano foi avaliada para as variantes com ligação de FcgRIIb acentuada e variantes com ligação de FcgRIIb mantida assim como ligação reduzida para outros FcgRs. As variantes foram produzidas por combinação das variantes acima com alterações que reduzem a ligação de C1q, e as variantes foram avaliadas. Além disso, a ligação a cada FcgR foi avaliada para todas as variantes produzidas de acordo com o método do Exemplo de Referência 2. A IgG4 humana foi usada como um controle negativo para avaliação de ligação de C1q. IL6R-G4d (SEQ ID NO: 52), que compreende G4d preparado com o uso de Pro no lugar de Ser na posição 228 em conformidade com a numeração de EU e remoção de Gly e Lys do terminal C de IgG4 humana, foi produzida. IL6R-L (SEQ ID NO: 6) foi utilizada como cadeia L de anticorpo comum.
[000425] A Tabela 18 mostra os resultados de avaliação da ligação das variantes produzidas para C1q humano. "Quantidade de ligação de C1q quando aquela para G1d é definida como 100" na tabela é um valor obtido por divisão da quantidade de C1q ligado a cada variante pela quantidade de cada variante capturada, então divisão do mesmo pelo valor obtido por divisão da quantidade de C1q ligado a IL6R- G1d/IL6R-L pela quantidade de IL6R-G1d/IL6R-L capturada e, então, multiplicação desse valor por 100. Mais especificamente, é um valor que mostra o nível de of ligação de C1q em comparação àquele de IL6R-G1d/IL6R-L.
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[000426] Quando o valor para G1d que compreende a sequência nativa foi definido como 100, o valor para o controle negativo, G4d, foi 15,5. A ligação de C1q de G1dK322A, G1dK322E e G1dGSS que foi produzido por introdução em G1d alterações que reduzem a ligação de C1q teve valores de 20,5, 2,3 e 15,2, respectivamente, que foram valores equivalentes a ou menores do que aqueles de G4d. Isso mostrou que a ligação de C1q foi grandemente reduzida em comparação a antes da introdução das alterações. Além disso, F648 produzido por introdução da alteração de P238D que acentua seletivamente a ligação de FcgRIIB mostrou ter ligação de C1q quase igual àquela de G4d mesmo sem o uso de alterações que reduzem a ligação de C1q. A capacidade de ligação de C1q de P741, P742 e P743 produzidos por introdução adicional de alterações que reduzem a ligação de C1q nessas variantes tiveram todos os valores equivalentes ou menores do que aqueles de G4d.
[000427] Entre P600, P691, P727, P729, P733 e P737 que são variantes com sua ligação de FcgRIIb mantida no mesmo nível que aquele do tipo nativo e a capacidade atenuada de ligar-se a outros FcgRs, P600, P691, P729 e P733, todos, tiveram uma atividade de ligação de C1q equivalente àquela de G4d. Por outro lado, embora P727 e P737 tenham mostrado capacidades de ligação amplamente atenuadas em comparação àquelas de G1d, as mesmas foram duas vezes ou mais altas em comparação àquela de G4d. A alteração de A330H é comu- mente introduzida em ambas as variantes e acredita-se que acentue a ligação de C1q. Introduzindo-se em todas as variantes K322A ou K322E que são alterações que reduzem a ligação de C1q, a atividade de ligação de C1q foi suprimida a um nível menor do que aquele de G4d.
[000428] Entre P587, P588, P769, P112, P555, P556, P559, P562, P763, P764 e P765 que são variantes de com ligação de FcgRIIb acentuada, P587 e P588 mostraram ter ligação de C1q igual ou maior do que aquela de G1d. Além disso, em comparação a G1d, as capacidades de ligação de P769, P556, P559, P562, P763 e P765 foram grandemente atenuadas; no entanto, foram quase duas vezes aquela de G4d. Por outro lado, as atividades de ligação de C1q de P112 e P764 foram quase iguais àquela de G4d. Além disso, introduzir alterações que reduzem a ligação de C1q suprimiu as atividades de ligação de C1q em todas as variantes a níveis equivalentes a ou menores do que aqueles de G4d.
[000429] A Tabela 19 mostra as atividades de ligação relativas de cada variante para FcgRIIaR e FcgRIIb. Esses valores são obtidos por divisão de valores pela quantidade de cada variante ligada a FcgRIIaR ou FcgRIIb por valores pela quantidade de IL6R-G1d/IL6R-L ligada a FcgRIIaR ou FcgRIIb e, então, multiplicar os valores por 100. TABELA 19
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[000430] As variantes contendo alterações que reduzem a ligação complementar mostradas na Tabela 19 tinham uma atividade de ligação de FcgRIIaR relativa 105% ou menos em comparação àquela de G1d, e uma atividade de ligação de FcgRIIb relativa mantida a 48% ou mais em comparação àquela de G1d.
[000431] A ligação dessas variantes a cada FcgR é mostrada na Tabela 20. A atividade de ligação relativa na Tabela é um valor obtido por divisão do valor KD de IL6R-G1d/IL6R-L pelo valor KD de cada variante e representa a atividade de ligação relativa de cada variante quando o valor KD de IL6R-G1d/IL6R-L para cada FcgR é definido em 1. Entre os valores KD mostrados na tabela, os valores nas caixas cinza sóli- das são valores calculados utilizando-se a Equação 2 do Exemplo de Referência 2, já que a ligação der FcgR a cada variante é muito fraca e não pode ser analisada precisamente por análise cinética. EQUAÇÃO 2
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[000432] Comparar os efeitos das alterações que reduzem ligação de C1q na capacidade de ligação de FcgRIIb mostra que a capacidade de ligação de G1dK322A produzido por introdução de K322A em G1d foi 1,0 vez aquela de G1d, a capacidade de ligação de G1dK322E produzido por introdução de K322E foi 1,1 vez aquela de G1d, a capacidade de ligação de G1dGSS produzido por introdução de A327G/A330S/P331S foi 0,9 vez aquela de G1d; e todas as alterações que reduzem a ligação de C1q dificilmente têm quaisquer efeitos sobre a ligação de FcgRIIb. Em P741 produzido por introdução de K322A em F648 que contém a alteração de P238D que acentua seletivamente a ligação de FcgRIIb ou em P742 produzido por introdução de K322E em F648, a ligação de hFcgRIIb foi dificilmente alterada em comparação àquela de F648 antes da introdução da alteração, enquanto em P743 produzido por introdução de A327G/A330S/P331S, a capacidade de ligação de FcgRIIb diminui ligeiramente e torna-se 0,6 vez aquela de G1d. A partir dos resultados mencionados acima, quando combinadas com P238D, as alterações K322A e K322E atenuam a capacidade de ligação de C1q sem reduzir a capacidade de ligar-se a FcgRIIb, mas as alterações A327G/A330S/P331S mostraram diminuir ligeiramente a capacidade de ligação de FcgRIIb. Os mesmos resultados foram obtidos quando as alterações foram introduzidas em outras variantes que portam a alteração P238D. Por exemplo, a ligação de FcgRIIb de P744 produzido por introdução de K322A em P600 foi 0,7 vez em comparação àquela de G1d, a ligação de P745 produzido por introdução de K322E foi 0,7 vez aquela de G1d, e a ligação de P781 produzido por introdução de A327G/A330S/P331S foi 0,2 vez aquela de G1d, que foi um pouco diminuída.
[000433] Por outro lado, do ponto de vista de imunogenicidade, em vez de introduzir a alteração K322A ou K322E, introduzir A327G/A330S/P331S, que é da sequência de IgG4 humana nativa, pode ser mais preferencial. Portanto, ao introduzir alterações que reduzem a ligação de C1q em uma variante produzida por introdução de alterações que acentuam a ligação de FcgRIIb, a alteração A327G/A330S/P331S pode ser mais preferencial. Por exemplo, a introdução da alteração A327G/A330S/P331S em P787, que foi produzido por introdução combinada de E233D e G237D em P781, resultou em ligação de C1q reduzida e, ao mesmo tempo, não acentuou grandemente a ligação a FcgRs de ativação e aprimorou a ligação de FcgRIIb de 0,2 vez a 0,5 vez.
[000434] As variantes produzidas por esse exame, cuja ligação de FcgRIIb foi acentuada ou mantida e a ligação complementar foi reduzida, todas tiveram ligação de FcgRIIb de 0,2 vez ou mais aquela de G1d e a ligação de FcgRIIaR suprimiu até 1,0 vez ou menos aquela de G1d. Além disso, sua ligação de FcgRIa foi suprimida a 0,85 vezes ou menos aquela de G1d, a ligação de FcgRIIaH foi suprimida a 0,036 vez ou menos aquela de G1d, e a ligação de FcgRIIIaV foi suprimida a 0,012 vez ou menos aquela de G1d. Entre as mesmas, as variantes produzidas por introdução da alteração A327G/A330S/P331S, P756, P757, P758, P759, P760, P761, P762, P766, P767, P768, P770 e P784 todas tiveram ligação de FcgRIIb acentuada em comparação àquela de G1d e sua ligação de FcgRIIaR foi 1,0 vez ou menos aquela de G1d.
[000435] Os resultados mencionados acima mostraram que é possível produzir variantes com seletividade de ligação de FcgRIIb excelente e ligação de C1q atenuada por introdução de alterações que reduzem a ligação complementar em variantes cuja ligação de FcgRIIb foi acentuada ou é mantida no mesmo nível que aquela do tipo nativo e cuja ligação a outros FcgRs foi atenuada.
EXEMPLO 6 AVALIAÇÃO DE CAPACIDADE DE ATIVAÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS (DC)DE VARIANTES DE FC [6-1] AVALIAÇÃO DE CAPACIDADE DE ATIVAÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS (DC)DE VARIANTES DE FC
[000436] Até o momento, as células dendríticas tem sido relatadas como ativadas pela reticulação de FCYRS de ativação, em particular FcyRIIa, expresso na superfície celular através da região Fc de anticorpo (The Journal of Clinical Investigation, 2005, 115, 2.914 a 2.923, The Journal of Immunology, 2003, 170, 3.963 a 3.970). Se a capacidade mediada por região Fc de anticorpo de ativar as células dendríticas é reduzida foi examinado pelas variantes de Fc produzidas no Exemplo 4 com ligação seletivamente reduzida a FcyRs de ativação. (6-2) PREPARTAÇÃO DE VARIANTES DE FC
[000437] XolairH-G1d (SEQ ID NO: 18), XolairH-F648 em que Asp é usada no lugar de Pro na posição 238 de XolairH-G1d em conformidade com a numeração de EU e XolairH-P600 em que Asp é usada no ligar de Pro na posição 238 e Ala é usada no lugar de Ser na posição 298 em conformidade com a numeração de EU em XolairH-G1d, foram preparados de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. Xo- lairL-k0 (SEQ ID NO: 7) foi utilizada como uma cadeia L de anticorpo comum e, juntamente com a respectiva cadeia H, os anticorpos foram expressos e purificados de acordo com o método do Exemplo de Referência 1. As variantes de Fc foram citadas como G1d, F648 e P600, respectivamente. (6-3) ISOLAMENTO DE MONÓCITOS E INDUÇÃO DE DIFERENCIAÇÃO EM CÉLULAS DENDRÍTICAS
[000438] As quantidades equivalentes de sangue inteiro humano e meio RPMI foram misturadas, e a camada de leucócito foi separada por ficol. Os monócitos foram isolados da camada de leucócitos com o uso do Monocyte Isolation Kit II (Miltenyi Biotec). Os monócitos foram colocados no meio RPMI (10% de FBS, 100 ng/ml de hIL-4 (R&D systems), 250 ng/ml de hGM-CSF (R&D systems)) a 5 x 105 células/ml, e as células foram cultivadas a 37 °C por sete dias para induzir a diferenciação em DC. (6-4) REVESTIMENTO DE PLACA E ESTIMULAÇÃO DE DC
[000439] Uma solução contendo a respectiva variante de Fc (G1d, F648 ou P600) diluída com PBS (50 μg/ml) ou PBS foi adicionado a uma placa com 96 cavidades (Maxisorp, Nunc) a 100 μl/poço e a mesma foi agitada à temperatura ambiente por uma hora. A lavagem por três vezes com PBS foi seguida por semeadura de DC a 2 x 105 células/cavidade. Após a incubação a 37 °C por quatro horas, as células foram coletadas e a extração de RNA foi realizada com o uso do Kit RNeasy 96 (QIAGEN). (6-5) AVALIAÇÃO DE EXPRESSÃO DE IL-8
[000440] Os níveis de expressão de mRNA de GAPDH e IL-8 foram determinados por PCR em temo real (Applied Biosystems 7900HT Fast Real Time PCR System) com o uso de QuantiTect Probe RT-PCR (QIAGEN). O nível de expressão de IL-8 foi corrigido pelo nível de expressão de GAPDH. Nesse sistema de avaliação, quando G1d, que é o controle positivo, foi usado, o nível de expressão de IL-8 aumentou para 8,2; em quando PBS foi adicionado em vez da solução de anticorpo, o nível de expressão de IL-8 mostrou ser 0,03.
[000441] Nesse sistema de avaliação, quando os níveis de expressão de IL-8 de DC foram comparados quando as variantes de Fc F648 e P600 foram individualmente adicionadas, os resultados da Figura 6 foram obtidos.
[000442] Esses resultados mostraram que P600 suprime o nível de expressão de IL-8 em DC em comparação a F648 ou, mais especificamente, reduz a propriedade de ativar DC. Em comparação a F648, P600 tem ligação reduzida a FcyRIIa, que é um FCYR de ativação. Portanto, considerou-se que P600 mostra ativação de DC suprimida devido à redução do nível de expressão de IL-8 em DC causado como um resultado de ligação de FcyRIIa reduzida em particular.
[000443] Mais especificamente, isso mostrou que as moléculas de ligação de antígeno que compreendem uma região Fc da presente invenção com ligação seletivamente reduzida a FCYRS de ativação, incluindo FcyRIIa, podem ser moléculas excelentes que superam o problema de ativação de célula imunológica sem perder a propriedade de IgG1 nativa de diminuir rapidamente a concentração de antígeno no plasma.
EXEMPLO 7 AVALIAÇÃO DE CAPACIDADE DE AGREGAÇÃO DE PLAQUETAS DE ANTICORPOS QUE COMPREENDEM UMA REGIÃO FC SUBMETIDA A ALTERAÇÕES EXISTENTES QUE ACENTUAM A LIGAÇÃO DE FcyRIIB (7-1) FUNDAMENTO DE ATIVAÇÃO E AGREGAÇÃO DE PLAQUETAS POR ANTICORPOS IGG1
[000444] Até o momento, diversos anticorpos IgG1 foram relatados por apresentar efeitos colaterais através da indução de ativação de plaquetas através da interação com FcyRs. Por exemplo, o risco de tromboembolismo é conhecido por aumentar no grupo de pacientes que receberam administração de bevacizumab, um anticorpo anti- VEGF (J. Natl. Cancer Inst. (2007) 99 (16), 1.232 a 1.239). Além disso, tromboembolismo foi similarmente observado em estudos de desenvolvimento clínico de anticorpos contra o ligante CD40 (CD154), e os testes clínicos foram descontinuados (Arthritis. Rheum. (2003) 48 (3), 719 a 727). Em plaquetas, FcyRIIa, que é um receptor Fcy de ativação, é expresso em vez de FcyRIIb que é um receptor Fcy inibidor (J. Exp. Med. (2006) 203 (9), 2.157 a 2.164). Estudos posteriores com o uso de modelos de animal sugeriram que os anticorpos administrados causam agregação de plaquetas através da ligação a FcyRIIa em plaquetas e isso resulta em formação de trombo (J. Thromb. Haemost. (2009) 7 (1), 171 a 181, e J. Immunol. (2010) 185 (3), 1.577 a 1.583). Foi rela- tado que em pacientes com lúpus sistêmico eritematoso, que é uma doença autoimune, as plaquetas são ativadas por um mecanismo dependente de FcyRIIa e a ativação de plaquetas está correlacionada à severidade da doença (Sci. Transl. Med. (2010) 2 (47), 47 a 63). Dessa forma, mesmo anticorpos IgG1 nativos podem ativar plaquetas e exibir efeitos colaterais severos. (7-2) AVALIAÇÃO DE ATIVAÇÃO DE PLAQUETAS COM O USO DE ANTICORPOS ANTI-CD154
[000445] A ativação de plaquetas tem sido relatada por originar-se a partir da interação entre FcyRIIa expresso em plaquetas e Fc de IgG1; portanto, se essa ativação de plaquetas pode ser evitada foi examinado com o uso de anticorpos produzidos por redução da ligação de FcyRIIa de IgG1.
[000446] O método do Exemplo de Referência 2 foi usado para preparar 5c8-G1d (cadeia pesada SEQ ID NO: 8, cadeia leve SEQ ID NO: 9), que é um anticorpo IgG1 contra o ligante CD40. Em seguida, o método do Exemplo de Referência 2 foi usado para preparar o anticorpo 5c8-F648 (cadeia leve SEQ ID NO: 9) que compreende uma região Fc em que Asp foi usada no lugar de Pro na posição 238 em conformidade com a numeração de EU na região Fc de 5c8-G1d, que é uma técnica existente com ligação de FcyRIIa reduzida. Adicionalmente, o método do Exemplo de Referência 2 foi usado para preparar o anticorpo 5c8-P600 (cadeia leve SEQ ID NO: 9) que compreende uma região Fc em que Glu foi usada no lugar de Pro na posição 238 e Ala foi usada no lugar de Ser na posição 298 em conformidade com a numeração de EU na região Fc de 5c8-G1d, um anticorpo cuja ligação de FcyRIIa foi adicionalmente reduzida em relação á técnica existente. 5c8-G1d, 5c8- F648 e 5c8-P600 foram citados como G1d, F648 e P600, respectivamente. As capacidades de agregação de plaquetas dessas variantes de Fc foram avaliadas.
[000447] A ativação de plaquetas foi avaliada pelo método abaixo. Em primeiro lugar, aproximadamente 50 ml de sangue inteiro coletado derivado de um doador com polimorfismo de gene de FcyRIIa (R131/R131) foram divididos em alíquotas e colocados em um tubo de coleta de sangue a vácuo de 4,5 ml contendo 0,5 ml de citrato de sódio a 3,2%, o mesmo foi centrifugado a 200 g por 15 minutos, e o so- brenadante foi usado como Plasma Rico em Plaquetas (PRP). O PRP foi lavado com o uso de tampão A (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 12 mM de NaHCO3, 0,42 mM de NaH2PO4, 2 mM de MgCl2, 5 mM de HEPES, 5,55 mM de dextrose, 1,5 U/ml de apirase e 0,35% de BSA) e, então, o tampão foi substituído por tampão B (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 12 mM de NaHCO3, 0,42 mM de NaH2PO4, 2 mM de MgCl2, 5 mM de HEPES, 5,55 mM de dextrose, 2 mM de CaCl2 e 0,35% de BSA). Como resultado, as plaquetas lavadas com uma densidade de aproximadamente 300.000 células^l foram preparadas. 168 μl das plaquetas lavadas foram distribuídos em um cadinho de medição equipado com uma haste de agitação e o mesmo foi colocado em um dispositivo para medir a capacidade de agregação de plaquetas. As plaquetas foram agitadas a 1.000 rpm pela haste de agitação no cadinho mantido a 37,0 °C no dispositivo. Então, 42 μl de uma solução de complexo imunológico que compreende o respectivo anticorpo e antígeno, que foram preparados de modo que as concentrações finais fossem 120 μg/ml de anticorpo e 111 μg/ml de antígeno, foram adicionados; e as plaquetas e o complexo imunológico foram permitidos reagir por cinco minutos. Além disso, fosfato de adenosina (ADP, SIGMA) foi adicionado à solução de reação a uma concentração que não causará agregação secundária e a possibilidade de a ativação ser acentuada foi confirmada.
[000448] A ativação de plaquetas pode ser determinada a partir de um aumento na expressão de marcadores de ativação, tal como CD62p (p-seletina) ou integrina ativada (PAC-1), na superfície de membrana de plaqueta. 2 μl do complexo imunológico foram adicionados a 8 μl das plaquetas lavadas preparadas pelo método anteriormente descrito e os mesmos foram deixados reagir à temperatura ambiente por cinco minutos. Então, ADP foi adicionado a uma concentração que induz ativação ligeira para produzir ativação e foi confirmada a possibilidade de ativação por ADP ter sido acentuada pelo complexo imunológico. Uma amostra preparada por adição de tampão fosfato (pH 7,4) (Gibco) em vez do complexo imunológico foi usada como o controle negativo. Um anticorpo anti-CD62 identificado com PE (BEC-TON DICKINSON), um anticorpo anti-CD61 identificado com PerCP e um anticorpo PAC-1 identificado com FITC (BD bioscience) foram adicionados a cada uma das amostras reagidas para manchamento. A intensidade de fluorescência de cada manchamento foi medida com o uso de um citômetro de fluxo (FACS CantoII, BD bioscience). Quando 5c8-G1d foi adicionado como o controle positivo nesse sistema de ensaio, a expressão de CD62p e a expressão de PAC-1 em plaquetas foram confirmadas como sendo acentuadas.
[000449] As capacidades de ativação de plaquetas de F648 e P600 foram comparadas com o uso desse sistema de ensaio. Os resultados de expressão de CD62p e expressão de integrina ativada quando cada variante de Fc foi ativada são mostrados nas Figuras 7 e 8, respectivamente. A expressão de CD62p e integrina ativada, cujas expressões são induzidas na superfície de membrana de plaqueta por estimulação de ADP, foi acentuada quando F648 foi adicionado, mas não quando P600 foi adicionado.
[000450] Esses resultados mostraram que efeitos supressivos maiores são observados em anticorpos que compreendem uma região Fc que foi alterada para ter ligação de FcyRIIa humano reduzida através de uso de Asp no lugar de Pro na posição 238 e Ala no lugar de Ser na posição 298 em conformidade com a numeração de EU na região Fc de IgG1, em comparação a variantes de Fc da técnica existente cuja ligação de FcyRIIb foi acentuada seletivamente.
[000451] Mais especificamente, foi mostrado que as moléculas de ligação de antígeno que compreendem uma região Fc da presente invenção cuja ligação de FcyRIIa foi reduzida seletivamente ainda mais podem ser moléculas excelentes que superaram o problema de ativação de plaquetas sem perder a propriedade de IgG1 nativa de reduzir rapidamente a concentração de antígeno em plasma.
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 1 CONSTRUÇÃO DE VETORES DE EXPRESSÃO DE ANTICORPO; E EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS
[000452] Síntese de genes de tamanho natural que codificam as sequências de nucleotídeo da cadeia H e cadeia L das regiões variáveis do anticorpo foi realizada por métodos de produção conhecidos por aqueles versados na técnica usando PCR de montagem e similares. Introdução de substituições de aminoácido foi realizada pelos métodos conhecidos por aqueles versados na técnica usando PCR ou tal. O fragmento de plasmídeo obtido foi inserido em um vetor de expressão de célula animal, e o vetor de expressão de cadeia H e vetor de expressão de cadeia L foram produzidos. A sequência de nucleotídeo do vetor de expressão obtido foi determinada por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Os plasmídeos produzidos foram introduzidos transitoriamente na linhagem celular HEK293H derivada de células de câncer de rim embriônicas humanas (Invitrogen) ou em células FreeStyle293 (Invitrogen) para expressão de anticorpo. O sobre- nadante de cultura obtido foi coletado, e em seguida passado através de um filtro de 0,22 μm MILLEX(R)-GV (Millipore), ou através de um filtro de 0,45 μm MILLEX(R)-GV (Millipore) para obter o sobrenadante de cultura. Os anticorpos foram purificados do sobrenadante de cultura obtido por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica usando rProtein A Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) ou Proteína G Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare). Para a concentração dos anticorpos purificados, sua absorvência a 280 nm foi medida usando um espectrofotômetro. A partir do valor obtido, o coeficiente de extinção calculado pelos métodos tais como PACE foi usado para calcular a concentração de anticorpo (Protein Science 1995; 4: 2411-2423).
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2 MÉTODO PARA PREPARAÇÃO DE FCyR E MÉTODO PARA ANÁLISE DA INTERAÇÃO ENTRE UM ANTICORPO ALTERADO E FCyR
[000453] Domínios extracelulares de FcyRs foram preparados pelo seguinte método. Primeiro, um gene do domínio extracelular de FcyR foi sintetizado por um método bem conhecido por aqueles versados na técnica. Naquele momento, a sequência de cada FcyR foi produzida com base na informação registrada em NCBI. Especificamente, FcyRI foi produzido com base na sequência de NCBI n° de acesso NM_000566,3, FcyRIIa foi produzido com base na sequência de NCBI n° de acesso NM_001136219,1, FcyRIIb foi produzido com base na sequência de NCBI n° de acesso NM_004001,3, FcyRIIIa foi produzido com base na sequência de NCBI n° de acesso NM_001127593,1, e FcyRIIIb foi produzido com base na sequência de NCBI n° de acesso NM_000570,3, e um rótulo de His foi ligado ao terminal C. Além disso, polimorfismo conhecido quanto ao FcyRIIa, FcyRIIIa, e FcyRIIIb, e os sítios polimórficos foram produzidos referindo-se a J. Exp. Med., 1990, 172: 19-25 para FcyRIIa; J. Clin. Invest., 1997, 100 (5): 1059-1070 para FcyRIIIa; e J. Clin. Invest., 1989, 84, 1688-1691 para FcyRIIIb.
[000454] Os fragmentos de gene obtidos foram inseridos em um vetor de expressão de célula animal, e vetores de expressão foram produzidos. Os vetores de expressão produzidos foram introduzidos transitoriamente em células FreeStyle293 derivadas da linhagem de célula de câncer de rim embriônico (Invitrogen) para expressar as proteínas de interesse. Com relação a FcyRIIb usado para análise cristalográfica, a proteína de interesse foi expressa na presença de Kifunensine em uma concentração final de 10 μg/ml, de modo que a cadeia de açúcar adicionada a FcyRIIb seja o tipo manose elevada. As células foram cultivadas, e após coleção do sobrenadante de cultura obtido, isto foi passado através de um filtro de 0,22 μm para obter o sobrenadante de cultura. Em princípio, os sobrenadantes de cultura obtidos foram purificados nas seguintes quarto etapas. As etapas realizadas foram, cro- matografia de coluna de permuta de cátion (SP Sepharose FF) na etapa 1, cromatografia de coluna de afinidade (HisTrap HP) para rótulo His na etapa 2, cromatografia de coluna por filtração de gel (Super- dex200) em etapa 3, e cromatografia asséptica na etapa 4. Entretanto, para FcyRI, cromatografia de coluna de permuta de ânion usando Q sepharose FF foi realizada como a etapa 1. As proteínas purificadas foram submetidas às medições de absorvência a 280 nm usando um espectrofotômetro; e a partir dos valores obtidos, as concentrações das proteínas purificadas foram calculadas usando o coeficiente de absorção calculado usando métodos tais como PACE (Protein Science 1995; 4: 2411-2423).
[000455] Análise de interação entre cada anticorpo alterado e o receptor Fcy, preparado como mencionado acima, foi realizada usando Biacore T100 (GE Healthcare), Biacore T200 (GE Healthcare), Biacore A100, e Biacore 4000. HBS-EP+ (GE Healthcare) foi usado como o tampão fluente, e a temperatura de medição foi fixada em 25 °C. Chips produzidos por imobilização do o peptídeo antígeno, Proteína A (Thermo Scientific), Proteína A/G (Thermo Scientific), e Proteína L (ACTIGEN ou BioVision) pelo método de acoplamento de amina a um Chip CM5 Sensor de Série S (GE Healthcare) ou Chip CM4 Sensor de Série S (GE Healthcare), ou alternativamente, chips produzidos permi- tindo peptídeos antígenos preliminarmente biotinilados interagirem com, e imobilizarem-se sobre um Chip AS Sensor de Série S (certified) (GE Healthcare) foram usados.
[000456] Após a captura de anticorpos de interesse sobre estes chips sensores, um receptor Fcy diluído com o tampão fluente foi deixado interagir, a quantidade ligada a um anticorpo foi medida, e os anticorpos foram comparados. Entretanto, visto que a quantidade de receptor Fcy ligado depende da quantidade dos anticorpos capturados, a quantidade de receptor Fcy ligado foi dividida pela quantidade de cada anticorpo capturado para obter valores corrigidos, e estes valores foram comparados. Além disso, anticorpos capturados sobre os chips foram lavados por reação com 10 mM de glicina-HCl, pH 1,5, e os chips foram regenerados e usados repetidamente.
[000457] Análises cinéticas para calcular os valores de KD de cada anticorpo alterado para FcyR foram realizadas de acordo com os seguintes métodos. Primeiramente, os anticorpos de interesse foram capturados sobre os chips sensores mencionados acima, e um receptor Fcy diluído com o tampão fluente foi deixado interagir. O Biacore Evaluation Software foi usado para globalmente ajustar os resultados mensurados ao sensógrafo obtido usando o modelo de ligação 1:1 Langmuir, e a constante da taxa de associação ka (L/mol/s) e a constante da taxa de dissociação kd (1/s) foram calculadas; e a partir daqueles valores as constantes de dissociação KD (mol/L) foram calcu-ladas.
[000458] Quando a interação entre cada dos anticorpos alterados e FcyR foi fraca, e a análise correta foi determinada ser impossível pela análise cinética acima mencionada, a KD para tais interações foi calculada usando a seguinte equação de modelo de ligação 1:1 descrita no Biacore T100 Software Handbook BR1006-48 Edição AE.
[000459] O comportamento de moléculas de interação, de acordo com o modelo de ligação 1:1 em Biacore pode ser descrito pela Equação 1 mostrada abaixo. EQUAÇÃO 1
Figure img0046
Req: um plote de níveis de ligação de estado constante em função da concentração de analito C: concentração RI: contribuição do índice refrativo de volume na amostra Rmax: capacidade de ligação de analito da superfície
[000460] Quando esta equação é reorganizada, a KD pode ser expressa como a Equação 2 mostrada abaixo. EQUAÇÃO 2
Figure img0047
[000461] A KD pode ser calculada substituindo-se os valores de Rmax, RI, e C nesta equação. Os valores de RI e C podem ser determinados a partir do sensógrafo dos resultados de mensuração e as condições de mensuração. Rmax foi calculado de acordo com o seguinte método. Como um alvo de comparação, para anticorpos que tiveram interações suficientemente fortes quando avaliadas simultaneamente em um mesmo ciclo de mensuração, o valor Rmax foi obtido através de ajuste global usando o modelo de ligação de 1:1 Langmuir, e em seguida ele foi dividido pela quantidade do anticorpo capturado de comparação sobre o chip sensor, e multiplicado pela quantidade capturada de um anticorpo alterado a ser avaliada.
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 3 PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS QUE SE LIGAM À IGA HUMANA DE UMA MANEIRA DEPENDENTE DE CÁLCIO (3-1) PREPARAÇÃO DE IGA HUMANA (HIGA)
[000462] A IgA humana (doravante também referida como hIgA), que é um antígeno, foi preparada com o uso de técnicas de recombinação tais como abaixo. hIgA expressa por cultivo de células hospedeiras que portam um vetor recombinante que compreende H (WT)-IgA1 (SEQ ID NO: 19) e L (WT) (SEQ ID NO: 20) foi purificada com o uso de cromatografia de troca iônica e cromatografia de filtração em gel por um método conhecido por aqueles versados na técnica. (3-2) ANTICORPOS COM LIGAÇÃO DEPENDENTE DE CÁLCIO
[000463] H54/L28-IgG1 revelado no documento WO2009/125825 é um anticorpos de receptor de anti-IL-6 humanizado, e Fv4-IgG1 é um anticorpo de receptor de anti-IL-6 humanizado produzido conferindo a H54/L28-IgG1 a propriedade de ligação a um receptor de IL-6 humano solúvel de uma maneira dependente de pH (liga-se sob uma condição neutra e dissocia-se sob uma condição ácida). No teste de camundongo in vivo revelado no documento WO2009/125825, a eliminação do receptor de IL-6 humano solúvel mostrou ser grandemente acelerada no grupo administrado com uma mistura de Fv4-IgG1 e o receptor de IL-6 humano solúvel (antígeno), em comparação ao grupo administrado com uma mistura de H54/L28-IgG1 e o receptor de IL-6 humano solúvel (antígeno).
[000464] O receptor de IL-6 humano solúvel ligado a um anticorpo típico que se liga ao receptor de IL-6 humano solúvel é reciclado em plasma através de FcRn juntamente com o anticorpo. Por outro lado, um anticorpo que se liga ao receptor de IL-6 humano solúvel de uma maneira dependente de pH dissocia um receptor de IL-6 humano solúvel ligado ao anticorpo sob condições ácidas no endossomo. Como o receptor de IL-6 humano solúvel dissociado é degradado em lisosso- mos, a eliminação do receptor de IL-6 humano solúvel do plasma pode ser grandemente acelerada, e os anticorpos que se ligam ao receptor de IL-6 humano solúvel de uma maneira dependente de pH são reci-clados no plasma por FcRn após a dissociação do receptor de IL-6 humano solúvel, e os anticorpos reciclados podem se ligar novamente a um receptor de IL-6 humano solúvel. Por repetição do ciclo mencionado acima (captação de anticorpos ligados a antígeno em células > dissociação do antígeno do anticorpo > degradação do antígeno e reciclagem do anticorpo ao plasma), uma molécula de anticorpo única pode ligar-se repetidamente ao receptor de IL-6 humano solúvel diversas vezes (Figura 9).
[000465] Além disso, conforme revelado no documento WO2011/122011, H54/L28-IgG1 é um anticorpos de receptor de anti- IL-6 humanizado, Fv4-IgG1 é um anticorpo de receptor de anti-IL-6 humanizado produzido conferindo a H54/L28-IgG1 a propriedade de ligação a um receptor de IL-6 humano solúvel de uma maneira dependente de pH (liga-se sob uma condição neutra e dissocia-se sob uma condição ácida) e Fv4-IgG1-v2 é um anticorpo de receptor de anti-IL-6 humanizado produzido conferindo-se a Fv4-IgG1 ligação de FcRn acentuada sob condições de pH neutro. No teste de camundongo in vivo revelado no documento WO2011/122011, a eliminação do receptor de IL-6 humano solúvel foi grandemente acelerada em um grupo administrado com uma mistura de Fv4-IgG1-v2 e o receptor de IL-6 humano solúvel (antígeno), em comparação a um grupo administrado com uma mistura de Fv4-IgG1 e o receptor de IL-6 humano solúvel (antígeno). Mais especificamente, foi relatado que a acentuação da ligação de FcRn de um anticorpo que se liga a um antígeno de uma maneira dependente de pH sob uma condição de pH neutro (pH 7,4) aprimora adicionalmente o efeito do anticorpo alterado acentuado li-gar-se repetidamente a antígenos e o efeito de promover a eliminação de antígenos do plasma, e que a administração desse anticorpo possibilita a eliminação do plasma (Figura 10).
[000466] Nas ações de anticorpos que se ligam a um antígeno de uma maneira dependente de pH, conforme mostrado nas Figuras 9 e 10, a diferença nos ambientes plasmático e endossômico, isto é, a di- ferença em pH (plasma: pH 7,4; endossomos: pH 6,0) foi usada para utilizar a propriedades dos anticorpos de se ligar fortemente aos antí- genos em plasma e liberar os antígenos nos endossomos. Para utilizar tais diferenças para a capacidade de ligação de antígeno de anticorpos que se ligam a antígeno de uma maneira dependente de pH em plasma e em endossomos, as propriedades dos fatores ambientais no plasma e nos endossomos assim como o grau de diferença nessas propriedades são importantes. A diferença de pH é, a saber, uma diferença na concentração de íons de hidrogênio. Mais especificamente, como a concentração de íons de hidrogênio no plasma (a pH 7,4) é aproximadamente 40 nM e a concentração de íons de hidrogênio no endossomo (a pH 6,0) é aproximadamente 1.000 nM, a diferença em concentrações de íons de hidrogênio entre o plasma e os endosso- mos, que pode ser um dos fatores ambientais, é aproximadamente 25 vezes.
[000467] Além disso, para atingir os efeitos mostrados nas Figuras 9 e 10 em uma modalidade diferente ou para atingir simultaneamente essas modalidades, podem-se usar anticorpos que mostram ligação de antígeno de uma maneira que depende de um fator ambiental diferente da concentração de íons de hidrogênio que difere no plasma e no endossomo. Como resultado da busca por um fator ambiental que difira grandemente entre a concentração em plasma e a concentração em endossomo, cálcio foi encontrado. A concentração de íons de cálcio em plasma é cerca de 1,1 a 1,3 mM enquanto a concentração de íons de cálcio no endossomo é cerca de 3 μM; portanto, a diferença na concentração de íons de cálcio, que é considerada como sendo um dos fatores ambientais em plasma e em endossomo, é aproximadamente 400 vezes e mostrou ser maior do que a diferença de concentração de íons de hidrogênio (25 vezes). Mais especificamente, o uso de um anticorpo que se liga a um antígeno de uma maneira dependen- te de concentração de cálcio ionizado, que se liga ao antígeno sob condições de alta concentração de cálcio (1,1 a 1,3 mM) e dissocia o antígeno sob condição de baixa concentração de cálcio (3 μM), pode possibilitar a dissociação de antígenos do anticorpo em endossomos a um grau equivalente a ou maios do que aquele de anticorpos com ligação de antígeno dependente de pH. (3-3) EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS DE LIGAÇÃO DE HIGA
[000468] GA1-IgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 21 e cadeia leve SEQ ID NO: 22) e GA2-IgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 23 e cadeia leve SEQ ID NO: 24) são anticorpos que se ligam a hIgA. As sequências de DNA que codificam GA1-IgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 21 e cadeia leve SEQ ID NO: 22) e GA2-IgG1 (cadeia pesada SEQ ID NO: 23 e cadeia leve SEQ ID NO: 24) foram inseridas em plasmídeos para expressão em célula de animal por um método conhecido por aqueles versados na técnica. Os anticorpos foram expressos com o uso do método a seguir. Células da linhagem FreeStyle 293-F (Invitro- gen) derivadas de célula de rim fetal humano foram suspensas em Meio de Expressão de FreeStyle 293 (Invitrogen). A suspensão celular foi plaqueada a uma densidade celular de 1,33 x 106 células/ml em 3 ml para cada cavidade de uma placa com 6 cavidades. Então, o plas- mídeo preparado foi introduzido em células pelo método de lipofecção. As células foram curadas em um incubador de CO2 (37 °C, 8% de CO2, 90 rpm) por 4 dias. A partir do sobrenadante de cultura isolado, o anticorpo foi purificado por um método conhecido por aqueles versados na técnica com o uso de rProtein A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences). A absorbância (comprimento de onda: 280 nm) da solução do anticorpo purificado foi medida com o uso de um espectrofotômetro. A concentração de anticorpo foi determinada com o uso do coeficiente de extinção calculado a partir do valor medido pelo método PACE (Protein Science (1995) 4, 2.411 a 2.423). (3-4) AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE DE LIGAÇÃO DE HIGA DEPENDENTE DE CÁLCIO DOS ANTICORPOS OBTIDOS
[000469] As atividades de ligação de hIgA (constante de dissociação KD (M)) dos anticorpos isolados em (1-3) foram avaliadas com o uso de Biacore T200 (GE Healthcare). As medições foram realizadas com o uso de uma solução de 0,05% de tween20, 20 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCl (pH 7,4 ou pH 5,8) contendo 3 μM ou 1,2 mM CaCh, ou uma solução de 0,05% de tween20, 20 mmol/l de ACES, 150 mmol/l de NaCl (pH 8,0) contendo 0,1 μM ou 10 mM de CaCl2 como um tampão contínuo.
[000470] Uma quantidade apropriada de Proteína A/G recombinante (Thermo Scientific) foi imobilizada em um chip de sensor CM5 (GE Healthcare) por um método de acoplamento de amino, e o anticorpo foi deixado ligar-se à mesma. Então, uma concentração apropriada de hIgA (descrita em (1-1)) foi injetada como um analito e deixada interagir com o anticorpo no chip de sensor. A medição foi executada a 37 °C. Após a medição, 10 mmol/l de glicina-HCl (pH 1,5) foram injetados para regenerar o chip de sensor. A partir do resultado de medição, a constante de dissociação KD (M) foi calculada por análise de ajuste de curva e análise de equilíbrio com o uso do Software de Avaliação Bia- core T200 (GE Healthcare). O resultado é mostrados na Tabela 21. O sensorgrama obtido é mostrado na Figura 11. GA2-IgG1 ligou-se fortemente a hIgA a uma concentração de Ca2+ de 1,2 mM e ligou-se fracamente a hIgA a uma concentração de Ca2+ de 3 μM. Entretanto, a uma concentração de Ca2+ de 1,2 mM, GA2-IgG1 ligou-se fortemente à IgA humana em pH 7,4 e ligou-se fracamente à IgA humana em pH 5,8. Em suma, GA2-IgG1 demonstrou ligar-se à IgA humana de uma maneira dependente de pH e cálcio.
Figure img0048
EXEMPLO DE REFERÊNCIA 4 PREPARAÇÃO DE VARIANTES DE UM ANTICORPO QUE SE LIGA A HIGA DE UMA MANEIRA DEPENDENTE DE CÁLCIO
[000471] Para acentuar adicionalmente a eliminação de antígenos (hIgA) do plasma, GA2-N434W (cadeia leve SEQ ID NO: 24) foi preparado, em que a substituição de aminoácido N434W para acentuar a ligação de FcRn de camundongo a pH 7.4 foi introduzida em GA2- IgG1 que se liga a hIgA de uma maneira dependente de cálcio. Além disso, para remover as propriedades de ligação de FCYR de GA2-IgG1, GA2-FCYR(-) (cadeia leve SEQ ID NO: 24) foi preparado por introdução das substituições de aminoácido L235R e S239K em GA2-IgG1. Com o uso de plasmídeos para a expressão em animais que foram introduzidos com sequências de DNA que codificam GA2-N434W (cadeia leve SEQ ID NO: 24) e GA2-FcyR(-) (cadeia leve SEQ ID NO: 24) por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica, as variantes de anticorpo foram expressas pelo método descrito acima e as concentrações dessas variantes de anticorpo foram determinadas após a purificação. A avaliação da ligação de GA2-FcyR(-) a cada FcyRs de camundongo (mFcYRI, mFcyRII, mFcyRIII e mFcYRIV) mostrou que a ligação não poderia ser observada para qualquer um dos receptores. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 5 PREPARAÇÃO DE VARIANTES DE ANTICORPO QUE SE LIGAM A HIGA DE UMA MANEIRA DEPENDENTE DE CÁLCIO
[000472] Em seguida, para acelerar adicionalmente a eliminação de antígeno (hIgA) do plasma, GA2-F1087 foi produzido usando-se Tyr no lugar de Leu na posição 328 (numeração de EU) em GA2-IgG1 para acentuar a ligação de FCYR de camundongo de GA2-IgG1 que se liga a hIgA de uma maneira dependente de cálcio. Uma sequência de DNA que codifica GA2-F1087 (cadeia leve SEQ ID NO: 24) foi inserida em um plasmídeo de expressão de animal por um método conhecido por aqueles versados na técnica. As variantes de anticorpo foram expressas pelo método descrito acima com o uso do plasmídeo. As concentrações das variantes foram medidas após a purificação. Os anticorpos que compreende a modificação acima exibiram ligação de FCYR significativamente acentuada, conforme mostrado no Exemplo de Referência 5. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 6 AVALIAÇÃO DO EFEITO SOBRE A RETENÇÃO DE ANTÍGENO EM PLASMA EM CAMUNDONGOS NORMAIS ADMINISTRADOS COM ANTICORPOS DE LIGAÇÃO DE HIGA DEPENDENTE DE CA (6-1) TESTES IN VIVO COM O USO DE CAMUNDONGOS NORMAIS
[000473] hIgA (IgA humana, preparada conforme descrito no Exemplo de Referência (3-1)) foi administrada sozinha ou em combinação com um anticorpo anti-hIgA a camundongos normais (camundongo C57BL/6J, Charles River Japão). Após a administração, a dinâmica in vivo de hIgA e anticorpos anti-hIgA foi avaliada. Uma solução de hIgA (80 μg/ml) ou uma solução misturada de hIgA e um anticorpo anti-hIgA foi administrada uma vez a uma dose de 10 ml/kg na veia caudal. Os anticorpos anti-hIgA usados foram GA2-IgG1 e GA2-F1087 descritos acima.
[000474] Em todas as soluções misturadas, a concentração de hIgA foi 80 μg/ml e a concentração de anticorpo anti-hIgA foi 2,69 mg/ml. Nesse experimento, os anticorpos anti-hIgA estavam presentes significativamente em excesso em relação a hIgA e, portanto, acreditou-se que a maior parte de hIgA ligou-se aos anticorpos. No grupo administrado com GA-IgG1, o sangue foi coletado dos camundongos cinco minutos, sete horas, um dia, dois dias, três dias e sete dias após a administração. Entretanto, no grupo administrado com GA-F1087, o sangue foi coletado dos camundongos cinco minutos, 30 minutos, uma hora, duas horas, um dia, três dias e sete dias após a administração. O sangue coletado foi imediatamente centrifugado a 12.000 rpm e 4 °C por 15 minutos para isolar o plasma. O plasma isolado foi armazenado em um congelador a -20 °C ou abaixo até o uso. (6-2) DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPO AN- TI-HIGA NO PLASMA EM CAMUNDONGOS NORMAIS PELO MÉTODO ELISA
[000475] As concentrações de anticorpo anti-hIgA em plasma de camundongo foram medidas pelo método ELISA. Primeiramente, para preparar uma placa imobilizada com IgG anti-humana, IgG AntiHumana (específica de cadeia Y), Fragmento de anticorpo F(ab')2 (SIGMA) foi dividido em alíquotas em cada cavidade de uma Placa Nunc-Immuno, MaxiSorp (Nalge nunc International), e a placa foi deixada em repouso a 4 °C de um dia para o outro. As amostras de curva de calibração de anticorpo anti-hIgA preparadas como soluções padrão para a concentração plasmática (0,5, 0,25, 0,125, 0,0625, 0,03125, 0,01563 e 0,007813 μg/ml) e amostras de ensaio de plasma de camundongo diluído 100 vezes ou mais, foram divididas em alíquotas na placa imobilizada com IgG anti-humana mencionada acima. Após uma hora de incubação da placa a 25 °C, Conjugado de Biotina (BIOT) e IgG Anti-Humana de cabra (específica de cadeia Y) (Southern Biotechnology Associates Inc.) foi dividido em alíquotas a cada poço da placa. Então, a placa foi incubada à 25 °C por uma hora. Em seguida, Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foi dividida em alíquotas em cada cavidade da placa. Então, a placa foi incubada a 25 °C por uma hora. Reação cromogênica foi realizada com o uso como um substrato TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). Após terminar a reação com ácido sul- fúrico a 1N (Showa Chemical), a absorbância da solução de reação em cada cavidade foi medida a 450 nm com um leitor de microplaca. As concentrações de anticorpo anti-hIgA em plasma de camundongo foram determinadas com base na absorbância da curva-padrão com o uso do software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Um curso de tempo das concentrações de anticorpo de GA2-IgG1 e GA2- F1087 no plasma de camundongos normais após administração intravenosa, que foi medida pelo método descrito acima, é mostrado na Figura 12. Os resultados demonstram que, em relação ao clone GA2- IgG1 que tem atividade de ligação de hIgA forte dependente de pH e Ca, a concentração plasmática do anticorpo não é significativamente reduzida se a ligação de FcyR for acentuada. (6-3) DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE HIGA NO PLASMA PELO MÉTODO ELISA
[000476] As concentrações de hIgA em plasma de camundongo foram medidas pelo método ELISA. Primeiramente, para preparar uma placa imobilizada por IgA anti-humana, Anticorpo IgA anti-humano de cabra (BETHYL) foi dividido em alíquotas em cada cavidade de uma Placa Nunc-Immuno Plate, MaxiSoup (Nalge nunc International), e a placa foi deixada em repouso a 4 °C de um dia para o outro. As amostras de curva de calibração de hIgA foram preparadas como soluções padrão da concentração de plasma (0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 e 0,00625 μg/ml) e usadas. 100 μl cada das amostras de curva de cali- bração e amostras de ensaio de plasma de camundongo diluídos 100 vezes ou mais foram combinados com 200 μl de 500 ng/ml de hsIL6R. Os mesmos foram misturados e incubados à temperatura ambiente por uma hora. Então, 100 μl das misturas foram divididos em alíquotas na placa imobilizada por IgA anti-humana. A placa foi deixada em repouso à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, Anticorpo IL-6 R Anti-humano Biotinilado (R&D) foi dividido em alíquotas em cada cavidade da placa. Após uma hora de inoculação à temperatura ambiente, Streptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Technologies) foi dividida em alíquotas em cada cavidade da placa. A placa foi incubada à temperatura ambiente por uma hora. Reação cromogê- nica foi realizada com o uso como um substrato de TMB One Component HRP Microwell Substrate (BioFX Laboratories). Após terminar a reação com ácido sulfúrico a 1N (Showa Chemical), a absorbância da solução de reação em cada cavidade foi medida a 450 nm com um leitor de microplaca. As concentrações em plasma de camundongo foram determinadas com base na absorbância da curva padrão com o uso do software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Um curso de tempo da concentração de hIgA no plasma de camundongos normais após administração intravenosa, que foi medida pelo método acima, é mostrado na Figura 13.
[000477] O resultado mostrou que, em camundongos administrados com hIgA em combinação com GA2-IgG1 que tem uma atividade de ligação de hIgA dependente de Ca de 100 vezes ou mais, a eliminação de hIgA foi acelerada em comparação à administração de hIgA apenas. Entretanto, no plasma de camundongos administrados com GA2- F1087 com ligação acentuada a hIgA e FCYR, a concentração de hIgA foi reduzida abaixo da faixa mensurável (0,006 μg/ml ou mais) um dia após a administração e, assim, a eliminação de hIgA foi acelerada sig- nificativamente em comparação ao plasma de camundongos administrados com GA-IgG1. O anterior mostra que, em camundongos administrados com hIgA e um anticorpo anti-hIgA que forma complexos imunológicos, o efeito de eliminação do antígeno (hIgA) do plasma pelo anticorpo com ligação de FCYR acentuada foi acentuado em comparação ao efeito de eliminação do antígeno (hIgA) pelo anticorpo do qual o anticorpo com ligação de FcyR acentuada é derivado. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 7 EFEITOS DE ELIMINAÇÃO DE AN- TÍGENO DO PLASMA DE MOLÉCULAS DE LIGAÇÃO DE ANTÍGE- NO CUJA ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DE FCrR É MAIS ALTA DO QUE A ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DA REGIÃO FC DE CAMUNDONGO (7-1) EFEITO DE ELIMINAÇÃO DE ANTÍGENO DE ANTICORPOS DE CAMUNDONGO COM ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DE FCrR ACENTUADA
[000478] Foi examinado pelo método abaixo se uma molécula de ligação de antígeno que compreende uma região Fc de anticorpo de camundongo e que tem a propriedade de ligação a um receptor de IL- 6 humano de uma maneira dependente de pH tem o efeito de aceleração da eliminação de um receptor de IL-6 humano solúvel no plasma de camundongos normais que portam FcRn de camundongo. (7-2) PRODUÇÃO DE ANTICORPOS DE CAMUNDONGO COM ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DE FCrR ACENTUADA
[000479] VH3-mIgG1 (SEQ ID NO: 25) e VL3-mk1 (SEQ ID NO: 26) foram produzidos como uma cadeia pesada e uma cadeia leve, respectivamente, do anticorpo IgG1 de camundongo que tem a propriedade de ligação ao receptor de IL-6 humano de uma maneira dependente de pH, com o uso do método do Exemplo de Referência 1. Além disso, para acentuar a atividade de ligação de VH3-mIgG1 a FcyR de camundongo, VH3-mIgG1-mF44 foi produzido usando-se Asp em lu- gar de Ala na posição 327 em conformidade com a numeração de EU. Similarmente, VH3-mIgG1-mF46 foi produzido usando-se Asp em lugar de Ser na posição 239 e Asp em lugar de Ala na posição 327 em conformidade com a numeração de EU em VH3-mIgG1. Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 ou Fv4-mIgG1-mF46 que compreende VH3-mIgG1, VH3-mIgG1-mF44, ou VH3-mIgG1-mF46, respectivamente, como uma cadeia pesada e VL3-mk1 como uma cadeia leve foi produzido com o uso do método do Exemplo de Referência 1. (7-3) CONFORMAÇÃO DA ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DE FCrR DE CAMUNDONGO
[000480] VH3/L (WT)-mIgG1, VH3/L (WT)-mIgG1-mF44, ou VH3/L (WT)-mIgG1-mF46 que compreende VH3-mIgG1, VH3-mIgG1-mF44 ou VH3-mIgG1-mF46, respectivamente, como uma cadeia leve e L (WT)-CK (SEQ ID NO: 27) como uma cadeia pesada foi produzido pelo método do Exemplo de Referência 1. As atividades de ligação desses anticorpos às FCYRS de camundongo foram avaliadas pelo método do Exemplo de Referência 2. Os resultados são mostrados na Tabela 22. Além disso, a Tabela 23 mostra quanto aumento foi observado para as atividades de ligação de cada variante para os FcyRs de camundongo em comparação àquelas de mIgG1 antes da introdução da alte-ração. Na tabela, VH3/L (WT)-mIgG1, VH3/L (WT)-mIgG1-mF44 e VH3/L (WT)-mIgG1-mF46 são mostrados como mIgG1, mF44 e mF46, respectivamente.
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[000481] O resultado de avaliação do Exemplo 4, que mostra que VH3/L (WT)-mIgG1 que tem a região Fc de anticorpo IgG1 de camundongo nativa liga-se apenas à FcyRIIb de camundongo e a FcyRIII de camundongo, mas não à FCYRI de camundongo e à FCYRIV de camundongo, sugere que os FCYRS de camundongo importantes para a redução de concentração de antígeno são FcyRII de camundongo e/ou FcyRIII de camundongo. VH3/L (WT)-mIgG-mF44 e VH3/L (WT)- mIgG1-mF46 introduzidas com uma alteração que é se acredita que aumente a atividade de ligação de FcyR of VH3/L (WT)-mIgG1 de-monstraram ter atividade de ligação aumentada tanto para FcyRIIb de camundongo como para FcyRIII de camundongo. (7-4) AVALIAÇÃO DO EFEITO PARA REDUZIR A CONCENTRAÇÃO DE RECEPTOR DE IL-6 SOLÚVEL NO PLASMA DE CAMUNDONGOS NORMAIS
[000482] O efeito para eliminar receptor de IL-6 solúvel do plasma de camundongos normais administrados com o anticorpo de receptor de IL-6 anti-humano Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44, ou Fv4-mIgG1mF46 foi avaliado conforme segue.
[000483] Os modelos de animal em que a concentração de receptor de IL-6 humano solúvel em plasma foi mantida em um estado estável foram produzidos por implantação de uma bomba de infusão (MINI- OSMOTIC PUMP MODEL2004, alzet) carregada com o receptor de IL- 6 humano solúvel, por via subcutânea nas costas de camundongos normais (camundongo C57BL/6J, Charles River Japão). Anticorpos de receptor de IL-6 anti-humano foram administrados aos modelos de animais e, então, a farmacocinética do receptor de IL-6 humano foi avaliada. Para suprimir a produção de anticorpos contra o receptor de IL-6 humano solúvel, anticorpos CD4 anticamundongo monoclonais foram administrados uma vez à veia da cauda a uma dose de 20 mg/kg. Então, uma bomba de infusão contendo 92,8 μg/ml de receptor de IL-6 humano solúvel foi implantada por via subcutânea nas costas do camundongo. Três dias após a implantação da bomba de infusão, um anticorpo de receptor de IL-6 anti-humano foi administrado uma vez a 1 mg/kg na veia caudal. O sangue foi coletado dos camundongos 15 minutos, sete horas, um dia, dois dias, quatro dias, sete dias, 14 dias (ou 15 dias) e 21 dias (ou 22 dias) após a administração do anticorpo de receptor de IL-6 anti-humano. Imediatamente, o sangue coletado foi centrifugado a 15.000 rpm e 4 °C por 15 minutos para preparar o plasma. O plasma isolado foi armazenado em um congelador ajustado a -20 °C ou abaixo até o uso.
[000484] A concentração de receptor de IL-6 humano solúvel em plasma, as concentrações de receptor de IL-6 humano solúvel hsIL-6R em plasma de camundongo foram determinadas por um método ele- tro-quimioluminescente. As amostras de curva padrão de receptor de IL-6 humano solúvel hsIL-6R preparadas a 2.000, 1.000, 500, 250, 125, 62,5 e 31,25 pg/ml e amostras de ensaio de plasma de camundongo diluído 50 vezes ou mais foram misturadas com Anticorpo de IL- 6R Anti-humano Monoclonal (R&D), Anticorpo de IL-6 R Anti-humano Biotinilado (R&D), Tocilizumabe, que foi rutenado com Éster SULFOTAG NHS (Meso Scale Discovery). As misturas foram incubadas a 37 °C de um dia para o outro. Tocilizumabe foi preparado a uma concentração final de 333 μg/ml. Então, as misturas de reação foram divididas em alíquotas em uma Placa de Estratavidina MA400 PR (Meso Scale Discovery). A solução reagida à temperatura ambiente por uma hora foi lavada e, então Tampão e Leitura T (x4) (Meso Scale Discovery) foi dividido em alíquotas. Imediatamente depois, a medição foi executada com o uso do Leitor SECTOR PR 400 (Meso Scale Discovery). A concentração de receptor de IL-6 humano solúvel hsIL-6R foi determinada com base na resposta da curva padrão com o uso do software de análise SOFTmax PRO (Molecular Devices). Os resultados são mostrados na Figura 14.
[000485] De modo surpreendente, foi demonstrado que, em camundongos administrados com mF44 e mF46 introduzidos com uma alteração para aumentar a atividade de ligação de mIgG1 (IgG1 de camundongo nativa) para FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo, a concentração de receptor de IL-6 em plasma foi marcada- mente reduzida em comparação a camundongos administrados com mIgG1. Em particular, mesmo no dia 21 após a administração de mF44, a concentração de receptor de IL-6 em plasma no grupo administrado com mF44 foi reduzida em cerca de 6 vezes em comparação à concentração de receptor IL-6 de plasma no grupo sem administração de anticorpo e cerca de 10 vezes em comparação ao grupo administrado com mIgG1. Por outro lado, no dia sete após a administração de mF46, a concentração de receptor de IL-6 em plasma no grupo administrado com mF46 foi marcadamente reduzida em cerca de 30 vezes em comparação à concentração de receptor IL-6 de plasma no grupo sem administração de anticorpo e cerca de 50 vezes em comparação ao grupo administrado com mIgG1.
[000486] As conclusões acima demonstram que a eliminação de receptor de IL-6 solúvel do plasma foi também acelerada em camundongos administrados com anticorpos em que a atividade de ligação de FCYR de camundongo de uma molécula de ligação de antígeno que tem as regiões Fc de anticorpo IgG1 de camundongo é aumentada, como com anticorpos em que a atividade de ligação de FCYR de camundongo de uma molécula de ligação de antígeno que tem a região Fc de anticorpo IgG1 humano é aumentada. Sem ater-se a uma teoria particular, o fenômeno observado conforme descrito acima pode ser explicado conforme segue.
[000487] Quando administrado a camundongos, os anticorpos que se ligam a um antígeno solúvel de uma maneira dependente de pH e têm atividade de ligação de FcyR aumentada são incorporados de modo ativo principalmente em células que expressam FcyR na membrana celular. Os anticorpos incorporados dissociam o antígeno solúvel sob uma condição de pH ácido no endossomo e, então, reciclados ao plasma através de FcRn. Portanto, um fator que atinge o efeito de eliminação do antígeno solúvel em plasma de tal anticorpo é o nível de atividade de ligação de FcyR do anticorpo. Especificamente, como a atividade de ligação de FcyR é maior, a incorporação em células que expressam FcyR ocorre mais ativamente e isso torna a eliminação de antígenos solúveis do plasma mais rápida. Além disso, contanto que a atividade de ligação de FcyR tenha sido aumentada, o efeito pode ser avaliado da mesma maneira a despeito de se a região Fc contida em um anticorpo se origina de IgG1 de humano ou camundongo. Especificamente, a avaliação pode ser atingida para uma região Fc de qualquer espécie de animal, tal como qualquer um dentre IgG1 de humano, IgG2 de humano, IgG3 de humano, IgG4 de humano, IgG1 de camundongo, IgG2a de camundongo, IgG2b de camundongo, IgG3 de camundongo, IgG de rato, IgG de macaco e IgG de coelho, contanto que a atividade de ligação para a FcyR da espécie animal a ser administrada tenha sido aumentada. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 8 O EFEITO DE ELIMINAÇÃO DE AN- TÍGENO POR ANTICORPOS COM A ATIVIDADE DE LIGAÇÃO AUMENTADA DE UMA MANEIRA SELETIVA PARA FcyRllB (8-1) O EFEITO DE ELIMINAÇÃO DE ANTÍGENO DE ANTICORPOS EM QUE A ATIVIDADE DE LIGAÇÃO DE FcyRllB FOI AUMENTADA SELETIVAMENTE
[000488] Camundongos com deficiência de FcyRIII (B6.129P2- FcgrR3tm1Sjv/J mouse, Jackson Laboratories) expressam FCYRI de camundongo, FcyRIIb de camundongo e FCYRIV de camundongo, mas não FcyRIII de camundongo. Entretanto, os camundongos com deficiência de cadeia Y de receptor Fc (camundongo Fcerlg, Taconic, Cell (1994) 76, 519 a 529) expressam FcyRIIb de camundongo apenas, mas não FcyRI de camundongo, FcyRIII de camundongo e FcyRIV de camundongo.
[000489] Conforme descrito no Exemplo de Referência 7, foi demonstrado que mF44 e mF46 com atividade de ligação de FcyR aumentada de IgG1 de camundongo nativa mostram ligação seletivamente acentuada a FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo. Foi concebido que, com o uso da atividade de ligação seletivamente aumentada dos anticorpos, a condição sob a qual um anticorpo com ligação de FcyRIIb de camundongo seletivamente acentuada pode ser simulada por administração de mF44 e mF46 a camundongos deficientes de FcyRIII de camundongo ou camundongos com deficiência de cadeia y de receptor Fc que não expressam FcyRIII de camundongo. (8-2) AVALIAÇÃO DO EFEITO DE ELIMINAÇÃO DE ANTÍGENO POR ACENTUAÇÃO SELETIVA DE LIGAÇÃO A FCyRIIB DE CAMUNDONGO COM O USO DE CAMUNDONGOS COM DEFICIÊNCIA DE FCyRIII
[000490] O efeito para eliminar o receptor de IL-6 solúvel do plasma em camundongos com deficiência de FcyRIII administrados com o anticorpo de receptor de IL-6 anti-humano Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 ou Fv4-mIgG1-mF46 foi avaliado pelo mesmo método descrito no Exemplo 5. As concentrações de receptor de IL-6 humano solúvel no plasma dos camundongos foram determinadas pelo método descrito acima no Exemplo de Referência (7-4). O resultado é mostrado na Figura 15.
[000491] De modo surpreendente, foi demonstrado que, as concentrações de receptor de IL-6 em plasma em camundongos com deficiência de FcyRIII administrados com mF44 e mF46, que imitam a condição sob a qual a atividade de ligação de FcyRIIb de mIgGI (IgG1 de camundongo nativa) é seletivamente aumentada, foram marcadamen- te reduzidas em comparação à concentração de receptor de IL-6 em plasma em camundongos administrados com mIgG1. Em particular, a concentração de receptor de IL-6 em plasma do grupo administrado com mF44 foi reduzida em cerca de três vezes em comparação àquela do grupo administrado com mIgG1 e a acumulação de concentração de anticorpo devido à administração de anticorpo foi suprimida. Entretanto, no dia três após a administração, a concentração de receptor de IL-6 em plasma do grupo administrado com mF46 foi marcadamente reduzida em cerca de seis vezes em comparação à concentração de receptor IL-6 de plasma do grupo sem administração de anticorpo e cerca de 25 vezes em comparação à concentração de receptor de IL-6 em plasma do grupo administrado com mIgG1. Esse resultado mostra que, como a atividade de ligação de FcyRIIb de camundongo de um anticorpo de receptor de IL-6 anti-humano que se liga ao antígeno de uma maneira dependente de pH é maior, a concentração de receptor de IL-6 pode ser mais reduzida no plasma de camundongos administrados com o anticorpo. (8-3) AVALIAÇÃO DO EFEITO DE ELIMINAÇÃO DE ANTÍGENO POR ACENTUAÇÃO SELETIVA DE LIGAÇÃO DE FCyRIIB DE CAMUNDONGO COM O USO DE CAMUNDONGOS DEFICIENTES DE CADEIA y DE RECEPTOR FC
[000492] O efeito para eliminar o receptor de IL-6 solúvel do plasma de camundongos com deficiência de cadeia Y de receptor Fc administrados com o anticorpo de receptor de IL-6 anti-humano Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 ou Fv4-mIgG1-mF46 foi avaliado pelo mesmo método conforme descrito no Exemplo 6. As concentrações de receptor de IL-6 humano solúvel no plasma dos camundongos foram determinadas pelo método descrito acima no Exemplo de Referência (7-4). O resultado é mostrado na Figura 16.
[000493] Como com o caso em que mF44 e mF46 foram administrados a camundongos com deficiência de FcyRIII, a concentração de receptor de IL-6 em plasma em camundongos com deficiência de cadeia y de receptor Fc administrados com mF44 e mF46, que simulam a condição resultante do aumento seletivo na atividade de ligação de FcyRIIb de camundongo de mIgGI (IgG1 de camundongo nativa), foi demostrada ser marcadamente reduzida em comparação à concentração de receptor de IL-6 em plasma em camundongos com deficiência de cadeia y de receptor Fc administrados com mIgG1. Em particular, a concentração de receptor de IL-6 em plasma do grupo administrado com mF44 foi reduzida a cerca de três vezes àquela do grupo administrado com mIgG1 e a acumulação de concentração de antígeno devido à administração de anticorpo foi suprimida. Entretanto, no dia três após a administração, a concentração de receptor de IL-6 em plasma do grupo administrado com mF46 foi marcadamente reduzida em cerca de cinco vezes em comparação àquela do grupo sem administração de anticorpo e cerca de 15 vezes em comparação àquela do grupo administrado com mIgG1.
[000494] Os resultados descritos nos Exemplos de Referência (8-2) e (8-3) mostram que a concentração de antígeno solúvel no plasma é marcadamente reduzida no grupo administrado com um anticorpo que se liga a um antígeno solúvel de uma maneira dependente de pH e tem atividade de ligação de FcyRIIb de camundongo seletivamente aumentada. EXEMPLO DE REFERÊNCIA 9 O EFEITO DE ELIMINAÇÃO DE AN- TÍGENO DE ANTICORPOS COM ACENTUAÇÃO SELETIVA DA LIGAÇÃO A FCyRIII (9-1) O EFEITO DE ELIMINAÇÃO DE ANTÍGENO DE ANTICORPOS COM LIGAÇÃO DE FCyRIII SELETIVAMENTE ACENTUADA
[000495] Camundongos com deficiência de FcyRIIb (Fcgr2b (FcyRII) mouse, Taconic) (Nature (1996) 379 (6.563), 346 a 349) expressam FCYRI de camundongo, FcyRIII de camundongo e FCYRIV e camundongo, mas não FcyRIIb de camundongo. Conforme descrito no Exemplo 5, foi demonstrado que mF44 e mF46 resultantes do aumento da atividade de ligação de FCYR de IgG1 de camundongo nativa mostram ligação seletivamente acentuada a FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo. Foi concebido que, com base no uso da atividade de ligação seletivamente aumentada dos anticorpos, a condição de administração de um anticorpo com ligação seletivamente acentuada a FcyRIII de camundongo pode ser simulada por administração de mF44 ou mF46 a camundongos com deficiência de FcyRIIb de camundongo que não expressam FcyRIIb de camundongo.
[000496] Conforme descrito no Exemplo de Referência 8, a concentração de antígeno solúvel foi reduzida no plasma de camundongos com deficiência de FcyRIII, que simulam a condição de administração de um anticorpo com atividade de ligação de FcyRIIb de camundongo seletivamente aumentada. Entretanto, se a concentração de antígeno solúvel é reduzida no plasma de camundongos com deficiência de FcyRIIb, que simulam a condição de administração de um anticorpo com atividade de ligação de FcyRIII de camundongo seletivamente aumentada, foi avaliado pelo teste descrito abaixo. (9-2) AVALIAÇÃO DO EFEITO DE ELIMINAÇÃO DE ANTÍGENO POR ACENTUAÇÃO SELETIVA DE LIGAÇÃO DE FCyRIII DE CA-MUNDONGO COM O USO DE CAMUNDONGOS COM DEFICIÊNCIA DE FCyRIIB
[000497] O efeito para eliminar o receptor de IL-6 solúvel do plasma de camundongos com deficiência de FcyRIIb administrados com o anticorpo de receptor de IL-6 anti-humano Fv4-mIgG1, Fv4-mIgG1-mF44 ou Fv4-mIgG1-mF46 foi avaliado pelo mesmo método conforme descrito no Exemplo 5. As concentrações de receptor de IL-6 humano solúvel em plasma foram determinadas pelo método descrito acima no Exemplo de Referência (7-4). O resultado é mostrado na Figura 17.
[000498] De modo surpreendente, nos grupos administrados com mF44 e mF46, que simulam aumento seletivo da atividade de ligação de FcyRIII de mIgG1 (IgG1 de camundongo nativa), a concentração de receptor de IL-6 em plasma foi reduzida, mas a redução notável não foi confirmada em comparação àquela mostrada no Exemplo de Referência 8.
[000499] Sem ater-se a uma teoria particular, com base nos resultados descritos nos Exemplos de Referência 7, 8 e 9, a discussão a seguir é possível. A eliminação de receptor de IL-6 solúvel do plasma mostrou ser marcadamente acelerada em camundongos normais que expressam tanto FcyRIIb de camundongo como FcyRIII de camundongo que foram administrados com mF44 e mF46 com atividade de ligação seletivamente aumentada de of mIgG1 (IgG1 de camundongo nativa) para FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo. Além disso, foi revelado que, quando mF44 e mF46 foram administrados a camundongos que expressam FcyRIIb de camundongo, mas não FcyRIII de camundongo (isto é, camundongos com deficiência de FcyRIII e camundongos com deficiência de cadeia Y de receptor Fc), a eliminação de receptor de IL-6 solúvel foi também acelerada marca- damente nos camundongos. Entretanto, quando mF44 e mF46 foram administrados a camundongos que expressam FcyRIII de camundongo, mas não FcyRIIb de camundongo (isto é, camundongos com deficiência de FcyRII), a eliminação de receptor de IL-6 solúvel do plasma não foi marcadamente acelerada nos camundongos.
[000500] A partir das conclusões acima, acredita-se que os anticorpos mF44 e mF46 em que a atividade de ligação de mIgG1 (IgG1 de camundongo nativa) a FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo é aumentada são incorporados em células que expressam FCYR principalmente por FcyRIIb de camundongo e, portanto, o antí- geno solúvel no plasma que se liga aos anticorpos é eliminado. Entretanto, acredita-se que a incorporação mediada por FcyRIII de complexos de anticorpo/antígeno em células que expressam FcyR não contribua significativamente para a eliminação do antígeno solúvel do plasmas.
[000501] Além disso, a concentração plasmática de receptor de IL-6 solúvel foi marcadamente reduzida em camundongos administrados com Fv4-IgG1-F1087 (SEQ ID NO: 28 de cadeia pesada; SEQ ID NO: 29 de cadeia leve) que tem atividade de ligação aumentada a FcyRIIb de camundongo e FcyRIII de camundongo. Entretanto, o efeito para eliminar receptor de IL-6 solúvel do plasma de camundongos administrados com Fv4-IgG1-F1182 com atividade de ligação aumentada a FcyRI de camundongo e FcyRIV de camundongo foi confirmada como sendo menor do que aquela de Fv4-IgG1-F1087.
[000502] Fv4-IgG1-Fuc (produzido por expressão de Fv4-IgG1 (SEQ ID NO: 30 de cadeia pesada; SEQ ID NO: 29 de cadeia leve) com o uso de células CHO que carecem do gene transportador de fucose (WO2006/067913) como células hospedeiras) acentuou grandemente a atividade de ligação a FcyRIV de camundongo, já que tem uma cadeia de açúcar do tipo com baixo teor de fucose (Science (2005) 310 (5.753) 1.510 a 1.512). Apesar de a concentração do receptor de IL-6 solúvel em plasma de camundongos com Fv4-IgG1-Fuc ter sido diminuída em comparação àquela de camundongos administrados com Fv4-IgG1, esse efeito de diminuição foi aproximadamente duas vezes e foi confirmado como sendo pequeno. Portanto, a captação de anticorpos em células que expressam FCYR através de FCYRIV de camundongo pode não ser grandemente contribuinte para a eliminação de antígenos solúveis em plasma.
[000503] Em vista do anterior, foi demonstrado que, de diversos FCYRS de camundongo, a FcyRIIb de camundongo exerce um papel principal na incorporação de anticorpo em células que expressam FcyR em camundongos. Portanto, pode-se acreditar que as mutações a serem introduzidas no domínio de ligação de FcyR de camundongo incluem de modo preferencialmente particular, porém sem limitação particular, mutações que acentual a ligação a FcyRIIb de camundongo.
[000504] Os presentes exames mostraram que a administração de uma molécula de ligação de antígeno que se liga a um antígeno solúvel de uma maneira dependente de pH e tem atividade de ligação de FcyR acentuada pode acelerar a eliminação do antígeno solúvel no plasma do organismo administrado com anticorpo. Essa eliminação de antígenos solúveis em plasma através de FcyRs era conhecida por ocorrer principalmente através de FcyRIIb entre os FcyRs em camundongos. Mais especificamente, para acelerar a eliminação de antíge- nos solúveis em plasma com o uso da interação entre FcyR e o complexo de anticorpo e antígeno, FcyRIIb é particularmente importante entre os FcyRs, contanto que a ligação de FcyRIIb seja mantida, o efeito de eliminação é mantido. Dessa forma, revela-se que quando uma molécula de ligação de antígeno que se liga a antígenos solúveis de uma maneira dependente de pH e tem atividade de ligação de FcyRIIb acentuada foi administrada in vivo, a mesma pode acelerar a eliminação de antígenos solúveis em plasma para reduzir de modo efi- caz a concentração de antígenos solúveis em plasma e mostra claramente ações muitos eficazes.
APLICABILIDADE INDUSTRIAL
[000505] A presente invenção fornece variantes de região Fc com atividades de ligação diminuídas para todos os FCYRS de ativação, em particular FcyRIIa (tipo R), enquanto mantêm sua atividade de ligação de FcyRIIb em comparação àquela de um polipeptídeo que contém uma região Fc de IgG nativa; e polipeptídeos que compreendem tais variantes de região Fc. Com o uso dos polipeptídeos, é possível trans- duzir sinais de resposta imunológica inflamatória mediada por fosfori- lação de ITIM em FcyRIIb. Além disso, dotando-se um anticorpo Fc d a propriedade de ligação de FcyRIIb seletiva, as ações imunossupresso- ras através de FcyRIIb podem possibilitar a supressão de produção de antianticorpo.

Claims (6)

1. Variante de região Fc de IgG1 humana, caracterizada pelo fato de que apresenta uma atividade de ligação de FcyRIIb que é de pelo menos 80% da quantidade de ligação de uma região Fc de IgG1 nativa e tem uma atividade de ligação de FcyRIIaR que é 30% ou menos da quantidade de ligação da região Fc de IgG1 nativa, selecionada do grupo consistindo em: (1) uma variante da região IgG1 Fc humana compreendendo uma região IgG1 Fc humana na qual o aminoácido na posição 237 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por Gln e o aminoácido na posição 238 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por Asp; (2) uma variante da região IgG1 Fc humana compreendendo uma região IgG1 Fc humana na qual o aminoácido na posição 238 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por Asp e o aminoácido na posição 241 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por Met ou Leu; (3) uma variante da região IgG1 Fc humana compreendendo uma região IgG1 Fc humana na qual o aminoácido na posição 238 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por Asp e o aminoácido na posição 268 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por Pro; (4) uma variante da região IgG1 Fc humana compreendendo uma região IgG1 Fc humana na qual o aminoácido na posição 238 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por Asp e o aminoácido na posição 295 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por Val; (5) uma variante da região IgG1 Fc humana compreendendo uma região IgG1 Fc humana na qual o aminoácido na posição 238 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por Asp e o aminoácido na posição 296 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por Glu ou His; (6) uma variante da região IgG1 Fc humana compreendendo uma região IgG1 Fc humana na qual o aminoácido na posição 238 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por Asp e o aminoácido na posição 298 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por Met; (7) uma variante da região IgG1 Fc humana compreendendo uma região IgG1 Fc humana na qual o aminoácido na posição 238 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por Asp e o aminoácido na posição 324 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por Asn ou His; (8) uma variante da região IgG1 Fc humana compreendendo uma região IgG1 Fc humana na qual o aminoácido na posição 238 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por Asp e o aminoácido na posição 330 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por His ou Tyr; (9) uma variante da região IgG1 Fc humana que compreende uma região IgG1 Fc humana na qual o aminoácido na posição 238 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por Asp, a posição 241 do aminoácido da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído com Met, a posição de aminoácido 268 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituída por Pro, a posição de aminoácido 296 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituída por Glu e a posição de aminoácido 324 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por His; (10) uma variante da região IgG1 Fc humana compreendendo uma região IgG1 Fc humana na qual a posição de aminoácido 237 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituída por Gln, o aminoácido na posição 238 da região Fc de acordo com a nu- meração EU é substituído por Asp, a posição de aminoácido 241 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituída por Met, a posição de aminoácido 296 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituída por Glu e a posição de aminoácido 330 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por His; e (11) uma variante da região IgG1 Fc humana compreendendo uma região IgG1 Fc humana na qual a posição de aminoácido 235 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituída por Phe, a posição de aminoácido 237 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituída com Gln, o aminoácido na posição 238 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por Asp, a posição do aminoácido 241 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituída por Met e a posição do aminoácido 296 da região Fc de acordo com a numeração EU é substituído por Glu, em que a região Fc de IgG1 nativa é uma região Fc compreendida em uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 31.
2. Variante de região Fc de IgG1 humana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a razão da atividade de ligação de FcyRIIb da variante em relação à atividade de ligação de um polipeptídeo que compreende a região Fc de IgG1 nativa é pelo menos 0,75, e as razões das atividades de ligação para FcyRs é de 0,2 ou menos, ou em que adicionalmente uma razão de uma atividade de ligação de FcyRIIaR da variante em relação à atividade de ligação de um polipeptídeo que compreende a região Fc de IgG1 nativa é de 0,1 ou menos.
3. Polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende a variante de região Fc de IgG1 humana, como definida na reivindicação 1 ou 2.
4. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 3, caracteri- zado pelo fato de que o polipeptídeo compreendendo a variante de região Fc de IgG1 humana é: um anticorpo IgG1; ou uma molécula de proteína de fusão Fc.
5. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o polipeptídeo, como definido na reivindicação 3 ou 4, e um veículo medicamente aceitável.
6. Método para produzir um polipeptídeo, como definido na reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) alterar um ácido nucleico que codifica a região Fc de IgG1 humana para codificar o polipeptídeo como definido na reivindicação 3 ou 4; (b) introduzir o ácido nucleico da etapa (a) em uma célula hospedeira e cultivar a célula para expressar o polipeptídeo codificado pelo ácido nucleico da etapa (a); e (c) coletar o referido polipeptídeo da cultura de células hospedeiras.
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