CN106318951A - 生产具有ph依赖性结合特性的抗原结合蛋白的小鼠 - Google Patents

生产具有ph依赖性结合特性的抗原结合蛋白的小鼠 Download PDF

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Abstract

本申请提供了经基因修饰的非人动物，所述非人动物包含免疫球蛋白重链基因座，所述基因座含有未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列含有加入至少一个组氨酸密码子或者使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。本申请提供了用于制备如本申请所述的经基因修饰的非人动物的组合物和方法。本申请还提供了能够表达抗原结合蛋白的非人动物，所述抗原结合蛋白的特征为pH依赖性抗原结合、增强的再循环性和/或增强的血清半衰期。

Description

生产具有PH依赖性结合特性的抗原结合蛋白的小鼠
相关申请的交叉引用
本申请是申请号为201380025685.9、申请日为2013年3月15日、发明名称为“生产具有PH依赖性结合特性的抗原结合蛋白的小鼠”的中国发明专利申请的分案申请，原申请要求2012年3月16日提交的美国临时申请号61/611,950，2012年3月20提交的美国临时申请号61/613,352，以及2012年12月13日提交的美国临时申请号61/736,930的优先权，所述各申请的全部内容通过引用并入本申请。
发明领域
非人动物经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的人源重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个非组氨酸密码子。非人动物，包含啮齿动物例如小鼠和大鼠，在其种系中包含未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个非组氨酸密码子。基因工程改造的非人动物能够表达抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白的特征为pH依赖性抗原结合、再循环性(recyclability)的提高和/或血清半衰期的增加。
发明背景
能够通过多种消除机制影响给予身体的药物(包括治疗性单克隆抗体)，所述消除机制包括肾小球滤过(例如进入尿液)、分泌(例如进入胆汁)和通过细胞的分解代谢。尽管小分子通过肾脏的过滤从身体中清除，但大多数的分泌抗体(例如IgG，其过大而无法滤过肾小球)主要通过细胞介导的分解代谢从身体中除去，例如流体相的内吞作用(吞噬作用)或受体介导的内吞作用。例如，具有若干重复表位的可溶性分子与多个循环抗体结合，并且所得到的较大的抗原-抗体复合物被迅速地吞噬进入细胞而降解。另一方面，与抗体结合的细胞表面靶受体(即受体-抗体复合物)以剂量依赖性的方式经历靶向介导的内吞作用，这导致细胞内形成前往溶酶体降解的核内体(endosome)。在一些情况下，细胞内吞的受体-抗体复合物以pH依赖性的方式在核内体内结合新生儿Fc受体(FcRn)并且当暴露于中性细胞外pH(例如pH 7.0-7.4)时，再返回细胞表面以释放进入血浆或组织液。
在本领域中需要系统，例如生成具有可滴定的残基(titratable residue)的抗原结合蛋白的非人动物、细胞和基因组的基因座，例如经基因修饰的基因座，所述基因座重排免疫球蛋白基因区段以生成响应pH的改变的重链可变结构域，例如提供或接受质子并且例如根据质子化状态不同而具有不同的结合特性。
在本领域中还需要某种方法和组合物，所述方法和组合物能够在不影响所述抗原结合蛋白对目标抗原的特异性和亲和性的情况下，通过促进抗原结合蛋白从受体抗原结合蛋白复合物中解离或通过在酸性核内体隔室中增加抗原结合蛋白对FcRn的亲和性，来进一步增加细胞内吞的抗原结合蛋白的再循环效率。
发明概述
本申请提供了在非人动物的种系基因组中的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座，其中所述免疫球蛋白重链基因座包含经基因修饰的未经重排的重链可变区核苷酸序列(例如一个或多个经基因修饰的人源VH、D和/或JH基因区段)，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。在各种实施方式中，所述经基因修饰的未经重排的重链可变区核苷酸序列在编码免疫球蛋白重链可变结构域的至少一个阅读框架中包含至少一个组氨酸密码子。在各种实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含与人源或非人源重链恒定区核苷酸序列(例如编码选自IgM、IgD、IgA、IgE和IgG的免疫球蛋白同种型的重链恒定区核苷酸序列)可操作地连接的至少一个组氨酸密码子。
本申请提供了非人动物(哺乳动物，例如啮齿动物，如小鼠、大鼠或仓鼠)，所述非人动物经基因工程改造以便在其种系基因组中含有免疫球蛋白重链基因组基因座，其中所述基因组基因座包含未经重排的重链可变区核苷酸序列(例如一个或多个经基因修饰的人源VH、D和/或JH基因区段)，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。在各种实施方式中，所述非人动物的基因组包含修饰(i)所述修饰使全部或基本上全部的内源性免疫球蛋白VH、D和/或JH基因区段缺失或使其不具有功能(例如通过在所述免疫球蛋白基因座插入核苷酸序列例如外源性核苷酸序列，或通过使内源性VH、D和/或JH基因区段产生不具有功能的重排或反转)；以及(ii)所述修饰引入未经重排的人源重链可变区核苷酸序列(例如经基因修饰的人源VH、D或JH基因区段)，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。在各种实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列存在于内源性基因座(即所述未经重排的重链可变区核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在与其基因组中的内源性免疫球蛋白重链基因座不同的基因座上)，或在其内源性基因座中(例如在免疫球蛋白可变基因座内，其中所述内源性基因座位于或移至基因组中的不同位置)。在各种实施方式中，所述免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与人源或非人源重链恒定区核苷酸序列(例如编码选自IgM、IgD、IgA、IgE和IgG的免疫球蛋白同种型的重链恒定区核苷酸序列)可操作地连接。
本申请提供了经基因修饰的非人动物，所述非人动物能够表达包含一个或多个组氨酸的经基因修饰的免疫球蛋白重链可变结构域，其中所述一个或多个组氨酸不是由与野生型非人动物对应的种系基因区段编码。
本申请提供了经基因修饰的非人动物，所述非人动物包含B细胞群，所述B细胞群的特征为经重排的免疫球蛋白重链可变基因编码具有一个或多个组氨酸的免疫球蛋白重链可变结构域，所述一个或多个组氨酸不是由与野生型非人动物对应的种系基因区段编码。
本申请提供了用于制备非人动物的方法和组合物，所述非人动物包含经基因修饰的免疫球蛋白重链可变基因座，所述基因座包含未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列在编码重链可变结构域的至少一个阅读框架中含有一个或多个组氨酸密码子。
本申请提供了用于非人动物的方法和组合物，所述方法和组合物生成显示出与抗原以pH依赖性方式结合的抗原结合蛋白。本申请提供了用于制备非人动物的方法和组合物，所述非人动物具有B细胞群或抗体群，其富含(与相应的野生型动物相比)pH依赖性的抗原结合蛋白，例如特别是重链可变结构域和/或其抗原结合片段。
在一个方面，本申请提供了在非人动物的种系基因组中的经基因修饰的免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座包含未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，包含啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在一个实施方式中，所述组氨酸密码子的加入或取代存在于选自下组的免疫球蛋白重链基因区段中：人源VH基因区段、人源D基因区段、人源JH基因区段及其组合。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白重链基因区段选自人源种系VH基因区段、人源种系D基因区段、人源种系JH基因区段及其组合。
在一个实施方式中，所述人源V基因区段(VH)选自下组：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1、VH7-81及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段选自下组：D1-1、D1-7、D1-14、D1-20、D1-26、D2-2、D2-8、D2-15、D2-21、D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22、D4-4、D4-11、D4-17、D4-23、D5-12、D5-5、D5-18、D5-24、D6-6、D6-13、D6-19、D6-25、D7-27及其组合。
在一个实施方式中，所述人源J基因区段选自下组：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6及其组合。
在一个实施方式中，所述加入或取代的组氨酸密码子存在于编码N-末端区、环4区、CDR1、CDR2、CDR3及其组合的未经重排的重链可变区核苷酸序列中。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个、34个或更多个、35个或更多个、36个或更多个、37个或更多个、38个或更多个、39个或更多个、40个或更多个、41个或更多个、42个或更多个、43个或更多个、44个或更多个、45个或更多个、46个或更多个、47个或更多个、48个或更多个、49个或更多个、50个或更多个、51个或更多个、52个或更多个、53个或更多个、54个或更多个、55个或更多个、56个或更多个、57个或更多个、58个或更多个、59个或更多个、60个或更多个或者61个或更多个组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列与编码选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同种型的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与选自CH1、铰链、CH2、CH3及其组合的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列含有CH1、铰链、CH2和CH3(即CH1-铰链-CH2-CH3)。
在一个实施方式中，重链恒定区核苷酸序列存在于内源性基因座(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在与其基因组的内源性免疫球蛋白链基因座不同的基因座上，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列含有在CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述重链恒定区氨基酸序列与FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含在位置250的修饰(例如E或Q)；在位置250和428的修饰(例如L或F)；在位置252的修饰(例如L/Y/F/W或T)、在254的修饰(例如S或T)和在256的修饰(例如S/R/Q/E/D或T)；或在位置428和/或433的修饰(例如L/R/S/P/Q或K)和/或在434的修饰(例如H/F或Y)；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308的修饰(例如308F、V308F)和在434的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述人源CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH3氨基酸序列，所述人源CH3氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述CH3氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、N434S及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、V259I、V308F及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含N434A突变。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：M252Y、S254T、T256E及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：T250Q、M248L或这两者。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：H433K、N434Y或这两者。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含：(1)第一等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第一重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第一重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和(2)第二等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第二重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第二重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列与蛋白A的结合降低或消除的修饰(参见例如US 2010/0331527A1，其通过引用整体并入本申请)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列还包含Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)。在另一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)和Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)这两者。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG1并且还包含选自下组的突变：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG2并且还包含选自下组的突变：N44S、K52N和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为N384S、K392N和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG4并且还包含选自下组的突变：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区氨基酸序列是非人源恒定区氨基酸序列，并且所述重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段从免疫球蛋白重链基因座中缺失或者使其不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列(例如外源性核苷酸序列)或者通过使内源性VH、D、JH区段产生不具有功能的重排或反转)。在一个实施方式中，例如，约80％或更多的、约85％或更多的、约90％或更多的、约95％或更多的、约96％或更多的、约97％或更多的、约98％或更多的或者约99％或更多的全部的内源性VH、D或JH基因区段被缺失或使其不具有功能。在一个实施方式中，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的内源性具有功能的V、D或J基因区段被缺失或使其不具有功能。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座包含使全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段缺失或使其不具有功能的修饰；并且所述经基因修饰的基因座包含未经重排的重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列含有具有一个或多个组氨酸密码子的一个或多个人源VH、D和/或JH基因区段，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列存在于内源性位置中(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在与其基因组的内源性免疫球蛋白链基因座不同的基因座上)，或在其内源性基因座中(例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者，并且所述基因修饰不会影响所述内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者的表达和/或功能。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含异位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座还包含人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列与免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述轻链恒定区核苷酸序列选自λ轻链恒定区核苷酸序列和κ轻链恒定区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ轻链可变区核苷酸序列与λ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述λ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的κ轻链可变区核苷酸序列与κ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述κ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含未经重排的轻链可变基因序列，所述未经重排的轻链可变基因序列含有在编码轻链可变结构域的至少一个阅读框架中引入至少一个组氨酸密码子的至少一个修饰。在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含经重排的序列(例如重排的λ或κV/J序列)，所述经重排的序列在轻链CDR中含有1个、2个、3个或4个组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述CDR选自CDR1、CDR2、CDR3及其组合。在一个实施方式中，所述未经重排的或经重排的轻链可变区核苷酸序列是未经重排的或经重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述未经重排的或经重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列存在于内源性小鼠免疫球蛋白轻链基因座中。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠κ基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠λ基因座。
在一个实施方式中，如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重链基因座中。在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠中的人源化的免疫球蛋白重链基因座中。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不具有基因修饰的相应野生型重链可变结构域相比，在酸性环境中(例如在约5.5至约6.0的pH下)显示出更弱的抗原结合。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白，在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含B细胞群，所述B细胞群经目标抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白含有具有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。如本申请所述的抗原结合蛋白当给予对象时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出的增加的血清半衰期，与相应的野生型抗原结合蛋白相比高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与没有本申请所述的基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比，具有的特征为pH依赖的再循环性的提高、血清半衰期的增加或两者兼而有之。
在一个方面，本申请提供了在非人动物的种系基因组中的经基因修饰的免疫球蛋白基因座，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座含有未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，其中所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，包含啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在一个实施方式中，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个、34个或更多个、35个或更多个、36个或更多个、37个或更多个、38个或更多个、39个或更多个、40个或更多个、41个或更多个、42个或更多个、43个或更多个、44个或更多个、45个或更多个、46个或更多个、47个或更多个、48个或更多个、49个或更多个、50个或更多个、51个或更多个、52个或更多个、53个或更多个、54个或更多个、55个或更多个、56个或更多个、57个或更多个、58个或更多个、59个或更多个、60个或更多个或者61个或更多个内源性非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
在一个实施方式中，所述内源性非组氨酸密码子编码选自下组的氨基酸：Y、N、D、Q、S、W和R。
在一个实施方式中，所述取代的组氨酸密码子存在于未经重排的重链可变区核苷酸序列中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列编码选自下组的免疫球蛋白可变结构域：N-末端区、环4区、CDR1、CDR2、CDR3及其组合。
在一个实施方式中，所述取代的组氨酸密码子存在于未经重排的重链可变区核苷酸序列中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列编码选自下组的互补性决定区(CDR)：CDR1、CDR2、CDR3及其组合。
在一个实施方式中，所述取代的组氨酸密码子存在于未经重排的重链可变区核苷酸序列中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列编码选自下组的框架区(FR)：FR1、FR2、FR3、FR4及其组合。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含经基因修饰的人源VH基因区段，其中所述人源VH基因区段的至少一个阅读框架中的一个或多个内源性非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含修饰，所述修饰使用组氨酸密码子取代人源VH基因区段的至少一个内源性非组氨酸密码子，其中所述人源VH基因区段选自下组：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1、VH7-81及其组合。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含经基因修饰的人源JH基因区段，其中所述人源JH基因区段的至少一个阅读框架中的一个或多个内源性非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含修饰，所述修饰是使用组氨酸密码子取代人源JH区段的至少一个内源性非组氨酸密码子，其中所述人源JH基因区段选自下组：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6及其组合。
在一个实施方式中，所述取代的组氨酸密码子存在于编码CDR3的一部分的重链可变区核苷酸序列中。在一个实施方式中，所述CDR3的一部分包含来源于经基因修饰的人源D基因区段的阅读框架的氨基酸序列，所述经基因修饰的D基因区段含有使用组氨酸密码子取代在阅读框架中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述被组氨酸密码子取代的内源性非组氨酸密码子编码选自下组的氨基酸：Y、N、D、Q、S、W和R。
在一个实施方式中，所述取代的组氨酸密码子存在于在人源化免疫球蛋白小鼠中最常见的人源D基因区段的至少一个阅读框架中。
在一个实施方式中，编码CDR3的一部分的所述经基因修饰的人源D基因区段的阅读框架选自疏水性框架、终止框架和亲水性框架。
在一个实施方式中，所述阅读框架是人源D基因区段的疏水性框架。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D1-1(GTTGT；SEQ ID NO:88)、D1-7(GITGT；SEQ ID NO:89)、D1-20(GITGT；SEQ ID NO:89)和D1-26(GIVGAT；SEQ ID NO:90)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(DIVVVPAAI；SEQ ID NO:92)、D2-8(DIVLMVYAI；SEQ ID NO:94)、D2-15(DIVVVVAAT；SEQ ID NO:95)和D2-21(HIVVVTAI；SEQ ID NO:97)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(ITIFGVVII；SEQ ID NO:98)、D3-9(ITIF*LVII；SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100)、D3-10(ITMVRGVII；SEQ ID NO:101)、D3-16(IMITFGGVIVI；SEQ ID NO:102)和D3-22(ITMIVVVIT；SEQ ID NO:103)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(TTVT；SEQ ID NO:105)、D4-11(TTVT；SEQ ID NO:105)、D4-17(TTVT；SEQ ID NO:105)、D4-23(TTVVT；SEQ ID NO:106)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(VDTAMV；SEQ ID NO:107)、D5-12(VDIVATI；SEQ ID NO:108)、D5-18(VDTAMV；SEQ ID NO:107)和D5-24(VEMATI；SEQ ID NO:109)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(SIAAR；SEQ ID NO:111)、D6-13(GIAAAG；SEQ ID NO:113)和D6-19(GIAVAG；SEQ ID NO:115)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述疏水性框架包含编码人源D7-27(LTG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述阅读框架是人源D基因区段的终止阅读框架。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D1-1(VQLER；SEQ ID NO:8)、D1-7(V*LEL)、D1-20(V*LER)、D1-26(V*WELL；SEQ ID NO:12)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(RIL**YQLLY；SEQ ID NO:14)、D2-8(RILY*WCMLY；SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17)、D2-15(RIL*WW*LLL)和D2-21(SILWW*LLF；SEQ ID NO:19)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(VLRFLEWLLY；SEQ ID NO:21)、D3-9(VLRYFDWLL*；SEQ ID NO:23)、D3-10(VLLWFGELL*；SEQ ID NO:25)、D3-16(VL*LRLGELSLY；SEQ ID NO:27)和D3-22(VLL***WLLL；SEQ ID NO:29)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(*LQ*L)、D4-11(*LQ*L)、D4-17(*LR*L)和D4-23(*LRW*L)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(WIQLWL；SEQ ID NO:35)；D5-12(WI*WLRL；SEQ ID NO:37)、D5-18(WIQLWL；SEQ ID NO:35)和D5-24(*RWLQL；SEQ ID NO:39)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(V*QLV)、D6-13(V*QQLV；SEQ ID NO:41)和D6-19(V*QWLV；SEQID NO:43)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码D7-27(*LG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中人源D基因区段的至少一个内源性密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述阅读框架是人源D基因区段的亲水性框架。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D1-1(YNWND；SEQ ID NO:45)、D1-7(YNWNY；SEQ ID NO:47)、D1-20(YNWND；SEQ ID NO:45)和D1-26(YSGSYY；SEQ ID NO:49)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(GYCSSTSCYT；SEQ ID NO:51)、D2-8(GYCTNGVCYT；SEQ ID NO:53)、D2-15(GYCSGGSCYS；SEQ ID NO:55)和D2-21(AYCGGDCYS；SEQ ID NO:57)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(YYDFWSGYYT；SEQ ID NO:59)、D3-9(YYDILTGYYN；SEQ ID NO:61)、D3-10(YYYGSGSYYN；SEQ ID NO:63)、D3-16(YYDYVWGSYRYT；SEQ ID NO:65)和D3-22(YYYDSSGYYY；SEQ ID NO:67)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(DYSNY；SEQ ID NO:69)、D4-11(DYSNY；SEQ ID NO:69)、D4-17(DYGDY；SEQ ID NO:71)和D4-23(DYGGNS；SEQ ID NO:73)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:70、SEQID NO:72、SEQ ID NO:74及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(GYSYGY；SEQ ID NO:75)、D5-12(GYSGYDY；SEQ ID NO:77)、D5-18(GYSYGY；SEQ ID NO:75)和D5-24(RDGYNY；SEQ ID NO:79)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(EYSSSS；SEQ ID NO:81)、D6-13(GYSSSWY；SEQ ID NO:83)和D6-19(GYSSGWY；SEQ ID NO:85)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:76及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码D7-27(NWG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86及其组合。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与选自下组的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接：CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含CH1、铰链、CH2和CH3(即CH1-铰链-CH2-CH3)。
在一个实施方式中，重链恒定区核苷酸序列存在于内源性基因座(例如所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在与其基因组的内源性免疫球蛋白链基因座不同的基因座上)，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含在位置250(例如E或Q)的修饰；在位置250和428的修饰(例如L或F)；在位置252的修饰(例如L/Y/F/W或T)、在254的修饰(例如S或T)和在256的修饰(例如S/R/Q/E/D或T)；或在位置428和/或433的修饰(例如L/R/S/P/Q或K)和/或在434的修饰(例如H/F或Y)；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308的修饰(例如308F、V308F)和在434的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述人源CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH3氨基酸序列，所述人源CH3氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述CH3氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、N434S及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、V259I、V308F及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含N434A突变。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：M252Y、S254T、T256E及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：T250Q、M248L或这两者。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：H433K、N434Y或这两者。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含：(1)第一等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第一重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第一重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和(2)第二等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第二重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第二重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列与蛋白A的结合降低或消除的修饰(参见例如US 2010/0331527A1，其整体通过引用并入本申请)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列还包含Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)。在另一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)和Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)这两者。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG1，并且还包含选自下组的突变：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG2，并且还包含选自下组的突变：N44S、K52N和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为N384S、K392N和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG4，并且还包含选自下组的突变：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区氨基酸序列是非人源恒定区氨基酸序列，并且所述重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列是人源重链恒定区氨基酸序列，并且所述人源重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段从免疫球蛋白重链基因座中缺失或者使其不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列例如外源性核苷酸序列，或者通过使内源性VH、D、JH区段产生不具有功能的重排或反转)。在一个实施方式中，例如，约80％或更多的、约85％或更多的、约90％或更多的、约95％或更多的、约96％或更多的、约97％或更多的、约98％或更多的或者约99％或更多的全部的内源性VH、D或JH基因区段被缺失或使其不具有功能。在一个实施方式中，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的内源性具有功能的V、D或J基因区段被缺失或使其不具有功能。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的基因座包含使全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段缺失或使其不具有功能的修饰；并且所述基因组的基因座包含经基因修饰的、未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列含有在至少一个阅读框架中使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述经基因修饰的、未经重排的免疫球蛋白重链可变基因序列存在于内源性位置(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在与其基因组的内源性免疫球蛋白链基因座不同的基因座上)，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或移至基因组中的不同位置。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的基因座包含内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者，并且所述基因修饰不会影响所述内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者的表达和/或功能。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的基因座包含异位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是小鼠Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是小鼠Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座还包含人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列与免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述轻链恒定区核苷酸序列选自λ轻链恒定区核苷酸序列和κ轻链恒定区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ轻链可变区核苷酸序列与λ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述λ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的κ轻链可变区核苷酸序列与κ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述κ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含未经重排的轻链可变基因序列，所述未经重排的轻链可变基因序列含有在编码轻链可变结构域的至少一个阅读框架中引入至少一个组氨酸密码子的至少一个修饰。在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含重排的序列(例如重排的λ或κV/J序列)，所述序列在轻链CDR中含有1个、2个、3个或4个组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述CDR选自CDR1、CDR2、CDR3及其组合。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的轻链可变区核苷酸序列是未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列存在于内源性小鼠免疫球蛋白轻链基因座中。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠κ基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠λ基因座。
在一个实施方式中，如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重链基因座中。在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠中的人源化的免疫球蛋白重链基因座中。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含如本申请所述的基因修饰的相应野生型重链可变结构域相比，在酸性环境中(例如在约5.5至约6.0的pH下)显示出更弱的抗原结合。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比，具有的特征为pH依赖的再循环性的提高、血清半衰期的增加或两者兼而有之。
在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含B细胞群，所述B细胞群经目标抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白包含含有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。通过本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座产生的抗原结合蛋白当给予对象时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出的增加的血清半衰期，与相应的野生型抗原结合蛋白相比高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个方面，本申请提供了非人动物的经基因修饰的免疫球蛋白基因座，所述免疫球蛋白基因座包含人源VH、D和JH基因区段，其中至少一个人源D基因区段相对于相应的野生型序列从5’至3’反转，并且其中所述反转的人源D基因区段的至少一个阅读框架包含一个或多个组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，包含啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于种系基因组中。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座编码免疫球蛋白重链可变结构域，所述免疫球蛋白重链可变结构域含有1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个或者34个或更多个组氨酸残基。
在一个实施方式中，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或者全部或基本上全部的具有功能的人源D基因区段相对于对应的野生型序列是反向的。
在一个实施方式中，全部或基本上全部的内源性免疫球蛋白VH、D、JH基因区段从所述免疫球蛋白重链基因座中缺失或使其不具有功能(例如通过在所述免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列例如外源性核苷酸序列，或通过使全部或基本上全部的内源性免疫球蛋白VH、D、JH区段产生不具有功能的重排或反转)，并且所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含人源VH、D和JH基因区段，其中所述至少一个人源D基因区段以相对于对应的野生型序列相反的方向存在，并且其中在反转的人源D基因区段中的至少一个阅读框架包含至少一个组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述反转的人源D基因区段与人源VH基因区段和/或人源JH基因区段可操作地连接。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段以相对于选自下组的相应的野生型序列相反的方向存在：D1-1、D1-7、D1-20、D1-26、D2-2、D2-8、D2-15、D2-21、D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22、D4-4、D4-11、D4-17、D4-23、D5-5、D5-12、D5-18、D5-24、D6-6、D6-13、D6-19、D7-27及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D1基因区段：D1-1、D1-7、D1-20、D1-26及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D2基因区段：D2-2、D2-8、D2-15、D2-21及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D3基因区段：D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D4基因区段：D4-4、D4-11、D4-17、D4-23及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D5基因区段：D5-5、D5-12、D5-18、D5-24及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D6基因区段：D6-6、D6-13、D6-19及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是D7-27。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的阅读框架选自终止阅读框架、亲水性阅读框架和疏水性阅读框架，并且所述反转的人源D基因区段的至少一个阅读框架包含一个或多个组氨酸密码子。
在一个实施方式中，包含所述反转的人源D基因区段的所述未经重排的重链可变区核苷酸序列与编码选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同种型的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接。
在一个实施方式中，包含所述反转的人源D基因区段的所述未经重排的重链可变区核苷酸序列与编码选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同种型的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与选自下组的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接：CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含CH1、铰链、CH2和CH3(即CH1-铰链-CH2-CH3)。
在一个实施方式中，重链恒定区核苷酸序列存在于内源性基因座(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在与其基因组中的内源性免疫球蛋白链基因座不同的基因座)，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或被移至基因组中的不同位置。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含在位置250的修饰(例如E或Q)；在位置250和428的修饰(例如L或F)；在位置252的修饰(例如L/Y/F/W或T)、在254的修饰(例如S或T)和在256的修饰(例如S/R/Q/E/D或T)；或在位置428和/或433的修饰(例如L/R/S/P/Q或K)和/或在434的修饰(例如H/F或Y)；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308的修饰(例如308F、V308F)和在434的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)以及307和/或308修饰(例如308F或308P)，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述人源CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH3氨基酸序列，所述CH3氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述CH3氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、N434S及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、V259I、V308F及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含N434A突变。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M252Y、S254T、T256E及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：T250Q、M248L或这两者。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：H433K、N434Y或这两者。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含：(1)第一等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第一重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第一重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和(2)第二等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第二重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第二重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列与蛋白A的结合降低或消除的修饰(参见例如US 2010/0331527A1，其通过引用整体并入本申请)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列还包含Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)。在另一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)和Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)这两者。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG1并且还包含选自下组的突变：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG2并且还包含选自下组的突变：N44S、K52N和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为N384S、K392N和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG4并且还包含选自下组的突变：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区氨基酸序列是非人源恒定区氨基酸序列，并且所述重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列是人源重链恒定区氨基酸序列，并且所述人源重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段从免疫球蛋白重链基因座中缺失或者使其不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列(例如外源性核苷酸序列)或者通过使内源性VH、D、JH区段进行不具有功能的重排或反转)。在一个实施方式中，例如，约80％或更多的、约85％或更多的、约90％或更多的、约95％或更多的、约96％或更多的、约97％或更多的、约98％或更多的或者约99％或更多的全部的内源性VH、D或JH基因区段被缺失或使其不具有功能。在一个实施方式中，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的内源性具有功能的V、D或J基因区段被缺失或使其不具有功能。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座包含使全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段缺失或使其不具有功能的修饰；并且所述经基因修饰的基因座包含未经重排的重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列含有如本申请所述的至少一个反转的人源D基因区段，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列存在于内源性位置(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在与其基因组的内源性免疫球蛋白链基因座不同的基因座，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者，并且所述基因修饰不会影响所述内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者的表达和/或功能。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含异位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是小鼠Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是小鼠Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座还包含人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列与免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述轻链恒定区核苷酸序列选自λ轻链恒定区核苷酸序列和κ轻链恒定区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ轻链可变区核苷酸序列与λ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述λ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的κ轻链可变区核苷酸序列与κ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述κ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含未经重排的轻链可变基因序列，所述未经重排的轻链可变基因序列含有在编码轻链可变结构域的至少一个阅读框架中引入至少一个组氨酸密码子的至少一个修饰。在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含重排的序列(例如重排的λ或κV/J序列)，所述序列在轻链CDR中含有1个、2个、3个或4个组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述CDR选自CDR1、CDR2、CDR3及其组合。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的轻链可变区核苷酸序列是未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列存在于内源性小鼠免疫球蛋白轻链基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠κ基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠λ基因座。
在一个实施方式中，如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重链基因座中。在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠中的人源化的免疫球蛋白重链基因座中。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含所述的基因修饰的相应野生型重链可变结构域相比，在酸性环境中(例如在约5.5至约6.0的pH下)显示出更弱的抗原结合。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含所述的基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比，具有的特征为pH依赖的再循环性的提高、血清半衰期的增加或两者兼而有之。
在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含B细胞群，所述B细胞群经目标抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白包含含有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。如本申请所述的抗原结合蛋白当给予对象时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出的增加的血清半衰期与相应的野生型抗原结合蛋白相比，高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个方面，本申请提供了在种系基因组中包含经基因修饰的免疫球蛋白基因座的非人动物，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座含有未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，包含啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在一个实施方式中，所述加入的或取代的组氨酸密码子存在于选自下组的免疫球蛋白重链基因区段：人源VH基因区段、人源D基因区段、人源JH基因区段及其组合。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白重链基因区段选自人源种系VH基因区段、人源种系D基因区段、人源种系JH基因区段及其组合。
在一个实施方式中，所述人源VH基因区段选自下组：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1、VH7-81及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段选自下组：D1-1、D1-7、D1-14、D1-20、D1-26、D2-2、D2-8、D2-15、D2-21、D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22、D4-4、D4-11、D4-17、D4-23、D5-12、D5-5、D5-18、D5-24、D6-6、D6-13、D6-19、D6-25、D7-27及其组合。
在一个实施方式中，所述人源JH基因区段选自下组：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6及其组合。
在一个实施方式中，所述加入的或取代的组氨酸密码子存在于编码N-末端区、环4区、CDR1、CDR2、CDR3及其组合的未经重排的重链可变区核苷酸序列中。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个、34个或更多个、35个或更多个、36个或更多个、37个或更多个、38个或更多个、39个或更多个、40个或更多个、41个或更多个、42个或更多个、43个或更多个、44个或更多个、45个或更多个、46个或更多个、47个或更多个、48个或更多个、49个或更多个、50个或更多个、51个或更多个、52个或更多个、53个或更多个、54个或更多个、55个或更多个、56个或更多个、57个或更多个、58个或更多个、59个或更多个、60个或更多个或者61个或更多个组氨酸密码子。
在一个实施方式中，包含所述反转的人源D基因区段的所述未经重排的重链可变区核苷酸序列与编码选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同种型的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与选自CH1、铰链、CH2、CH3及其组合的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列含有CH1、铰链、CH2和CH3(即CH1-铰链-CH2-CH3)。
在一个实施方式中，重链恒定区核苷酸序列存在于内源性基因座(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在与其基因组的内源性免疫球蛋白链基因座不同的基因座中)，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或移至基因组中的不同位置。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列含有在CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述重链恒定区氨基酸序列与FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含在位置250的修饰(例如E或Q)；在250和428的修饰(例如L或F)；在252的修饰(例如L/Y/F/W或T)、在254的修饰(例如S或T)和在256的修饰(例如S/R/Q/E/D或T)；或在位置428和/或433的修饰(例如L/R/S/P/Q或K)和/或在434的修饰(例如H/F或Y)；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308的修饰(例如308F、V308F)和在434的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述人源CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH3氨基酸序列，所述人源CH3氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述CH3氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、N434S及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、V259I、V308F及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含N434A突变。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：M252Y、S254T、T256E及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：T250Q、M248L或这两者。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：H433K、N434Y或这两者。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含：(1)第一等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第一重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第一重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和(2)第二等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第二重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第二重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列与蛋白A的结合降低或消除的修饰(参见例如US 2010/0331527A1，其通过引用整体并入本申请)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列还包含Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)。在另一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)和Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)这两者。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG1并且还包含选自下组的突变：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG2并且还包含选自下组的突变：N44S、K52N和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为N384S、K392N和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG4并且还包含选自下组的突变：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区氨基酸序列是非人源恒定区氨基酸序列，并且所述重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列是人源重链恒定区氨基酸序列，并且所述人源重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段从免疫球蛋白重链基因座中缺失或者使其不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列(例如外源性核苷酸序列)或者通过使内源性VH、D、JH区段进行不具有功能的重排或反转)。在一个实施方式中，例如，约80％或更多的、约85％或更多的、约90％或更多的、约95％或更多的、约96％或更多的、约97％或更多的、约98％或更多的或者约99％或更多的全部的内源性VH、D或JH基因区段被缺失或使其不具有功能。在一个实施方式中，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的内源性具有功能的V、D或J基因区段被缺失或使其不具有功能。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座包含使全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段缺失或使其不具有功能的修饰；并且所述经基因修饰的基因座包含未经重排的重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列含有具有一个或多个组氨酸密码子的一个或多个人源VH、D和/或JH基因区段，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列存在于内源性位置(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在与其基因组的内源性免疫球蛋白链基因座不同的位置，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者，并且所述基因修饰不会影响所述内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者的表达和/或功能。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含异位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座还包含人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列与免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述轻链恒定区核苷酸序列选自λ轻链恒定区核苷酸序列和κ轻链恒定区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ轻链可变区核苷酸序列与λ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述λ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的κ轻链可变区核苷酸序列与κ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述κ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含未经重排的轻链可变基因序列，所述未经重排的轻链可变基因序列含有在编码轻链可变结构域的至少一个阅读框架中引入至少一个组氨酸密码子的至少一个修饰。在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含重排的序列(例如重排的λ或κV/J序列)，所述序列在轻链CDR中含有1个、2个、3个或4个组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述CDR选自CDR1、CDR2、CDR3及其组合。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的轻链可变区核苷酸序列是未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列存在于内源性小鼠免疫球蛋白轻链基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠κ基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠λ基因座。
在一个实施方式中，如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重链基因座中。在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠中的人源化的免疫球蛋白重链基因座中。
在一个实施方式中，所述非人动物是针对经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座的杂合子，并且所述非人动物能够表达人源免疫球蛋白重链可变结构域，所述人源免疫球蛋白重链可变结构域包含主要来源于如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座的至少一个组氨酸残基。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含所述基因修饰的相应野生型重链可变结构域相比，在酸性环境中(例如在约5.5至约6.0的pH下)显示出更弱的抗原结合。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含所述的基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比，具有的特征为pH依赖的再循环性的提高、血清半衰期的增加或两者兼而有之。
在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含B细胞群，所述B细胞群经目标抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白包含含有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。如本申请所述的抗原结合蛋白当给予对象时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出的增加的血清半衰期，与相应的野生型抗原结合蛋白相比高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个方面，本申请提供了包含经基因修饰的免疫球蛋白基因座的非人动物，其中所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座含有未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，并且其中所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，包含啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在一个实施方式中，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个、34个或更多个、35个或更多个、36个或更多个、37个或更多个、38个或更多个、39个或更多个、40个或更多个、41个或更多个、42个或更多个、43个或更多个、44个或更多个、45个或更多个、46个或更多个、47个或更多个、48个或更多个、49个或更多个、50个或更多个、51个或更多个、52个或更多个、53个或更多个、54个或更多个、55个或更多个、56个或更多个、57个或更多个、58个或更多个、59个或更多个、60个或更多个或者61个或更多个内源性非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
在一个实施方式中，所述内源性非组氨酸密码子编码选自下组的氨基酸：Y、N、D、Q、S、W和R。
在一个实施方式中，所述取代的组氨酸密码子存在于未经重排的重链可变区核苷酸序列中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列编码选自下组的免疫球蛋白可变结构域：N-末端区、环4区、CDR1、CDR2、CDR3及其组合。
在一个实施方式中，所述取代的组氨酸密码子存在于未经重排的重链可变区核苷酸序列中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列编码选自下组的互补性决定区(CDR)：CDR1、CDR2、CDR3及其组合。
在一个实施方式中，所述取代的组氨酸密码子存在于未经重排的重链可变区核苷酸序列中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列编码选自下组的框架区(FR)：FR1、FR2、FR3、FR4及其组合。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含经基因修饰的人源VH基因区段，其中所述人源VH基因区段的至少一个阅读框架中的一个或多个内源性非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含使用组氨酸密码子取代人源VH基因区段的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰，其中所述人源VH基因区段选自下组：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1、VH7-81及其组合。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含经基因修饰的人源JH基因区段，其中所述人源JH基因区段的至少一个阅读框架中的一个或多个内源性非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含使用组氨酸密码子取代人源JH区段的至少一个内源性非组氨酸密码子的取代，其中所述人源JH基因区段选自下组：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6及其组合。
在一个实施方式中，所述取代的组氨酸密码子存在于编码CDR3的一部分的重链可变区核苷酸序列中。在一个实施方式中，所述CDR3的一部分包含来源于经基因修饰的人源D基因区段的阅读框架的氨基酸序列，所述经基因修饰的人源D基因区段含有使用组氨酸密码子取代在阅读框架中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述被组氨酸密码子取代的内源性非组氨酸密码子编码选自下组的氨基酸：Y、N、D、Q、S、W和R。
在一个实施方式中，所述取代的组氨酸密码子存在于在人源化免疫球蛋白小鼠中最常见的人源D基因区段的至少一个阅读框架中。
在一个实施方式中，编码CDR3的一部分的所述经基因修饰的人源D基因区段的阅读框架选自疏水性框架、终止框架和亲水性框架。
在一个实施方式中，所述阅读框架是人源D基因区段的疏水性框架。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D1-1(GTTGT；SEQ ID NO:88)、D1-7(GITGT；SEQ ID NO:89)、D1-20(GITGT；SEQ ID NO:89)和D1-26(GIVGAT；SEQ ID NO:90)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(DIVVVPAAI；SEQ ID NO:92)、D2-8(DIVLMVYAI；SEQ ID NO:94)、D2-15(DIVVVVAAT；SEQ ID NO:95)和D2-21(HIVVVTAI；SEQ ID NO:97)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(ITIFGVVII；SEQ ID NO:98)、D3-9(ITIF*LVII；SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100)、D3-10(ITMVRGVII；SEQ ID NO:101)、D3-16(IMITFGGVIVI；SEQ ID NO:102)和D3-22(ITMIVVVIT；SEQ ID NO:103)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(TTVT；SEQ ID NO:105)、D4-11(TTVT；SEQ ID NO:105)、D4-17(TTVT；SEQ ID NO:105)、D4-23(TTVVT；SEQ ID NO:106)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(VDTAMV；SEQ ID NO:107)、D5-12(VDIVATI；SEQ ID NO:108)、D5-18(VDTAMV；SEQ ID NO:107)和D5-24(VEMATI；SEQ ID NO:109)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(SIAAR；SEQ ID NO:111)、D6-13(GIAAAG；SEQ ID NO:113)和D6-19(GIAVAG；SEQ ID NO:115)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述疏水性框架包含编码人源D7-27(LTG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述阅读框架是人源D基因区段的终止阅读框架。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D1-1(VQLER；SEQ ID NO:8)、D1-7(V*LEL)、D1-20(V*LER)、D1-26(V*WELL；SEQ ID NO:12)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(RIL**YQLLY；SEQ ID NO:14)、D2-8(RILY*WCMLY；SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17)、D2-15(RIL*WW*LLL)和D2-21(SILWW*LLF；SEQ ID NO:19)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(VLRFLEWLLY；SEQ ID NO:21)、D3-9(VLRYFDWLL*；SEQ ID NO:23)、D3-10(VLLWFGELL*；SEQ ID NO:25)、D3-16(VL*LRLGELSLY；SEQ ID NO:27)和D3-22(VLL***WLLL；SEQ ID NO:29)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(*LQ*L)、D4-11(*LQ*L)、D4-17(*LR*L)和D4-23(*LRW*L)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(WIQLWL；SEQ ID NO:35)；D5-12(WI*WLRL；SEQ ID NO:37)、D5-18(WIQLWL；SEQ ID NO:35)和D5-24(*RWLQL；SEQ ID NO:39)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(V*QLV)、D6-13(V*QQLV；SEQ ID NO:41)和D6-19(V*QWLV；SEQID NO:43)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码D7-27(*LG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中人源D基因区段的至少一个内源性密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述阅读框架是人源D基因区段的亲水性框架。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D1-1(YNWND；SEQ ID NO:45)、D1-7(YNWNY；SEQ ID NO:47)、D1-20(YNWND；SEQ ID NO:45)和D1-26(YSGSYY；SEQ ID NO:49)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(GYCSSTSCYT；SEQ ID NO:51)、D2-8(GYCTNGVCYT；SEQ ID NO:53)、D2-15(GYCSGGSCYS；SEQ ID NO:55)和D2-21(AYCGGDCYS；SEQ ID NO:57)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(YYDFWSGYYT；SEQ ID NO:59)、D3-9(YYDILTGYYN；SEQ ID NO:61)、D3-10(YYYGSGSYYN；SEQ ID NO:63)、D3-16(YYDYVWGSYRYT；SEQ ID NO:65)和D3-22(YYYDSSGYYY；SEQ ID NO:67)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(DYSNY；SEQ ID NO:69)、D4-11(DYSNY；SEQ ID NO:69)、D4-17(DYGDY；SEQ ID NO:71)和D4-23(DYGGNS；SEQ ID NO:73)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:70、SEQID NO:72、SEQ ID NO:74及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(GYSYGY；SEQ ID NO:75)、D5-12(GYSGYDY；SEQ ID NO:77)、D5-18(GYSYGY；SEQ ID NO:75)和D5-24(RDGYNY；SEQ ID NO:79)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(EYSSSS；SEQ ID NO:81)、D6-13(GYSSSWY；SEQ ID NO:83)和D6-19(GYSSGWY；SEQ ID NO:85)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:76及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码D7-27(NWG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86及其组合。
在一个实施方式中，包含所述反转的人源D基因区段的所述未经重排的重链可变区核苷酸序列与编码选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同种型的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与选自下组的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接：CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含CH1、铰链、CH2和CH3(即CH1-铰链-CH2-CH3)。
在一个实施方式中，重链恒定区核苷酸序列存在于内源性基因座(例如所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在与其基因组的内源性免疫球蛋白链基因座不同的基因座中，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含在位置250的修饰(例如E或Q)；在250和428的修饰(例如L或F)；在252的修饰(例如L/Y/F/W或T)、在254的修饰(例如S或T)和在256的修饰(例如S/R/Q/E/D或T)；或在位置428和/或433的修饰(例如L/R/S/P/Q或K)和/或在434的修饰(例如H/F或Y)；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308的修饰(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述人源CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH3氨基酸序列，所述人源CH3氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述CH3氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、N434S及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、V259I、V308F及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含N434A突变。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：M252Y、S254T、T256E及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：T250Q、M248L或这两者。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：H433K、N434Y或这两者。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含：(1)第一等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第一重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第一重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和(2)第二等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第二重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第二重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列与蛋白A的结合降低或消除的修饰(参见例如US 2010/0331527A1，其通过引用整体并入本申请)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列还包含Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)。在另一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)和Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)这两者。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG1并且还包含选自下组的突变：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG2并且还包含选自下组的突变：N44S、K52N和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为N384S、K392N和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG4并且还包含选自下组的突变：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区氨基酸序列是非人源恒定区氨基酸序列，并且所述重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列是人源重链恒定区氨基酸序列，并且所述人源重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段从免疫球蛋白重链基因座中缺失或者使其不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列(例如外源性核苷酸序列)或者通过使内源性VH、D、JH区段进行不具有功能的重排或反转)。在一个实施方式中，例如，约80％或更多的、约85％或更多的、约90％或更多的、约95％或更多的、约96％或更多的、约97％或更多的、约98％或更多的或者约99％或更多的全部的内源性VH、D或JH基因区段被缺失或使其不具有功能。在一个实施方式中，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的内源性具有功能的V、D或J基因区段被缺失或使其不具有功能。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的基因座包含使全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段缺失或使其不具有功能的修饰；并且所述基因组基因座包含经基因修饰的、未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列包含在至少一个阅读框架中使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述经基因修饰的、未经重排的免疫球蛋白重链可变基因序列存在于内源性位置(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在与其基因组的内源性免疫球蛋白链基因座不同的基因座中)，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或移至基因组中的不同位置。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的基因座包含内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者，并且所述基因修饰不会影响所述内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者的表达和/或功能。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的基因座包含异位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是小鼠Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是小鼠Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座还包含人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列与免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述轻链恒定区核苷酸序列选自λ轻链恒定区核苷酸序列和κ轻链恒定区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ轻链可变区核苷酸序列与λ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述λ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的κ轻链可变区核苷酸序列与κ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述κ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含未经重排的轻链可变基因序列，所述未经重排的轻链可变基因序列含有在编码轻链可变结构域的至少一个阅读框架中引入至少一个组氨酸密码子的至少一个修饰。在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含重排的序列(例如重排的λ或κV/J序列)，所述序列在轻链CDR中含有1个、2个、3个或4个组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述CDR选自CDR1、CDR2、CDR3及其组合。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的轻链可变区核苷酸序列是未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列存在于内源性小鼠免疫球蛋白轻链基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠κ基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠λ基因座。
在一个实施方式中，如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重链基因座中。在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠中的人源化的免疫球蛋白重链基因座中。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含所述的基因修饰的相应野生型重链可变结构域相比，在酸性环境中(例如在约5.5至约6.0的pH下)显示出更弱的抗原结合。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含所述的基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比，具有的特征为pH依赖的再循环性的提高、血清半衰期的增加或两者兼而有之。
在一个实施方式中，如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含B细胞群，所述B细胞群经目标抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白包含含有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。如本申请所述的抗原结合蛋白当给予对象时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出的增加的血清半衰期，与相应的野生型抗原结合蛋白相比高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个实施方式中，所述非人动物是针对经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座的杂合子，并且所述非人动物能够表达人源免疫球蛋白重链可变结构域，所述人源免疫球蛋白重链可变结构域包含主要来源于如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座的至少一个组氨酸残基。
在一个方面，本申请提供了包含经基因修饰的免疫球蛋白基因座的非人动物，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含人源VH、D和JH基因区段，其中至少一个所述人源D基因区段相对于相应的野生型序列从5’至3’反转，并且其中所述反转的人源D基因区段的至少一个阅读框架包含组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，包含啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于种系基因组中。
在一个实施方式中，其中所述反转的人源D基因区段的阅读框架包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个或者34个或更多个组氨酸密码子。
在一个实施方式中，至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或者全部或基本上全部的具有功能的人源D基因区段相对于对应的野生型序列是反向的。
在一个实施方式中，全部或基本上全部的内源性免疫球蛋白VH、D、JH基因区段从所述免疫球蛋白重链基因座中缺失或使其不具有功能(例如通过在所述免疫球蛋白基因座插入核苷酸序列例如外源性核苷酸序列，或通过使全部或基本上全部的内源性免疫球蛋白VH、D、JH区段产生不具有功能的重排或反转)，并且所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含人源VH、D和JH基因区段，其中至少一个所述人源D基因区段以相对于对应野生型序列相反的方向存在，并且其中在反转的人源D基因区段中的至少一个阅读框架包含至少一个组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述反转的人源D基因区段与人源VH基因区段和/或人源JH基因区段可操作地连接。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段以相对于选自下组的相应的野生型序列相反的方向存在：D1-1、D1-7、D1-20、D1-26、D2-2、D2-8、D2-15、D2-21、D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22、D4-4、D4-11、D4-17、D4-23、D5-5、D5-12、D5-18、D5-24、D6-6、D6-13、D6-19、D7-27及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D1基因区段：D1-1、D1-7、D1-20、D1-26及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D2基因区段：D2-2、D2-8、D2-15、D2-21及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D3基因区段：D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D4基因区段：D4-4、D4-11、D4-17、D4-23及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D5基因区段：D5-5、D5-12、D5-18、D5-24及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D6基因区段：D6-6、D6-13、D6-19及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是D7-27。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的阅读框架选自终止阅读框架、亲水性阅读框架、疏水性阅读框架及其组合，其中所述反转的人源D基因区段的至少一个阅读框架包含组氨酸密码子。
在一个实施方式中，包含所述反转的人源D基因区段的所述未经重排的重链可变区核苷酸序列与编码选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同种型的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与选自下组的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接：CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含CH1、铰链、CH2和CH3(即CH1-铰链-CH2-CH3)。
在一个实施方式中，重链恒定区核苷酸序列存在于内源性基因座(例如所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在与其基因组的内源性免疫球蛋白链基因座不同的基因座，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含在位置250的修饰(例如E或Q)；在250和428(例如L或F)；在252的修饰(例如L/Y/F/W或T)、在254的修饰(例如S或T)和在256的修饰(例如S/R/Q/E/D或T)；或在位置428和/或433的修饰(例如L/R/S/P/Q或K)和/或在434的修饰(例如H/F或Y)；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308的修饰(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述人源CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH3氨基酸序列，其中所述CH3氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述CH3氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、N434S及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、V259I、V308F及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含N434A突变。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M252Y、S254T、T256E及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：T250Q、M248L或这两者。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：H433K、N434Y或这两者。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含：(1)第一等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第一重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第一重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和(2)第二等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第二重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第二重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列与蛋白A的结合降低或消除的修饰(参见例如US 2010/0331527A1，其通过引用整体并入本申请)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列还包含Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)。在另一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)和Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)这两者。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG1并且还包含选自下组的突变：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG2并且还包含选自下组的突变：N44S、K52N和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为N384S、K392N和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG4并且还包含选自下组的突变：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区氨基酸序列是非人源恒定区氨基酸序列，并且所述重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列是人源重链恒定区氨基酸序列，并且所述人源重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段从免疫球蛋白重链基因座中缺失或者使其不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列(例如外源性核苷酸序列)或者通过使内源性VH、D、JH区段进行不具有功能的重排或反转)。在一个实施方式中，例如，约80％或更多的、约85％或更多的、约90％或更多的、约95％或更多的、约96％或更多的、约97％或更多的、约98％或更多的或者约99％或更多的全部的内源性VH、D或JH基因区段被缺失或使其不具有功能。在一个实施方式中，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的内源性具有功能的V、D或J基因区段被缺失或使其不具有功能。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座包含使全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段缺失或使其不具有功能的修饰；并且所述经基因修饰的基因座包含未经重排的重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列含有如本申请所述的至少一个反转的人源D基因区段，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列存在于内源性位置(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在与其基因组的内源性免疫球蛋白链基因座不同的基因座，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者，并且所述基因修饰不会影响所述内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者的表达和/或功能。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含异位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是小鼠Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是小鼠Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座还包含人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列与免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述轻链恒定区核苷酸序列选自λ轻链恒定区核苷酸序列和κ轻链恒定区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ轻链可变区核苷酸序列与λ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述λ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的κ轻链可变区核苷酸序列与κ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述κ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含未经重排的轻链可变基因序列，所述未经重排的轻链可变基因序列含有在编码轻链可变结构域的至少一个阅读框架中引入至少一个组氨酸密码子的至少一个修饰。在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含重排的序列(例如重排的λ或κV/J序列)，所述序列在轻链CDR中含有1个、2个、3个或4个组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述CDR选自CDR1、CDR2、CDR3及其组合。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的轻链可变区核苷酸序列是未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列存在于内源性小鼠免疫球蛋白轻链基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠κ基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠λ基因座。
在一个实施方式中，如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重链基因座中。在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠中的人源化的免疫球蛋白重链基因座中。
在一个实施方式中，所述非人源动物是针对经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座的杂合子，并且所述非人动物能够表达人源免疫球蛋白重链可变结构域，所述人源免疫球蛋白重链可变结构域包含主要来源于如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座的至少一个组氨酸残基。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含所述的基因修饰的相应野生型重链可变结构域相比，在酸性环境中(例如在约5.5至约6.0的pH下)显示出更弱的抗原结合。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含所述基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比，具有的特征为pH依赖的再循环性的提高、血清半衰期的增加或两者兼而有之。
在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含B细胞群，所述B细胞群经目标抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白包含含有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。如本申请所述的抗原结合蛋白当给予对象时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出的增加的血清半衰期，与相应的野生型抗原结合蛋白相比高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个方面，本申请提供了非人动物，所述非人动物能够表达具有增强的pH依赖的再循环性和/或增加的血清半衰期的抗原结合蛋白，其中所述非人动物在其种系基因组中包含未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含如本申请所述的加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含所述的基因修饰的相应野生型重链可变结构域相比，在酸性环境中(例如在约5.5至约6.0的pH下)显示出更弱的抗原结合。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含所述的基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比，具有的特征为pH依赖的再循环性的提高、血清半衰期的增加或两者兼而有之。
在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含B细胞群，所述B细胞群经目标抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白包含含有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。如本申请所述的抗原结合蛋白当给予对象时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出的增加的血清半衰期，与相应的野生型抗原结合蛋白相比高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个方面，本申请提供了靶向构建体，所述靶向构建体包含与非人动物的基因组D区或者基因组V和J区具有同源性的5’和3’靶向臂，其中至少一个VH、D或JH基因区段包含如本申请所述的任意修饰，例如加入至少一个组氨酸密码子、将至少一个内源性非组氨酸密码子取代为组氨酸密码子，和/或相对于相应的野生型序列反转至少一个具有功能的D基因区段。
在一个方面，本申请提供了杂交瘤或四价体杂交瘤，所述杂交瘤或四价体杂交瘤来源于如本申请所述的任意非人动物的细胞。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在一个方面，本申请提供了来源于非人动物的多能干细胞、诱导性多能干细胞或全能干细胞，所述非人动物包含本申请所述的多种基因组修饰。在一个特定的实施方式中，所述多能干细胞、诱导性多能干细胞或全能干细胞是小鼠或大鼠胚胎干(ES)细胞。在一个实施方式中，所述多能干细胞、诱导性多能干细胞或全能干细胞具有XX染色体组型或XY染色体组型。在一个实施方式中，所述多能干细胞或诱导性多能干细胞是造血干细胞。
在一个方面，本申请还提供了细胞，所述细胞含有包含如本申请所述的基因修饰的细胞核，所述修饰例如通过前核显微注射(pronuclear injection)引入细胞的修饰。在一个实施方式中，所述多能干细胞、诱导性多能干细胞或全能干细胞包含经基因修饰的免疫球蛋白基因组基因座，其中所述基因组基因座从5’至3’包含(1)FRT重组位点，(2)人源VH基因区段，(3)小鼠adam6基因，(4)loxP重组位点，(5)组氨酸取代的人源D基因区段，(6)人源JH基因区段，随后为(7)小鼠Ei(内含子增强子(intronic enhancer))和(8)小鼠IgM恒定区核苷酸序列。
在一个方面，本申请提供了淋巴细胞，所述淋巴细胞分离自如本申请所述的经基因修饰的非人动物。在一个实施方式中，所述淋巴细胞是B细胞，其中所述B细胞包含免疫球蛋白基因组基因座，所述基因座含有未经重排的重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的重链可变基因序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。
在一个方面，本申请提供了淋巴细胞，所述淋巴细胞分离自如本申请所述的经基因修饰的非人动物。在一个实施方式中，所述淋巴细胞是B细胞，其中所述B细胞包含免疫球蛋白基因座，所述基因座含有人源V、D和J基因区段，其中至少一个所述人源D基因区段相对于野生型序列从5’至3’反转，并且其中所述反转的人源D基因区段的至少一个阅读框架编码至少一个组氨酸残基。在一个实施方式中，所述B细胞能够产生抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白包含如本申请所述的经基因修饰的重链可变结构域。在一个实施方式中，如本申请所述的经基因修饰的重链可变结构域与重链恒定区氨基酸序列可操作地连接。
在一个方面，本申请提供了B细胞群，所述B细胞群能够表达在重链可变结构域中包含至少一个组氨酸残基的抗原结合蛋白，其中所述B细胞群包含如本申请所述的任意基因修饰。在一个实施方式中，所述至少一个组氨酸残基存在于重链CDR中。在一个实施方式中，所述CDR选自CDR1、CDR2、CDR3及其组合。在一个实施方式中，所述至少一个组氨酸残基存在于CDR3中。
在一个方面，本申请提供了B细胞群，所述B细胞群能够表达具有增加的血清半衰期和/或增强的pH依赖的再循环性的抗原结合蛋白，其中所述B细胞群包含如本申请所述的任意基因修饰。
在一个方面，本申请提供了制备非人动物的方法，所述非人动物包含经基因修饰的免疫球蛋白重链可变基因座，所述方法包括：
(a)修饰非人动物的基因组以使内源性免疫球蛋白重链V、D和J基因区段缺失或使其不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列例如外源性核苷酸序列，或通过使内源性VH、D、JH区段产生不具有功能的重排或反转)；和
(b)在基因组中放置未经重排的重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含如本申请所述加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，包含啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在一个实施方式中，2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个、34个或更多个、35个或更多个、36个或更多个、37个或更多个、38个或更多个、39个或更多个、40个或更多个、41个或更多个、42个或更多个、43个或更多个、44个或更多个、45个或更多个、46个或更多个、47个或更多个、48个或更多个、49个或更多个、50个或更多个、51个或更多个、52个或更多个、53个或更多个、54个或更多个、55个或更多个、56个或更多个、57个或更多个、58个或更多个、59个或更多个、60个或更多个或者61个或更多个内源性非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
在一个实施方式中，所述内源性非组氨酸密码子编码选自下组的氨基酸：Y、N、D、Q、S、W和R。
在一个实施方式中，所述加入或取代的组氨酸密码子存在于未经重排的重链可变区核苷酸序列中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列编码选自下组的免疫球蛋白可变结构域：N-末端区、环4区、CDR1、CDR2、CDR3及其组合。
在一个实施方式中，所述加入或取代的组氨酸密码子存在于未经重排的重链可变区核苷酸序列中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列编码选自下组的互补性决定区(CDR)：CDR1、CDR2、CDR3及其组合。
在一个实施方式中，所述加入或取代的组氨酸密码子存在于未经重排的重链可变区核苷酸序列中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列编码选自下组的框架区(FR)：FR1、FR2、FR3、FR4及其组合。
在一个实施方式中，所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含经基因修饰的人源VH基因区段，其中所述人源VH基因区段的至少一个阅读框架中的一个或多个内源性非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含使用组氨酸密码子取代人源VH基因区段的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰，其中所述人源VH基因区段选自下组：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1、VH7-81及其组合。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含经基因修饰的人源JH基因区段，其中所述人源JH基因区段的至少一个阅读框架中的一个或多个内源性非组氨酸密码子被组氨酸密码子取代。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的重链可变区核苷酸序列包含使用组氨酸密码子取代人源JH区段的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰，其中所述人源JH基因区段选自下组：JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6及其组合。
在一个实施方式中，所述加入或取代的组氨酸密码子存在于编码CDR3的一部分的重链可变区核苷酸序列中。在一个实施方式中，所述CDR3的一部分包含来源于经基因修饰的人源D基因区段的阅读框架的氨基酸序列，所述经基因修饰的D基因区段含有使用组氨酸密码子取代在阅读框架中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述被组氨酸密码子取代的内源性非组氨酸密码子编码选自下组的氨基酸：Y、N、D、Q、S、W和R。
在一个实施方式中，所述加入的或取代的组氨酸密码子存在于在人源化免疫球蛋白小鼠中最常见的人源D基因区段的至少一个阅读框架中。
在一个实施方式中，编码CDR3的一部分的所述经基因修饰的人源D基因区段的阅读框架选自疏水性框架、终止框架和亲水性框架。
在一个实施方式中，所述阅读框架是人源D基因区段的疏水性框架。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D1-1(GTTGT；SEQ ID NO:88)、D1-7(GITGT；SEQ ID NO:89)、D1-20(GITGT；SEQ ID NO:89)和D1-26(GIVGAT；SEQ ID NO:90)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(DIVVVPAAI；SEQ ID NO:92)、D2-8(DIVLMVYAI；SEQ ID NO:94)、D2-15(DIVVVVAAT；SEQ ID NO:95)和D2-21(HIVVVTAI；SEQ ID NO:97)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(ITIFGVVII；SEQ ID NO:98)、D3-9(ITIF*LVII；SEQ ID NO:99,SEQ ID NO:100)、D3-10(ITMVRGVII；SEQ ID NO:101)、D3-16(IMITFGGVIVI；SEQ ID NO:102)和D3-22(ITMIVVVIT；SEQ ID NO:103)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(TTVT；SEQ ID NO:105)、D4-11(TTVT；SEQ ID NO:105)、D4-17(TTVT；SEQ ID NO:105)、D4-23(TTVVT；SEQ ID NO:106)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(VDTAMV；SEQ ID NO:107)、D5-12(VDIVATI；SEQ ID NO:108)、D5-18(VDTAMV；SEQ ID NO:107)和D5-24(VEMATI；SEQ ID NO:109)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的疏水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(SIAAR；SEQ ID NO:111)、D6-13(GIAAAG；SEQ ID NO:113)和D6-19(GIAVAG；SEQ ID NO:115)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述疏水性框架包含编码人源D7-27(LTG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述阅读框架是人源D基因区段的终止阅读框架。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D1-1(VQLER；SEQ ID NO:8)、D1-7(V*LEL)、D1-20(V*LER)、D1-26(V*WELL；SEQ ID NO:12)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(RIL**YQLLY；SEQ ID NO:14)、D2-8(RILY*WCMLY；SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17)、D2-15(RIL*WW*LLL)和D2-21(SILWW*LLF；SEQ ID NO:19)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(VLRFLEWLLY；SEQ ID NO:21)、D3-9(VLRYFDWLL*；SEQ ID NO:23)、D3-10(VLLWFGELL*；SEQ ID NO:25)、D3-16(VL*LRLGELSLY；SEQ ID NO:27)和D3-22(VLL***WLLL；SEQ ID NO:29)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(*LQ*L)、D4-11(*LQ*L)、D4-17(*LR*L)和D4-23(*LRW*L)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(WIQLWL；SEQ ID NO:35)；D5-12(WI*WLRL；SEQ ID NO:37)、D5-18(WIQLWL；SEQ ID NO:35)和D5-24(*RWLQL；SEQ ID NO:39)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(V*QLV)、D6-13(V*QQLV；SEQ ID NO:41)和D6-19(V*QWLV；SEQID NO:43)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性非组氨酸密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的终止阅读框架包含编码D7-27(*LG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中人源D基因区段的至少一个内源性密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述阅读框架是人源D基因区段的亲水性框架。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D1-1(YNWND；SEQ ID NO:45)、D1-7(YNWNY；SEQ ID NO:47)、D1-20(YNWND；SEQ ID NO:45)和D1-26(YSGSYY；SEQ ID NO:49)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D2-2(GYCSSTSCYT；SEQ ID NO:51)、D2-8(GYCTNGVCYT；SEQ ID NO:53)、D2-15(GYCSGGSCYS；SEQ ID NO:55)和D2-21(AYCGGDCYS；SEQ ID NO:57)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D3-3(YYDFWSGYYT；SEQ ID NO:59)、D3-9(YYDILTGYYN；SEQ ID NO:61)、D3-10(YYYGSGSYYN；SEQ ID NO:63)、D3-16(YYDYVWGSYRYT；SEQ ID NO:65)和D3-22(YYYDSSGYYY；SEQ ID NO:67)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D4-4(DYSNY；SEQ ID NO:69)、D4-11(DYSNY；SEQ ID NO:69)、D4-17(DYGDY；SEQ ID NO:71)和D4-23(DYGGNS；SEQ ID NO:73)，并且所述人源D基因区段包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:70、SEQID NO:72、SEQ ID NO:74及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D5-5(GYSYGY；SEQ ID NO:75)、D5-12(GYSGYDY；SEQ ID NO:77)、D5-18(GYSYGY；SEQ ID NO:75)和D5-24(RDGYNY；SEQ ID NO:79)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：D6-6(EYSSSS；SEQ ID NO:81)、D6-13(GYSSSWY；SEQ ID NO:83)和D6-19(GYSSGWY；SEQ ID NO:85)，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。在一个实施方式中，所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:76及其组合。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码D7-27(NWG)的核苷酸序列，并且所述人源D基因区段还包含使用组氨酸密码子取代在所述核苷酸序列中的至少一个内源性密码子的修饰。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ IDNO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86及其组合。
在一个实施方式中，包含所述反转的人源D基因区段的所述未经重排的重链可变区核苷酸序列与编码选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同种型的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与选自下组的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接：CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含CH1、铰链、CH2和CH3(即CH1-铰链-CH2-CH3)。
在一个实施方式中，重链恒定区核苷酸序列存在于内源性基因座(例如所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在与其基因组的内源性免疫球蛋白链基因座不同的基因座，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如，在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含在位置250的修饰(例如E或Q)；在250和428的修饰(例如L或F)；在252的修饰(例如L/Y/F/W或T)、在254的修饰(例如S或T)和在256的修饰(例如S/R/Q/E/D或T)；或在位置428和/或433的修饰(例如L/R/S/P/Q或K)和/或在434的修饰(例如H/F或Y)；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308的修饰(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述人源CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH3氨基酸序列，所述人源CH3氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述CH3氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、N434S及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、V259I、V308F及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含N434A突变。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M252Y、S254T、T256E及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：T250Q、M248L或这两者。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：H433K、N434Y或这两者。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含：(1)第一等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第一重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第一重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和(2)第二等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第二重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第二重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列与蛋白A的结合降低或消除的修饰(参见例如US 2010/0331527A1，其通过引用整体并入本申请)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列还包含Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)。在另一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)和Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)这两者。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG1并且还包含选自下组的突变：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG2并且还包含选自下组的突变：N44S、K52N和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为N384S、K392N和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG4并且还包含选自下组的突变：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区氨基酸序列是非人源恒定区氨基酸序列，并且所述重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列是人源重链恒定区氨基酸序列，并且所述人源重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段从免疫球蛋白重链基因座中缺失或者使其不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列(例如外源性核苷酸序列)或者通过使内源性VH、D、JH区段进行不具有功能的重排或反转)。在一个实施方式中，例如，约80％或更多的、约85％或更多的、约90％或更多的、约95％或更多的、约96％或更多的、约97％或更多的、约98％或更多的或者约99％或更多的全部的内源性VH、D或JH基因区段被缺失或使其不具有功能。在一个实施方式中，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的内源性具有功能的V、D或J基因区段被缺失或使其不具有功能。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的基因座包含使全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段缺失或使其不具有功能的修饰；并且所述基因组的基因座包含经基因修饰的、未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列含有在至少一个阅读框架中使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述经基因修饰的、未经重排的免疫球蛋白重链可变基因序列存在于内源性位置(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在与其基因组的内源性免疫球蛋白链基因座不同的基因座)，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或移至基因组中的不同位置。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的基因座包含内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者，并且所述基因修饰不会影响所述内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者的表达和/或功能。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的基因座包含异位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是小鼠Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是小鼠Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座还包含人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列与免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述轻链恒定区核苷酸序列选自λ轻链恒定区核苷酸序列和κ轻链恒定区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ轻链可变区核苷酸序列与λ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述λ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的κ轻链可变区核苷酸序列与κ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述κ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含未经重排的轻链可变基因序列，所述未经重排的轻链可变基因序列含有在编码轻链可变结构域的至少一个阅读框架中引入至少一个组氨酸密码子的至少一个修饰。在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含重排的序列(例如重排的λ或κV/J序列)，所述序列在轻链CDR中含有1个、2个、3个或4个组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述CDR选自CDR1、CDR2、CDR3及其组合。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的轻链可变区核苷酸序列是未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列存在于内源性小鼠免疫球蛋白轻链基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠κ基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠λ基因座。
在一个实施方式中，如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重链基因座中。在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的人源化的免疫球蛋白重链基因座中。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含所述基因修饰的相应野生型重链可变结构域相比，在酸性环境中(例如在约5.5至约6.0的pH下)显示出更弱的抗原结合。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与没有所述基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比，具有的特征为pH依赖的再循环性的提高、血清半衰期的增加或两者兼而有之。
在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含B细胞群，所述B细胞群经目标抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白包含含有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。如本申请所述的抗原结合蛋白当给予对象时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出的增加的血清半衰期，与相应的野生型抗原结合蛋白相比高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个方面，本申请提供了制备非人动物的方法，所述非人动物包括经基因修饰的免疫球蛋白重链可变基因座，所述方法包括：
(a)修饰非人动物的基因组以缺失内源性免疫球蛋白重链V、D和J基因区段或使其不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列(例如外源性核苷酸序列)或通过使内源性VH、D、JH区段产生不具有功能的重排或反转)；和
(b)在基因组中放置人源VH、D和JH基因区段，其中至少一个人源D基因区段相对于相应的野生型序列从5’至3’反转，并且其中所述反转的人源D基因区段的至少一个阅读框架包含组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物，包含啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于种系基因组中。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座编码免疫球蛋白重链可变结构域，所述免疫球蛋白重链可变结构域含有1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个或者34个或更多个组氨酸残基。
在一个实施方式中，至少两个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或者全部或基本上全部的具有功能的人源D基因区段相对于对应的野生型序列是反向的。
在一个实施方式中，全部或基本上全部的内源性免疫球蛋白VH、D、JH基因区段从所述免疫球蛋白重链基因座中缺失或使其不具有功能(例如通过在所述免疫球蛋白基因座插入核苷酸序列例如外源性核苷酸序列，或通过使全部或基本上全部的内源性免疫球蛋白VH、D、JH区段产生不具有功能的重排或反转)，并且所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含人源VH、D和JH基因区段，其中所述至少一个人源D基因区段以相对于对应的野生型序列相反的方向存在，并且其中在反转的人源D基因区段中的至少一个阅读框架包含至少一个组氨酸密码子。
在一个实施方式中，所述反转的人源D基因区段与人源VH基因区段和/或人源JH基因区段可操作地连接。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段以相对于选自下组的野生型序列相反的方向存在：D1-1、D1-7、D1-20、D1-26、D2-2、D2-8、D2-15、D2-21、D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22、D4-4、D4-11、D4-17、D4-23、D5-5、D5-12、D5-18、D5-24、D6-6、D6-13、D6-19、D7-27及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D1基因区段：D1-1、D1-7、D1-20、D1-26及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D2基因区段：D2-2、D2-8、D2-15、D2-21及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D3基因区段：D3-3、D3-9、D3-10、D3-16、D3-22及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D4基因区段：D4-4、D4-11、D4-17、D4-23及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D5基因区段：D5-5、D5-12、D5-18、D5-24及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是选自下组的D6基因区段：D6-6、D6-13、D6-19及其组合。
在一个实施方式中，以相对于相应的野生型序列相反的方向存在的所述人源D基因区段是D7-27。
在一个实施方式中，所述人源D基因区段的阅读框架选自终止阅读框架、亲水性阅读框架、疏水性阅读框架及其组合。
在一个实施方式中，包含所述反转的人源D基因区段的所述未经重排的重链可变区核苷酸序列与编码选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同种型的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接。
在一个实施方式中，所述人源未经重排的免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与选自下组的人源或非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接：CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含CH1、铰链、CH2和CH3(即CH1-铰链-CH2-CH3)。
在一个实施方式中，重链恒定区核苷酸序列存在于内源性基因座(例如所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在与其基因组的内源性免疫球蛋白链基因座不同的基因座，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如，在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述人源重链恒定区氨基酸序列包含在位置250的修饰(例如E或Q)；在250和428的修饰(例如L或F)；在252的修饰(例如L/Y/F/W或T)、在254的修饰(例如S或T)和在256的修饰(例如S/R/Q/E/D或T)；或在位置428和/或433的修饰(例如L/R/S/P/Q或K)和/或434的修饰(例如H/F或Y)；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308的修饰(例如308F、V308F)和434的修饰。在一个实施方式中，所述修饰包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰(例如T250Q和M428L)；以及307和/或308修饰(例如308F或308P)，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述重链恒定区氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述人源CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH3氨基酸序列，所述人源CH3氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述CH3氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、N434S及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、V259I、V308F及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含N434A突变。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：M252Y、S254T、T256E及其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：T250Q、M248L或这两者。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源重链恒定区氨基酸序列，所述氨基酸序列包含选自下组的突变：H433K、N434Y或这两者。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含：(1)第一等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第一重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第一重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第一CH3氨基酸序列；和(2)第二等位基因，其中如本申请所述的未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与第二重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述第二重链恒定区核苷酸序列编码选自IgG1、IgG2、IgG4及其组合的人源IgG的第二CH3氨基酸序列，并且其中所述第二CH3氨基酸序列包含使所述第二CH3氨基酸序列与蛋白A的结合降低或消除的修饰(参见例如US 2010/0331527A1，其通过引用整体并入本申请)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列还包含Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)。在另一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列包含H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)和Y96F修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H436F)这两者。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG1并且还包含选自下组的突变：D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为D356E、L38M、N384S、K392N、V397M和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG2并且还包含选自下组的突变：N44S、K52N和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为N384S、K392N和V422I)。
在一个实施方式中，所述第二CH3氨基酸序列来自经修饰的人源IgG4并且还包含选自下组的突变：Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT编号；根据EU编号为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区氨基酸序列是非人源恒定区氨基酸序列，并且所述重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列是人源重链恒定区氨基酸序列，并且所述人源重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段从免疫球蛋白重链基因座中缺失或者使其不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列(例如外源性核苷酸序列)或者通过使内源性VH、D、JH区段进行不具有功能的重排或反转)。在一个实施方式中，例如，约80％或更多的、约85％或更多的、约90％或更多的、约95％或更多的、约96％或更多的、约97％或更多的、约98％或更多的或者约99％或更多的全部的内源性VH、D或JH基因区段被缺失或使其不具有功能。在一个实施方式中，例如，至少95％、96％、97％、98％或99％的内源性具有功能的V、D或J基因区段被缺失或使其不具有功能。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座包含使全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段缺失或使其不具有功能的修饰；并且所述经基因修饰的基因座包含未经重排的重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列包含至少一个如本申请所述的反转的人源D基因区段，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列存在于内源性位置(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在与其基因组的内源性免疫球蛋白链基因座不同的基因座，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者，并且所述基因修饰不会影响所述内源性Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者的表达和/或功能。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含异位存在的Adam6a基因、Adam6b基因或者这两者。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是非人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是小鼠Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6a基因是人源Adam6a基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是非人源Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是小鼠Adam6b基因。在一个实施方式中，所述Adam6b基因是人源Adam6b基因。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座还包含人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ和/或κ轻链可变基因序列与免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接，所述轻链恒定区核苷酸序列选自λ轻链恒定区核苷酸序列和κ轻链恒定区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的λ轻链可变区核苷酸序列与λ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述λ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。在一个实施方式中，所述人源化的、未经重排的κ轻链可变区核苷酸序列与κ轻链恒定区核苷酸序列可操作地连接。在一个实施方式中，所述κ轻链恒定区核苷酸序列是小鼠、大鼠或人源序列。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含未经重排的轻链可变基因序列，所述未经重排的轻链可变基因序列含有在编码轻链可变结构域的至少一个阅读框架中引入至少一个组氨酸密码子的至少一个修饰。在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含重排的序列(例如重排的λ或κV/J序列)，所述序列在轻链CDR中含有1个、2个、3个或4个组氨酸密码子。在一个实施方式中，所述CDR选自CDR1、CDR2、CDR3及其组合。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的轻链可变区核苷酸序列是未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列。在一个实施方式中，所述未经重排的或重排的人源λ或κ轻链可变区核苷酸序列存在于内源性小鼠免疫球蛋白轻链基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠κ基因座。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白轻链基因座是小鼠λ基因座。
在一个实施方式中，如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的免疫球蛋白重链基因座中。在一个实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于小鼠的人源化的免疫球蛋白重链基因座中。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含所述的基因修饰的相应野生型重链可变结构域相比，在酸性环境中(例如在约5.5至约6.0的pH下)显示出更弱的抗原结合。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含所述的基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比，具有的特征为pH依赖的再循环性的提高、血清半衰期的增加或两者兼而有之。
在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含B细胞群，所述B细胞群经目标抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白包含含有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。如本申请所述的抗原结合蛋白当给予对象时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出的增加的血清半衰期，与相应的野生型抗原结合蛋白相比，高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个方面，本申请提供了制备非人动物的方法，所述非人动物能够生成具有增加的血清半衰期和/或增强的pH依赖的再循环性的免疫球蛋白重链可变结构域，所述方法包括
(a)修饰非人动物的基因组以缺失内源性免疫球蛋白重链V、D和J基因区段或使其不具有功能(例如通过在免疫球蛋白基因座中插入核苷酸序列(例如外源性核苷酸序列)或者通过使内源性VH、D、JH区段进行不具有功能的重排或反转)；和
(b)在基因组中放置未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子，并且其中由所述非人动物生成的、包含所述免疫球蛋白重链可变结构域的抗原结合蛋白，与野生型免疫球蛋白重链结构域相比显示出增加的血清半衰期和/或增强的pH依赖的再循环性。
在一个实施方式中，所述非人动物在与抗原接触后能够产生富集的B细胞群的库，所述B细胞群的库表达具有增加的血清半衰期和/或增强的pH依赖的再循环性的抗原结合蛋白，其中所述富集的B细胞群包含如本申请所述的任意基因修饰。
在一个实施方式中，由经基因修饰的非人动物生成的抗原结合蛋白的特征为在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)对目标抗原具有足够的亲和性，在低于中性pH的pH下(例如在核内体pH下，例如pH约5.5至6.0)所述抗体从抗原-抗原结合蛋白复合物中的解离增强。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白与不含所述的基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比，具有的特征为pH依赖的再循环性的提高、血清半衰期的增加或两者兼而有之。
在一个实施方式中，本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含富集的B细胞群，所述B细胞群经目标抗原刺激后能够产生抗原结合蛋白例如抗体，所述抗原结合蛋白包含含有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域。如本申请所述的抗原结合蛋白当给予对象时，与相应的野生型抗原结合蛋白相比显示出增加的血清半衰期，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。在一些实施方式中，本申请所述的抗原结合蛋白显示出的增加的血清半衰期与相应的野生型抗原结合蛋白相比，高至少约2倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍，所述野生型抗原结合蛋白具有相似的或足够相似的编码重链可变结构域的氨基酸序列，但是在所述重链可变结构域中不包含组氨酸残基。
在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白包含免疫球蛋白重链可变结构域，所述免疫球蛋白重链可变结构域在中性pH(例如pH约7.0至约7.4)下能够以低于10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11和10-12的亲和性(KD)特异性结合目标抗原。
在一个方面，本申请提供了获得具有增强的再循环性和/或改善的血清半衰期的抗原结合蛋白的方法，所述方法包括：
(a)免疫如本申请所述的具有经基因修饰的免疫球蛋白基因座的非人动物，其中所述非人动物包含未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列含有加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子；
(b)使所述非人动物产生免疫应答；
(c)从免疫的非人动物中收集淋巴细胞(例如B细胞)；
(d)将所述淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞，和
(e)获得由所述杂交瘤细胞生产的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白显示出增强的再循环性和/或血清稳定性。
在一个方面，本申请提供了由如本申请所述的任意方法获得的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座。
在一个方面，本申请提供了由如本申请所述的任意方法获得的经基因修饰的非人动物。
在各种实施方式中，所述非人动物是哺乳动物。在一个实施方式中，所述哺乳动物是啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
在各种实施方式中，如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座存在于非人动物的种系基因组中，所述非人动物例如哺乳动物，例如啮齿动物，例如小鼠、大鼠或仓鼠。
附图的简要说明
图1A和1B显示了由人源D基因区段(D)的三个阅读框架(即终止、亲水性和疏水性阅读框架)编码的氨基酸序列和由组氨酸取代的人源D基因区段(HD)的三个阅读框架编码的氨基酸序列。在亲水性阅读框架中引入组氨酸密码子(以粗体表示)还将终止阅读框架中的多个终止密码子改变为Ser密码子(以粗体表示)但是在疏水性阅读框架中引入了极少的改变。“*”符号表示终止密码子，和在两个SEQ ID NO之间的逗号表示其为由终止密码子分隔的两条氨基酸序列。
图2显示了将含有大观霉素选择性表达盒的pLMa0174靶向至MAID 1116的5’末端的示意图(步骤1BHR(Spec))。在步骤1中，将均位于hVH6-1上游的氯霉素选择性表达盒、新霉素选择性表达盒、loxP位点、两个VH基因区段(hVH1-3和hVH1-2)、人源Adam6基因均从所述克隆中缺失并使用大观霉素表达盒取代以产生VI433克隆。在步骤2(BHR(Hyg+Spec))中，将翼侧为FRT位点的含有潮霉素表达盒的pNTu0002靶向至含有人源免疫球蛋白D基因区段的区域。通过步骤2，将全部的人源D基因区段从VI433中缺失并使用潮霉素表达盒取代以产生MAID6011VI 434(克隆1)。
图3显示了通过顺序连接来组装组氨酸取代的人源D基因区段的示意图。
图4显示了通过酶介导的消化(PI-SceI和I-CeuI)和连接将含有新霉素表达盒的预组装的组氨酸取代的人源D基因区段引入D-近端VH基因区段(VH6-1)和D-近端JH基因区段(JH1)之间的区域。这一过程从MAID 6011VI434中除去潮霉素表达盒并将预组装的人源组氨酸取代的D基因区段引入该克隆。根据对新霉素和大观霉素二者的抗性选择包含成功靶向的克隆的细菌细胞。所得到的克隆(MAID6012VI469)从5’至3’包含(1)大观霉素选择性表达盒，(2)包含人源VH基因区段(VH6-1)的50kb臂，(3)翼侧为loxP位点的新霉素表达盒，(4)含有组氨酸取代的人源D基因区段(HD 1.1-6.6(9586bp；SEQ ID NO:1)、HD 1.7-6.13(9268bp；SEQ ID NO:2)、HD 1.14-6.19(9441bp；SEQ ID NO:3)和HD 1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQ ID NO:4))，(5)含有人源JH基因区段的约25kb的基因组区域，(6)小鼠Ei序列(SEQ ID NO:5；在发育中的B细胞中促进VH向DJH重排的内含子增强子)和(7)小鼠IgM恒定区核苷酸序列(mIgM外显子1；SEQ ID NO:7)。
图5显示了通过在MAID 6011VI434中使用潮霉素选择性表达盒靶向来源于129品系的MAID 1460het染色体从MAID 1460杂合子ES细胞中缺失人源免疫球蛋白重链D基因区段的示意图。
图6显示了在鉴定MAID 6011的筛选试验中用于确定等位基因丢失(LOA)、等位基因获得(GOA)或母本等位基因(母本)的引物和探针列表。
图7显示了通过使用MAID 6012VI469靶向MAID 6011杂合子ES细胞来构建MAID6012het的示意图。通过电穿孔使MAID 6012VI469构建体进入MAID 6011杂合子ES细胞产生MAID 6012杂合子ES细胞，在所述ES细胞中129品系来源的染色体被修饰以使其从5’至3’方向含有FRT位点、人源VH基因区段、含有adam6基因的小鼠基因组区、翼侧为LoxP(floxed)的新霉素选择性表达盒、含有组氨酸取代的人源D基因区段(HD 1.1-6.6(9586bp；SEQ ID NO:1)、HD 1.7-6.13(9268bp；SEQ ID NO:2)、HD 1.14-6.19(9441bp；SEQ ID NO:3)和HD 1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQ ID NO:4))、人源JH基因区段、小鼠Ei序列(SEQ ID NO:5；在发育中的B细胞中促进VH向DJH重排的内含子增强子)和小鼠IgM恒定区核苷酸序列(mIgM外显子1；SEQ ID NO:7)。
图8显示了在鉴定MAID 6012的筛选试验中用于确定等位基因丢失(LOA)、等位基因获得(GOA)或母本等位基因(母本)的引物和探针列表。
图9显示了用于从MAID 6012杂合子ES细胞中除去新霉素表达盒的示意图。通过电穿孔使Cre-表达质粒进入MAID 6012ES细胞以重组和缺失翼侧为LoxP(floxed)的新霉素表达盒，以产生MAID 6013杂合子ES细胞。
图10A-10E显示了带有针对六个阅读框架中各个框架的翻译的人源D基因区段核苷酸序列，所述六个阅读框架即三个阅读框架为5’至3’方向和三个阅读框架为相反方向(3’至5’方向)。“*”符号表示终止密码子和在两个SEQ ID NO之间的逗号表示其为由终止密码子分隔的两条氨基酸序列。
图11-13显示了由6013F0杂合子小鼠表达的mRNA序列及其编码的蛋白序列，所述序列在其129品系来源的染色体的免疫球蛋白重链基因座中包含组氨酸取代的人源D基因区段(HD 1.1-6.6(9586bp；SEQ ID NO:1)、HD 1.7-6.13(9268bp；SEQ ID NO:2)、HD 1.14-6.19(9441bp；SEQ ID NO:3)和HD 1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQ ID NO:4))。各图中框中的序列表示在从包含组氨酸取代的人源D基因区段的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座中来源的CDR3序列中存在的组氨酸密码子。FWR表示框架区和CDR表示互补性决定区。在比对中，点“.”表示与查询序列相同的序列，连接线“-”表示序列中的间隙。
图14显示了在免疫球蛋白重链CDR3序列中组氨酸的掺入频率。X轴表示在各CDR3序列中出现的组氨酸密码子的数量，Y轴表示相应的读取比例。“6013F0het”表示由含有组氨酸取代的D基因区段的6013杂合子小鼠表达的CDR3序列。“VI3-Adam6”表示获自对照小鼠的CDR3序列，所述对照小鼠含有人源VH、D和JH基因区段，不含如本申请所述的组氨酸修饰。“ASAP”表示获自瑞恩泽(Regeneron)抗体数据库的CDR3序列，将其作为另一个对照。
发明详述
本发明不限于所述的特定方法和实验条件，因为这种方法和条件可以改变。还应理解本申请使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并不旨在限定，因为本发明的保护范围是由权利要求定义的。
除非另有定义，否则本申请使用的所有术语和短语包括所述术语和短语在本领域中所具有的含义，除非有相反的明确说明或根据使用所述术语或短语的上下文是显而易见的。尽管在本发明的实施或检测中可以使用与本申请所述的那些类似或等效的任意方法和材料，但是现在描述特定的方法和材料。所提及的全部出版物均通过引用并入本申请。
定义
本申请所使用的术语“互补性决定区”或“CDR”包含由生物体免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列，所述免疫球蛋白基因通常(即在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如抗体或T细胞受体)的轻链或重链可变区中的两个框架区之间。CDR可以由例如种系序列或者重排的序列编码，以及例如由初始(naive)B细胞或者成熟的B细胞或T细胞来编码。CDR可以是体细胞突变的(例如不同于在动物种系中编码的序列)、人源化的和/或使用氨基酸取代、加入或缺失修饰的。在一些情况下(例如针对CDR3)，CDR可由两条或更多条序列(例如种系序列)编码，所述序列(例如在未经重排的核酸序列中)不是邻近的，但是在B细胞核酸序列中是邻近的，例如作为所述序列剪接或连接的结果(例如V-D-J重组以形成重链CDR3)。
在本申请中使用的术语“解离半衰期”或“t1/2”指由下述公式计算的值：t1/2(min)＝(ln2/kd)/60，其中kd表示解离速率常数。
涉及免疫球蛋白核酸序列的术语“种系”包含能够传递给后代的核酸序列。
短语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括免疫球蛋白重链序列，其包括来自任意生物体的免疫球蛋白重链恒定区序列。除非另有明示，重链可变结构域包含三个重链CDR和四个FR区。重链的片段包含CDR、CDR和FR及其组合。典型的重链具有下述可变结构域(从N-末端到C-末端)：CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域。重链的功能性片段包含能够特异性识别表位(例如以在微摩、纳摩或皮摩范围内的KD识别所述表位)、能够由细胞表达和分泌并且包含至少一个CDR的片段。重链可变结构域由可变区核苷酸序列编码，所述序列通常包含来源于在种系中存在的VH、DH和JH区段库的VH、DH和JH区段。各种生物体V、D和J重链区段的序列、位置和命名可见于IMGT数据库，可以通过在URL“imgt.org.”登录万维网(www)对其进行访问。
短语“轻链”包括来自任何生物体的免疫球蛋白轻链，并且除了另有明示包括人源κ和λ轻链和VpreB，以及替代轻链。除非另有明示，轻链可变结构域通常包括三个轻链CDR和四个框架(FR)区。在通常情况下，全长的轻链从氨基末端到羧基末端包含含有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变结构域和轻链恒定区氨基酸序列。轻链可变结构域由轻链可变区核苷酸序列编码，所述轻链可变区核苷酸序列通常包含来源于种系中存在的轻链V和J基因区段库的轻链VL和轻链JL基因区段。各种生物体轻链V和J基因区段的序列、位置和命名可见于IMGT数据库，可以通过在URL“imgt.org.”登录万维网(www)对其进行访问。轻链包含例如不选择性结合第一或第二表位的那些，所述第一或第二表位与在包含该轻链的表位结合蛋白选择性结合。轻链还包含结合和识别或者辅助重链结合和识别一个或多个表位的那些，所述表位与包含该轻链的表位结合蛋白选择性结合。
短语“可操作地连接”指某种关系，其中所述组件以预期的方式与可操作地连接功能。在一个例子中，编码蛋白的核酸序列可以与调节序列(例如启动子、增强子、沉默子序列等)可操作地连接，以保持适宜的转录调节。在一个例子中，免疫球蛋白可变区(或V(D)J区段)核酸序列可以与免疫球蛋白恒定区的核酸序列可操作地连接，以使得在所述序列之间适宜的重组形成免疫球蛋白重链或轻链序列。
在本申请中使用的短语“体细胞突变的”包含涉及来自已经过类别转换的B细胞的核酸序列，其中在经过类别转换的B细胞中的免疫球蛋白可变区例如重链可变区的核酸序列(例如重链可变结构域或包含重链CDR或FR序列)不同于类别转换前在B细胞中的核酸序列，例如未经过类别转换的B细胞与已经过类别转换的B细胞之间在CDR或框架核酸序列中存在差异。短语“体细胞突变的”包含涉及来自亲和性成熟的B细胞的核酸序列，所述序列不同于在未经过亲和性成熟的B细胞中相应的免疫球蛋白可变区序列(即，在种系细胞基因组中的序列)。短语“体细胞成熟的”还包含涉及将B细胞与目标表位接触后来自B细胞的免疫球蛋白可变区核酸序列，其中所述核酸序列不同于在将所述B细胞与目标表位接触前相应的核酸序列。短语“体细胞突变的”还涉及来自抗体的序列，所述抗体在具有人源免疫球蛋白可变区核酸序列的动物例如小鼠中针对免疫原攻击生成并且由在这种动物中固有的选择过程产生。
表达包含组氨酸残基的免疫球蛋白重链可变结构域的非人动物
所述的发明提供了经基因修饰的非人动物，所述非人动物能够产生具有pH依赖性抗原结合性质的抗原结合蛋白。在各种实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的非人动物产生的抗原结合蛋白显示出增加的pH依赖的再循环效能和/或增加的血清半衰期。特别地，所述的发明在免疫球蛋白重链基因座中使用基因修饰以便将组氨酸密码子引入人源重链可变区核苷酸序列，并且任选地在编码CH2和/或CH3结构域的恒定区核苷酸序列中引入一个或多个突变，其增加抗体恒定区与FcRn受体的结合，这促进了抗原结合蛋白的再循环。由于质子化的组氨酸残基位于抗原结合位点中，所以与细胞外环境中或在细胞表面上(即在生理pH下，例如pH范围约7.0至约7.4)相比，含有所述修饰的抗原结合蛋白在酸性细胞内隔室中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)可以更加松散地结合其靶点。因此，在靶点介导的内吞作用之后，与不包含这种基因修饰的野生型抗原结合蛋白相比，包含如本申请所述的基因修饰的抗原结合蛋白能够更加迅速或有效地再循环。而且，由于经修饰的组氨酸残基仅在酸性环境中而不是中性pH中质子化，因而预计这种修饰将不会影响抗原结合蛋白与目标抗原在生理pH下的结合亲和性和/或特异性。
在各种方面，本申请提供了包含免疫球蛋白重链基因座的非人动物，所述基因座包含未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的人源重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。
在各种方面，本申请还提供了制备和使用非人动物的方法。当使用目标抗原免疫时，所述经基因修饰的非人动物能够产生B细胞群，所述B细胞群产生包含具有组氨酸残基的重链可变结构域的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白显示出增加的pH依赖的再循环性和/或增加的血清半衰期。在各种实施方式中，所述非人动物产生B细胞群，所述B细胞群表达人源重链可变结构域以及同源的人源轻链可变结构域。在各种实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座存在于非人动物的种系基因组中。
在各种实施方式中，所述经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座包含修饰，所述修饰使得全部或基本上全部的内源性VH、D和JH基因区段缺失或不具有功能；并且所述经基因修饰的基因座包含未经重排的重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列包含具有一个或多个组氨酸密码子的一个或多个人源VH、D和/或JH基因区段，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列存在于内源性位置(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)或存在于异位(即在与其基因组的内源性免疫球蛋白链基因座不同的基因座，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或移至基因组中的不同位置)。在一个实施方式中，例如约80％或更多的、约85％或更多的、约90％或更多的、约95％或更多的、约96％或更多的、约97％或更多的、约98％或更多的或者约99％或更多的全部内源性重链V、D或J基因区段缺失或使其不具有功能。在一个实施方式中，例如至少95％、96％、97％、98％或99％的内源性具有功能的重链V、D或J基因区段缺失或使其不具有功能。
在一个实施方式中，所述非人动物是哺乳动物。尽管在本申请中广泛讨论了将组氨酸密码子引入小鼠中未经重排的人源重链可变基因序列的实施方式，但是本申请还提供了其他非人动物，所述非人动物包含经基因修饰的免疫球蛋白基因座，所述基因座含有未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列含有加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。这种非人动物包含能够被基因修饰以表达如本申请所公开的含有组氨酸重链可变结构域的那些非人动物中的任意一个，包含例如小鼠、大鼠、家兔、猪、牛(例如奶牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、犬、雪貂、灵长类(例如狨猴、恒河猴)等。例如，对于那些适宜的可基因修饰的ES细胞不易获得的非人动物而言，使用其他方法制备包含所述基因修饰的非人动物。此类方法包括例如修饰非ES细胞基因组(例如成纤维细胞或诱导性多能干细胞)并且使用体细胞核转移(SCNT)将经基因修饰的基因组转移至适宜细胞，例如将卵母细胞去核，并在适宜条件下在非人动物中妊娠所述经修饰的细胞(例如所述经修饰的卵母细胞)以形成胚胎。用于修饰非人动物基因组(例如猪、奶牛、啮齿动物、鸡等基因组)的方法包括例如使用锌指核酸酶(ZFN)或转录激活因子样效应器核酸酶(TALEN)修饰基因组以包含编码的核苷酸序列。
在一个实施方式中，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠总科(Dipodoidea)或鼠总科(Muroidea)。在一个实施方式中，所述经基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠总科。在一个实施方式中，所述经基因修饰的动物来自选自下组的科：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、非洲刺毛鼠、帚尾仓鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、白尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如多刺睡鼠(spiny dormouse))和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一个特定的实施方式中，所述经基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、非洲刺毛鼠和帚尾仓鼠。在一个实施方式中，所述经基因修饰的小鼠来自鼠科成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，所述啮齿动物是选自下组的C57BL品系的小鼠：C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6N、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola。在另一个实施方式中，所述小鼠是129品系。在一个实施方式中，所述129品系选自下组：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如Festing等，(1999)Revised nomenclature for strain 129mice(129小鼠品系经修订的命名法),MammalianGenome 10:836，亦参见Auerbach等，(2000)Establishment and Chimera Analysis of129/SvEv-and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines(129/SvEv-和C57BL/6-来源的小鼠胚胎干细胞系的建立和嵌合体分析))。在一个实施方式中，所述经基因修饰的小鼠是前述129品系和前述C57BL品系(例如C57BL/6品系)的混合。在另一个实施方式中，所述小鼠是前述129品系的混合，或前述C57BL/6品系的混合。在一个实施方式中，所述129品系的混合是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一个实施方式中，所述小鼠是129/SvEv-和C57BL/6-来源的品系的混合。在一个特定的实施方式中，所述小鼠是在如Auerbach等2000BioTechniques 29:1024-1032中所述的129/SvEv-和C57BL/6-来源的品系的混合。在另一个实施方式中，所述小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在另一个实施方式中，所述小鼠是BALB品系(例如BALB/c品系)和另一种前述品系的混合。
在一个实施方式中，所述非人动物是大鼠。在一个实施方式中，所述大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley大鼠、Fischer品系、F344、F6和Dark Agouti。在一个实施方式中，所述大鼠品系是两种或更多种选自下组的品系的混合：Wistar、LEA、SpragueDawley、Fischer、F344、F6和Dark Agouti。
在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。在一个实施方式中，所述小鼠是人源化小鼠。
人源化小鼠(参见例如US 6,596,541、US 7,105,348和US20120322108A1，其通过引用整体并入本申请)含有在内源性小鼠基因座使用人源免疫球蛋白可变区对小鼠免疫球蛋白可变区的精确取代，所述小鼠在B细胞发育方面显示出与野生型小鼠令人吃惊的和显著的相似性。人源化小鼠对免疫显示出基本正常的野生型应答，仅在一个重要方面与野生型小鼠不同——其免疫应答产生的可变区是全人源的。
人源化小鼠含有使用相应的人源免疫球蛋白可变区核苷酸序列在内源性基因座对小鼠免疫球蛋白重链(IgH)和免疫球蛋白轻链(例如κ轻链，Igκ)的种系可变区核苷酸序列的精确的、大规模的取代(参见例如US 6,596,541、US 7,105,348、US20120322108A1，其通过引用整体并入本申请)。总体而言，约6百万碱基的小鼠基因座被约1.5百万碱基的人源基因组序列取代。该精确的取代得到具有杂交的免疫球蛋白基因座的小鼠，所述小鼠制备具有人源可变区和小鼠恒定区的重链和轻链。小鼠VH-D-JH和Vκ-Jκ区段的精确取代在杂交的免疫球蛋白基因组中保留了被翼侧包围的小鼠序列的完整性和功能。所述小鼠体液免疫系统的功能与野生型小鼠类似。B细胞发育在任何重要的方面都没有阻碍，并且在抗原攻击后在小鼠中产生了丰富多样的人源可变区。
人源化小鼠是可能的，因为在人和小鼠中用于重链和κ轻链重排的免疫球蛋白基因区段具有相似性，这并不是说其基因座是相同的或甚至几乎如此——显然它们不是。然而，所述基因座足够相似，可以通过使用基本上覆盖人源免疫球蛋白基因座的等效序列的、约1百万个碱基的相邻的人源基因组序列来取代含有全部VH、D和JH基因区段的约3百万个碱基对的相邻的小鼠序列，从而实现所述重链可变基因座的人源化。
在一些实施方式中，使用人源恒定区核苷酸序列对某些小鼠恒定区核苷酸序列的进一步取代(例如使用人源重链CH1核苷酸序列取代小鼠重链CH1核苷酸序列，和使用人源轻链恒定区核苷酸序列取代小鼠轻链恒定区核苷酸序列)得到具有杂交的免疫球蛋白基因座的小鼠，所述小鼠制备具有人源可变区和部分人源恒定区的抗体，其适于例如制备全人源抗体片段，例如全人源Fab。具有杂交的免疫球蛋白基因座的小鼠显示出正常的可变基因区段重排、正常的体细胞高突变频率和正常的类别转换。这些小鼠显示出与野生型小鼠没有区别的体液免疫系统，并且在B细胞发育的所有阶段均显示出正常的细胞群和正常的淋巴器官结构——即使是缺乏人源可变区核苷酸区段的完整的库的小鼠。免疫这些小鼠导致了强大的体液应答，所述体液应答显示出广泛多样的可变基因区段的使用。
对小鼠种系可变区核苷酸序列的精确取代使得制备得到具有部分人源免疫球蛋白基因座的小鼠。由于部分人源免疫球蛋白基因座正常地重排、高突变和类别转换，因而所述部分人源免疫球蛋白基因座在小鼠中产生包含人源可变区的抗体。编码所述可变区的核苷酸序列能够被鉴定和克隆，然后与所选择的任意序列例如适用于特定用途的任意免疫球蛋白同种型融合(例如在体外系统中)，结果得到全部来源于人源序列的抗体或抗原结合蛋白。
在各种实施方式中，至少一个组氨酸密码子存在于编码N-末端区、环4区、CDR1、CDR2、CDR3或其组合的未经重排的重链可变区核苷酸序列中。
在各种实施方式中，至少一个组氨酸密码子存在于编码选自下组的框架区(FR)的未经重排的重链可变区核苷酸序列中：FR1、FR2、FR3和FR4。
在各种方面，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含其中至少一个密码子被组氨酸密码子取代的核苷酸序列。
在各种方面，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含未经重排的人源重链可变区核苷酸序列，所述核苷酸序列包含使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子。
在一个实施方式中，使用组氨酸密码子取代2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个、34个或更多个、35个或更多个、36个或更多个、37个或更多个、38个或更多个、39个或更多个、40个或更多个、41个或更多个、42个或更多个、43个或更多个、44个或更多个、45个或更多个、46个或更多个、47个或更多个、48个或更多个、49个或更多个、50个或更多个、51个或更多个、52个或更多个、53个或更多个、54个或更多个、55个或更多个、56个或更多个、57个或更多个、58个或更多个、59个或更多个、60个或更多个或者61个或更多个内源性非组氨酸密码子。
此前对人源免疫球蛋白D基因区段的阅读框架使用情况的研究显示在三个阅读框架(例如终止、疏水性和亲水性阅读框架)中，终止框架的使用非常不频繁。显然，一些终止框架被损坏(chewed back)并导致表达。然而，终止阅读框架的使用频率非常低，使得在用于工程改造组氨酸密码子的目的时不使用终止阅读框架是更有效的。在亲水性和疏水性阅读框架之间，亲水性阅读框架似乎是优选的。因而，在一个实施方式中，对人源D基因区段的亲水性阅读框架进行工程改造以使其含有一个或多个组氨酸密码子(与终止框架或疏水性框架相比)。
在体外引入突变的方法例如位点定向诱变是本领域熟知的。在所述发明的一些实施方式中，通过计算机模拟(in silico)设计组氨酸取代的人源D基因区段(例如将Y、D和N密码子突变为H密码子，例如CAT、CAC)来富集组氨酸密码子，这是使用用于将其再连接在一起的(独特)限制性酶位点合成(例如化学合成)。使用上游和下游适宜的重组信号序列(RSS)制备所合成的D基因区段。在一个实施方式中，当彼此连接时，所合成的组氨酸取代的D基因区段包含在各人源D基因区段之间出现的基因间序列。
应理解编码所述一个或多个组氨酸的密码子在重排和/或体细胞高突变后可以改变，以使得一个或多个组氨酸变成其他氨基酸。然而，这可能不发生在非人动物中的每次重排中的每个编码组氨酸的密码子上。如果发生这种改变，则所述改变可能发生在一些但不是全部的B细胞上或在一些但不是全部的重链可变序列上。
在各种方面，所述经基因修饰的免疫球蛋白基因座包含人源重链V、D和J基因区段，其中至少一个所述人源D基因区段相对于相应的野生型序列已从5’至3’反转，并且其中反转的人源D基因区段的至少一个阅读框架包含组氨酸密码子。
在各种实施方式中，所述核苷酸序列包含1个或更多个、2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个或者25个或更多个组氨酸密码子。
在6个家族、每个家族有3-5个成员(1个家族--D7家族--具有一个成员)中，有25个具有功能的人源D基因区段。人源D基因区段的直接重组比反向的频率高得多，尽管反转阅读框架显示有更多的组氨酸密码子。某些D基因区段和阅读框架比其他的使用地更加频繁。针对所有具有功能的D基因区段的全部三个正向阅读框架和全部三个反转阅读框架见图10A-10E。如图10A-10E所示，与正向阅读框架相比，在反转阅读框架中具有更多的组氨酸密码子。更具体地，在反转阅读框架中有34个组氨酸，在正向阅读框架中仅有4个。此外，在正向阅读框架的4个组氨酸中，有3个组氨酸由假基因编码或存在于替代等位基因中。因此，种系人源D基因区段仅有一个正向阅读框架含有组氨酸密码子，更多的组氨酸密码子可能出现在替代等位基因中(可能在人群子集中)。
反转的D重排极为罕见。Tuaillon等(J.Immunol.,154(12):5453-6465，其通过引用整体并入本申请)发现反转阅读框架的使用非常罕见(通过有限稀释PCT测定)，即在大多数情况下正向与反向重排的比例为100至1000。就正向与反向重排的比例较低的问题而言，其仅在显示出极低使用情况的那些D区段中观察到。还发现与J1相邻(远离其他D家族成员)的D基因区段家族7在胎儿中使用最多，但是在成人中显示出较低的使用情况(Schroeder等，Immunology 30,2006,119-135，其通过引用整体并入本申请)。因此，在一个实施方式中，D家族7序列不是5’至3’反转的。
在一个实施方式中，至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个或者全部或基本上全部的人源具有功能的D基因序列相对于相应的野生型序列是5’至3’反转的。
在一个实施方式中，包含至少一个非天然存在的组氨酸残基的所述人源免疫球蛋白重链可变结构域显示出pH依赖的抗原结合特性。例如，包含所述经修饰的免疫球蛋白重链可变结构域的抗体在约中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)以充足的亲和性与靶点结合，而在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)与相同的靶点不结合或结合减弱。在一个实施方式中，所述酸性pH选自约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9和约6.0。在一个实施方式中，所述中性pH选自约7.0、约7.1、约7.2、约7.3和约7.4。
在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于2min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在25℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在37℃在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)具有的解离半衰期(t1/2)少于1min。在一个实施方式中，由如本申请所述的经基因修饰的免疫球蛋白基因座表达的、含有重链可变结构域的抗原结合蛋白在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)的解离半衰期(t1/2)比所述抗原结合蛋白在中性pH下(例如pH约7.0至约7.4)的解离半衰期(t1/2)降低至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍或至少约30倍。
在一个实施方式中，包含经基因修饰的人源免疫球蛋白重链可变结构域的抗原结合蛋白能够在中性或生理pH下(pH约7.0至约7.4)以低于10-6、10-7、10-8、10-9或10-10、10-11、10-12的亲和性(KD)与目标抗原特异性结合。
在酸性pH下(例如pH约5.5至约6.0)所述免疫球蛋白重链可变结构域改变的结合性质将在一些情况下允许抗体更迅速的周转(turnover)，因为与细胞表面上的靶点结合的治疗性抗体将被内化进入核内体，并且在核内体中更容易或更迅速地从靶点上解离，以使得治疗剂能被再循环以结合在另一个细胞上存在的另一个靶分子。这将导致能够以较低的剂量给予治疗性抗体，或者以较少的频率给予治疗抗体。这对于不希望频繁给予治疗性抗体或者给药超过一定剂量会导致安全性或毒性问题的情况是特别有用的。
在各种实施方式中，如本申请所述的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与人源或非人源重链恒定区核苷酸序列(例如编码选自IgM、IgD、IgG、IgE和IgA的免疫球蛋白同种型的重链恒定区核苷酸序列)可操作地连接。在各种实施方式中，所述人源或非人源重链恒定区核苷酸序列选自下组：CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述恒定区核苷酸序列包含CH1、铰链、CH2和CH3(例如CH1-铰链-CH2-CH3)。
在各种实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列存在于内源性基因座(即所述核苷酸序列位于野生型非人动物中)存在于异位(例如，在与其基因组的内源性免疫球蛋白链基因座不同的基因座，或在其内源性基因座中，例如在免疫球蛋白可变基因座中，其中所述内源性基因座位于或移至基因组中的不同位置)。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列包含在CH2或CH3中的修饰，其中所述修饰增加在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)所述重链恒定区氨基酸序列核内体与FcRn的亲和性。
针对IgG的新生儿Fc受体(FcRn)已在由母体通过胎盘和近端小肠向其胎儿转移的被动体液免疫中被很好地表征(Roopenian,D.和Akilesh,S.,Nat.Rev.Immun.,2007,7:715-725，其通过引用整体并入本申请)。FcRn与IgG的Fc部分结合的位点不同于启动补体活化经典通路中的经典FcγR或补体C1q组分的结合位点。更具体地，显示了FcRn结合IgG抗体的CH2-CH3铰链区——多功能的Fc区，所述Fc区还与金黄色葡萄球菌(Staphylococcal)蛋白A、链球菌(Streptococcal)蛋白G和类风湿因子结合。然而，与其他Fc结合蛋白不同，FcRn以严格的pH依赖性方式与IgG的Fc区结合；在生理条件下的pH 7.4时，FcRn不结合IgG，而在核内体的酸性pH下(例如pH范围约5.5至约6.0)，FcRn针对IgG的Fc区显示出较低的微摩至纳摩的亲和性。已发现这种pH依赖性相互作用由在IgG的CH2-CH3区中组氨酸残基的滴度及其随后与FcRn表面上的酸性残基的相互作用所介导(Roopenian,D.和Akilesh,S.,Nat.Rev.Immun.,2007,7:715-725，其通过引用整体并入本申请)。
在IgG的CH2-CH3区中能够增加在酸性pH下Fc区与FcRn的亲和性的多种突变是本领域所公知的。这些包括但不限于在位置250的修饰(例如E或Q)；在250和428的修饰(例如L或F)；在252的修饰(例如L/Y/F/W或T)、在254的修饰(例如S或T)和在256的修饰(例如S/R/Q/E/D或T)；或在位置428和/或433的修饰(例如L/R/S/P/Q或K)和/或434的修饰(例如H/F或Y)；或在位置250和/或428的修饰；或在位置307或308的修饰(例如308F、V308F)和434的修饰。在另一个实施例中，所述修饰可以包含428L(例如M428L)和434S(例如N434S)修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)修饰；250Q和428L修饰或其组合。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置252和257的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述人源CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH2氨基酸序列，所述人源CH2氨基酸序列包含在位置307和311的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述CH2氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列编码人源CH3氨基酸序列，所述人源CH3氨基酸序列包含在位置433和436的氨基酸残基之间的至少一个修饰，其中所述修饰在酸性环境中(例如在pH范围是约5.5至约6.0的核内体中)增加所述CH3氨基酸序列对FcRn的亲和性。
在一个实施方式中，由如本申请所述的重链恒定区核苷酸序列编码的所述人源恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、N434S及其组合。在一个实施方式中，所述人源恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：M428L、V259I、V308F及其组合。在一个实施方式中，所述人源恒定区氨基酸序列包含N434A突变。在一个实施方式中，所述人源恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：M252Y、S254T、T256E及其组合。在一个实施方式中，所述人源恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：T250Q、M248L或这两者。在一个实施方式中，所述人源恒定区氨基酸序列包含选自下组的突变：H433K、N434Y或这两者。
在一个实施方式中，所述重链恒定区氨基酸序列是非人源恒定区氨基酸序列，并且所述重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
在一个实施方式中，所述重链恒定区核苷酸序列是人源重链恒定区氨基酸序列，并且所述人源重链恒定区氨基酸序列包含上文所述任意类型的修饰中的一种或多种。
实施例
本发明提供下述实施例是为了向本领域的普通技术人员提供如何制备和使用本发明的完整的公开和描述，而不是旨在限定发明人所认为的发明的范围，也不旨在表示下面的实验是完成的所有的实验或仅有的实验。尽力确保所使用的数量(例如量、温度等)的准确度，但是应考虑一些实验误差和偏差。除非另有明示，份数以重量份计，分子量以平均分子量表示，温度以摄氏度表示，以及压力为处于或接近大气压。
实施例1：包含组氨酸取代的D基因区段的人源化免疫球蛋白重链基因座的构建
通过使用细菌人工染色体(BAC)DNA，在细菌细胞(BHR)中进行一系列同源重组反应来构建含有组氨酸取代的人源D基因区段的免疫球蛋白重链基因座。使用基因工程技术生成用于形成基因工程小鼠的若干靶向构建体，所述基因工程小鼠表达含有一个或多个组氨酸残基的重链可变结构域(参见例如美国专利号6,586,251和Valenzuela,D.M.等(2003),High-throughput engineering of the mouse genomecoupled with high-resolution expression analysis(与高分辨表达分析偶联的小鼠基因组的高通量工程改造),Nature Biotechnology 21(6):652-659，其通过引用整体并入本申请)。
首先，在计算机模拟中以四个片段(4个重复)的形式合成人源D基因区段，其中在亲水性框架中编码酪氨酸(Y)、天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)和天冬氨酸(D)的密码子被组氨酸密码子取代(在下文中“组氨酸取代的人源D基因区段”，即HD 1.1-6.6(9586bp；SEQ ID NO:1)、HD 1.7-6.13(9268bp；SEQ ID NO:2)、HD 1.14-6.19(9441bp；SEQ ID NO:3)和HD 1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQ ID NO:4)(图3)。所述四个重复还在末端含有用于将其重新连接在一起的独特的限制性酶位点。在各人源D基因区段中的组氨酸取代的特定位置(以粗体标记)如图1A和1B中标记为“亲水性”的一栏所示。如图1所示，所述修饰在亲水性阅读框架中引入组氨酸密码子的同时，还将“终止”阅读框架中的一些终止密码子变为丝氨酸密码子。然而，所述修饰几乎没有改变“疏水性”阅读框架。将四个合成的D区段重复连接的详细步骤如图3中所示(顺序连接)。所得到的克隆从5’至3’含有5’小鼠同源臂、翼侧为loxP位点(floxed)的新霉素表达盒、含有组氨酸取代的人源D基因区段(即HD 1.1-6.6(9586bp；SEQID NO:1)、HD 1.7-6.13(9268bp；SEQ ID NO:2)、HD 1.14-6.19(9441bp；SEQ ID NO:3)和HD1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQ ID NO:4))、氯霉素选择性表达和3’同源臂。
进行下述六个基因修饰以便使用上文所述的组氨酸取代的人源D基因区段在人源化小鼠中取代内源性人源D基因区段。
首先，将含有大观霉素选择性表达盒和AsiSI限制性位点的pLMa0174靶向至MAID1116克隆的5’末端(步骤1BHR(Spec)；图2)。在步骤1中，将全部位于hVH6-1的5’上游的氯霉素选择性表达盒、新霉素选择性表达盒、loxP位点、两个VH基因区段(hVH1-3和hVH1-2)和人源Adam6p基因均从MAID 1116克隆中缺失并使用大观霉素表达盒取代以产生VI433克隆。
其次，在步骤2中(BHR(Hyg+Spec)；图2)，将含有翼侧为FRT位点的潮霉素表达盒的pNTu0002靶向至含有人源免疫球蛋白DH基因区段的区域。在步骤2中，将全部的人源重链D基因区段从VI433中缺失并使用潮霉素表达盒取代以产生MAID6011VI 434(克隆1)。所述修饰还在潮霉素表达盒的5’和3’末端引入PI-SceI和I-CeuI限制性位点。
第三，通过限制性消化和连接将含有组氨酸取代的人源D基因区段(HD 1.1-6.6(9586bp；SEQ ID NO:1)、HD 1.7-6.13(9268bp；SEQ ID NO:2)、HD 1.14-6.19(9441bp；SEQID NO:3)和HD 1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQ ID NO:4))的基因组区域引入在MAID 6011VI434的PI-SceI和I-CeuI位点之间的区域(PI-SceI/I-CeuI连接修饰的1116(Kan+Spec)；图4)。这产生了MAID6012VI469，所述MAID6012VI469从5’至3’含有大观霉素表达盒、含有VH6-1的约50kb的基因组区域、翼侧为loxP位点的新霉素表达盒、约40kb的组氨酸取代的人源D基因区段(HD 1.1-6.6(9586bp；SEQ ID NO:1)、HD 1.7-6.13(9268bp；SEQ ID NO:2)、HD1.14-6.19(9441bp；SEQ ID NO:3)和HD 1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQ ID NO:4))和含有人源JH基因区段的约25kb的基因组区域，后接小鼠Ei(mIgH内含子增强子；SEQ ID NO:5)、小鼠转换区(SEQ ID NO:6)和小鼠IgM恒定区核苷酸序列(mIgM外显子1；SEQ ID NO:7)。基于卡那霉素和大观霉素的选择性来选择含有所述修饰的细菌细胞。
第四，如图5中所示，通过电穿孔将MAID 6011VI434靶向至MAID 1460杂合子小鼠ES细胞以便从MAID 1460克隆中除去全部内源性人源D基因区段。这产生了MAID 6011杂合子小鼠ES细胞，所述ES细胞在其免疫球蛋白重链基因座中(在129品系来源的染色体上)从5’至3’含有FRT位点、人源VH基因区段、包含adam6a/b基因的小鼠基因组区域、翼侧为FRT位点的潮霉素表达盒和人源JH区段，后接小鼠Ei序列和IgM恒定区核苷酸序列。通过使用如图6所示的探针和引物确证了MAID 6011的基因修饰(等位基因丧失、等位基因获得和存在母本等位基因)。
第五，使用MAID 6012VI469电穿孔MAID 6011杂合子小鼠ES细胞，以便将组氨酸取代的人源D基因区段(即HD 1.1-6.6(9586bp；SEQ ID NO:1)、HD 1.7-6.13(9268bp；SEQ IDNO:2)、HD 1.14-6.19(9441bp；SEQ ID NO:3)和HD 1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQ ID NO:4))引入MAID 6011。所述靶向步骤从MAID 6011中除去翼侧为loxP位点的潮霉素选择性表达盒并且使用组氨酸取代的人源D基因区段取代所述序列。这产生了MAID 6012杂合子ES细胞，所述ES细胞含有野生型C57BL/6品系来源的染色体和经基因修饰的129品系来源的染色体，所述染色体含有人源野生型VH和JH基因区段和本申请所述的组氨酸取代的人源D基因区段。此外，所述ES细胞包含在VH和D区段之间含有adam6a/b基因和翼侧为loxP位点的新霉素表达盒的小鼠基因组区域(图7)。通过使用如图8所示的探针和引物确证了MAID 6012的基因修饰(等位基因丧失、等位基因获得和存在母本等位基因)。
最后，使用表达Cre重组酶的质粒电穿孔MAID 6012 ES细胞以便从MAID 6012 ES细胞中除去新霉素选择性表达盒，结果得到MAID 6013杂合子ES细胞(图9)。最终的MAID6013杂合子(“MAID 6013het”)ES细胞含有野生型C57BL/6品系来源的染色体和经基因修饰的129品系来源的染色体，所述经基因修饰的129品系来源的染色体在其免疫球蛋白重链基因座中从5’至3’含有：(1)FRT位点；(2)人源VH基因区段；(3)包含adam6a/b基因的小鼠基因组区域；(4)翼侧为FRT位点的新霉素选择性表达盒；(5)组氨酸取代的人源D基因区段(HD1.1-6.6(9586bp；SEQ ID NO:1)、HD 1.7-6.13(9268bp；SEQ ID NO:2)、HD 1.14-6.19(9441bp；SEQ ID NO:3)和HD 1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQ ID NO:4))；(6)人源JH基因区段；后接(7)小鼠Ei序列(mIgH内含子增强子；SEQ ID NO:5)，(8)转换区(SEQ ID NO:6)；和(9)小鼠IgM恒定区核苷酸序列(mIgM外显子1；SEQ ID NO:7)，如图9所示。
使用上文所述的靶向的ES细胞(MAID 6013)作为供体ES细胞并且通过方法将其引入8细胞阶段的小鼠胚胎(参见例如US 7,576,259、US 7,659,442、US 7,294,754、US 2008-0078000 A1，其均通过引用整体并入本申请)。通过使用图8中所示引物和探针的基因分型对携带经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座的小鼠进行鉴定，所述基因座含有本申请所述的组氨酸取代的人源重链D基因区段。将所得到的经基因修饰的F0小鼠与野生型小鼠交配以获得F1后代。对F1幼仔进行基因分型，并且选择针对含有组氨酸取代的人源重链D基因区段的经基因修饰的免疫球蛋白基因座是杂合子的F1幼仔进行进一步鉴定。
实施例2：重排的重链可变区核苷酸序列的分析
接下来，检查含有本申请所述组氨酸取代的人源D基因区段的所述经基因修饰的小鼠(即6013F0杂合子小鼠)是否能够表达含有来源于经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座的一个或多个组氨酸密码子的重排的重链V(D)J序列，所述6013F0杂合子小鼠在其种系中含有129品系来源的染色体，所述染色体含有人源VH、JH基因区段和组氨酸取代的人源D基因区段(HD 1.1-6.6(9586bp；SEQ ID NO:1)、HD 1.7-6.13(9268bp；SEQ ID NO:2)、HD1.14-6.19(9441bp；SEQ ID NO:3)和HD 1.20-6.25,1.26(11592bp；SEQ ID NO:4))。
为了这个目的，通过高通量测序针对来源于组氨酸取代的人源D基因区段的IgMCDR3序列的存在情况分析了编码IgM重链可变区的mRNA序列。简言之，收集脾脏并使用玻片在1xPBS(Gibco)中匀浆。在离心机中将细胞离心沉淀(500xg，5分钟)，并且在ACK裂解缓冲液(Gibco)中裂解红细胞3分钟。使用1xPBS洗涤细胞并使用0.7μm的细胞筛过滤。使用针对CD19的MACS磁性阳性选择从脾细胞中分离B-细胞(美天旎生物公司(Miltenyi Biotec))。使用RNeasy Plus试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从沉淀的B细胞中分离总RNA。使用Direct mRNA微量试剂盒(凯杰公司(Qiagen))从总RNA中分离PolyA+mRNA。
使用SMARTerTMPico cDNA合成试剂盒(克隆达公司(Clontech))通过5’RACE从脾脏B细胞中制备双链cDNA。使用英杰公司(Invitrogen)的Superscript II和dNTP代替克隆达公司的逆转录酶和dNTP。使用IgM恒定区特异性引物和SMARTerTM5’RACE引物(表1)从cDNA扩增重链可变区(VH)抗体库。使用PCR纯化试剂盒(凯杰公司(Qiagen))纯化PCR产物。使用相同的5’RACE引物和嵌套的对IgM恒定区具有特异性的3’引物进行第二轮PCR(表2)。使用SizeSelectTM 系统(英杰公司(Invitrogen))纯化第二轮的PCR产物。使用加入454个适体(adapter)和条形码(barcode)的引物进行第三轮PCR。使用XP小珠纯化第三轮PCR产物。使用KAPA实验室定量试剂盒(KAPA生物系统公司(KAPA Biosystems))通过-qPCR对纯化的PCR产物进行定量。根据生产厂商的方案，使用454GS小型钛系列Lib-A emPCR试剂盒(罗氏诊断公司(RocheDiagnostics))对混合文库进行乳液PCR(emPCR)并且使用Roche 454GS小型仪器进行双向测序。
表1
表2
生物信息分析
根据样品条形码的极佳匹配对454条序列进行分类和对质量进行整理。使用组氨酸取代的人源D基因区段创建定制的D数据库。使用在本地安装的igblast(NCBI,v2.2.25+)将重排的Ig序列与人源种系V和J区段数据库进行比对，根据比对结果对序列进行注释。使用90％的相似性阈值滤除来源于内源性小鼠免疫球蛋白重链基因座的序列。当检测到具有相同评分的多个最佳命中时，将序列标记为不明确并且从分析中除去。开发一组perl脚本对结果进行分析并且在mysql数据库中存储数据。针对轻链CDR3区被定义为保守的C密码子和FGXG基序之间(SEQ ID NO:323)和针对重链为WGXG基序(SEQ ID NO:324)。仅使用生产的抗体来确定CDR3的长度。计算各CDR3区的组氨酸密码子的数量。
如图11-13所示，6013F0杂合子小鼠表达编码CDR3中的一个或多个组氨酸密码子的多样性的经重排的重链可变区mRNA序列(重排的V-D-J序列)的库。测序和比对数据表明出现在CDR3序列中的组氨酸密码子来源于在本申请所述的6013小鼠的经基因修饰的免疫球蛋白重链基因座中存在的多种组氨酸取代的人源D基因区段。另外，与包含人源VH、DH、JH基因区段和小鼠adam6基因的对照小鼠(VI3-Adam6，美国公开号2012/0322108A1，其通过引用整体并入本申请)相比，所述经基因修饰的6013F0杂合子小鼠显示在重链CDR3序列中组氨酸出现的频率更高(图14)。
尽管已参照其特定的实施方式对所述发明进行了描述，但是本领域技术人员应理解在不脱离本发明真实精神和范围的前提下可以对其进行各种改变和可以用等价物替代。此外，对所述发明客观的精神和范围，可以采用特定的情况、材料、物质的组合物、工艺、一个或多个工艺步骤进行多种修改。所有这些修改均在所附权利要求的范围内。

Claims (47)

1.一种制备核酸的方法，所述核酸编码包含至少一个组氨酸的人源免疫球蛋白重链可变区，所述方法包括：
从非人动物的淋巴细胞或从由所述淋巴细胞生成的杂交瘤处获取核酸，所述核酸包含编码人源免疫球蛋白重链可变结构域的经重排的人源免疫球蛋白重链可变区基因序列；
其中所述非人动物在其种系基因组中包括未经重排的人源免疫球蛋白重链可变结构域核苷酸序列，其中所述未经重排的重链可变结构域核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子；
其中所述加入的或取代的组氨酸密码子不由对应的人源种系重链可变区基因区段编码，并且
其中所述人源免疫球蛋白重链可变结构域包括来自所述加入的或取代的组氨酸密码子的组氨酸氨基酸。
2.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使用目标抗原免疫所述非人动物，并且在获取所述核酸前允许所述动物针对所述目标抗原产生免疫应答。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述人源免疫球蛋白重链可变结构域特异性结合所述目标抗原。
4.根据权利要求3所述的方法，其中获取的所述经重排的人源免疫球蛋白重链可变区基因序列包括至少一个体细胞高突变。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述取代的组氨酸密码子取代编码选自下组的氨基酸的非组氨酸密码子：Y、N、D、Q、S、W和R。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述加入的或取代的组氨酸密码子存在于选自人源VH基因区段、人源D基因区段、人源JH基因区段及其组合的人源免疫球蛋白重链基因区段中。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述人源免疫球蛋白重链基因区段选自人源种系VH基因区段、人源种系D基因区段、人源种系JH基因区段及其组合。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述加入的或取代的组氨酸密码子存在于所述人源免疫球蛋白重链基因区段的至少一个阅读框架中，所述阅读框架编码选自N-末端区、环4区、互补性决定区1(CDR1)、互补性决定区2(CDR2)、互补性决定区3(CDR3)及其组合的重链可变结构域。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述加入的或取代的组氨酸密码子存在于人源D基因区段的至少一个阅读框架中。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述阅读框架是所述人源D基因区段的亲水性框架，并且所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86及其组合。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述非人动物在其种系基因组中进一步包括未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列，所述未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包括未经重排的人源VL基因区段和未经重排的人源JL基因区段；并且
其中所述淋巴细胞或由其生成的杂交瘤表达与所述人源重链可变结构域同源的人源轻链可变结构域。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列与非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，其中所述加入的或取代的组氨酸密码子存在于编码互补性决定区3(CDR3)的序列，其中所述非人动物进一步在其种系基因组中包括未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列，所述未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包括未经重排的人源VL和未经重排的人源JL基因区段，并且其中所述淋巴细胞或由其形成的杂交瘤表达与所述人源免疫球蛋白重链可变结构域同源的人源免疫球蛋白轻链可变结构域。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述非人动物是选自下组的啮齿动物：小鼠、大鼠和仓鼠。
15.根据权利要求1-14任一所述的方法，其中所述非人动物是：小鼠或大鼠。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述非人动物是小鼠。
17.根据权利要求1或13所述的方法，其中所述淋巴细胞是B细胞。
18.一种包含根据权利要求1或13所述的方法制备的所述经重排的人源免疫球蛋白重链可变区基因序列的核酸。
19.根据权利要求18所述的核酸，其中所述核酸进一步包括与所述未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列可操作地连接的人源重链恒定区基因序列。
20.根据权利要求18所述的核酸，其中所述人源重链恒定区基因序列包括在pH约5.5至约6.0的范围内增加IgG重链恒定区氨基酸序列的CH2-CH3区域对新生儿Fc受体(FcRn)亲和性的修饰，其中所述修饰是在所述IgG重链恒定区氨基酸序列中的选自下组的突变：M428L、N434S、M428L、V259I、V308F、N434A、M252Y、S254T、T256E T250Q、M248L、H433K、N434Y及其组合。
21.包括权利要求18所述核酸的细胞。
22.一种获取细胞的方法，所述细胞表达具有至少一个组氨酸的人源免疫球蛋白重链可变结构域，所述方法包括：
从非人动物中分离淋巴细胞，
其中所述非人动物在其种系基因组中包括未经重排的人源免疫球蛋白重链可变区核苷酸序列，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列包含加入至少一个组氨酸密码子或使用组氨酸密码子取代至少一个内源性非组氨酸密码子；
其中所述加入的或取代的组氨酸密码子不由对应的人源种系重链可变区基因区段编码，并且
其中所述淋巴细胞包含编码人源免疫球蛋白重链可变区的经重排的人源免疫球蛋白重链可变区基因序列，所述人源免疫球蛋白重链可变区包括来自所述加入的或取代的组氨酸密码子的组氨酸氨基酸。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述取代的组氨酸密码子取代编码选自下组的氨基酸的非组氨酸密码子：Y、N、D、Q、S、W和R。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述加入的或取代的组氨酸密码子存在于选自人源VH基因区段、人源D基因区段、人源JH基因区段及其组合的人源免疫球蛋白重链基因区段中。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述人源免疫球蛋白重链基因区段选自人源种系VH基因区段、人源种系D基因区段、人源种系JH基因区段及其组合。
26.根据权利要求22所述的方法，其中所述加入的或取代的组氨酸密码子存在于所述人源免疫球蛋白重链基因区段的至少一个阅读框架中，所述阅读框架编码选自N-末端区、环4区、互补性决定区1(CDR1)、互补性决定区2(CDR2)、互补性决定区3(CDR3)及其组合的重链可变结构域。
27.根据权利要求22所述的方法，其中所述加入的或取代的组氨酸密码子存在于人源D基因区段的至少一个阅读框架中。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述阅读框架是所述人源D基因区段的亲水性框架，并且所述亲水性框架包含编码选自下组的氨基酸序列的核苷酸序列：SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ IDNO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ IDNO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86及其组合。
29.根据权利要求22所述的方法，其中所述非人动物在其种系基因组进一步包括未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列，所述未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列包括未经重排的人源VL和未经重排的人源JL基因区段；并且
其中所述淋巴细胞或由其生成的杂交瘤表达与所述人源免疫球蛋白重链可变结构域同源的人源免疫球蛋白轻链可变结构域。
30.根据权利要求22所述的方法，其中所述未经重排的人源重链可变区核苷酸序列与非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接。
31.根据权利要求22所述的方法，进一步包括使用目标抗原免疫免疫所述非人动物，并且在获取所述淋巴细胞前使得所述动物能够针对所述目标抗原产生免疫应答。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述人源免疫球蛋白重链可变结构域特异性结合所述目标抗原。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述获取的经重排的人源免疫球蛋白重链可变区基因序列包括至少一个体细胞高突变。
34.根据权利要求22所述的方法，进一步包括由分离的所述淋巴细胞制备杂交瘤，其中所述杂交瘤表达包含至少一个来自所述加入的或取代的组氨酸密码子的组氨酸的人源免疫球蛋白重链可变结构域。
35.根据权利要求22所述的方法，其中所述未经重排的重链可变区核苷酸序列与非人源重链恒定区核苷酸序列可操作地连接，其中所述加入的或取代的组氨酸密码子存在于编码互补性决定区3(CDR3)的序列，其中所述非人动物进一步在其种系基因组中包括未经重排的轻链可变区核苷酸序列，所述未经重排的轻链可变区核苷酸序列包括未经重排的人源VL基因区段和未经重排的人源JL基因区段，并且所述淋巴细胞或由其形成的杂交瘤表达与所述人源免疫球蛋白重链可变结构域同源的人源免疫球蛋白轻链可变结构域。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述人源免疫球蛋白重链可变结构域特异性结合所述目标抗原。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述获取的经重排的人源免疫球蛋白重链可变区基因序列包括至少一个体细胞高突变。
38.根据权利要求35所述的方法，进一步包括由分离的所述淋巴细胞制备杂交瘤，其中所述杂交瘤表达包含至少一个来自所述加入的或取代的组氨酸密码子的组氨酸的人源免疫球蛋白重链可变结构域。
39.根据权利要求22所述的方法，其中所述非人动物是选自下组的啮齿动物：小鼠、大鼠和仓鼠。
40.根据权利要求22-39任一所述的方法，其中所述非人动物是：小鼠或大鼠。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述非人动物是小鼠。
42.根据权利要求22或35所述的方法获取的细胞。
43.一种体外制备人源免疫球蛋白重链可变结构域的方法，包括：
在细胞中表达权利要求18所述的核酸。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述核酸进一步包括与所述经重排的人源免疫球蛋白重链可变区基因序列可操作地连接的人源免疫球蛋白重链恒定区基因序列。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述非人源重链恒定区基因序列包括在pH约5.5至约6.0的范围内增加IgG重链恒定区氨基酸序列的CH2-CH3区域对新生儿Fc受体(FcRn)亲和性的修饰，其中所述修饰是在所述IgG重链恒定区氨基酸序列中的选自下组的突变：M428L、N434S、M428L、V259I、V308F、N434A、M252Y、S254T、T256E T250Q、M248L、H433K、N434Y及其组合。
46.根据权利要求43所述的方法，进一步包括在所述细胞中共表达编码人源免疫球蛋白轻链可变结构域的核苷酸序列。
47.根据权利要求43所述的方法制备的人源免疫球蛋白重链可变结构域。
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