MX2010014542A - Mamiferos no humanos los cuales producen anticuerpos. - Google Patents

Abstract

La invención proporciona animales no humanos, transgénicos los cuales comprenden un ácido nucleico el cual codifica una cadena ligera de inmunoglobulina, en donde la cadena ligera de inmunoglobulina es humana, similar a humana o humanizada. El ácido nucleico es proporcionado con un medio que lo lleva a ser resistente a redisposiciones de ADN y/o hipermutaciones somáticas. En una modalidad, el ácido nucleico comprende un casete de expresión para la expresión de una molécula deseada en células durante una cierta etapa de desarrollo en células que se desarrollan en células B maduras. La invención además proporciona métodos para producir una inmunoglobulina a partir de un animal no humano, transgénico.

Description

MAMIFEROS NO HUMANOS LOS CUALES PRODUCEN ANTICUERPOS Campo de la Invención La invención se relaciona a la producción y uso de animales no humanos capaces de producir anticuerpos o derivados de los mismos, los cuales son expresados a partir de por lo menos ácidos nucleicos parcialmente exógenos (transgénes) . Se describen los transgénes para producir los animales transgénicos y métodos para producir los anticuerpos heterólogos ; métodos y vectores para producir los animales transgénicos .

Antecedentes de la Invención Las células B median la inmunidad humoral por producir anticuerpos específicos. La subunidad estructural básica de un anticuerpo (Ab) es una molécula de inmunoglobulina (Ig) . Las moléculas de Ig consisten de un complejo de dos cadenas de polipéptido pesadas (H por sus siglas en inglés) idénticas y dos ligeras (L) idénticas. En la terminación amino de cada cadena H cadena L está una región que varía en la secuencia de aminoácidos nombrada la región variable (V) . La porción restante de las cadenas H y L es relativamente constante en la secuencia de aminoácidos y es nombrada la región constante (C) . En una molécula de Ig, las regiones V de cadena H y L (VH y VL) por sus siglas en inglés) son yuxtapuestas para formar el sitio de enlace al Ref. 216659 antígeno potencial. Los genes que codifican las regiones V de cadena H y L son ensamblados somáticamente a partir de segmentos de ADN de línea germinal durante la diferenciación de las células B precursoras (pre-B) . Los segmentos de genes V, D y J para la cadena H y los segmentos de genes V y J y para la cadena L. Dentro de las regiones V de IG están tres regiones de mayor variabilidad de secuencia de aminoácidos que interactúan para formar el sitio de reconocimiento del antígeno y son de esta forma referidas como regiones determinantes de complementaridad (CDR por sus siglas en inglés) .

Los segmentos de genes V codifican el volumen del dominio de región V, incluyen CDR1 y CDR2. La diversidad en la CDR1 y CDR2 deriva de la heterogeneidad de la secuencia entre los múltiples segmentos V codificados, de línea germinal diferentes. La CDR3 es codificada por las secuencias que son formadas por la unión de segmentos de gen V, D y J de la cadena H, y los segmentos V y J de la cadena L y por mecanismos que crean la heterogeneidad de secuencia de nucleótidos donde estos segmentos son combinados. La diversidad adicional puede ser derivada de formar parejas de las regiones V de cadena H y L diferentes. Colectivamente estos procesos producen un repertorio primario de anticuerpos codificados por los segmentos de genes de línea germinal y expresados por las células B formadas recientemente.

Una fuente adicional de diversidad de anticuerpos está impuesta en la parte superior de la diversidad generada por recombinación de segmentos de genes de Ig. Las células son capaces de introducir mutaciones en las regiones V de anticuerpos que ellas expresan, un proceso llamado hipermutación somática. De esta forma, cuando un animal encuentra primero un antígeno, el antígeno enlaza a una célula B específica lo cual sucede para realizar anticuerpos los cuales tienen un dominio V el cual enlaza al antígeno. Esta respuesta primaria puede activar esta célula B para ir a secretar el anticuerpo cognado. Estas células B activadas pueden también ahora objetivar un proceso de mutación somática para sus segmentos de genes de anticuerpos redispuestos y de esta forma permiten la producción de células hijas las cuales hacen variantes de anticuerpos de la respuesta primaria. Un proceso de selección amplifica aquellos descendientes de células B variantes los cuales hacen un anticuerpo de afinidad mejorada del antígeno. En las células B, las hipermutaciones somáticas son objetivadas para una región genómica restringida incluyendo tanto los genes VH y VL redispuestos. De esta forma, la mutación somática permite la maduración de afinidad- la producción y selección de anticuerpos de alta afinidad. Por lo tanto, la mutación somática es importante para la generación de anticuerpos de alta afinidad.

La especificidad exquisita y alta afinidad de anticuerpos y el descubrimiento de la tecnología de hibridoma que permite la generación de anticuerpos monoclonales (mAbS) ha generado grandes expectaciones para su utilización como terapéuticos objetivados para enfermedades humanas. Los mAB son idénticos ya que son producidos por una célula B sencilla y su progenie. Los mAb son hechos por fusionar las células de bazo a partir de ratón que ha sido inmunizado con el antígeno deseado con células de mieloma para generar hibridomas inmortalizados. Uno de los impedimentos principales que confronta el desarrollo de aplicaciones in vivo para mAb en humanos es la inmunogenicidad intrínsica de la Ig no humana. Los pacientes responden a dosis terapéuticas de mAbs de ratón por hacer los anticuerpos contra las secuencias Ig de ratón (anticuerpo antiratón humanos: HAMA por sus siglas en inglés) , provocando toxicidad aguda, alterar su biodistribución y acelerar el aclarado, de esta forma reduciendo la eficacia de administraciones subsecuentes (Mirick, et al., (2004) Q. Nucí. Med. Mol. Imaging 48, 251-257) .

Para eludir la generación de HAMA, han sido desarrollados métodos de humanización de anticuerpo en un intento para producir mAb con inmunogenicidad disminuida cuando se aplica a humanos. Estos esfuerzos han producido varios procedimientos a base de ADN recombinantes con el objeto de incrementar el contenido de secuencias de aminoácidos humanas en mAb mientras que retiene la especificidad y afinidad del anticuerpo no humano parental . La humanización empieza con la construcción de mAb quiméricos ratón-humanos (Morrison, S. 1., et al., (1984). Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 81 6851-5), en el cual las regiones C de Ig en mAb de murino son reemplazadas por regiones C humanas. Los mAbs quiméricos contienen 60-70% de secuencias de aminoácido humanas y son considerablemente menos inmunogénicos que sus contrapartes de murino cuando se inyectan en humanos . A pesar de que todavía se observa la respuesta de anticuerpos antiquiméricos (Hwang, . Y., et al. (2005). Methods, 36, 3-10) .

En intentos para humanizar además mAb de murino, se desarrolla el injerto de CDR. En el injerto de CDR, los anticuerpos de murino son humanizados por injertar sus CDR en los cuadros VL y VH de moléculas de Ig humanas, mientras que retienen aquellos residuos de cuadro de murino esenciales para especificidad y afinidad (Jones, P. T. , et al., (1986). Nature, 321, 522) . Sobre todo, los anticuerpos injertados con CDR consisten de más de 80% de secuencias de aminoácidos humanas (Queen, C. et al., (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 86, 10029; Cárter, P. et al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 89, 4285). A pesar de estos esfuerzos, los anticuerpos humanizados, injertados con CDR son mostrados para evocar todavía una respuesta de anticuerpo contra la región V injertada (Hwang, W. Y., et al. (2005). Methods, 36, 3) .

Subsecuentemente al injerto de CDR, los métodos de humanización en base a los paradigmas diferentes como renovación (Padlan, E. A., et a. (1991). Mol. Immunol . 28, 489), superhumanización (Tan, P., D. A., et al., (2002) J. Immunol. 169, 1119), optimización de contenido de cuerda humana (Lazzr, G. A., et al., (2007). Mol. Immunol., 44, 1986) y humaneering (modificado a humano) han sido desarrollados en un intento para disminuir además el contenido de secuencias no humanas en mAb terapéuticos (Almagro, J. C, et al., (2008), Frontiers in Bioscince 13, 1619) . Como en los procedimientos de injerto CDR, estos métodos dependen de los análisis de la estructura de anticuerpo y comparación de secuencia de mAb no humano y humano con el fin de evaluar el impacto del proceso de humanización en la inmunogenicidad del producto final. Cuando se compara con la inmunogenicidad de anticuerpos quiméricos y humanizados, la humanización de regiones variables parece disminuir además la inmunogenicidad (Hwang, . Y., et al. (2005). Methods, 36, 3-10).

La desinmunización es otro procedimiento desarrollado para reducir la inmunogenicdad de anticuerpos quiméricos o de ratón. Esto implica la identificación de epítopos de células T lineales en el anticuerpo de interés, usando bioinformáticos , y su reemplazo subsecuente por mutagénesis dirigida a sitio a secuencias humanas o no inmunogénicas (solicitud WO0985976A1) . Aunque los anticuerpos desinmunizados exhiben inmunogenicidad reducida en primates, comparados con sus contrapartes quiméricas, se observa alguna pérdida de afinidad de enlace (Jain, M . , et al., (2007). Trends in Biotechnol . 25, 307).

El desarrollo de tecnología de exhibición de fagos complementada y procedimientos de humanización extendidos son intentos para obtener mAb menos inmunogénicos para terapia en humanos. En exhibición de fagos, grandes colecciones ("bibliotecas") de regiones VH y VL de anticuerpo humano son expresadas en la superficie de partículas bacteriófagas filamentosas. A partir de estas bibliotecas, se seleccionan fagos raros a través de la interacción de enlace con antígeno, fragmentos de anticuerpo solubles son expresados a partir de bacterias infectadas y la afinidad de enlace de anticuerpos seleccionados es mejorada por mutación (Winter, G., et al. (1994). Annu. Rev. Immunol . 12, 433). El proceso imita la selección inmunológica, y se han aislado anticuerpos con diferentes especificidades de enlace usando este procedimiento (Hoogenboom, H. R. , et al. (2005). Nat . Biotechnoll, 23, 1105) . Varias fuentes de regiones V de cadena H y L han sido usadas para construir bibliotecas de exhibición de fagos incluyendo aquellas aisladas de donadores no inmunogénicos o inmunogénicos . Además, las bibliotecas de exhibición de fagos han sido construidas de regiones V que contienen regiones CDR sintéticas aleatorias artificialmente con el fin de crear diversidad adicional. Con frecuencia, los anticuerpos obtenidos a partir de bibliotecas de exhibición de fagos son sometidos a maduración de afinidad in vitro para obtener anticuerpos de alta afinidad (Hoogenboom, H. R. , et al. (2005). Nat. Biotechnol . , 23, 1105).

La creación de cepas de ratón transgénicas que producen anticuerpos humanos en la ausencia de anticuerpos de ratón ha proporcionado otra plataforma de tecnología para la generación de mAb humanos de alta afinidad y específicos. En estos animales transgénicos , la maquinaria de anticuerpo de ratón endógena es inactivada y reemplazada por loci de Ig humano para reproducir substancialmente el sistema inmunológico humoral humano en ratones (Jakobovits , A., et al. (2007). Nat. Biotechnol. 25, 1134. Lonberg, N. (2005). Nat. Biotechnol. 23, 1117). El desarrollo de células B así como también diversificación de Ig por recombinación de segmentos de genes es reproducido fielmente en estos ratones, llevando a un repertorio diverso de células B de murino que expresan Ig humanos. Por inmunizar estos ratones con antígenos, es además demostrado que estos animales transgénicos acumulan mutaciones somáticas en las regiones V de tanto cadenas pesadas y ligeras para producir una diversidad amplia de mAb humanos de alta afinidad (Lonberg, N. (2005). Nat. Biotechnol . 23, 1117).

La cuestión, si mAb « totalmente humanos » como los derivados de bibliotecas de exhibición de fagos o ratones transgénicos son menos inmunogénicos que los mAb humanizados no puede ser contestada aún, ya que los datos de inmunogenicidad total están disponibles para solo dos mAb humanos. Un mAb de factor de necrosis anti -tumoral , desarrollado de bibliotecas humanas exhibidas por fagos induce respuesta de anticuerpos en 12% de los pacientes- en el extremos superior de la incidencia de respuestas de anticuerpo de los anticuerpos humanizados (Hwang, W. E. et a. (2005) Methods., 36, 3-10).

La evaluación de la inmunogenicidad de los primeros mAb humanos registrados por el procedimiento transgénico demuestra que el tratamiento mAb resulta en la generación de anticuerpos en aproximadamente 5.5% de pacientes con cáncer tratados (Jakobovits, A., et al., (2007). Nat. Biotechnol. 25, 1134., Lofgren, J. A., et al. (2007). J. Immunol . 178, 7467) .

Permanece por lo tanto una necesidad para un método y medio para preducir anticuerpos que son específicos para sus objetivos, pero son menos inmunogénicos. De acuerdo a la invención la reducción de inmunogenicidad es por lo menos parcialmente lograda por proporcionar un mamífero no humano transgénico el cual comprende, por lo menos en su linaje de células B, un ácido nucleico el cual codifica por lo menos una cadena ligera o cadena pesada de inmunoglobulina , en donde se proporciona una secuencia que codifica la cadena pesada o ligera con un medio que la lleva a ser resistente a redisposiciones de ADN y/o hipermutaciones somáticas, preferentemente el animal no humano es un roedor, más específicamente un ratón. El ácido nucleico preferentemente codifica una cadena de inmunoglobulina humana, similar a humana o humanizada.

En el resto de la especificación los ratones son típicamente usados como ejemplos de los mamíferos no humanos. Los hospederos mamíferos no humanos transgénicos son capaces de montar una respuesta inmunológica a un antígeno, donde la respuesta produce anticuerpos que tienen regiones variables de primate, particularmente humanas. Los varios hospederos transgénicos pueden ser empleados, particularmente murino, laogomorfa, ovino, avina, porcino, equino, canino, felino, o similares. Los ratones han sido usados para la producción de B-linfocitos para inmortalización para la producción de anticuerpos. Ya que los ratones son fáciles de manejar, pueden ser reproducidos en grandes números, y son conocidos para tener un repertorio inmunológico extensivo, los ratones usualmente serán el animal de elección. Por lo tanto, en la siguiente discusión, la discusión se referirá a ratones, pero debe ser entendido que otros animales, particularmente mamíferos no primates, pueden ser fácilmente substituidos por los ratones, siguiendo los mismos procedimientos.

La razón para evitar redisposiciones e hipermutación es que en esta forma puede ser elegido un polipéptido no inmunogénico de antemano conociendo que esta cadena de polipéptido permanecerá no inmunogénica . Por lo menos una de las cadenas de las inmunoglobulinas resultantes es de esta forma menos inmunogénica. El anticuerpo resultante necesita tener (usualmente) tanto una cadena ligera o pesada. La cadena no inmunogénica debe por lo tanto ser capaz de formar par con la otra cadena. La otra cadena puede ser una cadena endógena, una cadena exógena o un híbrido de ambos. Para terapia humana, la cadena no inmunogénica debe ser tan cercana a la humana como sea posible.

Un medio para llevar a un gen que codifica una cadena de inmunoglobulina (o cadenas) a ser resistente para redisposición de ADN y/o mutación es por supuesto la remoción de todos los elementos genéticos responsables para la redisposición y/o mutación. La desventaja de lo mismo es que la variabilidad de las dos cadenas es eliminada, mientras que la invención preferentemente retiene la variabilidad en una cadena (preferentemente la cadena pesada) e inhibe y/o evita la redisposición mutación de la otra cadena (preferentemente la cadena ligera) .

Los elementos para redisposición y/o hipermutación caracterizados hasta ahora son ubicados dentro del loci para inmunoglobulinas . Por lo tanto el medio para llevar a la secuencia que codifica la inmunoglobulina a ser resistente a redisposición de ADN y/o mutación es insertar el gen en un locus fuera de los loci de inmunoglobulina.

De esta forma se proporciona de acuerdo a la invención un mamífero no humano transgénico en donde la secuencia de codificación de la cadena ligera/pesada es integrada en el genoma del mamífero no humano en un locus fuera de los loci de inmunoglobulina. Preferentemente la inserción está en un locus que es resistente a silenciación de genes. De acuerdo a la invención, la integración está en el locus Rosa o un locus comparable.

Se prefiere proporcionar un cásete de expresión el cual puede ser insertado en un locus Rosa o locus comparable con un medio que permite la expresión de la cadena de inmunoglobulina esencialmente limitada a las células de linaje de células B, preferentemente con un medio que permite la expresión del ácido nucleico que codifica la cadena ligera durante una cierta etapa del desarrollo de células B. El término "expresión limitada esencialmente" indica que la expresión es predominantemente en células del linaje de células B, pero que los niveles inferiores de expresión en otras células como se compara con el nivel de expresión en las células B, es posible. En una modalidad preferida, el término "expresión esencialmente limitada" indica que la expresión está presente exclusivamente en células del linaje de células B. El medio típica y preferentemente incluye promotores específicos de células B (etapa de desarrollo) como CD19, CD20, µ?? (todos genes V), VpreBl , VpreB2 , VpreB3 , ?5, Iga, Ig , KLC (todos los genes), ???? (todos los genes), BSAP (Pax5) . Aunque es muy posible dirigir la expresión de la redisposición de ADN y/o cadena resistente a mutación por los promotores, son relativamente débiles. Un promotor fuerte típicamente será requerido para asegurar expresión de superficie adecuada del receptor de células B (hecho de la membrana unida a cadena H y L de Ig) y para competir con la expresión y formar en pares las cadenas endógenas (si están presentes) a través de exclusión alélica. El promotor, sin embargo es usualmente no específico a tejido. Para conferir la especificidad a tejido, un sistema indirecto que emplea Cre/lox o similares es preferido. La cadena deseada es puesta bajo el control de un promotor fuerte inhibido por un elemento que puede ser removido por la acción de una proteína Cre, llevando a la activación del gen que codifica la inmunoglobulina deseada. Este sistema es descrito en detalle en Wunderlich F. T. (2004) , "Generation of inducible Cre systems for conditional gene inactivation in mice" , Inauguraldissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftichen Fakultát der Universitát zu Kóln; htt : //deposit . d . db . de/cgi -bin/dokserv?idn=97557230x&dok var=dl&dok ext=pdf&filename=975 57230x.pdf.

Preferentemente la cadena de inmunoglobulina producida en una forma resistente a redisposición e hipermutación es una cadena ligera capaz de formar pares con diferentes cadenas pesadas diferentes codificadas por el mamífero no humano. La cadena ligera será entonces la misma (y menos inmunogénica) en todos los anticuerpos, pero la variedad en la especificidad es retenida a través de las redisposiciones e hipermutaciones en las cadenas pesadas. Puede en ese caso ser preferible silenciar por lo menos uno de los loci endógenos que codifican una cadena ligera, aunque la exclusión alélica puede llevar a esto a ser innecesario.

De acuerdo a esta modalidad, preferentemente el locus de cadena ligera kappa (?) es funcionalmente silenciado.

Si el locus de cadena ? endógena ligera es silenciado, pero también por otras razones, es preferible que la cadena ligera resistente sea una cadena ligera K, preferentemente una cadena ligera que tiene una secuencia similar a línea germinal. De acuerdo a la invención la cadena ligera puede llevar a un anticuerpo con inmunogenicidad reducida. La secuencia de línea germinal preferida es basada en IGKV1-39 humano (012) ya que esta cadena ligera es muy frecuentemente observada en el repertorio humano (de Wildt et al. 1999, J. Mol. Biol .. 285(3) :895) y tiene estabilidad termodinámica rendimiento y solubilidad superiores (Ewert et al. 2003, J. Mol. Biol.. 325 (3):531).

Lo siguiente da modalidades más específicas del cásete de expresión con el cual el animal no humano puede ser proporcionado de acuerdo a la invención. Aunque esto es típicamente ventajoso para inmunoglobulinas , se contemplan también otros genes de interés.

De esta forma la invención proporciona en una modalidad específica un mamífero no humano transgénico en donde el ácido nucleico que codifica la cadena ligera comprende en la dirección 5'- 3': un promotor específico para células B, un líder, un gen V humano redispuesto, opcionalmente un mejorador Mo-EKi, una región constante (?) y opcionalmente un mejorador MoEK3 ' (truncado) . Neuberger identifica y examina un mejorador específico a células B novedoso ubicado cadena abajo de la región constante kappa (EP004690251 ) . Este mejorador ha sido mostrado para jugar un papel crucial en la expresión de genes kappa ya que la remoción del mejorador 808bp reduce fuertemente la expresión. La deleción del mejorador kappa 3' también reduce fuertemente el nivel de hipermutación somática (SHM por sus siglas en inglés) . En los estudios de expresión celular y transgénicos se ha revelado que los mejoradors 3'kappa reducidos, mutados o eliminados no solamente disminuyen los niveles de expresión sino también disminuye el nivel de hipermutaciones somáticas. Actualmente, no puede ser determinado si el mej orador 3' kappa está implicado en procesos SHM, la regulación de expresión o ambos (análisis Odegard, V. H. , et al. (2006) . Nat. Rev. Immunol . 6,573; Inlay, M . , et al. (2002). Nat . Immunol . 3, 463) .

Los estudios de expresión detallados usando variantes modificadas del mejorador 3 'kappa indican que una región de 50 nucleótidos es suficiente para accionar la expresión. Sin embargo para expresión apropiada se prefiere una secuencia reducida de 145 nucleótidos (EP04690251; Meyer, K. B., et al. (1990) Nucleic Acids. Res. 18 (19) : 5609-15) .

De esta forma la invención en un aspecto proporciona un ácido nucleico para inserción en el genoma de un animal no humano que es un cásete de expresión para la expresión de una molécula proteinácea deseada en células que se desarrollan en células B maduras durante una cierta etapa de desarrollo, el cásete que comprende un medio para evitar la silenciación de expresión de la molécula proteinácea deseada después de la introducción en una célula hospedera, y un medio pars sincronizar la expresión de la molécula proteinácea deseada con la . etapa de desarrollo deseada de la célula hospedera.

Un cásete de expresión es definido como un ácido nucleico que ha sido proporcionado con un medio para la introducción en el genoma de una célula hospedera, como las secuencias las cuales permiten la recombinación homologa con un cierto sitio en el genoma. Usualmente el ácido nucleico será ADN, típicamente de doble cadena. Típicamente el cásete de expresión será proporcionado a la célula en un vector a partir del cual es transferido al genoma de la célula. El cásete de expresión además comprende todos los elementos necesarios para expresión del gen en una célula hospedera, aunque en ciertas modalidades algunos de los elementos pueden estar presentes en un segundo ácido nucleico a ser introducido, donde estos elementos actúan en trans. Los elementos necesarios para expresión en una célula hospedera incluyen promotores, mej oradores y otros elementos regulatorios . Solamente aquellos elementos que son necesarios no son proporcionados por la célula hospedera.

De acuerdo a la invención es importante que la expresión del gen de interés no sea silenciado en el genoma de la célula hospedera, especialmente no en la etapa de desarrollo donde se requiere la expresión. Esto puede ser hecho por varios medios, como la inserción en el locus endógeno o por proporcionar el cásete con elementos de ácido nucleico que evitan la silenciación (Kwaks et al. (2006).

Trends Biotechnol . 24(3), pág. 137-142; lo cual se incorpora en la presente para referencia) . Es preferido que el cásete de expresión se inserte en un locus que no es silenciado en las células huésped (EP 01439234; la cual se incorpora en la presente para referencia) .

El medio para prevención de silenciación comprende Stabilizing Anti-Repression-sequences (STAR®-sequences estabilización de secuencias antirepresión) y Matriz Attachment Regions (MAR por sus siglas en inglés de regiones de unión de matriz) . Una secuencia STAR es una secuencia de ácido nucleico que comprende una capacidad para influir en la transcripción de genes en cis. Típicamente, aunque no necesariamente, una secuencia STAR no codifica por sí misma un elemento de proteína funcional. En una modalidad un elemento STAR es usado. Preferentemente, sin embargo, más de un elemento STAR es usado. En una modalidad particularmente preferida un cásete de expresión de acuerdo a la invención es proporcionada con dos secuencias STAR, una secuencia STAR en el lado 5' de la secuencia de codificación del gen de inmunoglobulina y una secuencia STAR en el lado 3' de la secuencia de codificación del gen de inmunoglobulina. Las MARS son secuencias de ADN que están implicadas en un ADN de anclaj e/cromatina a la matriz nuclear y han sido descritas en tanto especies mamíferas y vegetales. Las MAR poseen un número de características que facilitan la abertura y mantenimiento de eucromatina. Las MAR pueden incrementar la expresión del transgén y limita los efectos de posición.

De acuerdo a la invención es importante que la expresión a partir del cásete solamente ocurre durante un cierto periodo en el desarrollo de una célula, en particular una célula B de desarrollo, más en particular una célula B en un animal no humano, transgénico, en particular un ratón. En este caso particular el periodo de desarrollo es elegido de tal forma que la expresión del gen a partir del cásete (típicamente un polipéptido como cadena ligera o cadena pesada) no interfiere significativamente con la diferenciación normal y/o maduración de la célula y cuando sea aplicable, permite la formación en pares de la cadena de polipéptido producida con su contraparte.

De acuerdo a la invención esta puede, en una modalidad, ser lograda por proporcionar un ácido nucleico de acuerdo a la invención, en donde el medio para sincronizar la expresión es un promotor del cual la actividad es esencialmente limitada a cierta etapa del desarrollo. En una célula B de desarrollo, la cual, por ejemplo después de la inmunización está madurando y/o diferenciando, la expresión del gen de interés, cuando es una de las cadenas de polipéptido de una inmunoglobulina, no debe interferir (significativamente) con la maduración y/o diferenciación y necesita ser sincronizada de tal forma que el polipéptido resultante puede formar pares con sus contrapartes. Por lo tanto la invención proporciona un ácido nucleico de acuerdo con la invención en donde cierta etapa inicia en una etapa inmediatamente precedente o coincidente con el inicio de la expresión de las moléculas de cadena ligera por las células en una cierta etapa del desarrollo en una célula B madura.

Esto puede ser logrado al seleccionar un promotor el cual es activo solamente durante el periodo adecuado. El promotor puede ser un promotor CD19, el promotor Ig-O, el promotor Ig-ß, el promotor µ?? (todos los genes) , el promotor Vk o análogos u homólogos del mismo.

En una modalidad específica de la presente invención el promotor como se describe anteriormente no acciona la expresión del gen de interés directamente. En su lugar acciona la expresión de un gen del cual el producto actúa in trans la expresión del gen de interés. El gen activador puede ser un gen que codifica la así llamada proteína Cre recombinasa o similar a Cre . El cásete de expresión para el gen de interés puede por ejemplo ser proporcionado con una secuencias que inhiben la expresión del gen de interés. La secuencia puede ser removida por la acción de la Cre recombinasa, la cual está bajo el control del promotor deseado (activos durante la etapa apropiada del desarrollo) . En esta modalidad se requiere un juego de casetes de expresión.

Por lo tanto la invención proporciona un juego de ácidos nucleicos que son casetes de expresión, en donde un ácido nucleico comprende un cásete de expresión que codifica una proteína similar a Cre bajo el control de un promotor activo durante la etapa deseada del desarrollo de la célula hospedera y el segundo ácido nucleico comprende una secuencia la cual codifica una molécula proteinácea deseada bajo el control de un promotor constitutivo el cual puede ser activado por la acción de una proteína similar a Cre. La activación es lograda preferentemente por la remoción de una secuencia de detención flanqueada por los sitios loxP. El sistema Cre/lox es descrito en detalle en Rajewsky et al. (1996) J. Clin. Invest. 98, pág. 600-603, la cual se incorpora para referencia en la presente. Los sistemas son analizados en Wunderlich F. T. (2004), "Generation of inducible Cre Systems for conditional gene inactivation in mice" Inauguraldissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissnschaftlichen Fakultát der Universit t zu Kóln, http : /deposit . d. db . de/cgi-bin/dokserv?idn=97557230x&dok_var=dl&dok_ext=pdf&filename=975 57230x.pd, la cual se incorpora en la presente para referencia .

La invención además proporciona un animal no humano, transgénico el cual ha sido proporcionado con un cásete de expresión de acuerdo a la invención, en donde la molécula proteinácea deseada es una cadena de polipéptido de una inmunoglobulina . Una cadena de polipéptido preferida es una cadena ligera. Un polipéptido más preferido es una cadena ligera de linea germinal o similar a línea germinal. Un polipéptido más preferido es 012, preferentemente la cadena ligera kappa de línea germinal IGKV1-39*01/IGKJ1*01 (nomenclatura de acuerdo a la base de datos IMGT, http : //www. imgt . org) .

Es además preferido que la cadena de polipéptido sea llevada a ser esencialmente incapaz de redisposición y/o excluida de cualquier modificación de secuencia como la operación normalmente en Ig durante el proceso de maduración de afinidad de células B. Por lo tanto, la invención proporciona un animal no humano, transgénico el cual ha sido proporcionado con un cásete de expresión de acuerdo a la invención, en donde la redisposición y/o modificaciones de secuencia son evitadas por la ausencia de elementos por lo menos parcialmente responsables para hipermutación somática como, por ejemplo, el mej orador MoEki .

Un cásete de expresión preferido de acuerdo a la invención comprende un medio para prevención de silenciación. En una modalidad, el medio para la prevención de silenciación son medios para inserción en un locus en el genoma de la célula hospedera que es resistente a silenciación. El medio para inserción son preferentemente medios para recombinación homologa en el sitio resistente a silenciación . Un locus preferido cuando el animal no humano es un ratón es el locus rosa .

Un cásete de expresión preferido adicional de acuerdo a la invención comprende en una dirección S"- 3': un promotor VK, un lider de ratón, un gen V humano, opcionalmente un mej orador MoEKi, una región constante de rata (CK) y opcionalmente un mej orador MoEK3' (truncado) .

Aún un cásete de expresión preferido adicional de acuerdo a la invención comprende en una dirección 5'-3': un promotor V , un líder humano, un gen V humano, opcionalmente un mej orador MoEki, una región constante de rata (CK) y opcionalmente un mejorador MoEK3 ' (truncado) .

Por supuesto la meta última de la invención es producir anticuerpos a ser usados en terapéuticos humanos. De esta forma la invención proporciona un método para producir un anticuerpo deseado el cual comprende exponer un mamífero no humano de acuerdo a la invención a un antígeno de tal forma que se induce una respuesta de anticuerpo y aislar los anticuerpos específicos para el antígeno.

En una modalidad alternativa, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo deseado el cual comprende exponer un mamífero no humano de acuerdo a la invención a un antígeno de tal forma que una respuesta de anticuerpo es inducida y aislar las células que producen los anticuerpos, cultivar y opcionalmente inmortalizar las células y cosechar los anticuerpos.

En una modalidad adicional, la invención proporciona un método para producir un anticuerpo deseado el cual comprende exponer un mamífero no humano de acuerdo a la invención a un antígeno de tal forma que una respuesta de anticuerpo es inducida y aislar el ácido nucleico el cual codifica por lo menos parte del anticuerpo, insertar el ácido nucleico o una copia o un derivado del mismo en un cásete de expresión y expresar el anticuerpo en una célula hospedera.

Los métodos para producir los anticuerpos a partir de ratones transgénicos son conocidos para una persona experta en la técnica. Particularmente preferidos son métodos para producción de mezclas de anticuerpos a partir de una célula, donde los ácidos nucleicos que codifican estos anticuerpos han sido derivados de ratones de acuerdo a la invención .

Estos así llamados oligoclónicos son descritos en la solicitud WO04106375 y WO005068622, las cuales se incorporan en la presente para referencia.

La presente invención proporciona mamíferos no humanos, preferentemente ratones, capaces de generar los anticuerpos humanos-ratón híbridos de alta afinidad y específicos con preferentemente regiones variables de cadena ligera de inmunoglobulina (VL por sus siglas en inglés) en o cerca de la configuración de línea germinal y preferentemente regiones variables de cadena pesada (VH por sus siglas en inglés) de inmunoglobulina de murino que puede tener mutaciones somáticas acumuladas durante el proceso de maduración de afinidad accionada por antígeno. Está comprendido que las regiones VH de murino de los anticuerpos híbridos pueden ser sometidos a procedimientos de humanización para producir mAb que tienen inmunogenicidad reducida cuando se aplican en humanos en base a las regiones VL de línea germinal o cerca de la línea germinal y regiones VH de murino que han sido humanizado.

En particular, se ha mostrado en la presente invención que los ratones trasngénicos que cosechan una construcción de expresión de ADN que codifica una región VL humana redispuesta bajo el control de los elementos genéticos de actuación cis que proporcionan expresión oportuna y regulada del transgén en una proporción significativa de células B durante el desarrollo de células B, carecen aún de elementos que dirigen la maquinaria de hipermutación somática al transgén, son capaces de generar anticuerpos híbridos ratón-humano específicos y de alta afinidad con esencialmente cadenas L no mutadas . Es mostrado que el transgén humano redispuesto es capaz de formar pares con una diversidad de cadenas H de inmunoglobulina de murino endógenas para formar inmunoglobulinas híbridas ratón -humano expresadas en la superficie de células B y para facilitar suficientemente el desarrollo de células B de murino para obtener un compartimiento de células B periféricas dimensionables y diversas .

En una modalidad preferida, la construcción de expresión de transgén cosecha las secuencias de codificación de una región V de cadena L redispuesta humana bajo el control de un promotor VL humano para dirigir la expresión específica a células B. Además, la construcción cosecha la secuencia de mej orador 3'Ck de murino para expresión de alto nivel e inducible y específica a células B del transgén. Adicionalmente, se diseña la construcción para carecer de los elementos regulatorios que facilitan el recrutamiento de la maquinaria de hipermutación somática al transgén, como el mejorador de introñes y el mej orador 3' C- kappa.

En una modalidad relacionada, el gen VL humano redispuesto es insertado en el locus Rosa26 murino por integración específica a sitio. El locus Rosa26 es útil en el contexto del procedimiento de "transgénesis objetivado" para generación eficiente de organismos transgénicos (como ratones) con un patrón de expresión de transgén predecible.

En una modalidad preferida, la región VL humana redispuesta es seleccionada por su capacidad para formar pares con muchos genes VH de murino diferentes para así asegurar la generación de una población de células B con un repertorio de genes VH diverso. Un método para obtener las regiones VL comprende amplificar un repertorio de genes VH redispuestos a partir de las células B de ratones y un repertorio de regiones VL de línea germinal redispuestos humanos a partir de las células B de humanos y clonarlos en vectores de exhibición de fagémidos para preparar diversas bibliotecas de inmunoglobulinas híbridas en bacterias. Por análisis de secuencia de nucleótidos de colecciones de pares de VH/VL no seleccionados y seleccionados de antígeno, son identificados genes VL de línea germinal humana con muchos genes VH de murino diferentes. Se describe una colección de genes VL de línea germinal humanos con este capacidad.

En una modalidad, se muestra que ante inmunización con antígeno, las células B son capaces de montar una respuesta inmunológica, llevando a la generación de células B que secretan anticuerpos híbridos con alta especificidad y afinidad. Las regiones V que codifican estos anticuerpos son caracterizadas por la cadena ligera transgénica humana que cosecha ninguna o muchas pocas mutaciones y una cadena pesada de murino que cosecha un número variable de mutaciones introducidas por la maquinaria de hipermutación somática.

En una modalidad relacionada, las estrategias para obtener anticuerpos monoclonales híbridos de alta afinidad a partir de ratones transgénicos por hibridoma y tecnologías de exhibición son contempladas así como también procedimientos para humanizar las regiones VH de murino para obtener anticuerpos menos inmunogénicos para aplicación en humanos.

En una modalidad, la invención proporciona una construcción de transgén de cadena L de inmunoglobulina la cual comprende secuencia de ADN que codifica una región VI de inmunoglobulina humana en combinación con una región constante de cadena ligera (CL por sus siglas en inglés) de una proteína de inmunoglobulina animal, las secuencias que son enlazadas operablemente a secuencias de transcripción y regulatorias que, cuando se integran en un animal transgénico no humano, producen un polipéptido VL-CL de Ig en una región VL humana que es o no es marginalmente sometida a Jiipermutación somática. La VL de Ig es capaz de formar pares con polipéptidos VH-CH redispuestos que son generados durante el desarrollo de células B en el animal transgénico no humano, con el polipéptido VH-CH que retiene la capacidad para sufrir hipermutación somática ante estimulación. La región CL puede ser de cualquier especie animal y es generalmente capaz de formar pares con las regiones CH del animal transgénico no humano.

La invención también incluye el uso de una construcción de transgén como anteriormente para producir un animal no humano, transgénico capaz de producción de anticuerpos híbridos que consisten de polipéptidos VL-CL y polipéptidos VH-CH en los cuales la región VL es de origen humano y la CL, VH y CH puede ser de cualquier especie animal, incluyendo humanos. Ante inmunización, estos animales transgénicos son capaces de generar anticuerpos de alta afinidad codificados por genes VH hipermutados somáticamente y esencialmente genes VL no imitados codificados por el transgén.

En otro aspecto, la invención proporciona un proceso para la producción de un animal no humano, transgénico capaz de producción de anticuerpos híbridos en respuesta a reto antigénico, el cual comprende alterar funcionalmente el locus de cadena ligera de inmunoglobulina endógena e insertar en el genoma animal una construcción de transgén de la invención.

La invención incluye el uso de animales obtenibles por este proceso en la producción de células B que producen inmunoglobulina que tiene cadena ligera VL humana. En otro aspecto de la invención se proporciona un proceso para la producción de células B que producen inmunoglobulina que tiene VL humana y enlace a un antígeno seleccionado, que comprende someter a reto un animal obtenible por un proceso como anteriormente con el antígeno y tamizar las células B a partir del animal que enlazan al antígeno. La invención además incluye las células B obtenibles por este proceso e hibridomas obtenibles por inmortalizar las células B, por ejemplo hibridomas obtenidas por fusionar las células B como anteriormente con células de mieloma. La invención también incluye un proceso para producir anticuerpo monoclonal el cual comprende cultivar el hibridoma. En aún un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de las células B anteriores para producir un hibridoma o anticuerpo monoclonal correspondiente.

Aún un aspecto adicional de la invención es un proceso para la producción de inmunoglobulina que tiene cadena VL humana y enlaza a un antígeno seleccionado, el cual comprende someter a reto un animal obtenible como anteriormente con el antígeno y obtener la inmunoglobulina a partir del mismo.

En aún una estrategia, como una etapa individual, una región VL redispuesta codificada por los segmentos de gen V y j de línea germinal humano y una región constante de cadena ligera de cualquier especie animal pero preferentemente una región constante de murino es introducida en la línea germinal de ratón. El ADN de transgén puede ser introducido en el pronúcleo de oocitos fertilizados o células germinales embriónicas . La integración puede ser aleatoria u homologa dependiendo de la estrategia particular a ser empleada. Por ejemplo, el transgén VL puede ser introducido por inserción aleatoria, resultando en ratones que portan una o múltiples copias del transgén en el genoma. Alternativamente, el transgén VL humano puede ser objetivado a un locus genómico específico ' usando recombinación específica a sitio como se describe en la técnica.

En una modalidad preferida, el transgén VL es objetivado al locus ROSA26 de murino el cual es un adecuado sitio de integración que permite la expresión fuerte y predecible de transgénes insertados (EP 1439234) . El vector de objetivación permite la inserción de una copia sencilla de un caste de expresión de genes, de esta forma evitando la modulación de expresión de transgén por la disposición de múltples copias. Por elegir el locus Rosa25 autosomal como sitio de inserción, el patrón de expresión del transgén insertado en el animal no humano es predecible. Adicionalmente , la inactivación X aleatoria y/o modulación por efectos de posición cromosomal son evitados. Esto también elimina la necesidad para generar y analizar las cepas transgénicas múltiples para cualquier transgén dado. Finalmente, el vector de objetivación Rosa25 para la integración específica a sitio puede ser usada para múltiples casetes de expresión de genes. De esta forma, puede estar comprendido que 2 ó más diferente regiones VL humanas de línea germinal redispuestas son insertadas en el locus Rosa25 para además incrementar la diversidad del repertorio de anticuerpos híbridos o humanos.

En otra modalidad, una región VL humana redispuesta puede ser objetivada al locus de cadena ligera lambda o kappa de Ig murino para así funcionalmente inactivar el locus endógeno o ratones que contienen la región VL humana redispuesta pueden ser reproducidos con ratones que carecen de loci de Ig kappa o lambda funcional, o ambos. De esta forma, por usar transformación, usando etapas repetitivas o en combinación con reproducción, pueden ser obtenidos los animales transgénicos los cuales son capaces de producir anticuerpos que cosechan el transgén VL humano en la ausencia substancial de cadenas ligeras de inmunoglobulina hospederas.

En una modalidad, un transgén VL humano se selecciona para su capacidad para formar par con una porción substancial de regiones VH de murino para formar un repertorio diverso de anticuerpos híbridos ratón-humano expresados en la superficie de las células B. Por una porción substancial de regiones VH de murino se entiende que la VL humanos formar par con por lo menos 0.1% de regiones VH de murino generadas durante el desarrollo de células B, más preferentemente con por lo menos 1% y más preferentemente con por lo menos 10%. Los métodos para identificar los genes VL humanos con esta característica incluyen formar en pares aleatoriamente un repertorio de regiones VL humanas con un repertorio de regiones VH de murino, la co-expresión de las regiones VH y VL en vectores de expresión eucariótica o procariótica apropiados y tamizar las regiones VL humanas que forman pares con una porción substancial de regiones VH de murino. En una modalidad, los vectores fagemidos pueden ser usados para dirigir la expresión de fragmentos de anticuerpo ratón-humano en células bacterianas o a la superficie de fagos filamentosos y análisis de capacidad de enlace de fragmentos de anticuerpo por métodos conocidos en la técnica.

En otra modalidad, un transgén VL humano se selecciona para su capacidad para formar pares con una porción substancial de regiones VH humanas para formar un repertorio diverso de anticuerpos humanos expresados en la superficie de células B. Por una porción substancial de regiones VH humanas se entiende que VL humanos se forma en par con con por lo menos 0.1% de las regiones VH humanas generadas durante el desarrollo de células B, más preferentemente con por lo menos 1% y más preferentemente con por lo menos 10%.

En la última modalidad, los ratones transgénicos VL humanos son cruzados con ratones que cosechan loci de inmunoglobulina de cadena H humana redispuesta o no redispuesta funcional y funcionalmente loci Ig de cadena H endógenos inactivados funcionalmente como se describe en la técnica. La inactivación funcional de las dos copias de cada uno de los tres loci de Ig de huésped (cadena pesada, cadena ligera kappa y lambda) donde el huésped contiene IgH humana y el transgén VL humano redispuesto puede permitir la producción de moléculas de anticuerpo puramente humanas sin la producción de anticuerpos quiméricos humanos hospederos. La cepa huésped, por inmunización con antígenos específicos, puede responder por la producción de células B de ratón que producen anticuerpos humanos específicos, las células B las cuales son subsecuentemente fusionadas con células de mieloma de ratón o son inmortalizadas en cualquier otra forma para la producción estable continua de anticuerpos monoclonales humanos. Alternativamente, la población de células B es usada como una fuente de regiones VH que pueden ser obtenidas por construir bibliotecas ADNc o por amplificación de PCR usando cebadores para regiones VH humanas como es conocido en la técnica .

Un gen VL redispuesto humano es reconstruido en un microorganismo eucariótico o procariótico apropiado y los fragmentos de ADN resultantes pueden ser introducidos en pronúcleos de oocitos de ratón fertilizados o células germinales embriónicas . Varias construcciones que dirigen la expresión específica de células B de transgénes VL han sido descritas en la técnica y tienen el siguiente formato general: una secuencia líder y secuencias cadena arriba relevantes para dirigir la expresión específica a células B del transgén, una secuencia de codificación de un transgén VL humano, una secuencia me oradora que dirige la expresión de alto nivel y específica a células B del transgén y un gen de región constante de murino. En un formato preferido, el mej orador es el mejorador 3' C-kappa ya que dirige la expresión de alto nivel en células de linaje B, pero no recruta hipermutación somática cuando se usa en construcciones de transgén.

En una modalidad, los animales, preferentemente ratones, que comprenden una o múltiples copias del transgén en el genoma son aislados y analizados para expresión estable. Los animales son seleccionados al mostrar expresión estable del transgén sobre periodos largos de tiempo, preferentemente en las células B. Si se requiere, diferentes líneas animales que comprenden inserciones independientes de una o múltiples copias del transgén, preferentemente en diferentes cromosomas, son cruzados para obtener animales con diferentes inserciones de una o múltiples copias del transgén para incrementar la expresión de los transgénes en animales, preferentemente en las células B.

La invención además proporciona progenie de un animal no humano, transgénico de acuerdo a la invención, la progenie que comprende, por lo menos en su linaje de células B, una secuencia que codifica una cadena pesada o ligera junto con un medio que lleva a la secuencia a ser resistente a redisposiciones de ADN y/o hipermutaciones somáticas.

La invención además proporciona la progenie de un animal no humano, transgénico de acuerdo a la invención, la progenie que comprende un cásete de expresión para la expresión de una molécula proteinácea deseada en células durante una cierta etapa del desarrollo en células que se desarrollan en células B maduras.

La invención además proporciona una célula que se aisla de un animal no humano, transgénico de acuerdo a la invención, la célula que comprende una secuencia de codificación de cadena pesada o ligera junto con un medio que lleva a la secuencia a ser resistente a redisposiciones de ADN y/o hipermutaciones somáticas. La invención además proporciona una célula que se aisla de un animal no humano, transgénico de acuerdo a la invención, la célula comprende un cásete de expresión para la expresión de una molécula proteinácea deseada en células durante una cierta etapa de desarrollo en células que se desarrollan en células B maduras. Una célula de acuerdo a la invención, preferentemente una célula B productora de anticuerpos, o una célula que es capaz de diferenciación o maduración en una célula B productora de anticuerpos, puede ser usada para producción in vitro de anticuerpos, como es conocido para la persona experta, por ejemplo a partir de Gasean et al. 1991 J. Ex . Med. 173: 747-750. Los métodos para inmortalización de una célula de acuerdo a la invención son conocidos en la técnica e incluyen la generación de hibridomas, por ejemplo por fusión con una célula de mieloma, transformación con virus Epstein Barr, expresión del transductor de señal de activación y transcripción (STAT por sus siglas en inglés) , activación por medio de señalización del receptor CD4 y IL4, y/o expresión de Bcl6 (Shwarts et al. 2002 Genes Dev. 16:681-686) .

En una etapa separada los loci de cadena ligera kappa y lambda endógeno de ratón son llevados a ser esencialmente no funcionales de tal forma que por lo menos la mayoría de las células B en los ratones transgénicos portan receptores de Ig que contienen la región VL humana transgénica. La inactivación de los loci de inmunoglobulina de ratón endógena se logra por alteración objetivada de los loci apropiados por recombinación homologa en células germinales embriónicas de ratón. La alteración objetivada comprende la alteración de la secuencia de genoma de tal forma que se produce cadena ligera kappa y lambda de inmunoglobulina de ratón endógeno substancialmente no funcional. El término "inmunoglobulina de ratón endógena substancialmente no funcional" indica que los loci de cadena ligera kappa y/o lambda endógenos son silencionados funcionalmente de tal forma que el nivel de expresión de proteína funcional de los loci de cadena ligera Kappa y/o lambda endógena, preferentemente el locus de cadena ligera kappa endógena, se reduce a aproximadamente 20% del nivel de expresión en un ratón de referencia, más preferido a aproximadamente 10%, más preferido a aproximadamente 5%, más preferido a aproximadamente 2% y más preferido a aproximadamente 1%. En una modalidad más preferida, el nivel de expresión de la proteína funcional de los loci de cadena ligera kappa y/o lambda endógena se reduce a 0%. El nivel de expresión de proteína funcional puede ser determinado por medios conocidos para la persona experta, incluyendo estern blotting y formación enpar con una cadena pesada de ratón. El ratón de referencia es un ratón en el cual los loci de cadena ligera kappa y/o lambda endógena no se alteran. La alteración comprende mutación y/o deleción de las secuencias de genes que son requeridas para expresión funcional de los genes de inmunoglobulina endógenos. Alternativamente, la alteración comprende inserción de un ácido nucleico en los loci de cadena ligera kappa y/o lambda de inmunoglobulina de ratón endógenos de tal forma que la expresión funcional de los genes de inmunoglobulina endógena se reducen. En una modalidad, el ácido nucleico comprende un elemento de silenciación que resulta en la silenciación transcripcional del gen de inmunoglobulina endógeno. En una modalidad adicional, o además, el ácido nucleico comprende una secuencia que altera el empalme y/o translación del gen de inmunoglobulina endógeno, por ejemplo por introducir un exon que lleva al cambio de cuadro en la secuencia de codificación, o que comprende un codon de' detención prematuro. En cada caso se generan los animales quiméricos los cuales se derivan en parte de las células germinales embriónicas modificadas y son capaces de transmitir las modificaciones genéticas a través de la línea germinal. El apareamiento de las cepas de ratón con loci de inmunoglobulina humana a cepas con loci de ratón inactivados produce animales los cuales producen anticuerpos que comprenden esencial y solamente cadenas ligeras humanas.

Una construcción para recombinación homologa es preparada por medios conocidos en la técnica y cualquier secuencia indeseable es removida, por ejemplo secuencias procarióticas . Cualquier técnica conveniente para introducir una construcción para recombinación homologa en una célula objetiva puede ser empleada. Estas técnicas incluyen fusión de esferoplasto, lipofección, electroporación, transferencia de ADN mediada con fosfato de calcio, o microinyección directa. Después de la transformación o transfección de las células objetivo, las células objetivo son seleccionadas por medio de marcadores positivos y/o negativos, por ejemplo por resistencia a neomicina y/o resistencia a aciclovir y/o ganciclovir. Aquellas células las cuales muestran el fenotipo deseado pueden entonces ser analizadas además por análisis de restricción, electroforesis , análisis Southern, PCR o similares. Por identificar fragmentos los cuales muestran la presencia de lesiones en el locus objetivo, son identificadas las células en las cuales ha ocurrido la recombinación homologa para inactivar una copia del locus objetivo.

Adicionalmente , se muestra que ante inmunización, las regiones VH de murino y humanas en los ratones transgénicos mencionados anteriormente pero no las regiones VL son capaces de sufrir hipermutaciones somáticas para generar anticuerpos de alta afinidad. Ventajosamente, estos anticuerpos codificados por las regiones VL de línea germinal son predecibles para contribuir a menor inmunogenicidad cuando se aplican en humanos y resultan en anticuerpos más estables que son menos tendientes a agregación y de esta forma más seguros para uso terapéutico en humanos.

Mab derivados de los animales o células transgénicos no humanos mencionados anteriormente todos comparten las mismas regiones VL humanas idénticas. Se ha descrito que mAb que comparten la misma región VL idéntica pueden ser co-expresados en una sola célula clonal para la producción de mezclas de anticuerpos recombinantes con sitios de enlace funcional (ver la solicitud WO 04106375 y WO05068622) . De esta forma, la invención proporciona una plataforma para la generación de mAb de afinidad específica y alta que constituyen la base para mezclas de mAb producidos por células clónales.

Se prefiere que los mAb derivados de las células o animales transgénicos no humanos mencionados anteriormente se dirijan contra objetivos celulares. Los objetivos preferidos son moléculas de proteínas o carbohidratos expresados en la superficie o solubles humanas. Los objetivos preferidos adicionales son moléculas de proteínas o carbohidratos expresados en la superficie que son expresados en la superficie de bacterias, virus, y otros patógenos, especialmente de humanos.

Más específicamente, los objetivos preferidos incluyen citosinas y quimocinas, incluyendo pero no limitadas a interleucina lbeta (lLlbeta), IL2, IL4, IL5, IL7, IL8, IL12, IL13, IL15, IL18, IL21, IL23 y quimocinas como, por ejemplo, quimocinas CXC, quimocinas CC, quimocinas C (o quimiocinas gamma) como XCL1 ( linfotactina-alfa) y XCL2 ( linfotactina-beta) y quimocinas CX3C. además se incluyen como objetivos preferidos las moléculas receptoras de las citosinas y quimocinas, incluyendo los receptores de citosina del tipo I como, por ejemplo, el receptor IL-2, receptores de citosina tipo II como tales, por ejemplo, receptores de interferón, receptores de la superfamilia de inmunoglobulina (Ig) , familia del receptor de factor de necrosis tumoral que incluyen los receptores para CD40, CD27 y CD30, receptores de serina/treonina-proteína cinasa como receptores TGF beta, receptores acoplados a la proteína G como CXCR1-CXCR7, y receptores de tirosina cinasa como miembros de la familia del receptor del factor de crecimiento de fibroblasto (FGFR por sus siglas en inglés) , miembros de la familia del receptor EGF que incluyen erbBl (EGF-R; HERI), erbB2, (HER2 ) , erbB3 (HER3) , y erbB4 (HER4 ) , miembros de la familia del receptor de insulina que incluyen miembros de la familia de receptores IGR-R y IGFR-RII, PDGF, miembros de la familia de receptor de factor de crecimiento de hepatocitos que incluyen los miembros de la familia del receptor Trk, c-Met (HGF-R) , los miembros de la familia del receptor TIE, miembros de la familia de receptor ROR, miembros de la familia del receptor DDR, miembros de la familia del receptor KLG, miembros de la familia del receptor RYK, miembros de la familia del receptor MuSK, y miembros de la familia del receptor de factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR por sus siglas en inglés) .

Objetivos adicionales preferidos son objetivos que son sobre-expresados o expresados selectivamente en tumores como, por ejemplo, VEGF, CD20, CD38, CD33, CEA, EpCAM, PSMA, CD54, Lewis Y, CD52, CD40, CD22, CD51/CD61, CD74 , MUC-1, CD38, CD19, CD262 (TRAIL-R2), RANKL, CTLA4 y CD30: objetivos que están implicados en inflamación crónica como, por ejemplo, CD25, CDlla, TNF, CD4 , CD80, CD23, CD3 , CD14 , lFngamma, CD40L, CD50, CD122, TGFbeta y TGFalfa.

Las moléculas de proteínas o carbohidratos expresados en la superficie preferidas que son expresadas en la superficie de bacterias, virus y otros patógenos parásitos, especialmente de humanos, incluyen marcadores superficiales de los virus de la influenza A y B como la hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) , filovirus como el virus del ébola, rabias, sarampiones, rubéola, paperas, flavivirus como el virus del dengue tipos 1-4, virus de encefalitis transportado grueso, virus del Nilo del Occidente, virus de encefalitis Japonesa, y virus de la fiebre amarilla, paramixovirus que incluyen paramixovirus como la parainfluenza 1, 3, rubulavirus como el virus de paperas y para influenza 2,4, morbilivirus , y neumovirus como el virus sincicial respiratorio, . vacinia, viruela, coronavirus, incluyendo el virus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS por sus siglas en inglés) , virus de la hepatitis A, B y C, virus de la inmunodeficiencia humana, virus del herpes, incluyendo citomegalovirus , virus de Epstein Barr, virus del herpes simples, y virus de Varicela zoster, parvovirus como, por ejemplo, B19; neumofilia Legionela, listeria monocitogenes ; campilobacetr jejuni; Staphylococcus aureus; E. coli 0157; H7 ; Borrelia burgdorferi; Helicobacter pylori ; Ehrlichia chaffeensis ; Chostridum difficile; B brio cholerA; Salmonella entérica Serotype Typhimurium; Bartonella henselae; Streptococcus pyogenes (Strep grupo A) ; Streptococcus agalactiae (Strep Grupo B) ; S. Aureus resistente a fármacos múltiples (por ejemplo MRSA) ; Chlamydia pneumoniae; Chostridium botulinum; Vibrio vulnificus; Parachlamydia pneumonía; Corynebactierum amycolatum; Klebsiella pneumonía; enterococos resistente a Linezolid (E. faecalis y E. faecium) ; y Acinetobacter baumannii resistente a fármacos múltiples.

Los objetivos más preferidos son IL-6 y su receptor, IL-6Ralpha, gpl30 denominado glicoproteína, RSV, especialmente las proteínas superficiales F, G y SH y proteínas no estructurales como N y M, y tirosina cinasa receptoras, en particular erbBl (EGF-R; HERI), erbB2 , (HER2) , erbB3 (HER3), erbB4 (HER4 ) , IGF-R1 y IGF-RII, c-Met (HGF-R) .

Por lo tanto, la invención proporciona una plataforma para la generación de mAB de alta afinidad y específicos contra los objetivos mencionados anteriormente que constituyen la base para mezclas de mAb producidos por células clónales. En una modalidad preferida, los mAb específicos y de alta afinidad comprenden mAbs que son dirigidos contra epítopos diferentes en por lo menos uno de los objetivos. En una modalidad preferida adicional, los mAB de alta afinidad y específicos comprenden mAb que son dirigidos contra objetivos diferentes, como, por ejemplo, uno o más miembros de la familia del receptor EGF, incluyendo erbBl (EGF-R; HERI), erbB2 (HER2), erbB3 (HER3) y erbB4 (HER4) .

A menos que se defina de otra forma, los términos científicos y técnicos usados en conexión con la presente invención deberán tener los significados que son entendidos comúnmente por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Además, a menos de que se requiera de otra forma por el contexto, los términos singulares deberán incluir pluralidades y términos plurales deben incluir el singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y técnicas de, cultivo de células y tejido, biología molecular y proteína y química de oligo o polinucleótidos e hibridización descritos en la presente son aquellos bien conocidos y usados comúnmente en la técnica. Las técnicas estándar son usadas para ADN recombinante , síntesis de oligonucleótidos , y cultivo de tejido y transformación (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Reacciones enzimáticas y técnicas de purificación son realizadas de acuerdo a las especificaciones del fabricante o como comúnmente se realizan en la técnica o como se describen en la presente. Las técnicas y procedimientos mencionados anteriormente son generalmente realizados de acuerdo a métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales y más espefícias que son citadas y discutidas a través de la presente especificación. Ver por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning A. Laboratory Manual (3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)), la cual se incorpora en la presente para referencia. Las nomenclaturas utilizadas en conexión con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente son aquellas bien conocidas y comúnmente usadas en la técnica. Las técnicas estándar son usadas para síntesis químicas, análisis química, preparación farmacéutica, formulación y suministro, y tratamiento de pacientes.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 es un mapa de topología de las ubicaciones de templado de cebadores de VH específicos y la posición de sitios de restricción requeridos que son introducidos por secuencias colgantes en el extremo 3 'de los cebadores .

La figura 2 son las etapas de amplificación de PCR (amplificación, introducción intermedia y sitio) . La ubicación y los nombres de los cebadores de amplificación de VH de ratón (y mezclas de cebadores) son indicados por etapa.

La Figura 3 es la topología del vector MV1043. Este vector es usado para la clonación de fragmentos de VH humano o de murino. 012 (IGKV1-39) es indicado como el gen VL. Los productos de este vector en combinación con fagos auxiliares en las células E. coli permiten la generación de fagos que exhiben fragmentos de Fab en la superficie de las partículas de fagos como un producto de fusión a la proteína g3 y presencia del vector en el fago como el contenido genético (Fl ORI) .

La Figura 4 es la topología de los locus C kappa de ratón cadena abajo de los segmentos J. Tanto los mejoradores y la región C kappa son indicados. La flecha inferior indica la región que es removida con el fin de silenciar el locus.

La Figura 5 es la topología del locus C-lambda de ratón. Todas las tres regiones V activas son indicadas (Igl-VI, V2 y V3) ya que son los segmentos J (Igl-Jl, Igl-J2, Igl-J3 , Igl-J4 y el pseudo segmento Igl-J3p) y las regiones constantes (Igl-Cl, Igl-C2, Igl-C3 y Igl-C4) . Las regiones que son eliminadas con el fin de silenciar el locus son indicadas por marcadores de deleción. Estas deleciones incluyen todos los genes V activos (1, 2 y 3) y el segmento intergénico entre V2 y V3.

La Figura 6 es la topología de construcción de IGKVl-39/H-Ck con un intrón ubicado en el cuadro de lectura abierto líder (ORF por sus siglas en inglés) .

La Figura 7 es la topología de construcción de IGLV2-14/J-Ck con un intrón ubicado en el cuadro de lectura abierto líder (ORF) .

La Figura 8 es la topología de construcción de VkP-IGKVl-39/J-Ck (VkP-012) . El promotor se origina del gen IGKV1-39 y se coloca directamente en el frente de los elementos requeridos para transcripción y translación eficiente. Las secuencias intergénicas (que incluyen los mejoradores) son derivadas de ratones y obtenidas de clones BAC. Los códigos de secuencia C-kappa para la región constante kappa de rata.

La Figura 9 es la topología de construcción de VkP-IGLV2-14/J-Ck (VkP-2a2) . El promotor se origina del gen IGKV1-39 y se coloca directamente en el frente de los elementos requeridos para eficiente transcripción y translación. Las secuencias intergénicas (que incluyen los me oradores) son derivados de ratones y obtenidos de clones BAC. Los códigos de secuencia de C-kappa para la región constante kappa de rata.

La Figura 10 es la topología de construcción de VkP-IGKVl-39/J-Ck-Al (VkP-012 -dell) es idéntica a VkP-IGKVl-39/J-Ck a partir de la figura 9 excepto que se remueve la región mej oradora del intrón.

La figura 11 es la topología de construcción de VkP-IGKVl-39/J-Ck-A2 VkP-012 -del2 ) es idéntica a VkP-IGKVl-39/J-Ck-Al a partir de la Figura 10 excepto que una gran pieza de la región intergénica entre el gen Ck y el mej orador 3' es eliminada. Además, el mej orador 3' es reducido en tamaño a partir de 809 pb a 125 pb.

La Figura 12 es una de las secuencias usadas o referidas en esta solicitud.

Las Figuras 13A-13C son la generación del alelo Rosa26-IgVkl-39 Kl . La figura 13A es el dibujo esquemático del vector de objetivación pCAGGS-IgVKl-39 . La Figura 13B es la secuencia de nucleótidos del vector de objetivación pCAGGS-IgVKl-39. La Figura 13C es la estrategia de obj etivación .

La Figura 14A es el análisis Southern blot de ADN genómica de clones ES que comprenden una inserción del vector de objetivación pCAGGS-IgVKl-39. El ADN genómico de 4 clones independientes es digerido con Asel y probado con 5el indicando el límite 5' del vector de objetivación. Todos los clones comprenden una inserción correcta del vector de objetivación en el extremo 5'.

La Figura 14B es el análisis Southern blot de ADN genómico de clones ES que comprenden una inserción del vector de objetivación pCAGGS-IgVKl-39. El ADN genómico de 4 clones independientes es digerido con MscI y sondeado con 3el que incida el límite 3' del vector de obj etización . Todos los clones comprenden una inserción correcta del vector de objetivación en el extremo 3'.

La Figura 14C es el análisis Southern blot de ADN genómico de clones ES el cual comprende una inserción del vector de objetivación pCAGGS-IgVKl-39. El ADN genómico de 4 clones independientes es digerido con BamHI y sondeado con una sonda Neo interna que indica el límite 5' del vector de objetivación. Todos los clones comprenden una inserción correcta, sencilla del vector de objetivación.

Las Figuras 15A.a 15C son la generación del alelo Rosa25-IgV12-14 KI . La Figura 15A muestra el dibujo esquemático del vector de objetivación pCAGGS-IgVL2-14. La Figura 15B muestra la secuencia de nucleótidos del vector de objetivación pCAGGS-IgVL2-14 que contiene el inserto de expresión CAGGS en base a la región lambda IGLV2-14/J V de línea germinal redispuesto (IGLV2-14/J-Ck) . La Figura 15C estrategia de objetivación.

Las Figuras 16A-16C son perfiles Epibase® de residuos IGKV1-39 1-107. La figura 16A exhibe la resistencia de enlace para alotipos DRB1, mientras que figura 16C exhibe la resistencia de enlace para DRB3/4/5, alotipos DQ y DP. Los valores en las figuras representan constantes de disociación (kd's) y son graficados en una escala logarítmica en el intervalo 0.01 µ?-0.1µ? (enlazadores muy fuertes pueden tener corridas fuera de la gráfica) . Para péptidos de enlace medio, son dados solamente los valores cualitativos, y los enlaces débiles o no enlaces no son mostrados. Se grafican los valores en el primer residuo del péptido en la secuencia objetivo (el péptido por si mismo se extiende por otros 9 residuos) . En forma importante, solamente el receptor de enlace más fuerte para cada péptido es mostrado: los alotipos de reacción cruzada con menor afinidad no son visibles en esta gráfica. El receptor de enlace más fuerte es indicado por su nombre serotípico. Finalmente, cualquier péptido filtrado por línea germinal es graficado con un color más ligero en el mapa del epítopo (en este caso, no se encuentran auto epítopos) . La subfigura B muestra la promiscuidad de enlace HLA para cada péptido decamérico (eje Y; el número de los alotipos HLA que reconocen los epítopos críticos en cada uno de los péptidos de partida en el residuo indicado mostrados en el eje X) . La promiscuidad es medida como el número de alotipos fuera del total de 47 para el cual el péptido es un enlazador crítico. Las columnas blancas se refieren a auto péptidos y las columnas negras (ausentes aquí) a no auto péptidos.

La Figura 17 es el mapa de epítopo de IGKVl-39 el cual muestra la presencia de enlazadores de péptido predichos en la secuencia de IGKVl-39 por el serotipo en el formato 15-mer. Cada 15-mer es numerado como se indica en la parte superior de la figura. La secuencia total de 15-mer correspondiente es enlistada en la tabla 7. Los cuadros negros indican la presencia de uno o más auto epítopos críticos en el 15-mer para el serotipo enlistado en la izquierda. Los epítopos críticos son definidos operacionalmente como enlazadores DRB1 fuertes o medios y enlazadores DP o DQ o DRB3/4/5 fuertes.

Las Figuras 18A y 18B son ratones desnudos constitutivos (KO) del locus Ig Kappa. La Figura 18A muestra la estrategia de objetivación La Figura 18B muestra un dibujo esquemático del vector de objetivación plgKappa.

Las Figuras 19A Y 19B son KO constitutivos del locus Ig lambda La Figura 19A primera etapa de la estrategia de objetivación La Figura 19B muestra la segunda etapa de la estrategia de objetivación.

Las Figuras 20A y 20B son dibujos esquemáticos de vectores de objetivación. La Figura 20A muestra pVkP-012 (VkP-IGKVl-39/J-Ck) ; La Figura 20B muestra pVkP-012dell (VkP-IGKVl-39/J-Ck--Al) ; La Figura 20C muestra pVkP-012-del2 (VkP-IGKVl-39/J-Ck-A2) .

Las Figuras 21A a 21C son las estrategias de objetivación para inserción del transgén en el locus Rosa26 por transgénesis objetivada usando RMCE . La Figura 21A muestra VkP-012 (VkP-IGKVl-39/J-Ck) ; La Figura 2IB muestra VkP-012-dell (VkP-IGKVl-39/J-Ck-Al) ; La Figura 21C muestra VkP-012-del2 (VkP-IGKVl-39/J-Ck-A2) .

La Figura 22 es la topología del vector MV1057.

Reemplazar el fragmento stuffer indicado con un fragmento VH produce un vector de expresión que puede ser transgectado a células eucarióticas para la producción de anticuerpos IgGl con cadenas ligeras que contienen un gen VL 012 (IGKV1-39) .

La Figura 23 es la carencia de la expresión de cadena ligera Vkl humana transgénica en poblaciones de células no B del bazo.

La Figura 24 es la cadena ligera Vkl humana transgénica es expresada en todas las poblaciones de células B del bazo.

La Figura 25 es la cadena ligera Vkl humana transgénica que es expresada en las células Bl de la cavidad péritoneal .

Las Figuras 26A y 26 B son cadena ligera Vkl humana transgénica no es expresada en células Pro B y pre B pero en células B de poblaciones inmaduras y recirculantes en la médula ósea. La Figura 26A es la activación de puerta de las células de médula ósea La Figura 26B muestra las histogramas de la expresión de transgén con traslape a partir del control WT.

La Figura 27 es la cadena ligera Vkl humana transgénica que está directamente correlacionada con la cadena ligera endógena y la expresión IgM en células B circulantes en la sangre.

Descripción Detallada de la Invención Ejemplos Ejemplo 1 Clones de genes V de cadena ligera humanos Este ejemplo describe el antecedente racional de la elección de dos genes V de cadena ligera humanos, un gen del tipo kappa y un gen del tipo lambda, que son usados como una prueba del concepto para ratones transgénicos que expresan la cadena ligera. De Wildt et al. 1999 (de Wildt et al. (1999) J. Mol. Biol . 285 (3):895) analiza la expresión de cadenas ligeras humanas en células B positivas a IgG periféricas. En base a estos datos, se eligen IGKV1-39 (012) y IGLV2-14 (2a2) como cadenas ligeras ya que son bien representadas en el repertorio de células B. La secuencia de segmento J de las cadenas ligeras ha sido elegida en base a las secuencias como se presentan en GenBank ABA26122 for IGKV1-39 (Rabquer,B. J. , Smithson, S . L . , Shriner,A.K. y Westerink,M.A. J. ) y GenBank AAF20450 for IGLV2-14 ( Ignatovich, 0. , Tomlinson, I . . , ?????,?.?., Bruggemann, M . y Winter,G. J. Mol. Biol. 294 (2), 457-465 (1999)).

Todos los segmentos de cuadro son convertidos en secuencias de aminoácidos de línea germinal para proporcionar la inmunogenicidad más baja posible en aplicaciones clínicas potenciales.

Ejemplo 2 Obtener los genes V de cadena pesada de ratón que forman pares con el segmento de gen IGKV1-39 humano para formar sitios de enlace de anticuerpo funcional.

Este ejemplo describe la identificación de genes V de cadena pesada de ratón que son capaces de formar pares con una región IGKV1-39/J de línea germinal humana, redispuesta, sencilla. Un repertorio VH de bazo a partir de ratones que son inmunizados con el toxoide tetánico es clonado en un vector Fab de exhibición de fagos con una cadena ligera IGKV1-39-C kappa humana sencilla y sometidos a apelmazado contra el toxoide tetánico. Los clones obtenidos después de una vuelta de apelmazado son analizados para su especificidad de enlace. Los genes VH de murino que codifican los fragmentos Fab específicos a toxoide son sometidos a análisis de secuencia para identificar los clones únicos y asignar la utilización de VH, DH y JH .

Muchos de los protocolos descritos en la presente son protocolos estándar para la construcción de bibliotecas de exhibición de fagos y el apelmazado de fagos para enlace a un antígeno de interés y descritos en Antibody Phage Display: Methods and Protocols (editores) : Philippa M. O'Brien, Robert Aitken) .

Inmunizaciones Los ratones BABL/m reciben una inmunización con toxoide tetánico y son reforzados después de 6 semanas con el toxoide tetánico.

Aislamiento de esplenocitos .

La preparación de suspensión de células de bazo. Después de la disección, se lava el bazo con PBS y se transfiere a una caja de petri de 60 mm con 20 mi de PBS. Una jeringa de punta con 20 mi de PBS y una aguja G20 se usa para fluir repetidamente el bazo. Después de lavar las células fluidas con PBS, las células son llevadas cuidadosamente en suspensión usando 20 mi de PBS y dejados en un banco por 5 minutos para separar los esplenocitos a partir de residuos y glomérulos celulares. La suspensión de esplenocitos es transferida en la parte superior del tubo lleno con Ficoll -Paque™ PLUS y procesado de acuerdo a los procedimientos del fabricante para aislamiento de linfocitos (Amersham Biosciences) .

Aislamiento de ARN y síntesis de ADNc Después del aislamiento y granulación de linfocitos, las células son suspendidas en reactivo TRIzoll Ls (Invitrogen) para el aislamiento de ARN total de acuerdo al protocolo del fabricante anexo y sometido a reacción de transcripción inversa usando 1 microgramo de ÁRN, Superscript III RT en combinación con dT20 de acuerdo a los procedimientos del fabricante (Invitrogen) .

Amplificación PCR de ADNc Se amplifica el ADNc en una reacción PCR usando combinaciones de cebador que permiten la amplificación de aproximadamente 110 diferentes genes V de murino que pertenecen a 15 familias VH ( (tabla 1; RefSeq NG_005838; Thiebe et al., 1999. European -Journal of Immunology 29: 2072 - 2081) . En la primera vuelta, las combinaciones de cebador que enlazan al extremo 5' de los genes V y el extremo 3' de las regiones J son usadas. En la segunda vuelta, los productos PCR que son generados con el cebador MJH-Rev2 son amplificados con el fin de introducir modificaciones en la región 3' para permitir la clonación eficiente de los productos. En la última vuelta de la amplificación, todos los productos PCR son amplificados usando cebadores que introducen un sitio de restricción Sfil en el extremo 5' y un sitio de restricción BstEll en el extremo 3" (ver las figuras 1 y 2, tabla 1) .

Las condiciones de reacción para la primera vuelta PCR: 4 diferentes reacciones que combinan todos los 25 cebadores hacia delante (MVH1 a MVH25, tabla 1 y la figura 2) y el cebador 1 inverso por reacción (MJH-Revl, MJKH-Rev2, MJH-Rev3 o MJH-Rev4; ver la tabla 1 y la figura 2) . 50 microlitros de volúmenes de PCR son compuestos de 2 microlitros de ADNc (a partir de las reacciones RT) , 10 microlitros de amortiguador de HF de polimerasa Phusion 5*, 40 nM de cada uno de los 25 cebadores hacia delante (concentración total de 1 micromolar) , 1 cebador inverso micromolar, 1 microlitro 10 mM de provisión d TP, 1.25 unidades de polimerasa Phusion y agua MQ estéril. El programa termociclador consiste de un programa de zona de contacto: 1 ciclo 98°C por 30 segundos, 30 ciclos 98°C por 10 segundos, 58°C disminuyendo 0.2°C por ciclo 10 segundos, 72°C 20 segundos y 1 ciclo 72 °C por 3 minutos. El program PCR de segunda vuelta es fijado solamente para los productos de la primera PCR que contienen el cebador MJH-Rev2 : 2 diferentes reacciones que combinan ya sea los cebadores ExtMVH-1 o ExtMVH-2 (tabla 1 y la figura2) en combinación con el cebador inverso ExtMJH-Rev2int (tabla 1 y figura 2) . 50 microlitros de volúmenes de PCR están compuestos de 50 ng de producto de PCR (a partir de la primera vuelta de PCR) , 10 microlitros de amortiguador HF de polimerasa 5* Phusion, 500 nM de cada cebador hacia delante, 1 micromolar de cebador inverso, 1 microlitro de 10 mM de provisión de dNTP, 1.25 unidades de polimerasa Phusion y agua MQ estéril. El programa termociclador consiste de un programa de zona de contacto seguido por una etapa de amplificación regular: 1 ciclo 98°C por 30 segundos, 10 ciclos 98°C por 10 segundos, 65°C disminuyendo 1.5°C por ciclo 10 segundos, 72°C 20 segundos, 10 ciclos 98°C por 10 segundos, 55°C 10 segundos, 72°C 20 segundos y 1 ciclo 72°C por 3 minutos. La tercera vuelta del programa de PCR se fija como se describe en la Figura 2. volúmenes de 50 microlitros de PCR están compuestos de 50 ng del producto de PRCR (a partir de las primeras vueltas de PCR, figuras 20A y 20B) , 10 microlitros de amortiguador HF de 5* Phusion polimerasa, 1 micromolar de cebador cadena adelante (tabla 1 y figura 2), 1 micromolar de cebador inverso, 1 microlitro de 10 mM de provisión de dNTP, 1.25 unidades de polimerasa Phusion y agua MQ estéril. El programa consiste de un programa de zona de contacto seguido por una etapa de amplificación regular: 1 ciclo 98°C por 30 segundos, 10 ciclos 98°C por 10 segundos, 65°C disminuyendo 1.5°C por ciclo 10 segundos, 72°C 20 segundos, 10 ciclos 98°C por 10 segundos, 55°C 10 segundos, 72 °C 20 segundos y 1 ciclo 72°C por 3 minutos. Después de las amplificaciones de PCR, todos los productos PCR son purificados en gel usando Qiaex II de acuerdo a los protocolos del fabricante .

Digestiones Con Enzimas de Restricción Se digieren los productos purificados con BstEII y Sfil en dos etapas. Primero 1 microgramo de ADN se digiere en reacciones de 100 microlitros que consisten de 10 microlitros de amortiguador 3 10* NEB (New England Biolabs) , 1 microlitro 100* BSA, 12.5 unidades de BstEii y agua estéril por 6 horas en 60°C en una estufa. Los productos son purificados usando Qiaquick PCR de Qiagen de acuerdo a las instrucciones manuales y eluidos en 40 microlitros de agua. Después todos los productos son además digeridos con Sfil en reacciones de 100 microlitros que consisten de 10 microlitros de amortiguador 2 10* EB (New England Biolabs) , 1 microlitro de 100* BSA, 12.5 unidades Sfil y agua estéril por 12 horas en 50°C en una estufa. Los fragmentos digeridos son purificados por el kit de extracción de gel Qiaquick después de la separación de gel en 20 cm de gel de bromuro de etidio mas TBE agarosa al 1.5% en 80 V. Se digiere 100 microgramos del vector aceptor (MV1043, figuras 3 y 12) con 50 unidades Eco911 en 600 microlitros bajo condiciones estándar (amortiguador Tango) y después se purifica en un gel de agarosa al 0.9%. Después de una segunda etapa de digestión bajo las condiciones prescritas con 400 unidades de Sfil en 500 microlitros por 12 horas, se agregan 100 unidades de BsrGl por 3 horas en 50°C.

Ligaciones Cada producto de PCR es ligado separadamente de acuerdo al siguiente esquema: 70 ng de productos PCR digeridos, 300 ng de vector aceptor digerido, 100 unidades de T4 ligasa (NEB) , 1+ amortiguador de ligasa en 30 microlitros por 16 horas en 12°C. Las reacciones de ligamiento son purificadas con extracciones de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico seguido por precipitaciones de glicógeno (Sigma-Aldrich #G1767) de acuerdo al protocolo del fabricante y finalmente se disuelven en 25 microlitros de agua estéril.

Transformaciones y Almacenamiento de bibliotecas Los. productos de ligación purificados son transformados por electroporacion usando 1200 microlitros de bacterias electrocompetentes TG1 (Stratagene #200123) por lote de ligamiento y colocados en placas sobre placas de carbenicilina LB que contienen 4% de glucosa. Las bibliotecas son cosechadas por raspar las bacterias en 50 mi de Lb carbenicilina. Después de la centrifugación en 2000 g por 20 minutos en 4°C, los gránulos bacterianos son resuspendidos cuidadosamente en 2 mi de hielo frío 2"TY/30% de glicerol en agua de hielo y congelados en hielo seco/etanol antes del almacenamiento en -80°C.

Amplificación de Bibliotecas Se hacen crecer las bibliotecas y se cosechan de acuerdo a procedimientos como se describen por Kramer et al. 2003 (Kramer et al. 2003. Nucleic Acids Res. 31(11) : e59) usando VCSM13 (Stratagene) como cepa de fagos auxiliadora.

Selección de Fagos en Inmunotubos recubiertos Se disuelve el toxoide tetánico en PBS en una concentración de 2 µg/ml y se recubren con MaxiSorp Nunc - Immuno tube (Nunc 444474) durante la noche en 4°C. Después de descargar la solución de recubrimiento, los tubos son bloqueados con 2% de leche descremada (ELK) en PBS (amortiguador de bloqueamiento) por 1 hora en RT . En paralelo, 0.5 mi de la biblioteca de fagos se mezcla con 1 mi de amortiguador de bloqueamiento y se incuban por 20 minutos en temperatura ambiente. Después de bloquear los fagos, se agrega la solución de fagos a los tubos recubiertos con toxoide tetátnico y se incuban por 2 horas en RT en una plataforma de rotación lentamente para permitir el enlace. Después, se lavan los tubos 10 veces con PBS/0.05% de Tween-20 seguido por la elusión de fagos por una incubación con 1 mi de 50 mM de glicina-HCl pH 2.2 10 minutos en RT en rueda de rotación y directamente seguido por neutralización del eluyente cosechado con 0.5 mi de Tris-HCl 1M pH 7.5.

Cosechar Clones de Fagos Se agregan 5 mi de MRF XLl-Blue (Stratagene) en O. D. a la solución de fagos cosechada y se incuba por 30 minutos en 37°C sin agitar para permitir la infección de los fagos. Se colocan en placas las bacterias en placas 2*TU de 4% de glucosa y carbenicilina/tetraciclina y se hacen crecer durante la noche en 37°C.

Producción de Fagos Se hacen crecer los fagos y se procesan como se describe por Kramer et al. 2003 (Kramer et al. 2003. Nucleic Acids. Res. 31(11) :e59) usando VCSM13 como una cepa de fagos auxiliadora.

ELISA de Fagos Se recubren las placas de ELISA con 100 microlitros de toxoide tetánico por pozo en una concentración de 2 microgramos/ml en PBS durante la noche en 4°C. Las placas son recubiertas con 100 microlitros de tiroglobulina en una concentración de 2 microgramos/ml en PBS son usados como un control negativo. Los pozos son vaciados, secados por golpes en una toalla de papel, llenados completamente con PBS- leche descremada al 4% (ELK por sus siglas en inglés) y se incuban por 1 hora en temperatura ambiente para bloquear los pozos. Después de descargar la solución de bloque, las minipreparaciones de fagos premezcladas con 50 µ? de solución de bloqueo son agregadas y se incuban por 1 hora en RT. Después 5 etapas de lavado con PBS- Tween-20 al 0.05% remueven los fagos no enlazados. Los fagos enlazados son detectados por incubar los pozos con 100 microlitros de conjugado de anticuerpo anti M 13-HRP (diluido 1/5000 en amortiguador de bloqueamiento) por 1 hora en temperatura ambiente. El anticuerpo libre es removido al repetir las etapas de lavado como se describe anteriormente, seguido por la incubación de substrato TMB hasta que el desarrollo de color es visible. La reacción es detenida al agregar 100 microlitros de 2 M de H2S04 por pozo y se analiza en un lector ELISA en 450 nm de longitud de onda de emisión (Tabla 2) . Números superiores indican señales más fuertes y de esta forma mayor incidencia de enlace específico del complejo de Fab de fagos.

Secuenciación Los clones que dan señales por lo menos 3 veces arriba de la señal antecedente (Tabla 2) son propagados, usados para procedimientos de miniprep de ADN (ver los procedimientos Qiagen miniPrep manual) y sometidos a análisis de secuencia de nucleótidos. La secuenciación se realiza de acuerdo al manual anexo a un kit Big Dye 1.1 (Applied Biosystems) usando un cebador inverso (CHl_Revl, tabla 1) que reconoce una secuencia 5" de la región CH1 de la cadena pesada IgGl humana (presente en el vector de exhibición de Fab MV1043, figuras 3 y 12) . Las secuencias VH de ratón de 28 clones de enlace de toxoide tetánico son representados en la Tabla 3. Los resultados muestran que los genes VH de murino seleccionados pertenecen a diferentes familias de genes, y diferentes miembros individuales a partir de estas familias de genes son capaces de formar pares con la región VH IGKV1-39/J humana redispuesta para formar sitios de enlace de anticuerpo específicos a toxoide tetánico funcional. A partir de los análisis de secuencia, se concluye que las regiones VH de murino utilizan una diversidad de segmentos de gen DH y JD.

Ejemplo 3 Silenciación del locus de cadena ligera kappa de ratón Este ejemplo describe la silenciación del locus de cadena ligera kappa endógeno de ratón. El locus kappa endógeno es modificado por recombinación homologa en células ES, seguido por la introducción de células ES modificadas genéticamente en embriones de ratón para obtener descendencia adaptada genéticamente.

Un vector que contiene una secuencia de nucleótidos ensamblada que consiste de una parte que comprende la región J para 338 pb cadena abajo del segmento de gen J5 fusionado a la terminación de secuencia 3' del mej orador 3'CK es usada para recombinación homologa en células ES. La secuencia ensamblada es usada para eliminar un fragmento de ADN genómico que se extiende desde 3 'de la región JK a justo 3' del mej orador CK. Como una consecuencia de este procedimiento, el gen constante CK, el mej orador 3' y algunas regiones intergénicas son removidas (ver las Figuras 4 y 18) .

Construcción del Vector de Objetivación Se usa un vector que recibe 4.8-8 kb de extremidades de flanqueo en el extremo 3' y 5' fusionados al segmento de deleción para objetivar recombinación homologa en una línea celular ES. Ambos extremos son obtenidos por medios de PCR asegurando la homología máxima. La estrategia de objetivación permite la generación de alelo KO constitutivo. La secuencia genómica de ratón que comprende el mejorador intrónico Igk( región constante Igk y el mej orador Igk 3' se reemplaz acón un cásete PuroR, el cual es flanqueado por los sitios F3 e insertados cadena bajo de los elementos Jk. La remoción mediada por Flp del marcador de selección resulta en un alelo KO constitutivo. El reemplazamiento de la región genómica 3? Igk iEk-IgK C- Igk (aproximadamente 10 kb) con un cásete F3-puro (aproximadamente 3 kb) es probable para disminuir la eficiencia de recombinación homologa. Por lo tanto, las extremidades de homología son extendidas por consiguiente y más colonias de células ES son analizadas después de la transfección con el fin de identificar clones recombinantes homólogos.

Generación de Células ES que portan el fragmento kappa eliminado La generación de células ES modificadas genéticamente es realizada esencialmente como se describe (Seibler et al. Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15:31(4) :el2) . Ver también el ejemplo 14 para una descripción detallada.

Generación de ratones ES por complementación de embrión tetraploide La producción de ratones por complementación de embriones tetraploide usando células ES modificadas genéticamente es esencialmente realizada como se describe (Eggan et al., PNAS 98, 6"209-6214; Seibler J, et al. Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15 ; 31 (4 ) : el2 ; Hogan et al., (Summary of mouse development. Manipulating the Mouse Embryo, (1994) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY . ) , pp. 253-289.)).

Ejemplo 4 Silenciación de locus de cadena ligera lambda de ratón Este ejemplo describe la silenciación del locus de cadena ligera lambda endógeno de ratón. El locus lambda endógeno es modificado por recombinación homologa en células ES seguido por la introducción de células ES modificadas genéticamente en embriones de ratón para obtener descendencia adaptada genéticamente.

Dos regiones del locus lambda de murino que juntas contienen todas las regiones V lambda funcionales son sometidas a deleción.

La primera región objetivada para deleción a base de recombinación homologa es una región que se ubica 408 pb cadena arriba del sitio de inicio del segmento de gen IGLV2 y los extremos 216 pb cadena abajo del segmento de gen IGLV3 , incluyendo la extensión de secuencia intergénica entre estos segmentos de genes IGLV. La segunda región que es sometida a una deleción implica el segmento de gen IGLV1 el cual consiste de un fragmento que se extiende desde 392 pb cadena arriba a 171 pb cadena abajo del segmento de gen IGLV1. Como una consecuencia de estas dos etapas de deleción, todos los segmentos de genes V lambda funcionales son eliminados, llevando al locus a ser inactivo funcionalmente (Figuras 5 y 19) .

Construcción de los Vectores de Objetivación Los vectores que reciben 3-9.6 kb de extremidades de flanqueo en el extremo 3' y 5" fusionados al segmento de deleción son usados para objetivar la recombinación homologa en la línea celular ES. Ambos extremos son obtenidos por medios de PCR asegurando la homología máxima. En una primera etapa, la secuencia genómica de ratón que comprende las regiones V2-V3 Igl son reemplazadas con un cásete PuroR flanqueado por los sitios F3 , lo cual produce un alelo KO constitutivo después de la remoción mediada por Flp del marcador de selección (ver la Figura 19A) . En una segunda etapa, la secuencia genómica de ratón que comprende la región VI Igl es reemplazada con un cásete Neo en los clones de células ES los cuales ya portan una deleción de las regiones V2-V3 de Igl (ver la figura 19B) . El marcador de selección (NeoR) es flanqueado por los sitios FRT . Un alelo KO constitutivo es obtenido después de la remoción mediada por Flp de marcadores de selección.

Generación de células ES que portan el fragmento lambda eliminado La generación de células ES modificadas genéticamente es esencialmente realizada como se describe (Seibler J, Zevnik B, Küter-Luks B, Andreas S, Kern H, Hennek T, Rodé A, Heimann C, Faust N, Kauselmann G, Schoor M, Jaenisch R, Raj ewsky K, Kühn R, Schwenk F. Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15;31(4) :el2) . Ver también el ejemplo 14 para una descripción detallada. Para mostrar que ambos eventos de objetivación ocurren en el mismo cromosoma son seleccionados varios clones objetivados dobles para deleción in vitro con pCM C31deltaCpG. Los clones son expandidos bajo presión de antibiótico en una capa alimentadora inactivada mitot icamente de fibroblastos embriónicos de ratón en medio concentrado en glucosa DMEM que contiene 20% de FCS (PAN) y 1200µ/p?1 de factor inhibitorio de leucemia (Millipore ESG 1107) . lxlO7 células a partir de cada clon son electroporados con 20 g de pCM C31deltaCpG circularen 240 V y 500 µ? y colocados en placas en cuatro discos de 10 cm cada uno. 2-3 días después de la electroporación se cosechan las células y se analizan por PCr. Los cebadores usados son: 2005_5: CCCTTTCCAATCTTTATGGG 2005_7: AGGTGGATTGGTGTCTTTTTCTC 2005_9 : GTCATGTCGGCGACCCTACGCC Las reacciones PCR son realizadas en mezclas que comprenden 5 µ? de amortiguador PCR 10 x ( Invitrogen) , 2 µ? de MgCl2 (50 mM) , 1 µ? de dNTP (10 mM) , 1 µ? de primer cebador (5 µ?) , 1 µ? del segundo cebador (5 µ?) , 0.4 µ? de Taq (5 U/µ? , Invitrogen) , 37.6 µ? de H20 y 2 µ? de ADN. El programa usado es 95 °C, 5'; seguido por 35 ciclos de 95°C, 30"; 60°C, 30°, 72°C, 1" ; seguido por 72°C 10'.

Generación de ratones ES por complementación de embriones tetraploides La producción de ratones por complementación de embriones tetraploides usando células ES modificadas genéticamente es realizada esencialmente como se describe (Eggan et al., PNAS 98, 6209-6214, Seibler J, Zevnik B, Küter-Luks B, andreas S, Kern H, Hennek T, Rodé A, HeimannC, Faust N, Kauselmann G, Schoor M, Jaenisch R, Rajewsky K, Kühn R, Schwenk F. Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15; 31(4),-el2; jhogan et al., (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY) , pág . 253-289) .

Ej emplo 5 Construcción de inserto de expresión de CAGGS en base a gen IGKVl-39/J-Ck de línea germinal humano redispuesta (IGVl-39/J-Ck) Este ejemplo describe la construcción de un cásete de expresión CAGGS el cual incorpora la región IGKV1-39/J de línea germinal humana redispuesta. Este caste de expresión de inserto comprende los sitios de clonación, una secuencia Kozak, una secuencia líder que contiene un intrón, un cuadro de lectura abierta de la región IGKV1-39 redispuesta, una región constante CK de rata a partir del alelo a y una secuencia de detención translacional (IGKVl-39/J-Ck; Figura 6) . La construcción primaria consiste de secuencias que ocurren en forma natural y ha sido analizada y optimizada al remover los elementos de actuación cis no deseados como los cuadros TATA internos, señales de poliadenilación, sitios chi , sitios de entrada ribosomal, extensiones de secuencia ricas en AT o ricas en GC, elementos de secuencia ARE, INS y CRS, secuencias de repetición, estructuras secundarias de ARN, donador de splice (críptico) y sitios aceptores y puntos de ramificación de splice (GeneARt GMBH) . Además, el uso de codón en regiones de cuadro de lectura abierta es optimizado para expresión en ratones. La secuencia de intrones no es cambiada y de esta forma representa la secuencia idéntica a la parte de codificación del intron líder IGKV1-39 humano.

En el extremo 5' del cásete de expresión, se introduce un sitio Notl y en el sitio 3' un sitio Nhel. Ambos sitios son usados para clonación en el módulo de expresión CAGGS . Después del ensamble de genes de acuerdo a los métodos usados por GeneARt , el inserto es digerido con Notl-Nhel y clonado en el módulo de expresión el cual contiene un promotor CAGGS, una secuencia detenedora flanqueada por los sitios LoxP ("Floxed"), una secuencia de señal de poliadenilación y, en el extremo 5' y 3', las secuencias para facilitar la recombinación homologa en el locus Rosa26 de líneas celulares ES de ratón. El promotor y/o los fragmentos de ADNc son amplificados por PCR, confirmados por secuenciación y/o clonados directamente a partir de plásmidos suministrados en un vector de intercambio de RMCE que cosecha las características indicadas. Un dibujo esquemático y la secuencia confirmada del vector de objetivación final pCAGGS-IgVKl-39 son mostrados en la Figura 13A y 13B. La estrategia de objetivación es representada en la figura 13C.

Ejemplo 6 Inserto de expresión de CAGGS en base a la región lambda IGLV2-14/J V de línea germinal redispuesta (IGLV2-14/J-Ck) Este ejemplo describe la secuencia e inserción de un cásete de expresión que incorpora la región lambda IGLV2-14/J V de línea germinal redispuesta. Este inserto comprende sitios de clonación, una secuencia Kozak, una secuencia líder que contiene un intrón, un cuadro de lectura abierta de la región IGLV2-14/J redispuesta, una región constante CK de rata a partir del alelo a y una secuencia de detención de traducción (IGLV2-14/J-Ck; Figura 7) ; La construcción primaria consiste de secuencias que ocurren en forma natural y ha sido analizada y optimizada al remover los elementos de actuación cis no deseados como: cuadros TATA internos, señales de poliadenilación, sitios chi, sitios de entrada ribosomal, extensiones de secuencia rica en AT o rica en GC, elementos de secuencia ARE-, INS- y CRS, secuencias de repetición, estructuras secundarias de ARN, donador splice (críptico) y sitios aceptores y puntos de ramificación splice (GeneARt GMBH) . Además, el uso de codon en las regiones de cuadro de lectura abierta se optimizan para expresión en ratones. La secuencia de intrones es no cambiada y de esta forma representa la secuencia idéntica al intrón líder IGKV1-39 humano.

En el extremo 5' del cásete de expresión, se introduce un sitio Notl y en el sitio 3' un sitio Nhel. Ambos sitios son usados para clonación en el módulo de expresión CAGGS como se describe por TaconicArtemis . Después del ensamble de genes de acuerdo a los métodos usados por GeneARt , el inserto es digerido con Notl-Nhel y clonado en el módulo de expresión el cual contiene un promotor CAGGS, una secuencia detenedora flanqueada por sitios LoxP ("Floxed"), una secuencia de señal de poliadenilación y, en el extremo 5' y 3', secuencias para facilitar la recombinación homologa en el locus Rosa25 de líneas celulares ES de ratón. Para construir el vector de objetivación ROSA26 RMCe final, se amplifican el promotor y/o fragmentos ADNc por PCR. Los productos amplificados son confirmados por secuenciación y/o clonados directamente a partir de plásmidos suministrados en un vector de intercambio RMCE que cosecha las características indicadas. Un dibujo esquemático y la secuencia confirmada del vector de objetivación final pCAGGS- IgVL2 - 14 es mostrado en la Figura 15A y 15B. La estrategia de objetivación es representada en la Figura 15C.

Ejemplo 7 Expresión de IGKVl-39/J-Ck en líneas celulares HEK293 (pSELECT-IGKVl-39/J-Ck) Este ejemplo describe un método para verificar que las construcciones IGKVl-39/J-Ck descritas en el ejemplo 5 permitan la expresión y detección de la cadena L IGKVl-39/J-Ck en células HEK293. Se modifica el inserto IGKV1-39/J (Figura 6) en el extremo 5' por cambiar el sitio Notl en un sitio Salí. Este cambio es requerido para clonación del producto en el plásmido de cásete de expresión pSELECt-hygro (InvivoGEn) . El inserto de expresión CAGGS IGKV1-39/J-Ck y pSELECT-hygro son digeridos con Salí y Nhel, ligados y usados para transformar células XLl-Blue competentes usando técnicas estándar. Las colonias son tomadas y se purifica el ADN usando columnas Qiagen Midi-prep de acuerdo a los procedimientos del fabricante. La cadena ligera - resultante (LC) que expresa el vector nombrado 0817676_pSELECT_0815426 es usada para transfectar células HEK293 con Fugene6 (Roche) de acuerdo a los protocolos del fabricante. Se tamizan los sobrenadantes para la presencia de cadenas ligeras IGKVl-39/J-Ck por ELISA y western blot usando anticuerpos antirata Ck (Beckton Dickinson #550336 y 553871) y protocolos usados en la técnica .

El VH de toxoide antitetánico (TT) IgG Mg 1494 es clonado en el vector de expresión IgG MV1056 usando sitios de restricción Sfil y BstEII. Se verifica la secuencia del clon resultante. Las células HEK293T son transfectadas con cinco combinaciones diferentes de vector como se muestra en la Tabla 4 (ver el ejemplo 8 para detalles del vector 0817678_pSELECT_0815427) . Los sobrenadantes son cosechados y las concentraciones de IgG determinadas (ver la Tabla 4) . Ningún IgG puede ser detectado para los sobrenadantes A y B que contienen cadena ligera solamente como se espera (anticuerpo de detección reconoce la parte Fe de IgG) . La concentración de IgG en sobrenadantes C y D es comparable con aquella del sobrenadante E de control positivo, indicando expresión correcta de las construcciones de cadena ligera .

El enlace a TT es analizado por ELISA para checar funcionalidad de los anticuerpos producidos, usando hemoglobina como antígeno de control negativo. Ningún enlace específico a TT puede ser detectado para los sobrenadantes A y B que contiene la cadena ligera solamente, como se espera. El enlace específico a TT para los sobrenadantes C y D es por lo menos tan bueno como para el sobrenadante E de control positivo, confirmando la expresión correcta de las construcciones de cadena ligera y ensamble funcional con la cadena pesada. Los anticuerpos son detectados no solamente usando un anticuerpo secundario IgG antihumano, sino también un anticuerpo secundario de cadena ligera Ckappa anti rata.

Los resultados confirman que el anticuerpo Ckappa anti rata (BD Pharmingen #553871, clon MR -1) reconoce la cadena ligera expresada por los vectores pSELECT.

Los sobrenadantes son analizados por SDS-PAGE no reductora y Western blot (no mostrada) . La detección usando un anticuerpo de cadena pesada IgG antihumana no muestra bandas para los sobrenadantes A y B que contienen la cadena ligera solamente, como se espera. Los resultados para los sobrenadantes C y D son comparables con el sobrenadante E de control positivo, con una banda cercana al marcador 170 kD como se espera para IgG intacto. Bandas de peso molecular inferior adicionales son observadas también para los sobrenadantes C, D y E los cuales representan productos de degradación, fragmentos IgG que resultan de reducción (parcial) y/o bandas de proteína irrelevantes debido a enlace no específico del anticuerpo de detección.

¦ La detección usando anticuerpo de cadena ligera C kappa antirata muestra una banda cercana al marcador de 25 kD para sobrenadantes A y B, como se espera para la cadena ligera solamente. Esta banda es mucho más intensa para A comparado con B, indicando que la cadena ligera IGKV1-39 libre puede ser expresada mejor y/o más estable que la cadena ligera IGLV2-14 libre. Ninguna banda es detectadas para el sobrenadante E de control como se espera, ya que la IgG expresada contiene una cadena ligera Ckappa humana. Para los sobrenadantes C y D, bandas esperadas cercanas al marcador de 170 kD son observadas, pero a un grado menor que anteriormente usando el anticuerpo IgG antihumano.

En conclusión, la transfección de las construcciones de expresión de cadena ligera combinadas con la cadena pesada de MG1494 de IgG toxoide antitetánico (TT) resulta en la producción de IgG comparable con la construcción de control positivo para tanto las construcciones de cadena ligera kappa y lambda pSELECT. Tanto las producciones IgG producen señales ELISA en un ELISA de TT que son mejores que o comparables con el control. Los análisis SDS-PAGE y Western blot confirman la presencia de IgG intacta. El anticuerpo Ckappa anti-rata probado trabaja eficientemente en tanto ELISA y Western blot. El sobrenadante del cultivo a partir de células transíectadas con construcciones de cadena ligera no solamente resultan en producción de IgG detectable ni en enlace específico a TT detectible, mientras que la cadena ligera es detectada en Western blot.

Ejemplo 8 Expresión de IGLV2-14/J-Ck en líneas celulares HEK293 (pSELECT-IGLV2-14/J-Ck) Este ejemplo describe un método para verificar que las construcciones IGLV2-14/J descritas en el ejemplo 6 permiten la expresión y detección de la cadena L IGLV2-14/J-Ck en las células HEK293. Se modifica el inserto IGLV2-14/J-Ck (Figura 7) en el extremo 5' por cambiar el sitio Notl en un sitio Salí . Este cambio es requerido para clonación del producto en el plásmido de cásete de expresión pSELECT-hygro (InvivoGEn) . El inserto de expresión CAGGS IGLV2 - ¡ 4/J-CK y pSELECT-hygro son digeridos con Salí y Nhel ligados y usados para transformar células XLl-Blue competentes usando técnicas estándar. Las colonias son tomadas y se purifica el ADN usando columna Qiagen Midi-prep de acuerdo a los procedimientos del fabricante. Esta cadena ligera resultante (LC) que expresa el vector nombrado 0817678_pSELECT_0815427 es usada para transfectar células HEK293 con Fugene6 (Roche) de acuerdo a los protocolos del fabricante. Los sobrenadantes son tamizados para la presencia de cadenas ligeras IGLV2 - 14/J-Ck por ELISA y western blot usando anticuerpos anti-rata Ck(Becton Dickinson %550336 y 553871) y protocolos usados en la técnica. Ver el ejemplo 7 para los detalles y resultados.

Ejemplo 9 Construcción de una construcción de expresión accionada por el promotor VK que contiene un inserto IGKV1-39/J y múltiples elementos mej oradores derivados del locus CK de murino (VkP-IGKVl-39/J-Ck; VkP-012) .

Este ejemplo describe la construcción de un cásete de expresión que contiene elementos relevantes para permitir a las células B y la expresión específica a etapa de desarrollo/diferenciación de la región VK IGKV1-39 humana redispuesta, en base a la región promotora IGKV1-39 VK, un líder que contiene un intrón, gen V de línea germinal, CDR3 , segmento IGKJ, región intergénico de ratón ubicado entre Jk y Ck, alelo Ck de rata un cuadro de lectura abierto, y un fragmento intergénico de ratón a partir del extremo 3' del gen CK de ratón que termina solo 3' del mejorador 3'CK.

Los cuadros de lectura abierta optimizados del líder, gen redispuesto IGKV1-39 y un gen de alelo a Ck de rata, como se describe en el ejemplo 5, es usado para la construcción del cásete de expresión. La región promotora VK es obtenida por procedimientos de síntesis de genes (GeneARt, GMBH) y es casi idéntica a la secuencia de la región IGKV1-39 humana entre 500 bp y ATG (sitio de partida) del gen. La única desviación a partir de la secuencia natural es la introducción de una secuencia Kozak GCCACCATGG en el sitio ATG (de partida) con el fin de promover la traducción. Un fragmento genómico a partir del clon Bac de ratón (TaconicArtemis) es usado como la base para la introducción de elementos individuales. Este fragmento es idéntico a la secuencia del locus VK de ratón que inicia con el sitio donador de intrones ubicado directamente 3' de la región JK5 y terminando justo 3' del mejorador 3'CK y cubre aproximadamente 12.5 kb.

La construcción final contiene del extremo 5' al 3' los siguientes elementos: un promotor IGKV1-30 genómico humano (500 pb) , una secuencia Kozak, un líder IGKV1-30 humano parte 1 (optimizado) , un intrón líder IG V-39 humano, un líder IGKV1-30 humano parte 2 (optimizado) , un gen de líena germinal IGKV1-30 humano (optimizado) , una región J humana (optimizada) , una región intergénica de ratón que incluye el elemento mejorador de intrón, una región constante kappa de rata (Rattus norvergicus) (optimizada) , y una región intergénica de ratón que incluye el mejorador 3 'kappa. Los elementos de este cásete de expresión son mostrados en la Figura 8 y nombrados VkP-IG Vl-39/J-Ck (VkP-012) . Una outline del vector pVkP-012 y la estrategia de objetivación es representada en la Figura 20A y 21A. El vector es introducido en las células ES siguiendo los procedimientos estándar (ver el ejemplo 14) .

Ejemplo 10 Construcción una construcción de expresión accionada por promotor VK que contiene un clon IGLV2-14/J y elementos mejoradores derivados de locus CK múltiples (VkP-IGLVL2-14/J- Ck; VkP-2a2) Este ejemplo describe la misma construcción como se describe en el Ejemplo 9, excepto que el gen IGKVl-39 y la región J son reemplazados por el gen de línea germinal IGLV2-14 humano optimizado incluyendo una región V-J única (VkP-IGLV2-14/J-Ck; VkP-2a2; Figura 9).

Ejemplo 11 Construcción de una construcción de expresión accionada por promotor VK que contiene un clon IGKV1-39 que carece del elemento me orador de intrón CK (VkP-IGKVl-39/J-Ck-Al; VkP- 012-Dell) La construcción descrita en el ejemplo ( 9 es modificada al remover el elemento mej orador de intrón CK, ubicado en la región intergénica entre la región J humana y la región CK de rata por modificación de PCR estándar y metodologías de clonación de ADN (GeneARt, GMBH) . El cásete de expresión resultante es mostrado en la Figura 10 y nombrado VkP-IGKVl-39/J-Ck-Al (VkP-012-dell) .

Un perfil del vector pVkP-012-dell y la estrategia de objetivación es representado en la Figura 20B y 21B. El vector es introducido en las células ES después de los procedimientos estándar (ver el ejemplo 14) .

Ejemplo 12 Construcción de una construcción de expresión accionada por promotor VK que contiene un clon IGKV1-30 que carece de un elemento mej orador de intrón CK y un elemento incrementado CK 3 ' truncado (VkP-IGKVl-39/J-Ck-A2 ; VkP- 012-del2) La construcción descrita en el Ejemplo 11 es modificada por truncar el elemento mej orador 3'CK y eliminar la parte de la región intergénica 3 del gen CK de rata, para remover los elementos inhibitorios potenciales. Esto es lgorado al remover la secuencia intergénica entre un sitio EcoRV (ubicado 3' del gen Ck de rata) y el sitio Ncol presente en el mej orador 3' (5993 pb) y además removiendo la secuencia entre el sitio BstXI mejorador 3' y el sitio 3' BstXI del mejorador 3' (474 pb) usando métodos estándar. El cásete de expresión resultante es mostrado en la Figura 11 y nombrado VkP-IGKVl-30/J-Ck-A2 (VkP-012 -del2 ) .

Un perfil del vector pVkP-012 -del2 y la estragegia de objetivación es representado en la Figura 20C y 21C. El vector es introducido en las células ES que siguen a los procedimientos estándar (ver el ejemplo 14) .

Ejemplo 13 Expresión de las construcciones Vk en líneas celulares Las construcciones descritas en el ejemplo 9-12 son probadas para su capacidad para producir proteínas de cadena ligera en las líneas celulares de mieloma MPC11 (ATCC CCL167) , linfoma de células B WEHI231 (ATCC CRL-1702), el linfoma de células T EL4 (ATCC TIB-39) y en HEK293 (ATCC CRL1573) . El mejorador y los elementos promotores en la construcción permiten la expresión en las líneas de células B pero no en las líneas celulares derivadas de otros tejidos. Después de la transfección de las líneas celulares usando ADN linearizado purificado y Fugene6 (Roche) se cultivan las células para expresión temporal. Las células y sobrenadante son cosechados y sometidos a análisis SDS-PAGE seguido por western blotting usando un anticuerpo anti-rata C kappa específico. Los sobrenadantes son analizados en ELISA para cadenas L secretadas usando el anticuerpo CK antirata (Beckton Dickinson #550336) .

Ejemplo 14 Generación de las líneas ES transgénicas Todas las construcciones como se describe en los ejemplos 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11 y 12 son usadas para generar líneas ES transgénicas estables individuales por medio de recombinación homologa. Los métodos para generación de líneas ES transgénicas por medio de recombinación homologa son conocidos en el campo (por ejemplo . Eggan et al., PNAS 98, 6209-6214; Seibler J, Zevnik B, Küter-Luks B, Andreas S, Kern H, Hennek T, Rodé A, HeimannC, Faust N, Kauselmann G, Schoor M, Jaenisch R, Rajewsky K, Kühn R, Schwenk F. Nucleic Acids Res. 2003 Feb 15;31 (4) :el2; Hogan et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY. ) , pág. 253-289. ) .

Para todas las construcciones descritas en los ejemplos 5-6, y ejemplos 9-12, se hace crecer la línea celular RMCE ES (derivada de cepa de ratón 129S6B6F1-Gt (ROSA) 25ortmlOArte) en una capa alimentadora inactivada mitóticamente comprendida de fibroblastos embriónicos de ratón (MEF) en medio concentrado en glucosa DMEM que contiene 15% de FBS (PAN 1302 -P2209821) . El factor inhibitorio de leucemia (Chemicon ESG 1107) es agregado al medio en una concentración de 900 U/ml. Para manipulación, se colocan en placas 2xl05 células ES en cajas de 3.5 cm en 2ml de medio. Directamente antes de la transfeccion, se agregan 2 mi de medio fresco a las células. Se mezcla 3 ul de reactivo Fugene6 (Roche; no. de catálogo 1 814 443) con 100 ul de medio libre de suero (OptiMEM I con glutamax I; Invitrogen; no. de catálogo 51985-035) y se incuba por 5 minutos, 100 ul de la solución Fugene/ (OptiMEM se agrega a 2 ug de vector circular y 2 ug de CAGGS-Flp y se incuba por 20 minutos. Este complejo de transfeccion es agregado en gotas a las células y mezclado. Se agrega medio fresco a las células al siguiente día. A partir del día 2 hacia adelante el medio es reemplazado diariamente con medio que contiene 250 ug/ml de G418 (Geneticin; Invitrogen; no. de catálogo 10131-019) Siete días después de la transfeccion, se aislan clones sencillos, se expanden y se analiza molecularmente por Southern blotting de acuerdo a los procedimientos estándar.

Para cada construcción, los análisis de múltiples clones por digestión de enzima de restricción de ADN genómica de clones sencillos seguido por hibridización con sondas 5', sondas 3', y sondas internas resulta en clones que comprenden una inserción correcta, sencilla en la posición correcta en el locus Rosa26. Se proporciona un ejemplo en las Figuras 14A a 14C.

Ejemplo 15 Generación de Cepas de Ratón Transgénicos Todas las líneas celulares ES que son generadas y verificadas para sus modificaciones como se describe en el ejemplo 14 son usadas para generar ratones transgénicos estables por medio de recombinación tetraploide. Los métodos son conocidos en el campo. En general, después de la administración de las hormonas, se aparean las hembras Balb/c superovuladas con machos Balb/c. Se aislan, los blastocistos a partir del útero en dpc 3.5. Para microinyección, se colocan los blastocistos en una gota de DMEM con 15% de FCS bajo aceite mineral. Se usa una pipeta de microinyección piezo accionada de punta plana, con un diámetro interno de 12-15 micrométros para inyectar 10-15 células ES C57BL/6N . tac objetivadas en cada blastocisto. Después de la recuperación, se transfieren los blastocistos inyectados a cada trompa de Falopio de hembras NMRI pseudopreñadas, 2.5 días post coito.

Se mide el quimerismo en quimeras (GO) por contribución de color de recubrimiento de células ES al huésped Balb/c (negro/blanco) . Se reproducen los ratones altamente quiméricos para la cepa de hembras C57BL/6. Dependiendo de los requerimientos del proyecto, las parejas de apareamiento C57BL/6 son no mutantes (W) o mutantes para la presencia de un gen de recombinasa (Flp-Deleter o Cre-deleter o deleter inducible por CreER o combinación de Flp-deleter/CreER) . La transmisión de línea germinal es identificada por la presencia de descendencia de la cepas C57BL/6 negra, (Gl) .

Por ejemplo, el clon ESC IgVKl-39 2683 8 (ver los ejemplos 5 y 14) es inyectado en un total de 62 blastocistos en 3 experimentos independientes. Se obtienen 3 carnadas con un total de 6 crías. Todas las crías son quiméricas: 3 crías de descendencia heterocigota son obtenidas las cuales son usadas además para cruzamiento.

Se inyecta el clon ESC Kappa 2692-A-C10 (ver los ejemplos 3 y 14) en un total de 54 blastocistos en 3 experimentos independientes. Se obtienen 3 carnadas con un total de 11 crías, de los cuales 10 son quiméricos. Se obtienen 8 crias de descendencia heterocigota que son usadas para cruzamiento adicional .

Se inyecta el clon ESC Kappa 2692 B-Cl (ver los ejemplos 3 y 14) en un total de 51 blastocistos en 3 experimentos independientes. Se obtienen 2 carnadas con un total de 6 crías, de las cuales 4 son quiméricas. Se obtienen 3 crías de descendencia heterocigota las cuales son usadas para cruzamiento adicional.

Ejemplo 16 Reproducción Este ejemplo describe la reproducción para obtener ratones que contienen casetes de expresión transgénicos como se describe en el ejemplo 14 y ratones desnudos en los cuales se ha silenciado el loci lambda y kappa endógeno. La ubicación de V- lambda en el cromosoma 16 y CD19 en el cromosoma 7 permite los procedimientos de reproducción estándar. La reproducción del locus Vk colocalizado y locus Rosa26 en el cromosoma 6 con una distancia de aproximadamente 24 cM requiere atención especial durante el tamizado ya que solamente un porcentaje de la descendencia muestra cruzamiento en una forma que ambas modificaciones son llevadas entre sí en un cromosoma .

Todos los cuatro loci tienen que ser combinados en una cepa de ratón sencilla que es homo o heterocigota para CD19-cre (no descritos) y transgén Rosa26 modificado y homocigotos para los otros loci. La reproducción es realizada por reproducción estándar y técnicas de tamizado como sea apropiado y ofrecida por compañías de reproducción comercial (por ejemplo TaconicArtemis) .

E emplo 17 Inmunizaciones de ratones Se realiza la inmunización primaria y de refuerzo de ratones usando protocolos estándar.

Para validar la expresión transgénica de cadenas ligeras CK de rata VK 012 (IGKV1-39) redispuestas humanas (ver el ejemplo 5, 14-16) en las células B a partir de ratones CD19-HuVKl y para evaluar su impacto en tamaño de repertorio VH, diversidad de uso de familia VH y recombinación V(D)J después de la inmunización, los ratones transgénicos CD19-HuVKl son inmunizados con vacuna de toxina tetánica (vacuna TT) y diversidad de secuencia VH de clones tomados aleatoriamente a partir de ratones CH19-HuVKl son comparados con ratones wt inmunizados TT y camadasnegativos CD19-Cre HuVkl . Son obtenidos los datos en la frecuencia SHM del transgén VK 012 humano en los ratones inmunizados. Se recupera una colección diversa de por lo menos 40 mAB relacionados clonalmente, específicos a TT que contienen VK 012 humano a partir de ratones CD19-HuVKl por exhibición de fagos .

Para esto, se vacunan tres ratones CD19-HuVKl adultos con vacuna TT usando procedimientos de inmunización estándar. Después de la inmunización, se miden los títulos de suero usando ELISA específico a TT (TT: Statens Serum Institue, Art . No. 2674) y suspensiones de bazo sometidos a clasificación celular por el procedimiento FACS después de la tinción con un anticuerpo monoclonal específico a CK de rata para aislar células B transgénicas (clon RG7/9.1; BD Pharmingen# 553901, lote#06548) . ARN a partir de células B positivas CK de rata y el material de ADNc resultante son usados para construcción de bibliotecas y análisis SHM.

Se usa anticuerpo CK anti rata de ratón monoconal estándar (clon RG7/9.1; BD Pharmingen#553901 , Lote #06548) en análisis FACS de células B de expresión de transgén (Meyer et al., 1996, int . Immunol . 8:1561). El anticuerpo RG7/9.1 de clon reacciona con un determinante de cadena kappa monotípico (común). Este anticuerpo CK anti rata (clon RG7/9.1 (BD Pharmingen# 553901, Lote #06548) es etiquetado con R-ficoeritrina (PE por sus siglas en inglés) usando el kit de conjugación rápida LY X de acuerdo a las instrucciones del fabricante para análisis y clasificación FACS. El anticuerpo etiquetado es probado primeramente por citometría de flujo por enlace a proteínas de cadena ligera funcionales que contienen CK de rata producidas en células HEK-293T transfectadas temporalmente; el anticuerpo no conjugado sirve como un control positivo. Los otros dos cuerpos muestran enlace a CK de rata por ELISA y Western-blot (ver el ejemplo 7) son probados también por citometría de flujo.

La construcción de biblioteca de exhibición de fagos Fab se realiza con un grupo de cebadores PCR degenerados optimizados diseñados para amplificar los genes C57BL/6VH; el tamaño de biblioteca mínimo es 106 clones, y la frecuencia de inserto mínima es 80%. El vector usado, MV1043 (Figuras 3 y 12), contiene el VK 012 humano fusionado a una región CK humana . La rata CK es por lo tanto intercambiada para la contraparte humana en el proceso de generación de bibliotecas .

Antes de la selección, la secuenciación VH de 96 clones tomados aleatoriamente es realizada para validar la diversidad del repertorio VH que se compara con la diversidad obtenida a partir de una biblioteca no seleccionada generada previamente usando los mismos procedimientos a partir de ratones BALB/c inmunizados con TT. Una biblioteca a partir de ratones C57B1/6 wt que son inmunizados en la misma forma permite la comparación de diversidad entre dos bibliotecas pre seleccionadas que comparten la misma vacuna y el mismo antecedente genético.

Varias selecciones independientes son realizadas en TT recubierto en inmunotubos . Las variables que pueden ser incluidas son seleccionadas usando antígenos bioestañados en solución o selecciones en TT capturado. En base al número y diversidad de clones positivos a ELISA obtenidos en las primeras selecciones, se hacen decisiones en vueltas adicionales de selección. Los clones son considerados positivos cuando >3x positivo sobre un clon de control negativo. Los clones positivos son analizados por ELISA contra un panel de antígenos de control negativos para verificar la especificidad de antígeno. La ayuda es para identificar por lo menos 40 regiones VH únicas, como base en secuencias CDR3 únicas y redisposiciones VHDJH.

La amplificación del material ADNc a partir de células B clasificadas positivas a CK de rata es realizado con un cebador cadena delante de PCR específicas a la secuencia líder humana y un cebador inverso de PCR específico a la secuencia CK de rata, en una región no redundante con la secuencia CK de ratón, como se reporta en un estudio reciente (Brady et al., 2006, JIM, 315-61). Las combinaciones de cebador y temperaturas de templado son primeramente probadas en ADNc a partir de las células HEK-293T transfectadas con el vector 0817676_pSELECT_0815426=pSELECT con el cásete de ADN IGKV1-39 (ver el ejemplo 7) .

El producto de amplificación es clonado en el vector pret-1 y después de la transformación de azul XL1 , se secuencian 96 colonias para evaluar la frecuencia VLSHM por comparación directa a la secuencia de línea germinal VK 012 (IGKV1-39) . El método de proporción R/S, como se describe en el presente estudio en anticuerpos específicos a TT humanos (de Kruif et al., 209, J. Mol. Biol .. , 387:548) permite la discriminación entre las mutaciones aleatorias y mutaciones accionadas por antígeno que ocurren en las secuencias VL .

Ejemplo 18 Análisis Inmunofluorescente de poblaciones de células B en líneas de ratón transgénicas Este ejemplo describe el uso de anticuerpo y citometría de flujo para analizar poblaciones de células B en órganos linfoides primarios (médula ósea) y secundaria (bazo, peritoneal) y sangre. Los métodos y reactivos son descritos en Middendorp et al. (2002) J. Immunol . 168:2695 y Middendorp et al. (2004) J. Immunol. 172:1371. Para análisis de desarrollo temprano de células B en médula ósea, las células son teñidas superficialmente con combinaciones de anticuerpos (Becton Dickinson) específicos para B220, CD19, CD25, IgM, IgD, Ckappa de ratón, C lmabda de ratón y Ckappa de rata para detectar las células pro-B, células pre-Be, células pre-B grandes, células B inmaduras tempranas y tardías y recircular las poblaciones de células B que expresan el transgén en su superficie. Se incluye la tinción DAPI (Invitrogen) para excluir las células muertas a partir del análisis y bloque FC (Becton Dickinson) para inhibir la interacción de anticuerpo con receptores Fe en células mieloides. Para análisis de expresión de transgén superficial en poblaciones de células B en órganos linfoides periféricos y sangre, se tiñen las células con combinaciones de anticuerpos (Becton Dickinson) específico para B220, CD5, CD19, CD21, CD23, IgM,. IgD, Ckappa de ratón, Clambda de ratón y Ckappa de rata. La tinción DAPI es incluida para excluir células muertas a partir del análisis y bloque FC para inhibir la interacción de anticuerpo con receptores Fe en células mieloides. Además, se incluyen las combinaciones de anticuerpos (Becton Dickinson) específicos para CD3 , CD4 , CDllb, CDllc y NK1.1 para determinar si la expresión de transgén ocurre en tipos celulares fuera del compartimiento de células B.

Tres ratones heterocigotos para el transgén Ckappa de rata/IGKVl-39 humano y heterocigotos para el transgén CD19-Cre en un antecedente C57BL6 (HuVkl/CD ! 9-Cre) son analizados. Como controles para el análisis FACS, tres ratones de carnada del tipo silvestre para el transgén Ckappa rata/IGKVl-39 humano y heterocigoto para el transgén CD19-Cre en un antecedente C57BL6 (CD19-Cre) y dos ratones C57BL6/nATC ( t) son incluidos. Todos los animales son permitidos para aclimatarse en la instalación animal por una semana antes del análisis y todos los ratones son machos y de 6 semanas de edad. Los linfocitos son aislados de los fémures, bazos, cavidad peritoneal y sangre de ratón usando técnicas convencionales como se describe previamente (Middendorp et al. (2002) J. Immunol. 168:2695 y Middendorp et al. (2004) J. Immunol . 172:1371). Los anticuerpos son precombinados como se muestra en la Tabla 10 y se realiza la tinción en placas de 96 pozos. La incubación con C kappa anti-rata conjugado a Pe (descrito anteriormente) se realiza antes de la tinción con los anticuerpos anti-murino de rata para evitar el enlace no específico. Después de la terminación de tinción celular, las células etiquetadas son analizadas en una máquina Becton Dickinson LSR II ACS y los datos adquiridos son analizados con software FlowJo (v6.5.7).

Los ratones transgénicos son similares en peso, apariencia y actividad a ratones del tipo silvestre. Ninguna alteración anatómica gruesa se observa durante la cosecha de tejidos. No se observa diferencia en los números de células B en la médula ósea (BM por sus siglas en inglés) y bazo (Tabla 11) o en los números de células B, las células T y células mieloides en órganos periféricos entre ratones transgénicos y del tipo silvestre. Además, la frecuencia o proporción de las células en las trayectorias de desarrollo de linfocitos diferentes no es alterado en ratones transgénicos cuando se compara con los ratones del tipo silvestre. De esta forma en el linfoide de los ratones transgénicos dobles (HuVkl/CD19-Cre) y transgénicos (CD19-Cre) y en forma más importante en el desarrollo de las células B es indistinguible a partir de los ratones del tipo silvestre.

En los órganos linfoides periféricos, la tinción con el anticuerpo específico a transgén (anti rata Ckappa-PE) es solamente observado en las poblaciones de células B. Las células T, células mieloides y poblaciones de células NK son todas negativas para expresión superficial del transgén en el bazo (Figura 23) . En contraste, en las células teñidas con los marcadores de células B pan B220 y CD19 todas las células son cambiadas a la derecha en la gráfica FCAS indicando la expresión de superficie celular del transgén (Figura 24) . Una tinción específica a transgén similar es medida en células CD5+B1 del peritoneo, una población distinta de desarrollo de las células B (Figura 25) .

La diferenciación de las células B a partir de precursores multilinaje para células B maduras ocurre en la médula ósea. En los linfocitos analizados a partir de la médula ósea, la expresión extracelular y de transgén no es detectable en los progenitores de células B más tempranos la células pro y pre B consistentes con el patrón de expresión de cadena ligera normal (Figuras 26A y 26B) . La expresión de transgén llega a ser primero detectable en células B inmaduras, la etapa de desarrollo en la cual la cadena ligera de murino de línea germinal sufre de redisposición y es expresada en la superficie celular en el contexto de la cadena pesada preseleccionada (Figuras 26A y 26B) . Consistente con la tinción en la expresión de cadena ligera transgénica de bazo es también detectada en células B recirculantes maduras (Figuras 26) . De esta forma la expresión accionada por CD19-Cre del transgén es consistente con el patrón normal de expresión de cadena ligera. La tinción con el anticuerpo específico a cadena ligera endógeno es más intensa que aquella del anticuerpo de cadena ligera específica a transgén. Esto puede indicar un nivel de expresión superior de la cadena ligera endógena, una tinción más sensible con el anticuerpo específico a cadena ligera endógena o una combinación de ambos. En forma importante, la intensidad de la expresión superficial de la cadena ligera transgénica es correlacionada con tanto la cadena ligera endógena y la expresión superficial de IgM como se observa en la tinción de células B circulantes en la sangre (Figura 27) .

De esta forma todo este análisis demuestra que la expresión del transgén IGKVl-39/Ckappa humano es restringido al compartimiento de células B y la regulación temporal de su expresión es similar a cadenas ligeras kappa endógenas que resultan en desarrollo normal de todas las poblaciones de células B. El nivel inferior aparente de expresión del transgén puede ser explicado por la concentración del promotor en comparación con el promotor y mejoradores presentes en los genes de cadena ligera endógena o por un retraso en la expresión del transgén que da a las cadenas ligeras endógenas una ventaja competitiva para formar pareja con la cadena pesada redispuesta. Esto es consistente con la observación que ya que las células B maduran la intensidad relativa del transgén la tinción se incrementa comparado con las cadenas ligeras endógenas. Además, la observación que los númros de las células B son normales y que cada superficie Ig+B celular coexpresa una cadena ligera endógena y transgénica soporta la conclusión que la región variable IGKV1-39 es capaz de formar pares con un repertorio normal de regiones variables de cadena pesada de murino diferentes. Se concluye en la presente a partir de este análisis que la inserción del transgén IGKVl-39/Ckappa de rata accionado por CD19-Cre activa el promotor CAGGS en las instalaciones de locus Rosa a tiempo y la expresión específica de células B del transgén y que el transgén es capaz de formar pares con un repertorio normal de cadenas pesadas de murino.

Ejemplo 19 Perfil de epitpo de células T Epibase® para IGKV1-39 La secuencia de proteína de IGKV1-39 (Figura 12, proteína IGKV1-39/J de línea germinal humana) es escaneada para la presencia de epítopos restringidos de la clase II HLA putativos, también conocidos como TH epítopos. Para esto, se aplica la plataforma Algonomics 'Epibase® a iGKVl-39. En resumen, la plataforma analiza las especificadades de enlace de Hla de todos los péptidos 10-mer posibles derivados de una secuencia objtivo (desmet et al. Nature 1992, 356:539-542; Desmet et al. FASEB J. 1997, 11:164-172; Desmet et al. Proteins 2002, 48:31-43; Desmet et al. Proteins 2005, 58:53-69) . El perfil es hecho en el nivel de alotipo para 20 DRB1, 7 DRB3/4/5, 13DQ y 7DP, es decir 47 receptores de la clase II HLA en total (ver la taba 5) . Epibase® calculca un estimado cuantitativo de la energía libre de enlace AGbind de un pépido para cada uno de los 47 receptores de la clase II HLA. Estos datos son entonces además procesados como a continuación: • se convierten las energías libres en valores Kd a AGbind=RT In (kd) .

• Los péptidos son clasificados como fuerte (S) , medio (M) , débil y no enlazadores (N) . Los siguiente cortes son aplicados: S: enlazador fuerte: Kd<0.1 µ? M: enlazador medio: 0.1 µ? < Kd < 0.8 µ? N: enlazador débil y no enlazador. 0.8 |1 < Kd. • péptidos que corresponden a auto péptidos son tratados separadamente. La lista de auto-peptidos es tomada de 293 secuencias de línea germinal de anticuerpo. Son referidos como péptidos "filtrados de línea germinal" .

Los péptidos S y M son mapeados en la secuencia objetivo en los así llamados epítopos; las afinidades S son graficadas cuantitativamente; los valores M son presentados cualitativamente. Como un resumen general de los resultados. La tabla 6 enlista el número de enlazadores fuertes y medios en las proteínas analizadas, para los grupos de los receptores de la clase II HLA que corresponden a los genes DRB1, DQ, DP y DRB3/4/5. La cuenta es hecha separadamente para enlazadores de afinidad fuerte y media. Los péptidos que enlazan a alotipos múltiples del mismo grupo son contados como uno. Los valores entre paréntesis se refieren a péptidos filtrados de línea germinal. En la tabla 7, la secuencia es mostrada en un formato adecuado para trabajo experimental. La secuencia es rota en 15-mers consecutivos que traslapan por 12 residuos. Para cada 15mer, se en lista la promiscuidad (el número de alotipos fuera de un tota de 47 para el cual el 15-mer contiene un nlazador crítico) , así como también los serotipos implicados. El perfil Epibase® y los mapas de epítopos son mostrados en la Figura 16 y 17.

Se concluye que IGKV1-39 no contiene auto enlazadores DRBl no fuertes. Típicamente, significativamente más enlazadores son encontrados para DRBl que para otros genes HLA. Esto está en acuerdo con evidencia experimental que los alotipos que pertenecen al grupo DRBl son enlazadores de péptido más potentes. Los epítopos fuertes medios para alotipos DRBl son esperados para contribuir a la respuesta de población, y no puedes ser descartados. Otra vez, no se encuentran no autoenlazadores DRBl en IGKV1-39.

En la respuesta humoral originada contra un antígeno, la activación/proliferación de células TH es generalmente interpretada en términos de la especificidad DRBl. Sin embargo, uno no puede ignorar la posible contribución de los genes DRB3/4/5, DQ y DP. Dados los niveles de expresión inferior de estos genes como se compara con DRB1, el foco está en la clase de epítopos fuertes para DRB3/4/5, DQ y DP . Los "epítopos críticos" son aquellos epítopos que son enlazadores fuertes para DRB1. IGKV1-39 contiene no autoenlazadores no fuertes o medios para DRB3/4/5, DQ o DP .

Está también presente un número de péptidos en las secuencias de línea germinal (valores entre paréntesis en la Tabla 6) . Los péptidos pueden enlazar muy bien a HLA pero son asumidos para ser auto, y por lo tanto no inmunogénicos . En total, 6 enlazadores DRB1 filtrados por línea germinal fuertes y 16 medios son encontrados en la región de cuadro 1 IGKV1-30 hasta que la región de cuadro 3 es un acoplamiento exacto para el segmento VK1 2-1- (1) 012 de segmento V de línea germinal (Vbase) , a.k.a. La región de cuadro IGKV1-39*01 (IMGT) es un acoplamiento exacto para el segmento J de línea germinal JK1 (V-base) a.k.a. IGKJ1*01 (IMGT) . Es duramente sorprendente que estos segmentos no contienen ningún no auto epítopo.

Ejemplo 20 Características de Producción de IGKV1-39 Hay una gran demanda para plataformas de descubrimiento de anticuerpo que produzcan anticuerpos terapéuticos que sean estables termodinámicamente y den buenos rendimientos de expresión. Estas características son importantes en asegurar la estabilidad de la substancia de fármacos durante la producción y después de la inyección del producto de fármaco en el paciente. Además buenos rendimientos de expresión impactan directamente en el costo de fabricación de fármacos y de esta forma el precio, acceso del paciente y beneficios. Virtualmente todos los anticuerpos terapéuticos en uso clínico ahora están compuestos de IgGl humana y regiones constantes kappa pero usan diferentes regiones variables de cadena pesada y ligera que confieren especificidad. Los dominios de cadena pesada y ligera variables humanos pueden ser divididos en familias que tienen más de 80% de divergencia de secuencia. Cuando los ejemplos redispuestos de estas familias en configuración de línea germinal están combinados y comparados para estabilidad y rendimiento es claro que las familias de genes no son iguales en términos de propiedades biofísicas. En particular VH3 , VH.l y VH5 tienen estabilidad favorable para las cadenas pesadas y Vkl y VK3 tienen la mejor estabilidad y rendimiento de las cadenas ligeras. Además cuando se introducen las mutaciones como parte del proceso de hipermutación somática pueden interferir con emparejamiento de VH/VL. Para evaluar el efecto que diferentes genes de cadena ligera con diferentes proporciones de mutación tienen en las características de producción de una cadena VH fija, se construye una biblioteca de exhibición de fagos Fab de cadenas ligeras (kappa y lambda) a partir de seis donadores saludables naive combinados con un panel de 44 cadenas pesadas de enlace a TT a partir de donadores inmunizados. Después de una vuelta de selección los clones Fab de enlace a TT son aislados. Varios de estos comparten el mismo gen VH como el clon PG1433 TT en combinación con diferentes cadenas ligeras. Los fragmentos de cadena ligera Fab son reclonados en un vector de expresión kappa y transíectados en combinación con ADN que codifica la cadena pesada de PG1433 en las 293 células y producción específica de IgG medida por ELISA. Como se demuestra en la tabla 8 los clones seleccionados que contienen PG1433 VH combinados con diferentes cadenas ligeras tienen entre 5 y 10 veces la expresión menor de proteína PG1433 VH combinada con IGKV1-39. Notar que todas las cadenas ligeras contienen mutaciones de aminoácidos dentro de sus regiones de codificación que pueden alterar el emparejamiento VH y reducir la estabilidad de producción. De esta forma, además de reducir los cambios de inmunogenicidad no deseada, se espera que el uso de la cadena ligera IGKV1-39 sin mutaciones contribuya a la estabilidad de producción mejorada y rendimientos de varios genes VH que contribuyen a la especificidad. En efecto los clones estables generados por la transfección de diferentes genes VH todos formar pares con IGKV1-39 son capaces de ser pasados extensivamente y todavía retienen las características de producción robusta como se muestra en la tabla 9.

Ejemplo 21 Generación de ratones que expresan regiones VH y VL totalmente humanas Los ratones transgénicos de acuerdo a la invención son cruzados con ratones que ya contienen un locus VH humano. Ejemplos de ratones apropiados que comprenden el locus VH humano son descritos en Taylor et al. (1992). Nucleic Acids Res 20: 6287-95; Lonberg et al. (1994). Nature 368: 856-9; Green et al. (1994). Nat Genet 7: 13-21; Dechiara et al. (2009). Methods Mol Biol 530: 311-24.).

Después de cruzar y seleccionar los ratones que son menos heterocigotos para el transgén IGKV1-39 y el locus VH humano, los ratones seleccionados son inmunizados con un objetivo. Los genes VH son cosechados como se describe anteriormente en la presente. Este método tiene la ventaja que los genes VH son ya totalmente humanos y de esta forma no requieren humanización.

Ejemplo 22 Aislamiento, caracterización, formateo de oligoclónicos y producción de anticuerpos que objetivan IL6 humano para tratamiento de enfermedades inflamatorias crónicas como la artritis reumatoide.

Un repertorio VH de bazo a partir de ratones transgénicos que son inmunizados con IL6 recombinante humano es clonado en un vector Fab de exhibición de fagos con una cadena ligera C-kappa IG V1-39 humano sencillo (idéntico al transgén de ratón) y sometido a apelmazado contra el inmunogen IL6 humano. Los clones que son obtenidos después de dos a cuatro vueltas de apelmazado son analizados para su especificidad a enlace. Los genes VH que codifican los fragmentos Fab específicos a IL6 son sometidos a análisis de secuencia para identificar clones únicos y asignar utilización de VH, DH y JH. Los fragmentos Fab son reformateados como moléculas IgGl y expresados temporalmente. Los clones únicos son entonces agrupados en base a no competición en ensayos de enlace y sometidos a afinidad y análisis funcional. Los mAb IgGl anti-IL6 más potentes son subsecuentemente expresados como combinaciones de dos, tres, cuatro o cinco cadenas pesadas que comprenden diferentes regiones VH en el formato de oligoclónicos , junto con una cadena ligera kappa en base a IGKV1-39-C y probados in vitro para formación de complejo con IL-6.Los oligoclónicos son también probados in vivo para claridad de IL-7 humano a partir de ratones. Se elige un oligoclónico con la actividad de claridad más potente y los genes VH de murino humanizados de acuerdo a los métodos convencionales . IgGl humanizado son transíectados en una línea celular de mamífero para generar un clon estable. Un subclon óptimo es seleccionado para la generación de un banco de células maestras y la generación de material de prueba clínica.

Muchos de los protocolos descritos en la presente son protocolos estándar para la construcción de bibliotecas de exhibición de fagos y el apelmazado de fagos para enlace a un antígeno de interés y son descritos, por ejemplo, en Antibody Phage Display: Methods and Protocols. 2002. Editor(s): Philippa M. O'Brien, Robert Aitken. Humana Press, Totowa, New Jersey, USA.

Inmunizaciones Los ratones transgénicos reciben tres inmunizaciones con IL6 humano cada dos semanas usando el adyuvante Sigma titerMax de acuerdo a las instrucciones del fabricante .

Aislamiento de ARN y síntesis de ADNc Tres días después de la última inmunización, se remueven los bazos y nudos linfáticos a partir de los ratones y se pasan a través de un filtro de 70 mieras en un tubo el cual contiene PBS pH 7.4 para generar una suspensión de células sencilla. Después del lavado y granulación de linfocitos, las células son suspendidas en reactivo TRIzol LS (Invitrogen) para el aislamiento de ARN total de acuerdo al protocolo del fabricante y sometido a reacción de transcripción inversa usando 1 microgramo de ARN, Superscript III RT en combinación con dT20 de acuerdo a los procedimientos del fabricante (Invitrogen) .

Se realiza la generación de bibliotecas de exhibición de fagos Fab como se describe en el ejemplo 2.

Selección de Fagos en Inmunotubos Recubiertos IL6 recombinante humano es disuelto en PBS en una concentración de 5 µg/ml y recubierto para MaxiSorp Nunc-Immuno Tube (Nunc 444474) durante la noche en 4°C. Después de descargar la solución recubierta, los tubos son bloqueados con 2% de leche descremada (ELK) en PBS (amortiguador de bloqeuo) por 1 hora en temperatura ambiente (RT) . En paralelo, 0.5 mi de la biblioteca de fagos se mezcla con 1 mi de amortiguador de bloqueo y se incuba por 20 minutos en temperatura ambiente. Después de bloquear los fagos, se agrega la solución de fagos a los tubos recubiertos IL6 y se incuban por 2 horas en RT en una plataforma de rotación lentamente para permitir el enlace. Después, los tubos son lavados 10 veces con PBS/0.05% Tween-20 seguido por la elusión de fagos por incubación con 1 mi de 50 mM de glicina-HCl pH 2.2 10 minutos en RT en rueda de rotación y directamente seguido por neutralización del eluyente cosechado con 0.5 mi 1 M de Tris-HCl pH 7.5.

Cosecha de Clones de Fagos Se agrega 5 mi de cultivo XLl-Blue MRF (Stratagene) en O.D. 0.4 a la solución de fagos cosechada y se incuba por 30 minutos en 37°C sin agitación para permitir la infección de los fagos. Las bacterias son colocadas en placas en placas de en Carbenicilina/tetraciclina 4% de glucosa 2*TY y se hacen crecer durante la noche en 37°C.

Producción de Fagos Los fagos se hacen crecer y se procesan como se describe por Kramer et al. 2003 (Kramer et al. 2003, Nucleic. Acids Res. 31(11) : e59) usando VCSM13 como una cepa de fagos auxiliadora.

ELISA de Fagos Se recubren las placas de ELISA con 100 microlitros de IL6 humana recombinante por pozo en una concentración de 2.5 microgramos/ml en PBS durante la noche en 4°C. Las placas recubiertas con 100 microlitros de t iroglobulina en una concentración de 2 microgramos/ml en PBS son usadas como un control negativo. Los pozos son vaciados, secados por golpes en toalla de papel, llenados completamente con PBS-4% de leche descremada (ELK) y se incuban por 1 hora en temperatura ambiente para bloquear los pozos. Después de descargar la solución de bloques, las minipreparaciones de fagos premezcladas con 50 µ? de solución de bloqueo son agregadas e incubadas por 1 hora en RT . Los fagos no enlazados son subsecuentemente removidos por 5 etapas de lavado con PBS-0.05% de T een-20. Los fagos enlazados son detectados por incubar los pozos con 100 microlitros de anticuerpo anti-M13-HRP conjugado (diluido 1/5000 en amortiguador de bloqueo) por 1 hora en temperatura ambiente. El anticuerpo libre es removido al repetir las etapas de lavado como se describe anteriormente, seguido por incubación del substrato TMB hasta que es visible un desarrollo de color. Se detiene la reacción por agregar 100 microlitros de 2M H2S04 por pozo y se analiza en un lector ELISA en 450 nm de longitud de onda de emisión.

Secuenciación Los clones que dan señales por lo menos 3 veces arriba de la señal antecedente son · propagados , usados para procedimientos miniprep de ADN (ver los procedimientos Qiagen miniPrep manual) y sometidos a análisis de secuencia de nucleótidos. La secuenciación es realizada de acuerdo a un manual anexado al kit Big Dye 1.1 (Applied Biosystems) usando un cebador inverso (CHl_Revl, tabla 1) que reconoce una secuencia 5' de la región CH1 de la cadena pesada IgGl humana (presente en el vector de exhibición de Fab MV1043, figuras 3 y 12) . Las secuencias de las regiones VH de murino son analizadas para diversidad de segmentos de gen DH y JD Construcción y Expresión de IgGl Quimérico Se genera el vector MV1057 (Figuras 12 y 22) por clonación del fragmento de cadena L de transgén (IGKV1-39) en un derivado de vector pcDNA3000Neo (Crucell, Leiden, Países Bajos) que contienen las regiones constantes kappa y IgGl humanas. Las regiones VH son clonadas en MV1057 y se verifican las secuencias de nucleótidos para todas las construcciones de acuerdo a técnicas estándar. Las construcciones resultantes son expresadas temporalmente en células HEK293T y los sobrenadantes que contienen IgGl quiméricos son obtenidos y purificados usando procedimientos estándar como se describe antes (Throsby, M . 2006. J Virol 80: 6982-92) .

Análisis de Enlace y Competición de IgGl Los anticuerpos IgGl son titulados en ELISA, usando placas recubiertas de IL6 como se describe anteriormente y un conjugado de peroxidasa IgG antihumano. Los ELISA de competición para agrupar anticuerpos en base a reconocimiento de epítopo son realizados por incubar los fagos Fag junto con IgGl o con anticuerpos comerciales contra IL6 (por ejemplo Abcam Cat . No. ab9324) en placas recubiertas con IL6, seguido por detección de fagos Fab enlazado usando un conjugado de peroxidasa anti-M13.

Mediciones de Afinidad IgGl Las afinidades de los anticuerpos a IL6 son determinadas con el protocolo cinético cuantitativo en Octet (ForteBio) . Los anticuerpos son capturados en un biosensor de captura IgG Fe anti humano y expuestos a IL6 libre y analizados usando el software de. marca registrada para calcular el Kd de cada anticuerpo.

Actividad Funcional de los Anticuerpos IL6 Para probar la capacidad de los anticuerpos seleccionados para inhibir el enlace entre IL6 y el receptor de IL6 (IL6R) , se usa un ensayo a base de ELISA. Se mezclan varias concentraciones de anticuerpo con una concentración fija (10 ng/ml) de IL6 bioestañado como se describe por Naoko et al. 2007, Can. Res. 67:817-875. El complejo inmunológico de anticuerpo IL6 es agregado a IL6R inmovilizado. El enlace de IL6 bioestañado a IL6R es detectado con estreptavidina conjugada a peroxidasa de rábano. La reducción de la señal de ELISA es una medición de inhibición. Como control positivo para inhibición de enlace entre IL6 y IL6R se usa ya sea anticuerpo anti-IL6R (Abcam cat . No. ab34351; clon B-R6) o anticuerpo anti IL6 (Abcam cat. No. ab9324) .

Se mide la actividad de bloqueo in vitro de los anticuerpos anti-IL6 seleccionados en un ensayo de proliferación usando la línea celular 7TD1 dependiente a IL6. Brevemente, se incuban las células con diferentes concentraciones de IL6 humano con o sin el anticuerpo anti-IL6. La cantidad disponible de IL6 determina el grado de proliferación. De esta forma si un anticuerpo agregado bloquea el enlace IL6 se reduce la lectura de proliferación comparada con un control de anticuerpo no enlace. Se mide la proliferación por la incorporación de 5 -bromo- 2 ' -deoxi -uridina (BrdU) en el ADN usando el kit de proliferación BrdU (Roche no. de cat . 11444611001) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Generación de oligoclónicos anti-IL6 Los anticuerpos anti-IL6 más potentes son seleccionados de cada grupo de epítopo. Las construcciones de expresión que expresan estos anticuerpos son transfectados en células HEK293T en grupos no competitivos de tres en diferentes proporciones (1:1:1; 3:1:1; 1:3:1; 1:1:3; 3:3:1; 1:3:3; 3:1:3; 10:1:1; 1:10:1, 1:1:10; 10:10:1; 1:10:10; 10:1:10; 3:10:1; 10:3:1, 1:10:3; 3:1:10; 10:1:3; 1:3:10) . Los anticuerpos que contienen anticuerpo son cosechados y purificados y caracterizados como anteriormente .

Formación de complejo y aclareado in vivo de oliglocónicos anti-IL6 Para medir la capacidad de los oligoclónicos anti-IL6 para formar complejos inmunológicos y analizar estos complejos se usa la cromatografía de exclusión de tamaño (SEC por sus siglas en inglés) de acuerdo al procedimiento descrito por Min-Soo Kim et al. (2007) JMB 374: 1374-1388 para caracterizar los complejos inmunológicos formados con diferentes anticuerpos para TNFa. Diferentes proporciones molares de los oligoclónicos anti-IL6 son mezclados con IL6 humano e incubados por 20 horas en 4°C ó 25°C. Se analiza la mezcla en un sistema HPLC fijo con una columna de exclusión de tamaño; diferentes tiempos de elusión están correlacionados al peso molecular usando estándares de peso molecular. La capacidad de los anticuerpos para formar complejos con IL6 está correlacionada con su capacidad para aclarar rápidamente la citosina a partir de la circulación in vivo. Esto se confirma por medir el aclarado de IL6 radioetiquetado a partir de los ratones. Brevemente, se obtienen ratones hembra, de 6 a 8 semanas de edad Balb/c y 18 horas antes del experimento, se inyectan los animales intravenosamente (IV) por medio de la vena de la cola lateral con diferentes dosis de oligoclónicos anti-IL-6 purificados. En el día 0 los ratones son inyectados IV con 50 microlitros de IL-6 radioetiquetado (lxlOE7 cpm/ml) bajo las mismas condiciones. Las muestras de sangre (aproximadamente 50 microlitros) son recolectadas en varios intervalos de tiempo y almacenados en 4°C. Las muestras son centrifugadas por 5 minutos en 4000 xg y se determina la radioactividad del suero. Todos los experimentos farmacocinét icos son realizados simultáneamente con tres animales para cada tratamiento.

Generación de Clones Estables Oligoclónicos anti-IL6 y Desarrollo Preclínico Un oligoclónico anti-IL6 de derivación se selecciona en base a la potencia in vitro e in vivo como se determina anteriormente. Los genes VH de murino son humanizados de acuerdo a los métodos estándar y combinados con la cadena ligera IGKV1-39 totalmente humana en un vector de expresión como se describe anteriormente. Ejemplos de métodos de humanización incluyen aquellos basados en paradigmas como la renovación (Padlan, E. A., et a. (1991) . Mol. Immunol . 28, 489), superhumanización (Tan, P.( D. A., et al., (2002) J. Immunol. 169, 1119), optimización de contenido de cuerda humana (Lazar, G. A., et al., (2007) . Mol. Immunol., 44, 1986) . Las tres construcciones son transfectadas en células PER.C6 en la proporción óptima predeterminada (descrita anteriormente) bajo la presión selectiva de G418 de acuerdo a los métodos estándar. Un clon oligoclónico anti-IL6 de alta producción estable se selecciona y un banco de células maestra de desarrollo y calificado es generado.

Tabla 1 Lista de cebadores D0- cebador Secuencia 0012 CHl_Revl TGCCAGGGGGAAGACCGATG 0656 MVH-1 GCCGGCCATGGCCGAGGTRMAGCTTCAGGAGTCAGGAC 0657 MVH-2 GCCGGCCATGGCCGAGGTSCAGCTKCAGCAGTCAGGAC 0658 MVH-3 GCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGAAGSASTCAGG 0659 MVH-4 GCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTTCAGGAGTCSGGAC 0660 MVH-5 GCCGGCCATGGCCGARGTCCAGCTGCAACAGTCYGGAC 0661 MVH-6 GCCGGCCATGGCCCAGGTCCAGCTKCAGCAATCTGG 0662 MVH-7 GCCGGCCATGGCCCAGSTBCAGCTGCAGCAGTCTGG 0663 MVH-8 GCCGGCCATGGCCCAGGTYCAGCTGCAGCAGTCTGGRC 0664 MVH-9 GCCGGCCATGGCCCAGGTYCAGCTYCAGCAGTCTTGG 0665 MVH-10 GCCGGCCATGGCCGAGGTCCARCTCAACAATCTGGACC 0666 MVH-11 GCCGGCCATGGCCCAGGTCCACGTGAAGCAGTCTGGG 0667 MVH-12 GCCGGCCATGGCCGAGGTGAASSTGGTGGAATCTG 0668 MVH-13 GCCGGCCATGGCCGAVGTGAAGYTGGTGGAGTCTG 0669 MVH-14 GCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGSKGGTGGAGTCTGGGG 0670 MVH-15 GCCGGCCATGGCCGAKGTGCAMCTGGTGGAGTCTGGG 0671 MVH-16 GCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGCTGATGGARTCTGG 0672 MVH-17 GCCGGCCATGGCCGAGGTGCARCTTGTTGAGTCTGGTG 0673 MVH-18 GCCGGCCATGGCCGARGTRAAGCTTCTCGAGTCTGGA 0674 MVH-19 GCCGGCCATGGCCGAAGTGAARSTTGAGGAGTCTGG 0675 MVH-20 GCCGGCCATGGCCGAAGTGATGCTGGTGGAGTCTGGGG 0676 MVH-21 GCCGGCCATGGCCCAGGTTACTCTRAAAGWGTSTGGCC DO- cebador Secuencia 0677 VH-22 GCCGGCCATGGCCCAGGTCCAACTVCAGCARCCTGG 0678 MVH-23 GCCGGCCATGGCCCAGGTYCARCTGCAGCAGTCTG 0679 MVH-24 GCCGGCCATGGCCGATGTGAACTTGGAAGTGTCTGG 0680 MVH-25 GCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGGTCATCGAGTCTGG 0681 ExtMVH-1 CAGTCACAGATCCTCGCGAATTGGCCCAGCCGGCCATGGCCSANG 0682 ExtMVH-2 CAGTCACAGATCCTCGCGAATTGGCCCAGCCGGCCATGGCCSA G 0683 JH-Revl GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC GGTGACC GTGG 0684 MJH-Rev2 GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC TGTGAGA GTGG 0685 MJH-Rev3 GGGGGTGTCGTTTTGGCTGCAGAGAC AGTGACC AGAG 0686 MJH-Rev4 GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC GGTGACT GAGG 0687 ExtMJH- GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC GGTGACC GTGG 0688 ExtMJH- GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC GGTGACA GTGG 0690 ExtMJH- GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC GGTGACC AGAG 0691 ExtMJH- GGGGGTGTCGTTTTGGCTGAGGAGAC GGTGACC GAGG TABLA 2 Niveles de señal de ELISA de fagos como se mide en 450 nm. Las placas recubiertas con TT representan placas que son recubiertas con toxoide tetánico. Las placas recubiertas con tiroglobulina son usadas como controles negativos. 10/10 y 15/15 indican el número de etapas de lavado con PBS-Tween durante los procedimientos de 5 apelmazado. Placas 10/10 toxoide tetánico y 10/10 tiroglobulina y placas de 15/15 toxoide tetánico y 15/15 tiroglobulina son duplicados a partir uno del otro excepto para el agente de recubrimiento. Los valores OD superiores a 3 veces el antecedentes son asumidos específicos. 10/10 lavados de Placa recubierta con TT 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0. 139 0 .093 0. 089 0. 121 0 .117 0 .598 0. 146 0. 115 0 .18 0.155 0 .543 0 .601 B 0. 136 0 .404 0. 159 0. 187 0 .489 0 .134 0. 216 0. 092 0. 222 0.108 0 .181 0 .484 C 0. 197 0 .526 0 .09 0. 213 0 .395 0 .155 0. 108 0 .12 0. 183 0.136 0 .092 0 .866 D 0. 143 0 .258 0. 101 0. 422 0 .088 0 .243 0. 485 0. 251 0. 304 0.198 0 .478 0 .091 E 0. 445 0 .169 0. 526 0. 481 0 .206 0 .285 0. 111 0. 119 0. 128 0.2 0 .118 0 .098 F 0. 237 0 .291 0. 594 0. 139 0 .206 0 .565 0. 543 0. 091 0. 136 0.227 0 .228 0 .099 G 0.459 0.102 0.152 0.659 0.203 0.452 0.152 0.133 0.094 0.102 0.375 0.098 H 0.341 0.623 0.745 0.415 0.682 0.527 0.655 0.114 0.258 0.284 0.685 0.113 15/15 lavados de placas recubiertas con TT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0.247 0.582 0.421 0.428 0.133 0.082 0.262 0.079 0.343 0.414 0.095 0.292 B 0.065 0.364 0.073 0.042 0.049 0.071 0.046 0.103 0.078 0.057 0.048 0.155 C 0.081 0.044 0.066 0.082 0.225 0.444 0.203 0.362 0.122 0.047 0.052 0.309 D 0.092 0.11 0.59 0.22 0.33 0.544 0.058 0.159 0.047 0.174 0.086 0.05 E 0.469 0.577 0.206 0.304 0.13 0.749 0.431 0.062 0.167 0.049 0.056 0.049 F 0.846 0.07 0.561 0.656 0.882 0.094 0.383 0.13 0.152 0.098 0.134 0.048 G 0.537 0.052 0.49 0.150 0.337 0.193 0.514 0.294 0.068 0.35 0.525 0.05 H 0.061 0.306 0.157 0.853 0.054 0.534 0.102 0.235 0.441 0.412 0.565 0.061 10/10 Lavados de Flaca Recubierta de tiroglobulina 10 11 12 CN 00 o LO ID CN LO 00 00 00 i r\I o O o o o o O o o H O o o o o o O o o o o o O o o o o o o co LD H s? LD LO H r- m oo in LO LO f- n Lfl o o o o o s O o H o o o O o o o o o o o o o O o o o o o o o o o o o o o o O o o o o o o o o CN CN C LO LO LD LO CN Lfl r- CN 00 LO LO LD «i LO O o o o o o O o 00 o o o o o o o O o o o o o O o o o o o o o o CQ U Q W fu O CQ U P W fu Ü H 0.057 0.05 0.046 0.045 0.047 0.049 0.047 0.047 0.046 0.047 0.53 0.048 TABLA 3 Análisis de secuencia de proteína de enlazadores de toxoide tetánico positivo a ELISA. Se indica la secuencia CDR3, longitud CDR3 , miembros de la familia VH y nombre específico, origen JH y origen DH de los clones TABLA 4 Combinaciones de vectores que son transfectados a HEK293T TABLA 5 Alotipos HLA considerados en perfil de TH-epítopo. Los serotipos correspondientes son mostrados, así como también las frecuencias de alotipo en la población caucásica (Klitz et al. Tissue Antigens 2003, 62:296-307; Gjertson and Terasake (eds) en HLA 1997; Gjertson and Terasake (eds) en: HLA, 1998; Castelli et al. J. Immunol. 2002, 169:6928-6934). Las frecuencias pueden agregarse hasta más de 100% ya que cada individuo tiene 2 alelos para cada gen. Si todas las frecuencias de alelos de un solo gen son conocidas, pueden agregarse hasta ligeramente menos de 200% debido a los individuos homocigotos.

Tipo HLA Serotipo % Tipo HLA Serotipo % DRB1*0101 DR1 17.4 DRB4*0103 DR53 21 DRB1*0102 DR1 4.9 DRB5*0101 DR51 15.8 DRB1*0301 DR17 (3) 21.2 DRB5*0202 DR51 5.7 DRB1*0401 DR4 11.3 DQA1*0101/DQB1*0501 DQ5(1) 20.5 DRB1*0402 DR4 3.1 DQA1*0102/DQB1* 0502 DQ5 (1) 2.6 DRB1*0404 DR4 5.5 DQA1*0102/DQB1*0602 DQ6 (1) 26.5 DRB1*0405 DR4 2.2 DQA1*0102/DQB1*0604 DQ6(1) 6.7 DRB1*0407 DR4 <2 DQA1*0103/DQB1*0603 DQ6 (1) 11 DRB1*0701 DR7 23.4 DQA1*0104/DQB1*0503 DQ5 (1) 4 DRB1*0801 DR8 3.3 DQA1*0201/DQB1*0202 DQ2 20. 9 DRB1*0802 DR8 <2 DQA1*0201/DQB1*0303 DQ9(3) 7.2 DRB1*0901 DR9 <2 DQA1*0301/DQB1*0301 DQ7 (3) 12. 5 5 DRB1*1101 DR11 (5) 17 DQA1*0301/DQB1*0302 DQ(8) 18. 3 DRB1*1104 DR11 (5) 5.7 DQA1*0401/DQB1*0402 DQ4 4.5 DRB1*1201 DR12(5) 3.1 DQA1*0501/DQB1*0201 DQ2 24. 6 DRB1*/1301 DR13(6) 15.4 DQA1*0501/DQB1*0301 DQ7 (3) 20. 9 DRB1*1302 DR13(6) 10.8 DPA1*0301/DPB1*0201 DPw2 19. 9 10 DRB1*1401 DR14(6) 4.2 DPA1*0103/DPB1*0401 DPw4 65. 1 DRB1*1501 DR15(2) 13.2 DPA1*0103/DPB1*0402 DPw4 24. 3 DRB1*1601 DR16(2) 5.5 DPA1*0201/DPB1*0101 DPwl 6.3 DRB3*0101 DR52 24.6 DPA1*0201/DPB1*0301 DPw3 <2 DRB3*0202 DR52 43 DPA1*0201/DPB1*0501 DpW5 <2 15 DRB3*0301 DR52 10 DPA1*0201/DPB1*0901 - 2.4 DRB4*0101 DR53 25.5 Tabla 6. Las cuentas de epítopos TH para IGKV1-39. Los péptidos que enlazan a Hla múltiples del mismo grupo (DRB1, DRB3/4/5, DP, DQ) son contados como uno. Los valores entre paréntesis se refieren a péptidos filtrados por línea germinal DRB1 DRB3/4/5 DQ DP fuerte medio fuerte medio fuerte medio fuerte medio Merus 0(+6) 0(+16) 0(+0) 0(+5) 0(+3) 0(+9) 0( +0) 0 (+9) IGKV1-39 Tabla 7. Mapeo de predicciones de Epibase® para Merus IGKV1-39 en el formato de péptido de 15-mer clásico. Esta tabla muestra la cuenta de alotipo de epítopos críticos y serotipos implicados para cada uno de los 15-mer de extensión de la secuencia IGKV1-39 de Merus. 15mer Posición Secuencia 15-mer Cuenta Serotipos implicados de de inicio alotipo 1 1 DIQMTQGSPSSLSASV 6 DR1 , DR4 , DR7 , DR9 2 4 MTQSPSSLSASVGDR 5 DR1 , DR4 , DR9 3 7 SPSSLSASVGDRVTI 0 4 10 SLSASVGDRVTITCR 0 5 13 ASVGDRVTITCRASQ 0 6 16 GDRVTITCRASQSIS 2 DR11 (5) ,DR7 7 19 VTITCRASQSISSYL 4 DQ2 , DR11 ( 5 ) , DR4 , DR7 8 22 TCRASQSISSYLNWY 2 DQ2 , DR4 9 25 ASQSISSYLNWYQQK 5 DR13 (6) ,DR15 (2) , DR4 10 28 SISSYL WYQQKPGK 8 DR12 (5) ,DR13 (6) ,DR15 (2) ,DR16 (2) , DR4 , DR8 11 31 SYL YQQKPGXAPK 10 DR1,DR12 (5) ,DR16 (2) , DR4 , DR51 , DR8 12 34 NWYQQKPGKAPKLLI 9 DR1,DR15(2) , DR4 , DR51 , DR8 13 37 QQKPGKAPKLLIYAA 7 DQ4,DR1,DR11 (5) , DR15 (2) ,DR51.DR8 5 14 40 PGKAPKLLIYAASSL 7 DQ4,DR1,DR11 (5) , DR4 , DR8 DR1,DR11 (5) ,DR12 (5) , DR13 (6) ,DR14 (6) ,DR15 (2) 15 43 APKLLIYAASSLQSG 15 DR4 DR51,DR8,DR9 16 46 LLIYAASSLQSGVPS 15 DR1 , DR11 ( 5 ) , DR12 ( 5 ) , DR13 ( 6 ) , DR14 ( 6 ) , DR15 ( 2 ) 10 17 49 YAASSLGSGVPSRFS 1 DR4 18 52 SGLQSGVPSRFSGSG 1 DR51 , DR8 , DRP 19 55 QSGVPSRFSGSGSGT 0 DR15 (2) 20 58 VPSRFSGSGSGTDFT 0 DR15 (2) 21 61 RFSGSGSGTDFTLTI 0 15 22 64 GSGSGTDFTLTISSL 1 23 67 SGTDFTLTISSLQPE 4 24 70 DETLTISSLQPEDFA 4 DR52 25 73 LTISSLQPEDFATYY 1 DR4 , DR52 , DR7 , DR9 26 76 SSLQPEDFAYYCQQ 0 DQ2 , DR4 , DR7 , DR9 27 79 QPEDFATYYCQQSYS 1 DQ2 28 82 DFATYYCQQSYSTPP 5 29 85 TYYCQQBYSTPPTFG 4 DR4 30 88 CQQSYSTPPTFGQGT 0 DR4,DR51,DR7 31 91 SYSTPPFFGQGTKVE 0 DR4,DR51,DR7 32 94 TPPTFGQGTKVEIK 0 TABLA 8. El gen VH a partir de PG1433 que forma par con varios genes de cadena ligera con diferentes proporciones de mutación de aminoácidos son comparados para niveles de producción con el clon original que contiene el gen IGKVl-39 Tabla 9 Parámetros de estabilidad para clones estables que contienen el gen IGKV1-39 de línea germinal Tabla 10 Mezclas de Anticuerpos usados para tinción de poblaciones de linfocitos.

APC 5000 APC 3000 APC 3000 Bazo PP |APC-CY7 PC PE-Cy7 5000 PE-Cy7 3000 DAPI CD5* 320 00 B220Alex-700 160 00 Bloque FC 400 80 BM 6 57-64 IgMFITC 160 640 4.00 Rata PE Ckappa 160 4.00 CD19PerCP"Cy5 5 500 1.28 RatónBIO-pE-Cy7 Ckappa 100 1:50 PECy7 5000 10 Ratón610" PE"Cy7 Clambda 100 1:30 PECy7 3000 DAPI CD25* 80 8.00 ?220? 160 4.00 Bloque FC 400 I 1.60 15 Bazo de rata 7 144 RataPE Ckappa 160 80 0.5 Rata B220FITC 160 0.5 Tabla 11 Números de linfocitos cosechados a partir de la médula ósea y bazo ratones del tipo silvestre y transgénicos Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (42)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un mamífero no humano transgénico caracterizado porque comprende, por lo menos en su linaje de células B, un ácido nucleico el cual codifica por lo menos una cadena ligera o cadena pesada de inmunoglobulina, en donde la secuencia de codificación de cadena pesada o ligera se proporciona con un medio que la lleva a ser resistente a redisposiciones de ADN y/o hipermutaciones somáticas.

2. Un mamífero no humano tarnsgénico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es un roedor, preferentemente un ratón.

3. Un mamífero no humano transgénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque la secuencia de codificación de la cadena ligera/pesada está integrada en el genoma del mamífero no humano .

4. Un mamífero no humano transgénico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la integración está en un locus que es resistente a silenciación .

5. Un mamífero no humano transgénico de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la integración está en el locus Rosa.

6. Un mamífero no humano transgénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica la cadena ligera es proporcionado con un medio que permite la expresión del ácido nucleico esencialmente limitado a las células del linaje de células B.

7. Un mamífero no humano transgénico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica la cadena ligera es proporcionado con un medio que permite la expresión del ácido nucleico que codifica la cadena ligera predominantemente durante una cierta etapa del desarrollo de células B.

8. Un mamífero no humano transgénico de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el medio comprende un promotor seleccionado del grupo de CD19, CD20, µ??, VpreBl, VpreB2, VpreB3 , ?5 , Iga, IgP, KLC, h , y BSAP (Pax5) .

9. Un mamífero no humano transgénico de conformidad con la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque el medio comprende un sistema cre-lox o similares.

10. Un mamífero no humano, transgénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque la secuencia de codificación de cadena ligera codifica una cadena ligera capaz de formar pares con por lo menos dos cadenas pesadas diferentes codificadas por el mamífero no humano.

11. Un mamífero no humano, transgénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, caracterizado porque por lo menos uno de los loci endógenos que codifican una cadena ligera endógena es funcionalmente silenciada .

12. Un mamífero no humano, transgénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque el locus de cadena ligera ? endógeno es funcionalmente silenciado.

13. Un mamífero no humano transgénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, caracterizado porque la secuencia de la secuencia de codificación de cadena ligera es una secuencia VK humana.

14. Un mamífero no humano transgénico de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la secuencia de codificación de cadena ligera es una secuencia similar a línea germinal.

15. Un mamífero no humano transgénico de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la secuencia de codificación de cadena ligera es una secuencia de línea germinal.

16. Un mamífero no humano transgénico de conformidad con la reivindicación 15, caracteriazado porque la secuencia de línea germinal se basa en 012.

17. Un mamífero no humano transgénico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica la cadena ligera comprende en una dirección 5 '-3': un promotor Vk, un líder humano, un gen V humano, opcionalmente un mej orador ?????; una región constante de rata (?) y opcionalmente un mej orador MoEK3 (truncado) .

18. Un animal no humano, transgénico caracterizado porque ha sido proporcionado con un cásete de expresión para la expresión de una molécula proteinácea deseada en las células durante una cierta etapa de desarrollo en células que se desarrollan en células B maduras, el cásete que comprende: un medio para evitar la silenciación de expresión de la molécula proteinácea deseada después de la introducción en una célula hospedera, y un medio para expresión sincronizada de la molécula proteinácea deseada con la etapa de desarrollo deseada de la célula hospedera.

19. Un animal no humano, transgénico el cual ha sido proporcionado con un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el medio para expresión de sincronización es un promotor del cual la actividad es limitada esencialmente a cierta etapa de desarrollo.

20. Un animal no humano, transgénico el cual ha sido proporcionado con un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 18 ó 19, caracterizado porque la cierta etapa inicia en una etapa que precede inraediatemente o que coincide con el inicio de la expresión de las moléculas de cadena ligera por las células en una cierta etapa de desarrollo en una célula B madura.

21. Un animal no humano, transgénico el cual ha sido proporcionado con un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 10 ó 20, caracterizado porque el promotor se selecciona del grupo el cual consiste del promotor CD19, el promotor Ig-oc, el promotor Ig-ß, el promotor µ???, el promotor vk, o análogos y/u homólogos del mismo.

22. Un animal no humano, transgénico el cual ha sido proporcionado con un cásete de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19-21, caracterizado porque el promotor acciona la expresión de una proteína como ere .

23. Un animal no humano, transgénico el cual ha sido proporcionado con un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la secuencia que codifica la molécula proteinácea deseada es activada por la acción de la proteína similar a ere.

24. Un animal no humano, transgénico el cual ha sido proporcionado con un juego de ácidos nucleicos que son casetes de expresión, caracterizado porque un ácido nucleico comprende un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 22 y el segundo ácido nucleico comprende una secuencia que codifica una molécula proteinácea deseada bajo el control de un promotor constitutivo el cual puede ser activado por la acción de una proteína similar a ere.

25. Un animal no humano, transgénico el cual ha sido proporcionado con un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 23 ó 24, caracterizado porque se logra la activación por remoción de una "detención" .

26. Un animal no humano, transgénico el cual ha sido proporcionado con un cásete de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-25, caracterizado porque la molécula proteinácea deseada es una cadena de polipéptido de una inmunoglobulina .

27. Un animal no humano, transgénico, el cual ha sido proporcionado con un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la cadena de polipéptido es una cadena ligera.

28. Un animal no humano, transgénico el cual ha sido proporcionado con un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la secuencia que codifica la cadena de polipéptido es llevada a ser esencialmente incapaz de redisposición.

29. Un animal no humano, transgénico el cual ha sido proporcionado con un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 27 ó 28, caracterizado porque la cadena ligera es una cadena ligera como de línea germinal.

30. Un animal transgénico no humano el cual ha sido proporcionado con un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque la cadena ligera como de línea germinal es 012.

31. Un animal no humano, transgénico el cual ha sido proporcionado con un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 28-30, caracterizado porque la redisposición es evitada por la ausencia de elementos por lo menos parcialmente responsables por hipermutación somática como el mejorador MoEK.

32. Un animal no humano, transgénico el cual ha sido proporcionado con un cásete de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-31, caracterizado porque el medio para prevención de silenciación son medios para inserción en un locus en el genoma de la célula hospedera que es resistente a silenciación.

33. Un animal no humano, transgénico el cual ha sido proporcionado con un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el medio para inserción son medios para recombinación homologa en el sitio resistente a silenciación.

34. Un animal no humano, transgénico el cual ha sido proporcionado con un cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 32 ó 33, caracterizado porque el locus es el locus rosa.

35. Un animal no humano, transgénico el cual ha sido proporcionado con un cásete de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, caracterizado porque comprende en una dirección 5"-3": un promotor VK, un líder humano, un gen V humano, opcionalmente un mej orador MoEK3 ' (truncado) .

36. Un método para producir un anticuerpo deseado caracterizado porque comprende exponer un mamífero no humano de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-35 a un antígeno de tal forma que una respuesta de anticuerpo es inducida y aislar los anticuerpos específicos para el antígeno .

37. Un método para producir un anticuerpo deseado caracterizado porque comprende exponer un mamífero no humano de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36 a un antígeno de tal forma que se induce una respuesta de anticuerpo y aislar las células que producen los anticuerpos, cultivar y opcionalmente inmortalizar las células y cosechar los anticuerpos.

38. Un método para producir un anticuerpo deseado caracterizado porque comprende exponer un mamífero no humano de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-37 a un antígeno de tal forma que se induce una respuesta de anticuerpo y aislar un ácido nucleico que codifica por lo menos parte del anticuerpo, insertar el ácido nucleico o una copia o derivado del mismo en un cásete de expresión y expresar el anticuerpo en una célula hospedera.

39. La progenie de un animal no humano, transgénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizada porque comprende, por lo menos en su linaje de células B, una secuencia que codifica una cadena pesada o ligera junto con un medio que lleva la secuencia a ser resistente a redisposiciones de ADN y/o hipermutaciones somáticas.

40. La progenie de un animal no humano, transgénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-35, caracterizada porque comprende un cásete de expresión para la expresión de una molécula proteinácea deseada en células durante una cierta etapa del desarrollo en células que se desarrollan en células B maduras .

41. Una célula que es aislada a partir de un animal no humano, transgénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, caracterizada porque comprende una secuencia de codificación de cadena pesada o ligera junto con un medio que lleva a la secuencia a ser resistente a redisposiciones de ADN y/o hipermutaciones somáticas.

42. Una célula que es aislada a partir de un animal no humano, transgénico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18-35, caracterizada porque comprende un cásete de expresión para la expresión de una molécula proteinácea deseada en células durante una cierta etapa de desarrollo en células que se desarrollan en células B maduras .