TW202034952A - 用於治療疾病之CLEC12AxCD3雙特異性抗體及方法 - Google Patents

用於治療疾病之CLEC12AxCD3雙特異性抗體及方法 Download PDF

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Abstract

本發明係有關於用於治療一個體的CLEC12A陽性癌症之構件及方法。在一些具體例中，該方法包含以一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體之二或多次投予來治療有需要的該個體，其中於一第一次投予中投予該雙特異性抗體的一第一量且其中於每次的後續投予中該雙特異性抗體的量比該第一次投予的該雙特異性抗體的量高。在一些具體例中，每隔一段時間提供CLEC12A陽性癌症治療方法且保留造血幹細胞腔室之用劑方案允許恢復正常的CLEC12A陽性造血細胞。

Description

用於治療疾病之CLEC12AxCD3雙特異性抗體及方法
發明領域 本發明有關於抗體領域，特別係關於治療抗體領域。該等抗體可用於治療人類。更特別地，本發明係關於用於治療癌症的抗體且較佳為雙特異性抗體。
發明背景 急性骨髓性白血病(AML)為全世界第三常見的白血病，但在過去的四十年中疾病成果的進步不大(Arrighi, Soulas等人之2003乙文, Lowenberg, Ossenkoppele等人之2009, Burnett, Wetzler等人之2011乙文)。AML於歐洲成年人之年發生率為每100,000位中5至8位。在美國每年每100,000人有4至5位新診斷為AML，且每年有10,000人死於AML。年輕成年人之五年存活大約是40%，但於年長的患者此隨著年齡明顯下降至小於25%。於誘導性化學治療後達到形態完全緩解的大多數患者隨後於三年內再發(Juliusson, Lazarevic等人之2012, Oran and Weisdorf 2012)。此等患者因而迫切需要開發具有更有效的作用模式之新製劑。
發明概要 本發明聚焦在AML芽細胞及白血病的幹細胞(LSCs)上特異性表現的抗原，其為C型凝集素域家族12成員A或CLEC12A(亦稱為人類骨髓抑制性C型凝集素、hMICL、C型凝集素樣分子1、CLL-1或CD371) (Bakker, van den Oudenrijn等人之2004乙文, van Rhenen, van Dongen等人之2007乙文)。CLEC12A為不論亞型的90-95%重新(de novo)或再發的AML病例之白血病細胞上表現的骨髓分化抗原(Bakker, van den Oudenrijn等人之2004乙文, Zhao, Singh等人之2010乙文, Larsen, Roug等人之2012乙文)。CLEC12A選擇性地表現於CD34POSCD38NEG LSCs上，但根據活體外及活體內證據，其於正常的造血幹細胞(HSCs)、紅血球前驅體或巨核細胞上不表現(van Rhenen, van Dongen等人之2007乙文, Kikushige and Miyamoto 2013乙文)。
於本發明中已顯示CLEC12AxCD3雙特異性抗體誘發有效的T細胞媒介的CLEC12A靶向及選擇性地根除白血病細胞(包括白血病的幹細胞)而不影響正常的HSCs，藉此允許於治療後迅速地重建正常的造血作用且從而限制血液毒性。
許多T細胞銜接器格式面臨包括血清半生期很短、免疫原性及在製造方面困難的問題(Brinkmann and Kontermann 2017)。本發明之CLEC12AxCD3雙特異性抗體的血清半生期很優良。本發明的構件及方法不會明顯誘發針對治療劑之免疫反應。
本發明提供一種治療一個體的一CLEC12A陽性癌症之方法，該方法包含以一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體之二或多次投予來治療有需要的該個體，其中於一第一次投予中投予該雙特異性抗體的一第一量且其中於每次的後續投予中該雙特異性抗體的量比該第一次投予的該雙特異性抗體的量高。
本發明亦提供一種結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體供用於一種治療一個體的CLEC12A陽性癌症之方法中，其中該治療包含一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體之二或多次投予，其中於一第一次投予中投予該雙特異性抗體的一第一量且其中於每次的後續投予中該雙特異性抗體的量比該第一次投予的該雙特異性抗體的量高。
於一個態樣中本發明提供一種從一個體清除CLEC12A陽性造血細胞，較佳CLEC12A陽性惡性細胞，且以正常細胞再植(repopulating)該個體之該造血系統之方法，該方法包含每隔一段時間投予一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體給有需要的該個體藉此殺滅CLEC12A陽性惡性細胞，且刺激該個體的造血幹細胞及/或造血前驅體細胞以用新生的造血幹細胞衍生細胞，包括CLEC12A陽性細胞予以再植該造血系統。造血幹細胞駐留在骨髓中。不良的CLEC12A陽性細胞存在會剝奪健康細胞的營養並佔據腔室而藉此限制顆粒球、巨噬細胞幹細胞—其等自身會產生嗜鹼性球、嗜中性球、嗜酸性球及單核球血球細胞—的正常生長及發展。藉由通過本文所述之雙特異性抗體的投予方式而從骨髓腔室移去不良的CLEC12A陽性細胞，透過增加骨髓腔室內供健康的造血幹細胞生長、存活及分化成下游的CLEC12A陽性及CLEC12A陰性健康的細胞，例如嗜鹼性球、嗜中性球、嗜酸性球及單核球血球細胞之營養及空間的供應，而刺激健康的造血幹細胞之補充。
個體較佳為一經診斷具有急性骨髓性白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(MDS)、骨髓纖維化或骨髓增生性贅生物急性期(myeloproliferative neoplasm blast phase，MPN-BP)的個體。
亦提供一種製備一用於一要治療一CLEC12A陽性癌症之個體的自體骨髓細胞移植物之方法，該方法包含於適合殺滅CLEC12A陽性細胞的條件下、以一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體培育該個體的一骨髓細胞製備物，且隨後從該培育採集骨髓細胞。
本發明進一步提供一種治療一個體的一CLEC12A陽性癌症之方法，該方法包含於適合殺滅CLEC12A陽性細胞的條件下、以一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體培育該個體的一骨髓細胞製備物，以一造血系統消融療法(ablative therapy)來治療該個體且提供一包含該培育的骨髓細胞之骨髓細胞移植物給該個體。
進一步提供一種提供一個體一保留(sparing)造血幹細胞的癌症治療之方法，該方法包含投予一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體給有需要的該個體。該個體較佳有一種CLEC12A陽性癌症。
較佳實施例之詳細說明 治療單株抗體(mAbs)之用劑通常根據體型大小。這是因為體型大小為基的用劑會減少藥物暴露之個體間變異性。然而，多數mAbs為標靶特異性且有比較大的治療範圍及通常很小的藥物動力學變異性體型大小貢獻。另一方面取決於抗體類型、抗體的標靶特異性及其他因子，抗體會展現嚴重的中靶及脫靶副作用。其等中更嚴重的一些為集體稱為細胞介素釋放症候群(CRS)的病況。細胞介素釋放症候群是一種全身性發炎反應症候群的形式，其出現為一些疾病或感染的併發症，以及已知存在為一些抗體藥物及授受性T細胞療法的不良效應。嚴重情況亦已稱為「細胞介素風暴」。
自從第一種單株抗體藥物，莫羅單抗(muromonab-CD3)批准後就已經知道為抗體治療可能的不良效應之CRS，莫羅單抗造成CRS。然而，該問題在2006年促效CD28結合抗體TGN 1412之第I期臨床試驗後被認為是嚴重的。全部六位健康的志願者展現嚴重的CRS且病得很重。
近來，注意到在CD3抗體的背景下、以CD3/CD19及CD3/CD123雙特異性抗體進行的臨床試驗已被擱置(Johnson A. Oct 9, 2018及Sheridan C, 2016)。
於本發明中發現投予啟動劑量作為第一次投予接著一結合CD3及CLEC12A的抗體全劑量是有效的且要治療CLEC12A陽性癌症的個體耐受良好。不希望受理論束縛，但據信以較低的劑量啟動—較低的劑量以一或多個步驟遞增至全劑量—在這方面是有幫助的。啟動劑量通常給予一次但也能給予二次，或以許多次投予更多次。啟動劑量可接著逐步增量劑量的逐步調升用劑直到達到全劑量為止。抗體的第一量較佳為啟動劑量。抗體劑量投予通常是定期給予。啟動和後續的啟動或逐步調升投予，設若超過一次，之間的時間間隔可在1-7天之間變化，但通常是一天或三天。後續的逐步調升劑量投予，設若超過一次，之間的時間間隔可在3-7天之間變化，但通常是三天。全劑量投予之間的時間間隔通常是一週。第一啟動投予及後續的逐步調升投予，如果有的話，之間的時間間隔通常是三天。最後一次投予及後續的全劑量投予，如果有的話，之間的時間間隔可在3-7天之間變化，但通常是三天。第一次投予及後續的全劑量投予之間的時間間隔通常是七天。劑量投予通常每天計算。啟動劑量、逐步調升劑量或全劑量為一天給予的量。實際的投予可能需要一些時間。通常但未必為在一或多個小時的時間內之輸注。
先前技藝中的劑量遞增研究主要是於臨床試驗執行以快速地找到有效劑量以及避免患者不必要的暴露於亞治療劑量(Tourneau, Michiels等人之2009)。於本發明中的啟動劑量不是要給來快速地找到治療劑量及避免患者暴露於亞治療劑量。反而其係給予個體作為用劑方案的一部分，該用劑方案係設計來治療個體而在達到全劑量時同時降低治療族群的發生率及/或副作用的程度。
本發明提供一種治療一個體的一CLEC12A陽性癌症之方法，該方法包含以一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體之二或多次投予來治療有需要的該個體，其中於一第一次投予中投予該雙特異性抗體的一第一量且其中於後續投予中該雙特異性抗體的量比該第一次投予的該雙特異性抗體的量高。於該二或多次投予之該第二次中該投予的雙特異性抗體的量較佳比該第一次投予的該雙特異性抗體的量高，以及，在超過二次投予的情況下，比該二或多次投予之第三次的該雙特異性抗體的量低，在該第二次投予含括一逐步調升劑量時。設若該第二次投予為一全劑量，則該第二及第三次投予之該投予的雙特異性抗體的量是相等的。於該二或多次投予之該第三次中該投予的雙特異性抗體的量較佳比該二或多次投予之該第二次的該雙特異性抗體的量高，以及，在該第三次投予含括一逐步調升劑量的情況下，比該二或多次投予之第四次的量低。於該遞增量的雙特異性抗體之該投予之後，即於該啟動及逐步調升階段之後，該雙特異性抗體於每次的該後續投予中較佳以一實質恆定劑量來投予。該實質恆定劑量亦稱為全劑量。
於每次的該後續投予中該實質恆定劑量較佳為至少15 mg的該雙特異性抗體。該實質恆定劑量每次後續投予較佳為至少或等於20、25、30、35、40、45、50、55 mg，以及較佳介於60-600 mg之間，例如介於60-120；60-180；60-200；60-240；60-480；120-240；120-480；240-480；或240-600 mg之間的該雙特異性抗體。
該雙特異性抗體的該第一量較佳為9 mg或更小，例如介於1-9 mg之間或介於1-5 mg之間，較佳為3 mg或更小，例如介於1-3 mg之間，更佳為大約1 mg，還更佳為大約3 mg，最佳為大約5 mg。
該遞增量的抗體之投予較佳於投予之間以3至4天之間的時間間隔來完成。抗體之實質恆定量的投予日之間的時間間隔較佳為6-8天，較佳為7天。
雙特異性抗體的第一量較佳為雙特異性抗體的亞治療量。雙特異性抗體的亞治療量為當以每週投予來投予時通常不會產生治療效應的抗體量。
在一具體例中，於治療的第1天給予介於1-9 mg之間的雙特異性抗體的第一量。於治療的第3、4或5天給予介於3-20 mg之間，較佳為介於10-20 mg之間的第一逐步調升劑量；於治療的第7、8或9天給予介於15-30 mg之間，較佳為介於20-30 mg之間的第二逐步調升劑量；以及於治療的第14、15或16天給予介於25-600 mg之間的全劑量。
在一具體例中，於治療的第1天給予1 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予3 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予15 mg的第二逐步調升劑量；以及於治療的第15天給予25 mg的全劑量。
在一具體例中，於治療的第1天給予3 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予15 mg的逐步調升劑量；以及於治療的第8天給予25 mg的全劑量。
在一具體例中，於治療的第1天給予5 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予15 mg的逐步調升劑量；以及於治療的第8天給予25 mg的全劑量。
在一具體例中，於治療的第1天給予3 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予10 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量；以及於治療的第15天給予40 mg的全劑量。
在一具體例中，於治療的第1天給予3 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予15 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量，於治療的第15天給予40 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予5 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予10 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量；以及於治療的第15天給予40 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予5 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予15 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量以及於治療的第15天給予40 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予3 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予10 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量；以及於治療的第15天給予60 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予3 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予15 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量；以及於治療的第15天給予60 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予5 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予10 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量；以及於治療的第15天給予60 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予5 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予15 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量；以及於治療的第15天給予60 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予3 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予10 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量，於治療的第15天給予120 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予3 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予15 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量，於治療的第15天給予120 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予5 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予10 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量，於治療的第15天給予120 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予5 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予15 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量，於治療的第15天給予120 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予3 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予10 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量，於治療的第15天給予240 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予3 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予15 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量，於治療的第15天給予240 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予5 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予10 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量，於治療的第15天給予240 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予5 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予15 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量，於治療的第15天給予240 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予3 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予10 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量，於治療的第15天給予400 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予3 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予15 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量，於治療的第15天給予400 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予5 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予10 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量，於治療的第15天給予400 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予5 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予15 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量，於治療的第15天給予400 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予3 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予10 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量，於治療的第15天給予600 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予3 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予15 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量，於治療的第15天給予600 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予5 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予10 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量，於治療的第15天給予600 mg的全劑量。
在另一具體例中，於治療的第1天給予5 mg的雙特異性抗體的第一量。於治療的第4天給予15 mg的第一逐步調升劑量；於治療的第8天給予25 mg的第二逐步調升劑量，於治療的第15天給予600 mg的全劑量。
設若由一劑量至另一劑量，譬如舉例而言由25 mg至240 mg，的步驟似乎造成CRS症狀，則劑量方案可改動成包括一個或多個另外的逐步調升劑量，舉例而言(of for instance)120 mg。亦可決定延長逐步調升劑量及/或全劑量之間的時間間隔。此等原理可用於本文所揭示的任一劑量方案。
本發明使用一種特異性投予方法，較佳有離散的時間間隔。投予方案經設計以提供有效且安全的全劑量。於一態樣中安全劑量目的在于防止及最小化細胞介素釋放症候群(CRS)之嚴重性及發生率。
較佳的投予方案包含投予一或多個投予之啟動劑量，一或多個逐步調升劑量其中該劑量隨著劑量增量增高直到達到全劑量為止。增量較佳是逐步的。於一態樣中增量是等增量直到達到全劑量或維持劑量為止。然而，已發現與低或非常低的啟動劑量及/或首次逐步調升劑量開始相比，以較高啟動劑量及/或較高的首次逐步調升劑量開始會導致全劑量較不嚴重的副作用，譬如舉例而言細胞介素釋放。換句話說，以較高的啟動劑量開始會比以較低的啟動劑量開始更有效地減輕細胞介素釋放。例示性較高的啟動劑量為例如3或5 mg。較低的啟動劑量為例如1 mg。
全劑量通常在治療期間是固定的，但可取決於個體個別的治療及/或副作用反應而向上或向下調整。
一或多個逐步調升劑量較佳於第一週或第二週投予期間給予。在一具體例中每3天給予第一啟動投予及逐步調升投予(D1-D4-D8)，接著每7天全劑量投予(每週一次)。於第8天(D8)之劑量可與全劑量相等。全劑量較佳從第8-15天開始，取決於逐步調升投予的次數。
於本發明的一態樣中一或多個抗體投予伴隨著乙醯胺酚及抗組織胺之預治療及/或伴隨治療。抗組織胺較佳為H1拮抗劑。H1拮抗劑抑制抗組織胺於H1 受體之作用。乙醯胺酚及抗組織胺之治療較佳在抗體投予同一天給予且較佳在抗體投予之前。乙醯胺酚及抗組織胺之治療較佳隨著每種抗體投予來給予。
提供一種結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體供用於一種治療一個體的CLEC12A陽性癌症之方法中，其中該治療包含一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體之二或多次投予，其中於一第一次投予中投予該雙特異性抗體的一第一量且其中於每次的後續投予中該雙特異性抗體的量比該第一次投予的該雙特異性抗體的量高。本發明進一步提供一種結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體用於製造用於治療一個體的CLEC12A陽性癌症之一藥物之用途，其中於一第一次投予中投予該雙特異性抗體的一第一量且其中於每次的後續投予中該雙特異性抗體的量比該第一次投予的該雙特異性抗體的量高。
進一步提供一種從一個體清除CLEC12A陽性造血細胞且以正常CLEC12A陽性細胞再植該個體之該造血系統之方法，該方法包含每隔一段時間投予一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體給有需要的該個體藉此刺激該個體的造血幹細胞以用新生的造血幹細胞衍生細胞，包括CLEC12A陽性細胞予以再植該造血系統。該個體較佳為一具有AML、骨髓增生性贅生物急性期(MPN-BP)、骨髓纖維化(MF)或骨髓發育不良症候群(MDS)的個體。於較佳的具體例中該個體具有骨髓增生性贅生物急性期(MPN-BP)、骨髓纖維化(MF)或骨髓發育不良症候群(MDS)。發現正常的造血幹細胞主要是CLEC12A陰性。於前驅體部分中CLEC12A表現局限於顆粒球-巨噬細胞前驅體(GMP)細胞及一部分的共同骨髓前驅體(CMP)及巨核細胞-紅血球前驅體(MEP)細胞。於清除CLEC12A陽性細胞後，該等未清除的CMP及MEP仍然能產生GMP及BFU-E(紅血球)及CFU-Mk(巨核細胞)。如本文所述之CD3xCLEC12A雙特異性抗體的治療能移去惡性細胞，而保持造血幹細胞及前驅體細胞的潛力未改變。此等在如本文所述之抗體治療後受到刺激而以新的健康的細胞，包括CLEC12A陽性細胞來再植造血系統。受刺激的細胞亦生產新分化的CLEC12A陰性細胞。這可以通過該抗體之治療來實現，從而在與使用CD19或CD123或其他的標靶之CD3銜接器進場相比時至少降低了從造血系統移去CLEC12A陽性細胞之免疫的影響。再植時間至少比其他的CD3銜接器方式例如CD19及CD123更短。此外與其他CD3銜接器格式相比時，因為本發明之治療保留了CFU-Mk及BFU-E前驅體，所以也保留了該造血系統之血小板生產能力及紅血球生產能力。
亦提供一種從一個體清除CLEC12A陽性造血細胞且以正常CLEC12A陽性細胞再植該個體之該造血系統之方法，該方法包含每隔一段時間投予一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體給有需要的該個體藉此誘發該個體的造血幹細胞及/或造血前驅體細胞以用新生的造血幹細胞衍生CLEC12A陽性細胞予以再植該造血系統。
進一步提供一種用於刺激一個體之顆粒球及單核球發展之方法，該方法包含每隔一段時間投予一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體給有需要的該個體藉此誘發CLEC12A陰性造血幹細胞或前驅體細胞發展顆粒球及單核球。每隔一段時間投予較佳遵循如上文所述之時間間隔。用劑時間表較佳如本文所述。
該個體較佳為一具有AML、骨髓增生性贅生物急性期(MPN-BP)、骨髓纖維化(MF)或骨髓發育不良症候群(MDS)的個體。於較佳的具體例中該個體具有骨髓增生性贅生物急性期(MPN-BP)、骨髓纖維化(MF)或骨髓發育不良症候群(MDS)。
亦提供一種製備一用於一要治療一CLEC12A陽性癌症之個體的自體骨髓細胞移植物之方法，該方法包含於適合殺滅CLEC12A陽性細胞的條件下、以一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體培育該個體的一骨髓細胞製備物，且隨後從該培育採集骨髓細胞。進一步提供一種治療一個體的一CLEC12A陽性癌症之方法，該方法包含於適合殺滅CLEC12A陽性細胞的條件下、以一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體培育該個體的一骨髓細胞製備物，以一造血系統消融療法來治療該個體且提供一包含該培育的骨髓細胞之骨髓細胞移植物給該個體。自體移植物內從移植物的骨髓或血液衍生的T細胞重新靶向以由自體移植物消除CLEC12A陽性細胞。一種如本文所揭示之CD3及CLEC12A雙特異性抗體即使在很低的效應子標靶細胞比率，包括在1:3-1:97範圍內以及在圖6及表II反映的位準下都是有效的。如本文所述之適合殺滅CLEC12A陽性細胞的條件需要T細胞例如自體T細胞或預活化的T細胞存在。由於以許多當代的骨髓收穫法通常亦採集到的大量的血液存在，所以此等細胞通常會存在於骨髓製備物內。消融療法為一種治療其由於療法而導致細胞破壞。許多化學療法及其他抗腫瘤療法亦殺滅正常的細胞。骨髓是較敏感的器官之一。造血系統消融療法在本發明的背景下係一種有額外作用或副作用的療法(或治療)其中該療法或治療殺滅「正常的」或「健康的」造血系統之很大部分。骨髓通常在以造血系統消融療法治療患者前採集。此骨髓於療法刺激該個體的造血系統之再植完成之後移植回該個體。為防止異常細胞亦被移植，此骨髓製備物通常清除異常細胞。分選CD34陽性細胞在異常細胞不是CD34陽性時為一種方法。此等清除方法通常導致移去超出必要的細胞而導致比該個體的造血系統可能的再植更慢。本發明之清除方法有效地從骨髓製備物移去異常細胞而讓再植更快速。
在本發明之具體例中提供一種提供一個體一保留(sparing)造血幹細胞的癌症治療之方法，其中該方法包含投予一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體給有需要的該個體。在一些具體例中該個體有一種CLEC12A陽性癌症。
一種如本文所揭示之雙特異性抗體較佳投予為靜脈灌注。灌注通常需要大約2-4小時但更長及更短投予亦是可能的。灌注通常不會持續超過12小時的期間。
每次投予到達到實質恆定量為止之抗體量之增量亦稱為單一的患者之劑量遞增方案或患者內劑量遞增。
為了使本說明書更容易理解，首先定義某些術語。在整個詳細說明中闡明額外的定義。除非另有說明，否則本文所使用的所有技術和科學術語係與本技藝具有通常技術者所通常瞭解的意義相同，且使用習知的免疫學、蛋白化學、生物化學、重組DNA技術及藥理學方法。
當使用於本文中，除非上下文另外明確指定，否則單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該」包括複數的指示對象。使用術語「包括(including)」及其他形式，例如「包括(include)」、「包括(includes)」及「包括(included)」係非限制性的。
當使用於本文中，術語“CLEC12A”係指C型凝集素域家族12成員A。CLEC12A亦稱為C型凝集素蛋白CLL-1；MICL；樹突細胞締合凝集素2；C型凝集素超家族；骨髓抑制性C型凝集素樣受體；C型凝集素樣分子1；DCAL2；CLL1；C型凝集素樣分子1；DCAL-2；殺手細胞凝集素樣受體次家族L，成員1(KLRL1)；CD371(分化群371) (Bakker, van den Oudenrijn等人之2004；GenBankTM登錄序號：AY547296；Zhang W.等人之GenBankTM登錄序號：AF247788；Marshall, Willment等人之2004；GenBankTM登錄序號：AY498550；Han, Zhang等人之2004；Chen, Floyd等人之2006. GenBankTM登錄序號：AY426759；Chen, Floyd等人之2006. Ids：HGNC：31713；Entrez Gene：160364；Ensembl：ENSG00000172322；OMIM：612088；UniProtKB：Q5QGZ9。
CLEC12A是一種抗原其表現在急性骨髓性白血病(AML)中的白血病芽細胞上及白血病幹細胞上，包括CD34陰性或CD34低表現的白血病幹細胞(邊緣族群(side population))(Bakker, van den Oudenrijn等人之2004；van Rhenen, van Dongen等人之2007；Moshaver, van Rhenen等人，2008)，以及於骨髓發育不良症候群(MDS)中(Bakker, van den Oudenrijn等人之2004，及Toft-Peterson, Nederby等人，2016)。CLEC12A的表現另外被認為侷限於造血譜系，特別是末梢血液及骨髓內的骨髓譜系，即顆粒球、單核球及樹突細胞前驅體。更重要地是，CLEC12A不存在於正常的造血幹細胞上。在本文談及CLEC12A之處，其係指人類CLEC12A(序列辨識編號：1)，除非另有特別說明。
術語「CLEC12A」意指本文所述的所有變異體(例如剪接和突變)及其保有骨髓表現剖析(在表面表現位準及mRNA位準兩者)的同功型，包括如Bakker, van den Oudenrijn等人之2004及Marshall, Willment等人之2004乙文所述。雖然主要提供登錄序號作為另外的鑑別方法，但實際的蛋白序列可能，譬如因為編碼基因突變而變化，例如在一些癌症及類似癌症中發生的該等。
術語「CD3」(分化群3)係指由CD3γ鏈(SwissProt P09693)、CD3δ鏈(SwissProt P04234)、CD3ε鏈(SwissProt P07766)及CD3ζ鏈同型二聚體(SwissProt P20963)組成的蛋白錯合物。CD3ε以各種別名而聞名，其中一些為：「CD3e分子，ε(CD3-TCR錯合物)」；「CD3e抗原，ε多肽(TiT3錯合物)」；T細胞表面抗原T3/Leu-4 ε鏈；T3E；T細胞抗原受體錯合物，T3之ε亞單位；CD3e抗原；CD3-ε3；IMD18；TCRE。CD3E基因之Ids為HGNC：1674；Entrez Gene：916；Ensembl：ENSG00000198851；OMIM：186830及UniProtKB：P07766。此等鏈與T細胞受體(TCR)締合且ζ鏈於T淋巴細胞內產生活化訊息。TCR、ζ鏈及CD3分子一起組成TCR錯合物。CD3表現於T細胞上。在本文談及CD3之處，其係指人類CD3(序列辨識編號：2-5)，除非另有特別說明。
當使用於本文中術語「抗體」係指一種蛋白質分子其屬於免疫球蛋白類的蛋白質，其含有一個或多個域與抗原上的表位結合，其中此等域係衍生自一抗體的可變異區域或與一抗體的可變異區域共享序列同源性。抗體典型由基本結構單元組成-各基本結構單元有二重鏈及二輕鏈。治療用途的抗體較佳盡可能接近待治療個體的天然抗體(譬如人類個體之人類抗體)。如本發明之抗體不限於任何特定格式或其生產方法。
「雙特異性抗體」為一種如本文所述之抗體其中該抗體之一域與第一抗原結合而該抗體之第二域與第二抗原結合，其中該第一與第二抗原不是完全相同的。術語「雙特異性抗體」亦包含抗體其中一重鏈可變異區域/輕鏈可變異區域(VH/VL)組合結合一抗原上的第一表位及第二VH/VL組合結合第二表位。該術語進一步包括抗體其中VH能特異性辨識第一抗原，且與免疫球蛋白可變異區域之VH配對的VL能特異性辨識第二抗原。生成的VH/VL對會結合抗原1或抗原2。此等所謂的“二合一抗體”係於舉例而言WO 2008/027236、WO 2010/108127及Schaefer, Haber等人，2011乙文內有描述。如本發明之雙特異性抗體不限於任何特定雙特異性格式或其生產方法。
當使用於本文中術語「共同的輕鏈」係指雙特異性抗體內的二個輕鏈(或其VL部分)。該二個輕鏈(或其VL部分)可能完全相同或有一些胺基酸序列差異卻不影響全長抗體的結合特異性。「共同的」亦指胺基酸序列不是完全相同的該輕鏈之功能等效物。該輕鏈存在有許多變異體其內有出現不影響功能結合區域形成之突變(缺失、取代、插入及/或加入)。本發明之輕鏈亦可為上文指明的輕鏈，其具有0至10個，較佳0至5個胺基酸插入、缺失、取代、加入或其等之組合。要製備或找到不是完全相同但仍然在功能上相等的輕鏈係落在舉例而言本文所使用的共同的輕鏈之定義範疇內，譬如藉由導入且測試保留型胺基酸變化來進行，當與重鏈等等配對時，區域內的胺基酸變化不會對結合特異性起作用或只是起部分作用等等。
如本發明之術語「全長IgG」或「全長抗體」係定義為包含基本上完整的IgG，然而其不一定具有完整的IgG的全部功能。為避免疑義，全長IgG含有二重鏈及二輕鏈。各鏈含有恆定(C)及可變異(V)區域，其等能細分為命名為CH1、CH2、CH3、VH及CL、VL的域。IgG抗體係經由Fab部分內含的可變異區域域與抗原結合，且於結合後能經由恆定域，主要是經由Fc部分，來與分子及免疫系統的細胞交互作用。如本發明之全長抗體包含其中可能存在提供所欲特徵的突變之IgG分子。全長IgG不應有任何區域的實質部分之缺失。然而，術語「全長IgG」包含其中缺失一或數個胺基酸殘基，但沒有實質改變產生的IgG分子之結合特徵之IgG分子。舉例來說，此IgG分子能有1至10個之間的胺基酸殘基缺失，較佳於非CDR區域內，其中缺失的胺基酸對IgG之結合特異性不是必需的。
本文的胺基酸殘基之「同一性百分率(%)」係定義為為了進行最佳比較而排列比對序列後，候選序列的胺基酸殘基與一選定序列的胺基酸殘基為同一的百分比。要比較的兩個序列中的任何一個可引入間隙以使兩個序列的排列比對達成最大。此排列比對可以在要比較的全長序列上進行。任擇地，排列比對可以於較短的長度上進行，舉例而言大約20、大約50、大約100或更多核苷酸/鹼基或胺基酸。序列同一性為兩個序列於報告的排列比對區域之間同一的匹配之百分比。
序列之比較及兩個序列之間的序列同一性百分率之測定可使用數學演算法完成。熟習此項技術者會知道可用數種不同的電腦程式來排比二個序列且判定二個序列之間的同一性(Kruskal, J. B., 1983)。二個胺基酸序列之間的序列同一性百分率可使用供用於二個序列排比之尼德曼與溫施演算法(Needleman and Wunsch algorithm)來測定。(Needleman and Wunsch, 1970)。尼德曼-溫施演算法已在電腦程式NEEDLE中被執行。關於本發明，可使用來自EMBOSS套裝軟體的NEEDLE程式(版本2.8.0或更高，Rice, Longden等人，2000；http://emboss.bioinformatics.nl/)。針對蛋白質序列，EBLOSUM62使用於替代矩陣(substitution matrix)。所使用的選擇性參數是10的間隙-開放懲罰(gap-open penalty)以及0.5的間隙擴展懲罰(gap extension penalty)。
於以上所述的程式NEEDLE進行排比後，查詢序列與本發明的序列之間的序列同一性百分率可計算如下：排比中於二個序列內顯示為同一的胺基酸或同一的核苷酸之對應位置的數目除以排比中減去間隙總數後的排比總長度。
因一種抗體典型地僅辨識抗原的一表位，且此一表位也可存在於其他化合物，如本發明「特異地辨識」一抗原舉例而言，CLEC12A或CD3，之抗體也可辨識其他化合物，若此其他化合物含有同類的表位。因此就抗原與抗體的交互作用而言，術語「特異地辨識」不排除抗體與含有同類表位的其他化合物之結合。
術語「表位」或「抗原決定位」係指一抗原上與免疫球蛋白或抗體特異性結合的位址。表位可由相鄰的胺基酸或由蛋白之三級折疊並列的不連續胺基酸(所謂的線形或構形表位)形成。自相鄰的、線形胺基酸形成之表位通常在暴露於變性溶劑時得以保持，而由三級折疊形成之表位，構形通常在用變性溶劑處理時有所損失。表位在獨特之空間構形中通常包括3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個胺基酸。判定表位之空間構形的方法係熟悉此藝者已知的且包括本技藝的技術例如x射線結晶學、HDX-MS及二維核磁共振、肽掃描(pepscan)及丙胺酸掃描，取決於表位的性質(參見諸如Morris G.E., 1996)。
當使用於本文中術語「異常細胞」包括腫瘤細胞，更具體地血液來源的腫瘤細胞，亦包括白血病前期細胞例如造成骨髓發育不良症候群(MDS)的細胞及白血病細胞例如急性骨髓性白血病(AML)腫瘤細胞或慢性骨髓性白血病(CML)細胞。
當使用於本文中術語「免疫效應子細胞」或「效應子細胞」係指哺乳動物免疫系統內的細胞天然庫內的細胞，其能予以活化以影響標靶細胞的生存力。免疫效應子細胞包括淋巴譜系細胞例如自然殺手(NK)細胞、T細胞包括胞毒型T細胞或B細胞，且包括骨髓譜系細胞，例如單核球或巨噬細胞、樹突細胞及嗜中性顆粒球。因此，該效應子細胞較佳為NK細胞、T細胞、B細胞、單核球、巨噬細胞、樹突細胞及或嗜中性顆粒球。募集效應子細胞至異常細胞意指使免疫效應子細胞接近異常標靶細胞以使得效應子細胞能直接殺滅異常細胞或間接發起殺滅異常細胞。
當使用於本文中，術語「個體」及「患者」係可互換使用且係指哺乳動物例如人類、小鼠、大鼠、倉鼠、天竺鼠、兔、貓、狗、猴、牛、馬、豬等(例如，有癌症的患者，例如人類患者)。
當使用於本文中，術語「治療(treat)」、「治療(treating)」及「治療(treatment)」係指在個體上進行任何類型之干預或過程或向該個體投予活性劑或活性劑組合，且目的在於逆轉、減輕、改良、抑制或減慢或預防與疾病相關聯的症狀、併發症、病況或生物化學指標之進展、發展、嚴重性或復發。
當使用於本文中，「有效的治療」或「正面治療反應」係指產生有益效應的治療，例如減輕一疾病或障礙，如癌症的至少一症狀。有益效應能以比基線有所改善的方式呈現，包括比依據該方法的療法起始前所進行的測量或觀察有改善。舉例而言，有益效應能以減慢、穩定、中止或逆轉癌症於處於任何臨床階段的個體內之進展的方式呈現，如由疾病的臨床或診斷症狀或癌症標識減少或消除來證明。有效的治療可，舉例而言減小腫瘤尺寸、減少循環的腫瘤細胞存在、降低或預防腫瘤轉移、減慢或阻止腫瘤生長及/或預防或延遲腫瘤復發或再發。
術語「治療量」係指提供所欲的生物、治療及/或預防結果之一製劑或製劑組合的量。該結果可為減少、改良、緩和、衰減、延遲及/或減輕疾病的一或多個徵象、症狀或原因，或生物系統任何其他所欲改變。在一些具體例中，治療量為足以延遲腫瘤發展的量。在一些具體例中，治療量為足以預防或延遲腫瘤復發的量。治療量能以一或多次投予予以投予。藥物或組成物之治療量可以：(i)降低癌細胞的數目；(ii)縮小腫瘤尺寸；(iii)在一定程度上抑制、減緩、減慢且可中止癌細胞浸潤至周邊器官內；(iv)抑制腫瘤轉移；(v)抑制腫瘤生長；(vi)預防或延遲腫瘤發生及/或復發；及/或(vii)在一定程度上緩解癌症相關聯的一或多個症狀。在一實例中，「治療量」係CLEC12A/CD3雙特異性抗體的量其減少癌症(舉例而言癌細胞數目減少)或減慢癌症的進展，例如急性骨髓性白血病、骨髓發育不良症候群或慢性骨髓性白血病。
如本文所揭示供用於本文所提供的方法之雙特異性抗體包括雙特異性抗體，其包含結合CLEC12A之一重鏈可變異區域/輕鏈可變異區域(VH/VL)組合及結合CD3之第二VH/VL組合。
供用於CLEC12A/CD3雙特異性抗體之合適的CLEC12A重鏈可變異(VH)區域包括結合CLEC12A的該等。在較佳具體例中，CLEC12A/CD3雙特異性抗體之CLEC12A VH區域結合腫瘤細胞上表現的CLEC12A。供用於CLEC12A/CD3雙特異性抗體之例示性CLEC12A VH區域係揭示於，舉例而言WO2017/010874、WO2014/051433及WO2005/000894內(其等之各者併入本文中以作為參考資料)。
在一些具體例中，用於腫瘤細胞上的CLEC12A之該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的結合親和力比對CD3的結合親和力更高至少2倍、4倍、6倍、10倍、20倍、30倍、40倍或50倍。在某些具體例中，用於CLEC12A之該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的CLEC12A結合親和力係介於大約1x10e-6 M及1x10e-10 M之間、介於大約1x10e-7 M及1x10e-10 M之間，或介於大約1x10e-8與1x10e-10之間。在一些具體例中，用於CLEC12A之該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的CLEC12A結合親和力為至少1x10-e8 M，較佳為至少1x10-e9 M。在某些具體例中，用於CLEC12A之該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的結合親和力係介於大約1x10e-8 M與1x10e-9 M之間，包括舉例而言，大約2x10e-9 M、大約3x10e-9 M、大約4x10e-9 M、大約5x10e-9 M、大約6x10e-9 M、大約7x10e-9 M、8x10e-9 M或大約9x10e-9 M，以及用於CD3之該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的結合親和力為低至少30倍、低至少40倍或低至少50倍。
在某些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的CD3 VH區域係以顯著低於小鼠類抗CD3抗體，mOKT3的親和力(KD)之親和力與人類T細胞株上細胞表面表現的CD3/TCR結合。在一些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的CD3 VH區域係以至少1x10-e6 M的結合親和力結合CD3。在一些具體例中，該雙特異性抗體的CD3結合親和力係介於大約1x10e-6 M及1x10e-10 M之間。在一些具體例中，該雙特異性抗體的CD3 VH區域之CD3結合親和力係介於大約1x10e-7 M - 1x10e-8 M之間。
在一些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體包含一結合人類CLEC12A之第一重鏈可變異區域，其中該重鏈可變異區域包含： (a)一包含胺基酸序列SGYTFTGY(序列辨識編號：9)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IINPSGGS(序列辨識編號：10-)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTTGDWFDY(序列辨識編號：11)之重鏈CDR3； (b) 一包含胺基酸序列SGYTFTSY(序列辨識編號：13)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IINPSGGS(序列辨識編號：14)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GNYGDEFDY(序列辨識編號：15)之重鏈CDR3；或 (c) 一包含胺基酸序列SGYTFTGY(序列辨識編號：17)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列WINPNSGG(序列辨識編號：18)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列DGYFADAFDY(序列辨識編號：19)之重鏈CDR3。
可允許與所述的CDR序列有1、2或3個胺基酸殘基之保留型變異同時保有同類的結合活性(於種類方面，不一定是數量)。因此，該重鏈CDR 1、2及3序列較佳含有的序列與所述的CDR序列偏離不超過三個，較佳為不超過二個，更佳為不超過一個胺基酸。在某些具體例中，該重鏈CDR 1、2及3序列與所述的CDR序列為同一的。
在一些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體包含一結合人類CLEC12A之重鏈可變異區域，其中該重鏈可變異區域包含序列辨識編號：12、16或20內列出的VH區域之HCDR1、HCDR2及HCDR3。
在一些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體包含一結合人類CLEC12A之重鏈可變異區域，其中該重鏈可變異區域包含與序列辨識編號：12、16或20內列出的胺基酸序列為至少90%，較佳為至少95%，更佳為至少97%，更佳為至少98%，更佳為至少99%同一的或100%同一的一胺基酸序列。
舉例而言，在一些具體例中，結合人類CLEC12A之該雙特異性抗體之重鏈可變異區域於三個CDR序列以外的該重鏈可變異區域之序列內可具有0-10個，較佳0-5個胺基酸插入、缺失、取代、加入，或其等之組合。在一些具體例中，該重鏈可變異區域就所示的胺基酸序列而言包含由0至9、由0至8、由0至7、由0至6、由0至5、由0至4，較佳為由0至3，較佳為由0至2，較佳為由0至1且較佳為0個胺基酸插入、缺失、取代、加入，或其等之組合。
在某些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體包含一結合人類CLEC12A之重鏈可變異區域，其中該重鏈可變異區域包含選自於序列辨識編號：12、16及20的胺基酸序列。
合適用於該CLEC12A/CD3雙特異性抗體之CD3重鏈可變異(VH)區域包括能結合CD3γ鏈、CD3δ鏈、CD3ε鏈，或CD3δ/CD3ε或CD3γ/CD3ε之組合的該等。在一些具體例中，該雙特異性抗體之CD3 VH區域結合CD3ε鏈。在一些具體例中，該CD3 VH區域結合人類CD3。在一些具體例中，該CD3 VH區域結合人類CD3ε鏈。
用於該CLEC12A/CD3雙特異性抗體之例示性CD3結合區域係揭示於WO2017/010874、WO2014/051433及WO2005/118635內(其等之各者併入本文中以作為參考資料)。
在某些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體包含一結合人類CD3之重鏈可變異區域，其中該重鏈可變異區域包含： (a) 一包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IWYNGRKQ(序列辨識編號：22)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTGYNWFDP(序列辨識編號：23)之重鏈CDR3； (b) 一包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IWYSGSKKN(序列辨識編號：30)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTGYNWFDP(序列辨識編號：23)之重鏈CDR3； (c) 一包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IWYHGRKQ(序列辨識編號：32)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTGYNWFDP(序列辨識編號：23)之重鏈CDR3； (d) 一包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IWYHARKQ(序列辨識編號：34)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTGYNWFDP(序列辨識編號：23)之重鏈CDR3； (e) 一包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IWYNARKQ(序列辨識編號：36)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTGYNWFDP(序列辨識編號：23)之重鏈CDR3； (g) 一包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IWYNTRKQ(序列辨識編號：45)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTGYNWFDP(序列辨識編號：23)之重鏈CDR3； (h) 一包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IWYDGKNT(序列辨識編號：47)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTGYNWFDP(序列辨識編號：23)之重鏈CDR3； (i) 一包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IYYDGSRT(序列辨識編號：49)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTGYNWFDP(序列辨識編號：23)之重鏈CDR3；或 (j) 一包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IWHDGRKT(序列辨識編號：51)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTGYNWFDP(序列辨識編號：23)之重鏈CDR3。
該包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之CDR1係根據IMGT來定義。該CDR1可包含如根據Kabat來定義之胺基酸序列SYGMH(序列辨識編號：60)。
所述的CDR序列可有1、2或3個胺基酸殘基變異同時保有同類的結合活性(於種類方面，不一定是數量)。因此，該重鏈CDR 1、2及3序列較佳含有的序列與所述的CDR序列偏離不超過三個，較佳不超過二個，更佳不超過一個胺基酸。在某些具體例中，該重鏈CDR 1、2及3序列與所述的CDR序列為同一的。
在一些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體包含一結合人類CD3之重鏈可變異區域，其中該重鏈可變異區域包含序列辨識編號：24-29、31、33、35、37-44、46、48、50及52內列出的VH區域之HCDR1、HCDR2及HCDR3。
在一些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體包含一結合人類CD3之重鏈可變異區域，其中該重鏈可變異區域包含與序列辨識編號：24-29、31、33、35、37-44、46、48、50及52內列出的VH區域序列之一的胺基酸序列為至少90%，較佳為至少95%，更佳為至少97%，更佳為至少98%，更佳為至少99%同一的或100%同一的。
在某些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體包含一結合人類CD3之重鏈可變異區域，其中該重鏈可變異區域包含與序列辨識編號：37-44內列出的序列VH區域之一的胺基酸序列為至少90%，較佳為至少95%，更佳為至少97%，更佳為至少98%，更佳為至少99%同一的或100%同一的。
舉例而言，在一些具體例中，結合人類CD3之該雙特異性抗體之重鏈可變異區域於三個CDR序列以外的該重鏈可變異區域之序列內可具有0至10個，較佳0至5個胺基酸插入、缺失、取代、加入，或其等之組合。在一些具體例中，該重鏈可變異區域就所示的胺基酸序列而言包含由0至9、由0至8、由0至7、由0至6、由0至5、由0至4，較佳為由0至3，較佳為由0至2，較佳為由0至1且較佳為0個胺基酸插入、缺失、取代、加入，或其等之組合。
保有CLEC12A或CD3結合之所揭示的胺基酸序列之額外的變異體可，舉例而言由噬菌體展示庫獲得，該噬菌體展示庫含有重排的人類IGKVl-39/IGKJl VL區域(de Kruif, Kramer等人之2010)，以及一批併入胺基酸取代至本文所揭示的CLEC12A或CD3 VH區域的胺基酸序列內之VH區域，如前所述(諸如US 2016/0368988)。可選擇編碼結合CLEC12A或CD3的Fab區域之噬菌體且藉由流動式細胞測量術來分析，及定序以鑑別保有抗原結合、有胺基酸取代、插入、缺失或加入的變異體。舉例而言，如US 2016/0368988中所述，CD3 VH區域可於位置A50予以取代且由S、Y、M或Q予以修飾；D59可由L、I、V、F、R、A、N、H、S、T、Y或E，較佳為Y或E予以取代；A61可由N、I、H、Q、L、R、Y、E、S、T、D、K、V予以取代；以及F105可由Y或M予以取代。可容易地找到耐受的胺基酸取代。
在某些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體包含一結合人類CD3之重鏈可變異區域，其中該重鏈可變異區域包含選自於序列辨識編號：24-29、31、33、35、37-44、46、48、50或52的胺基酸序列。
在某些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體包含一結合人類CD3之重鏈可變異區域，其中該重鏈可變異區域包含選自於序列辨識編號：37-44的胺基酸序列。
在某些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體包含一結合人類CLEC12A之第一重鏈可變異區域，其中該第一VH區域包含與序列辨識編號：12、16及20內列出的VH區域胺基酸序列為至少90%，較佳為至少95%，更佳為至少97%，更佳為至少98%，更佳為至少99%同一的或100%同一的一胺基酸序列；及一結合人類CD3之第二重鏈可變異區域，其包含，其中該第二VH區域包含與序列辨識編號：37-44內列出的VH區域序列中一者之胺基酸序列為至少90%，較佳為至少95%，更佳為至少97%，更佳為至少98%，更佳為至少99%同一的或100%同一的一胺基酸序列。
在某些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體包含一結合人類CLEC12A之第一重鏈可變異區域及一結合人類CD3之第二重鏈可變異區域，其中 (a)該第一重鏈可變異區域包含： (i)一包含胺基酸序列SGYTFTGY(序列辨識編號：9)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IINPSGGS(序列辨識編號：10)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTTGDWFDY(序列辨識編號：11)之重鏈CDR3； (ii)一包含胺基酸序列SGYTFTSY(序列辨識編號：13)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IINPSGGS(序列辨識編號：14)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GNYGDEFDY(序列辨識編號：15)之重鏈CDR3；或 (iii)一包含胺基酸序列SGYTFTGY(序列辨識編號：17)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列WINPNSGG(序列辨識編號：18)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列DGYFADAFDY(序列辨識編號：19)之重鏈CDR3；以及 (b)該第二重鏈可變異區域包含， (i)一包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IWYNGRKQ(序列辨識編號：22)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTGYNWFDP(序列辨識編號：23)之重鏈CDR3； (ii)一包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IWYSGSKKN(序列辨識編號：30)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTGYNWFDP(序列辨識編號：23)之重鏈CDR3； (iii)一包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IWYHGRKQ(序列辨識編號：32)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTGYNWFDP(序列辨識編號：23)之重鏈CDR3； (iv)一包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IWYHARKQ(序列辨識編號：34)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTGYNWFDP(序列辨識編號：23)之重鏈CDR3； (v)一包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IWYNARKQ(序列辨識編號：36)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTGYNWFDP(序列辨識編號：23)之重鏈CDR3； (vi)一包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IWYNTRKQ(序列辨識編號：45)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTGYNWFDP(序列辨識編號：23)之重鏈CDR3； (vii)一包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IWYDGKNT(序列辨識編號：47)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTGYNWFDP(序列辨識編號：23)之重鏈CDR3； (viii)一包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IYYDGSRT(序列辨識編號：49)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTGYNWFDP(序列辨識編號：23)之重鏈CDR3；或 (ix)一包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IWHDGRKT(序列辨識編號：51)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTGYNWFDP(序列辨識編號：23)之重鏈CDR3。
在某些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體包含一結合人類CLEC12A之第一重鏈可變異區域，其中該第一VH區域包含一包含胺基酸序列SGYTFTGY(序列辨識編號：9)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IINPSGGS(序列辨識編號：10)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTTGDWFDY(序列辨識編號：11)之重鏈CDR3；以及一第二重鏈可變異區域，其中該第二VH區域包含一包含胺基酸序列GFTFSSYG(序列辨識編號：21)之重鏈CDR1、一包含胺基酸序列IWYNARKQ(序列辨識編號：36)之重鏈CDR2，及一包含胺基酸序列GTGYNWFDP(序列辨識編號：23)之重鏈CDR3。
在某些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體包含一結合人類CLEC12A之第一重鏈可變異區域，其中該第一VH區域的胺基酸序列係選自於序列辨識編號：12、16及20；及一結合人類CD3之第二重鏈可變異區域，其中該第二VH區域的胺基酸序列係選自於序列辨識編號：24-29、31、33、35、37-44、46、48、50及52。
在某些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體包含一結合人類CLEC12A之第一重鏈可變異區域，其中該第一VH區域的胺基酸序列係序列辨識編號：12；及一結合人類CD3之第二重鏈可變異區域，其中該第二VH區域的胺基酸序列係選自於序列辨識編號：37-44。
在一具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體包含一結合人類CLEC12A之第一重鏈可變異區域，其中該第一VH區域的胺基酸序列係列於序列辨識編號：12內；及一結合人類之第二重鏈可變異區域，其中該第二VH區域的胺基酸序列係列於序列辨識編號：37內。
該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的VH/VL CLEC12A結合區域及CD3結合區域之VH/VL結合區域之輕鏈可變異區域與親代CLEC12A單特異性抗體的VL區域及/或親代CD3單特異性抗體的VL區域可以是相同的，或一或二個VH/VL區域組合可使用任擇的VL區域，只要該雙特異性抗體保有與CLEC12A及CD3抗原二者的結合。
在一些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的VH/VL CLEC12A結合區域之VL區域與VH/VL CD3結合區域之VL區域相似。在某些具體例中，第一及第二VH/VL區域組合內的VL區域是同一的。
在某些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的一或二個VH/VL結合區域之輕鏈可變異區域包含一共同的輕鏈。在一些具體例中，該一或二個VH/VL結合區域之該共同的輕鏈可變異區域包含一生殖系列O12可變異區域V節段。在某些具體例中，該一或二個VH/VL結合區域之該輕鏈可變異區域包含κ輕鏈V節段IgVκ1-39*01。IgVκ1-39為免疫球蛋白可變異κ1-39基因之簡稱。該基因也被稱為免疫球蛋白κ可變異1-39；IGKV139；IGKV1-39；O12a或O12。該基因之External Ids為HGNC：5740；Entrez Gene：28930；Ensembl：ENSG00000242371。序列辨識編號：56提供V區域的胺基酸序列。V區域能與五個J區域之一者組合。較佳的J區域為jk1及jk5，以及聯結的序列係表示為IGKV1-39/jk1及IGKV1-39/jk5；替換名稱為IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ5*01(根據imgt.org之IMGT資料庫全球資訊網來命名)。在某些具體例中，該一或二個VH/VL結合區域之輕鏈可變異區域包含κ輕鏈IgVκ1-39*01/IGJκ1*01或IgVκ1-39*01/IGJκ1*05(分別為序列辨識編號：57及序列辨識編號：58)。
在一些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的一或二個VH/VL結合區域之該輕鏈可變異區域包含一包含胺基酸序列QSISSY(序列辨識編號：53)之LCDR1、一包含胺基酸序列AAS之LCDR2，及一包含胺基酸序列QQSYSTP(序列辨識編號：55)之LCDR3(即，根據IMGT之IGKV1-39的CDRs)。在一些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的一或二個VH/VL結合區域之該輕鏈可變異區域包含一包含胺基酸序列QSISSY(序列辨識編號：53)之LCDR1、一包含胺基酸序列AASLQS(序列辨識編號：54)之LCDR2，及一包含胺基酸序列QQSYSTP(序列辨識編號：55)之LCDR3。
在一些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的一或二個VH/VL結合區域包含一輕鏈可變異區域，其包含與序列辨識編號：57內列出的胺基酸序列為至少90%，較佳為至少95%，更佳為至少97%，更佳為至少98%，更佳為至少99%同一的或100%同一的一胺基酸序列。在一些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的一或二個VH/VL結合區域包含一輕鏈可變異區域，其包含與序列辨識編號：58內列出的胺基酸序列為至少90%，較佳為至少95%，更佳為至少97%，更佳為至少98%，更佳為至少99%同一的或100%同一的一胺基酸序列。
舉例而言，在一些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的一或二個VH/VL結合區域之可變異輕鏈就序列辨識編號：57或序列辨識編號：58而言，可具有0至10個，較佳0至5個胺基酸插入、缺失、取代、加入或其等之組合。在一些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的一或二個VH/VL結合區域之輕鏈可變異區域就所示的胺基酸序列而言包含由0至9、由0至8、由0至7、由0至6、由0至5、由0至4，較佳為由0至3，較佳為由0至2，較佳為由0至1且較佳為0個胺基酸插入、缺失、取代、加入，或其等之組合。
在其他的具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的一或二個VH/VL結合區域之輕鏈可變異區域包含序列辨識編號：57或序列辨識編號：58之胺基酸序列。在某些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的二個VH/VL結合區域包含同一的VL區域。在一具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的二個VH/VL結合區域之VL包含序列辨識編號：57內列出的胺基酸序列。在一具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的二個VH/VL結合區域之VL包含序列辨識編號：58內列出的胺基酸序列。
供用於本文所揭示的方法之CLEC12A/CD3雙特異性抗體可以許多格式提供。本技藝已知許多不同格式的雙特異性抗體，且Kontermann, Brinkmann, 2015, 2018及Spiess, Zhai等人，2015)已有評論，其等之各者併入本文中以作為參考資料。舉例而言，不是具有二個VH/VL組合之古典抗體的雙特異性抗體格式，具有包含一重鏈可變異區域及一輕鏈可變異區域之至少一可變異域。此可變異域可鏈接一單鏈Fv片段、單一體型(monobody)、VH及提供第二結合活性的Fab片段。
在一些具體例中，本文提供的方法中使用的CLEC12A/CD3雙特異性抗體一般屬於人類IgG亞類(例如，舉例而言IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。在某些具體例中，該抗體屬於人類IgG1亞類。因為全長IgG抗體有利的半生期以及出於低免疫原性的原因，所以其等為較佳的。因此，在某些具體例中，CLEC12A/CD3雙特異性抗體為全長IgG分子。在一具體例中，CLEC12A/CD3雙特異性抗體為全長IgG1分子。
因此，在某些具體例中，CLEC12A/CD3雙特異性抗體包含一可結晶片段(Fc)。CLEC12A/CD3雙特異性抗體之Fc較佳包括人類恆定區域。CLEC12A/CD3雙特異性抗體之恆定區域或Fc與天然存在的人類抗體之恆定區域可含有一或多個差異，較佳不超過10個，較佳不超過5個胺基酸差異。舉例而言，在某些具體例中，雙特異性抗體之各個Fab臂可進一步包括一Fc區域，該Fc區域包含促進雙特異性抗體形成之修飾、影響Fc媒介的效應子功能之修飾，及/或於此所描述之其他特徵。
在較佳具體例中，CLEC12A/CD3雙特異性全長抗體具有突變下部鉸鏈及/或CH2域以使得該雙特異性IgG抗體與Fcγ(Fcγ)受體之交互作用降低。當使用於本文中，術語「以使得該雙特異性IgG抗體與Fcγ受體之交互作用降低」意指該CLEC12A/CD3雙特異性抗體與Fcγ受體之交互作用降低了，設若此Fcγ受體存在於該抗體的附近。在某些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體與Fc受體之交互作用基本上被破壞了。Fcγ受體結合降低之雙特異性抗體之前已經有描述過(US 2014/0120096，併入本文中以作為參考資料)。
在某些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體包含一突變下部鉸鏈及/或CH2域加上在胺基酸位置235及/或236(EU編號)之至少一取代。較佳地，胺基酸位置235及236二者均取代。如US 2014/0120096內所述，此等位址之取代基本上能防止抗體與腫瘤細胞或效應子細胞上存在的Fc受體之間的交互作用。因此，在某些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體包含一種包含L235G及/或G236R取代之突變CH2及/或下部鉸鏈域。較佳地，L235G及G236R二者均取代。任擇地，本技術領域的嫻熟技術人員可導入包含取代234F、235E及/或331S之下部鉸鏈及/或CH2域突變(Oganesyan, Gao等人之2008)。較佳地，所有三種取代都導入此替代方案內。
雙特異性抗體通常由表現編碼抗體的核酸的細胞來生產。因此，在一些具體例中，本文所揭示的雙特異性CLEC12A/CD3抗體係藉由提供一種細胞來生產，該細胞包含編碼該雙特異性CLEC12A/CD3抗體之重及輕鏈可變異區域及恆定區域的一或多種核酸。該細胞較佳為動物細胞，更佳為哺乳動物細胞，更佳為靈長類動物細胞，最佳為人類細胞。一種合適的細胞為能包含且較佳生產該CLEC12A/CD3雙特異性抗體之任何細胞。
適合抗體生產的細胞為本技藝已知的且包括融合瘤細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、NS0細胞或PER-C6細胞。各種機構及公司已經開發出用於大規模生產抗體之細胞株，譬如供臨床使用。此等細胞株之非限制性實例為CHO細胞、NS0細胞或PER.C6細胞。在一特別佳的具體例中該細胞為人類細胞。較佳為一種由腺病毒E1區域或其功能等效物轉形的細胞。此一細胞株之較佳實例為PER.C6細胞株或其等效物。在一特別佳具體例中該細胞為CHO細胞或其變異體。較佳為一種利用麩醯胺酸合成酶(GS)載體系統用於表現抗體的變異體。在一特別佳的具體例中，該細胞為CHO細胞。
在一些具體例中，細胞表現組成該CLEC12A/CD3雙特異性抗體之不同的輕及重鏈。在某些具體例中，細胞表現二種不同的重鏈及至少一輕鏈。在一特別佳的具體例中，細胞表現如本文所述之「共同的輕鏈」以降低不同的抗體種類數目(不同的重及輕鏈組合)。舉例而言，個別的VH區域係使用本技藝已知的生產雙特異性IgG方法選殖至表現載體之內(WO2013/157954；併入本文中以作為參考資料)，聯合重排的人類IGKV1 39/IGKJ1 (huVκ1 39)輕鏈。該huVκ1 39先前顯示出能與一種以上的重鏈配對藉此產生不同特異性的抗體，其促進雙特異性分子產生(de Kruif, Kramer等人之2009；WO2009/157771)。
一種表現一共同的輕鏈及等量的二種重鏈之抗體生產細胞通常生產50%雙特異性抗體及25%的每種單特異性抗體(即有同一的重輕鏈組合)。已經公開數種方法有利於生產雙特異性抗體而不是生產個別的單特異性抗體。這件事典型地係藉由修飾重鏈的恆定區域以使得其等有利異質二聚合(即與另一重/輕鏈組合之重鏈進行二聚合)超過同質二聚合來達成。於較佳的具體例中本發明的雙特異性抗體包含具有相容的異質二聚合域之二個不同的免疫球蛋白重鏈。本技藝中已有描述各種相容的異質二聚合域。相容的異質二聚合域較佳為相容的免疫球蛋白重鏈CH3異質二聚合域。本技藝描述了各種可完成此等重鏈的異質二聚合的方法。
US 9,248,181及US 9,358,286中揭示一種用於生產CLEC12A/CD3雙特異性抗體的較佳方法。具體地，基本上只生產雙特異性全長IgG分子之較佳的突變為第一CH3域之胺基酸取代L351K及T366K(EU編號) (「KK-變異體」重鏈)以及第二域之胺基酸取代L351D及L368E(「DE-變異體」重鏈)，或反之亦然。如前所述，DE-變異體及KK-變異體優先配對形成異二聚體(所謂的「DEKK」雙特異性分子)。由於完全相同的重鏈之間的CH3-CH3界面之帶電殘基之間強大的排斥作用，所以DE-變異體重鏈之同質二聚合(DEDE同型二聚體)或KK-變異體重鏈之同質二聚合(KKKK同型二聚體)幾乎不會發生。
因此，在一具體例中包含結合CLEC12A的可變異域之重鏈/輕鏈組合，包含了該重鏈的DE變異體。在此具體例中包含結合CD3的可變異域之重鏈/輕鏈組合，包含了該重鏈的KK變異體。
候選CLEC12A/CD3 IgG雙特異性抗體能使用任何合適的分析來測試結合作用。舉例而言，HPB-ALL細胞上膜表現的CD3之結合作用係藉由流動式細胞測量術來評估(根據如前於WO2014/051433所述的FACS程序來執行)。在一具體例中，候選CLEC12A/CD3雙特異性抗體與HPB ALL細胞上的CD3之結合作用係藉由根據本技藝已知的標準程序來執行之流動式細胞測量術來證明。與細胞表現的CD3之結合作用係使用轉染CD3δ/ε或CD3γ/ε的CHO細胞來確認。候選雙特異性IgG1與CLEC12A之結合作用係使用一種CLEC12A表現建構物轉染的CHO細胞予以判定；分析內包括一種CD3單特異性抗體及一種CLEC12A單特異性抗體，及不相干的IgG1同型對照mAb 作為對照(諸如，結合CD3及另一種抗原例如破傷風毒素(TT)的抗體)。
候選CLEC12A/CD3雙特異性抗體的CD3及CLEC12A Fabs對於其等之標靶的親和力能藉由表面電漿子共振(SPR)技術、使用BIAcore T100來測量。簡言之，抗人類IgG小鼠單株抗體(Becton and Dickinson, cat. Nr. 555784)係使用游離胺化學(NHS/EDC)偶合至CM5感測器晶片表面。繼而捕捉bsAb於感測器表面上。隨後，一濃度範圍之重組純化的抗原人類CLEC12A(Sino Biological Inc, cat. Nr. 11896-H07H)與人類CD3δε-Fc蛋白於感測器表面移動來測量締合及解離速率。於每週期之後，通過HCl脈衝使感測器表面再生且再次捕捉bsAb。從得到的感應圖，使用BIAevaluation軟體來判定締合及解離速率以及結合人類CD3及CLEC12A的親和力值，如前所述(諸如US 2016/0368988)。
一種CLEC12A/CD3雙特異性抗體之T細胞刺激能力可以一分析來判定，其係使用根據WO2014/051433及US 2016/0368988中描述的程序獲得的健康的捐贈者休眠T細胞。舉例而言，一種候選CLEC12A/CD3雙特異性抗體係以純化的健康的捐贈者休眠T細胞與來自白血病衍生的HL60細胞株的細胞以10:1或5:1的效應子：標靶細胞比率、於10%胎牛血清(FBS)或10%正常的人類血清(HS)內培育歷時二天來測試。結果表現為CD4陽性或CD8陽性T細胞族群內的CD69陽性或CD25陽性細胞百分率。
CLEC12A/CD3雙特異性抗體誘發標靶細胞溶解的能力可以一分析來測試，其係使用白血病細胞例如羧基螢光素二乙酸酯琥珀醯亞胺酯(carboxyfluorescein diacetate succimidyl ester，CFSE)標記的HL-60細胞且與來自健康的捐贈者的T細胞共培養，根據WO2014/051433及US 2016/0368988中描述的程序。存活的CFSE陽性細胞係藉由流動式細胞測量術來定量，以及結果表現為關於PBS對照條件之特異性溶解的百分率。
於一態樣中提供一種藥學組成物，其包含一CLEC12A/CD3雙特異性抗體及一藥學上可接受的載劑。當使用於本文中，術語「藥學上可接受的」意指由政府管理機構核准或列於美國藥典或其他通常公認的藥典內供用於動物中，更特定言之於人類中，以及包括生理上可相容之任何及所有溶劑、鹽類、分散媒介、包衣、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲透壓性及吸收延遲劑及類似物。術語"「載劑」係指一種隨著該化合物投予的稀釋劑、佐劑、賦形劑或媒介物。此等藥學載劑可為無菌液體，例如水及油，包括石油、動物、植物油或合成來源的該等油，例如花生油、大豆油、礦油、芝麻油、甘油蓖麻醇酸酯及其類似物。可利用水或食鹽水溶液及右旋糖和甘油水溶液作為載劑，特別是用於可注射的溶液。供非經腸投予之液體組成物可調配供注射或連續灌注之投予。注射或灌注之投予途徑包括膀胱內、腫瘤內、靜脈內、腹膜內、肌肉內、鞘內及皮下。取決於投予途徑(諸如例如，靜脈、皮下、關節內及類似物)活性化合物可塗覆一材料以防護化合物不受酸及其他可能使化合物不活化的自然條件作用。
合適供投予人類患者之藥學組成物通常予以調配例如於液體載劑內供非經腸投予，或合適先還原(reconstitution)成液體溶液或懸浮液供靜脈投予。組成物可調配呈劑量單位型式以易於投予及劑量均一。
亦包括固體製備物用於使用前立刻轉換成液體製備物供口或非經腸投予。此等液體型式包括溶液、懸浮液及乳劑。
本文提供的組成物及方法對於活化患者內的一T細胞或T細胞是特別有用的。該患者有癌症或處於患癌症的風險。後者為處於癌症緩解及癌症復發、再發或轉移的風險的患者。因此，該組成物及方法可用於治療各種的骨髓惡性腫瘤(malignancies)，包括骨髓性白血病及骨髓來源的白血病前期疾病。因此，可依據本文提供的方法治療的疾病包括骨髓性白血病(如AML及CML)或白血病前期疾病如骨髓發育不良症候群(MDS) (且進展至AML)、骨髓纖維化(MF)或骨髓增生性贅生物急性期(MPN-BP)。
當使用於本文中，該雙特異性抗體CLEC12A/CD3雙特異性抗體可組合另一治療分子。此組合投予(共同投予)包括該CLEC12A/CD3雙特異性抗體及IL-15部分呈相同或不同的劑量型式之同時投予、分別投予或相繼投予。因此，在一些具體例中，一種CLEC12A/CD3雙特異性抗體可用於一種用於活化個體內的T細胞的方法，其中該CLEC12A/CD3雙特異性抗體係與一IL-15部分同時、分別或相繼投予。在其他的具體例中，一種CLEC12A/CD3雙特異性抗體可用於治療一個體的癌症，其中該CLEC12A/CD3雙特異性抗體可與一IL-15部分同時、分別或相繼投予。
在其他的具體例中，一種CLEC12A/CD3雙特異性抗體可用於製造用於活化一個體的T細胞之藥物，其中該CLEC12A/CD3雙特異性抗體係與一IL-15部分同時、分別或相繼投予。一種包含一CLEC12A/CD3雙特異性抗體及一IL-15部分之產品可為一種組合製備物供同時、分別或相繼使用於活化一個體的T細胞。在其他的具體例中，一種CLEC12A/CD3雙特異性抗體可用於製造用於治療一個體的癌症之一藥物，其中該CLEC12A/CD3雙特異性抗體可與一IL-15部分同時、分別或相繼投予。一種包含一CLEC12A/CD3雙特異性抗體及一IL-15部分之產品可為一種組合製備物供同時、分別或相繼使用於治療一個體的癌症。
IL-15部分可依照合適的劑量、途徑(例如靜脈內、腹膜內、肌肉內、鞘內或皮下)投予。
該CLEC12A/CD3雙特異性抗體及IL-15部分能以單一調配物同時投予。任擇地，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體及IL-15部分能調配供用於分別投予，其中其等係並行或相繼投予。
在一些具體例中，該IL-15部分及該CLEC12A/CD3雙特異性抗體係同時投予。
在一具體例中，一個體係投予單一劑量的IL-15部分及單一劑量的該CLEC12A/CD3雙特異性抗體。在一些具體例中，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體及IL-15部分將會重複投予，持續一個療程。舉例而言，在某些具體例中，多重(例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)劑量的IL-15部分及多重(如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多)劑量的CLEC12A/CD3雙特異性抗體係投予給有需要治療的個體。
在一些具體例中，一IL-15部分及一CLEC12A/CD3雙特異性抗體的投予可以每週進行，於該方案中，其等可以於同一天(例如同時)投予，或一個接一個(例如，於另一者之前或之後一或多分鐘、小時或天)。當分別投予時，該CLEC12A/CD3雙特異性抗體及IL-15部分可以，但不一定依據相同的投予(即用劑)程序來投予。該IL-15部分之治療有效的劑量之投予可以比CLEC12A/CD3雙特異性抗體更常或更不常投予。在某些具體例中，該IL-15部分及該CLEC12A/CD3雙特異性抗體之每劑量投予可以於同一天，或任擇地，該IL-15部分可以於該CLEC12A/CD3抗體之前或之後1天或更多天投予。
為了方便，如果需要的話，總每日劑量可以分開且於期間內分批投予。亦可以使用間歇療法(例如，3週中的1週或4週中的3週)。
在一些具體例中，本文提供的方法中使用的該IL-15部分為重組人類IL-15(rhIL-15)。在某些具體例中，以每天大約0.125 µg/kg至每天2.0 µg/kg的劑量投予rhIL-15。在某些具體例中，以每天0.125、0.25、0.5、1.0或2.0 µg/kg投予rhIL-15。在某些具體例中，該rhIL-15係藉由靜脈速注投予。在其他的具體例中，該rhIL-15係藉由連續靜脈灌注(CIV)投予。在某些具體例中，該rhIL-15係藉由CIV於2至10天、5至10天或7至10天之間內投予。在一具體例中，該rhIL-15係藉由CIV投予10天。在相關的具體例中，該rhIL-15係於大約30及60天之間的治療週期內投予，其中該rhIL-15於每週期最初的5至10天係藉由CIV予以投予。
在一些具體例中，依據本文提供的方法投予的該IL-15部分為可溶性IL-15受體或受體片段(sIL-15Ra)。在其他的具體例中，該IL-15部分為包含IL-15及sIL-15Ra的錯合物，舉例而言，如US 9,255,141及US 9,328,159中所述。在某些具體例中，該IL-15/IL-15Ra錯合物係以大約0.1 µg/kg至大約20 µg/kg、大約10 µg/kg至大約20 µg/kg、大約20 µg/kg至大約40 µg/kg，或大約25 µg/kg至50 µg/kg的劑量投予給個體。
在某些具體例中，該IL-15部分係皮下投予的IL-15/IL-15Ra。在一些具體例中，該IL-15/IL-15Ra錯合物係以每天、每隔一天、每3、4、5、6或7天的頻率投予。在某些具體例中，每週投予IL-15/IL-15Ra 1、2、3、4、5、6或7天。在某些具體例中，第一週期及每後續週期的劑量為0.1 µg/kg至1 µg/kg、1 µg/kg至5 µg/kg或5 µg/kg至10 µg/kg。在另一具體例中，第一週期及每後續週期的第一劑量為0.1 µg/kg至0.5 µg/kg、1 µg/kg至2 µg/kg、1 µg/kg至3 µg/kg、2 µg/kg至5 µg/kg或2 µg/kg至4 µg/kg。在另一具體例中，第一週期及每後續週期的劑量為0.1 µg/kg、0.25 µg/kg、0.5 µg/kg、1 µg/kg、1.25 µg/kg、1.5 µg/kg、1.75 µg/kg、2 µg/kg、2.25 µg/kg、2.5 µg/kg、2.75 µg/kg、3 µg/kg、3.25 µg/kg、3.5 µg/kg、4 µg/kg、4.25 µg/kg、4.5 µg/kg、4.75 µg/kg或5 µg/kg。在一具體例中，該IL-15/IL-15Ra錯合物係按照28天週期予以投予其中該IL-15/IL-15Ra錯合物係每週皮下投予三次連續二週。
在還有其他的具體例中，本文提供的方法中使用的該IL-15部分為長效型的IL-15，舉例而言，IL-15及水溶性聚合物的複合物(conjugate)，舉例而言於WO 2015815373內所述。本技藝具有通常技術者可判定足夠於IL-15受體("IL-15R")提供臨床相關的促效劑活性之長效、IL-15促效劑的量。在一些具體例中，IL-15聚合物複合物係以由大約0.001 mg/kg至大約10 mg/kg，較佳由大約0.001至大約5 mg/kg的劑量投予。在某些具體例中，IL-15聚合物複合物係以大約0.03 mg/kg至大約3 mg/kg的劑量投予。在某些具體例中，IL-15聚合物複合物係以大約0.03 mg/kg、大約0.1 mg/kg、大約0.3 mg/kg或大約3.0 mg/kg的劑量投予。在其他的具體例中，IL-15聚合物複合物係以大約0.0025 mg/kg、大約0.008 mg/kg、大約0.01 mg/kg、大約0.025 mg/kg、0.05 mg/kg或大約0.25 mg/kg的劑量投予。
只要臨床醫生監督的患者照護認為該治療方法有效，即，患者對治療有回應，本文所述之治療方法通常會持續。表示治療方法有效的非限制性參數可包括下列中之一或多者：腫瘤細胞減少；抑制腫瘤細胞增殖；腫瘤細胞消除；無惡化存活期；合適的腫瘤標識適當的回應(如果適用)；NK(天然殺手)細胞數目增高；CLEC12A特異性T細胞數目增高；及CLEC12A特異性記憶T細胞數目增高。
關於投予該CLEC12A/CD3雙特異性抗體的頻率，本技藝具有通常技術者將能夠判定適當的頻率。舉例而言，臨床醫生能決定相對很少投予該CLEC12A/CD3雙特異性抗體(如每二週一次)以及在患者耐受時逐步縮短劑量之間的期間。當投予IL-15部分時，此等製劑的頻率可以類似的方式來判定。依據所主張的方法之療程有關的例示性時間長短包括：大約1週；2週；大約3週；大約4週；大約5週；大約6週；大約7週；大約8週；大約9週；大約10週；大約11週；大約12週；大約13週；大約14週；大約15週；大約16週；大約17週；大約18週；大約19週；大約20週；大約21週；大約22週；大約23週；大約24週；大約7個月；大約8個月；大約9個月；大約10個月；大約11個月；大約12個月；大約13個月；大約14個月；大約15個月；大約16個月；大約17個月；大約18個月；大約19個月；大約20個月；大約21個月；大約22個月；大約23個月；大約24個月；大約30個月；大約3年；大約4年；大約5年；永恆(例如持續的維持療法)。上述期間可能與一或多回/週期治療有關。
本文提供的治療方法之功效可使用任何合適的手段來評估。在一具體例中，組合治療的臨床功效係使用骨髓內的AML芽細胞減少來分析作為客觀反應準則。根據本文揭示之方法治療之患者，諸如人類較佳經歷癌症之至少一種徵象之改善。在一些具體例中，可能發生下列中之一或多者：可降低癌細胞的數目；預防或延遲癌症復發；癌症相關聯的一個或多個症狀可在一定程度上得到緩解。此外，判定T細胞媒介的標靶細胞溶解之活體外分析(如WO2017/010874中所述)能用自個體單離的AML腫瘤芽細胞來執行。
在一些具體例中，於如本文所述之治療後不再可偵測到腫瘤細胞。在一些具體例中，個體係部分或完全緩解。在某些具體例中，個體的整體存活期、中位數存活率、及/或無惡化存活期增高。
本發明的治療(例如CLEC12A/CD3雙特異性抗體)或連同一IL-15部分之組合治療，亦可與因其針對要治療的癌症之特殊用途而選出的其他知名療法聯合使用。本發明之組合與已知的藥學上可接受的製劑於適當時可以任擇地相繼使用。
供安全且有效的投予化學治療劑的方法為熟習此項技術者已知的。此外，其等之投予於標準文獻中有說明。舉例而言，許多的化學治療劑的投予於Physicians' Desk Reference (PDR)，例如，1996版(Medical Economics Company, Montvale, N.J. 07645-1742, USA)中有說明；其之揭露內容併入至該處以作為參考資料。
投予化學治療劑及/或放射線療法可取決於待治療的疾病及化學治療劑及/或放射線療法對該疾病的已知效應而變化，對於熟習此項技術者會是顯而易見的。並且，依據熟練的臨床醫生的知識，治療程序(例如投予劑量的量及次數)可基於投予的治療劑觀察到的對患者之效應，以及基於該疾病對投予的治療劑觀察到的反應而變化。
本文所述之所有文件及參考資料，包括Genbank登錄、專利及公開的專利申請案以及網站，係各自明確併入本文以作為參考資料，如同其等是全部或部分寫在本文件中。
現在參照下列實施例 來說明本發明，該等僅用於說明且不是要限制本發明。雖然已詳細說明本發明且參考其之特定具體例，但可以對其進行各種改變及修飾而不偏離其精神與範圍對於本技藝中具有技術者會是顯而易見的。
為了清晰和簡潔的描述，本文所述之特徵為相同或獨立具體例的一部分，然而，會瞭解到本發明的範疇可包括具有所述之全部或某些特徵的組合之具體例。 實施例 實施例1材料及方法 流動式細胞測量術
使用Coulter FC500, Cyan-ADP, Gallios或NAVIOSTM流式細胞儀(Beckman Coulter)或FACS CantoA(BD Biosciences)來執行流動式細胞測量術。資料係使用Flowjo軟體(TreeStar Inc)或Kaluza軟體®(Beckman Coulter)予以分析。芽細胞根據CD45/SSC及CD3(針對T細胞)、排除淋巴細胞而定義為SSC+/- CD45DIM及/或CD45POS細胞。
1. 抗體MF4327xMF5196相對於同型對照IgG於細胞株上的特異性結合模式係用以抗人類IgG-PE抗體來顯現之非複合的抗體予以評估。
2. 使用Oregon Green-複合的IgG批次組合以a) CD1c-PE、CD19-ECD、CD3-PECY5、CD56-PECY7(Beckman Coulter)、CD8-AF700、CD4-Pacific blue、CD45-Krome orange；或b) CD303-PE、CD304-PE、CD14-ECD、CD33-PECY5、CD16-PECY7及CD45-Krome orange來測試抗體MF4327xMF5196雙特異性抗體相對於同型對照IgG於健康的捐贈者衍生的末梢血液樣本內之特異性結合模式。
3.使用PE-複合的IgG批次組合以譜系(CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56)-FITC、CD38-ECD、7AAD、CD34-PECY7、CD10-APC、CD45RA-AF700、CD135a-BV421、CD90-BV510及CLEC12A-PE (R&D Systems)來測試健康的捐贈者衍生的骨髓樣本之CD34POS部分的抗體MF4327xMF5196雙特異性抗體相對於同型對照IgG之特異性結合模式。
4. 以HL60細胞進行之細胞毒性分析中的T細胞活化係使用CD25-PE、7AAD、CD3-PECY7、CD69-APC、CD8-AF700及CD4-BV421予以判定。
5. 單核球細胞毒性係使用CD14-FITC、CD16-PE、CD19-ECD、7AAD、CD3-PECY7、CD69-APC及CD8-AF700來定量。
6. 為了定量T細胞增殖，T細胞係用7AAD、CD3-PECY7、CD8-AF700及CD4-BV421來顯現。
7. 使用a)CLEC12A-PE(Biolegend)、7AAD、CD34-PECY7、CD10-APC-AF750及CD5-BV421；及b)用CD90-FITC、CLEC12A-PE(Biolegend)/IgG2a-PE、CD38-ECD、7AAD、CD34-PECY7、CD10-APC、CD45RA-AF700、CD123-BV421或CD135a-BV421及譜系(CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56)-BV510來定量CD34POS骨髓前驅體細胞之細胞毒性。
8. 用AML芽細胞及純化的T細胞進行的細胞毒性分析中使用的AML芽細胞上的CLEC12A表現係使用a)CLEC12A-PE(R&D Systems)、CD14-ECD、CD33-PECY5、CD38-PECY7、CD117-APC、CD19-AF700、CD34-BV421及CD45-krome orange；或b)CLEC12A-PE(R&D Systems)、CD19-ECD、CD3-PECY5、CD56-PECY7(Biolegend)、CD8-AF700、CD4-BV421及CD45-krome orange來定量。
9.於使用AML芽細胞及純化的T細胞之細胞毒性分析之抗體MF4327xMF5196的功效係使用a) CD197-AF488、CD4-PE、CD45RO-ECD、7AAD、CD3-PECY7、CD8-AF700及CD45RA-太平洋藍；及b) CD25-PE、CD4-ECD、7AAD、CD3-PECY7、CD117-APC、CD8-AF700、CD34-BV421及CD45-krome orange來定量。
10. AML芽細胞上的CLEC12A表現係使用a) (1,000 ng/mL條件) CD14-FITC、CLEC12A-PE(R&D Systems)/IgG2b-PE、CD34-ECD、7AAD、CD33-PECY7、CD8-AF700、CD4-BV421及CD45-krome orange；或b) (200 ng/mL條件) CD14-FITC、CLEC12A-PE(R&D Systems)、CD34-ECD、CD4-PECY5.5、CD117-APC、CD8-AF700、CD33-APC AF750及CD45-krome orange予以判定。
11. 抗體MF4327xMF5196於原發性AML芽細胞樣本內的功效係使用a) (1,000 ng/mL條件)CD14-FITC、CD34-ECD、7AAD、CD33-PECY7、CD3-APC、CD8-AF700、CD4-BV421及CD45-krome orange；或b)(200 ng/mL條件)CD3-FITC、7AAD、CD4-PECY7、CD8-AF647、CD45RA-AF700、CD33-APC AF750及CD45-krome orange予以評估。雙特異性 抗體
如實施例及實施例提及的圖中使用的抗體MF4327xMF5196為具有序列表概要內的SEQ ID：NO 56之IgVk1-39*01的共同的輕鏈可變異區域、對CLEC12A及CD3有特異性之全長人類IgG1雙特異性抗體。其具有MF4327的重鏈可變異區域及序列表概要描述的MF5196之重鏈可變異區域。抗體的恆定部分可以為效應子功能沈默的或不如所示者。負對照抗體為針對破傷風類毒素之cLC單特異性抗體(TTxTT IgG，同型對照(de Kruif, Kramer等人之2009))及針對破傷風類毒素及CD3之cLC雙特異性抗體(MockxCD3或TTxCD3 IgG，使用如抗體MF4327XMF5196相同的CD3 Fab)；陽性對照抗體為針對CD3之二價cLC單特異性抗體(CD3xCD3，亦使用如抗體MF4327xMF5196相同的CD3 Fab)。於起始的雙特異性抗體批次方面，靜電工程處理的重鏈用於暫時生產，導致>95%純度的雙特異性IgG1(Gunasekaran, Pentony等人之2010)。稍後的批次生產係使用重鏈Fc工程處理其中於CH3界面處導入含括帶電殘基的專屬突變(proprietary mutations)(De Nardis, Hendriks等人之2017)。除非另有規定，否則抗體MF4327xMF5196、MockxCD3及TTxTT IgG之IgG批次一旦導入變化至CH2區域內便缺乏Fc效應子功能。親和力測量
抗體MF4327xMF5196係經由小鼠抗人類IgG單株抗體(BD Biosciences)而固定於CM5晶片(GE Healthcare)上。隨後使用Biacore T100儀器(GE Healthcare)使重組純化的CLEC12A-His(Sino Biologicals)或重組CD3δε-Fc蛋白在表面移動。活體內 藥物動力學 研究
C57Bl/6J小鼠接受單一靜脈劑量的1 mg/kg抗體MF4327xMF5196。各種時間點的抗體MF4327xMF5196血清位準係使用抗人類IgG ELISA(ZeptoMetrix)來定量。細胞株
HL60細胞(DSMZ)培養於含有2mM l-麩醯胺酸及10% FBS(Integro)之IMDM(GIBCO Invitrogen, 21980-065)內。CHO-K1(DSMZ)、Jurkat E6.1(LGC)及J.RT-T3.5(LGC)細胞株維持於補充2mM l-麩醯胺酸及10% FBS(ThermoFisher Scientific)之DMEM/F12(GIBCO Invitrogen, 11320-033)內。CLEC12A-CHO-K1細胞株係藉由穩定嵌入編碼人類CLEC12A之pcDNA3.1+載體(ThermoFisher Scientific)來產生。臨床 樣本
AML患者樣本(表III)及健康的捐贈者的骨髓係依據赫爾辛基宣言及RUMC機構指導方針及規定來獲得。為了儲存於液態氮，使細胞再懸浮於含有7%二甲亞碸(DMSO；Sigma-Aldrich, W387509)及10%胎牛血清(FBS, Integro)之IMDM培養基內。解凍後，細胞於含有250 µg/mL DNAse(Roche, 11284932001)及1.25 mM MgCl2 的10%人類血清(HS, PAA laboratories)內培育10 min。隨後，用超量的培養基清洗細胞。純化的 T 細胞之細胞毒性分析
藉由密度梯度離心以從健康的捐贈者或AML患者採集的末梢血液(PB)單離人類末梢血液單核細胞(PBMCs) (患者特徵參見表III)。CD3POS T細胞係藉由使用磁性細胞分選(MACS, Miltenyi, 130-096-535)之負向選擇而從新鮮單離或冷凍保存的PBMCs予以純化。細胞毒性分析於補充10% AB+ HS(Sanquin)的IMDM內、於96孔平盤(NuncTM, ThermoFisher Scientific)進行。除非另有規定，否則使用105 個T細胞。使用CFSE標記的HL60或原發性AML芽細胞標靶細胞(ThermoFisher Scientific, C11-57)。在CFSE標記前，AML芽細胞係於補充100 ng/mL GM-CSF(Immunotools, 11343125)、100 ng/mL G-CSF(Amgen Inc, Neupogen®)、50 ng/mL IL-3(Cellgenix)、25 ng/mL SCF(Immunotools, 11343325)及20 ng/mL Flt3L(Immunotools, 11343305)之分析培養基內預培養過夜。隨後，T細胞及標靶細胞係在抗體MF4327xMF5196或對照IgGs存在下、於同樣的細胞介素補充分析培養基內共培養。於24-72小時之後，T細胞活化及剩餘的CFSEPOS 標靶細胞的數目係藉由流動式細胞測量術來定量(關於圈選策略參見圖7)。特異性溶解的百分率計算如下：特異性溶解(%)=100 - [(100 x有IgG的條件之標靶細胞數目)/(於沒有IgG的條件之平均標靶細胞數目)]。PBMC 為基的單核球 細胞毒性分析
PBMCs(2x105 )係在抗體MF4327xMF5196或對照IgGs存在下、於有10% AB+ HS之IMDM內培育48小時。收穫前，離心(500g，5分鐘)分析平盤來收集上清液用於細胞介素定量化。於2-8℃的後續培育1小時之後，細胞不清洗而於分析培養基內予以染色。單核球、B細胞及自然殺手(NK)細胞之特異性溶解係由每分析孔採集固定體積、藉由流動式細胞測量術來定量(圖8)。T 細胞 增殖分析
CFSE標記的CD3POS T細胞與CD14POS MACS-純化的(Miltenyi, 130-050-201)自體單核球係以5:1的E:T比率、在有或沒有測試IgG的情況下、於有10%AB+ HS之IMDM內共培養。於5天之後，增殖的T細胞部分係藉由流動式細胞測量術以顯現為CFSE低 T細胞。細胞介素 分析
培養上清液內的IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF、TNF-α及IFN-γ的位準係使用Luminex®平台(Life Technologies, LHC0001)來測量。健康的捐贈者 骨髓 細胞之細胞毒性分析
CD3POS T細胞及CD34POS 細胞係使用MACS(分別為Miltenyi, 130-046-702及130-050-101)、藉由正向選擇而從健康的捐贈者骨髓單核細胞(獲自骨科患者或購買於Lonza, 2M-125C)單離。產生預活化的T細胞係藉由於補充10% HS A+(Sanquin血庫)及30 IU/mL IL-2(Chiron, Proleukin®)之IMDM內、在預塗覆抗CD3(1 µg/mL, BD Bioscience, 555329)及抗CD28(2 µg/mL, BD Bioscience, 555725)之平盤內活化純化的T細胞6天，接著於有30 IU/mL IL-2之平盤內休眠過夜。隔天，預活化的T細胞與自體CD34POS細胞係於抗體MF4327xMF5196或對照條件存在下、在96孔平盤(Corning Costar, 3799)內、於補充10% A+ HS之IMDM中、以10:1的E:T比率共培養。於16小時之後，抗體MF4327xMF5196的影響係藉由流動式細胞測量術以及如以下所述之群落群落形成單位(CFU)分析來定量各種CD34POS 前驅體族群。關於流動式細胞測量術之定量化，使用流動計數螢光(Beckman Coulter, 7547053)。關於圈選策略參見圖10及11。群落形成單位 (CFU) 分析
T細胞及CD34POS 細胞之共培養物於清洗後依據製造商的指示、播種於MethoCult GF H84435(Stemcell Technologies, 84435)內用於分析紅血球及單核-骨髓性細胞群落生長物以及於MegaCultTM -C(有添加的人類低密度脂蛋白(40 µg/mL, 02698)之細胞介素(04971)的完整套組，二者均來自Stemcell Technologies)內用於分析巨核細胞群落形成。關於MethoCult及MegaCultTM -C分析二者，根據沒有IgG條件之CD34POS 細胞計數來播種二種不同的濃度的共培養物，以及抗體MF4327xMF5196-及對照IgG治療的共培養物播種等體積的細胞。關於MethoCult分析，非IgG治療條件的1x103 及5x102 CD34POS 細胞以三複本播種於35 mm培養皿(Corning, 430165)內，以及關於MegaCult-C分析，二室培養玻片的每室播種7.5x103 及2.5x103 CD34POS 細胞且各條件製備二玻片。於13-15天培養後評分紅血球、單核-骨髓性細胞及巨核細胞群落的數目，以及收穫隨後MethoCult培養且係藉由流動式細胞測量術來分析單核及骨髓性細胞的標誌。原發性 AML 樣本 之 細胞毒性分析
原發性AML患者樣本(5x105 個細胞)係於含有10% AB+ HS、2.5 ng/mL GM-CSF、12.5 ng/mL G-CSF(Neupogen, Amgen)、6.25 ng/mL IL-3(Immunotools, 11340035)、3.0 ng/mL SCF及2.5 ng/mL Flt3L之IMDM內、在抗體MF4327xMF5196或對照雙特異性IgG存在下培養。於24小時之後，添加20 ng/mL IL-15(Miltenyi, 130-095-766)至培養物。於10天之後，通過流動式細胞測量術來定量AML芽細胞溶解及T細胞擴增。
抗體 MF4327xMF5196 於 人類 AML 患者之 用劑 方案 。
首次於人類研究中探索MF4327xMF5196抗體作為單一製劑，其係於3-6位患者群使用劑量遞增。患者接受經設計來提供有效且安全的劑量之投予方案的抗體。該抗體以2-4小時輸注來投予。按時間間隔來計劃治療。設計投予方案以防止並最小化細胞介素釋放症候群(CRS)之嚴重性及發生率。
治療方案具有第一週期應用的組份(於最初的28天期間)。啟動劑量(C1D1)；逐步調升及固定的全用劑(C1D4，C1D8，C1D15)以及使用治療前給藥。啟動劑量：以低劑量(1 mg，3 mg，5 mg)給予第一次投予(C1D1)。逐步調升用劑：於C1D1後給予逐步增加劑量的後續劑量直到給予計畫的全劑量為止。逐步調升用劑包括於第一週期間更頻繁的投予。於第一週每3天給予治療(D1-D4-D8)然後每7天給予治療(每週一次)。固定的全用劑：於第15天給予全劑量以及從那時給予固定的全劑量治療。治療前給藥：於每種MF4327xMF5196抗體劑量前給予包括乙醯胺酚及抗組織胺(抗H1)。
於第一週期之後，以每週一次的方案繼續全劑量給予(第1-8-15-22天)。輸注一直伴隨治療前給藥於2-4小時內給予。
於一群內，患者於第1天接受1 mg之啟動劑量，接著於第4天接受3 mg及於第8天接受15 mg之逐步調升劑量，以及於第15天接受25 mg之全劑量。
於另一群內，患者於第1天接受3 mg之啟動劑量，接著於第4天接受10 mg及於第8天接受25 mg之逐步調升劑量，以及於第15天接受40 mg之全劑量。
於另外一群內，患者於第1天接受5 mg之啟動劑量，接著於第4天接受15 mg及於第8天接受25 mg之逐步調升劑量，以及於第15天接受60 mg之全劑量。
追蹤患者對治療的反應，包括分析每劑量前以及於輸注結束之後4小時和24小時的細胞介素位準。結果 抗體 MF4327xMF5196 特異地結合正常的 造血腔室內之 CLEC12APOS 及 CD3POS 細胞
抗體MF4327xMF5196為經開發要治療CLEC12a陽性癌細胞，例如AML內存在者的T細胞-靶向雙特異性抗體。其結合T細胞上的CD3及AML芽細胞及LSCs上的CLEC12A。抗體MF4327xMF5196根據共同的輕鏈(cLC)雙特異性IgG格式而為人類全長IgG1雙特異性抗體。
使用腫瘤細胞株的流動式細胞測量術顯示出抗體MF4327xMF5196特異性結合CLEC12A及CD3(圖1A)。經由其CLEC12A臂，其結合CLEC12APOS HL60細胞以及轉染人類CLEC12A之CHO-K1細胞，但不結合親代CHO-K1細胞。經由其CD3臂，其結合CD3POS JurkatE6.1細胞，但不結合CD3NEG Jurkat J.RT-T3.5細胞。
抗體MF4327xMF5196對於其標靶蛋白之親和力針對CLEC12A為3 nM及針對CD3為177 nM，其係使用重組蛋白、依表面電漿子共振技術來判定。為了調查抗體MF4327xMF5196之工程處理的Fc區域對於藥物動力學(PK)是否有可能的影響，所以測定抗體MF4327xMF5196於C57BL/6J小鼠內之活體內 半生期且發現為226小時(9.4天)。此半生期落在人類IgG1抗體於嚙齒動物體內通常觀察到的活體內半生期範圍內，表示人類cLC雙特異性抗體的特異性設計對於IgG之非特異性消除途徑沒有效應。
正常末梢血液內之抗體MF4327xMF5196之結合剖析分析顯示抗體MF4327xMF5196結合CD3表現CD4POS 及CD8POS T細胞以及結合CD3POS CD56POS NK T(NKT)細胞(圖1B)。與先前報導的CLEC12A表現剖析一致(Bakker, van den Oudenrijn等人之2004, Marshall, Willment等人之2004, Lahoud, Proietto等人之2009)，抗體MF4327xMF5196亦結合單核球、骨髓樹突細胞(mDC)、漿細胞樹突細胞(pDC)及顆粒球，但不結合自然殺手(NK)細胞或B細胞(圖1B且資料未顯示)。於正常的骨髓內，抗體MF4327xMF5196於CD34POS 前驅體腔室內之結合剖析(圖1C)亦與報導的CLEC12A表現剖析(van Rhenen, van Dongen等人之2007)類似。抗體MF4327xMF5196一致地結合顆粒球-巨噬細胞前驅體(GMP)細胞，而其只結合小部分的共同骨髓前驅體(CMP)及巨核細胞-紅血球前驅體(MEP)亞群。值得注意的是，於包括多潛能前驅體(MPP)及多潛能的造血幹細胞(HSC)之CD34POS CD38NEG 腔室內未觀察到抗體MF4327xMF5196結合。 抗體MF4327xMF5196 誘發CLEC12A 特異性T細胞活化及CLEC12APOS HL60 細胞溶解
接著，吾人以細胞毒性分析來判定CLEC12AxCD3雙特異性IgG抗體誘發CLEC12A抗原特異性T細胞活化及CLEC12APOS 標靶細胞溶解的能力。效應子細胞為健康的捐贈者衍生的休眠T細胞而標靶細胞為CLEC12APOS HL60細胞。於此分析中，有野生型(WT)Fc區域(完整的Fc效應子功能)之MF4327xMF5196雙特異性抗體與格式化為WT Fc區域之MockxCD3對照IgG作比較。MF4327xMF5196雙特異性抗體於24及48小時後誘發CD4及CD8 T細胞上CD69(圖2A)及CD25上調(資料未顯示)。T細胞媒介的HL60細胞溶解於24小時之後已經很明顯且於48小時之後測量到>95% HL60細胞之細胞毒性(圖2B)。標靶細胞溶解與效應子與標靶比率(E:T比率)有相關性且於5:1或更高的E:T比率溶解最大(圖9)。值得注意的是，CLEC12AxCD3誘發的溶解活性為CLEC12A抗原媒介的(圖2A，B)；MockxCD3對照過一段時間才觀察到一些T細胞活化及HL60標靶細胞溶解。不過，這表明具WT Fc之雙特異性IgG格式能在不需要CLEC12A結合之下誘發Fcγ受體媒介的T細胞活化(圖2A及B，72小時)。具 沈默的 Fc 效應子功能之 抗體 MF4327xMF5196 誘發 CLEC12APOS AML 細胞株 之 特異性溶解
為了防止雙特異性抗體MF4327xMF5196誘發非特異性Fcγ受體媒介的細胞溶解，藉由導入變化至二個IgG1重鏈的CH2區域內來產生缺乏Fc效應子功能之雙特異性IgG格式。各種減輕Fc效應子功能的手段為本技藝已知的。與CD16、CD32及C1q之結合，以及與CD64之結合減少達>200倍係經由Fc工程處理來修飾CH2域內的殘基來達成。於使用正常的休眠T細胞及CLEC12APOS HL60細胞之細胞毒性分析中，抗體MF4327xMF5196誘發CD4 T細胞及CD8 T細胞上的CD69(圖2C)及CD25(圖2D)上調。抗體MF4327xMF5196誘發的活性之最敏感的讀出為CD8 T細胞上之CD69上調且平均半最大有效濃度(EC50 )為44 ng/mL(表I)。更重要的是，抗體MF4327xMF5196誘發T細胞媒介的HL60細胞溶解且100 ng/mL及以上的濃度有>80%的溶解，以及68 ng/mL之平均EC50 (圖2E，表I)。雖然具野生型Fc效應子功能之MockxCD3抗體於第2天已看見CD4及CD8 T細胞活化(圖2A，1000 ng/mL)，但Fcγ受體沈默的MockxCD3抗體於48小時後沒有觀察到T細胞活化，即使在8000 ng/mL(圖2C-D)。此全部一起顯示通過Fcγ受體沈默的抗體MF4327xMF5196誘發的T細胞之細胞毒性(圖2C-E)為CLEC12A抗原特異性的。
此等資料共同證明了具有降低的Fc效應子功能之抗體MF4327xMF5196媒介CLEC12A特異性T細胞活化且有效地重定向此等T細胞以誘發CLEC12APOS HL60細胞溶解的能力。抗體 MF4327xMF5196 誘發自體 T 細胞特異性溶解 CLEC12APOS 單核球
抗體MF4327xMF5196通過休眠自體T細胞誘發重定向的CLEC12APOS 單核球溶解的能力係以PBMC培養物來判定。抗體MF4327xMF5196誘發CD4細胞及CD8 T細胞的活化(圖3A)，且溶解單核球(從100 ng/mL，圖3B)。重要的是，抗體MF4327xMF5196誘發的活性係CLEC12A特異性，因MockxCD3對照於高達10,000 ng/mL的濃度都不會誘發可觀察的T細胞活化或單核球溶解(圖3A-B)。此外，抗體MF4327xMF5196活化的細胞毒性T細胞之溶解的活性係對CLEC12A抗原表現細胞有選擇性，因B細胞及NK細胞部分不受影響，即使在最高測試的抗體MF4327xMF5196濃度(圖3C且資料未顯示)。
此等資料證明抗體MF4327xMF5196經由自體T細胞之重定向及活化能有效地誘發CLEC12A-限制性重定向的CLEC12APOS 單核球溶解。CLEC12A 特異性誘發細胞介素釋放及 T 細胞 增殖
接著，研究抗體MF4327xMF5196於單核球與自體休眠T細胞共培育後誘發T細胞增殖的能力。100及1,000 ng/mL之抗體MF4327xMF5196有效地誘發CD4及CD8 T細胞二者之CLEC12A特異性增殖(圖3D)。於共培養5天之後，MockxCD3對照沒有誘發任何T細胞增殖，再次證明抗體MF4327xMF5196功能為CLEC12A特異性的。
接著，於1,000 ng/mL之抗體MF4327xMF5196暴露48小時後測量此等PBMC培養物內的細胞介素位準。抗體MF4327xMF5196誘發10-200 pg/mL的範圍內之IL-1β、TNF-α、IFN-γ、IL-6及IL-10釋放，以及在10,000-30,000 pg/mL的範圍內之IL-8釋放(圖3E)。一般而言，抗體MF4327xMF5196誘發的細胞介素位準比抗CD3二價單特異性抗體刺激後獲得的該等更低。抗體MF4327xMF5196誘發的細胞介素釋放為CLEC12A特異性的，因在MockxCD3對照存在下缺少細胞介素釋放或細胞介素釋放是有限。
此等資料證明抗體MF4327xMF5196能在自體T細胞與CLEC12APOS 單核球共培育後誘發增殖及釋放細胞介素。抗體 MF4327xMF5196 誘發的正常的 CD34+ 細胞靶向保留紅血球及巨核細胞分化以及保有發展單核- 骨髓性細胞譜系的潛力
因CLEC12A表現於正常的CD34POS 腔室內之單核-骨髓性細胞前驅體腔室內，所以吾人目的在評估抗體MF4327xMF5196對於正常造血作用的影響。為此，以健康的捐贈者骨髓衍生的CD34POS 細胞及預活化的自體T細胞來執行細胞毒性分析。使用預活化的T細胞以擁有很短的16小時細胞毒性分析窗口，其使CD34POS 細胞之活體外 分化對於分析結果的影響最小。吾人觀察到抗體MF4327xMF5196特異性溶解>86%的CLEC12APOS CD34POS 細胞，而CLEC12ANEG CD10POS 或CD10NEG 細胞部分不受影響(圖4A)。各種CD34POS 前驅體部分的詳細分析表明抗體MF4327xMF5196靶向CLEC12A表現GMP(三倍減少，圖4B)。抗體MF4327xMF5196沒有顯著影響部分表現CLEC12A的細胞部分(CMP及MEP)也沒有顯著影響CLEC12A陰性HSC、MPP及共同淋巴前驅體(CLP)。有趣的是，抗體MF4327xMF5196僅溶解一部分的CD123POS 細胞，顯示一大亞群的CD123POS CLEC12ANEG 細胞不受抗體MF4327xMF5196影響，包含CMPs的一亞群(圖4C)。
接著，正常的CD34POS 細胞部分於抗體MF4327xMF5196誘發重定向溶解後、產生單核球、顆粒球、紅血球及巨核細胞的能力係使用CFU分析來評估功能位準。來自骨髓CD34POS 造血前驅體細胞的紅血球(BFU-E；暴發集落形成單位-紅血球)或巨核細胞(CFU-Mk；群落形成單位-巨核細胞)群落之生長物不受抗體MF4327xMF5196影響(圖4D)。值得注意的是，儘管抗體MF4327xMF5196誘發的重定向溶解造成GMPs很大的減少，但顆粒球-巨噬細胞群落(CFU-GM)生長物於功能位準只觀察到24%適度的減少。有趣的是，GM-前驅體細胞，不受抗體MF4327xMF5196影響，保有其等發展CD14POS CD36POS CD33POS 單核球及CD15POS CD33POS 骨髓性細胞二者的能力(圖4E)，依CFU-GM群落之流動式細胞測量術分析來判定。
匯總這些數據表明抗體MF4327xMF5196不影響紅血球巨核細胞的發展。此外，雖然其有效地根除CLEC12APOS CD34POS 前驅體，但於抗體MF4327xMF5196治療後仍保有顆粒球及單核球發展的潛力。抗體 MF4327xMF5196 通過自體 T 細胞誘發原發性 AML 芽細胞 之重定向溶解
接著，吾人判定抗體MF4327xMF5196誘發AML患者衍生的T細胞溶解CLEC12APOS 標靶細胞的能力。形態臨床緩解之AML患者的T細胞腔室顯示出正常的初始、中央記憶(CM)、效應子記憶(EM)及有重新取得的CD45RA之效應子記憶細胞(EMRA+)組成(圖12A、B及表III，患者1-6)。分析AML患者T細胞媒介CLEC12APOS 標靶細胞之抗體MF4327xMF5196的細胞毒性的能力顯示，在AML患者衍生的T細胞及健康的捐贈者衍生的T細胞於誘發抗體MF4327xMF5196媒介的T細胞活化及CLEC12APOS 細胞溶解的能力之間沒有差異(圖12C-E)。
抗體MF4327xMF5196通過自相同的AML患者採集的休眠自體T細胞、誘發原發性AML芽細胞之CLEC12A特異性溶解的能力係在稍晚的時間點判定(圖5A，表III中列出的患者，患者7-9)。於診斷取得的原發性AML芽細胞樣本含有大部分的(>80%)芽細胞表現CLEC12A(圖5B)。AML芽細胞係與臨床緩解期間取得的自體休眠T細胞以5:1的E:T比率共培養48小時。抗體MF4327xMF5196誘發有力的CLEC12A特異性CD4及CD8 T細胞活化以及>70% AML芽細胞溶解(圖5C-E)。此等資料顯示抗體MF4327xMF5196能通過自體T細胞有效地誘發CLEC12APOS 原發性AML芽細胞溶解。抗體 MF4327xMF5196 以低的 E:T 比率、於 診斷 樣本 內 重定向原發性 AML 芽細胞 之 溶解
吾人繼而判定抗體MF4327xMF5196通過於診斷時採集的原發性AML樣本內之自體T細胞、誘發AML芽細胞溶解的能力。於測試的原發性AML樣本(表III中列出，患者10-19)中，T細胞的數目與AML芽細胞的數目相比之下為相對稀缺的，導致低的有效E:T比率(1:3-1:97，表II)。FACS分析揭露患者於CLEC12A表現方面之異質性(表II)。原發性AML樣本係在細胞介素混合物存在下培養10天以支持分析期間AML芽細胞及T細胞的存活。於培養10天之後，中位數AML芽細胞的恢復在缺少抗體MF4327xMF5196的情況下為41-1591%。在培養一開始時添加抗體MF4327xMF5196及MockxCD3對照IgG一次。T細胞擴增及AML芽細胞溶解係於第7天及第10天藉由流動式細胞測量術來定量。抗體MF4327xMF5196不僅有效地誘發CLEC12A媒介的T細胞擴增(擴增倍數範圍6-157)，其亦於第7天及第10天誘發AML芽細胞溶解(圖6)。於第10天，抗體MF4327xMF5196於10/11的患者樣本內已有效地誘發AML芽細胞溶解(23-98%)。雖然MockxCD3對照抗體於一些樣本內亦減少腫瘤細胞數目，但該等樣本內之T細胞活化的位準遠低於抗體MF4327xMF5196觀察到的該等(抗體MF4327xMF5196 vs MockxCD3之T細胞擴增中位數48 vs 2倍)。值得注意的是，抗體MF4327xMF5196即使在效應子與標靶比率非常低的AML樣本內還是活性的(圖6及表II)。針對一個沒有觀察到芽細胞溶解的AML樣本(患者16)，T細胞擴增的位準也只有15倍，與10個抗體MF4327xMF5196有反應的樣本觀察到的T細胞擴增中位數48倍相比。
最後，抗體MF4327xMF5196通過AML患者骨髓樣本內存在的T細胞、有效地誘發CLEC12A媒介的AML芽細胞之溶解，即使在非常低的E:T比率，且亦激起有力的T細胞增殖。抗體 MF4327xMF5196 用劑 方案 於 人類 AML 患者 導致減輕的細胞介素位準
測量抗體MF437xMF5196治療後的患者細胞介素位準。
圖14顯示由第1天接受1 mg之啟動劑量，接著於第4天接受3 mg及於第8天接受15 mg之逐步調升劑量，以及於第15天接受25 mg之全劑量之患者獲得的資料。
圖15顯示由第1天接受3 mg之啟動劑量，接著於第4天接受10 mg及於第8天接受25 mg之逐步調升劑量，以及於第15天接受40 mg之全劑量之患者獲得的資料。
圖16顯示由第1天接受5 mg之啟動劑量，接著於第4天接受15 mg及於第8天接受25 mg之逐步調升劑量，以及於第15天接受60 mg之全劑量之患者獲得的資料。
總的說來，在某些患者中的資料顯示出，投予啟動劑量及逐步調升劑量會減輕投予全劑量時的細胞介素釋放。對於各種群內的某些患者，於啟動、逐步調升及全劑量的全部期間內觀察到有限的細胞介素釋放(資料未顯示)。討論
實施例提及的抗體MF4327xMF5196為全長抗體。CLEC12AxCD3雙特異性人類IgG1抗體之Fc效應子沈默版本顯示出能通過靶向AML芽細胞及白血病幹細胞(LSCs)上的CLEC12A來治療全部的AML亞型。抗體MF4327xMF5196為有力的雙特異性抗體其有效地活化且重定向T細胞以溶解CLEC12A表現細胞例如AML細胞。於10/11的原發性AML患者樣本內，此CLEC12AxCD3 T細胞銜接器通過重定向駐留的自體T細胞來有效地誘發CLEC12A媒介的AML芽細胞之溶解。於此擬體內細胞介素支持系統內，AML樣本係在抗體MF4327xMF5196存在下培養7-10天。此分析以兩種方式確立抗體MF4327xMF5196的功效：其表明抗體MF4327xMF5196有誘發此等樣本內的AML患者T細胞擴增的能力，以及顯示出該等抗體MF4327xMF5196重定向的T細胞能通過細胞溶解重定向對AML芽細胞之細胞溶解活性(表II中所示)。抗體MF4327xMF5196能誘發顯著的T細胞擴增及芽細胞溶解，即使於起始E:T比率很低(1:45-1:97)或CLEC12A表現位準相對低的該等AML樣本內。於擬體內 分析中抗體MF4327xMF5196相對於MockxCD3條件的比較表明抗體MF4327xMF5196誘發的活性係CLEC12A抗原媒介的；與MockxCD3於9/10原發性AML樣本內的最小活性相比，觀察到抗體MF4327xMF5196之有力的T細胞增殖及AML芽細胞細胞溶解。沒反應的一個樣本其缺少AML芽細胞溶解及有力的抗體MF4327xMF5196誘發的T細胞擴增(患者16)二者，可能有嚴重的T細胞官能不良。
雖然許多起始的實驗使用健康的捐贈者T細胞，但細胞毒性分析亦使用AML患者衍生的T細胞來執行以測試抗體MF4327xMF5196重定向疾病背景T細胞的能力。AML T細胞的特定缺陷已有報導，包括損傷的免疫突觸形成及降低的T細胞共刺激能力(Wendelbo, Nesthus等人之2004, Le Dieu, Taussig等人之2009)。於此，顯示抗體MF4327xMF5196能重定向形態臨床緩解獲得的AML患者衍生的T細胞(n=6)，如其重定向健康的捐贈者衍生的T細胞一般有效地誘發CLEC12A特異性的CLEC12APOS 腫瘤細胞溶解。此外，於10/11的AML樣本內發現抗體MF4327xMF5196能於原發性重新 AML樣本內有效地重定向自體T細胞以溶解AML芽細胞。於此，證明AML患者衍生的T細胞能以HSC保留方式及以低的E:T比率、由全長IgG CD3-銜接雙特異性IgG而予以功能上活化，導致T細胞活化及增殖。此等經由抗體MF4327xMF5196之自體T細胞功能活化有效地放大效應子T細胞腔室，因而促進更有利的E:T比率用於有效根除患者的AML芽細胞及LSCs。
於正常的骨髓方面，抗體MF4327xMF5196結合限制於骨髓性腔室，因抗體MF4327xMF5196能CLEC12A特異性靶向，保留了骨髓的其他區域。於此，顯示抗體MF4327xMF5196於骨髓內一致地結合GMP細胞，而其僅結合小部分的CMP及MEP亞群。更重要的是，抗體MF4327xMF5196不會結合包括多潛能HSCs之CD34POS CD38NEG 腔室。與CMP及MEP部分上的CLEC12A表現較少一致，抗體MF4327xMF5196於吾人的活體外 CFU分析中顯示出不會影響紅血球或巨核細胞譜系的發展。此外，雖然抗體MF4327xMF5196於擬體內 細胞毒性分析中降低CLEC12APOS GMP細胞的數目，但於跟進的CFU分析中觀察到抗體MF4327xMF5196治療後剩餘的CD34POS 骨髓細胞能產生單核及骨髓性細胞譜系二者，允許由CD34POS CLEC12ANEG 前驅體細胞，包括HSCs及MPPs產生單核-骨髓性細胞生長物，抗體MF4327xMF5196治療沒有明顯的影響其等(van Rhenen, van Dongen等人之2007, Notta, Zandi等人之2016, Bill, van Kooten Niekerk等人之2018)。
預期抗體MF4327xMF5196投予給患者後的血液毒性可能會限於嗜中性白血球減少症及單核球計數減少。本結果證明抗體MF4327xMF5196重定向溶解後，嗜中性球及單核球可從剩餘的CD34POS 細胞再植宿主。於抗體MF4327xMF5196治療後再植造血細胞的潛力與靶向CD33或CD123之治療可能的情況形成對比(Aigner, Feulner等人之2013, Al-Hussaini, Rettig等人之2016)。與CLEC12A相比，CD33及CD123更廣泛地表現於正常的CD34POS 前驅體，包括CMPs、GMPs及多潛能HSCs之上(Taussig, Pearce等人之2005)。本發明顯示CLEC12A靶向保留了CD123定向療法標靶之正常的CD123POS CMPs。人化小鼠之活體內 研究業已顯示CD33及CD123靶向嵌合抗原受體(CAR)轉導的T細胞誘發CD34POS CD38NEG 幹細胞部分的溶解(Pizzitola, Anjos-Afonso等人之2014, Kenderian, Ruella等人之2015)。結果是，靶向CD33及CD123療法引起了對血液毒性的擔憂：此等療法除了HSC根除—其會阻止正常的造血腔室的有效重建—的風險之外，還有可能會誘發血小板減少症、嗜中性白血球減少症及貧血。
抗體MF4327xMF5196的Fc區域已經修飾以預防結合FcγR及C1q，而不影響結合FcRn受體。單核球分析的結果的確顯示出抗體MF4327xMF5196誘發T細胞活化以及相關的細胞介素釋放局限於CLEC12A表現細胞。Fc沈默減弱了CD3POS 及/或CLEC12APOS 細胞之典型的抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)及C1q媒介的補體依賴性細胞毒性(CDC)。現在的資料顯示抗體MF4327xMF5196活化的T細胞選擇性地溶解CLEC12APOS 細胞(例如PBMC培養內的B細胞及NK細胞不受影響)。
小鼠的研究確認一種全長IgG1抗體MF4327xMF5196，有正常的9-10天的FcRn媒介的活體內 半生期。這意味著–不像其他T細胞銜接器概念–患者體內的抗體MF4327xMF5196有效的全身位準能藉由每週靜脈投予來達成。
抗體MF4327xMF5196選擇性地靶向骨髓性芽細胞同時保留正常的HSCs。根據其根除殘餘的LSCs的潛力，認為管理AML之微量殘存疾病(MRD)須考慮抗體MF4327xMF5196。 實施例2
骨髓增生性贅生物急性期(MPN-BP)患者之CLEC12A陰性及CLEC12A陽性CD34+幹及前驅體細胞的研究。
從MPN-BP患者骨髓採集細胞。CD34+ 細胞係依據前散射(FSC)、側散射(SSC)、CD45、CD34、CD38及CLEC12A表現來圈選。具低SSC及CD45dim 、CD34+ 、CD38的細胞根據CLEC12A表現分選成二部分。細胞係平板培養於補充SCF、IL-3、IL-6、EPO、G-CSF及GM-CSF之MethoCult™ H4435 Enriched(STEMCELL technologies)內且培育12-14天。挑選群落且重新平板培養於補充SCF、IL-3、IL-6、EPO、G-CSF及GM-CSF之MethoCult™ H4435 Enriched(STEMCELL technologies)內且再培育12-14天。第一次平板培養的結果為CLEC12A陰性部分每1500個平板培養的細胞有20個大群落(40個細胞或更多)及10個小群落(每群落>40個細胞)。CLEC12A陽性部分每1500個平板培養的細胞沒有大群落及有32個小群落。CLEC12A陰性部分的平板內的群落於重新平板培養實驗中不能產生二次群落，每1500個播種的細胞為零個大或小群落。另一方面重新平板培養來自CLEC12A第一次平板培養的細胞導致每1500個細胞有44個小群落，此等中大約80%為JAK2驅動突變陽性，參見圖13。 概要
來自MPN-BP患者的CD34posCD38-CLEC12A-細胞於原代培養內只能產生造血群落(CFU-GM)，其等主要是CFU-GM。相比之下，MPN-PB患者內表現CLEC12A的CD34-CD38-幹細胞能產生芽細胞群落、其等可連續重新平板培養且因而含有白血病起始的能力。
分化的CLEC12A表現可用來從有MPN-BP的患者鑑別、根除及/或單離白血病起始細胞(LIC)。一種如本文所揭示之CD3-CLEC12A雙特異性抗體可用來根除MPN-PB內的此等LIC，以減少MPN急性期細胞的數目並藉此使有MPN-BP患者的疾病減輕。引用技藝
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1   人類CLEC12A MWIDFFTYSSMSEEVTYADLQFQNSSEMEKIPEIGKFGEKAPPAPSHVWRPAALFLTLLCLLLLIGLGVLASMFHVTLKIEMKKMNKLQNISEELQRNISLQLMSNMNISNKIRNLSTTLQTIATKLCRELYSKEQEHKCKPCPRRWIWHKDSCYFLSDDVQTWQESKMACAAQNASLLKINNKNALEFIKSQSRSYDYWLGLSPEEDSTRGMRVDNIINSSAWVIRNAPDLNNMYCGYINRLYVQYYHCTYKKRMICEKMANPVQLGSTYFREA
2   人類CD3γ MEQGKGLAVL ILAIILLQGT LAQSIKGNHL VKVYDYQEDG SVLLTCDAEA KNITWFKDGK MIGFLTEDKK KWNLGSNAKD PRGMYQCKGS QNKSKPLQVY YRMCQNCIEL NAATISGFLF AEIVSIFVLA VGVYFIAGQD GVRQSRASDK QTLLPNDQLY QPLKDREDDQ YSHLQGNQLR RN
3   人類CD3δ MEHSTFLSGL VLATLLSQVS PFKIPIEELE DRVFVNCNTS ITWVEGTVGT LLSDITRLDL GKRILDPRGI YRCNGTDIYK DKESTVQVHY RMCQSCVELD PATVAGIIVT DVIATLLLAL GVFCFAGHET GRLSGAADTQ ALLRNDQVYQ PLRDRDDAQY SHLGGNWARN K
4   人類CD3ε MQSGTHWRVL GLCLLSVGVW GQDGNEEMGG ITQTPYKVSI SGTTVILTCP QYPGSEILWQ HNDKNIGGDE DDKNIGSDED HLSLKEFSEL EQSGYYVCYP RGSKPEDANF YLYLRARVCE NCMEMDVMSV ATIVIVDICI TGGLLLLVYY WSKNRKAKAK PVTRGAGAGG RQRGQNKERP PPVPNPDYEP IRKGQRDLYS GLNQRRI
5   人類CD3ζ MKWKALFTAA ILQAQLPITE AQSFGLLDPK LCYLLDGILF IYGVILTALF LRVKFSRSAD APAYQQGQNQ LYNELNLGRR EEYDVLDKRR GRDPEMGGKP QRRKNPQEGL YNELQKDKMA EAYSEIGMKG ERRRGKGHDG LYQGLSTATK DTYDALHMQA LPPR
6   人類IL-15 訊息胜肽劃底線 MRISKPHLRSISIQCYLCLLLNSHFLTEAGIHVFILGCFSAGLPKTEA NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
7   人類IL-15Ra 訊息胜肽劃底線 MAPRRARGCR TLGLPALLLL LLLRPPATRG ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS LKCIRDPALV HQRPAPPSTV TTAGVTPQPE SLSPSGKEPA ASSPSSNNTA ATTAAIVPGS QLMPSKSPST GTTEISSHES SHGTPSQTTA KNWELTASAS HQPPGVYPQG HSDTTVAIST STVLLCGLSA VSLLACYLKS RQTPPLASVE MEAMEALPVT WGTSSRDEDL ENCSHHL
8   可溶性人類 IL-15Ra 訊息胜肽劃底線 MAPRRARGCR TLGLPALLLL LLLRPPATRG ITCPPPMSVE HADIWVKSYS LYSRERYICN SGFKRKAGTS SLTECVLNKA TNVAHWTTPS LKCIRDPALV HQRPAPPSTV TTAGVTPQPE SLSPSGKEPA ASSPSSNNTA ATTAAIVPGS QLMPSKSPST GTTEISSHES SHGTPSQTTA KNWELTASAS HQPPGVYPQG
9   CLEC12A 4327 HCDR1 SGYTFTGY
10   CLEC12A 4327 HCDR2 IINPSGGS
11   CLEC12A 4327 HCDR3 GTTGDWFDY
12   4327 VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKGTTGDWFDYWGQGTLVTVSS
13   CLEC12A 4331 HCDR1 SGYTFTSY
14   CLEC12A 4331 HCDR2 IINPSGGS
15   CLEC12A 4331 HCDR3 GNYGDEFDY
16   4331 VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGNYGDEFDYWGQGTLVTVSS
17   CLEC12A HCDR1 SGYTFTGY
18   CLEC12A HCDR2 WINPNSGG
19   CLEC12A HCDR3 DGYFADAFDY
20   CLEC12A VH QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARDGYFADAFDYWGQGTLVTVSS
21   3056 HCDR1 GFTFSSYG
22   3056 HCDR2 IWYNGRKQ
23   3056 HCDR3 GTGYNWFDP
24   MF3056 VH QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIWYNGRKQDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
25   MF3874 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIWYNGRKQDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
26   MF3878 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIWYNGRKQDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
27   MF3883 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYNGRKQDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
28   MF3886 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIWYNGRKQDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
29   MF3891 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIWYNGRKQDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
30   3896 HCDR2 IWYSGSKKN
31   3896 VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRSYGMHWVRQAPGKGLEWVAIIWYSGSKKNYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
32   MF5192 HCDR2 IWYHGRKQ
33   MF5192 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIWYHGRKQDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
34   MF5193 HCDR2 IWYHARKQ
35   MF5193 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIWYHARKQDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
36   MF5196 HCDR2 IWYNARKQ
37   MF5196 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIWYNARKQDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
38   MF5603 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIWYNARKQEYIDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
39   MF5616 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIWYNARKQEYNDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
40   MF5626 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIWYNARKQEYRDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
41   MF5630 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIWYNARKQDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWYDPWGQGTLVTVSS
42   MF5648 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIWYNARKQEYLDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
43   MF5661 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAQIWYNARKQEYSDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
44   MF5694 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIWYNARKQEYSDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
45   MF5197 HCDR2 IWYNTRKQ
46   MF5197 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAAIWYNTRKQDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
47   MF5351 HCDR2 IWYDGKNT
48   MF5351 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAMIWYDGKNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
49   MF5354 HCDR2 IYYDGSRT
50   MF5354 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSGYGMHWVRQAPGKGLEWVAQIYYDGSRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
51   MF5356 HCDR2 IWHDGRKT
52   MF5356 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSKYGMHWVRQAPGKGLEWVAQIWHDGRKTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGTGYNWFDPWGQGTLVTVSS
53   VL CDR1 QSISSY
54   VL CDR2 AASSLQS
55   VL CDR3 QQSYSTP
56   IgVk1-39*01 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP
57   共同的輕鏈 IgKV1*39/jk1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ SYSTPPTFGQGTKVEIK
58   共同的輕鏈 IgKV1*39/jk5 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPK LLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ SYSTPPITFGQGTRLEIK
59   MF1337 TT VH EVQLVETGAEVKKPGASVKVSCKASDYIFTKYDINWVRQAPGQGLEWMGWMSANTGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSINTAYMELSSLTSGDTAVYFCARSSLFKTETAPYYHFALDVWGQGTTVTVSS
60   3056 HCDR1 SYGMH
表 I. 抗體 MF4327xMF5196 誘發的 T 細胞活化及 標靶細胞溶解 之平均 EC50 值
功能 讀出 抗體 MF4327xMF5196 EC50 平均 (ng/mL) 抗體 MF4327xMF5196 EC50 平均範圍 (ng/mL)
CD4 T細胞上之CD69 156.3 107.9 - 277.0
CD4 T細胞上之CD25 351.1 199.0 - 589.9
CD8 T細胞上之CD69 44.4 24.9 - 63.7
CD8 T細胞上之CD25 95.7 69.7 - 131.1
HL60細胞溶解 68.2 29.5 - 115.2
抗體MF4327xMF5196 EC50 值係以HL60細胞毒性分析來判定。資料來自6位健康的捐贈者。表 II. 抗體 MF4327xMF5196 誘發 原發性 AML 樣本 內之 AML 芽細胞溶解 及 T 細胞擴增
患者 編號 FAB 分類 風險分類 CLEC12A 陽性 %* E:T 比率 對照 條件 的恢復 抗體 MF4327xMF5196 之 芽細胞 殺滅 % 抗體 MF4327xMF5196 之 T 細胞擴增倍數 TTxCD3 對照 之 芽細胞 殺滅 % TTxCD3 對照 之 T 細胞擴增倍數
10 M1 小 39% 1:45 81% 91% 25 0% 1
11 M1 中等 83% 1:13 1591% 23% 6 5% 1
12 M2 小 91% 1:3 127% 98% 37 23% 2
13 M2 大 96% 1:17 890% 87% 139 15% 2
14 M4 非常大 88% 1:13 225% 92% 64 69%# 3
15 M4/M5 中等 58% 1:49 41% 39% 25 24%# 7
16 M4/M5 中等 74% 1:31 644% 0% 15 0% 1
17 M4/M5 中等 94% 1:15 112% 65% 98 15% 4
18 M4/M5 大 99% 1:46 1208% 36% 20 0% 1
19 M4/M5 大 100% 1:97 366% 33% 60 0% 1
20 M4/M5 非常大 79% 1:32 373% 31% 157 0%# 2
於診斷時取得的原發性AML患者樣本係於細胞介素混合物內培養10 天以支持AML芽細胞存活及增殖。關於AML芽細胞溶解之定量化，根據SSC、CD45、CD33及/或CD34表現來圈選AML芽細胞。於10天之後定量相對於PBS對照條件之抗體MF4327xMF5196誘發的T細胞增殖及AML芽細胞溶解。 *樣本內的CLEC12A陽性AML芽細胞百分率。根據CLEC12A陰性淋巴細胞部分來設定CLEC12A表現的閾值。# 樣本14、15及20係以1,000 ng/mL IgG來測試，而所有其他的患者樣本係以200 ng/mL IgG來測試。於第10天計算相對於PBS條件之芽細胞數目之特異性芽細胞溶解。表 III. 患者 特徵
患者 編號 性別 年齡 (Y) 樣本 類型 Fab 分類 診斷 時的 AML 表現型 風險分類 * 原發性 / 繼發性 AML 疾病狀態 芽細胞 % * T 細胞 %*
1 F 29 PB M4 NA 中等 - CR ND ND
2 F 50 PB M5 NA 風險很大 - CR ND ND
3 F 57 PB M1/M2 NA 風險很大 - CR ND ND
4 M 41 PB M1 NA 風險很小 - CR ND ND
5 F 50 PB M1 NA 中等 - CR ND ND
6 M 40 PB M4 NA 中等 - CR ND ND
7a M 53 BM M1 CD34-CD117+CD33+CD14-CD15- 風險很大 原發性AML 新診斷 83 9
7b M 53 PB M1 NA 風險很大 - 於alloSCT後之CR ND ND
8a F 60 BM M1/M2 CD34+CD117+CD33+CD14-CD15- 風險很大 原發性AML 新診斷 93 3
8b F 60 PB M1/M2 NA 風險很大 - CR ND ND
9a M 40 BM M5 CD34-CD117+(部分)CD33 +CD15+(部分)CD14+(部分) 風險很大 原發性AML 新診斷 97 1
9b M 41 PB M5 NA 風險很大 - CR ND ND
10 F 51 BM M1 CD34+CD117+CD33+CD14-CD15- 小 原發性AML 新診斷 89 2
11 M 34 BM M1 CD34+(部分)CD117+CD33+CD15-CD14- 中等 原發性AML 新診斷 91 7
12 M 49 BM M2 CD34+CD117+(部分) CD33+ CD15-CD14- 小 原發性AML 新診斷 67 20
13 F 45 PB M2 CD34+CD117+(部分), CD33+ CD15+CD14- 大 原發性AML 新診斷 84 5
14 F 60 PB M4 CD34+(部分)CD117+(部分)CD33+ CD15+(部分)CD14+(部分) 非常大 繼發性AML (與療法有關) 新診斷 93 7
15 M 42 BM M4/M5 CD34+(部分)CD117+ CD33+CD15+CD14- 中等 原發性AML 新診斷 97 2
16 F 44 BM M4/M5 CD34-CD117+CD33+CD14-CD15- 中等 原發性AML 新診斷 92 3
17 M 66 BM M4/M5 CD34-CD117-CD33+CD15+CD14- 中等 原發性AML 新診斷 92 6
18 M 59 BM M4/M5 CD34-CD117+(部分)CD33+ CD15+CD14+(部分) 大 原發性AML 新診斷 91 2
19 M 54 PB M4/M5 CD34-CD117-CD33+CD15+CD14+(部分) 大 原發性AML 新診斷 97 1
20 M 14 PB M4/M5 CD34+CD117+CD33+CD14-CD15+ 非常大 原發性AML 新診斷 96 3
表III. AML患者特徵。使用的縮寫為：Y：歲；M：男性；F：女性；PB：末梢血液；BM：骨髓；CR：完全緩解；alloSCT：同種異體的幹細胞移植；ND：未確定；NA：不適用。 * 於解凍後及功能分析前的樣本內AML芽細胞及T細胞百分率。 # 風險組別分類係使用Dutch-Belgian Cooperative Trial Group for Hematology-Oncology (HOVON)定義的準則來判定。表 IV. 用於 流動式細胞測量術 之試劑
化合物 公司 目錄 #   化合物 公司 目錄 #
7AAD 西格瑪奧瑞奇 A9400   CD34-ECD 貝克曼庫爾特 IM2709U
CD1c-PE 美天旎 130-090-508   CD34-PECy7 百進 343516
CD3-FITC 百進 300406   CD34-BV421 百進 343609
CD3-PECy5 貝克曼庫爾特 A07749   CD38-ECD 貝克曼庫爾特 A99022
CD3-PECy7 百進 300420   CD38-PECy7 百進 303516
CD3-APC 貝克曼庫爾特 IM2467   CD45 krome orange 貝克曼庫爾特 A96416
CD4-PE 貝克曼庫爾特 1707751   CD45RA-AF700 BD生物科學 560673
CD4-ECD 貝克曼庫爾特 6604727   CD45RA-Pacific blue 百進 304118
CD4-PECy5.5 貝克曼庫爾特 B16491   CD45RO-ECD 貝克曼庫爾特 IM2712U
CD4-PECy7 百進 317414   CD56-PECy7 貝克曼庫爾特 302016
CD4-BV421 百進 300531   CD56-PECy7 百進 318318
CD4-Pacific blue 貝克曼庫爾特 49197   CD69-APC 貝克曼庫爾特 A80711
CD5-BV421 百進 300626   CD90-BV510 百進 328126
CD8-AF647 英杰 MHCD0821   CD90-FITC BD生物科學 555595
CD8-AF700 英杰 MHCD0829   CD117-APC 貝克曼庫爾特 IM3638
CD10-APC 百進 312210   CD123-BV421 百進 306018
CD10-APC-AF750 貝克曼庫爾特 A89310   CD135a-BV421 BD生物科學 564708
CD14-FITC 百進 325604   CD197-AF488 百進 335601
CD14-ECD 貝克曼庫爾特 IM2707U   CD303-PE 美天旎 130-090-511
CD16-PE 貝克曼庫爾特 A07766   CD304-PE 美天旎 130-090-533
CD16-PECy7 百進 302016   CLEC12A-PE R&D系统 FAB2946p
CD19-ECD 貝克曼庫爾特 A07770   CLEC12A-PE 百進 2368020
CD19-AF700 英杰 MHCD1929   IgG2a-PE 百進 400214
CD25-PE 貝克曼庫爾特 A07774   IgG2b-PE 貝克曼庫爾特 731601
CD33-PECy5 貝克曼庫爾特 IM2647   譜系-BV510 百進 348807
CD33-PECy7 貝克曼庫爾特 A54824   譜系-FITC BD生物科學 340546
CD33-APC-AF750 貝克曼庫爾特 A70200   抗人類 IgG-PE 英杰  
貝克曼為「貝克曼庫爾特」；西格瑪為「西格瑪奧瑞奇」。
圖 1. CLEC12AxCD3 雙特異性 抗體 特異地結合 CLEC12APOS 及 CD3POS 標靶細胞。 (A)CLEC12AxCD3雙特異性抗體與CLEC12A及CD3之結合係依流動式細胞測量術以一組腫瘤細胞株來判定。HL60：CLEC12APOS 前骨髓性細胞株；CLEC12A-CHO-K1：穩定表現人類CLEC12A之CHO-K1細胞株(經參考抗CLEC12A抗體驗證，資料未顯示)；CHO-K1：CLEC12ANEG 親代CHO-K1細胞株；Jurkat E6.1：CD3POS T細胞株；J.RT-T3.5：CD3NEG T細胞株。(B)正常末梢血液依流動式細胞測量術之CLEC12AxCD3雙特異性抗體結合剖析。分析亞群的圈選策略為CD4 T細胞：CD4POS ；CD8 T細胞：CD8POS ；NK細胞：CD3NEG CD56POS ；NKT細胞：CD3POS CD56POS ；B細胞：CD19POS ；骨髓樹突細胞(DC)：BDCA1POS CD19NEG ；顆粒球：根據SSC-FSC；單核球：CD14POS CD33POS 。(C)正常的骨髓CD34POS 前驅體腔室內之依流動式細胞測量術之CLEC12AxCD3雙特異性抗體結合。HSC：造血幹細胞；MPP：多潛能前驅體；CMP：共同骨髓前驅體；GMP：顆粒球-巨噬細胞前驅體；MEP：巨核細胞-紅血球前驅體；CLP：共同淋巴前驅體。顯示關於抗體MF4327及MF5196及格式化為最終Fc格式之同型對照IgG(沈默的Fc效應子功能)的資料。
圖2 . 抗體 MF4327xMF5196 媒介 CLEC12A 特異性之 T 細胞活化及 重定向此等 T 細胞以誘發 CLEC12APOS HL60 細胞之溶解。 從健康的捐贈者衍生的休眠的T細胞係藉由負向選擇予以純化且在抗體MF4327xMF5196、MockxCD3、對照IgG或PBS存在下、與CFSE標記的HL60細胞共培養。(A-B)細胞係與1000 ng/mL IgG濃度之所示的IgGs–全部都有WT Fc效應子功能–以5:1的E:T比率一起共培育。具WT Fc效應子功能之抗體MF4327xMF5196原型誘發T細胞活化(A)及標靶細胞溶解(B)的能力係於24/48/72小時後藉由流動式細胞測量術、相對於PBS條件來定量。顯示的資料係從>10位測試的健康的捐贈者中代表性的二位。(C-E)細胞係與一系列的IgG濃度之所示的IgGs–全部都有沈默的Fc效應子功能–以5:1的E:T比率共培育。抗體MF4327xMF5196(具沈默的Fc效應子功能)誘發CD4及CD8 T細胞活化(C, D)及標靶細胞溶解(E)的能力係於48小時後藉由流動式細胞測量術、相對於PBS條件來定量。顯示的資料係從3次獨立的分析中測試總共6位捐贈者之一位代表性捐贈者。
圖3 . 抗體 MF4327xMF5196 誘發 CLEC12A 媒介的單核球溶解 及發炎細胞介素釋放，以及具有誘發 CLEC12A 抗原特異性 T 細胞 增殖 的能力 。 (A-C)健康的捐贈者衍生的PBMC樣本與所示的濃度範圍之抗體MF4327xMF5196或MockxCD3共培養且與PBS條件相比。T細胞活化(A)、通過自體T細胞之單核球溶解(B)及B細胞溶解(C)係於48小時之後使用流動式細胞測量術來評估。(D)從健康的捐贈者衍生的單核球係藉由負向選擇予以純化且與CFSE標記的休眠自體T細胞以5:1的E:T比率、加上1,000 ng/mL之抗體MF4327xMF5196及MockxCD3抗體(抗CD3 IgG格式化為WT Fc效應子功能)共培養歷時5天。T細胞增殖係通過CFSE-陽性T細胞減少來證明。(E)健康的捐贈者衍生的PBMCs係以1,000 ng/mL抗體MF4327xMF5196、MockxCD3或抗CD3(CD3)抗體予以培養48小時。隨後，收穫上清液、使用人類10-plex Luminex設定來測量此等上清液內之人類細胞介素位準。可偵測到六種細胞介素所示的細胞介素位準。A-D中顯示的資料係來自一位單一捐贈者且為來自多個獨立實驗的4位獨立的捐贈者之代表。E中顯示來自測試的8位健康的捐贈者之PBMCs，二位代表性健康的PBMC捐贈者，每位捐贈者二複本的資料。
圖 4. 抗體 MF4327xMF5196 保留正常的骨髓前驅體細胞發展完整的骨髓及紅血球譜系的潛力。 來自健康的捐贈者骨髓之CD34POS 造血前驅體細胞與自體預活化的T細胞係以10:1的E:T比率、在200 ng/mL抗體MF4327xMF5196或MockxCD3存在下共培養16小時。A) 使用定量流動式細胞測量術設定，針對所示的細胞部分、抗體MF4327xMF5196誘發的溶解係相對於非IgG條件來判定。各資料點表示一獨立的骨髓捐贈者的三複本測試之平均值(n=4)。圖10中描述圈選策略。B)抗體MF4327xMF5196於細胞毒性分析16小時後對於不同的CD34POS 骨髓族群之影響的分析，顯示三位捐贈者的絕對數。CD34POS 前驅體細胞之圈選係描繪於圖11中。不同的測試條件之絕對數定量化係通過整合以流動計數螢光(flow count fluorospheres)所判定的總CD34POS 細胞之頻率及絕對計數來計算。資料顯示二重複測量的平均。C) 散布圖顯示抗體MF4327xMF5196於所示條件之細胞毒性分析16小時後、對於CLEC12A-及/或CD123表現亞群的影響，圈選CD34POS LINNEG 細胞。顯示二位之中的一位代表性捐贈者。D) 來自四位不同的捐贈者之CD34POS 細胞於細胞毒性分析16小時後、以抗體MF4327xMF5196產生顆粒球-巨噬細胞群落(CFU-GM)、紅血球暴發集落形成單位(BFU-E)及巨核細胞群落(CFU-Mk)的能力，係在半固體培養基內培養二週之後予以定量。對照培養為非IgG治療的共培養或單獨播種的CD34POS 細胞。各資料點表示每位捐贈者之三複本培養(CFU-GM及BFU-E)或四複本(CFU-Mk)的平均值。E) D中描述之二週MethoCult培養的CD15POS CD33POS 及CD14POS CD36POS CD33POS 細胞含量之流動式細胞測量術分析。資料顯示針對三位不同的捐贈者之總CD33POS 細胞之中的單核及骨髓性細胞的頻率。HSC：造血幹細胞；MPP：多潛能前驅體；CMP：共同骨髓前驅體；GMP：顆粒球-巨噬細胞前驅體；MEP：巨核細胞-紅血球前驅體；CLP：共同淋巴前驅體。使用成對司徒頓試驗來進行統計分析。*p>0.05，**p>0.01，***p>0.001。
圖5 . 抗體 MF4327xMF5196 通過 自體 T 細胞有效地誘發 CLEC12APOS 原發性 AML 芽細胞之重定向溶解 自臨床緩解的AML患者末梢血液單離的休眠CD3POS T細胞係與AML診斷採集的CFSE標記的CLEC12APOS 自體原發性AML芽細胞共培養48小時。E:T比率為5:1且添加濃度1,000 ng/mL之IgGs：抗體MF4327xMF5196、MockxCD3或對照IgG(全部都有WT Fc效應子功能)。每種IgG相對於PBS條件所誘發的AML芽細胞溶解程度係使用流動式細胞測量術來定量。(A)圖顯示取得AML芽細胞樣本及自體T細胞的AML期別。(B)原發性AML芽細胞樣本上CLEC12A抗原的表現(AML芽細胞定義為CD45+/- SSC+/- )。直方圖顯示各患者樣本之抗CLEC12A IgG結合，且淋巴細胞以灰色表示及AML芽細胞以黑色表示。根據CLEC12A陰性淋巴細胞部分來設置CLEC12A陽性圈選；提供CLEC12A陽性芽細胞百分率。(C-D) AML患者之CD4POS (C)及CD8POS T細胞(D)的活化狀態。(E) 與所示的IgG培育時通過自體原發性T細胞、CLEC12APOS 原發性AML芽細胞媒介的細胞毒性(相對於PBS)。顯示的資料為三位AML患者的樣本(患者7-9，參見表III)以三複本測試的平均 ± SE。資料係相對於PBS、通過ANOVA予以分析：** P>0.01，*** P>0.001。
圖6 . 抗體 MF4327xMF5196 於原發性 AML 樣本 內 誘發 AML 芽細胞 殺滅 於AML診斷取得的原發性AML患者樣本係於補充細胞介素混合物的培養基內培養10天以支持AML芽細胞存活。添加200 ng/mL的抗體MF4327xMF5196或MockxCD3抗體。針對每位患者，顯示CD45xCD33圖；第0天的活的圈選(live gate)及第10天的每種IgG。以紅色顯示T細胞、以藍色顯示AML芽細胞(定義為CD45+/- SSC+/- )，及表示出T細胞及AML芽細胞的百分率。第0天直方圖顯示出每位患者之AML芽細胞細胞的CLEC12A表現位準。使用抗CLEC12A抗體染色以黑色顯示以及使用同型對照抗體的染色以灰色顯示。
圖7 . 通過流動式細胞測量術用來定量 HL60 標靶細胞溶解 之 圈選策略 。 藉由流動式細胞測量術來測量固定體積的細胞。根據FSC-SSC剖析來圈選活細胞(左手圖)。於活的圈選之中，接著圈選CFSEPOS HL60細胞(右手圖)。圈選之中CFSEPOS 活的HL60標靶細胞的絕對數係如材料及方法節中所述用來計算HL60標靶細胞溶解的百分率。上圖顯示無細胞毒性之PBS條件，而下圖顯示抗體MF4327xMF5196條件其中觀察到HL60細胞毒性。
圖8 . 以 PBMC 為基的單核球 細胞毒性分析中用來定量細胞毒性之 圈選策略 。 如同所示圈選出單核球(CD14POS )、CD4(CD4POS CD3POS )及CD8 (CD8POS CD3POS )T細胞，以及B細胞(CD19POS )。固定體積的分析培養基測量的單核球及B細胞之絕對數係予以定量且如材料及方法節中所述用來計算測試IgG條件誘發(下組)相對於PBS對照條件(上組)的細胞毒性百分率。確定的CD4POS 及CD8POS T細胞亞群在T細胞族群內，以及其等之活化狀態係使用活化標識CD69來判定，相對於PBS對照條件。
圖9 . 抗體 MF4327xMF5196 雙特異性 IgG 的活性 為 E:T 比率- 依賴性 的 健康的捐贈者衍生的休眠T細胞係在抗體MF4327xMF5196、MockxCD3或對照IgG存在下與CFSE標記的HL60細胞共培養。於48小時共培養後判定於1,000 ng/mL IgG、遞增的E:T比率對於HL60標靶細胞溶解的效應。
圖10 . 用來定量健康的捐贈者 骨髓 CD34POS 前驅體細胞之恢復的 圈選策略 。 A)如所示來圈選總CD34POS 細胞、CLEC12APOS 、CLEC12ANEG CD10NEG 及CLEC12ANEG CD10NEG 細胞。根據FSC及SSC面積及寬度來圈選第一單一細胞，然後根據FSC-SSC剖析及7AAD陰性來定義活細胞。於活細胞中，從共培養的T、使用CD34及CD5來圈選CD34POS 細胞。於總CD34POS 細胞之中，細胞根據CLEC12A及CD10表現而分為三個族群。針對CD34POS 族群之定量化，於獲取過程前添加已知濃度之固定體積的流動計數螢光給每種樣本。每mL細胞的絕對數係根據螢光及細胞比率來計算。B)散布圖顯示一位代表性捐贈者於的所有測試條件之不同CD34POS 族群。
圖11 . 用來判定 不同的 CD34POS 前驅體細胞之同一性 及 相對比率之 圈選策略 。 根據FSC及SSC面積及寬度來圈選第一單一細胞，然後根據FSC-SSC剖析及7AAD陰性來定義活細胞。於活細胞中，圈選譜系陰性CD34POS 細胞，接著FSC-SSC反向圈選。細胞隨後分為CD38POS 及CD38NEG 腔室。於CD34POS CD38POS 腔室中，根據CD10表現來圈選CLPs。缺少CD10表現的細胞根據CD123及CD45RA表現進一步分成CMP、MEP及GMP。針對一些捐贈者，使用CD135而不是CD123來定義此等三個族群。於CD34POS CD38NEG 腔室中，根據CD90及CD45RA表現來定義HSC及MPP。用螢光-減一對照來確認圈選。HSC：造血幹細胞；MPP：多潛能前驅體；CMP：共同骨髓前驅體；GMP：顆粒球-巨噬細胞前驅體；MEP：巨核細胞-紅血球前驅體；CLP：共同淋巴前驅體。
圖 12. 抗體 MF4327xMF5196 以等 效率 重定向 AML 患者 T 細胞和 健康的捐贈者 T 細胞 以特異性溶解 CLEC12APOS AML 細胞株 。 從六位健康的捐贈者或六位臨床緩解AML患者(患者1-6；患者特徵參見表III)之末梢血液單離休眠CD3POS T細胞。單離的T細胞係在1,000 ng/mL抗體MF4327xMF5196、MockxCD3 IgG或對照IgG存在下(全部都有WT Fc效應子功能)、與CFSE標記的HL60標靶細胞以5:1的E:T比率共培養48小時。(A-B)從健康的捐贈者(HD)或AML患者取得、隨後用於HL60標靶細胞溶解之T細胞CD3POS 部分內，CD4POS T細胞(A)及CD8POS T細胞(B)的亞群組成之流動式細胞測量術分析。TCM ：中央記憶T細胞；T初始 的 ：初始的(naïve)T細胞；TEMRA+ ：有重新取得的CD45RA之效應子-記憶細胞；TEM ：效應子記憶T細胞。(C-E)所示的IgGs及T細胞來源之CD4POS T細胞(C)及CD8POS T細胞(D)之活化以及HL60標靶細胞溶解(E)，藉由流動式細胞測量術來分析且與PBS條件相比。各圓形表示以三複本測試的單一T細胞捐贈者的平均值。資料係相對於PBS、通過ANOVA予以分析：* P>0.05，** P>0.01，*** P>0.001。
圖 13 . SSClow CD45dim CD34+ CD38- CLEC12A+/- 細胞二次平板培養所產生的細胞之 形態及 JAK2V617F 突變狀態。 重新平板培養的CLEC12A梅-吉姆沙(May-Giemsa)染色陽性細胞，挑選個別的群落並測試JAK2驅動突變。
圖 14a . 抗體MF4327xMF5196 治療 的患者 之IL-6 位準 。 在用劑前、輸注結束4小時及24小時之後以PG/ml來測量。用劑發生於第1天、第4天、第8天及第22天。患者於第1天接受1 mg之啟動劑量，接著於第4天接受3 mg及於第8天接受15 mg之逐步調升劑量，以及於第15天接受25 mg之全劑量。亦判定治療週期結束(第28天)時的細胞介素位準。
圖14b . 抗體MF4327xMF5196 治療 的患者 之IL-8 位準 。 在用劑前、輸注結束4小時及24小時之後以PG/ml來測量。用劑發生於第1天、第4天、第8天及第22天。患者於第1天接受1 mg之啟動劑量，接著於第4天接受3 mg及於第8天接受15 mg之逐步調升劑量，以及於第15天接受25 mg之全劑量。亦判定治療週期結束(第28天)時的細胞介素位準。
圖14c. 抗體MF4327xMF5196 治療 的患者 之TNFα 位準 。 在用劑前、輸注結束4小時及24小時之後以PG/ml來測量。用劑發生於第1天、第4天、第8天及第22天。患者於第1天接受1 mg之啟動劑量，接著於第4天接受3 mg及於第8天接受15 mg之逐步調升劑量，以及於第15天接受25 mg之全劑量。亦判定治療週期結束(第28天)時的細胞介素位準。
圖14d. 抗體MF4327xMF5196 治療 的患者 之IFN γ 位準 。 在用劑前、輸注結束4小時及24小時之後以PG/ml來測量。用劑發生於第1天、第4天、第8天及第22天。患者於第1天接受1 mg之啟動劑量，接著於第4天接受3 mg及於第8天接受15 mg之逐步調升劑量，以及於第15天接受25 mg之全劑量。亦判定治療週期結束(第28天)時的細胞介素位準。
圖 15a . 抗體MF4327xMF5196 治療 的患者 之IL-6 位準 。 在用劑前、輸注結束4小時及24小時之後以PG/ml來測量。用劑發生於第1天、第4天、第8天及第22天。患者於第1天接受3 mg之啟動劑量，接著於第4天接受10 mg及於第8天接受25 mg之逐步調升劑量，以及於第15天接受40 mg之全劑量。亦判定治療週期結束(第28天)時的細胞介素位準。
圖15b . 抗體MF4327xMF5196 治療 的患者 之IL-8 位準 。 在用劑前、輸注結束4小時及24小時之後以PG/ml來測量。用劑發生於第1天、第4天、第8天及第22天。患者於第1天接受3 mg之啟動劑量，接著於第4天接受10 mg及於第8天接受25 mg之逐步調升劑量，以及於第15天接受40 mg之全劑量。亦判定治療週期結束(第28天)時的細胞介素位準。
圖15c. 抗體MF4327xMF5196 治療 的患者 之TNFα 位準 。 在用劑前、輸注結束4小時及24小時之後以PG/ml來測量。用劑發生於第1天、第4天、第8天及第22天。患者於第1天接受3 mg之啟動劑量，接著於第4天接受10 mg及於第8天接受25 mg之逐步調升劑量，以及於第15天接受40 mg之全劑量。亦判定治療週期結束(第28天)時的細胞介素位準。
圖15d. 抗體MF4327xMF5196 治療 的患者 之IFN γ 位準 。 在用劑前、輸注結束4小時及24小時之後以PG/ml來測量。用劑發生於第1天、第4天、第8天及第22天。患者於第1天接受3 mg之啟動劑量，接著於第4天接受10 mg及於第8天接受25 mg之逐步調升劑量，以及於第15天接受40 mg之全劑量。亦判定治療週期結束(第28天)時的細胞介素位準。
圖16a. 抗體MF4327xMF5196 治療 的患者 之IL-6 位準 。 在用劑前、輸注結束4小時及24小時之後以PG/ml來測量。用劑發生於第1天、第4天、第8天及第22天。患者於第1天接受5 mg之啟動劑量，接著於第4天接受15 mg及於第8天接受25 mg之逐步調升劑量，以及於第15天接受60 mg之全劑量。亦判定治療週期結束(第28天)時的細胞介素位準。
圖16b. 抗體MF4327xMF5196 治療 的患者 之IL-8 位準 。 在用劑前、輸注結束4小時及24小時之後以PG/ml來測量。用劑發生於第1天、第4天、第8天及第22天。患者於第1天接受5 mg之啟動劑量，接著於第4天接受15 mg及於第8天接受25 mg之逐步調升劑量，以及於第15天接受60 mg之全劑量。亦判定治療週期結束(第28天)時的細胞介素位準。
圖16c. 抗體MF4327xMF5196 治療 的患者 之TNFα 位準 。 在用劑前、輸注結束4小時及24小時之後以PG/ml來測量。用劑發生於第1天、第4天、第8天及第22天。患者於第1天接受5 mg之啟動劑量，接著於第4天接受15 mg及於第8天接受25 mg之逐步調升劑量，以及於第15天接受60 mg之全劑量。亦判定治療週期結束(第28天)時的細胞介素位準。
圖16d. 抗體MF4327xMF5196 治療 的患者 之IFN γ 位準 。 在用劑前、輸注結束4小時及24小時之後以PG/ml來測量。用劑發生於第1天、第4天、第8天及第22天。患者於第1天接受5 mg之啟動劑量，接著於第4天接受15 mg及於第8天接受25 mg之逐步調升劑量，以及於第15天接受60 mg之全劑量。亦判定治療週期結束(第28天)時的細胞介素位準。
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(無)

Claims (15)

  1. 一種治療一個體的一CLEC12A陽性癌症之方法，該方法包含以一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體之二或多次投予來治療有需要的該個體，其中於一第一次投予中投予該雙特異性抗體的一第一量且其中於後續投予中該雙特異性抗體的量比該第一次投予之該雙特異性抗體的量高。
  2. 如請求項1之方法，其中該第一量為雙特異性抗體的一亞治療量。
  3. 如請求項1或請求項2之方法，其中於該二或多次投予之該第二次中該投予的雙特異性抗體的量係比該第一次投予的該雙特異性抗體的量高，以及比該二或多次投予之一第三次的該雙特異性抗體的量低。
  4. 如請求項3之方法，其中於該二或多次投予之該第三次中該投予的雙特異性抗體的量比該二或多次投予之該第二次的該雙特異性抗體的量高，以及比該二或多次投予之一第四次的該量低。
  5. 如請求項1-4中任一項之方法，其中於該遞增(incremental)量的雙特異性抗體投予後，該雙特異性抗體於每次的後續投予中係以一實質恆定劑量來投予。
  6. 如請求項5之方法，其中於每次的該後續投予中該實質恆定劑量為至少15 mg的該雙特異性抗體。
  7. 如請求項6之方法，其中於每次的該後續投予中該實質恆定劑量為至少60 mg的該雙特異性抗體。
  8. 如請求項1-7中任一項之方法，其中該雙特異性抗體的該第一量為9 mg或更小。
  9. 一種結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體供用於一治療一個體的CLEC12A陽性癌症之方法中，其中該治療包含一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體之二或多次投予，其中於一第一次投予中投予該雙特異性抗體的一第一量且其中於每次的後續投予中該雙特異性抗體的量比該第一次投予的該雙特異性抗體的量高。
  10. 一種從一個體清除CLEC12A陽性造血細胞且以正常CLEC12A陽性細胞再植(repopulating)該個體之造血系統之方法，該方法包含每隔一段時間投予一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體給有需要的該個體藉此殺滅CLEC12A陽性惡性細胞，且刺激該個體的造血幹細胞及/或造血前驅體細胞(hemopoietic progenitor cells)以用新生的造血幹細胞衍生的CLEC12A陽性細胞來再植該造血系統。
  11. 該個體較佳為一經診斷具有急性骨髓性白血病(AML)、骨髓發育不良症候群(MDS)、骨髓纖維化(MF)或骨髓增生性贅生物急性期(myeloproliferative neoplasm blast phase，MPN-BP)的個體。
  12. 一種製備一用於一要治療一CLEC12A陽性癌症之個體的自體骨髓細胞移植物之方法，該方法包含於適合殺滅CLEC12A陽性細胞的條件下、以一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體培育該個體的一骨髓細胞製備物，且隨後從該培育中採集骨髓細胞。
  13. 一種治療一個體的一CLEC12A陽性癌症之方法，該方法包含於適合殺滅CLEC12A陽性細胞的條件下、以一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體培育該個體的一骨髓細胞製備物，以一造血系統消融療法(ablative therapy)來治療該個體且提供一包含該培育的骨髓細胞之骨髓細胞移植物給該個體。
  14. 一種提供一個體一保留造血幹細胞的癌症治療(a hemopoietic stem cell sparing cancer treatment)之方法，該方法包含投予一結合CD3及CLEC12A的雙特異性抗體給有需要的該個體。
  15. 如請求項14之方法，其中該個體有一CLEC12A陽性癌症。
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