TWI629284B - 多價抗體片段與其三聚複合物 - Google Patents
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Abstract
本發明關於產生多價Fab片段的方法。特別是,本發明關於藉由於一哺乳動物細胞中共表現包含一Fab片段之一重鏈部分與一框內融合之類膠原蛋白胜肽的一基因構築體以及由IgG之一輕鏈部分所組成之一基因構築體之三聚體Fab片段之產生的方法。使用本發明方法所產生之分子的用途也被描述。
Description
本發明關於產生多價Fab片段的方法。特別是,本發明關於藉由於一哺乳動物細胞中共表現包含一Fab片段之一重鏈部分與一框內融合之類膠原蛋白胜肽的一基因構築體以及由IgG之一輕鏈部分所組成之一基因構築體之三聚體Fab片段之產生的方法。
功能性親和力(functional affinity(avidity))為一抗原與許多抗原決定因素(antigenic determinants)之整體結合能力的程度。對於結合至非常接近一目標細胞之一群組的專一相同配體而言,抗原結合伙伴的聚合大幅增加它們的效用(或價數(valency)),引起更大之目標結合效力、減緩之分離率與可延長配體之調節與促進生物潛力的交叉連結作用。
一單鏈變異片段(single-chain variable fragment,scFv)為免疫球蛋白之重鏈(VH)與輕鏈(VL)之變異區的一融合蛋白,藉由一短的連結胜肽來連結。與雙價免疫球蛋白G(IgG)對應物(counterpart)相較,scFv之主要缺點為產物的單價,其妨礙由於多價結合之增加的親和力。為了增加親和力,許多策略已針對scFv之多聚化來發展。
藉由使用一三聚體化區域之一三價單鏈抗體片段
(scFv)融合蛋白之重組產生已被報導,三價單鏈抗體片段(scFv)融合蛋白包括一前膠原蛋白(procollagen)之C前胜肽(C-propeptide)、膠原凝集素(collectin)家族蛋白質之一卷曲螺旋頸區(coiled-coil neck domain)、FasL之一C端部分與一噬菌體(bacteriophage)T4彈力素(fibritin)折疊區(Hoppe,H.J.,P.N.Barlow,et al.(1994). "A parallel three stranded alpha-helical bundle at the nucleation site of collagen triple-helix formation." FEBS Lett 344(2-3):191-195;Frank,Kammerer et al.2001 "Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering." J Mol Biol 308(5):1081-1089;Holler,N.,A.Tardivel,et al.(2003). "Two adjacent trimeric Fas ligands are required for Fas signaling and formation of a death-inducing signaling complex." Mol Cell Biol 23(4):1428-1440.)。具自身三聚體化與來自C-或N-端方向之異源融合蛋白質之增殖之能力的短α螺旋類膠原蛋白胜肽也已於EP1798240B1中被報導。
於EP1798240B1中使用的異源融合區被呈現於scFv抗體片段中。然而,在治療應用之多價形式中,scFv具有缺點。
不像免疫球白G(IgG)分子,其可藉由使用蛋白質A
或G結合之樹脂的親和力層析(affinity chromatographies),經由與IgG之Fc片段結合而容易地被純化,於純化方案之第一步驟,產生於大於98%產物同質性,用於治療應用之多聚scFV融合體的純化為挑戰的工作,由於並無可獲得的市售親和性管柱。多價之scFv依據建構它們之專一變異區具有明顯差異的穩
定度(Jung,S.,A.Honegger,et al.(1999). "Selection for improved protein stability by phage display." J Mol Biol 294(1):163-180;Worn,A.and A.Pluckthun(2001). "Stability engineering of antibody單鏈Fv fragments." J.Mol Biol 305(5):989-1010)。已報導經由變異區交換來媒介嵌合抗CD20單鏈Fv-Fc融合蛋白的多聚體化,導致異源抗體變異體(Wu,A.M.,G.J.Tan,et al.(2001). "Multimerization of a chimeric anti-CD20 single chain Fv-Fc fusion protein is mediated through variable domain exchange." Protein Eng 14(12):1025-1033)。
CFY196由與源自人類免疫球蛋白D樞紐之一連結
子融合的一人源化變體之mAb 1A616之一Fab片段以及源自人類轉錄因子ATFα之卷曲螺旋序列的四聚體化區域所組成(Charles,Luo et al.2003)。然而,ATFα並非一原生質取得蛋白質(plasma-derived protein),其可能與一可嚴重限制潛在治療應用之免疫反應的風險相關。
美國專利申請公開U.S.2008/0176247顯示與包括
GPP三連體(triplets)之一自身三聚體化類膠原蛋白支架N端融合之一抗-CD3 scFv具有形成由三個單鏈胜肽構成之三聚體抗體片段的能力。然而,這些類膠原蛋白支架融合體的三聚體scFv變體的下游純化是麻煩的,由於並無可獲得的親和樹脂來有效地將其純化。此外,所述三聚體scFv變體之低蛋白質表現程度與熱不穩定性不具備用於生物治療的條件。因此,需要設計一新形式之三聚體膠原蛋白支架抗體。
本實施例包括一種於一真核細胞中產生一多價Fab片段的方法,包括於一真核細胞中共表現之步驟:(1)一編碼出包括一Fab片段之一重鏈部分與一框內融合類膠原蛋白胜肽之一胺基酸序列的基因構築體;以及(2)一編碼出包括人類IgG之一輕鏈變異區與kappa輕鏈固定區之一胺基酸序列的基因構築體。
在一實施例中該(1)之基因構築體更包括編碼出一來自人類IgG之樞紐區的一序列。
在一實施例中,該人類IgG係擇由IgG1、IgG2、IgG3與IgG4所組成之群組。
在一實施例中,編碼出該樞紐區的該序列於該基因構築體中座落於該Fab片段與該類膠原蛋白胜肽之間。
在一實施例中,該(1)之基因構築體更包括編碼出一單鏈Fv之一序列。
在一實施例中,該(2)之基因構築體包括一人類IgG1之kappa輕鏈。
本發明之實施例包括藉由上方所討論之方法來產生的多價Fab片段。
另一實施例包括三聚之多價Fab片段,包括藉由至少它們之類膠原蛋白區來結合在一起的三個多價Fab片段。
一另外實施例包括一種多價抗體片段,包括:(1)包括一Fab片段之一重鏈部分與一框內融合之類膠原蛋白胜肽之一胺基酸序列;以及
(2)包括人類IgG之一輕鏈變異區與kappa輕鏈固定區之一胺基酸序列。
在一實施例中,該抗體片段為雙專一性。
上方討論之實施例之多價抗體片段之配體,可為人類CD3或人類CD3與人類表皮生長因子受體。
另一實施例為編碼該蛋白質實施例之一核酸、表現該蛋白質實施例之表現載體或包括該表現載體及/或該核酸的宿主細胞。
本發明提供藉由使用抗-CD3抗體片段來治療、避免或改善T細胞居中免疫疾病之症狀的方法,特別是自體免疫疾病。特別是,本發明之方法為了與人類CD3複合物內之epsilon次單元專一結合之抗體的投予作準備。此類抗體調節T細胞受體/同種抗原(alloantigen)相互作用,且因此調整與自體免疫失調相關之T細胞居中細胞毒性。另外,本發明為了抗-CD3抗體之修飾作準備以使它們相較於未修飾之抗-CD3抗體顯出經減少或經消除之效用功能(effector function)與T細胞活化。細胞激素釋放症候群(cytokine release syndrome)被以,例如,頭痛、噁心、嘔吐、發燒、肌痛(algias)、關節痛(hralgias)與發抖所表現,且可由增加之,例如IL-2、IL-6、IL-10,TNFα與IFNγ的血清程度所引起。
第1圖顯示,根據實施例之抗體片段分子之不同形式的一概要圖式:形式A:FabCSA,其為一三聚體抗體片段,由一Fab
片段所組成,於其中重鏈片段與一樞紐區及具自身三聚體化能力之類膠原蛋白支架融合;形式B:FabCSA-scFv,其為一三聚體雙專一抗體片段,係由分別位於一具自身三聚體化能力之類膠原蛋白支架之N-與C-端的一Fab片段與一單鏈抗體(scFv)所組成;形式C:FabCSA-sdAb,其為一三聚體雙專一抗體片段,係由分別位於一具自身三聚體化能力之類膠原蛋白支架之N-與C-端的一Fab片段與一單域抗體(single-domain antibody,sdAb)所組成。
第2圖顯示,根據實施例,藉由使用KappaSelect與Superdex 200管柱之順序層析(sequential chromatographies),自培養基純化之h145FabCSA分子的結構特性。(A)藉由凝膠過濾(gel filtration)之h145FabCSA種類(species)的分離。將洗提自KappaSelect管柱的樣本濃縮且載至以PBS(pH 7.4)平衡之一Superdex 200凝膠過濾管柱;(B)藉由SDS-PAGE,不同波峰分劃(peak fraction)(於A中編號為波峰1至3)與所載入樣本在非還原(泳道(lane)2、4、6與8)與其中將樣本於75℃以50mM之DTT處理10分鐘之還原狀態(泳道3、5、7與9)下分析。(C)對應於如於B中所示以箭頭指出之蛋白質條帶(band)之結構的概要圖式。虛線指出推定的雙硫鍵。將具有等量蛋白質之所有樣本以一4~12% SDS/Bis-Tris聚丙烯醯胺凝膠(polyacrylamide gel)進行電泳,伴隨MES為電泳緩衝溶液(running buffer)。將膠體以InstantBlue蛋白質染色溶液進行染色。
第3圖顯示,根據實施例藉由使用KappaSelect與Superdex 200管柱之順序層析(sequential chromatographies),純化自培養
基之hOKT3FabCSA分子的結構特性。將洗提自KappaSelect管柱的樣本濃縮且載至以PBS(pH 7.4)平衡之一Superdex 200凝膠過濾管柱。右上區塊(panel):藉由SDS-PAGE在非還原狀態下分析由Superdex 200分離之不同波峰分劃(編號波峰1至3)。藉由箭頭分別指出對應於hOKT3FabCSA三聚體與單體之蛋白質條帶。將所有樣本以一4~12% SDS/Bis-Tris聚丙烯醯胺凝膠進行電泳,伴隨MES為電泳緩衝溶液。將膠體以InstantBlue蛋白質染色溶液進行染色。
第4圖顯示,三聚體hOKT3FabCSA(於第3圖中之波峰2)、低-Fcγ受器結合抗-人類CD3抗體-hOKT3IgG-AA(藉由蛋白質A管柱來純化)與muromonab-CD3(OKT3),藉由SDS-PAGE於非還原(泳道2、3與4)與其中將樣本於75℃以50mM之DTT處理10分鐘之還原狀態(泳道5、6與7)下的純度分析。將具有等量蛋白質之所有樣本以一4~12% SDS/Bis-Tris聚丙烯醯胺凝膠進行電泳,伴隨MES為電泳緩衝溶液。將膠體以InstantBlue蛋白質染色溶液進行染色。M,BenchMarkTM分子量標準品。
第5圖顯示,根據實施例,三聚體hOKT3FabCSA(分離自於第3圖中之波峰2)、低-Fcγ受器結合抗-人類CD3抗體-hOKT3IgG-AA(二聚體)與單體hOKT3FabCSA(分離自於第3圖中之波峰3)對於經純化之人類T淋巴球的結合親和力抗-小鼠CD3抗體-145-2C11與三聚體h145FabCSA(於第2A圖中之波峰2)對於經純化之小鼠脾臟T淋巴球的親和力。
第6圖顯示,根據實施例,抗-小鼠CD3抗體-145-2C11與三聚體h145FabCSA(於第2A圖中之波峰2)對於經純化之小鼠
脾臟T淋巴球的結合親和力。
第7圖顯示,根據實施例之二-獨立-競爭取代結合分析(two-independent-competitive displacement binding assays)。將表現CD3(+)T-細胞受體之Jurkat細胞分別以連續稀釋之抗-CD3抗體-經純化之hOKT3FabCSA三聚體(實心圓形)與OKT3(空心圓形),於4℃培養1小時。加入飽和量之FITC-結合OKT3並培養額外之1小時。清洗細胞且藉由流式細胞分析(flow cytometry)將FITC-結合OKT3進行定量。數值被表現為最大螢光強度之百分比抑制,其被定義為藉由添加FITC-結合OKT3而無先前抗-CD3抗體之阻礙所獲得的平均螢光強度。
第8圖顯示,對經純化之OKT3、低-Fcγ受器結合抗-人類CD3抗體-hOKT3IgG-AA與hOKT3FabCSA三聚體反應之T細胞增生。自三位健康正常提供者收集人類周邊單核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)且將其分別以連續log稀釋之OKT3(實心圓形)、hOKT3IgG-AA(空心圓形)或hOKT3FabCSA(空心三角形)培養66小時,以10μM之BrdU脈衝(pulsed)額外6-小時。藉由BrdU-ELISA使用化學冷光免疫分析(chemiluminescent immunoassay)來測量細胞增生以將BrdU在DNA合成期間的併入進行定量。各點代表三位提供者之平均值±標準差。
第9圖顯示,由OKT3、hOKT3IgG-AA與hOKT3FabCSA三聚體誘導之細胞激素的釋放。自三位健康正常提供者收集人類PBMCs,且將其分別以連續log稀釋之OKT3(實心圓形)、hOKT3IgG-AA(空心圓形)或hOKT3FabCSA(空心三角形)
培養。藉由ELISA,分別在24-與72-小時時間點測定於培養上清液中之IL-2與剩餘部分之指出之細胞激素的程度。各點代表三位提供者之平均值±標準差。
第10圖顯示,藉由經純化之OKT3、hOKT3IgG-AA與hOKT3FabCSA三聚體之混合淋巴球反應的抑制。將與絲裂黴素(mitomycin)C-處理之刺激物(stimulator)PBMCs混合的應答物(responder)PBMCs,在不同濃度之OKT3(實心圓形),hOKT3IgG-AA(空心方形)或hOKT3FabCSA(空心三角形)存在下,共培養五天,以BrdU脈衝額外16小時。藉由BrdU-ELISA來測量細胞增生。在抗體不存在下,與絲裂黴素C-處理之刺激物PBMCs混合的應答物PBMCs以及應答物PBMCs分別被以一實心方形與一實心三角形顯示。在抗體不存在下,未處理之刺激物PBMCs的細胞增生被以一空心圓形顯示。
第11圖顯示,藉由經純化之hOKT3FabCSA(三聚體)、hOKT3IgG-AA(二聚體)與hOKT3FabCSA(單體)之T細胞受體(T cell receptor,TCR)-CD3調節/覆蓋(coating)的定量。CD3調節之資料顯示,於經處理之CD5-陽性T細胞之表面上的TCR-CD3複合物依照於未處理之CD5-陽性T細胞之表面上之TCR-CD3複合物的一部分(fraction)的百分比。CD3覆蓋被顯示為TCR-CD3複合物之部分,其無法被FITC-結合OKT3所偵測。
第12圖顯示,根據實施例,於小鼠中經純化h145FabCSA三聚體的血液清除率(blood clearance)。將雄性BALB/c小鼠以靜脈內注射25μg之h145FabCSA三聚體。於不同時間抽出血液
樣本。藉由抗-人類Fd塗覆之ELISA盤,使用山葵過氧化酵素(horseradish peroxidase)-結合抗-人類kappa輕鏈為偵測抗體,來測定於血漿中剩餘的抗體程度。結果被平均自各時間點之3隻動物。
第13圖顯示,根據實施例,不同抗-CD3抗體對實驗性自體免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠疾病模型的生物作用。(A)對EAE小鼠之不同生物效力。對於載劑(vehicle)(倉鼠控制IgG)、145-2C11(倉鼠IgG)與經純化之三聚體h145FabCSA群組,小鼠分別以1.0、0.1與1.0μg/小鼠之一劑量程度每天被靜脈內注射一次,達五個連續天數(以箭號指出)。對於干擾素(interferon)-β1a(正控制)群組,小鼠以10,000單位/小鼠之一劑量程度在整個治療期間每天被腹腔內注射一次。結果被顯示為來自兩個獨立實驗的一代表性實驗之各群組(n=10)的平均值±標準差。(B)對於在EAE小鼠上之h145-2C-11 IgG與三聚體h145FabCSA處理反應之Treg細胞族群的流式細胞分析。在最後之靜脈內注射一天後,準備來自載劑(倉鼠控制IgG)、145-2C11 IgG與三聚體h145FabCSA群組之各個的三隻小鼠的脾臟淋巴細胞,並將其以LAP-APC與CD4-FITC染色以流式細胞分析。Treg族群之測定被限制(gate)於LAP+細胞。資料來自於三個實驗中之一代表性小鼠。
第14A與B圖,顯示145-2C11 IgG與h145FabCSA三聚體對SLE小鼠模型的治療功效。
第15圖顯示,對在靜脈內注射一單一劑量之50μg之不同抗-CD3抗體之後之小鼠中之血清細胞激素程度的時間進程研
究。將小鼠分組並靜脈內投予50μg之經純化145-2C11 IgG(淺灰方形)、低-Fcγ受器結合抗-小鼠CD3抗體-145IgG-AA(深灰方形)或h145FabCSA三聚體(空心方形)。於0(前採血(pre-bleed))、0.5-、24-與144-小時之時間點收集血液(100μl/小鼠)。使用ELISA來測定細胞激素的程度。各點代表三個孔洞之平均值±標準差。PBS(黑色方形)被使用為控制組。
第16圖顯示,源自一非單一(A)或一單一穩定複製(clone)(B)之hOKT3FabCSA763scFv分子的結構特性。藉由使用KappaSelect與Superdex 200管柱之順序層析來純化各培養基。(A)藉由凝膠過濾之源自一非單一複製之hOKT3FabCSA763scFv種類的分離。右上區塊:藉由SDS-PAGE,在非還原狀態下分析不同波峰分劃(編號波峰1至3)。藉由箭號指出對應至雙硫連結二聚體(T)、非-雙硫-鍵結二聚體(Mt)與單體(Mm)的結構之條帶(band)位置;(B)藉由凝膠過濾之源自一穩定複製之hOKT3FabCSA763scFv種類的分離。藉由SDS-PAGE,在非還原狀態下分析波峰分劃。藉由箭號指出對應至雙硫連結二聚體(T)與非-雙硫-鍵結二聚體(Mt)的結構之條帶位置被顯示。將所有樣本以一4~12% SDS/Bis-Tris聚丙烯醯胺凝膠進行電泳,伴隨MES為電泳緩衝溶液。將膠體以InstantBlue蛋白質染色溶液進行染色。
第17圖顯示,EGFR(+)細胞一A431、WiDr與HCT116及CD3(+)Jurkat T細胞與三聚體雙專一抗-CD3×EGFR抗體,hOKT3FabCSA763scFv之結合的流式細胞分析,hOKT3FabCSA763scFv源自如於第16B圖中所示包含非-雙硫-
鍵結與雙硫連結三聚體兩者之三聚體的波峰分劃。
第18圖顯示,經由人類PBMCs,三聚體雙專一抗-CD3×EGFR,抗體hOKT3FabCSA763scFv抵抗EGFR-表現腫瘤細胞的細胞毒性。在三聚體hOKT3FabCSA763scFv之變化濃度下,將經刺激之人類PBMCs以不同之E/T比與A431細胞培養(A);或以固定10:1比與WiDr或HCT116細胞培養(B)。
第19圖顯示,經由三聚體雙專一hOKT3FabCSA763scFv之EGFR-過度表現腫瘤細胞的重定向裂解(redirected lysis)的縮時攝影(time-lapse photography)。將A431細胞與PKH26-預染(prestained)之人類T淋巴球共培養,在1μg/ml之三聚體hOKT3FabCSA763scFv不存在(A),或存在(B)下,達指定時間點(小時:分鐘),且分別藉由縮時顯微鏡來記錄影像。注意在共培養13小時後觀察到藉由T細胞之A431之細胞凋亡的完成。
第20圖顯示,於HCT116大腸結腸癌NOD/SCID小鼠模型中三聚體hOKT3FabCSA763scFv之vivo功效。於第0天,將兩群組-763 IgG與PBS控制組皮下接種5×106 HCT116細胞,在人類PBMC不存在下。剩餘之三個群組以皮下接種5×106 HCT116細胞與來自健康提供者於第0天之5×106未經刺激之PBMC的混合物,然後以尾靜脈注射PBS載劑控制物(100μl)、50μg與15μg之hOKT3FabCSA763scFv於第1天達10個連續不斷天數。來自各群組的腫瘤生長曲線,以指出動物的n數目被顯示。介於hOKT3FabCSA763scFv群組與未經刺激之人類PBMC控制組之劑量給藥的統計顯著差異(P<0.001)被顯示。
於下方詳細說明中,為了說明之目的提及許多特定細節以提供所揭露之實施例的徹底瞭解。然而,清楚的是,可實施一或多個實施例而無這些特定細節。在其他例子中,綱要性地顯示熟知結構與裝置以簡化圖式。
本揭露包括一種於一真核細胞中產生一多價Fab片段的方法,包括於一真核細胞中共表現之步驟:(1)一編碼出包括一Fab片段之一重鏈部分與一框內融合類膠原蛋白胜肽之一胺基酸序列的基因構築體;以及(2)一編碼出包括一輕鏈變異區與人類IgG之kappa輕鏈固定區之一胺基酸序列的基因構築體。
該(1)之基因構築體也可包括一IgG之樞紐區及/或一scFv。
於上方之方法中所述多價抗體片段可之後被裝配進一三聚體之構築體。
本發明包括編碼多價抗體片段之一核酸、一表現該多價抗體片段之表現載體當表現於一宿主細胞中。本發明也包括一宿主細胞,其包括表現該多價抗體片段之一表現載體。
本發明包括用於調節(即,抑制或增加)一配體之生物活性的方法或套組,包括將一包括三個多價抗體片段之三聚體與一配體一起培養。
本發明也提供經由投予多價抗-CD3抗體片段來治療、避免或改善T細胞居中免疫疾病之症狀的方法,特別是自體免疫疾病。
定義
1.抗體片段
此揭露之多價抗體片段包括一或多個“抗體片
段”,也描述為“抗體區(region)”、“抗體區域(domain)”或“抗原結合區域”。於此敘述之“抗體片段”包括一完整抗體之一部分,例如,一完整抗體之抗原結合或變異區。抗體片段的例子包括,Fab、Fab’、F(ab’)2與Fv片段;雙抗體(diabodies);線性(linear)抗體(參見U.S.Pat.No.5,641,870,Example 2;Zapata et al.,Protein Eng.8(10):1057-1062[1995])、單鏈抗體分子與多專一抗體。
抗體之木瓜蛋白酵素消化(papain digestion)產生
兩個相同之抗原結合片段,稱為“Fab”片段,與一殘餘“Fc”片段,一反映容易結晶之能力的命名。Fab片段可包括與H鏈之變異區域(variable region domain,VH)在一起的完整L鏈及一重鏈之第一固定區域(the first constant domain of one heavy chain,CH1)。輕鏈之固定區域可為lambda或kappa形式。各Fab片段有關抗原結合為單價,即其具有一單一抗原結合位。
Fd或Fd片段為抗體重鏈片段,其係由VH與CH1區域
所組成。
一抗體之木瓜蛋白酵素處理產生一單一大的
F(ab’)2片段,其大體上對應於具有雙價抗原結合能力之兩個雙硫連結的Fab片段,且仍具有交叉連結(cross-linking)抗原之能力。Fab’片段不同於Fab片段,因具有在CH1區域之羧基(carboxy)端的額外少數殘基,額外少數殘基包括一或多個來自抗體樞紐
區之半胱氨酸(cysteines)。
本發明多價抗體片段可包括重鏈之一部分輕鏈
(或其一部份),或一重鏈之部分與輕鏈或其部分兩者。
抗體片段可包括一單鏈Fv。“單鏈(single-chain)
Fv”也縮寫為“sFv”或“scFv”,為抗體片段,其包括VH與VL抗體區域連接成一單一多胜肽鏈。在一實施例中,scFv多胜肽更包括一多胜肽連結子介於VH與VL區域之間,其使scFv能形成所需要之用於抗原結合的結構。關於scFv的複習,參見以下Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994);Borrebaeck 1995。
“單域(single domain)”抗體(sdAb)為其互補決定
區窩一單域多胜肽之部分的抗體。例子包括重鏈抗體、自然缺乏輕鏈之抗體抗體、源自常見4-鏈抗體之單域抗體、經設計之(engineered)抗體與除了源自抗體之那些的單域支架。單域抗體可為本技術領域之任何或任何未來之單域抗體。單域抗體可源自任何物種(species),包括,但不限於小鼠、人類、駱駝、羊駝(Ilama)、鯊魚(shark)、山羊、兔子與牛科動物(bovine)。
“雙專一抗體(bispecific antibodies)”為對於至少兩
個不同之抗原具有結合專一性的抗體。
於實施例中之Fd-CS為一融合多胜肽鏈,其係由抗
體Fd片段接著一人類IgG1之樞紐區與本發明類膠原蛋白胜肽所組成。
可於此使用用語“單體”以描述具有一單一類膠原
蛋白胜肽一多價抗體片段的一實施例。在一實施例中,使用“單體”來描述一多價抗體片段,其中一重鏈與一輕鏈結合。所述“單體”被與多價抗體片段之“三聚化(trimerized)”結構區別。
於一實施例中,多價抗體片段為雙專一的。在一
實施例中,本發明之一單體結構可具有不只抗體片段、大於一個抗原結合區,且可結合大於一類型之抗原。例如,本發明多價抗體片段之一單一單體結構可包括一Fab區於單體結構之N端,且具有一scFv區於單體結構之C端。
2.樞紐區
本發明之實施例的蛋白質是需要而定包括一“樞
紐區”。在一實施例中,樞紐區為一大約4-15個胺基酸長的序列。其可為一人類IgG之樞紐區或一甘胺酸(glycine)連結子。
在一實施例中,一人類IgG之樞紐區為人類IgG1、IgG2、IgG3或人類IgG4之樞紐區。
如先前Fan,et al.(2008)“Production of
multivalent protein binders using a self-trimerizing collagen-like peptide scaffold.”FASEB J 22(11):3795-3804所證實,類膠原蛋白胜肽,(GPP)10,藉由其本身可驅動一非共價結合之三聚體融合蛋白質的形成。因此,“樞紐區”為視需要而定,且甚至目前對於所主張之融合胜肽不具有三聚體化功效。
3.類膠原蛋白胜肽
膠原蛋白為於哺乳動物中最豐富之蛋白質。其為
一細胞外基質(extracellular matrix)蛋白質,其包含一或多個三重螺旋區(triple-helical regions)(膠原蛋白區域或膠原蛋白
“支架”)具有一重複之Gly-Xaa-Yaa之三連體的序列,其中Xaa與Yaa為任何胺基酸殘基,隨著脯胺酸(proline)(胺基酸代號,P或Pro)為最頻繁被併入的殘基。在Yaa位置中,Pro一般被酵素修飾為4-羥脯胺酸(hydroxyproline)(胺基酸代號,O或Hyp),使得Gly-Pro-Hyp為於膠原蛋白最常見與最穩定中的三重複。此類三重複之存在允許三條膠原蛋白多胜肽鏈(α-鏈)折疊成一三重螺旋結構。類膠原蛋白胜肽之敘述,可被發現於於此特別引入其全文為引用文獻之U.S.Patent Application 13/588,752之類膠原蛋白區域的敘述中。本發明之類膠原蛋白多胜肽藉由其本身具有將一Fab片段之一重鏈部分三聚體化成一三價結構之能力,不需其他分開之三聚體化區域。本發明一類膠原蛋白多胜肽包括至少5,至少10個Gly-Pro-Pro或Gly-Pro-Hyp三個一組之連續重複的至少一伸長(stretch)。本發明之類膠原蛋白胜肽可包括一Gly-Pro-Pro或Gly-Pro-Hyp再現單位(motif)及/或其他Gly-Xaa-Yaa再現單位,其中Xaa與Yaa為任何胺基酸殘基。本發明之類膠原蛋白胜肽也可包括被發現於許多天然發生之膠原蛋白與含類膠原蛋白區域之蛋白質中之被一短的瑕疵所中斷之一完美重複的Gly-Xaa-Yaa三個一組,於其中第一位置之Gly或第三位置之Yaa殘基缺失。
可測定膠原蛋白多聚體結構的穩定性,藉由測量此三聚體之熔點溫度。許多研究已檢驗G-P-X1重複之熔點溫度/穩定性。Frank et al.,(2001);Persikov et al.,(2000)Biochemistry 39,14960-14967;Persikov et al.,(2004)Protein Sci.13:893-902;and Mohs et al.,(2007)J.Biol.Chem.282:
29757-29765。基於這些研究,可預測各種重複結構的穩定性。
4.連結子(Linker)
連結子為一短的胜肽序列,其可視需要而定被置於抗體片段與類膠原蛋白胜肽區之間,或結合區與類膠原蛋白胜肽區之間。scFv多胜肽也包括一多胜肽連結子介於VH與VL區之間,其使scFv能形成對於抗原結合所需之結構。在一些實施例中,在任一例子中,連結子為於長度介於4與10個胺基酸之間。
本發明多價抗體片段可於結合區與配體結合。一配體為一生物分子,其與本實施例之結合區形成一複合物。配體可在一特定功能性親和力下,經由分子間作用力(Intermolecular force)與結合區結合。在一實施例中,多價抗體片段對其配體具有大於10-6M之功能性親和力。在一實施例中,多價抗體片段對其配體具有大於10-8M之功能性親和力。在一實施例中,多價抗體片段對其配體具有大於10-10M之功能性親和力。在特定實施例中,可溶三聚體或六聚體融合蛋白質具有對其配體具有介於10-7M與10-12M之間、介於10-8M與10-11M之間、介於10-7M與10-10M之間、介於10-8M與10-10M之間,與介於10-9M與10-10M之間的功能性親和力(functional affinity(or affinity))。
在一實施例中,由多價抗體片段所建構之三聚體或六聚體蛋白質為一可溶性蛋白質。一可溶性蛋白質為在生理狀態(physiological conditions)下為可溶者。在一實施例中,由多價抗體片段所建構之可溶性三聚體或六聚體為一分泌蛋白
質(secreted protein)。一分泌融合蛋白質為被一細胞所分泌者。藉由具有訊息序列或於包含抗體區域之多胜肽上的訊息胜肽,可將一蛋白質的分泌做為目標。
訊息序列可包括:MetGluThrAspThrLeuLeuLeuTrpValLeuLeuLeuTrpValProGlySerThrGly(序列辨識號:11)。
訊息胜肽可被裂解在表現、裝配及/或分泌過程期間。小鼠融合瘤(myeloma)NS0細胞為一對於重組膠原蛋白或類膠原蛋白蛋白質產生以及對於本發明融合蛋白質之表現的良好表現系統。另外,CHO與CHO-S細胞可被用於重組膠原蛋白或類膠原蛋白蛋白質產生及用於本發明融合蛋白質之表現。
本發明之實施例之經裝配的三聚體包括三個單體;一第一、第二與第三多價抗體片段。在一實施例中,上述第一、第二與第三多價抗體片段為大體上相同,彼此具有至少75%(例如,任何介於75%與100%之間的數字,包含,例如75%、76%...95%、96%、97%、98%或99%)的序列相似度。藉由三個相同之多價抗體片段所形成之一複合物為一同源三聚體(homotrimer)。三個多價抗體片段可為功能等同物(functional equivalent)。一"功能等同物"意指一常見多胜肽的一多胜肽衍生物,例如具有一或多個點突變(point mutations)、插入、刪除、截斷的一蛋白質、一融合蛋白質,或其組合,並實質上維持形成一三重螺旋卷曲(triple helix coil)之能力與異源區域(heterologous domain)的活性,例如結合至一配體。在一實施例中,具有一第一單體多價抗體片段結構的三個複製(copy)與
一第二多價抗體片段結構的三個複製。在一實施例中,可具有一第一多價抗體片段結構的兩個複製、一第二多價抗體片段結構的兩個複製與一第三多胜肽結構的兩個複製。
百分比強度可被測定,例如,藉由使用Devereux
等人所敘述(Nucl.Acids Res.12:387,1984)且可獲自University of Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG)之GAP電腦程式,版本6.0來比較序列資訊。GAP程式利用Smith與Waterman(Adv.Appl.Math 2:482,1981)修訂之Needleman與Wunsch(J.Mol.Biol.48:443,1970)之校準方法(alignment method)。對於GAP程式之系統默認參數(default parameters)包括:(1)用於核苷酸之一一元比較矩陣(unary comparison matrix)(包含對於相同(identities)之1的值與對於不相同(non-identities)之0的值)與由Schwartz and Dayhoff,eds.,Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353-358,1979所述之Gribskov and Burgess,Nucl.Acids Res.14:6745,1986的加權比較矩陣(weighted comparison matrix);(2)對於各差距(gap)之一3.0的扣分(penalty)與對於在各差距中之各標記之一額外0.10的扣分;以及(3)對於末端差距(end gaps)沒有扣分。
如於此所使用,用語"一致序列(consensus
sequence)"意指形成自於相關序列之一家族中最頻繁發生之胺基酸(或核苷酸)的序列(參見Winnaker,From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft,Weinheim,Germany 1987;也參見Richards et al.,第9圖)。在一家族之蛋白質中,於一致序列中
之各位置被於此家族中最頻繁出現於此位置的胺基酸所佔據。若兩個胺基酸同樣頻繁出現,則任一個可被包括於一致序列中。
一異源多胜肽、核酸或基因為一多胜肽、核酸或
基因,其與並非自然結合之另一多胜肽、核酸或基因結合。兩個融合之區域或序列為彼此異源的,若它們並非於一自然發生之蛋白質或核酸中彼此連接。
一"經分離之"多胜肽(或多價抗體片段)或蛋白質
複合物意指一多胜肽或一蛋白質複合物大體上沒有自然結合分子(associated molecule)摻雜,即根據乾重(dry weight),其為至少75%(即包括介於75%與100%之間之任何數字)純。藉由任何適合之標準方法可測量純度,例如,藉由管柱層析(column chromatography)、聚丙烯醯胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis)或HPLC分析。本發明之實施例之一經分離之多胜肽或蛋白質複合物可純化自一天然來源、藉由重組DNA技術產生。
三聚體化以形成三聚體多價抗體片段之三個單體
抗體片段可為非連續的(non-contiguous)。在另一實施例中,三聚體化以形成三聚體多價抗體片段之三個單體抗體片段為為連續的,即,被轉譯為一單一轉譯產物。
另一方面,當二或多個之六個結合區為彼此相同
時,蛋白質複合物可具有專一於一結合伙伴(binding partner)(例如,抗原)的1-3個結合區,相較於一僅具有一或兩個此類區域的一般抗體或受體。換句話說,和對於一抗原僅為單價
或雙價的一般抗體或受體不同,蛋白質複合物可為雙-、三-、四-、五-或六-價。因此,其可被製作為具有高於一一般抗體或受體的親和力。由於較高的親和力,相較於一般抗體需要較少量之蛋白質複合物與較短之培養期間來達成所需目標,例如,治療作用,藉此降低治療成本與使副作用最小化(例如,不想要的免疫反應)。
另一方面,當二或多個之六個結合區為彼此不同
時,本發明之一蛋白質複合物可具有專一於2-6個不同之結合伙伴的2-6個結合區。將不同專一性之多個結合伙伴位置聯合成一單元,其具有將多個結合伙伴聚集在一起之能力,且因此在於奈米程度之治療、組織重建(tissue reconstruction)與活性蛋白質機器(machinery)(例如,一多單元次單位酵素)的裝配方面,具有所需用途。
本發明之實施例的一蛋白質複合物可被結合至一
治療部分(moiety),例如一細胞毒素(cytotoxin)、一治療試劑或一放射性離子(radioactive ion)。一細胞毒素或細胞毒性試劑包括對細胞有害之任何試劑。例子包括紫杉醇(taxol)、細胞遲緩素B(cytochalasin B)、滅革蘭菌素D(gramicidin D)、溴化乙菲錠(ethidium bromide)、吐根素(emetine)、絲裂霉素(mitomycin)、伊妥普賽(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、秋水仙素(colchicines)、阿黴素(doxorubicin)、道紅鏈絲菌素(daunorubicin)、二羥炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracin dione)、雙羥恩(mitoxantrone)、光神霉素(mithramycin)、放射
菌素D(actinomycin D)、去氢睾丸素(1-dehydrotestosterone)、葡萄糖皮質素(glucocorticoids)、普魯卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普潘奈(propranolol)、嘌呤黴素(puromycin)、美登類化合物(maytansinoids),例如美登素醇(maytansinol)(參見U.S.Pat.No.5,208,020)、CC-1065(參見U.S.Pat.Nos.5,475,092, 5,585,499與5,846,545)與其類似物(analogs)或同源物(homologs)。治療試劑包括,但不限於,抗代謝物質(antimetabolites)(例如,胺甲基葉酸(methotrexate)、6-硫醇嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鳥嘌呤(6-thioguanine)、阿拉伯糖基胞嘧啶(cytarabine)、5-氟尿嘧啶達卡巴仁(5-fluorouracil decarbazine))、烷化試劑(例如,二氯甲基二乙氨(mechlorethamine)、thioepa chlorambucil、CC-1065、氮芥苯丙胺酸(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)與環己亞硝(lomustine)(CCNU)、癌德星錠(cyclothosphamide)、硫酸布他卡因(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、鏈佐黴素(streptozotocin)、絲裂霉素C與順式二氯二氨合鉑(cis-dichlorodiamine platinum(II),DDP)二氯二氨鉑(cisplatin)、蔥環類化合物(anthracyclines)(例如,道紅鏈絲菌素(daunorubicin)(先前為daunomycin)與阿黴素(doxorubicin))、抗生素(例如,放線菌素(dactinomycin)(先前為actinomycin)、博來黴素(bleomycin)、光神霉素與氨茴霉素anthramycin(AMC))與抗有絲分裂試劑(例如,長春新鹼、長春花鹼、紫衫醇與美登類化合物)。
於本發明之實施例中所考慮的放射性離子包括,
但不限於,111銦(Indium)、113銦、99錸(Rhenium)、105錸、101錸、99鍀(Mtechnetium)、121碲(Mtellurium)、122碲、125碲、165銩(Thulium)、167銩、168銩、123碘(Iodine)、125碘、126碘、131碘、133碘、81氪(Krypton)、33氙(Xenon)、90釔(Yttrium)、213鉍(Bismuth)、77溴(Bromine)、18氟(Fluorine)、95釕(Ruthenium)、97釕、103釕、105釕、107汞(Mercury)、203汞、67鎵(Gallium)、68鎵、35硫(Sulphur)與14碳(Carbon)。
結合物(conjugates)可被用來修飾一產生的免疫反
應,藉由將結合物投予至一宿主。藥物部分drug moiety不被解釋為限制為正統化學治療試劑。例如,藥物部分可為具有一所需生物活性的一蛋白質或多胜肽。此類蛋白質可包括,例如一毒素,如雞母珠毒蛋白(abrin)、蓖麻毒蛋白A(ricin A);綠膿桿菌外毒素(pseudomonas exotoxin)或白喉毒素(diphtheria toxin);一蛋白質,如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor)、α-干擾素(interferon)、β-干擾素、神經生長因子(nerve growth factor)、血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor)。
組織型溶脢原活化因子(tissue plasminogen activator);或生物反應修飾子(biological response modifiers),如,例如,淋巴因子(lymphokines)、介白素(interleukin)-1("IL-1")、介白素-2("IL-2")、介白素-6("IL-6")、顆粒球巨噬細胞聚落刺激因子(granulocyte macrophase colony stimulating factor)("GM-CSF"),顆粒球聚落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor)("G-CSF")或其他生長因子。
在額外的實施例中,一多價抗體(或其三聚體複
合物)可被結合或接合至一標記試劑(labeling agent)(即“一標誌試劑(marking agent)”),例如,螢光試劑或放射性試劑。標誌蛋白質(marker protein)包括,但不限於發光酶(luciferase)、綠螢光蛋白質(green fluorescent protein)與增強綠螢光蛋白質(enhanced green fluorescent protein)。包括標誌蛋白質之目前實施例的多價抗體實施例可被用於診斷與分子造影(imaging)。在本發明實施例中,包括標誌蛋白質或放射性離子或其他融合部分之多價抗體片段可被包裝於一套組中,其包括多價抗體片段與特定分子之造影所需之其他試劑。這些試劑可包括,但不限於,生物樣本之製備的試劑用於與用於標記蛋白質之形象化(visualization)的試劑。
在本發明另外的實施例中,一多價抗體片段(或
其三聚體複合物)可被結合至一聚合物。此類聚合物包括,但不限於,聚乙二醇(polyethylene glycol)、聚丙二醇(polypropylene glycol)與聚氧乙烯多元醇(polyoxyethylated polyol)。
本發明之實施例也包括一經分離之核酸,其包含
編碼出正如上所述之多價抗體片段的一序列或此序列之一互補物(complement)。一核酸意指一DNA分子(例如,一cDNA或基因體DNA(genomic DNA))、一RNA分子(例如,一mRNA),或一DNA或RNA類似物。一DNA或RNA類似物可自核苷酸類似物來合成。核酸分子可為單股或雙股,但在一實施例中為雙股DNA。一"經分離之核酸"為一核酸,其結構並不相同於任何自然存在之核酸的結構或任何自然存在之基因體核酸之任何片
段的結構。因此,此用語包含,例如,(a)一DNA其具有一自然存在之基因體DNA分子之部分的序列,但不被位於生物體基因體中自然存在其中之分子的那部分之兩側的編碼序列兩者所位於兩側;(b)一核酸,其併入一載體後一原核細胞或真核細胞,以使所產生之分子不同於任何自然存在之載體或基因體DNA的方式;(c)一個別之分子(separate molecule),例如一cDNA、一基因體片段、由聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)所產生之一片段或一限制片段(restriction fragment);以及(d)一重組核苷酸序列,其為一混合基因(hybrid gene)的部分,即編碼出一融合蛋白質的一基因。上述核酸可被用來表現本發明之多胜肽。為此目的,可操作性地連結此核酸至適合之調控序列(regulatory sequence)以產生一表現載體。
一載體意指,一核酸分子,其具有運輸可連結至
其之其他核酸的能力。載體可具有自發複製之能力或可併入一宿主細胞。一載體的例子包括一質體(plasmid)、黏質體(cosmid)或病毒載體(viral vector)。本發明之載體包括於一適合在一宿主細胞中核酸之表現之形式的一核酸。載體包括一或多個調控序列操作性地連結至要被表現之核酸序列。在一實施例中,表現載體為pSecTag2/Hygro(Invitrogen)。
一"調控序列"包括啟動子(promoters)、增強子
(enhancers)與其他表現控制要素(例如,多聚腺苷酸化訊息(polyadenylation signals)),調控序列包括直接構成一核苷酸序列之表現的那些與組織專一調控及/或可誘導之序列。表現載體的設計可依據此類因子,例如要被轉形(transform)之宿主細
胞的選擇。所需之蛋白質的表現程度及其類似。表現載體可被引入宿主細胞以產生本發明之多胜肽。也在本發明之實施例的範圍中的是,包含上述核酸之一宿主細胞。例子包括大腸桿菌(E.coli)細胞、昆蟲細胞(例如,使用果蠅(Drosophila)S2細胞或桿狀病毒(baculovirus)感染之昆蟲細胞)、酵母菌細胞(yeast cell)或哺乳動物細胞(mammalian cell)(例如,小鼠融合瘤NS0細胞)。參見,例如Goeddel,(1990)Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,Calif。
編碼出本發明單體結構之序列也可包括提供用於
確認與純化之核苷酸或蛋白質序列。此類序列可包括限制位(restriction sites)、(標籤tags)、間隔物(spacer),與其他方法以純化或確認核苷酸或蛋白質序列。通常此類序列被包含於核苷酸中,且用於編碼於長度為4-6個胺基酸之短的胺基酸序列。
它們常出現於多價抗體片段之中間區域為人工製品(artifacts),但不實質上影響本發明之基本與新穎的特性。
為了產生一多價抗體片段,在允許一核酸所編碼
之多胜肽的表現的狀況下,可於一培養基中培養一宿主細胞,自培養之細胞或細胞之培養基純化此多胜肽。若沒有親和性標籤的話,則包含類膠原蛋白胜肽的胜肽可能不易被純化。在本發明多價抗體片段中,Fab區域協助純化,或者,本發明之核酸可被in vitro轉錄與轉譯,例如,使用T7啟動子調控序列與T7聚合酶。
為產生本發明之實施例的一蛋白質複合物,可於
一培養基中培養包含分別編碼出上述第一、第二與第三融合多
胜肽之一第一、第二與第三核酸的一宿主細胞,在允許藉由此三個核酸所編碼之多胜肽表現及在所表現之多胜肽之間之一三重螺旋卷區的形成的狀態下,並從培養之細胞或細胞之培養基純蛋白質複合物。宿主細胞為一真核細胞,其包含羥化(hydroxylates)一脯胺酸殘基的一酵素活性。
一宿主細胞可為任何原核或真核細胞。本發明之
實施例的蛋白質可被表現於細菌細胞(例如大腸桿菌)、昆蟲細胞、酵母菌細胞或哺乳動物細胞(例如,中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cells,CHO)或COS細胞(非洲綠猴腎臟細胞CV-1起源SV40細胞;Gluzman(1981)Cell 23:175 182))中。其他適合之宿主細胞為本技術領域中具有通常知識者所已知。
經由一般轉形(transformation)或轉染(transfection)
技術,載體DNA可被引入一宿主細胞。如於此使用,用語"轉形"與"轉染"被打算意指為各種本技術領域認可之用於引入外來核酸(例如,DNA)進入一宿主細胞的技術,包括磷酸鈣或氯化鈣共沈澱(co-precipitation)、DEAE-葡聚糖(dextran)-居中之轉染、脂質轉染(lipofection)或電穿孔(electroporation)。
為了in vivo使用於人類中,本發明之實施例的一多
價抗體片段為人類源的。例如,其可包一序列,其融合框內至一人類起源之類膠原蛋白區域。由於許多具有膠原蛋白區域之類膠原蛋白蛋白質於血液中相當穩定,因此多價抗體片段同樣地在血液中可維持結構完整。此外,樞紐區與Fc區域可取自一人類IgG或人源化抗體。
本發明之實施例也提供藉由使用抗-CD3抗體片段
來治療、避免或改善T細胞居中免疫疾病之症狀的方法,特別是自體免疫疾病。特別是,本發明之方法為了與人類CD3複合物內之epsilon次單元專一結合之抗體的投予作準備。此類抗體與抗體片段調節T細胞受體/同種抗原(alloantigen)相互作用,且因此調整與自體免疫失調(autoimmune disorder)相關之T細胞居中細胞毒性。另外,本發明為了抗-CD3抗體或抗-CD3抗體之片段的修飾作準備,以使它們相較於未修飾之抗-CD3抗體顯出經減少或經消除之效用功能(effector function)與T細胞活化。
免疫失調意指於其中免疫系統錯誤地攻擊與破壞
健康的身體組織藉此產生組織損傷的疾病。免疫失調包括,但不限於類風濕關節炎(rheumatoid arthritis)、幼年型類風濕性關節炎(juvenile rheumatoid arthritis)、僵直性脊椎炎(ankylosing spondylitis)、多發性硬化症(multiple sclerosis)、第1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus)、發炎性腸道疾病(inflammatory bowel diseases)、全身性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus)、混合型結締組織病(mixed connective tissue disease)、進行性全身性硬皮症(progressive systemic scleroderma)、抗磷脂症候群(antiphospholipid syndrome)、乾癬(psoriasis)、硬皮症(scleroderma)、腎絲球腎炎(glomerulonephritis)、皮肌炎(dermatomyositis)、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto's thyroiditis)與葛瑞夫茲氏症(Grave's disease)。
效用功能可被證實,藉由,通過補體依賴型細胞
毒殺作用(complement-dependent cytotoxicity,CDC)之一抗體覆蓋顆粒的吞噬作用(phagocytosis)與瓦解(collapse)、通過抗體依賴型的細胞媒介細胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)之一抗體覆蓋目標細胞的裂解,其起因於交叉連結抗體Fc片段與一經活化之作用細胞(effector cell),例如自然殺手細胞(natural killer cell)的Fcγ受器、包括IL-1α、IL-1β、IL-6與TNFα之發炎調解子(inflammatory mediator)的釋放,以及免疫產物的控制。
T細胞活化可被證實,藉由測量關於經由抗原或對
於T細胞受體(T cell receptor,TCR)之競爭抗體(agonistic antibody)之T細胞的刺激T細胞增生。T細胞受體活化可導致訊息傳遞途徑(signaling pathway)的起始,訊息傳遞途徑包括特定蛋白質胺酸激脢(protein tyrosine kinases,PTKs)的誘導、磷脂醯肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol 4,5-biphosphate,PIP2)的分解、蛋白質激酶C(protein kinase C,PKC)的活化與細胞內鈣離子濃度的提高。這些早期事件被傳送至細胞核並導致T細胞之複製擴增(clonal expansion);於細胞表面上之活化標誌的向上調控;分化成效用細胞(effector cells);細胞毒性之誘導或細胞激素釋放,例如IL-2;細胞凋亡之誘導。
細胞激素釋放症候群(cytokine release syndrome)
被以,例如,頭痛、噁心、嘔吐、發燒、肌痛、關節痛與發抖所表現,且可由增加之,例如IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10、TNFα與IFNγ的血清程度所引起。
上述蛋白質複合物,根據異源結合區的專一性,
可被用於治療各種失調,包括自體免疫失調、發炎疾病、代謝疾病、纖維化疾病(fibrosis diseases)、癌症與心血管疾病(cardiovascular diseases)。疾病之特定表現形式(manifestations)包括頭痛、噁心、嘔吐、發燒、肌痛、關節痛與發抖,且可由增加之,例如IL-2、IL-6、IL-10、TNFα與IFNγ的血清程度所引起。因此,本發明以治療此類疾病之方法為特徵,例如,藉由投予一需要之個體一有效量之本發明的蛋白質複合物以治療失調。要被治療之個體可被確認為具有具備疾病之特徵的情況,或為處於獲得具備疾病之特徵的情況的風險中。可將此方法單獨執行或與其他藥物或治療結合執行。
一實施例為被用來治療由T細胞受體/同種抗原互
相作用所引起或加重的疾病,且因此調控T細胞與免疫疾病相關之T細胞居中細胞毒性。在另一實施例中,本發明被用於在依需要之病患中調節CD3之生物活性、調節CD3尋席傳遞的程度或調節T受體/同種抗原互相作用。在一實施例中,本發明降低未結合之CD3的程度或CD3訊息傳遞。由於本發明一蛋白質複合物的多專一特徵,可使用其來連結通常不彼此結合之分子或細胞。此特徵對於細胞療法(cell-based therapies)特別有用。
在一例子中,本發明多價Fab抗體片段具有以一區域結合CD3而另一區域結合EGFR的能力。
經由以本發明之一蛋白質複合物與為細胞毒殺性
T細胞(cytotoxic T cell)之表面上之一效用抗原(effector antigen)的CD3抗原結合,可發生細胞毒殺性T細胞的活化。其他淋巴細胞相關效用抗原包括人類CD16抗原、NKG2D抗原、
NKp46抗原、CD2抗原、CD28抗原、CD25抗原、CD64抗原與CD89抗原。結合至這些效用抗原導致效用細胞的活化,效用細胞例如單核細胞(monocyte)、嗜中性粒細胞(neutrophilic granulocyte)與樹狀細胞(dendritic cell)。這些經活化之細胞之後對目標細胞施加一細胞毒性或一細胞凋亡作用。
用語"治療(treating)"被定義為,帶有治癒、緩和、
減輕、改善、避免或減輕一失調、此失調之症狀、繼發於此失調的疾病狀態、一被本發明之配體所加劇的失調或對於此失調之易染病體質的目的,而對一病患投予一組成物。一"有效量"為組成物其在如上述在一經治療個體中可產生一醫藥所需結果的一個量。
在一in vivo方式中,將一治療組成物(例如一組成
物,其包含本發明之一蛋白質複合物)投予至一個體。一般而言,將複合物懸浮於一藥學上可接受之載體中(例如,一生理食鹽水physiological saline)且將其口服或藉由靜脈內注入(intravenous infusion)投藥,或將其皮下(subcutaneously)、肌肉內(intramuscularly)、鞘內(intrathecally)、腹腔內(intraperitoneally)、直腸內(intrarectally)、陰道內(intravaginally)、鼻內(intranasally)、胃內(intragastrically)、氣管內(intratracheally)或肺內(intrapulmonarily)注射或植入。
劑量要求依據投藥途徑的選擇;配方之本質(the
nature of the formulation);個體之疾病的性質;個體之體型、重量、表面積、年齡與性別;要投予之其他藥物;與主治醫師的判斷。適合之劑量為在0.01-100.0mg/kg的範圍中。適合之
劑量為在0.01-100.0mg/kg,或更特別是0.1-100、0.1-75、0.1-50、0.1-25、0.1-10、0.5-100、0.5-75、0.5-50、0.5-25、0.5-10、1-100、1-75、1-50或1-25mg/kg的範圍中。劑量可包括1-10、10-100、10-75、10-50、10-25、25-50、50-75、25-100、25-50、50-100或75-100mg/kg。或者,劑量可在1-2、3-4、5-6、7-8或9-10mg/kg的範圍。
本發明之實施例的治療組成物可每天被投予一
次、兩次或三次或更多在介於1至10週之間,例如為介於2至8週之間,或者為介於3至7週之間,且甚至為約4、5或6週之每週。根據可利用之組成物之種類與投藥之種途徑的不同效力來預計在所需劑量中的變化。例如,相較於藉由靜脈內注射之投藥,口服投藥會被預期需要較高的劑量。為了最佳化,使用標準經驗途徑可調整於這些劑量程度中的變化,此為本技術領域中所熟知。於一適合之傳送載體(delivery vehicle)(例如,聚合微粒(polymeric microparticle)或可植入裝置(implantable device))中的組成物封裝可增加傳送效率,特別是對於口服傳送。
藥學上適合之載體包括一溶劑、一分散媒介
(dispersion medium)、一套膜(coating)、一抗細菌或抗真菌試劑及一等滲透壓與吸收延遲。特別是,這些試劑可包括鹽溶液(saline solution)、固定油(fixed oil)、聚乙二醇(polyethylene glycol)、甘油(glycerine)、丙二醇(propylene glycol)或其他合成試劑;抗細菌試劑,例如苯甲醇(benzyl alcohol)或對羥基苯甲酸甲酯(methyl parabens);抗氧化劑(antioxidants),例如抗
壞血酸(ascorbic acid)或亞硫酸氫鈉(sodium bisulfite);螯合試劑(chelating agent),例如乙二胺四醋酸(ethylenediaminetetraacetic acid);緩衝溶液(buffer),例如醋酸鹽(acetate)、檸檬酸鹽(citrate)或磷酸鹽(phosphate);與用於滲透強度(tonicity)之調整的試劑,例如氯化鈉或葡聚醣。可以酸或鹼來調整藥學組成物的pH值,例如鹽酸(hydrochloric acid)或氫氧化鈉(sodium hydroxide)。
也在本發明之實施例的範圍中者為一藥學組成
物,其包含藥學上可接受之載體與一有效量之本發明之實施例的一蛋白質複合物。藥學組成物可被用來治療上方所列之失調。藥學尚可接受之載體包括一溶劑、一分散媒介、一套膜、一抗細菌或抗真菌試劑及一等滲透壓與吸收延遲。使用一般之方法可將藥學組成物配製為用於不同之投藥途徑的劑量形式。
本發明之實施例的組成物可被評估於in vitro與in vivo兩者。對於in vivo研究而言,可將組成物注入一動物(例如,一小鼠模式)並之後存取其治療功效。根據此結果,可確定一適合之劑量範圍與投藥途徑。
如於此處所使用,用語"針對抵抗(directed
against)"與"專一性結合至(specifically binds to)"意指本發明融合蛋白質包括一抗體區域,其中一抗體之抗體或片段對其配體具有至少10-6M之功能性親和力。
在伴隨以下圖式與說明中,本發明之一或多個實施例之細節被提出。由說明書及圖式以及由申請專利範圍,本發明之其他特徵、目的與優點是明確的。
II.實施例之結構
A.抗體片段
根據一實施例之本發明多價抗體片段的單體可具有單一抗體片段(包括結合區域/區或抗原-結合片段)或多於一個抗體片段。一單體呈現多價抗體片段之抗體片段的例子包括,但不限於:(i)一Fab片段,由VL、VH、CL與CH1區域所組成之一單價片段;(ii)一F(ab')2片段,包括兩個由雙硫鍵於樞紐區連結之雙價片段;(iii)由VH與CH1區域所組成之一Fd片段;(iv)由一抗體之一單一手臂之VL與VH區域所組成的一Fv片段;(v)一dAb片段(Ward et al.,(1989)Nature 341:544-546),其由一VH區域所組成;(vi)一經分離之互補決定區(complementarity determining region,CDR);與(vii)VL或VH區域。
在一實施例,抗體片段為一Fab片段。
此外,儘管Fv片段的兩個區域,VL與VH為由個別之基因所編碼,然使用重組方法,經由一合成連結子可將它們連結,合成連結子能使它們被做成為於其中VL與VH區成對以形成單價分子之一單一蛋白質鏈(已知為單鏈Fv(scFv);參見,Bird et al.(1988)Science 242:423-426;與Huston et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此種單鏈抗體(scFv)也包含於一抗體之用語"抗原-結合片段"中。藉由使用本技術領域中具有通常知識者所知的一般技術,可獲得這些抗體片段,且,為了效用以與完整抗體相同之方式來篩選此片段。
在一實施例,抗體片段為一scFv。
在一實施例,多價抗體包括兩個抗體片段、一Fab與一scFv。
Fd或Fd片段為由VH與CH1區域所組成之抗體重鏈片段。
一抗體可為一單株抗體。在一實施例中,抗體被重組地產生,例如藉由嗜菌體展示(phage display)或藉由組合的方法。用於產生嗜菌體展示或藉由組合的方法為本技術領域中所已知(參見,例如Ladner et al.U.S.Pat.No.5,223,409;Kang et al.International Publication No.WO 92/18619;Dower et al.International Publication No.25 WO 91/17271;Winter et al.International Publication WO 92/20791;Markland et al.International Publication No.WO 92/15679;Breitling et al.International Publication WO 93/01288;McCafferty et al.International Publication No.WO 92/01047;Garrard et al.International Publication No.WO 92/09690;Ladner et al.International Publication No.WO 90/02809;Fuchs et al.(1991)Bio/Technology 9:1370-1372;Hay et al.(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81-85;Huse et al.(1989)Science 246:1275-1281;Griffths et al.(1993)EMBO J.12:725-734;Hawkins et al.(1992)J Mol Biol 226:889-896;Clackson et al.(1991)Nature 352:624-628;Gram et al.(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580;Garrad et al.(1991)Bio/Technology 9:1373-1377;Hoogenboom et al.(1991)Nuc Acid Res 19:
41334137;and Barbas et al.(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88:7978-7982,其所有內容於此被合併為參考文獻)。在一實施例中,抗體為一人類抗體(例如,於一小鼠中製造的一抗體,其已被基因工程建造以產生一來自人類免疫球蛋白序列的一抗體),或一非人類抗體,例如一齧齒目動物(小鼠或大鼠)、山羊、靈長類動物(primat)(例如猴子)或駱駝抗體。在一實施例中,非人類抗體一齧齒目動物(小鼠或大鼠抗體)。產生齧齒目動物之抗體的方法為本技術領域所已知。
相較於小鼠系統,使用攜帶人類免疫球蛋白基因之基因轉殖小鼠可產生人類單株抗體。使用以完整抗原免疫之來自基因轉殖小鼠的脾細胞來產生融合瘤,其分泌具有對來自一人類蛋白質之抗原決定位專一親和力的人類mAbs(參見,例如Wood et al.International Application WO 91/00906,Kucherlapati et al.PCT 15 publication WO 91/10741;Lonberg et al.International Application WO 92/03918;Kay et al.International Application 92/03917;Lonberg,et al.(1994)Nature 368:856-859;Green,L.L.et al.(1994)Nature Genet.7:13-21;Morrison et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855;Bruggeman et al.(1993)Year Immunol 7:33-40;Tuaillon et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720-3724;Bruggeman et al.(1991)Eur J Immunol 21:1323-1326)。
人類單株抗體的一例子為帕尼單抗(panitumumab)(VECTIBIX®),先前稱為ABX-EGF,為專一於表皮細胞生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)的一完整人類
單株抗體。帕尼單抗被用於治療具有表皮細胞生長因子受體表現,結腸(colon)或直腸(rectum)之轉移癌症的病患。
一抗體,可為於其中變化區或其部分,例如CDR's被產生於一非人類生物體,例如一大鼠或小鼠中者。可使用嵌合(chimeric)、CDR接枝(CDR-grafted)與人源化抗體。於一非人類生命體,例如一大鼠或小鼠中產生的抗體,且之後例如於變異骨架(variable framework)或固定區被修飾以降低於一人類中之抗原性(antigenicity)為於本發明中。
藉由本技術領域中已知的重組DNA技術可產生嵌合抗體。例如,以限制酶裂解編碼出一鼠科動物(或其他種類)單株抗體分子Fc固定區的一基因以移除編碼出鼠科動物之Fc的區域,且以編碼出一人類Fc固定區的一基因的等同部分取代(參見,Robinson et al.,International Patent Publication PCT/US86/02269;Akira,et al.,European Patent Application 184,187;Taniguchi,M.,European Patent Application 171,496;Morrison et al.,European Patent Application 173,494;Neuberger et al.,International Application WO 86/01533;Cabilly et al.U.S.Pat.No.4,816,567;Cabilly et al.,European Patent Application 125,023;Better et al.(1988)Science 240:1041-1043);Liu et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443;Liu et al.,(1987)J Immunol.139:3521-3526;Sun et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218;Nishimura et al.,(1987)Canc.Res.47:999-1005;Wood et al.et al(1985)Nature 314:446-449;and Shaw et al.,(1988)J.Natl Cancer Inst.
80:1553-1559)。
一人源化或CDR-接枝抗體會具有以一提供者CDR取代之一至少一或二個但通常全部三個(重及/或輕免疫球蛋白鏈)之接受者(recipient)CDR's。可以至少一非人類CDR之一部分來取代抗體,或僅有CDR's之一些可以非人類CDR's來取代。
僅需要取代人源化抗體或一其片段的結合所要求之CDR's的數目。提供者可為一齧齒目動物抗體,例如一大鼠或小鼠抗體,且接受者為一人類骨架或一人類一致骨架(consensus framework)。一般而言,提供CDR's之免疫球蛋白稱為"提供者(donor)",而提供骨架的免疫球蛋白稱為"接受者(acceptor)"。
在一實施例中,提供者免疫球蛋白為一非人類的(例如,齧齒目動物的)。接受者骨架為一自然發生(例如,一人類)骨架或一一致骨架,或一序列約與其85%或更高,為90%、95%、99%或更高相同。
在一實施例中,配體或抗原為CD3。在一實施例中,配體或抗原為EGFR。在一實施例中一雙專一結構具有抗-CD3區與抗-EGFR區兩者。
在一實施例中,Fab為抗-CD3,且可包括一或多個下列之結構:包括於h145FabCSA中之結合區
一抗體片段之結合區可源自一抗-CD3抗體,且可包括重鏈與輕鏈兩者。例如,源自倉鼠抗-小鼠CD3抗體(145-2C11)的重鏈變異區為:
(序列辨識號:
12)。
源自倉鼠抗-小鼠CD3抗體(145-2C11)的輕鏈變異區為:
(序列辨識號:13)。
包含於hOKT3FabCSA中之結合區
人源化鼠源單株抗體(muromonab)-CD3(Orthoclone OKT3抗體)的重鏈變異區為:
(序列辨識
號:14)。
人源化鼠源單株抗體(muromonab)-CD3(Orthoclone OKT3抗體)的輕鏈變異區為:
(序列辨識號:15)。
在Fab中,重鏈可包括人類IgG1之CH1區域與一樞紐區。此序列之一例子為:
(序列辨識號:16)。
在Fab中,IgG1之kappa輕鏈固定區域可C端被加至輕鏈變異區。kappa輕鏈固定區域的一例子為:
(序列辨識號:17)。
在一實施例中,多價抗體片段包括一scFv。一此種抗EGFR之scFv(763scFv)的序列顯示如下:
(序列辨識號:9)。
B.樞紐區
本發明之融合蛋白質可包括一“樞紐區”。在一實施例中,樞紐區為一約4-15個胺基酸長的序列。其可為It may be一人類IgG之樞紐區或一甘胺酸連結子。在一實施例中,人類IgG之樞紐區為人類IgG1或人類IgG2的一樞紐區。
在一實施例中,“樞紐區”具有下列序列之一:GluProLysSerGlyAspLysThrHisThrCysProProCysPro(序列辨識號:18)或GluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCysPro(序列辨識號:19)下列之一:
在一實施例中,“樞紐區”包括一甘胺酸連結子。
一甘胺酸連結子(G-連結子)的例子可包括下列:(GGGGS)3(序列辨識號:24)。最常見使用之scFv連結子包含一甘胺酸與絲胺酸(serine)殘基之十五個胺基酸的組合。
GGSGGSGGGGSGGGGS(序列辨識號:25),為顯示於U.S.Patent 5,908,626中:具有以一胜肽連結子連結之干擾素-β與免疫球蛋白Fc的混合物(hybrid)。
RGRGRGRGRGRGGGS:(序列辨識號:26)取自scFv-RG3。
在本發明多價抗體片段中,連結子也可被使用於別處。
C.類膠原蛋白胜肽
類膠原蛋白胜肽的敘述可被發現於於此被明確合併其全文為參考文獻之美國專利申請號13/588,752的類膠原蛋白區域的敘述中。本發明之類膠原蛋白胜肽可包括一GPP或GPO再現單位(motif)及/或一三聚體化再現單位或其他結構。例如,一此種類膠原蛋白胜肽可具有一如下之序列:
(序列辨識號:27)。
D.連結子
連結子為一短的胜肽序列,其可視需要而定被置於抗體片段與類膠原蛋白胜肽區之間,或結合區與類膠原蛋白
胜肽區之間。scFv多胜肽也包括一多胜肽連結子介於VH與VL區之間,其使scFv能形成對於抗原結合所需之結構。在一些實施例中,在任一例子中,連結子為於長度介於4與10個胺基酸之間,且可具有序列:Alaalaalaglyglyglyglyser(序列辨識號:28)或glyglyglyglyser(序列辨識號:29)。甘胺酸連結子(G-連結子):(GGGGS)3(序列辨識號:24)。最常見使用之scFv連結子包含一甘胺酸與絲胺酸(serine)殘基之十五個胺基酸的組合。
GGSGGSGGGGSGGGGS(序列辨識號:25)發現於於以具有以一胜肽連結子連結之干擾素-β與免疫球蛋白Fc的混合物(hybrid)為題名之藉此明確以參考文獻併入的U.S.Patent number 5,908,626中。
甘胺酸-丙胺酸(alanine)連結子:GGAGAGAG(序列辨識號:30)。
甘胺酸-精胺酸(arginine)連結子:RGRGRGRGRGRGGGS(序列辨識號:26)。
特定實施例包括形式A-C,顯示於第1圖中為三聚體。形式A:FabCSA,為一三聚體抗體片段,其具有一Fab片段於具有自身三聚體化之能力之類膠原蛋白胜肽的N端;形式B:FabCSA-scFv,為一三聚體雙專一之抗體片段,其具有一Fab片段與一單鏈抗體片段分別於具有自身三聚體化之能力之類膠原蛋白胜肽的N端與C端;以及形式C:FabCSA-sdAb,為一三聚體雙專一抗體 片段,其具有一Fab片段與一單域抗體分別於具有自身三聚體化之能力之類膠原蛋白胜肽的N端與C
端。值得注意的是,形式A-C包括三個單體,個單體具有一種鏈與輕鏈於Fab區。
下方特定實施例被建構為僅是說明,且不限制所揭露之剩餘部分以不管任何方式。無更進一步詳細闡述,相信本技術領域中聚通常知識者可根據於此之說明書利用本發明至其最大程度。於此所列所有出版物特此經由以其全文引用而合併到本文中。
實施例
實施例1
h145FabCSA、hOKT3FabCSA與hOKT3FabCSA763scFv的建構
下列為h145FabCSA之重鏈的多胜肽序列(序列辨識號:1)與編碼出其的cDNA序列(序列辨識號:2)。h145FabCSA之重鏈的編碼區,從N-至C-端,包括一訊息胜肽(底線)(序列辨識號:11)、倉鼠-抗小鼠CD3抗體(145-2C11)(boldface)之重鏈變異區(序列辨識號:12)、CH1區域與人類IgG1樞紐區(斜體)(序列辨識號:16),接著一(GPP)10類膠原蛋白區域(雙底線)(序列辨識號:31)。藉由部份重疊PCR來製備此合成序列(序列辨識號:2)。
序列辨識號:1
序列辨識號:2
下列為h145FabCSA之輕鏈的多胜肽序列(序列辨識號:3)與編碼出其的cDNA序列(序列辨識號:4)。h145FabCSA之輕鏈的編碼區,從N-至C-端,包括一訊息胜肽(底線)(序列辨識號:11)、倉鼠-抗小鼠CD3抗體(145-2C11)(粗體)之輕鏈變異區(序列辨識號:13),接著一人類IgG1之kappa輕固定區域(斜體)(序列辨識號:17)。藉由部份重疊PCR來製備此合成序列(序列辨識號:4)。
序列辨識號:3
序列辨識號:4
後來將h145FabCSA之重鏈與輕鏈插入子(insert)複製(clone)進源自pSecTag2/Hygro(Invitrogen)之雙重表現載體以於哺乳動物細胞中抗體表現。下列為hOKT3FabCSA(序列辨識號:5)之重鏈的多胜肽序列與編碼出其的cDNA序列(序列辨識號:6)。hOKT3FabCSA之重鏈的編碼區,從N-至C-端,包括一訊息胜肽(底線)(序列辨識號:11)、人源化鼠源單株抗體-CD3(Orthoclone OKT3)的重鏈變異區(粗體)(序列辨識號:14)、人類IgG1之CH1區域與樞紐區(斜體)(序列辨識號:16),接著一(GPP)10類膠原蛋白區域(雙底線)(序列辨識號:31)。藉由部份重疊PCR來製備此合成序列(序列辨識號:6)。
序列辨識號:5
序列辨識號:6
下列為hOKT3FabCSA(序列辨識號:5)之輕鏈的多胜肽序列(序列辨識號:7)與編碼出其的cDNA序列(序列辨識號:8)。hOKT3FabCSA之輕鏈的編碼區,從N-至C-端,包括一訊息胜肽(底線)(序列辨識號:11)、人源化鼠源單株抗體-CD3(Orthoclone OKT3)的輕鏈變異區(粗體)(序列辨識號:15),接著人類IgG1之kappa輕鏈固定區域(斜體)(序列辨識號:17)。藉由部份重疊PCR來製備此合成序列(序列辨識號:8)。
序列辨識號:7
序列辨識號:8
後來將上述hOKT3FabCSA之重鏈與輕鏈插入子複製進源自pSecTag2/Hygro(Invitrogen)之一雙重表現載體以於哺乳動物細胞中抗體表現。下列為763單鏈抗體的多胜肽序列(序列辨識號:9)與編碼出其的cDNA序列(序列辨識號:10)。使用源自對應於抗-EGFR單株抗體,帕尼單抗(panitumumab)(VECTIBIX®,Amgen,Inc.)之引子組(primer set),根據所公開之核苷酸序列(US patent number 6,235,883),將編碼出763scFv之VL與VH的cDNAs進行PCR擴增。藉由以一底線顯示於序列辨識號:9中的甘胺酸-連結子(GGGGS)3(序列辨識號:24)連結VL與VH鏈來產生763之scFv PCR融合體。
如下產生一抗-CD3×EGFR雙專一抗體,hOKT3FabCSA763scFv。將用於編碼763scFv之cDNA序列框內(in-frame)複製至hOKT3FabCSA之重鏈的C-端於AgeI與BamHI位以製造包括hOKT3Fab之重鏈、人類IgG1之樞紐區、一(GPP)10類膠原蛋白區域(序列辨識號:31)接著763scFv的重鏈構築體。之後將上述重構築體與hOKT3FabCSA之輕鏈構築體(序列辨識號:8)複製進一源自pSecTag2/Hygro(Invitrogen)之雙重表現載體以動物細胞中抗體表現。
序列辨識號:9
序列辨識號:10
對於低-Fcγ受器結合抗-人類CD3抗體-hOKT3IgG-AA之構築而言,具有相似於teplizumab(也稱為MGA031與hOKT3-γ1(Ala-Ala))之一結構特徵,將hOKT3之狀鏈與輕鏈的變異區複製進一源自pSecTag2/Hygro(Invitrogen)之人類IgG1表現載體,於其中在重鏈固定區之胺基酸234與235的野生型白胺酸(leucine)殘基被以兩個丙胺酸殘基取代。對於低-Fcγ受器結合抗-小鼠CD3抗體-145IgG-AA的構築而言,將倉鼠抗-小鼠CD3抗體(145-2C11)之重鏈與輕鏈的變異區複製進入一小鼠IgG2a表現載體(Invitrogen),於其中在重鏈固定區之胺基酸234與235的野生型白胺酸殘基被以兩個丙胺酸殘基取代。為了抗人類EGFR抗體-763IgG的建構,其具有相似於帕
尼單抗(panitumumab)(VECTIBIX®)的結構特徵,帕尼單抗的重鏈與輕鏈可變區被選殖進入源自pSecTag2/Hygro(Invitrogen)之一人類IgG2a表現載體
實施例2
h145FabCSA、145IgG-AA、hOKT3FabCSA,hOKT3IgG-AA、763 IgG與hOKT3FabCSA763scFv的表現與純化
使用Effectene(Qiagen),根據製造商之指南,將h145FabCSA、145IgG-AA與hOKT3IgG-AA的表現構築體用來轉染小鼠融合瘤NS0細胞(European Collection of Animal Cell Cultures,Wiltshire,UK)。在以潮霉素B(hygromycin B)(400μg/ml)篩選後,將穩定之複製體以5×105細胞/ml之起始接種密度培養於一搖晃之長頸瓶中的化學定義培養基(chemically-defined medium)HyQCDM4NS0(Hyclone)中。將培養物(culture)維持於130rpm達五天於37℃。藉由電穿孔(electroporation)使用Amax Nucleofector device(Amaxa,Inc.,Gaithersburg,Md.),根據製造商指南,分別使用hOKT3FabCSA、hOKT3FabCSA763scFv與763 IgG的表現構築體來轉染CHO-S細胞(Life Technologies Corporation)。在以潮霉素B(400μg/ml)篩選後,將穩定之複製體以3×105細胞/ml之起始接種密度培養於一搖晃之長頸瓶中的化學定義培養基(chemically-defined medium)CD OptiCHOTM(Life Technology)中。將培養物維持於130rpm達12天於37℃。藉由添加一30mg/ml之葡萄糖溶液,將葡萄糖控制於2mg/L。
對於h145FabCSA、hOKT3FabCSA與hOKT3FabCSA763scFv的純化而言,將約1L各個之經過濾培養基以60ml/小時的一流速提供至以磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffered saline,PBS),pH 7.4(0.01M磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffer)、0.0027M KCl、0.14M NaCl)平衡之一KappaSelect管柱(5-ml於柱床體積(bed volume)中,GE Healthcare)。在以相同緩衝溶液清洗之後,將重組抗體以50mM之磷酸鈉(sodium phosphate)緩衝溶液,pH 2.5洗提。於280nm監測UV吸收並收集波峰分劃(peak fraction),以1.0M之碳酸氫鈉(sodium bicarbonate)將其中和至pH 7.5。之後藉由使用具有Ultracel-30膜(EMD Millipore Corporation,Billerica,MA)之Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit的超過濾(ultrafiltration)來將經中和之樣本濃縮。將五毫升之濃縮物提供至以磷酸緩衝溶液(PBS),pH 7.4平衡之一HiLoad 16/600 Superdex 200管柱(GE Healthcare),以1.5ml/分鐘之一線性流速(linear flow rate)。
對於145IgG-AA、hOKT3IgG-AA與763 IgG的純化,將約1L各個之經過濾培養基提供至以磷酸鹽緩衝溶液(PBS),pH 7.4(0.01M磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffer)、0.0027M KCl、0.14M NaCl)平衡之一HiTrap Protein A HP管柱(5-ml於柱床體積(bed volume)中,GE Healthcare)。在以相同緩衝溶液清洗之後,將重組抗體以50mM之磷酸鈉緩衝溶液,pH 2.5來洗提。於280nm監測UV吸收並收集波峰分劃,以1.0M之碳酸氫鈉將其中和至pH 7.5。將經中和之樣本對著磷酸
緩衝溶液(PBS),pH 7.4進行透析。
使用一4~12% NuPAGE bis-Tris聚丙烯醯胺凝膠(polyacrylamide gel)之任一以MES為電泳緩衝溶液(running buffer)(Invitrogen,San Diego,CA)來執行SDS-PAGE。以InstantBlue(Expedeon,Cambridgeshire,UK)來將蛋白質進行染色。使用Bench Mark(Invitrogen,San Diego,CA)為分子大小標準品(molecular size standards)。
結果:h145FabCSA之層析(chromatography)與結構特性
第2圖顯示,根據實施例,藉由使用KappaSelect與Superdex 200管柱之順序層析(sequential chromatographies),自培養基純化之h145FabCSA分子的結構特性。(A)藉由凝膠過濾(gel filtration)之h145FabCSA種類(species)的分離。將洗提自一KappaSelect管柱的樣本濃縮且載至以PBS(pH 7.4)平衡之一Superdex 200凝膠過濾管柱;(B)藉由SDS-PAGE,將不同波峰分劃(peak fraction)(於A中編號為波峰1至3)與所載入之樣本在非還原(泳道(lane)2、4、6與8)與其中將樣本於75℃以50mM之DTT處理10分鐘之還原狀態(泳道3、5、7與9)下進行分析。(C)對應於以顯示於B中之SDS-PAGE所解析之種類之結構的概要圖式。
結果顯示本發明之類膠原蛋白胜肽具有將一抗-小鼠CD3 Fd片段三聚體化之能力,且一完整之Fab片段可被裝配於一真核細胞中且被分泌為一穩定的三聚體。
結果:hOKT3FabCSA的層析與結構特性
第3圖顯示,根據實施例藉由Superdex 200層析分離之hOKT3FabCSA分子的結構特性。將洗提自KappaSelect管柱的樣本濃縮且載至以PBS(pH 7.4)平衡之一Superdex 200凝膠過濾管柱。右上區塊(panel):藉由SDS-PAGE在非還原狀態下分析不同波峰分劃(編號波峰1至3)。波峰2為主要片段,其包含hOKT3FabCSA三聚體,而波峰3片段包含單體。顯示於波峰1中之主要下方條帶似乎為三聚體之一鏈間(interchain)雙硫鍵。
再次,結果顯示本發明之類膠原蛋白胜肽具有將一抗-小鼠CD3 Fd片段三聚體化之能力,且一完整之Fab片段可被裝配於一真核細胞中且被分泌為一穩定的三聚體。
結果:藉由SDS-PAGE之hOKT3FabCSA三聚體、hOKT3IgG-AA與OKT3的純度分析。
第4圖顯示源自於第3圖中之波峰2片段的hOKT3FabCSA、低-Fcγ受器結合抗-人類CD3抗體-hOKT3IgG-AA與OKT3抗體的純度分析,藉由SDS-PAGE於非還原(泳道(lane)2、3與4)與其中將樣本於75℃以50mM之DTT處理10分鐘之還原狀態(泳道5、6與7)下的分離。將具有等量蛋白質之所有樣本以一4~12% SDS/Bis-Tris聚丙烯醯胺凝膠進行電泳,伴隨MES為電泳緩衝溶液。將膠體以InstantBlue蛋白質染色溶液進行染色。M,BenchMarkTM分子量標準品。
在非還原狀態下,hOKT3FabCSA的主要條帶呈現為雙硫連結Fab三聚體(泳道2),而在變性狀態下將非雙硫連結之Fd-CS與輕鏈進行解析(泳道5)。hOKT3IgG-AA與OKT3
抗體為在一般IgG1形式,其包含兩個重鏈與兩個輕鏈(泳道3與4,在非還原狀態下,及泳道6與7,在非還原狀態下)。
實施例3
CD3結合活性的測定
藉由用於負向選擇(negative selection)之一泛T細胞分離套組(pan T cell isolation kit)(Miltenyi Biotec,CA),根據製造商指南,將人類T細胞(1×106/ml)自PBMC分離。將細胞以Fc blocker(2μg/ml,eBioscience,CA)於4℃處理30分鐘且之後以一連續稀釋之經純化之低-Fcγ受器結合抗-人類CD3抗體-hOKT3IgG-AA、hOKT3FabCSA三聚體與單體培養於4℃培養30分鐘。在清洗後,將細胞以山羊抗-人類IgG(H+L)-Alexa Fluor 647(Invitrogen)於4℃染色30分鐘,且藉由流式細胞分析(flow cytometry)來偵測抗體對T細胞之結合並將其呈現為平均螢光強度(mean fluorescence intensity,MFI)。如於第5圖中所示,相較於二價對應物(counterpart),hOKT3IgG-AA(具有經計算之K D =0.15nM),三聚體之hOKT3FabCSA(具有經計算之K D =0.02nM)顯示一7.5倍之對於人類T淋巴球較大之結合強度。單價形式之hOKT3FabCSA對於CD3+人類T細胞顯示一弱的、非顯著的結合親和力。
也執行此實驗以測定相較於倉鼠145-2C11 IgG,經純化之h145FabCSA(三聚體)對小鼠脾臟T淋巴球之結合親和力(第6圖)。再次,相較於二價對應物(counterpart)親代之倉鼠IgG,145-2C11(具有一經計算之K D =15nM),三聚體之hOKT3FabCSA(具有一經計算之K D =4nM)顯示一3.75倍之
對於小鼠T淋巴球較大之結合親和力。
實施例4
競爭置換結合分析(competitive displacement binding assay)
由於OKT3與hOKT3FabCSA辨認於CD3 ε鏈上之相同抗原決定位,所以hOKT3FabCSA可競爭地抑制OKT3對T細胞的結合。藉由流式細胞分析,使用以一飽和濃度之螢光-結合OKT3為一競爭物的抗體置換分析,可比較hOKT3FabCSA與OKT3對於與人類T-細胞之細胞表面上之CD3分子結合之親和力。於4℃執行所有下列步驟。將CD3(+)Jurkat T細胞,Clone E6-1(ATCC number TIB-152)以1 x 106細胞之一總數懸浮於0.1ml之染色緩衝溶液(2%胎牛血清與與0.1%疊氮化鈉(sodium azide)之磷酸緩衝溶液)。將細胞以一連續稀釋之hOKT3FabCSA或OKT3 IgG培養1小時。直接添加一固定、飽和之量(0.25μg/ml,藉由流式細胞分析測定)的FITC-結合OKT3(eBioscience,San Diego,CA)。在培養1小時後,將細胞以染色緩衝溶液清洗,並藉由使用FACSCalibur(Becton Dickinson,San Jose,CA,USA)系統之流式細胞分析來將其對於免疫螢光進行分析。資料被表現為最大螢光強度之百分比抑制,其被定義為,在阻礙mAb不存在下,藉由將T細胞以OKT3-FITC染色所獲得的平均螢光強度。計算各mAb所需抑制一半最大螢光強度的濃度(IC50)。
IC50值之比較指出使用Jurkat T細胞,OKT3需要比hOKT3FabCSA之IC50值約2-倍高的濃度來達成相同之抑制功
效(第7圖,兩個獨立之實驗顯示)。結果指出,由於親合作用,人源化三價hOKT3FabCSA具有高於其親代鼠源IgG形式,OKT3的結合強度。
實施例5
T細胞增生
藉由細胞增生分析來執行比較OKT3、hOKT3IgG-AA與hOKT3FabCSA在T細胞活化方面的研究。將從三位健康正常提供者收集之人類周邊單核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)以2 x 105細胞/孔於100μl具有10% FBS之RPMI-1640培養基中置於一黑色96-孔平底組織培養盤中於37℃,在10-倍連續稀釋之OKT3(eBioscience,Inc.)、hOKT3IgG-AA與hOKT3FabCSA存在下達66小時。將細胞以10μM之BrdU脈衝額外之6小時。在移除培養基之後,以FixDenat(Roche Applied Science,Indianapolis IN)將細胞固定且將DNA變性於一步驟中。之後將細胞以一過氧化物標記之抗-BrdU抗體(抗-BrdU POD,Fab片段)於室溫培養1.5小時。使用一微孔盤冷光儀(microplate-luminometer)(Hidex,CHAMELEON detection platform,Finland)來執行化學冷光(chemiluminescence)偵測與定量。顯示於第8圖中之各點代表三個提供者之平均值±標準差。
於第8圖中之結果顯示,即便是在非常低的濃度,顯著地OKT3誘導T細胞增生。低Fcγ受器結合之hOKT3IgG-AA在較高之抗體 濃度也誘導T細胞增生,即使誘導為較少之效力。這些結果與由Li、Li等人較早發表之成果(Li,J.,J.Davis,et
al.(2006). "Modulation of antigen-specific T cell response by a non-mitogenic anti-CD3 antibody." Int Immunopharmacol 6(6):880-891.)一致。相對地,沒有可偵測之T細胞增生被hOKT3FabCSA所誘導。因此,非Fc版本之hOKT3FabCSA三聚體為在不同之抗CD3抗體形式之中之T細胞增殖的最少之誘導者。
實施例6
細胞激素測量
將來自三位健康正常之提供者的人類PBMCs於37℃以2×105細胞/孔置於具有10% FBS之0.1ml RPMI-1640培養基中,在10-倍連續稀釋之OKT3、hOKT3IgG-AA與hOKT3FabCSA存在下。使用一人類細胞激素免疫分析套組(human cytokine immunoassay kit)(eBioscience,Inc.),於24-與72-小時之時間點分別測定培養上清液中之IL-2與其餘之細胞激素(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10與IFN-γ)的程度。
鼠源OKT3之有絲分裂活性(mitogenic activity)為由經由對於Fcγ受器-陽性細胞之結合之大量T細胞受體(TCR)-CD3交叉連結所引起。因此,藉由改變對Fcγ受器的結合,最近已對發展非有絲分裂形式之抗-CD3做出努力。測量OKT3、hOKT3IgG-AA與三聚體hOKT3FabCSA誘導細胞激素(IL-1β、IL-2、IL-6、IL-10與IFN-γ)的能力。如所預期,OKT3 IgG於一非常低的劑量引人注目地誘導細胞激素產生。低-Fcγ受器結合抗-人類CD3抗體-hOKT3IgG-AA,具有與teplizumab(也稱為MGA031與hOKT3-γ1(Ala-Ala))相似特徵,也在一較
高抗體濃度誘導細胞激素產生,即使較低的效力。這些結果與由Li較早發表之成果(Li,Davis et al.2006)一致。相對地,三聚體hOKT3FabCSA於一上至100μg/ml的濃度並沒有誘導可偵測之IL-2與IFN-γ。相較於hOKT3IgG-AA,在一高於10μg/ml的濃度,hOKT3FabCSA具有一IL-1β、IL-6與IL-10的較低誘導程度。結果顯示,hOKT3FabCSA在不同之抗-CD3抗體形式之中為最不有絲分裂的版本(第9圖)。
實施例7
混合之淋巴球(Mixed lymphocyte reaction,MLR)
如下評估於單向(one-way)混合之淋巴球反應中之免疫抑制。自兩個健康提供者獲得之人類PBMCs(刺激者(stimulator)與應答者(responder))。將刺激者與應答者細胞以在一完全培養基(補充10%人類AB血清、2mM麩醯胺酸glutamine、50nM 2-硫氫乙醇(2-mercaptoethanol)與各個盤尼西林與鏈黴素penicillin and streptomycin 100單位/ml之RPMI 1640)中之25μg/ml之絲裂霉素C(mitomycin C)(Sigma-Aldrich)於含5% CO2之潮濕空氣在37℃處理30分鐘,接著於RPMI 1640培養基中清洗三次。將反應者細胞單獨或以1:1比例混合以絲裂霉素C處理之刺激者或應答者細胞以2×105細胞/孔於200μl之完全培養基中培養。在反應者細胞貼附(planting)後,立即將經純化之hOKT3FabCSA三聚體、hOKT3IgG-AA或OKT3以不同之濃度添加至培養物。5天後,將經培養之細胞以10μM之BrdU脈衝並於24小時後收穫。執行5-溴-2'-脫氧尿苷(5-bromo-2'-deoxyuridine,BrdU)細胞增生分析。在移除培養基
之後,以FixDenat於一步驟中將細胞固定與DNA變性。之後,將細胞以過氧化物標記之抗-BrdU抗體(抗-BrdU POD,Fab片段)於室溫培養1.5小時。使用一微孔盤冷光儀(Hidex,CHAMELEON detection platform,Finland)來執行化學冷光偵測與定量。
為了測定,依據增加之對於CD3(+)T-細胞的結合親和力,三聚體之hOKT3FabCSA是否可展現優於親代(parental)OKT3抗體與低-Fcγ受器結合抗-人類CD3抗體-hOKT3IgG-AA的免疫抑制活性,針對T-細胞有絲活化,將抗體測試於一單向混合之淋巴球反應中(mixed lymphocyte reaction,MLR)。在無抗體處理培養5天之混合之PBMC培養物(絲裂霉素C處理之刺激者+應答者)中,一混合之淋巴球反應(MLR)發展,由於異體刺激(allogeneic stimulation)之T細胞活化(第10圖,實心方形)。以OKT3處理混合之PBMC培養物導致於低濃度程度,從0.1至1.0ng/ml之範圍,刺激T細胞增生(第10圖,實心圓形)。
當抗體濃度高於10ng/ml時,OKT3的免疫抑制是顯著的。低-Fcγ受器結合之抗人類CD3抗體-hOKT3IgG-AA不顯示顯著之T細胞活化的抑制(第10圖,空心方形)。相對的,於MLR中,hOKT3FabCSA三聚體之效力是顯著的,在0.1ng/ml之濃度達到背景程度(background level)(第10圖,空心三角形)。這些結果指出,當in vitro顯示減少之有絲分裂(mitogenicity)時,三聚體之hOKT3FabCSA為T細胞增生之一強有力之免疫抑制劑(immunosuppressant)。
實施例8
T細胞受體(TCR)調節
將來自一健康提供者之PBMC以2 x 106細胞/孔貼附(plated)於一24-孔盤(Nunc)中且培養於RPMI 1640加上10% FCS中伴隨不同量之hOKT3FabCSA(三聚體)、hOKT3IgG-AA(二聚體)與hOKT3FabCSA(單體)。在24小時的培養後,收取細胞並將其以FITC-結合OKT3或抗-TCRα/β mAb IP26(eBioscience)染色。將經染色之細胞以對於T細胞之藻紅蛋白(phycoerythrin)-結合抗-CD5 mAb UCHT2(eBioscience)複染(counterstain)並以流式細胞分析來分析。如先前所述(Cole,M.S.,C.Anasetti,et al.(1997). "Human IgG2 variants of chimeric anti-CD3 are non-mitogenic to T cells." J Immunol 159(7):3613-3621.)來執行CD3調節與覆蓋的計算:
其中F代表經染色細胞的平均螢光。
在第11圖中,在從0.1ng/ml至10μg/ml之範圍的抗體濃度,藉由三價hOKT3FabCSA達成之TCR-CD3複合物之結合的調節與覆蓋大於低-Fcγ受器結合抗-人類CD3抗體-hOKT3IgG-AA。由於對於TCR之低-交叉連結的活性,單價hOKT3FabCSA在各對應濃度顯示低很多的TCR覆蓋與調節。此結果顯示在三聚體hOKT3FabCSA之結合強度中的改善導致一
經增強的TCR調節程度。
實施例9
藥物代謝動力學分析(pharmacokinetic assays)
為了評估h145FabCSA血液清除(blood clearance),將15隻雄性BALB/c小鼠(隨機分成五組)靜脈投與經純化之h145FabCSA三聚體,以25μg/小鼠之一單一劑量程度,隨著0.1ml/小鼠的一劑量體積。在下列時間點:0、2、5、15、30分鐘,與1、2、4、6、8、24、48、72與96小時,連續地從小鼠收集血液(100μl/小鼠),且將其轉移至一EDTA-覆蓋試管。使用ELISA,藉由於連續稀釋之h145FabCSA標準品的一標準曲線中的插值(interpolation),將在來自各時間點之血漿樣本(plasma sample)中剩餘的h145FabCSA進行定量。分別將抗-人類Fd與山葵過氧化酶(peroxidase)-結合抗-人類kappa輕鏈使用為捕捉與偵測抗體。將3,3’,5,5’,-四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine)使用為過氧化酶受質。於小鼠中之h145FabCSA的藥物代謝動力學圖譜(profile)顯示於第12圖中。
測定非分室體模式(non-compartment model)的動力學。免疫反應性(immunoreactivity)之血漿程度雙向性地(biphasically)下降,隨著8.85小時之末端排除相半衰期(terminal elimination phase half-life)(t1/2)。
實施例10
生物分佈(biodistribution)
將經純化之h145FabCSA三聚體以碘-131放射性標記且於評估於30隻雄性BALB/c小鼠中之131I-h145FabCSA三聚
體的生物分佈。將五組之小鼠靜脈投予h145FabCSA(專一活性:1.2μCi/μg;30μCi/小鼠)。h145FabCSA之分析的時間點為0.5、1、2、6、24與48小時。在所選擇之時間點,安樂死(euthanized)並測定每克組織之注射劑量的百分比(% ID/g)。在48小時,131I-h145FabCSA展現一快速之具有大部分清潔的血液清除(表1)。然而,131I-h145FabCSA於脾臟中顯示當地化(localization),對應在0.5小時為33.76±1.56%ID/g,且於24小時達到最大值之42.09±1.64% ID/g。
註:器官攝入被表現為每克百分比注射劑量(percent injected dose per gram)(%IDg)。標準差以插入被呈現。
實施例11
實驗性自體免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis)小鼠疾病模型
實驗性自體免疫性腦脊髓炎(experimental
autoimmune encephalomyelitis,EAE)為一廣泛使用之多發性硬化症(multiple sclerosis)的小鼠模型。在此研究中,使用髓鞘磷脂寡樹突醣蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein,MOG)-誘導鼠源EAE來研究h145FabCSA對癱瘓(paralysis)之調節的治療功效。將雌性6-至8-週大之C57BL/6小鼠(國家實驗動物中心,臺灣)以在使用含500μg結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)H37RA之弗氏完全佐劑(complete Freund’s adjuvant)之200μL乳劑(emulsion)中的200μg MOG(35-55)進行皮下免疫。在免疫後當下,小鼠腹腔接受500ng百日咳毒素(pertussis toxin)且於48小時後再次接受。使用下列尺度來評估臨床EAE分數:0=無症狀、0.5=末稍部衰弱或尾部抽筋、1=完全跛行的尾部、1.5=跛行的尾部與後部(hindlimb)衰弱(足部失足穿過籠架)、2.0=單邊局部之後部癱瘓、2.5=雙邊局部之後部癱瘓、3.0=完全雙邊之後部癱瘓、3.5=完全後部與單邊部分前肢癱瘓、4.0=垂死的以及5=死亡。四組(載劑(vehicle):倉鼠IgG同型(isotype)控制組;處理:145-2C11 IgG與h145FabCSA(三聚體);以及正控制組:干擾素-β1a)之每個分配到十隻小鼠總計40隻小鼠。處理被起始於EAE之第一個臨床症狀的開始以測試不同之物件對於癱瘓之調節的影響。對於載劑、145-2C11 IgG與h145FabCSA組而言,將小鼠分別以1.0、0.1與1.0μg/小鼠的一劑量程度進行每天一次靜脈內注射,達五個連續不斷的天數。對於干擾素-β1a組而言,將小鼠以10,000單位/小鼠的一劑量程度,在整個處理期間進行每天一次腹腔內注射。
最初,以超過0.2μg/小鼠的劑量程度之145-2C-11 IgG處理的EAE小鼠,在處理一天後導致50%致命。粗略之屍體檢驗觀察顯示所有死亡之小鼠具有擴大之脾臟,暗示一主要全身性不受控制的發炎反應(systemic uncontrolled inflammatory response)或細胞激素風暴(cytokine storm)。因此將145-2C-11組之實驗劑量程度降低至每隻小鼠0.1μg。對於三聚體之h145FabCSA組而言,在處理方面,實施一劑量程度1.0μg/小鼠。結果顯示,在免疫之所有階段,三聚體h145FabCSA產生一較低程度的癱瘓(參見第13A圖)。特別是,以h145FabCSA處理之小鼠,相較於以145-2C11 IgG處理之小鼠或控制處理組顯示較少的癱瘓,伴隨介於h145FabCSA處理組與145-2C11 IgG處理組之間的統計上較低的癱瘓。最後,由h145FabCSA處理組所顯示之最大程度的癱瘓,不如單邊後部癱瘓(即,臨床尺度2)來得嚴重,而未處理組顯示之症狀則如同完全雙邊後部癱瘓嚴重。
調控之T(Treg)細胞的誘導為對於自體免疫疾病之免疫治療的主要目標之一。關於口服投予CD3-專一抗體的先前研究顯示CD4+CD25-LAP+Treg細胞被誘導(Ochi et.al(2006)“Oral CD3-specific antibody suppresses autoimmune encephalomyelitis by inducing CD4+CD25-LAP+T cells.”Nat Med 12(6):627-635)。在h145-2C-11 IgG與三聚體h145FabCSA處理之後,執行在EAE小鼠中之Treg族群的比較。在最後一次靜脈內注射之後,分別製備來自載劑(倉鼠控制組IgG)、145-2C11 IgG與三聚體h145FabCSA組之各個的三隻小鼠的脾
臟淋巴細胞,且之後為了流式細胞分析將其以LAP-APC與CD4-FITC進行染色。Treg族群的測定為對於LAP+細胞進行限制。
結果指出,在h145FabCSA處理之後,相較於同型IgG control and the 145-2C-11組,CD4+LAP+T細胞族群增加(參見的13B圖)。值得注意的是,可代表CD8+LAP+T細胞之CD4-LAP+T細胞族群,也於h145FabCSA處理組中被增加。
實施例12
於小鼠模型中之全身性紅斑性狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)
研究抗-CD3抗體之145-2C11 IgG與h145FabCSA三聚體對於具有自發性發展為狼瘡之NZB/W F1小鼠的治療功效。在一12-週之週期期間,藉由靜脈內注射,以5μg之同型IgG控制組、145-2C11 IgG或h145FabCSA(三聚體)之六個5-天的過程,每隔週來對已發展自發性狼瘡之約6個月大雌性之NZB/W F1小鼠進行處理。如於第14A圖中所示,以h145FabCSA處理之小鼠存活地比以同型IgG控制組處理之小鼠來得長,其指出三聚體h145FabCSA相較於145-2C11與同型IgG控制組在治療SLE小鼠模型方面更有效。
實施例13
對於雙股DNA(double-stranded DNA,dsDNA)之小鼠血清抗體的測量
當狼瘡為活躍時,存在高量之血清抗-dsDNA抗體。因此,使用抗-dsDNA自身抗體測試來測量於SLE小鼠模型
中之疾病進程(disease progression)。對於抗-dsDNA自身抗體的偵測,測定來自上述處理組之小鼠血清的ELISA如下:將96孔聚苯乙烯(polystyrene)ELISA盤以50μl之來自牛血清之甲基化牛白蛋白(Sigma)(50μg/ml於蒸餾水中)塗覆並於37℃培養1小時。然後在添加50μl之於磷酸緩衝溶液(phosphate buffered saline)中的dsDNA(10μg/ml)之前,以磷酸緩衝溶液清洗個孔洞三次。藉由於37℃以1U/mg S1核酸(Sigma)處理小牛胸腺DNA(calf thymus DNA)(Sigma)30分鐘來製備dsDNA。在於4℃隔夜培養之後,將盤以PBS清洗四次。之後以100μl之於PBS中之2% BSA(Sigma)來處理這些以避免非專一結合,於37℃培養1小時,且然後以含0.05%之Tween-20(PBS-T)(Sigma)的PBS清洗五次。將血清樣本於PBS-T中稀釋800-倍且以二重複將50μl等分(aliquots)加至孔洞。在於37℃培養1小時之後,將盤以PBS-T清洗六次。為了偵測總IgG抗體,加入以5000-倍稀釋之50μl/孔的HRP-結合大鼠抗-小鼠抗體(BD Bioscieces)並於37℃培養一小時。在以PBS-T清洗七次之後,使用100μl/孔之以1mg/ml在檸檬酸磷酸鹽緩衝液(citrate phosphate buffer)中之四甲基苯(tetramethylbenzene)(Sigma-Aldrich)來發展反應,並將其藉由添加50μl/孔之1N HCl來終止。以一ELISA測讀儀於450nm來取得吸收值。
如於第14B圖中所示,於h145FabCSA處理小鼠中之抗-dsDNA自身抗體的程度顯著地低於控制同型IgG組的抗-dsDNA自身抗體的程度,且似乎也低於以145-2C11 IgG處理之動物的大部分。此結果指出,三聚體h145FabCSA在治療SLE小
鼠模型方面是有效的,且在處理時間進程期間沒有疾病的發展。
實施例14
In vivo前發炎細胞激素(pro-inflammatory cytokine)分析
抗小鼠CD3抗體,145-2C11的投予,先前已被與T細胞增殖與包括IL-2、IFNγ、TNFα、IL-1β、IL-6、IL-10與IL17A的一專一細胞激素誘導聯想在一起。執行對於在一單一劑量之50μg之不同的抗CD3抗體的靜脈內注射後之小鼠中之血清前發炎細胞激素程度的時間進程研究,以評估是否非Fc版本之h145FabCSA(三聚體)對於以非有絲分裂(non-mitogenicity)的治療價值是否有益。將小鼠分群且靜脈內投予50μg之經純化之145-2C11 IgG(淺灰方形)、低-Fcγ受器結合抗小鼠CD3抗體-145IgG-AA(深灰方形)或h145FabCSA三聚體(空心方形)。0(前採血)、0.5-、24-與144-小時時間點收集血液(100μl/小鼠)。各點代表三個孔洞之平均值±標準差。使用PBS(黑色方形)為控制組。
結果如第15圖中所示。如所預期,於145-2C11組中顯著地產生最多細胞激素。低-Fcγ受器結合版本之145IgG-AA導致中度短暫之IL-2、TNFα、IL-6與IL-10的誘導。非Fc版本之h145FabCSA(三聚體)的投予顯示微不足道之細胞激素誘導程度。這些結果顯示,在第一注射之後三聚體之h145FabCSA於in vivo不誘導細胞激素產生。
實施例15
一三價雙專一之抗CD3×EGFR抗體,hOKT3FabCSA763scFv的層析與結構特性
本發明多價抗體片段對於藉由具有一膠原蛋白支架於任一端的兩個不同之抗體片段的融合來製作雙專一抗體特別可行。發展以CD3與GFR兩者為目標之一三價雙專一抗-CD3×EGFR抗體,hOKT3FabCSA763scFv,以顯示此種方式的使用。第16圖顯示,源自一非單一(A)或一單一穩定複製(clone)(B)之hOKT3FabCSA763scFv分子的結構特性。藉由使用KappaSelect與Superdex 200管柱之順序層析來純化各培養基。(A)藉由凝膠過濾之源自一非單一複製之hOKT3FabCSA763scFv種類的分離。右上區塊:藉由SDS-PAGE,在非還原狀態下分析不同波峰分劃(編號波峰1至3)。雙硫連結二聚體(T)、非-雙硫-鍵結二聚體(Mt)與單體(Mm)的結構被顯示;(B)藉由凝膠過濾之源自一穩定複製之hOKT3FabCSA763scFv種類的分離。藉由SDS-PAGE,在非還原狀態下分析波峰分劃。雙硫連結二聚體(T)與非-雙硫-鍵結二聚體(Mt)的結構被顯示。
結果顯示於真核細胞系統中,本發明之類膠原蛋白胜肽具有同時將一N端Fd片段與一C端scFv片段三聚體化之能力。此外,輕鏈可與經三聚體化之多胜肽鏈之Fd部份組裝已形成具有如於第1B圖中所示之一結構形式的一完整之Fab三聚體。
實施例16
三聚體雙專一抗體-hOKT3FabCSA763scFv對於
EGFR(+)與CD3(+)細胞的結合專一性
藉由流式細胞分析來確認hOKT3FabCSA763scFv對各抗原的結合。對應A431、WiDr與HCT116細胞(EGFR陽性)與Jurkat T細胞(CD3陽性;第17圖)觀察到強的反應性。
實施例17
細胞毒性分析
使用一螢光-基礎Eu TDA非放射性細胞毒性分析(Perkin Elmer,Boston,MA)來比較三聚體hOKT3FabCSA763scFv對於使用經刺激之人類PBMCs為效應者之不同的EGFR-攜帶腫瘤細胞株的細胞活性。藉由於一OKT3-塗覆(2μg/ml)盤中,在含50單位/ml(或0.2ng/ml)之IL-2之RPMI+10%FBS中生長細胞,來刺激自一健康提供者之人類PBMCs 72小時。根據製造商指南,以DELFIA BATDA Reagent來標記約1×106之目標細胞。將細胞以PBS清洗三次,且之後以5×104細胞/ml之濃度重新懸浮Eu3+-標記目標細胞於完全培養基(complete culture medium,CM)中。等分100μl(5×104細胞)之目標細胞置於96-孔V-底無菌微效價盤之孔洞中。添加一等體積之效應PBMCs至各孔洞以分別提供對於A431細胞之從50:1至2.5:1與對於WiDr與HCT116細胞一固定之10:1的效應/目標比(effector/target(E/T)ratio)。於一5% CO2之潮濕狀態中於37℃培養微量盤2小時。執行所有分析於三重複中。在培養後,將培養盤再次離心,且收取上清液以測量釋放之Eu3+。為了偵測釋放之Eu3+,將20-μl等分之上清液轉移至一平底96-孔微培養,且將一200-μl等分之增強溶液(enhancement solurion)
添加至各孔洞。
在室溫於旋轉震盪器(rotatory shaker)上混合15分鐘之後,於一時差性螢光儀(time-resolved fluorometer)(Hidex,CHAMELEON detection platform,Finland)中測量螢光。特定細胞毒性之百分比被計算為(實驗性釋放-自發性釋放)/(最大釋放-自發性釋放)×100。藉由以100μl之CM取代效應細胞(effector cells)來培養目標細胞以測定自發性釋放,而藉由以100μl之裂解緩衝溶液(lysis buffer)(0.5% Triton-X100)來培養目標細胞以測定最大釋放。
藉由人類PBMCs來評估T三聚體雙專一hOKT3FabCSA763scFv引導包括A43、WiDr與HCT116細胞株之不同EGFR-表現腫瘤細胞之裂解的能力。第18圖顯示,對於A431細胞以不同之E/T比(A);與對於WiDr或HCT116細胞以一固定10:1的E/T比(B)之不同濃度之三聚體hOKT3FabCSA763scFv的專一細胞毒殺性。藉由於一劑量中之三聚體雙專一hOKT3FabCSA763scFv與E/T比-依賴方式,在經刺激之人類PMBCs存在下,特別引起EGFR-過度表現之A431腫瘤細胞的裂解(第18A圖)。此導致伴隨一20:1之E/T比,在0.05μg/ml之hOKT3FabCSA763scFv濃度程度下,一最大之~80%的特定殺死(實心方形)。在hOKT3FabCSA763scFv不存在下,經刺激之人類PMBCs無法單獨有效殺死A431細胞。藉由將WiDr或HCT116細胞株之任一以三聚體hOKT3FabCSA763scFv於一固定之10:1的E/T比來進行培養而獲得相似的結果(第18B圖)。這些結果顯示,三聚體hOKT3FabCSA763scFv可有效引導
藉由人類PBMCs(想必細胞毒殺性T細胞(presumably cytotoxic T cells))之EGFR-攜帶之腫瘤的裂解。
實施例18
縮時顯微鏡(Time lapse microscopy)
在第19圖中之縮時顯微鏡攝影更證實,藉由三聚體hOKT3FabCSA763scFv之用於腫瘤細胞裂解之人類細胞毒殺性T淋巴球的改向。三價hOKT3FabCSA763scFv可瞬間連結一T細胞與一腫瘤細胞藉由同時分別結合CD3與一目標抗原-EGFR。此引發T-細胞活化,接著攻擊交叉連結之腫瘤細胞。附著之腫瘤細胞遭受程式細胞死亡(programmed cell death)(細胞凋亡(apoptosis))。自由之可獲得的T-細胞藉由與另一hOKT3FabCSA763scFv交叉連結可改向至另一腫瘤細胞且從事殺死事件。在hOKT3FabCSA763scFv不存在下,人類T淋巴球不影響腫瘤細胞A431生長。在第19B圖中,在三聚體hOKT3FabCSA763scFv存在下,人類T淋巴球與A431細胞交叉連結。T淋巴球被活化且開始攻擊腫瘤細胞。在13小時之培養時間中,大多數之細胞經由細胞凋亡途徑被裂解。在hOKT3FabCSA763scFv不存在下,即使在24小時之共培養時間之後,也沒有觀察到介於A431細胞與T淋巴球之間的交叉連結(第19A圖)。
實施例19
腫瘤異種移植(xenograft)小鼠模型
對於評估抗腫瘤活性的in vivo研究被執行於8-至10-週大、雌性之NOD/SCID小鼠(NOD.CB17-Prkdc scid /JNarl,
國家實驗動物中心,臺灣)。於第0天,來自一健康提供者之未經刺激的人類PBMCs(效應)(effector)與預先與HTC116腫瘤細胞(目標)(target)混合,接著皮下注射細胞混合物至NOD/SCID小鼠。使用1:1之低的細胞之(效應-比-目標)比(effector-to-target)。經由尾靜脈注射(tail vein injection)於第1天開始每天投予指定之劑量的hOKT3FabCSA763scFv或PBS載劑控制組,達10個連續之天數。藉由外部卡尺測量(external caliper measurement)每週兩次測定腫瘤之發展,且使用標準半橢面公式(standard hemiellipsoid formula):(長度×寬度2)/2來計算腫瘤體積。
結果如於第20圖中所示。第20圖顯示,於HCT116結腸癌NOD/SCID小鼠模型中三聚體hOKT3FabCSA763scFv之抗腫瘤功效。將兩組之NOD/SCID小鼠在人類PBMC(抗-EGFR 763 IgG與PBS控制組)不存在下,以皮下接種5×106 HCT116細胞。將剩餘之三組以5×106 HCT116細胞與5×106來自一健康提供者之未經刺激的人類PBMCs的混合物進行皮下注射。在於第0天之HCT116細胞接種之後,經由尾部靜脈注射於第1天投予PBS載劑控制組(100μl)、50μg與15μg之三聚體hOKT3FabCSA763scFv達10個連續不斷之天數。具有指出數目之來自各組的腫瘤生長曲線被顯示。
介於給予三聚體hOKT3FabCSA763scFv組與未經刺激之人類PBMC控制組之間的統計上顯著差異(P<0.001)被顯示出。此結果指出雙專一抗-CD3×EGFR抗體之hOKT3FabCSA763scFv在人類可PBMC存在下可有效減少腫瘤
生長。
對於本技術領域中具有通常知識者而言,可對揭露之實施例做出各種修飾與變化是明顯的。說明書與實施例僅被視為示範之意圖,對應著此揭露之真實範圍是被下列申請專利範圍與其等同物所指出。
<110> 財團法人工業技術研究院
<120> 多價抗體片段與其三聚複合物
<130> 2668-0128PUS1
<160> 31
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之h145FabCSA的重鏈
<400> 1
<210> 2
<211> 894
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼出h145FabCSA之重鏈的合成之cDNA序列
<400> 2
<210> 3
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之h145FabCSA的輕鏈
<400> 3
<210> 4
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼出h145FabCSA之輕鏈的合成之cDNA序列
<400> 4
<210> 5
<211> 299
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之hOKT3FabCSA的重鏈
<400> 5
<210> 6
<211> 900
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼出hOKT3FabCSA之重鏈的合成之cDNA序列
<400> 6
<210> 7
<211> 234
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之hOKT3FabCSA的輕鏈
<400> 7
<210> 8
<211> 705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 編碼出hOKT3FabCSA之輕鏈的合成之cDNA序列
<400> 8
<210> 9
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之763單鏈Fv的多胜肽序列
<400> 9
<210> 10
<211> 723
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之編碼出763單鏈Fv之多胜肽序列的cDNA序列
<400> 10
<210> 11
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之訊息序列
<400> 11
<210> 12
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之來自倉鼠抗-小鼠CD3抗體(145-2C11)之重鏈變異區
<400> 12
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之來自倉鼠抗-小鼠CD3抗體之輕鏈變異區
<400> 13
<210> 14
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之人源化之muromonab-CD3(Orthoclone OKT3)重鏈變異區
<400> 14
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之人源化muromonab-CD3(Orthoclone OKT3)輕鏈變異區
<400> 15
<210> 16
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之人類IgG1之CH1區與一樞紐區
<400> 16
<210> 17
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之IgG1之kappa輕鏈固定區
<400> 17
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人類
<220>
<221> misc_feature
<223> 一人類IgG之樞紐區
<400> 18
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 人類
<220>
<221> misc_feature
<223> 一人類IgG之樞紐區
<400> 19
<210> 20
<211> 23
<212> PRT
<213> 人類
<220>
<221> misc_feature
<223> 人類IgG1之樞紐區
<400> 20
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> 人類
<220>
<221> misc_feature
<223> 人類IgG2之樞紐區
<400> 21
<210> 22
<211> 25
<212> PRT
<213> 人類
<220>
<221> misc_feature
<223> 人類IgG3之樞紐區
<400> 22
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 人類
<220>
<221> misc_feature
<223> 人類IgG4之樞紐區
<400> 23
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之一般使用之scFv的連結子
<400> 24
<210> 25
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之甘胺酸連結子
<400> 25
<210> 26
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之甘胺酸連結子
<400> 26
<210> 27
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之類膠原蛋白胜肽
<400> 27
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之連結子
<400> 28
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之連結子
<400> 29
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之甘胺酸-丙胺酸連結子
<400> 30
<210> 31
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成之類膠原蛋白區域
<400> 31
Claims (24)
- 一種產生一多價Fab片段的方法,包括於一宿主細胞中共表現以下第一核酸及第二核酸之步驟:(1)第一核酸,編碼出一胺基酸序列,其從N端至C端依序為訊息胜肽(signal peptide)、OKT3重鏈變異區(heavy chain variable region)、人類IgG的CH1區、樞紐區(hinge region)與類膠原蛋白胜肽(collagen-like peptide),其中該樞紐區由序列辨識號:18或19所組成,且該類膠原蛋白胜肽具有至少10個重複之Gly-Xaa-Yaa之三連體的序列,其中Xaa與Yaa為任何胺基酸殘基;以及(2)第二核酸,編碼出另一胺基酸序列,其從N端至C端依序為訊息胜肽、OKT3輕鏈變異區(light chain variable region)與人類IgG的kappa輕鏈固定區(light chain constant region),其中該kappa輕鏈固定區由序列辨識號:17所組成。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該人類IgG係擇自由IgG1、IgG2、IgG3與IgG4所組成之群組。
- 如申請專利範圍第1項所述之方法,其中該第一核酸更包括編碼出一單鏈Fv之一序列。
- 一種多價Fab片段,藉由如申請專利範圍第1項所述之方法來產生。
- 一種多價Fab片段之三聚體,包括三個如申請專利範圍第4項所述之多價Fab片段,藉由至少它們之類膠原蛋白區來結合在一起。
- 如申請專利範圍第5項所述之多價Fab片段之三聚體,其中該Gly-Xaa-Yaa之三連體的序列中,Xaa為Pro,Yaa為Pro或Hyp。
- 一種多價抗體片段,包括:(1)從N端至C端依序為訊息胜肽、OKT3重鏈變異區、人類IgG的CH1區、樞紐區與類膠原蛋白胜肽之一胺基酸序列,其中該樞紐區由序列辨識號:18或19所組成,且該類膠原蛋白胜肽具有至少10個重複之Gly-Xaa-Yaa之三連體的序列,其中Xaa與Yaa為任何胺基酸殘基;以及(2)從N端至C端依序為訊息胜肽、OKT3輕鏈變異區與人類IgG的kappa輕鏈固定區之一胺基酸序列,其中該kappa輕鏈固定區由序列辨識號:17所組成。
- 一種多價抗體片段之三聚體,包括三個如申請專利範圍第7項所述之多價抗體片段的一複合物。
- 如申請專利範圍第8項所述之多價抗體片段之三聚體,其中該Gly-Xaa-Yaa之三連體的序列中,Xaa為Pro,Yaa為Pro或Hyp。
- 如申請專利範圍第8項所述之多價抗體片段之三聚體,其中該人類IgG係自擇由IgG1、IgG2、IgG3與IgG4所組成之群組。
- 如申請專利範圍第8項所述之多價抗體片段之三聚體,其中該(1)之胺基酸序列更包括一單鏈Fv之一序列。
- 如申請專利範圍第11項所述之多價抗體片段之三聚體,其中該抗體片段為雙專一性。
- 如申請專利範圍第8項所述之多價抗體片段之三聚體,其中該多價抗體片段之一配體為人類CD3。
- 如申請專利範圍第12項所述之多價抗體片段之三聚體,其中該多價抗體片段之配體為人類CD3與人類表皮生長因子受體。
- 一種核酸序列,其編碼如申請專利範圍第7項所述之多價抗體片段。
- 一種表現載體,當引入一宿主細胞時,其表現如申請專利範圍第7項所述之多價抗體片段。
- 一種宿主細胞,包括如申請專利範圍第16項所述之表現載體。
- 一種體外調節一配體之生物活性的方法,包括:將一多價抗體片段之三聚體與該配體一起培養,該多價抗體片段包括:(1)從N端至C端依序為訊息胜肽、OKT3重鏈變異區、人類IgG的CH1區、樞紐區與類膠原蛋白胜肽之一胺基酸序列,其中該樞紐區由序列辨識號:18或19所組成,且該類膠原蛋白胜肽具有至少10個重複之Gly-Xaa-Yaa之三連體的序列,其中Xaa與Yaa為任何胺基酸殘基;以及(2)從N端至C端依序為訊息胜肽、OKT3輕鏈變異區與人類IgG的kappa輕鏈固定區之一胺基酸序列,其中該kappa輕鏈固定區由序列辨識號:17所組成。
- 如申請專利範圍第18項所述之方法,其中該Gly-Xaa-Yaa之三連體的序列中,Xaa為Pro,Yaa為Pro或 Hyp。
- 一種多價抗體片段之三聚體在製備用以治療於一個體中之自體免疫疾病之藥物中的用途,其中該多價抗體片段包括:(1)從N端至C端依序為訊息胜肽、OKT3重鏈變異區、人類IgG的CH1區、樞紐區與類膠原蛋白胜肽之一胺基酸序列,其中該樞紐區由序列辨識號:18或19所組成,且該類膠原蛋白胜肽具有至少10個重複之Gly-Xaa-Yaa之三連體的序列,其中Xaa與Yaa為任何胺基酸殘基;以及(2)從N端至C端依序為訊息胜肽、OKT3輕鏈變異區與人類IgG的kappa輕鏈固定區之一胺基酸序列,其中該kappa輕鏈固定區由序列辨識號:17所組成。
- 如申請專利範圍第20項所述之用途,其中該Gly-Xaa-Yaa之三連體的序列中,Xaa為Pro,Yaa為Pro或Hyp。
- 如申請專利範圍第20項所述之用途,其中該多價抗體片段之一配體為人類CD3。
- 一種偵測一配體的方法,包括:將一多價抗體片段之三聚體與該配體一起培養,該多價抗體片段包括:(1)從N端至C端依序為訊息胜肽、OKT3重鏈變異區、人類IgG的CH1區、樞紐區與類膠原蛋白胜肽之一胺基酸序列,其中該樞紐區由序列辨識號:18或19所組成,且該類膠原蛋白胜肽具有至少10個重複之Gly-Xaa-Yaa之三連體 的序列,其中Xaa與Yaa為任何胺基酸殘基;以及(2)從N端至C端依序為訊息胜肽、OKT3輕鏈變異區與人類IgG的kappa輕鏈固定區之一胺基酸序列,其中該kappa輕鏈固定區由序列辨識號:17所組成;(3)一標記;偵測該多價抗體片段之三聚體的結合。
- 如申請專利範圍第23項所述之偵測一配體的方法,其中該Gly-Xaa-Yaa之三連體的序列中,Xaa為Pro,Yaa為Pro或Hyp。
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