JP2014518615A - 前立腺特異的膜抗原結合タンパク質および関連組成物ならびに方法 - Google Patents

前立腺特異的膜抗原結合タンパク質および関連組成物ならびに方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）発現細胞を特異的標的し、前立腺癌（例えば、去勢抵抗性前立腺癌）、腫瘍関連血管形成または良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）の治療に有用である単一特異性および多重特異性ポリペプチド治療学に関する。１つの実施形態では、多重特異性ポリペプチド治療は、Ｔ細胞上のＰＳＭＡ発現細胞とＴ細胞受容体複合体の両方に結合して標的依存性Ｔ細胞の細胞傷害活性化および増殖を誘発する。
【選択図】なし

Description

本出願は、２０１１年４月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／４７８，４４９号の利益を請求するものであり、これは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）発現細胞を特異的標的し、例えば、前立腺癌（例えば、去勢抵抗性前立腺癌）、腫瘍関連血管形成、または良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）等のＰＳＭＡ過剰発現を特徴とする障害の治療に有用である単一特異性および多重特異性タンパク質治療学に関する。１つの実施形態では、多重特異性タンパク質治療は、Ｔ細胞上のＰＳＭＡ発現細胞とＴ細胞受容体複合体の両方に結合して標的依存性Ｔ細胞の細胞傷害活性化および増殖を誘発する。
添付の配列表
本明細書に添付して電子媒体で提出したテキストファイル（名称：「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」、サイズ：２７２，０１４バイト；作成日：２０１２年４月２０日）の内容は、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩおよびＮ−アセチル化α結合した酸性ジペプチダーゼ１としても知られており、遺伝子ＦＯＬＨ１（葉酸ヒドロラーゼ１）によってコードされるペプチダーゼファミリーＭ２８に属す二量体２型膜貫通糖タンパク質である。タンパク質は、栄養葉酸および神経ペプチドＮ−アセチル−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−グルタミン酸塩を含む異なる代替的基質上のグルタミン酸カルボキシペプチダーゼとして作用し、前立腺、および少ない範囲で、小腸、中枢および末梢神経系ならびに腎臓等のいくつかの組織に発現する。ＰＳＭＡをコードする遺伝子は、少なくとも３つの変異型を産生するために代替的に挿入される。この遺伝子の変異は、食品葉酸の腸吸収不良に関連し得、低血液葉酸値および続発性高ホモシステイン血症に至り得る。脳中のこのタンパク質発現は、グルタミン酸興奮毒性に関連するいくつかの病的状態に関与し得る。
ＰＳＭＡは、十分に確立された、高度に限局性の前立腺癌関連細胞膜抗原である。前立腺癌細胞内、ＰＳＭＡは正常な前立腺上皮上より１０００倍高く発現する（Ｓｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９５ ４４：１４４１−１４４３）。ＰＳＭＡ発現は前立腺癌進行と共に増大し、転移性疾患、ホルモン難治性、より高悪性度の病変の場合に最高となる（Ｉｓｒａｅｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９４， ５４：１８０７−１８１１； Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ： Ｓｅｍｉｎａｒｓ ａｎｄ Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ １９９５ １：１８−２８； Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．， Ｕｒｏｌｏｇｙ １９９６ ４８：３２６−３３２； Ｓｗｅ ｅｔ ａｌ．， Ｕｒｏｌｏｇｙ １９９８ ５２：６３７−６４０）。さらに、ＰＳＭＡは、膀胱癌、膵癌、悪性黒色腫、肺癌および腎臓癌を含むが、正常な新血管系統上ではない様々な他の固形腫瘍の新血管系統上で豊富に発現する（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｕｒｏｌｏｇｙ ２００１ ５７：８０１−８０５； Ｄｉｖｇｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９８ ４：２７２９−３２７９）。
ＰＳＭＡは、ワクチンまたはモノクローナル抗体を用いた指向療法等、免疫アプローチにおいて重要な標的であることが示されている。分泌性タンパク質である他の前立腺限局的分子（ＰＳＡ、前立腺性酸性ホスファターゼ）とは異なり、ＰＳＭＡは非分泌型内在性細胞表面膜タンパク質であり、このため抗体療法において理想の標的である。ＰＲＯＳＴＡＳＣＩＮＴ（商標登録）（カプロマブペンデチド）は、新たに診断された再発性前立腺癌患者の造影および病期決定においてＦＤＡによって承認されている１１１Ｉｎラベル化抗ＰＳＭＡマウスモノクローナル抗体である（Ｈｉｎｋｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ １９９８， ８３：７３９−７４７）。しかしながら、カプロマブはＰＳＭＡの細胞内エピトープに結合し、ＰＳＭＡの内部ドメインの内在化または曝露を必要とするため、アポトーシスまたは壊死細胞に選択的結合する（Ｔｒｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｕｒｏｌｏｇｉｃ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ： Ｓｅｍｉｎａｒｓ ａｎｄ Ｏｒｉｇｉｎａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ １９９５ １：２９−３７； Ｔｒｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｓｔａｔｅ １９９７ ３０：２３２−２４２）。その結果、カプロマブは、治療的に有益ではない場合がある（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９７ ５７：３６２９−３６３４）。
ＰＳＭＡの外部ドメインを標的とする他のモノクローナル抗体が開発されている（例えば、Ｊ５９１、Ｊ４１５、Ｊ５３３、およびＥ９９）（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９７ ５７：３６２９−３６３４）。放射ラベル化Ｊ５９１は、現在、臨床試験中である（Ｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ ２０１０ １１６（Ｓ４）：１０７５）。しかしながら、証拠は、ＰＳＭＡが推定リガンドの内在化を媒介する受容体として作用し得ることを示唆する。ＰＳＭＡは構成的に内在化を実施し、ＰＳＭＡ特異的抗体は内在化率を誘発および／または増大することができ、これは次いで、エンドソーム中で抗体を蓄積させる（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １９９８ ５８：４０５５−４０６０）。ＰＳＭＡ特異的内在抗体は、前立腺癌細胞の内側への毒素、薬剤、または放射同位体送達を標的とする治療開発に役立ち得る一方（Ｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ ２０１０ １１６（Ｓ４）：１０７５）、ＰＳＭＡ特異的抗体は、エフェクター細胞によって認識される前に内在化し得るため、天然または遺伝子操作したエフェクター機序（例えば、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞介在性ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）、または再指向Ｔ細胞の細胞傷害（ＲＴＣＣ））を利用するＰＳＭＡ特異的抗体は問題である。
１つの実施形態では、本明細書の開示は、アミノ末端からカルボキシル末端側への順で（ａ）ヒトＰＳＭＡと特異的結合するＰＳＭＡ結合ドメイン、（ｂ）ヒンジ領域、および（ｃ）免疫グロブリン定常領域を含む前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）結合ポリペプチドを提供する。ある実施形態では、適切なＰＳＭＡ結合ドメインとしては、配列番号２１で表されるアミノ酸配列を有する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）とヒトＰＳＭＡ結合において競合する結合ドメインが挙げられる。ある実施形態では、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、それぞれの免疫グロブリン定常領域および／またはヒンジ領域間の結合を介して第２の同一ポリペプチド鎖と二量体を形成可能である。
ある実施形態では、ＰＳＭＡ結合ドメインは、（ｉ）ＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、ならびに／または（ｉｉ）ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。あるバリエーションでは、ＬＣＤＲ３は、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を有し、および／またはＨＣＤＲ３は、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有する；一部のかかる実施形態では、ＬＣＤＲ１およびＬＣＤＲ２は、それぞれ配列番号１５および配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有し、ならびに／またはＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ２は、それぞれ配列番号９および配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する。別のバリエーションでは、（ｉ）軽鎖可変領域は、配列番号５または配列番号２３で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む；ならびに／または（ｉｉ）重鎖可変領域は、配列番号２、配列番号２５、または配列番号２７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む。軽鎖および重鎖可変領域の片方または両方がヒト化されていることができる。
あるバリエーションでは、ＰＳＭＡ結合ドメインは、本明細書に開示された免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域を含む単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。ある実施形態では、ＰＳＭＡ結合ｓｃＦｖは、例えば、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、または配列番号３５で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。ある実施形態では、ｓｃＦｖの重鎖可変領域は、軽鎖可変領域に対するカルボキシル末端（本明細書において「ＶＬ−ＶＨ配向」とも称する）である。ＶＬ−ＶＨ配向を有するｓｃＦｖのいくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは配列番号２１、配列番号３０、または配列番号３１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、ペプチドリンカー、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、式中ｎ＝１〜５（配列番号１６５）を含むペプチドリンカーによって結合することができる。
本明細書に開示されたＰＳＭＡ結合ポリペプチドのいくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、免疫グロブリンのヒンジ領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＤの免疫グロブリンのヒンジ領域等由来である。かかる免疫グロブリンのヒンジ領域は、野生型免疫グロブリンのヒンジ領域であっても改変免疫グロブリンのヒンジ領域であってもよい。
本明細書に開示されたＰＳＭＡ結合ポリペプチドのさらなる実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＤの免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。別の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含み、定常領域は免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含まない。
あるバリエーションでは、本明細書に開示されたＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）から選択される少なくとも１つのエフェクター機能を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、免疫グロブリンのヒンジ領域由来であり、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。別の実施形態では、免疫グロブリンのヒンジ領域は、ＩｇＧ１のヒンジ領域由来であり、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されたＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号７０、または配列番号７２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む。
なおさらなる実施形態では、本明細書に開示されたＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、（ｄ）免疫グロブリン定常領域に対する第２ヒンジ領域カルボキシル末端、および（ｅ）第２ヒンジ領域に対する第２結合ドメインカルボキシル末端をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２ヒンジ領域は、２型Ｃレクチンまたは免疫グロブリンのヒンジ領域の軸領域に由来するものを含む。あるバリエーションでは、第２ヒンジ領域は、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、または配列番号６６で表されるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、本明細書の開示は、ヒトＰＳＭＡと特異的結合する前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）結合ポリペプチドを提供し、（ｉ）ＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、ならびに（ｉｉ）ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む第１結合ドメインを含む；ＬＣＤＲ３は、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を有し、ならびに／またはＨＣＤＲ３は、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＬＣＤＲ１およびＬＣＤＲ２は、それぞれ配列番号１５および配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有し、ならびに／またはＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ２は、それぞれ配列番号９および配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する。一部のバリエーションでは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７で表されるアミノ酸配列を有し、ならびにＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号９、配列番号１０および配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有する。一部のバリエーションでは（ｉ）軽鎖可変領域は、配列番号５または配列番号２３で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む；ならびに／または（ｉｉ）重鎖可変領域は、配列番号２、配列番号２５、または配列番号２７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号３、配列番号４、または配列番号２２で表される核酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の核酸配列によってコードされる；ならびに／または重鎖可変領域は、配列番号１、配列番号２４、または配列番号２６で表される核酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の核酸配列によってコードされる。軽鎖および重鎖可変領域の片方または両方がヒト化されていることができる。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、第２の同一ポリペプチド鎖と二量体を形成可能である。
本明細書に開示されたある実施形態では、第１結合ドメインは、免疫グロブリン軽鎖および重鎖可変領域を含む単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合ｓｃＦｖは、例えば、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、または配列番号３５で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖを含む。ある実施形態では、ｓｃＦｖの重鎖可変領域は、軽鎖可変領域に対するカルボキシル末端（「ＶＬ−ＶＨ配向」）である。ＶＬ−ＶＨ配向を有するｓｃＦｖのいくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは配列番号２１、配列番号３０、または配列番号３１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、ペプチドリンカー、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、式中ｎ＝１〜５（配列番号１６５）を含むペプチドリンカーによって結合することができる。
ある実施形態では、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、免疫グロブリン定常領域をさらに含む。例えば、一部のバリエーションでは、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＤの免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。一部のバリエーションでは、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、１つまたは複数のヒンジ領域をさらに含む。ある実施形態では、ヒンジ領域は、例えば、２型Ｃレクチンの軸領域に由来しても免疫グロブリンのヒンジ領域に由来してもよい。
別の実施形態では、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、アミノからカルボキシル末端側への順で、第１結合ドメイン、ヒンジ領域、および免疫グロブリン定常領域を含む。この形態のＰＳＭＡ結合ポリペプチドはＰＳＭＡ特異的ＳＭＩＰ分子とも呼ばれ得る。一般的ＳＭＩＰ配置は、例えば、米国特許公開第２００３／０１３３９３９号、同第２００３／０１１８５９２号、および同第２００５／０１３６０４９号（これらは、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に提供される。
別の実施形態では、ポリペプチド配向は、ポリペプチドがアミノからカルボキシル末端側への順で、免疫グロブリン定常領域、ヒンジ領域および第１結合ドメインを含むように逆行する。この配向において、ポリペプチドは、ＰＳＭＡ特異的ＰＩＭＳ分子とも呼ばれ得る。一般的ＰＩＭＳ配置は、例えば、米国特許公開第２００９／０１４８４４７号（これは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示された免疫グロブリン定常領域および、任意に、ヒンジ領域を有するＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、それぞれの免疫グロブリン定常領域および／またはヒンジ領域間の結合を介して第２の同一ポリペプチド鎖と二量体を形成可能である。
別の実施形態では、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）等の第２結合ドメインを含む。例えば、一部のバリエーションでは、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、アミノ末端からカルボキシル末端側への順でまたはカルボキシル末端からアミノ末端側への順で（ａ）第１結合ドメイン、（ｂ）第１ヒンジ領域、（ｃ）免疫グロブリン定常領域、（ｄ）第２ヒンジ領域、および（ｅ）第２結合ドメインを含む。
さらに別の実施形態では、本明細書の開示は、本明細書に開示された他の実施形態のＰＳＭＡ結合ポリペプチドを提供し、追加の結合ドメイン（例えば、第２結合ドメイン）を含み、第２結合ドメインはＴ細胞と特異的結合する。ある実施形態では、第２結合ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体またはその成分と特異的結合する。いくつかの実施形態では、第２結合ドメインは、ＣＤ３（例えば、ＣＤ３ε）に特異的結合するものを含む。あるバリエーションでは、第２結合ドメインは、ＣＲＩＳ−７またはＨｕＭ２９１モノクローナル抗体とＣＤ３結合において競合する。一部のかかるバリエーションでは、第２結合ドメインは、ＣＲＩＳ−７またはＨｕＭ２９１モノクローナル抗体由来である免疫グロブリン軽鎖可変領域および免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。例えば、ある実施形態では、第２結合ドメインの軽鎖および重鎖可変領域は、ＣＲＩＳ−７またはＨｕＭ２９１モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖ＣＤＲをそれぞれ含むヒト化可変領域である。別の実施形態では、第２結合ドメインの軽鎖および重鎖可変領域は、（ａ）配列番号４７の残基１３９〜２４５で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号４７の残基１〜１２１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに（ｂ）配列番号７８の残基６３４〜７４０で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ならびに配列番号７８の残基４９６〜６１６で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域から選択される。
第２結合ドメインを含むＰＳＭＡ結合ポリペプチドのある実施形態では、第２結合ドメインは、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。例えば、ＣＲＩＳ−７モノクローナル抗体に由来する軽鎖および重鎖可変領域を含む第２結合ドメインのいくつかの実施形態では、第２結合ドメインは、（ｉ）配列番号４７の残基１〜２４５で表されるアミノ酸配列、ならびに（ｉｉ）配列番号７８の残基４９６〜７４２で表されるアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一の。一部のかかる実施形態では、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、配列番号４９、配列番号５１、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、または配列番号１６４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである。
別の実施形態では、本明細書の開示は、第１および第２ポリペプチド鎖を含む二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質を提供し、前記ポリペプチド鎖のそれぞれは、本明細書に開示された任意の実施形態のＰＳＭＡ結合ポリペプチドである。
別の実施形態では、本明細書の開示は、アミノ末端からカルボキシル末端側への順で（ａ）ヒトＰＳＭＡと特異的結合する結合ドメイン、（ｂ）ヒンジ領域、（ｃ）免疫グロブリン定常領域、および（ｄ）免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを含むＰＳＭＡ結合ポリペプチドを提供する。ヘテロ二量体化ドメインは、例えば、免疫グロブリンＣＨ１ドメインまたは免疫グロブリンＣＬドメインを含むことができる。ある実施形態では、ＰＳＭＡ結合ドメインは、配列番号２１で表されるアミノ酸配列を有する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）とヒトＰＳＭＡ結合において競合する。ある実施形態では、ＰＳＭＡ結合ドメインは、例えば、上に開示されたＰＳＭＡ結合ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、免疫グロブリンのヒンジ領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＤの免疫グロブリンのヒンジ領域等由来である。かかる免疫グロブリンのヒンジ領域は、野生型免疫グロブリンのヒンジ領域であっても改変免疫グロブリンのヒンジ領域であってもよい。さらなる実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、もしくは任意のそれらの組み合わせの免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメイン；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭもしくは任意のそれらの組み合わせの免疫グロブリンＣＨ３ドメイン；またはＩｇＥ、ＩｇＭもしくはそれらの組み合わせの免疫グロブリンＣＨ３およびＣＨ４ドメイン等を含む。
ある実施形態では、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）から選択される少なくとも１つのエフェクター機能を含む。一部のかかる実施形態では、ヒンジ領域は、免疫グロブリンのヒンジ領域由来であり、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。より具体的なバリエーションでは、免疫グロブリンのヒンジ領域は、ＩｇＧ１のヒンジ領域由来であり、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。
ある実施形態では、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、配列番号４６、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、または配列番号６１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、本明細書の開示は、ヘテロ二量体化ドメイン（例えば、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン）によって結合し、ヘテロ二量体を形成する２つの非同一ポリペプチド鎖を含むＰＳＭＡ結合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシル末端側への順で（ａ）ＰＳＭＡと特異的結合する第１結合ドメイン、（ｂ）第１ヒンジ領域、（ｃ）第１免疫グロブリン定常領域、および（ｄ）第１免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを含む第１ポリペプチド鎖、ならびにアミノ末端からカルボキシル末端側への順で（ａ’）第２ヒンジ領域（ｂ’）第２免疫グロブリン副領域、および（ｃ’）第１ポリペプチド鎖の第１免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインと異なる第２免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを含む第２単鎖ポリペプチドを含み、第１および第２免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは互いに結合してヘテロ二量体を形成する。ある実施形態では、ＰＳＭＡ結合ドメインは、配列番号２１で表されるアミノ酸配列を有する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）とヒトＰＳＭＡ結合において競合する。ある実施形態では、ＰＳＭＡ結合ドメインは、例えば、上に開示されたＰＳＭＡ結合ドメインを含む。
ある実施形態では、ヘテロ二量体化ドメインは、免疫グロブリンＣＨ１ドメインまたは免疫グロブリンＣＬドメインのいずれかを含むドメインを含む。一部のかかる実施形態では、第１免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、第１免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含み、第２免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、第１免疫グロブリンＣＬドメインを含む。あるいは、他の実施形態では、第１免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、第１免疫グロブリンＣＬドメインを含み、第２免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、第１免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、第１および第２ヒンジ領域の少なくとも１つは、免疫グロブリンのヒンジ領域、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＤの免疫グロブリンのヒンジ領域等に由来する。かかる免疫グロブリンのヒンジ領域は、野生型免疫グロブリンのヒンジ領域であっても改変免疫グロブリンのヒンジ領域であってもよい。さらなる実施形態では、第１および第２免疫グロブリン定常領域の少なくとも１つは、免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、もしくは任意のそれらの組み合わせの免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメイン；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭもしくは任意のそれらの組み合わせの免疫グロブリンＣＨ３ドメイン；またはＩｇＥ、ＩｇＭもしくはそれらの組み合わせの免疫グロブリンＣＨ３およびＣＨ４ドメイン等を含む。
本明細書に開示されたヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質のあるバリエーションでは、第１および第２ポリペプチド鎖の片方または両方は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）から選択される少なくとも１つのエフェクター機能を含む。一部のかかる実施形態では、第１および第２ヒンジ領域のそれぞれは、免疫グロブリンのヒンジ領域に由来し、第１および第２免疫グロブリン定常領域のそれぞれは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ある実施形態では、第１および第２ヒンジ領域のそれぞれは、ＩｇＧ１のヒンジ領域に由来し、第１および第２免疫グロブリン定常領域のそれぞれは、ＩｇＧ１の免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。
本明細書に開示されたヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質のいくつかの実施形態では、第２ポリペプチド鎖は第２結合ドメインをさらに含む。例えば、第２ポリペプチド鎖は、第２ヒンジ領域に対する第２結合ドメインアミノ末端をさらに含むことができる。
あるバリエーションでは、本明細書に開示されたヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質は、単一特異性（すなわち、ＰＳＭＡ単一特異性）であることができる。あるいは、他の実施形態では、ヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質は、多重特異性である。例えば、ヘテロ二量体の各ポリペプチド鎖は、異なる結合ドメイン、例えば、ＰＳＭＡ結合ドメインを含む第１ポリペプチド鎖およびＰＳＭＡと異なる第２標的抗原に特異的な第２結合（例えば、第２ヒンジ領域に対するアミノ末端）を含む第２ポリペプチド鎖を含むことができる。
多重特異性、ヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質のいくつかの実施形態では、第２結合ドメインは、Ｔ細胞と特異的結合する。ある実施形態では、Ｔ細胞結合ドメインは、例えば、上に開示された追加の結合ドメインおよび第２結合ドメインを含む。Ｔ細胞に特異的結合する第２結合ドメインを含むヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質のある実施形態では、例えば（ａ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号４６で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチド鎖は、配列番号４７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む；（ｂ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号５８で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチド鎖は、配列番号５７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む；（ｃ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号５９で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチド鎖は、配列番号５７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む；（ｄ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号６０で表されるアミノ酸配列と少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチド鎖は、配列番号４７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む；または（ｅ）第１ポリペプチド鎖は、配列番号６１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチド鎖は、配列番号４７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含む。
本明細書に開示された二量体またはヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質のある実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、マウスモノクローナル抗体１０７−１Ａ４と比較してＰＳＭＡ発現細胞によって延長された血清半減期、低減した内在化、および／またはＰＳＭＡ発現細胞表面上の延長された持続時間を示す。
別の実施形態では、本明細書の開示は、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドをコードする単離核酸を提供する。例えば、あるバリエーションでは、核酸は、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、または配列番号１６３で表されるヌクレオチド配列を含む。
別の実施形態では、本明細書の開示は、組換え宿主細胞内の本明細書に開示されたＰＳＭＡ結合ポリペプチドまたはタンパク質発現用の発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含み、核酸セグメントは、宿主細胞内核酸セグメントの発現に適した調節配列に使用可能に結合されている。いくつかの実施形態では、核酸セグメントは、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、または配列番号１６３で表されるヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、発現ベクターは、第１および第２発現単位を含み、第１および第２発現単位はそれぞれ本明細書に開示されたある実施形態のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質の第１および第２ポリペプチド鎖をコードする第１および第２核酸セグメントを含み、第１および第２核酸セグメントは、宿主細胞内核酸セグメントの発現に適した調節配列に使用可能に連結している。あるバリエーションでは、（ａ）第１核酸セグメントは、配列番号４４で表されるヌクレオチド配列を含み、第２核酸セグメントは、配列番号４５で表されるヌクレオチド配列を含む；（ｂ）第１核酸セグメントは、配列番号５３で表されるヌクレオチド配列を含み、第２核酸セグメントは、配列番号５２で表されるヌクレオチド配列を含む；（ｃ）第１核酸セグメントは、配列番号５４で表されるヌクレオチド配列を含み、第２核酸セグメントは、配列番号５２で表されるヌクレオチド配列を含む；（ｄ）第１核酸セグメントは、配列番号５５で表されるヌクレオチド配列を含み、第２核酸セグメントは、配列番号４５で表されるヌクレオチド配列を含む；または（ｅ）第１核酸セグメントは、配列番号５６で表されるヌクレオチド配列を含み、第２核酸セグメントは、配列番号４５で表されるヌクレオチド配列を含む。
別の実施形態では、本明細書の開示は、本明細書に開示された発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。
別の実施形態では、本明細書の開示は、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドまたはタンパク質産生方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に開示されたＰＳＭＡ結合ポリペプチド産生方法である。ある実施形態では、方法は、一般に発現ベクターを含む組換え宿主細胞を培養することを含み、発現ベクターは、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含み、宿主細胞内核酸セグメントの発現に適した調節配列に使用可能に結合されており、培養は、核酸セグメントが発現し、したがって、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドを産生する条件下にある。あるバリエーションでは、核酸セグメントは、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、または配列番号１６３で表されるヌクレオチド配列を含む。ある実施形態では、方法は、ＰＳＭＡ結合ポリペプチド回収をさらに含む。
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に開示された二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質産生方法である。あるバリエーションでは、発現ベクターの核酸セグメントは、本明細書に開示されたＰＳＭＡ結合ポリペプチドをコードし、培養は、核酸セグメントが発現する条件下にあり、コードされたＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質として産生する。方法は、二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質回収をさらに含むことができる。
他の実施形態では、方法は、本明細書に開示されたヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質産生方法である。ある実施形態では、方法は、一般に第１および第２発現単位を含む組換え宿主細胞を培養することを含み、第１および第２発現単位はそれぞれ本明細書に説明するヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質の第１および第２ポリペプチド鎖をコードする第１および第２核酸セグメントを含み、第１および第２核酸セグメントは、宿主細胞内核酸セグメントの発現に適した調節配列に使用可能に連結しており、培養は、第１および第２核酸セグメントが発現し、コードされたポリペプチド鎖が、ヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質として産生する条件下にある。いくつかの実施形態では、方法は、ヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質回収をさらに含む。
別の実施形態では、本明細書の開示は、本明細書に説明する任意のＰＳＭＡ結合ポリペプチドもしくはタンパク質ならびに医薬上許容される担体、希釈液、または賦形剤を含む組成物を提供する。
別の実施形態では、本明細書の開示は、ＰＳＭＡ発現細胞に対する抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）誘発方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ発現細胞に対するＡＤＣＣまたはＣＤＣ誘発方法は、ＰＳＭＡ発現細胞を第１および第２ポリペプチド鎖を含む二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質と接触させることを含み、各ポリペプチド鎖は、本明細書に開示されたＰＳＭＡ結合ポリペプチドであり、前記接触は、ＰＳＭＡ発現細胞に対してＡＤＣＣまたはＣＤＣを誘発する条件下にある。他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現細胞に対するＡＤＣＣまたはＣＤＣ誘発方法は、段落［００３１］のように、ヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質と細胞を接触させることを含み、前記接触は、ＰＳＭＡ発現細胞に対してＡＤＣＣまたはＣＤＣを誘発する条件下にある。
別の実施形態では、本明細書の開示は、ＰＳＭＡ発現細胞に対する再指向Ｔ細胞の細胞傷害（ＲＴＣＣ）誘発方法を提供する。一部のバリエーションでは、ＰＳＭＡ発現細胞に対するＲＴＣＣ誘発方法は、ＰＳＭＡ発現細胞を第１および第２ポリペプチド鎖を含む二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質と接触させることを含み、前記ポリペプチド鎖のそれぞれは、本明細書に開示されたＰＳＭＡ結合ポリペプチドであり、前記接触は、ＰＳＭＡ発現細胞に対してＲＴＣＣを誘発する条件下にある。他の実施形態では、ＰＳＭＡ発現細胞に対するＲＴＣＣ誘発方法は、本明細書に開示されたヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質と細胞を接触させることを含み、前記接触は、ＰＳＭＡ発現細胞に対してＲＴＣＣを誘発する条件下にある。
別の実施形態では、本明細書の開示は、対象のＰＳＭＡ過剰発現を特徴とする障害の処置方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量の上に開示された二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質を対象に投与することを含む。一部のかかる実施形態では、二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質の第１および第２ポリペプチド鎖は、ＰＳＭＡ結合ポリペプチド（例えば、上に開示されたもの）であり、二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質は対象中に再指向Ｔ細胞の細胞傷害（ＲＴＣＣ）を誘発する。他のバリエーションでは、方法は、治療有効量のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質（例えば、上に開示されたもの）を対象に投与することを含む。一部のバリエーションでは、ヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質は、上に開示されたタンパク質であり、ヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質は対象中にＲＴＣＣを誘発する。開示された方法のある実施形態では、障害は、癌、例えば、前立腺癌（例えば、去勢抵抗性前立腺癌）、大腸癌、胃癌、淡明細胞型腎細胞癌、膀胱癌、または肺癌等である。いくつかの実施形態では、障害は、例えば、前立腺癌または良性前立腺肥大症等の前立腺障害である。他のバリエーションでは、障害は、新生血管障害である。治療する新生血管障害は、例えば、固体腫瘍成長を特徴とする癌、例えば、淡明細胞型腎細胞癌、大腸癌、膀胱癌、および肺癌等であることができる。
本発明のこれらのおよび他の実施形態および／または他の態様は、本発明の以下の発明を実施するための形態および添付図について言及時に明らかになるであろう。
ＰＳＭＡ（＋）（ＬＮＣａＰ）およびＰＳＭＡ（−）（ＤＵ−１４５）前立腺癌細胞系におけるＴＳＣ０８５、ＴＳＣ０９２およびＴＳＣ１２２と親１０７−１Ａ４マウス抗体（ＴＳＣ０４５）を比較するために使用された結合試験の結果を例証するグラフである。 ＰＳＭＡ（＋）（Ｃ４−２）およびＰＳＭＡ（−）（ＤＵ−１４５）前立腺癌細胞系におけるヒト化ＴＳＣ１８８およびＴＳＣ１８９を比較するために使用された結合試験の結果を例証するグラフである。 ＰＳＭＡ（＋）（Ｃ４−２）およびＰＳＭＡ（−）（ＤＵ−１４５）前立腺癌細胞系における親ヒト化ＳＭＩＰ分子ＴＳＣ１８８およびＴＳＣ１８９ならびにキメラインターセプター分子ＴＳＣ１２２に対するヒト化ＳＣＯＲＰＩＯＮ分子ＴＳＣ１９４およびＴＳＣ１９９の結合を比較するために使用された結合試験の結果を例証するグラフである。 インターセプターおよびＳＭＩＰ足場を足場とするＰＳＭＡ結合タンパク質に対する親１０７−１Ａ４マウス抗体を比較する内在化実験の結果を例証するグラフである。 ２つの異なるドナー（ＡＧおよびＶＶとしてラベル）のヒト血液由来Ｔ細胞の存在下で、低減する濃度（３００、１００、３０、１０および０ｐＭ）でキメラＴＳＣ１２２インターセプター分子と共に２４時間に渡り観察された強力な標的依存性細胞傷害活性を例証するグラフである。 親キメラインターセプター分子ＴＳＣ１２２と並んだＴＳＣ２００、ＴＳＣ２０２、ＴＳＣ２０４の細胞傷害を例証するグラフである。 キメラインターセプター分子ＴＳＣ１２２と比較したヒト化１０７−１Ａ４ＳＣＯＲＰＩＯＮ分子（ＴＳＣ１９４、ＴＳＣ１９９、ＴＳＣ２１２、ＴＳＣ２１３）によって媒介されるＴ細胞の細胞傷害を例証するグラフである。 Ｃ４−２細胞と反応する抗ＰＳＭＡ二重特異性分子（ＴＳＣ１９４、ＴＳＣ１９９、ＴＳＣ２０２およびＴＳＣ１２２）により誘発されたＣＤ４＋Ｔ細胞（図７Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図７Ｂ）の標的依存性増殖を例証するグラフである。 Ｃ４−２細胞と反応する抗ＰＳＭＡ二重特異性分子（ＴＳＣ１９４、ＴＳＣ１９９、ＴＳＣ２０２およびＴＳＣ１２２）により誘発されたＣＤ４＋Ｔ細胞（図７Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図７Ｂ）の標的依存性増殖を例証するグラフである。 Ｃ４−２細胞上のＰＳＭＡに対するｍＡｂ Ｊ５９１およびＪ４１５対１０７−１Ａ４ ｍＡｂおよびキメラおよびヒト化１０７−１Ａ４ ＳＭＩＰ分子の競合結合試験を例証するグラフである。具体的に、図８Ａは、ヒト化Ｊ５９１抗体（Ｈｕ５９１）がＣ４−２細胞上のＰＳＭＡに対する結合において１０７−１Ａ４、Ｊ５９１またはＪ４１５マウス抗体と競合するかどうかを決定する競合結合アッセイの結果を示す；図８Ｂは、３つのマウス抗体がＣ４−２細胞上のＰＳＭＡに対する結合においてキメラ１０７−１Ａ４ ＳＭＩＰ分子（ＴＳＣ０８５）と競合するどうかを決定する競合結合アッセイの結果を示す；ならびに図８Ｃは、３つのマウス抗体がＣ４−２細胞上のＰＳＭＡに対する結合においてヒト化１０７−１Ａ４ ＳＭＩＰ分子（ＴＳＣ１８９）と競合するかどうかを決定する競合結合アッセイの結果を示す。 Ｃ４−２細胞上のＰＳＭＡに対するｍＡｂ Ｊ５９１およびＪ４１５対１０７−１Ａ４ ｍＡｂおよびキメラおよびヒト化１０７−１Ａ４ ＳＭＩＰ分子の競合結合試験を例証するグラフである。具体的に、図８Ａは、ヒト化Ｊ５９１抗体（Ｈｕ５９１）がＣ４−２細胞上のＰＳＭＡに対する結合において１０７−１Ａ４、Ｊ５９１またはＪ４１５マウス抗体と競合するかどうかを決定する競合結合アッセイの結果を示す；図８Ｂは、３つのマウス抗体がＣ４−２細胞上のＰＳＭＡに対する結合においてキメラ１０７−１Ａ４ ＳＭＩＰ分子（ＴＳＣ０８５）と競合するどうかを決定する競合結合アッセイの結果を示す；ならびに図８Ｃは、３つのマウス抗体がＣ４−２細胞上のＰＳＭＡに対する結合においてヒト化１０７−１Ａ４ ＳＭＩＰ分子（ＴＳＣ１８９）と競合するかどうかを決定する競合結合アッセイの結果を示す。 Ｃ４−２細胞上のＰＳＭＡに対するｍＡｂ Ｊ５９１およびＪ４１５対１０７−１Ａ４ ｍＡｂおよびキメラおよびヒト化１０７−１Ａ４ ＳＭＩＰ分子の競合結合試験を例証するグラフである。具体的に、図８Ａは、ヒト化Ｊ５９１抗体（Ｈｕ５９１）がＣ４−２細胞上のＰＳＭＡに対する結合において１０７−１Ａ４、Ｊ５９１またはＪ４１５マウス抗体と競合するかどうかを決定する競合結合アッセイの結果を示す；図８Ｂは、３つのマウス抗体がＣ４−２細胞上のＰＳＭＡに対する結合においてキメラ１０７−１Ａ４ ＳＭＩＰ分子（ＴＳＣ０８５）と競合するどうかを決定する競合結合アッセイの結果を示す；ならびに図８Ｃは、３つのマウス抗体がＣ４−２細胞上のＰＳＭＡに対する結合においてヒト化１０７−１Ａ４ ＳＭＩＰ分子（ＴＳＣ１８９）と競合するかどうかを決定する競合結合アッセイの結果を示す。
Ｉ．一般的詳細
本発明は、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）と特異的結合するＰＳＭＡ結合ポリペプチドおよびタンパク質を提供する。治療有効量の本発明のＰＳＭＡ結合ポリペプチドまたはタンパク質をそれを必要としている患者に投与することは、ある癌および前立腺障害等のＰＳＭＡ過剰発現に関連するある障害の治療に有用である。１つの実施形態では、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドまたはタンパク質はＰＳＭＡ過剰発現標的細胞とＴ細胞に同時に結合し、したがって、ＰＳＭＡ過剰発現標的細胞とＴ細胞を「架橋」する。標的に対する両ドメインの結合は、強力な標的依存性再指向Ｔ細胞の細胞傷害（ＲＴＣＣ）を引き出す（例えば、標的依存性Ｔ細胞の細胞傷害、Ｔ細胞活性化およびＴ細胞増殖を誘発する）。
本明細書で使用する項の題名は、構成目的のみであり、記載の主題を限定するものとして解釈されない。特許、特許出願、記事、書物、および論文が挙げられるが、これらに限定されない本明細書に引用した全文書、または一部文書は、任意の目的で参照によってそれらの全体が本明細書に明示的に組み込まれる。１つまたは複数の組み込まれた文書または一部文書が出願中の用語の定義と矛盾する用語を定義する場合、本出願に示す定義が制御する。
本明細書の発明を実施するための形態において、任意の濃度範囲、割合範囲、比範囲、または整数範囲は、別段の指定のない限り、列挙した範囲内の任意の整数値、適切な場合、その留分（整数の１０分の１および１００分の１等）を含むものと理解されるべきである。本明細書で使用する「約」とは、別段の指定のない限り、提示の範囲、値、または構造の±２０％を意味する。本明細書で使用する用語「ａ」および「ａｎ」とは、別段の指定のない限り、列挙した成分「の１つまたは複数」を指すものと理解されるべきである。代用物（例えば、「または」）の使用は、代用物の１つ、両方、もしくは任意のそれらの組み合わせのいずれかを意味するものと理解されるべきである。本明細書で使用する用語「を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」と「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は同意語として使用される。さらに、本明細書に記載の様々な成分（例えば、ドメインまたは領域）および置換基の組み合わせを含むポリペプチドは、各ポリペプチドが個別に説明された場合と同一範囲で本明細書に開示されているものと理解されるべきである。したがって、各ポリペプチドの特定の成分の選択は、本明細書の開示の範囲内である。
ＩＩ．定義
本明細書で使用する用語「結合ドメイン」または「結合領域」とは、抗原、リガンド、受容体、基質、または阻害剤（例えば、ＣＤ３、ＰＳＭＡ）等の標的分子を特異的に認識して結合する能力を保有するタンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、またはペプチドのドメイン、領域、部分、または部位を指す。例示的な結合ドメインとしては、単鎖抗体可変領域（例えば、ドメイン抗体、ｓＦｖ、ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ）、受容体外部ドメイン、およびリガンド（例えば、サイトカイン、ケモカイン）が挙げられる。ある実施形態では、結合ドメインは、抗原結合部位（例えば、可変重鎖配列および可変軽鎖配列または代替的フレームワーク領域（ＦＲ）（例えば、任意に１つまたは複数のアミノ酸置換を含むヒトＦＲ）内に置いた抗体由来の３本の軽鎖補体決定領域、（ＣＤＲ）および３本の重鎖ＣＤＲを含むかまたはそれらからなる。特定の標的に特異的結合する本明細書に開示の結合ドメインを同定するための様々なアッセイ（ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ファージディスプレイライブラリースクリーニング、およびＢＩＡＣＯＲＥ（商標登録）相互作用分析等）が既知である。本明細書で使用するＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、「第１結合ドメイン」および、任意に、「第２結合ドメイン」を有することができる。ある実施形態では、「第１結合ドメイン」とは、ＰＳＭＡ結合ドメインであり、特定のポリペプチド形態（例えば、ＳＭＩＰまたはＰＩＭＳ）に応じて、アミノ末端に位置してもカルボキシル末端に位置してもよい。第１および第２結合ドメインの両方を含むある実施形態では、第２結合ドメインは、Ｔ細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３）に結合するマウスモノクローナル抗体（例えば、ＣＲＩＳ−７）に由来するｓｃＦｖ等のＴ細胞結合ドメインである。他の実施形態では、第２結合ドメインは、第２ＰＳＭＡ結合ドメインである。さらに他の実施形態では、第２結合ドメインは、ＰＳＭＡ結合ドメインまたはＴ細胞結合ドメイン以外の結合ドメインである。
１０５Ｍ−１以上の親和性またはＫａ（すなわち、単位１／Ｍで相互作用する特定の結合の平衡結合定数）で標的と結合するが、試験試料に存在する他の成分には有意に結合しない場合、結合ドメインは標的に「特異的結合する」。結合ドメインは、「高い親和性」結合ドメインおよび「低い親和性」結合ドメインに分類できる。「高い親和性」結合ドメインは、少なくとも１０７Ｍ−１、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも１０９Ｍ−１、少なくとも１０１０Ｍ−１、少なくとも１０１１Ｍ−１、少なくとも１０１２Ｍ−１、または少なくとも１０１３Ｍ−１Ｋａの結合ドメインを指す。「低い親和性」結合ドメインは、最大１０７Ｍ−１、最大１０６Ｍ−１、最大１０５Ｍ−１Ｋａの結合ドメインを指す。あるいは、親和性は、単位Ｍで相互作用する特定の結合の平衡解離定数（Ｋｄ）（例えば、１０−５Ｍ〜１０−１３Ｍ）と定義することができる。本明細書の開示によって、結合ドメインポリペプチドおよび単鎖ポリペプチドの親和性を、従来技術（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ． （１９４９） Ａｎｎ． Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ５１：６６０、ならびに米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、または均等物を参照されたい）を用いて容易に決定することができる。
「ＣＤ３」は、Ｔ細胞受容体複合体サブユニットである６鎖の多タンパク質複合体として当該技術分野において知られている（例えば、Ａｂｂａｓ ａｎｄ Ｌｉｃｈｔｍａｎ， ２００３； Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．， ｐ． １７２ａｎｄ １７８， １９９９を参照されたい）。哺乳動物において、Ｔ細胞受容体複合体のＣＤ３サブユニットは、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、およびＣＤ３ζ鎖のホモ二量体である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε鎖は、単一免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連した細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は負的に負荷し、これは、これらの鎖に正に帯電したＴ細胞受容体鎖に結合させる特徴である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε鎖の細胞内尾は、それぞれ免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはＩＴＡＭとして既知である単一の保存的モチーフを含み、各ＣＤ３ζ鎖は３を有する。ＩＴＡＭは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能において重要であることが考えられる。本明細書の開示に使用されるＣＤ３は、ヒト、サル、マウス、ラット、または他の哺乳動物を含む様々な動物種に由来し得る。
本明細書で使用する「保存的置換」とは、あるアミノ酸と類似の特性を有する別のアミノ酸との置換として当該技術分野において認識されている。例示的な保存的置換は、当該技術分野において周知である（例えば、ＷＯ９７／０９４３３号、ｐａｇｅ １０、１９９７年３月１３日公開； Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ； Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ． ＮＹ：ＮＹ （１９７５）， ｐｐ．７１−７７； Ｌｅｗｉｎ， Ｇｅｎｅｓ ＩＶ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ， Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ， ＭＡ （１９９０）， ｐ． ８を参照されたい）。ある実施形態では、保存的置換は、ロイシンからセリンへの置換を含む。
本明細書で使用する用語「誘導体」とは、酵素を用いたまたは用いない化学的または生物学的手段、例えば、グリコシル化、アルキル化、アシル化、エステル形態、またはアミド形態によるペプチドの１つまたは複数のアミノ酸残基の改変を指す。
本明細書で使用する設計化したポリペプチドまたはタンパク質「に由来する」ポリペプチドまたはアミノ酸配列とは、ポリペプチド起点を指す。ある実施形態では、特定の配列（「開始」または「親（ｐａｒｅｎｔ）」または「親の（ｐａｒｅｎｔａｌ）」配列と呼ばれることもある）に由来するポリペプチドまたはアミノ酸配列は、開始配列またはその部分と本質的に同一のアミノ酸配列を有し、前記部分は少なくとも１０〜２０個のアミノ酸、少なくとも２０〜３０個のアミノ酸、または少なくとも３０〜５０個のアミノ酸、または少なくとも５０〜１５０個のアミノ酸からなるか、あるいは開始配列中にその起点を有するとして当業者が識別可能である。
別のポリペプチドに由来するポリペプチドは、開始ポリペプチド、例えば、別のアミノ酸残基と置換されているかまたは１つもしくは複数のアミノ酸残基が挿入されたかもしくは欠失した１つまたは複数のアミノ酸残基と比較して１つまたは複数の変異を有することができる。ポリペプチドは、天然ではないアミノ酸配列を含むことができる。かかるバリエーションは必然的に、開始ポリペプチドと１００％未満の配列同一性または類似性を有する。１つの実施形態では、変異型は、開始ポリペプチドのアミノ酸配列と約６０％〜１００％未満のアミノ酸配列同一性または類似性のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、変異型は、開始ポリペプチドのアミノ酸配列と約７５％〜１００％未満、約８０％〜１００％未満、約８５％〜１００％未満、約９０％〜１００％未満、約９５％〜１００％未満のアミノ酸配列同一性または類似性のアミノ酸配列を有する。
別段の提示のない限り、本明細書で使用する免疫グロブリン分子の可変領域内のアミノ酸残基位置は、カバット番号付け法（Ｋａｂａｔ， Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ ｅｄ． Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ： Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ （１９９１））によって番号付け、免疫グロブリン分子の定常領域内のアミノ酸残基位置は、ＥＵ 命名法によって番号付ける（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９５ Ｔｈｅｒａｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２：７７−９４）。
本明細書で使用する用語「二量体」とは、共有結合（例えば、ジスルフィド結合）および他の相互作用（例えば、電気静的相互作用、塩架橋、水素結合、および疎水相互作用）を含む分子内力の１つまたは複数の形態を介して互いに結合し、適切な条件下（例えば、組換えタンパク質の発現、純化、および／もしくは保存に適した水溶液中の生理的条件下、または電気泳動の変性しないおよび／もしくは低減しない条件下）で安定している２つのサブユニットからなる生物学的実体を指す。「ヘテロ二量体」または「ヘテロ二量体タンパク質」とは、本明細書で使用する場合、２つの異なるポリペプチドから形成された二量体を指す。ヘテロ二量体は、４つのポリペプチド（すなわち、２つの軽鎖および２つの重鎖）から形成された抗体を含まない。「ホモ二量体」または「ホモ二量体タンパク質」とは、本明細書で使用する場合、２つの同一ポリペプチドから形成された二量体を指す。
本明細書で使用する「ヒンジ領域」または「ヒンジ」とは、（ａ）膜貫通型タンパク質（例えば、１型膜貫通型タンパク質）のインタードメイン領域；または（ｂ）２型Ｃ−レクチンの軸領域由来であるポリペプチドを指す。例えば、ヒンジ領域は、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバのインタードメイン領域由来であることができる；この特定のクラス内の適切なヒンジ領域としては、（ｉ）野生型および改変免疫グロブリンヒンジを含む免疫グロブリンのヒンジ領域（例えば、上および／または核領域（１つまたは複数）からなる）もしくはその機能的変異型、ならびに（ｉｉ）免疫グロブリンＶ様または免疫グロブリンＣ様ドメインに接続する領域（またはその機能的変異型）が挙げられる。
「野生型免疫グロブリンのヒンジ領域」とは、抗体重鎖に見られる、（ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤにおける）ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメイン間に介入されてそれらを接続するかまたは（ＩｇＥおよびＩｇＭにおける）ＣＨ１ドメインとＣＨ３ドメイン間に介入されてそれらを接続する天然上および中心ヒンジアミノ酸配列を指す。ある実施形態では、野生型免疫グロブリンのヒンジ領域配列はヒトであり、ヒトＩｇＧヒンジ領域を含むことができる。
「改変野生型免疫グロブリンのヒンジ領域」もしくは「改変免疫グロブリンのヒンジ領域」とは、（ａ）最大３０％のアミノ酸変化（例えば、最大２５％、２０％、１５％、１０％、または５％のアミノ酸置換または欠失）を有する野生型免疫グロブリンのヒンジ領域、または（ｂ）長さ約５アミノ酸（例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸）最大約１２０個のアミノ酸（例えば、長さ約１０〜約４０個のアミノ酸または約１５〜約３０個のアミノ酸または約１５〜約２０個のアミノ酸または約２０〜約２５アミノ酸を有する）、最大約３０％のアミノ酸変化（例えば、最大約２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、または１％のアミノ酸置換または欠失もしくはそれらの組み合わせ）を有し、ＰＣＴ／米国特許第２０１０／６２４３６号およびＰＣＴ／米国特許第２０１０／６２４０４号に開示のＩｇＧ核ヒンジ領域を有する野生型免疫グロブリンのヒンジ領域の一部を指す。
本明細書で使用する用語「ヒト化」とは、ヒトに対して免疫原性の低い非ヒト種（例えば、マウスまたはラット）に由来しつつ、遺伝学的技術の使用によって元の抗体の抗原結合特性を保持する抗体または免疫グロブリン結合タンパク質およびポリペプチドの作製プロセスを指す。いくつかの実施形態では、抗体または免疫グロブリン結合タンパク質およびポリペプチド（例えば、軽鎖および重鎖可変領域、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ）の結合ドメイン（１つまたは複数）はヒト化されている。非ヒト結合ドメインは、「再形成」（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ， ｅｔ ａｌ．， １９８８ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４−１５３６； Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ， ｅｔ ａｌ．， １９８８ Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３３７； Ｔｅｍｐｅｓｔ， ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ １９９１ ９：２６６−２７１）、「高キメラ化」（Ｑｕｅｅｎ， ｅｔ ａｌ．， １９８９ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：１００２９−１００３３； Ｃｏ， ｅｔ ａｌ．， １９９１ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：２８６９−２８７３； Ｃｏ， ｅｔ ａｌ．， １９９２Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４８：１１４９−１１５４）、および「化粧張り」（Ｍａｒｋ， ｅｔ ａｌ．， “Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｄ ｖｅｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉ−ＣＤ１８ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ． Ｉｎ： Ｍｅｔｃａｌｆ ＢＷ， Ｄａｌｔｏｎ ＢＪ， ｅｄｓ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｈｅｓｉｏｎ： ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， １９９４： ２９１−３１２）を含むＣＤＲグラフト（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６））およびその変異型として既知である技術を用いてヒト化することができる。非ヒト供給源に由来する場合、ヒンジ領域および定常領域ドメイン等の抗体または免疫グロブリン結合タンパク質およびポリペプチドの他の領域もヒト化できる。
「免疫グロブリン二量体化ドメイン」または「免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン」とは、本明細書で使用する場合、第２ポリペプチド鎖の異なる免疫グロブリンドメインと選択的に相互作用するかまたは結合するポリペプチド鎖の免疫グロブリンドメインを指し、異なる免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインの相互作用は、第１および第２ポリペプチド鎖のヘテロ二量体化に実質的に関与するかまたは効率的に促進する（すなわち、「ヘテロ二量体」とも呼ばれる２つの異なるポリペプチド鎖間の二量体形成）。第１ポリペプチド鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインおよび／または第２ポリペプチド鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインの不在下で第１および第２ポリペプチド鎖間の二量体化に統計的有意な低下がある場合、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン間の相互作用は、第１および第２ポリペプチド鎖のヘテロ二量体化に「実質的に関与するかまたは効率的に促進する」。ある実施形態では、第１および第２ポリペプチド鎖が共発現する場合、互いに少なくとも６０％、少なくとも約６０％〜約７０％、少なくとも約７０％〜約８０％、少なくとも８０％〜約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の第１および第２ポリペプチド鎖形態ヘテロ二量体である。代表的な免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとしては、そこに提供される野生型免疫グロブリンＣＨ１およびＣＬドメインならびに改変（または変異）免疫グロブリンＣＨ１およびＣＬドメインを含む免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、免疫グロブリンＣＬドメイン（例えば、ＣκまたはＣλアイソタイプ）、またはその誘導体が挙げられる。
「免疫グロブリン定常領域」または「定常領域」とは、１つまたは複数の定常領域ドメインの一部またはすべてと一致するかまたはそれらに由来するペプチドまたはポリペプチド配列について言及するように本明細書において定義した用語である。ある実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、１つまたは複数の定常領域ドメインの一部またはすべてであるが抗体源の定常領域ドメインのすべてではないものと一致するかまたはそれらに由来する。ある実施形態では、定常領域は、ＩｇＧ ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン（例えば、ＩｇＧ１ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む。ある実施形態では、定常領域は、ＣＨ１ドメインを含まない。ある実施形態では、定常領域を作製する定常領域ドメインは、ヒトである。いくつかの実施形態では（例えば、ＣＤ３または別のＴ細胞表面抗原に特異的結合する第２結合ドメインを含むＰＳＭＡ結合ポリペプチドまたはタンパク質のあるバリエーションでは）、本開示の融合タンパク質の定常領域ドメインは、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）ならびに補体活性化および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）のエフェクター機能がないかほとんどないのに対し、一部のＦＣ受容体（ＦＣＲｎ、新生児Ｆｃ受容体等）の結合能を保持し、比較的長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を保持する。他のバリエーションでは、本開示の融合タンパク質は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣの片方または両方のかかるエフェクター機能を保持する定常ドメインを含む。ある実施形態では、本開示の結合ドメインは、ヒトＩｇＧ１定常領域に融合され、ＩｇＧ１定常領域は、１つまたは複数の以下のアミノ酸変異：２３４位のロイシン（Ｌ２３４）、２３５位のロイシン（Ｌ２３５）、２３７位のグリシン（Ｇ２３７）、３１８位のグルタミン酸（Ｅ３１８）、３２０位のリジン（Ｋ３２０）、３２２位のリジン（Ｋ３２２）、もしくは任意のそれらの組み合わせ（ＥＵ番号付け）を有する。例えば、任意の１つまたは複数のこれらのアミノ酸は、アラニンに変異することができる。さらなる実施形態では、ＩｇＧ１Ｆｃドメインは、アラニン（すなわち、それぞれＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０Ａ、およびＫ３２２Ａ）に変異している各Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、およびＫ３２２（ＥＵ番号付け）を有し、任意にＮ２９７Ａ変異も同様に有する（すなわち、ＣＨ２ドメインのグリコシル化を本質的に除去する）。
「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは、細胞上の抗体受容体および補体のＣ１ｑ成分への結合に関与する抗体源部分に相当するかまたは由来するポリペプチド配列を指す。Ｆｃは、タンパク質結晶を容易に形成する抗体断片である「断片結晶」を表す。当初タンパク質分解の消化によって記載された異なるタンパク質断片は、免疫グロブリンタンパク質の全体の一般的構造を定義することができる。当初文献に定義されていたように、Ｆｃ断片はジスルフィド結合した重鎖ヒンジ領域、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインからなる。しかしながら、より最近、本用語は、ＣＨ３、ＣＨ２、および第２のかかる鎖とジスルフィド結合した二量体を形成する上で十分な少なくとも一部のヒンジからなる単鎖に適用されている。免疫グロブリン構造および機能の総説については、Ｐｕｔｎａｍ， Ｔｈｅ Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ， Ｖｏｌ． Ｖ （Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．， １９８７）， ｐｐ． ４９−１４０；およびＰａｄｌａｎ， Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ３１：１６９−２１７， １９９４を参照されたい。本明細書で使用する用語Ｆｃは、天然配列の変異型を含む。
本明細書で使用する用語「ＳＭＩＰ」とは、例えば、米国特許公開第２００３／０１３３９３９号、同第２００３／０１１８５９２号、および同第２００５／０１３６０４９号（これらは、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に一般に開示されるようにタンパク質足場について言及するために使用される。実施例および本明細書の開示全体に記載する「ＰＳＭＡ特異的ＳＭＩＰ分子」または「ＳＭＩＰ分子」とは、ＳＭＩＰ足場（例えば、アミノからカルボキシル末端側への順で）、第１結合ドメイン、ヒンジ領域、および免疫グロブリン定常領域を含むＰＳＭＡ結合タンパク質であるものと理解されるべきである。
本明細書で使用する用語「ＰＩＭＳ」とは、例えば、米国特許公開第２００９／０１４８４４７号（これは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）に一般に開示されるようにタンパク質足場について言及するために使用される。実施例および本明細書の開示全体に記載する「ＰＳＭＡ特異的ＰＩＭＳ分子」または「ＰＩＭＳ分子」とは、ＰＩＭＳ足場（例えば、アミノからカルボキシル末端側への順で）、免疫グロブリン定常領域、ヒンジ領域および第１結合ドメインを含むＰＳＭＡ結合タンパク質であるものと理解されるべきである。
本明細書で使用する用語「インターセプター」とは、ＰＣＴ出願のＰＣＴ／米国特許第２０１０／６２４３６号およびＰＣＴ／米国特許第２０１０／６２４０４号（これらは、それらの全体が本明細書に組み込まれる）に一般に開示されるように単一特異性または多重特異性ヘテロ二量体タンパク質足場について言及するために使用される。実施例および本明細書の開示全体に記載する「ＰＳＭＡ特異的インターセプター分子」または「インターセプター分子」とは、インターセプター足場、例えば、２つの非同一ポリペプチド鎖を含むＰＳＭＡ結合タンパク質であり、各ポリペプチド鎖は免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを含むものと理解されるべきである。界面免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは異なる。１つの実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、ＣＨ１ドメインまたはその誘導体を含む。別の実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、ＣＬドメインまたはその誘導体を含む。１つの実施形態では、ＣＬドメインは、ＣκもしくはＣλアイソタイプまたはその誘導体である。
本明細書で使用する「ＳＣＯＲＰＩＯＮ」とは、多重特異性結合タンパク質足場について言及するために使用される用語である。ＳＣＯＲＰＩＯＮ（商標）は、Ｅｍｅｒｇｅｎｔ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｅａｔｔｌｅ， ＬＬＣ商標である。多重特異性結合タンパク質およびポリペプチドは、例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ２００７／１４６９６８号、米国特許出願第２００６／００５１８４４号、ＰＣＴ出願ＷＯ２０１０／０４０１０５号、ＰＣＴ出願ＷＯ２０１０／００３１０８号、および米国特許第７，１６６，７０７号（これらは、参照によってそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。ＳＣＯＲＰＩＯＮポリペプチドは、２つの結合ドメイン（ドメインは、同一または異なる標的と特異的結合するように設計することができる）、２つのヒンジ領域、および免疫グロブリン定常領域を含む。ＳＣＯＲＰＩＯＮタンパク質は、２つの同一、ジスルフィド結合ＳＣＯＲＰＩＯＮポリペプチドを含むホモ二量体タンパク質である。実施例および本明細書の開示全体に記載する「ＰＳＭＡ特異的ＳＣＯＲＰＩＯＮ分子」または「ＳＣＯＲＰＩＯＮ分子」とは、ＳＣＯＲＰＩＯＮ足場、例えば、２つの結合ドメイン（ドメインは、同一または異なる標的と特異的結合するように設計することができる）、２つのヒンジ領域、および免疫グロブリン定常領域を含むＰＳＭＡ結合タンパク質であるものと理解されるべきである。
本明細書で使用する２型Ｃ−レクチンの「軸領域」とは、Ｃタイプレクチン様ドメイン（ＣＴＬＤ；（例えば、ナチュラルキラー細胞受容体のＣＴＬＤに類似）と膜貫通ドメイン間に位置する２型Ｃ−レクチンの余剰細胞ドメイン部分を指す。例えば、ヒトＣＤ９４分子（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＣ５０２９１．１、ＰＲＩ１９９５年１１月３０日）において、余剰細胞ドメインはアミノ酸残基３４〜１７９と一致し、ＣＴＬＤはアミノ酸残基６１〜１７６と一致する。したがって、ヒトＣＤ９４分子の軸領域は、膜およびＣＴＬＤ間で見られるアミノ酸残基３４〜６０を含む（Ｂｏｙｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：７５， １９９９を参照されたい；他の軸領域の詳細については、Ｂｅａｖｉｌ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：７５３， １９９２；およびＦｉｇｄｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２：７７， ２００２も参照されたい）。これらの２型Ｃ−レクチンは、軸領域および膜貫通領域またはＣＴＬＤ間で６〜１０連結アミノ酸を有することもできる。別の例では、２３３アミノ酸ヒトＮＫＧ２Ａタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｐ２６７１５．１、ＰＲＩ２０１０年６月１５日）は、アミノ酸７１〜９３の膜貫通ドメインおよびアミノ酸９４〜２３３の余剰細胞ドメインを有する。ＣＴＬＤは、アミノ酸１１９〜２３１からなり、軸領域は、アミノ酸９９〜１１６を含み、これは、５および２アミノ酸接合によって側面に位置する。他の２型Ｃ−レクチン、ならびにそれらの余剰細胞リガンド結合ドメイン、インタードメインもしくは軸領域、およびＣＴＬＤは、当該技術分野において知られている（例えば、ヒトＣＤ２３、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｄの配列ならびにそれらの詳細において、それぞれＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿００１９９３．２；ＡＡＨ０７０３７．１、ＰＲＩ２００６年７月１５日；ＮＰ＿００１７７３．１、ＰＲＩ２０１０年６月２０日；ＡＡＬ６５２３４．１、ＰＲＩ２００２年１月１７日、およびＣＡＡ０４９２５．１、ＰＲＩ２００６年１１月１４日を参照されたい）。
本明細書で使用する膜貫通型タンパク質（例えば、１型膜貫通型タンパク質）の「インタードメイン領域」とは、２つの隣接ドメイン間に位置する膜貫通型タンパク質の余剰細胞ドメインの一部を指す。インタードメイン領域例としては、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバの隣接Ｉｇドメインを連結する領域（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥ由来の免疫グロブリンのヒンジ領域；ＣＤ２のＩｇＶおよびＩｇＣ２ドメインを連結する領域；またはＣＤ８０もしくはＣＤ８６のＩｇＶおよびＩｇＣドメインを連結する領域）が挙げられる。インタードメイン領域の別の例は、ＣＤ２２、１型シアル酸結合Ｉｇ様レクチンの非ＩｇおよびＩｇＣ２ドメインを連結する領域である。
２型Ｃ−レクチンの軸領域「に由来する」または膜貫通型タンパク質インタードメイン領域（例えば、免疫グロブリンのヒンジ領域）「に由来する」ポリペプチド領域とは、約５〜約１５０個のアミノ酸配列、約５〜約１００個のアミノ酸配列、約５〜約５０個のアミノ酸配列、約５〜約４０個のアミノ酸配列、約５〜約３０個のアミノ酸配列、約５〜約２５アミノ酸配列、約５〜約２０個のアミノ酸配列、約１０〜約２５アミノ酸配列、約１０〜約２０個のアミノ酸配列、約８〜約２０個のアミノ酸配列、約９〜約２０個のアミノ酸配列、約１０〜約２０個のアミノ酸配列、約１１〜約２０個のアミノ酸配列、約１２〜約２０個のアミノ酸配列、約１３〜約２０個のアミノ酸配列、約１４〜約２０個のアミノ酸配列、約１５〜約２０個のアミノ酸配列、または約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のアミノ酸配列を指し、これらのすべてまたは少なくとも一部は以下（ｉ）野生型軸領域もしくはインタードメイン領域配列；（ｉｉ）野生型軸領域もしくはインタードメイン領域配列の断片；（ｉｉｉ）（ｉ）または（ｉｉ）のいずれかと少なくとも８０％、８５％、９０％、もしくは９５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド；または（ｉｖ）欠失、挿入、置換、もしくは任意のそれらの組み合わせを有する、例えば、１つもしくは複数の変化は置換を含むかまたは１つもしくは複数の変異は１つの欠失のみを含む１つ、２つ、３つ、４つ、もしくは５つのアミノ酸中の（ｉ）もしくは（ｉｉ）のいずれかを含む。いくつかの実施形態では、軸領域誘導体は、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ２３、ＣＤ６４、ＣＤ７２、またはＣＤ９４の約８〜約２０個のアミノ酸に由来するもの等、野生型軸領域配列と比較してタンパク質分解切断に対してより耐性である。
本明細書で使用する用語「連結アミノ酸」または「連結アミノ酸残基」とは、ヒンジおよび隣接免疫グロブリン定常領域間、またはヒンジおよび隣接結合ドメイン間、または２つの免疫グロブリン可変ドメインおよび隣接免疫グロブリン可変ドメインを連結するペプチドリンカー間等のポリペプチドの２つの隣接領域またはドメイン間の１つまたは複数の（例えば、約２〜１０）アミノ酸残基を指す。連結アミノ酸は、ポリペプチド構築物設計（例えば、ポリペプチドをコードする核酸分子の構築物中の制限酵素部位の使用に起因するアミノ酸残基）の結果であることができる。
本明細書で使用する語句「ＣＨ３およびＣＨ１またはＣＬ間リンカー」とは、ＣＨ３ドメイン（例えば、野生型ＣＨ３または変異ＣＨ３）のＣ末端ならびにＣＨ１ドメインもしくはＣＬドメイン（例えば、Ｃｋ）のＮ末端間の１つもしくは複数の（例えば、約２〜１２、約２〜１０、約４〜１０、約５〜１０、約６〜１０、約７〜１０、約８〜１０、約９〜１０、約８〜１２、約９〜１２、もしくは約１０〜１２）アミノ酸残基を指す。
本明細書で使用する用語「必要としている患者」とは、治療が奏効するかまたは本明細書に提供されるＰＳＭＡ結合タンパク質もしくはポリペプチドまたはその組成物を用いて改善される疾患、障害もしくは状態リスクのあるかまたはそれらを呈している患者を指す。
本明細書で使用する用語「ペプチドリンカー」とは、同一の軽鎖および重鎖可変領域を含む抗体と同一標的分子に対して重鎖可変領域を軽鎖可変領域と接続し、得られたポリペプチドが特異的な結合親和性を保持するように２つの副結合ドメインの相互作用と互換性のあるスペーサー機能を提供するアミノ酸配列を指す。ある実施形態では、リンカーは、５〜約３５アミノ酸、例えば、約１５〜約２５アミノ酸からなる。
本明細書で使用する用語「医薬上許容される」とは、当該技術分野において周知である経路を用いて投与時にアレルギー性または他の重篤な副作用を産生しない分子構成要素および組成物を指す。動物における、特にヒトにおける使用において、連邦もしくは州政府規制当局によって承認されているかまたは米国薬局方もしくは他の一般に認識された薬局方に掲載された分子構成要素および組成物は、「医薬上許容される」とみなされる。
本明細書で使用する用語「プロモーター」とは、結合ＲＮＡポリメラーゼに関与し転写を開始するＤＮＡ領域を指す。
本明細書で使用する用語「核酸」、「核酸分子」、もしくは「ポリヌクレオチド」とは、単一または二重鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドならびにそのポリマーを指す。特に限定されない限り、用語は、基準ヌクレオチドと類似の結合特性を有し、天然ヌクレオチドに類似の方法で代謝される天然核酸のアナログを含む核酸を包含する。別段の指定のない限り、特定の核酸配列はまた保存的に修飾されたその変異型（例えば、縮退コドン置換）および補体配列ならびに明白に提示された配列も暗に包含される。具体的には、縮退コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの第３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基と置換されている配列を生成することによって達成できる（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ． １９：５０８１； Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６０：２６０５−２６０８； Ｃａｓｓｏｌ ｅｔ ａｌ． （１９９２）； Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８）。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと同義的に使用される。本明細書で使用する用語「核酸」、「核酸分子」、または「ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、ヌクレオチドアナログを用いて生成したＤＮＡまたはＲＮＡアナログ、ならびにその誘導体、断片およびホモログを含むことが意図される。
用語「発現」とは、核酸によってコードされる生成物の生体合成を指す。例えば、目的のポリペプチドをコードする核酸セグメントの場合、発現は、ｍＲＮＡ内への核酸セグメント転写ならびに１つもしくは複数のポリペプチド内へのｍＲＮＡ翻訳に関与する。
用語「発現単位」と「発現カセット」は本明細書において同義的に使用され、目的のポリペプチドをコードする核酸セグメントを示し、宿主細胞内核酸セグメントの発現を提供することが可能である。発現単位は、典型的には、転写プロモーター、目的のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、および転写ターミネーターをすべて作動可能な配置で含む。転写プロモーターおよびターミネーターに加えて、発現単位は、例えば、エンハンサーまたはポリアデニル化シグナル等の他の核酸セグメントをさらに含むことができる。
用語「発現ベクター」とは、本明細書で使用する場合、１つまたは複数の発現単位を含む線形または円形の核酸分子を指す。１つまたは複数の発現単位に加えて、発現ベクターは、例えば、１つもしくは複数の複製起源または１つもしくは複数の選択マーカー等の追加の核酸セグメントも含むことができる。発現ベクターは、一般には、プラスミドもしくはウイルスＤＮＡに由来するかまたは両要素を含むことができる。
本明細書で使用する用語「配列同一性」とは、２つ以上のポリヌクレオチド配列間または２つ以上のポリペプチド配列間の関連を指す。ある配列中の位置が比較配列の相当する位置の同一核酸塩基またはアミノ酸残基に占められる場合、配列は、該位置で「同一」と記載される。「配列同一性」の割合とは、同一核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列において生じ、「同一」位置数が得られる位置数を決定することによって計数される。次いで、「同一」位置数を比較窓中の位置の総数で割り、１００を掛けて「配列同一性」の割合を得る。「配列同一性」の割合とは、比較窓上の至適に整列した２配列の比較によって決定する。核酸配列の比較窓は、例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００またはそれ以上の核酸長であることができる。ポリペプチド配列の比較窓は、例えば、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００またはそれ以上のアミノ酸長であることができる。比較用に配列を至適に整列するため、比較窓中の一部のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、添加またはすき間と呼ばれる欠失を含むことができ、基準配列は一定を保つ。至適アライメントは、すき間を有してさえ、基準配列と比較配列間の潜在的「同一」位置数が最も高いアライメントである。２配列間の「配列同一性」の割合は、国立生物工学情報センターから利用可能であった（２００４年９月１日時点）プログラム「ＢＬＡＳＴ２配列」版を用いて決定することができる。このプログラムはＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列比較用）とＢＬＡＳＴＰプログラム（ポリペプチド配列比較用）を組み込み、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ （Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０（１２）：５８７３−５８７７， １９９３）のアルゴリズムに基づく。「ＢＬＡＳＴ２配列」を利用する場合、２００４年９月１日時点でデフォルトパラメーターであったパラメーターを、ワード長（３）、オープンギャップペナルティ（１１）、延長ギャップペナルティ（１）、すき間の欠落（５０）、期待値（１０）およびマトリックス選択肢が挙げられるが、これらに限定されない他の任意の必要なパラメーターに使用することができる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列は、２配列が互いに比較して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％配列同一性を有する場合、「実質的に類似の配列同一性」または「実質的な配列同一性」を有するとみなされる。
本明細書で使用する「ポリペプチド」または「ポリペプチド鎖」とは、共有結合したアミノ酸の単、線形および連続的配列である。それは、鎖内ジスルフィド結合を介して非線形状で共に連結する２つのポリペプチド鎖（例えば、軽鎖がジスルフィド結合を介して重鎖と連結する半分の免疫グロブリン分子）を含まない。ポリペプチドは、１つまたは複数の鎖内ジスルフィド結合を有することも形成することもできる。本明細書に記載のポリペプチドに関して、配列番号に特定されるものに相当するアミノ酸残基についての言及は、かかる残基の翻訳後の改変を含む。
「タンパク質」とは、１つまたは複数のポリペプチド鎖を含む巨分子である。タンパク質は炭水化物基等の非ペプチド成分も含むことができる。炭水化物および他の非ペプチド置換基は、タンパク質が産生する、細胞によってタンパク質に加えることができ、細胞種で変わる。タンパク質は、アミノ酸骨格構造に関して本明細書において定義する；炭水化物基等の置換基は、一般に、特定されないが、存在し得る。
本明細書で使用する「小モジュラー免疫薬タンパク質」またはＳＭＩＰとは、例えば、米国特許公開第２００３／０１３３９３９号、同第２００３／０１１８５９２号、および同第２００５／０１３６０４９号に一般に開示されているタンパク質足場を指す。ＳＭＩＰ（商標）は、（商標）は、Ｅｍｅｒｇｅｎｔ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｅａｔｔｌｅ， ＬＬＣ商標である。ＳＭＩＰタンパク質は、結合ドメイン、ヒンジ領域および免疫グロブリン定常領域を有するポリペプチド鎖を含むことができる。
用語「アミノ末端」および「カルボキシル末端」とは、ポリペプチド内の位置を示すために本明細書で使用する。文脈上、無理のない限り、これらの用語は特定の配列または一部のポリペプチドに関連して使用され、近位または相対的位置を示す。例えば、ポリペプチド内の基準配列に対するカルボキシル末端に位置するある配列は、基準配列のカルボキシル末端の近位であるが、必ずしも完全なポリペプチドのカルボキシル末端にある必要はない。
「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）は、ＣＤ３と共にＴ細胞表面上に見られる分子であり、一般に主な組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原を認識することに関与する。それは、ほとんどのＴ細胞内の最も可変的なαおよびβ鎖のジスルフィド結合したヘテロ二量体からなる。他のＴ細胞内では、可変γおよびδ鎖からなる代替的受容体が発現する。ＴＣＲ各鎖は、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバであり、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびＣ末端の短い細胞質尾を保有する（Ａｂｂａｓ ａｎｄ Ｌｉｃｈｔｍａｎ， Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （５ｔｈ Ｅｄ．）， Ｅｄｉｔｏｒ： Ｓａｕｎｄｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ， ２００３； Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ： Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ， ４ｔｈ Ｅｄ．， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ， ｐ１４８， １４９， ａｎｄ １７２， １９９９を参照されたい）。本明細書の開示に使用されるＴＣＲは、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物を含む様々な動物種に由来し得る。
「ＴＣＲ複合体」とは、本明細書で使用する場合、ＣＤ３鎖と他のＴＣＲ鎖との結合によって形成された複合体を指す。例えば、ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖ホモ二量体、ＴＣＲα鎖、およびＴＣＲβ鎖を構成することができる。あるいは、ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、ＣＤ３ζ鎖ホモ二量体、ＴＣＲγ鎖、およびＴＣＲδ鎖を構成することができる。
「ＴＣＲ複合体の成分」とは、本明細書で使用する場合、ＴＣＲ鎖（すなわち、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲγまたはＴＣＲδ）、ＣＤ３鎖（すなわち、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３εまたはＣＤ３ζ）、または２つ以上のＴＣＲ鎖もしくはＣＤ３鎖によって形成された複合体（例えば、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ複合体、ＴＣＲγおよびＴＣＲδ複合体、ＣＤ３εおよびＣＤ３δ複合体、ＣＤ３γおよびＣＤ３ε複合体、またはＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、および２つのＣＤ３ε鎖の副ＴＣＲ複合体）を指す。
「抗体依存性細胞介在性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」とは、本明細書で使用する場合、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびマクロファージ等の単球細胞）が標的細胞上の結合抗体（またはＦｃγＲ結合が可能な他のタンパク質）を認識し、続いてその標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性プロセスを指す。本質的に、活性化ＦｃγＲを有する任意のエフェクター細胞がＡＤＣＣを媒介するきっかけとなり得る。ＡＤＣＣを媒介する主な細胞はＮＫ細胞であり、これはＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、それらの活性化、局所化、または分化状態に応じて、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩを発現することができる。造血細胞上のＦｃγＲ発現の総説については、例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ ｅｔ ａｌ．， １９９１， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ９：４５７−９２を参照されたい。
用語「ＡＤＣＣ活性を有する」とは、ポリペプチドまたはタンパク質についての言及において本明細書で使用する場合、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）由来等のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する免疫グロブリンのヒンジ領域および免疫グロブリン定常領域を含むもの）は、Ｆｃ受容体（例えば、ＮＫ細胞）を発現する細胞可溶性免疫エフェクター細胞上の細胞可溶性Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＩ）の結合を介して抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介が可能であることを意味する。
「補体依存性細胞傷害」および「ＣＤＣ」とは、本明細書で使用する場合、正常な血清中成分（「補体」）が標的抗原に結合した抗体または他のＣ１ｑ−補体結合タンパク質と共に、標的抗原を発現する標的細胞の溶解を示すプロセスを指す。補体は、調和して規則正しい配列中で作用してそれらの効果を発揮する血清タンパク質群からなる。
用語「従来の補体経路」および「従来の補体系」とは、本明細書で使用する場合、同義語であり、活性化の特定の経路を指す。従来の経路は、Ｃ１〜Ｃ９設計された９つの主なタンパク質成分を順に開始する抗原抗体複合体を必要とし、活性化に関与する。活性化プロセス中のいくつもの工程において、生成物は、連続工程を触媒する酵素である。このカスケードは、比較的小さな初回シグナルによって大量補体の増幅および活性化を提供する。
用語「ＣＤＣ活性を有する」とは、ポリペプチドまたはタンパク質についての言及において本明細書で使用する場合、ポリペプチドまたはタンパク質（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）由来等のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを有する免疫グロブリンのヒンジ領域および免疫グロブリン定常領域を含むもの）は、Ｃ１ｑ補体タンパク質の結合および従来の補体系の活性化を介して依存性細胞傷害（ＣＤＣ）媒介が可能であることを意味する。
「再指向Ｔ細胞の細胞傷害」および「ＲＴＣＣ」とは、本明細書で使用する場合、細胞傷害Ｔ細胞と標的細胞の両方に特異的結合可能な多重特異性タンパク質を用いて細胞傷害Ｔ細胞が標的細胞に補充され、標的依存性細胞傷害Ｔ細胞反応が標的細胞に対して引き出されるＴ細胞媒介性プロセスを指す。
用語「新血管新生」と「血管形成」は、本明細書において同義的に使用される。新血管新生および血管形成は、細胞、組織、または臓器内の新規血管産出を指す。血管形成の制御は、ある病態において典型的に改変され、多くの場合、疾患関連の病的損傷は、改変されたまたは未調節の血管形成に関する。持続性、未調節の血管形成は、内皮細胞による異常増殖を特徴とするもの等の様々な病態に生じ、血管の漏出および浸透等の状態に見られる病的損傷を支持する。
用語「新生血管障害」とは、増大したまたは未調節の血管形成活性に少なくとも部分的に媒介された病理を有する任意の疾患または障害を指すために本明細書で使用する。かかる疾患または障害例としては、固形腫瘍を含む様々な癌が挙げられる。ＰＳＭＡ過剰発現を特徴とする血管系を含むかかる疾患または障害（例えば、淡明細胞型腎細胞癌、大腸癌、膀胱癌、および肺癌等の固形腫瘍を含むある癌）は、本明細書に詳述のとおり血管形成を阻害するある治療法に特に反応する。
本明細書で使用する用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、または「改善する」とは、治療的処置または予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ／ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ）処置のいずれかを指す。処置は、処置中の個体の疾患の少なくとも１つの症状を改善するかまたは処置が個体の進行性疾患悪化を遅延化することができるかまたは追加の関連疾患発現を予防する場合、治療的である。
本明細書で使用する用語、特異的な結合分子または化合物の「治療的有効量（または投与量）」または「有効量（または投与量）」とは、処置中の疾患の１つまたは複数の症状の統計的有意な改善に至る化合物の十分な量を指す。各活性成分について言及時、単独投与する治療的有効量とは、成分単独を指す。併用について言及時、治療的有効量とは、連続投与するか（同一製剤でまたは別々の製剤で同時に）同時投与するかに関わらず、治療効果に至る活性成分の併用量を指す。
本明細書で使用する用語「形質転換」、「トランスフェクション」、および「形質導入」とは、細胞内への核酸（すなわち、ヌクレオチドポリマー）移動を指す。本明細書で使用する用語「遺伝子形質転換」とは、細胞内へのＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの移動および挿入を指す。移した核酸は、発現ベクターを介して細胞内に導入できる。
本明細書で使用する用語「変異型」とは、基準核酸またはポリペプチドとは異なるが、その本質的な特性を保持する核酸またはポリペプチドを指す。一般に、変異型は全体に密接に類似し、多くの領域内において基準核酸またはポリペプチドと同一である。例えば、変異型は、活性な部分または全長基準核酸またはポリペプチドと比較して少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％配列同一性を示し得る。
用語「軽鎖可変領域」（「軽鎖可変ドメイン」または「ＶＬ」とも呼ばれる）および「重鎖可変領域」（「重鎖可変ドメイン」または「ＶＨ」とも呼ばれる）はそれぞれ抗体軽鎖および重鎖由来の可変結合領域を指す。可変結合領域は、「補体決定領域」（ＣＤＲ）および「フレームワーク領域」（ＦＲ）として既知である不連続で十分に定義された副領域で構成されている。１つの実施形態では、ＦＲはヒト化されている。用語「ＣＬ」、「免疫グロブリン軽鎖定常領域」または「軽鎖定常領域」とは、すなわち、抗体軽鎖由来の定常領域を指す。用語「ＣＨ」とは、抗体アイソタイプに応じてＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＧ）、またはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４ドメイン（ＩｇＥ、ＩｇＭ）にさらに分割可能な「免疫グロブリン重鎖定常領域」または「重鎖定常領域」を指す。「Ｆａｂ」（抗原結合断片）は、抗原に結合する抗体の一部であり、鎖内ジスルフィド結合を介して軽鎖に連結する重鎖の可変領域およびＣＨ１ドメインを含む。
ＩＩＩ．ＰＳＭＡ結合ポリペプチド、タンパク質、およびその成分
本明細書の開示は、結合ドメイン、特に、ＰＳＭＡと特異的結合する第１結合ドメインを含むポリペプチドおよびタンパク質を提供する。本開示の結合ドメインを含むポリペプチドおよびタンパク質は、免疫グロブリン定常領域、リンカーペプチド、ヒンジ領域、免疫グロブリン二量体化／ヘテロ二量体化ドメイン、連結アミノ酸、タグ等をさらに含むことができる。開示されたポリペプチドおよびタンパク質のこれらの成分を以下にさらに詳述する。
さらに、本明細書に開示されたＰＳＭＡ結合ポリペプチドおよびタンパク質は、任意の様々な異なる形態の抗体または融合タンパク質形態であることができる（例えば、融合タンパク質は、ＳＭＩＰ分子、ＰＩＭＳ分子、ＳＣＯＲＰＩＯＮ分子またはインターセプター分子形態であることができる）。
本発明によるＰＳＭＡ結合タンパク質は、一般に（ａ）本明細書に説明するＰＳＭＡ結合ドメインを含む少なくとも１つのＰＳＭＡ結合ポリペプチド鎖を含む。あるバリエーションでは、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、（ｂ）ＰＳＭＡ結合ドメインに対するヒンジ領域カルボキシル末端、および（ｃ）免疫グロブリン定常領域（例えば、ＳＭＩＰ分子）をさらに含む。さらなるバリエーションでは、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、（ｄ）免疫グロブリン定常領域に対する第２ヒンジ領域カルボキシル末端、および（ｅ）第２ヒンジ領域に対する第２結合ドメインカルボキシル末端（例えば、ＳＣＯＲＰＩＯＮポリペプチド）をさらに含む。
さらに他のバリエーションでは、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、（ｂ）ＰＳＭＡ結合ドメインに対するヒンジ領域アミノ末端、および（ｃ）ヒンジ領域に対する免疫グロブリン副領域アミノ末端（例えば、ＰＩＭＳポリペプチド）を含む。
典型的に、上記形態（ＳＭＩＰ、ＳＣＯＲＰＩＯＮ、またはＰＩＭＳ）のＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、典型的に免疫グロブリン定常領域および／またはヒンジ領域を介した（例えば、ＩｇＧ ＣＨ２およびＣＨ３ドメインならびにＩｇＧヒンジ領域を含む免疫グロブリン定常領域を介した）ジスルフィド結合によりホモ二量体化が可能である。したがって、本発明のある実施形態では、２つの同一ＰＳＭＡ結合ポリペプチドはホモ二量体化して二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質を形成する。
他の実施形態では、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、第２の、非同一ポリペプチド鎖中の異なるヘテロ二量体化ドメインとヘテロ二量体化が可能なヘテロ二量体化ドメインをさらに含む。あるバリエーションでは、ヘテロ二量体化のための第２ポリペプチド鎖は、第２結合ドメインを含む。したがって、本発明のある実施形態では、２つの非同一ポリペプチド鎖（１つ目はＰＳＭＡ結合ドメインを含み、２つ目は任意に第２結合ドメインを含む）は二量体化してヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質を形成する。
ＰＳＭＡ結合ポリペプチド、タンパク質、およびそれらの様々な成分について、本明細書の以下に詳述する。
Ａ．結合ドメイン
上に示したように、本明細書に開示の免疫グロブリン結合ポリペプチドは、ＰＳＭＡと特異的結合する結合ドメインを含む。一部のバリエーションでは、ＰＳＭＡ結合ドメインは、配列番号５および配列番号２にそれぞれ示すアミノ酸配列（例えば、ｍＡｂ １０７−１Ａ４）を有するＶＬおよびＶＨ領域を有する抗体、または配列番号２１に示すアミノ酸配列を有する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）とＰＳＭＡ結合において競合可能である。ある実施形態では、ＰＳＭＡ結合ドメインは、（ｉ）ＣＤＲ ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）、ならびに（ｉｉ）ＣＤＲ ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。適切なＰＳＭＡ結合ドメインとしては、ｍＡｂ １０７−１Ａ４由来のＶＬおよびＶＨ領域を有するものが挙げられる。一部のかかる実施形態では、ＬＣＤＲ３は配列番号１７で表されるアミノ酸配列を有し、ならびに／またはＨＣＤＲ３は配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有し、ならびにＬＣＤＲ１およびＬＣＤＲ２は任意にそれぞれ配列番号１５および配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ２は任意にそれぞれ配列番号９および配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、例えば、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３は、それぞれ配列番号１５、１６、および１７に示すアミノ酸配列を有する；ならびに／またはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３は、それぞれ配列番号９、１０、および１１に示すアミノ酸配列を有する。
ある実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＰＳＭＡ以外の標的に結合する１つまたは複数の追加の結合ドメイン（例えば、第２結合ドメイン）を含むことができる。これらの他の標的分子は、例えば、特定の細胞種、毒素、追加の細胞受容体、抗体等への結合ドメインポリペプチドを標的とする特定のサイトカインまたは分子を含むことができる。
ある実施形態では、結合ドメインは、例えば、インターセプターまたはＳＣＯＲＰＩＯＮ分子部分として、Ｔ細胞補充のためのＴＣＲ結合ドメインを含み、ＰＳＭＡ発現細胞を標的とすることができる。ある実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドヘテロ二量体は、ＴＣＲ複合体もしくはその成分（例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、およびＣＤ３ε）に特異的結合する結合ドメインならびにＰＳＭＡに特異的結合する別の結合ドメインを含むことができる。
本開示の結合ドメインが由来し得る例示的な抗ＣＤ３抗体としては、ＣＲＩＳ−７モノクローナル抗体（Ｒｅｉｎｈｅｒｚ， Ｅ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｔｙｐｉｎｇ ＩＩ．， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， （１９８６）；それぞれ配列番号１５３
（ＱＶＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＦＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＳＳ
ＫＬＡＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＴＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＲＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＱＩＴＲ）および配列番号１５４
（ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＳＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰ
ＳＳＡＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＳＰＱＶＨＹＤＹＮＧＦＰＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ））に示されるＶＬおよびＶＨアミノ酸配列；ＨｕＭ２９１（Ｃｈａｕ ｅｔ ａｌ． （２００１） Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｏｎ ７１：９４１−９５０；それぞれ配列番号８６（ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶ
ＳＹＭＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＲＬＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＰＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫ）および配列番号８７（ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＩＳＹ
ＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＹＩＮＰＲＳＧＹＴＨＹＮＱＫＬＫＤＫＡＴＬＴＡＤＫＳＡＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＡＹＹＤＹＤＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ））に示されるＶＬおよびＶＨアミノ酸配列；ＢＣ３モノクローナル抗体（Ａｎａｓｅｔｔｉ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７２：１６９１）；ＯＫＴ３モノクローナル抗体（Ｏｒｔｈｏ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ （１９８５） Ｎ． Ｅｎｇｌ． Ｊ． Ｍｅｄ． ３１３：３３７）およびＯＫＴ３ ａｌａ−ａｌａ等のその誘導体（ＯＫＴ３ ＡＡ−ＦＬまたはＯＫＴ３ ＦＬとも呼ばれる）、２３４位および２３５位にアラニン置換を有するヒト化Ｆｃ変異型（Ｈｅｒｏｌｄ ｅｔ ａｌ． （２００３） Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １１：４０９）；ビジリズマブ（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００２） Ｂｌｏｏｄ ９９：２７１２）、Ｇ１９−４モノクローナル抗体（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９８６， Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １３６：３９４５）ならびに１４５−２Ｃ１１モノクローナル抗体（Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ． （１９８８） Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４０： ３７６６）が挙げられる。例示的な抗ＴＣＲ抗体は、ＢＭＡ０３１モノクローナル抗体である（Ｂｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２９：１７５−１８８）。
いくつかの実施形態では、結合ドメインは、目的の標的に特異的なＶＨおよびＶＬ領域を含む単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である。ある実施形態では、ＶＨおよびＶＬ領域は、ヒトである。
ある実施形態では、ＰＳＭＡ結合ドメインは、配列番号１９、２１、３０、３１、３４または３５のｓｃＦｖのアミノ酸配列を含むかまたは、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％同一のｓｃＦｖである。
関連実施形態では、ＰＳＭＡ結合ドメインは、軽鎖可変領域（ＶＬ）（例えば、配列番号２３）または重鎖可変領域（ＶＨ）（例えば、配列番号２５または配列番号２７）のアミノ酸配列、または両方を含むかまたは、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、または１００％同一の配列である。
さらなる実施形態では、各ＣＤＲは、目的の標的（例えば、ＰＳＭＡ）に特異的結合するモノクローナル抗体またはその断片もしくは誘導体由来と比較して１つ、２つ、または３つ以下の置換、挿入または欠失を含む。
ＣＤ３εに特異的結合する第２結合ドメインを含むＰＳＭＡ結合タンパク質のいくつかの実施形態では、第２結合ドメインは、ＣＲＩＳ−７またはＨｕＭ２９１モノクローナル抗体とＣＤ３ε結合において競合する。あるバリエーションでは、ＣＤ３結合ドメインは、ＣＲＩＳ−７またはＨｕＭ２９１モノクローナル抗体に由来する免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）および免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）を含む（例えば、第２結合ドメインのＶＬおよびＶＨは、モノクローナル抗体の軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲをそれぞれ含むヒト化可変領域であることができる）。例えば、ＣＲＩＳ−７に由来するＶＬおよびＶＨ領域は、（ａ）配列番号４７の残基１３９〜２４５で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域ならびに配列番号４７の残基１〜１２２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域、ならびに（ｂ）配列番号７８の残基６３４〜７４０で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＬ領域、ならびに配列番号７８の残基４９６〜６１６で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％もしくは１００％同一のアミノ酸配列を含むＶＨ領域から選択できる。
ある実施形態では、本明細書に開示の結合ドメインＶＬおよび／またはＶＨ領域は、既知のモノクローナル抗体（例えば、１０７−１Ａ４、ＣＲＩＳ−７、またはＨｕＭ２９１）のＶＬおよび／またはＶＨに由来し、既知のモノクローナル抗体のＶＬおよび／またはＶＨと比較して約１つまたは複数の（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）挿入、約１つまたは複数の（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）欠失、約１つまたは複数の（例えば、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０）アミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換）、または上記変化の組み合わせを含む。各ＣＤＲが変化を含まないかまたは最大１つ、２つ、または３つの変化を含み、修飾ＶＬおよび／またはＶＨ領域を含む結合ドメインを提供し、依然として野生型結合ドメインに類似の親和性でその標的と特異的結合することができる場合、挿入（１つまたは複数）、欠失（１つまたは複数）または置換（１つまたは複数）は、ＶＬおよび／またはＶＨ領域内（本領域のアミノまたはカルボキシル末端または両端を含む）の任意の箇所であることができる。
一部のバリエーションでは、結合ドメインは、ペプチドリンカーによって結合する免疫グロブリンＶＬおよびＶＨ領域を含む単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。ＶＬおよびＶＨ領域に結合するためのペプチドリンカーの使用は、当該技術分野において周知であり、大量の刊行物がこの特定の分野に存在する。広範囲に使用されるペプチドリンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒアミノ酸配列の３反復（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３）（配列番号１５２）からなる１５ｍｅｒである。他のリンカーも使用されており、ファージディスプレイ技術ならびに選択的感染性ファージ技術が適切なリンカー配列の多様化するおよび選択に使用されている（Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１， １５６８２−１５６８６， １９９６； Ｈｅｎｎｅｃｋｅ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ． １１， ４０５−４１０， １９９８）。ある実施形態では、ＶＬおよびＶＨ領域は、式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、式中ｎ＝１〜５（配列番号１６５）を含むアミノ酸配列を有するペプチドリンカーによって結合する。他の適切なリンカーは、無作為変異法を介した単純リンカー（例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ）の至適化によって得ることができる。
ある実施形態では、結合ドメインは、ヒト化免疫グロブリンＶＬおよび／またはＶＨ領域を含む。ヒト化免疫グロブリンＶＬおよびＶＨ領域技術は、当該技術分野において知られており、例えば、米国特許出願第２００６／０１５３８３７号に論じられている。
「ヒト化」は、元の分子の抗原結合特性を完全に保持する免疫原性の低い抗体に至ることが予期される。元の抗体のすべての抗原結合特性を保持するために、その抗原結合部位構造は「ヒト化」版で再産生されるべきである。これは、重要なフレームワーク残基を保持するかまたは保持しないヒト可変フレームワークドメインおよび定常領域上に非ヒトＣＤＲのみグラフトすることによって（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）； Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３９ （１９８８））または（リガンド結合特性を保持するための）完全非ヒト可変ドメインの再結合によって、ただし（抗原性を低減するために）露出残基の慎重な置換を介してヒト様表面でそれらを「覆う」ことによって（Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８：４８９ （１９９１））達成できる。
本質的に、ＣＤＲグラフトによるヒト化は、ヒト可変領域フレームワークおよびヒト定常領域上の非ヒト抗体ＣＤＲのみの再結合に関与する。理論的に、これは、免疫原性を実質的に低減または除去するべきである（アロタイプまたはイディオタイプ差が存在する場合を除く）。しかしながら、元の抗体の一部フレームワーク残基も保持する必要があり得ることが報告されている（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３ （１９８８）； Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８６：１０，０２９ （１９８９））。
保持する必要があるフレームワーク残基は、コンピュータモデル化により同一性に従う。あるいは、重要なフレームワーク残基は、既知の抗原結合部位構造の比較によって潜在的に同定できる（Ｐａｄｌａｎ， Ｍｏｌｅｃ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， ３１（３）：１６９−２１７ （１９９４）、参照によって本明細書に組み込まれる）。
抗原結合に潜在的に影響を及ぼす残基は、数群に分類される。第１群は、抗原部位表面と連続的な残基を含み、したがって、抗原と直接接触させることができる。これらの残基は、アミノ末端残基およびＣＤＲ隣接部を含む。第２群は、抗体のＣＤＲまたは別のペプチド鎖に接触することによってＣＤＲの構造または相対的アライメントを改変し得る残基を含む。第３群は、可変ドメインの構造的完全性に影響し得る埋没した側鎖を有するアミノ酸を含む。これらの群の残基は、通常、同位置に見られるが（上記Ｐａｄｌａｎ， １９９４）、同定されるそれらの位置は番号付け系に応じて異なり得る（Ｋａｂ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ， ５ｔｈ ｅｄ．， Ｐｕｂ． Ｎｏ． ９１−３２４２， Ｕ．Ｓ． Ｄｅｐｔ． Ｈｅａｌｔｈ ＆ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， ＮＩＨ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， Ｍｄ．， １９９１を参照されたい）。
本明細書に記載の実施形態は、ＳＭＩＰ、ＳＣＯＲＰＩＯＮ、およびインターセプター分子のヒト化に関与し、抗体に関与しないが、当該技術分野におけるヒト化抗体に関する知識は本発明によるポリペプチドに適応可能である。
Ｂ．ヒンジ領域
ある実施形態では、ヒンジは、野生型ヒト免疫グロブリンのヒンジ領域である。ある他の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸残基を、融合タンパク質構築物設計の一部として野生型免疫グロブリンのヒンジ領域のアミノまたはカルボキシル末端に追加することができる。例えば、ヒンジアミノ末端への追加の連結アミノ酸残基は「ＲＴ」、「ＲＳＳ」、「ＴＧ」、または「Ｔ」であることもでき、ヒンジカルボキシル末端は「ＳＧ」であることもでき、ヒンジ欠失は、カルボキシル末端で追加された「ＳＧ」を有するΔＰ等、添加と組み合わせることもできる。
ある実施形態では、ヒンジは、野生型免疫グロブリンのヒンジ領域内の１つまたは複数のシステイン残基が１つまたは複数の他のアミノ酸残基（例えば、セリンまたはアラニン）と置換された改変免疫グロブリンヒンジである。
例示的な改変免疫グロブリンヒンジとしては、１つ、２つまたは３つの異なるアミノ酸残基（例えば、セリンまたはアラニン）によって置換された野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジに見られる１つ、２つまたは３つのシステイン残基を有する免疫グロブリンヒトＩｇＧ１ヒンジ領域が挙げられる。改変免疫グロブリンヒンジは、別のアミノ酸（例えば、セリンまたはアラニン）と置換されたプロリンをさらに有することができる。例えば、上記の改変ヒトＩｇＧ１ヒンジは、別のアミノ酸残基（例えば、セリン、アラニン）によって置換された野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域の３つのシステインに対するカルボキシル末端に位置するプロリンをさらに有することができる。１つの実施形態では、核ヒンジ領域のプロリンは置換されていない。
ある実施形態では、ヒンジポリペプチドは、野生型ヒトＩｇＧ１ヒンジ、野生型ヒトＩｇＧ２ヒンジ、または野生型ヒトＩｇＧ４ヒンジ等の野生型免疫グロブリンのヒンジ領域を含むかまたは、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一の配列である。
さらなる実施形態では、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドに存在するヒンジは、免疫グロブリンヒンジに基づかないかまたは由来しない（すなわち、野生型免疫グロブリンヒンジまたは改変免疫グロブリンヒンジではない）ヒンジであり得る。かかるヒンジ例としては、膜貫通型タンパク質のインタードメイン領域または２型Ｃ−レクチンの軸領域に由来する約５〜約１５０個のアミノ酸ペプチド、例えば、約８〜２５アミノ酸ペプチドおよび約７〜１８アミノ酸ペプチドが挙げられる。
ある実施形態では、インタードメインまたは軸領域ヒンジは、７〜１８アミノ酸を有し、αらせん状に巻いた巻き構造を形成することができる。ある実施形態では、インタードメインまたは軸領域ヒンジは、０、１、２、３、または４システインを含む。例示的なインタードメインまたは軸領域ヒンジは、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ９４、ＮＫＧ２ＡおよびＮＫＧ２Ｄ軸領域由来の１０〜１５０個のアミノ酸断片等のインタードメインまたは軸領域のペプチド断片である。
ある実施形態では、ヒンジ配列は、約５〜１５０個のアミノ酸、５〜１０個のアミノ酸、１０〜２０個のアミノ酸、２０〜３０個のアミノ酸、３０〜４０個のアミノ酸、４０〜５０個のアミノ酸、５０〜６０個のアミノ酸、５〜６０個のアミノ酸、５〜４０個のアミノ酸、８〜２０個のアミノ酸、または１０〜１５アミノ酸を有する。ヒンジは、主に可塑性であることができるが、より硬い特徴を提供することも、最小のβシート構造を有する主にαらせん状構造を含むこともできる。ヒンジの長さまたは配列は、ヒンジが直接または間接的に（ヘテロ二量体化ドメイン等の別の領域またはドメインを介して）接続した結合ドメインの結合親和性、ならびにヒンジが直接または間接的に接続したＦｃ領域部分の１つもしくは複数の活性に影響を及ぼすことができる。
ある実施形態では、ヒンジ配列は、血漿および血清中で安定し、タンパク質分解切断に耐性である。ＩｇＧ１上ヒンジ領域内第１リジンは、タンパク質分解切断を最小限に抑えるように変異していることができる、例えば、リジンは、メチオニン、トレオニン、アラニンまたはグリシンと置換されることができるか、またが欠失していることができる。
本発明のいくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、第２ポリペプチド鎖を有するヘテロ二量体を形成可能であり、（ａ）免疫グロブリン定常領域に対するアミノ末端近位（例えば、免疫グロブリン定常領域がＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むアミノ末端〜ＣＨ２ドメイン、または免疫グロブリン副領域がＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含むアミノ末端〜ＣＨ３ドメイン）で、（ｂ）結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）と免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン間に介入されてそれらを接続し、（ｃ）（例えば、免疫グロブリン定常領域がＣＨ２およびＣＨ３ドメインまたはＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含む）免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインと免疫グロブリン定常領域間に介入されてそれらを接続し、（ｄ）免疫グロブリン定常領域と結合ドメイン間に介入されてそれらを接続し、（ｅ）ポリペプチド鎖のアミノ末端にあるか、または（Ｆ）ポリペプチド鎖のカルボキシル末端にあるヒンジ領域を含む。本明細書に記載のヒンジ領域を含むポリペプチド鎖は、異なるポリペプチド鎖と結合して本明細書に提供されるヘテロ二量体タンパク質を形成可能であり、形成されたヘテロ二量体はその標的特異性またはその特異的な標的結合親和性を保持する結合ドメインを含む。
ある実施形態では、別のポリペプチド鎖とヘテロ二量体を形成するポリペプチドに存在するヒンジは、野生型免疫グロブリンのヒンジ領域またはその改変免疫グロブリンのヒンジ領域等の免疫グロブリンヒンジであることができる。ある実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質の一方のポリペプチド鎖のヒンジは、ヘテロ二量体の他方のポリペプチド鎖の相当するヒンジと同一である。ある他の実施形態では、ある鎖のヒンジは、他鎖と（長さまたは配列が）異なる。異なる鎖中の異なるヒンジに、ヒンジが接続している結合ドメインの結合親和性の異なる操作をさせ、ヘテロ二量体がある結合ドメイン標的に対して他の結合ドメイン標的より選択的に結合可能であるようにする。例えば、ある実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質は、片鎖にＣＤ３またはＴＣＲ結合ドメインを有し、他方鎖にＰＳＭＡ結合ドメインを有する。２鎖中に２つの異なるヒンジを有することは、ヘテロ二量体をまずＰＳＭＡに結合させて、次いでＣＤ３または他のＴＣＲ成分に結合させ得る。したがって、ヘテロ二量体は、ＣＤ３＋Ｔ細胞をＰＳＭＡ発現細胞（例えば、ＰＳＭＡ発現腫瘍細胞）に補充し得、これは順に、ＰＳＭＡ発現細胞を損傷または破壊し得る。
本発明による使用に適した例示的なヒンジ領域を下表１および２に示す。追加の例示的なヒンジ領域は、ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号２４１〜２４４、６０１、７８、７６３〜７９１、２２８、３７９〜４３４、６１８〜７４９（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）で表される。
Figure 2014518615
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Ｃ．免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン
ある実施形態では、本発明のＰＳＭＡ結合ポリペプチドまたはタンパク質は、「免疫グロブリン二量体化ドメイン」または「免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン」を含むことができる。
「免疫グロブリン二量体化ドメイン」または「免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン」とは、本明細書で使用する場合、別のポリペプチド鎖の異なる免疫グロブリンドメインと選択的に相互作用するかまたは結合するポリペプチド鎖の免疫グロブリンドメインを指し、異なる免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインの相互作用は、第１および第２ポリペプチド鎖のヘテロ二量体化に実質的に関与するかまたは効率的に促進する（すなわち、「ヘテロ二量体」または「ヘテロ二量体タンパク質」とも呼ばれる２つの異なるポリペプチド鎖間の二量体形成）。第１ポリペプチド鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインおよび／または第２ポリペプチド鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインの不在下で第１および第２ポリペプチド鎖間の二量体化に統計的有意な低下がある場合、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン間の相互作用は、第１および第２ポリペプチド鎖のヘテロ二量体化に「実質的に関与するかまたは効率的に促進する」。ある実施形態では、第１および第２ポリペプチド鎖が共発現する場合、互いに少なくとも６０％、少なくとも約６０％〜約７０％、少なくとも約７０％〜約８０％、少なくとも８０％〜約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の第１および第２ポリペプチド鎖形態ヘテロ二量体である。代表的な免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとしては、本明細書に提供される野生型免疫グロブリンＣＨ１およびＣＬドメインならびに改変（または変異）免疫グロブリンＣＨ１およびＣＬドメインを含む免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、免疫グロブリンＣＬ１ドメイン（例えば、ＣκまたはＣλアイソタイプ）、またはその誘導体が挙げられる。
二量体化／ヘテロ二量体化ドメインは、片方または両ポリペプチド鎖が結合ドメインを含む２つの非同一ポリペプチド鎖からヘテロ二量体を形成することが所望される場合に使用することができる。ある実施形態では、本明細書に記載のあるヘテロ二量体の一方のポリペプチド鎖メンバは、結合ドメインを含まない。上に示したように、本明細書に開示のヘテロ二量体タンパク質は、各ポリペプチド鎖中に免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを含む。ヘテロ二量体のポリペプチド鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは互いに異なるため、両鎖のヘテロ二量体化を促進して片鎖のホモ二量体化を最小限に抑えるように異なって修飾することができる。実施例に示すように、本明細書に提供される免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、異なるポリペプチド間の効率的なヘテロ二量体化を可能とし、得られたヘテロ二量体タンパク質の精製を促進する。
本明細書に提供されるように、本明細書の開示によって２つの異なる単鎖ポリペプチド（例えば、一方は短く、一方は長い）のヘテロ二量体化を促進する上で有用な免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとしては、免疫グロブリンＣＨ１およびＣＬドメイン、例えば、ヒトＣＨ１およびＣＬドメインが挙げられる。ある実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、野生型ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ ＣＨ１ドメイン等の野生型ＣＨ１ドメインである。さらなる実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号１１４、１８６〜１９２および１９４（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）にそれぞれ説明される野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ ＣＨ１ドメインである。ある実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号１１４（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）で表される野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ１ドメインである。
さらなる実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、改変ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ ＣＨ１ドメイン等の改変免疫グロブリンＣＨ１ドメインである。ある実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、改変ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ ＣＨ１ドメインである。なおさらなる実施形態では、野生型免疫グロブリンＣＬドメイン（例えば、ヒトＣＬ）とのジスルフィド結合形成に関与する野生型ＣＨ１ドメイン（例えば、ヒトＣＨ１）のシステイン残基は、改変ＣＨ１ドメインと野生型ＣＬドメイン間でジスルフィド結合が形成されないように、改変免疫グロブリンＣＨ１ドメイン中で欠失しているかまたは置換されている。
ある実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、野生型Ｃκドメインまたは野生型Ｃλドメイン等の野生型ＣＬドメインである。ある実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号１１２および１１３（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）にそれぞれ説明される野生型ヒトＣκまたはヒトＣλドメインである。さらなる実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、改変ＣκまたはＣλドメイン、例えば、改変ヒトＣκまたはヒトＣλドメイン等の改変免疫グロブリンＣＬドメインである。
ある実施形態では、野生型免疫グロブリンＣＨ１ドメイン（例えば、ヒトＣＨ１）とのジスルフィド結合形成に関与する野生型ＣＬドメイン（例えば、ヒトＣＬ）のシステイン残基は、改変免疫グロブリンＣＬドメイン中で欠失しているかまたは置換されている。かかる改変ＣＬドメインは、それらのアミノ末端にアミノ酸欠失をさらに含むことができる。例示的なＣκドメインは、野生型ヒトＣｋドメインの第１アルギニンおよび最終システインが共に欠失しているＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号１４１（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）で表される。ある実施形態では、野生型ヒトＣｋドメインから欠失した第１アルギニンは、そのカルボキシル末端にアルギニンを有し、改変Ｃｋドメインのアミノ末端を別のドメイン（例えば、免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む副領域等の免疫グロブリン副領域）と連結するリンカーによって提供できるため、改変Ｃｋドメイン中で野生型ヒトＣｋドメインの最終システインのみ欠失している。例示的なＣλドメインは、野生型ヒトＣλドメインの第１アルギニンが欠失し、ＣＨ１ドメイン中のシステインとのジスルフィド結合形成に関与するシステインがセリンによって置換されているＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号１４０（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）で表される。
さらなる実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、野生型Ｃκドメインと比較して、Ｃκ−Ｃκ界面で鎖内水素結合ネットワーク形成に関与し得る位置で１つまたは複数のアミノ酸置換を含む改変Ｃκドメインである。例えば、ある実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、異なるアミノ酸と置換されるＮ２９、Ｎ３０、Ｑ５２、Ｖ５５、Ｔ５６、Ｓ６８またはＴ７０位に１つまたは複数のアミノ酸を有する改変ヒトＣκドメインである。アミノ酸番号は、ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号１４１（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）で表される改変ヒトＣκ配列中のそれらの位置に基づく。ある実施形態では、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、Ｎ２９、Ｎ３０、Ｖ５５、またはＴ７０位に１つ、２つ、３つまたは４つのアミノ酸置換を有する改変ヒトＣκドメインである。上記位置で置換基として使用されるアミノ酸は、アラニンであることも、アルギニン、トリプトファン、チロシン、グルタミン酸塩、グルタミン、またはリジン等の大量側鎖部分を有するアミノ酸残基であることもできる。野生型ヒトＣｋ配列のアミノ酸残基を上記位置（例えば、Ｎ３０）で置換するために使用することができる追加のアミノ酸残基としては、アスパラギン酸塩、メチオニン、セリンおよびフェニルアラニンが挙げられる。例示的な改変ヒトＣκドメインは、ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号１４２〜１７８（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）で表される。改変ヒトＣκドメインは、ＣＨ１ドメインとのヘテロ二量体化を促進するが、別のＣκドメインとのホモ二量体化を最小限に抑えるものである。代表的な改変ヒトＣκドメインは、ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号１６０（Ｎ２９Ｗ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ａ）、１６１（Ｎ２９Ｙ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ａ）、２０２（Ｔ７０Ｅ Ｎ２９Ａ Ｎ３０Ａ Ｖ５５Ａ）， １６７ （Ｎ３０Ｒ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ａ）， １６８ （Ｎ３０Ｋ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ａ）， １７０ （Ｎ３０Ｅ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ａ）， １７２ （Ｖ５５Ｒ Ｎ２９Ａ Ｎ３０Ａ）， １７５ （Ｎ２９Ｗ Ｎ３０Ｙ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ｅ）， １７６ （Ｎ２９Ｙ Ｎ３０Ｙ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ｅ）， １７７ （Ｎ３０Ｅ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ｅ）， １７８ （Ｎ３０Ｙ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ｅ）， ８３８ （Ｎ３０Ｄ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ｅ）， ８３９（Ｎ３０Ｍ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ｅ）、８４０（Ｎ３０Ｓ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ｅ）、および８４１（Ｎ３０Ｆ Ｖ５５Ａ Ｔ７０Ｅ）（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）で表される。
ある実施形態では、本明細書に記載のＣｋドメイン変異に加えてまたは代替的に、ポリペプチドヘテロ二量体の両免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン（すなわち、免疫グロブリンＣＨ１およびＣＬドメイン）は、得られた免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインが変異部位でアミノ酸残基間に塩架橋（すなわち、イオン性相互作用）を形成するように変異を有する。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、変異Ｃｋドメインと組み合わせた変異ＣＨ１ドメインであることができる。変異ＣＨ１ドメイン中、野生型ヒトＣＨ１ドメインの６８位のバリン（Ｖ６８）は、負電荷を有するアミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸塩またはグルタミン酸塩）によって置換されているが、第１アルギニンおよび最終システインが欠失している変異ヒトＣｋドメインの２９位のロイシン（Ｌ２９）は、正電荷を有するアミノ酸残基（例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジン）によって置換されている。得られた変異ＣＨ１ドメインの負電荷を有するアミノ酸残基と得られた変異Ｃｋドメインの正電荷を有するアミノ酸残基間の電荷−電荷相互作用は塩架橋を形成し、これは変異ＣＨ１およびＣｋドメイン間のヘテロ二量体界面を安定させる。あるいは、野生型ＣＨ１のＶ６８は、正電荷を有するアミノ酸残基によって置換されることができるが、第１アルギニンおよび最終システインが欠失している変異ヒトＣｋドメインのＬ２９は、負電荷を有するアミノ酸残基によって置換されることができる。Ｖ６８が負電荷または正電荷のいずれかを有するアミノ酸によって置換されている例示的な変異ＣＨ１配列は、ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号８４４および８４５（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）で表される。Ｌ２９が負電荷または正電荷のいずれかを有するアミノ酸によって置換されている例示的な変異Ｃｋ配列は、ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号８４２および８４３（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）で表される。
ＣＨ１ドメインのＶ６８およびＣｋドメインのＬ２９中の変異に加えてまたは代替的に、ヒトＣＨ１ドメインのＶ６８およびヒトＣｋドメインのＬ２９以外の位置は、逆電荷を有するアミノ酸と置換されて、アミノ酸間でイオン性相互作用を生じることができる。かかる位置は、無作為変異法、ＣＨ１−Ｃｋ対の結晶構造分析等の任意の適切な方法により同定し、一連の基準（例えば、イオン性相互作用に関与する傾向、潜在的パートナー残基への接近等）を用いてＣＨ１−Ｃｋ界面でアミノ酸残基を同定し、ＣＨ１−Ｃｋ界面でアミノ酸残基間の適切な位置をさらに同定することができる。
ある実施形態では、本明細書に開示のポリペプチドヘテロ二量体は、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを１対のみ含む。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体の第１鎖は、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとしてＣＨ１ドメインを含むことができ、第２鎖は、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとしてＣＬドメイン（例えば、ＣκまたはＣλ）を含むことができる。あるいは、第１鎖は、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとしてＣＬドメイン（例えば、ＣκまたはＣλ）を含むことができ、第２鎖は、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインとしてＣＨ１ドメインを含むことができる。本明細書に説明する第１および第２鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、結合して本開示のヘテロ二量体タンパク質を形成することが可能である。
ある他の実施形態では、本明細書に開示のヘテロ二量体タンパク質は、免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインを２対有することができる。例えば、ヘテロ二量体の第１鎖は、２つのＣＨ１ドメインを含むことができ、第２鎖は、第１鎖中の２つのＣＨ１ドメインに関する２つのＣＬドメインを有することができる。あるいは、第１鎖は、２つのＣＬドメインを含むことができ、第２鎖は、第１鎖中の２つのＣＬドメインに関する２つのＣＨ１ドメインを有することができる。ある実施形態では、第１ポリペプチド鎖は、ＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインを含み、第２ポリペプチド鎖は、第１ポリペプチド鎖のＣＨ１ドメインおよびＣＬドメインにそれぞれ結合するＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインを含む。
ヘテロ二量体タンパク質が一方のヘテロ二量体化対（すなわち、各鎖の１つの免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン）のみ含む実施形態では、各鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、該鎖の免疫グロブリン定常領域に対するアミノ末端に位置することができる。あるいは、各鎖の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、該鎖の免疫グロブリン定常領域に対するカルボキシル末端に位置することができる。
ヘテロ二量体タンパク質が２つのヘテロ二量体化対（すなわち、各鎖の２つの免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン）を含む実施形態では、各鎖の両免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインが、該鎖の免疫グロブリン定常領域に対するアミノ末端に位置することができる。あるいは、各鎖の両免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインが、該鎖の免疫グロブリン定常領域に対するカルボキシル末端に位置することができる。さらなる実施形態では、各鎖の１つの免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、該鎖の免疫グロブリン定常領域に対するアミノ末端に位置することができ、各鎖の他の免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインは、該鎖の免疫グロブリン定常領域に対するカルボキシル末端に位置することができる。すなわち、それらの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、各鎖の２つの免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン間に介入する。
Ｄ．免疫グロブリン定常領域
本明細書において示されるように、ある実施形態では、本明細書に開示のＰＳＭＡ結合ポリペプチド（例えば、ＳＭＩＰ、ＰＩＭＳ、ＳＣＯＲＰＩＯＮ、およびインターセプター分子）は各ポリペプチド鎖中に免疫グロブリン定常領域（定常領域とも呼ばれる）を含む。免疫グロブリン定常領域の含有によって、対象に投与後、循環由来の２つのＰＳＭＡ結合ポリペプチド鎖から形成されたホモ二量体およびヘテロ二量体タンパク質のクリアランスを緩慢化する。変異または他の改変によって、免疫グロブリン定常領域は、当該技術分野において知られており本明細書に記載のように、二量体ポリペプチドエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、補体固定、およびＦｃ受容体への結合）の調節をさらに比較的容易にすることができ、処置中の疾患に応じて増大することも低減することもできる。ある実施形態では、本明細書に開示のポリペプチドホモ二量体およびヘテロ二量体のポリペプチド鎖の片方または両方の免疫グロブリン定常領域は、１つまたは複数のこれらのエフェクター機能の媒介が可能である。他の実施形態では、１つまたは複数のこれらのエフェクター機能は、相当する野生型免疫グロブリン定常領域と比較して、本明細書に開示のポリペプチドホモ二量体およびヘテロ二量体のポリペプチド鎖の片方または両方の免疫グロブリン定常領域内で低減または欠損する。例えば、（例えば、ＣＤ３結合ドメインの含有を介して）ＲＴＣＣを引き出すように設計された二量体ＰＳＭＡ結合ポリペプチドにおいて、免疫グロブリン定常領域は、好ましくは、相当する野生型免疫グロブリン定常領域と比較して、エフェクター機能が低減しているか有さない。
本明細書に開示のＰＳＭＡ結合ポリペプチドに存在する免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、もしくは任意のそれらの組み合わせの一部またはすべてを含んでもそれらに由来してもよい。例えば、免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３の両ドメイン、ＣＨ３およびＣＨ４の両ドメイン、２つのＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメイン、２つのＣＨ４ドメイン、およびＣＨ２ドメインおよび一部のＣＨ３ドメインを含むことができる。
本明細書に開示のＰＳＭＡ結合ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域を形成することができるＣＨ２ドメインは、ある免疫グロブリンクラスもしくはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＤ）由来および様々な種（ヒト、マウス、ラット、および他の哺乳動物等）由来の野生型免疫グロブリンＣＨ２ドメインであることもその改変免疫グロブリンＣＨ２ドメインであることもできる。
ある実施形態では、ＣＨ２ドメインは、例えばＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号１１５、１９９〜２０１および１９５〜１９７（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）にそれぞれ説明されるヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、またはＩｇＤの野生型ＣＨ２ドメイン等の野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ２ドメインである。ある実施形態では、ＣＨ２ドメインは、ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号１１５（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）で表される野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインである。
ある実施形態では、ＣＨ２ドメインは、２９７位のアスパラギンでアミノ酸置換（例えば、アスパラギンからアラニンへの置換）を含む改変免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン）である。かかるアミノ酸置換は、この部位でグリコシル化を低減するかまたは除き、ＦｃγＲおよびＣ１ｑへの効率的Ｆｃ結合を無効にする。２９７位でＡｓｎをＡｌａと置換した改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン配列は、ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号３２４で表される（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）。
ある実施形態では、ＣＨ２ドメインは、２３４〜２３８位に少なくとも１つの置換または欠失を含む改変免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン）である。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、２３４位、２３５位、２３６位、２３７位もしくは２３８位、２３４位および２３５位、２３４位および２３６位、２３４位および２３７位、２３４位および２３８位、２３４〜２３６位、２３４位、２３５位および２３７位、２３４位、２３６位および２３８位、２３４位、２３５位、２３７位、および２３８位、２３６〜２３８位、または２３４〜２３８位の２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸の他の任意の組み合わせの置換を含むことができる。加えてまたは代替的に、改変ＣＨ２領域は、２３４〜２３８位、例えば、２３６位または２３７位の１つの１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つの）アミノ酸欠失を含み、他の位置は置換されていることができる。上記変異（１つまたは複数）は、改変ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドヘテロ二量体の抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性またはＦｃ受容体結合能を低減または除去する。ある実施形態では、２３４〜２３８位の１つまたは複数位置のアミノ酸残基は、１つまたは複数のアラニン残基と置換されている。さらなる実施形態では、２３４〜２３８位のアミノ酸残基の１つのみが欠失しているが、２３４〜２３８位の残りのアミノ酸の１つまたは複数は、別のアミノ酸（例えば、アラニンまたはセリン）と置換されることができる。
ある他の実施形態では、ＣＨ２ドメインは、２５３位、３１０位、３１８位、３２０位、３２２位、および３３１位のアミノ酸置換を１つまたは複数含む改変免疫グロブリンＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン）である。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、２５３位、３１０位、３１８位、３２０位、３２２位、もしくは３３１位、３１８位および３２０位、３１８位および３２２位、３１８位、３２０位および３２２位、または２５３位、３１０位、３１８位、３２０位、３２２位、および３３１位の２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つのアミノ酸の他の任意の組み合わせの置換を含むことができる。上記変異（１つまたは複数）は、改変ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドヘテロ二量体の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を低減または除去する。
ある他の実施形態では、２９７位のアミノ酸置換に加えて、改変ＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン）は、２３４〜２３８位に１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つの）追加の置換をさらに含むことができる。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、２９７位に加えて、２３４位および２９７位、２３４位、２３５位、および２９７位、２３４位、２３６位および２９７位、２３４〜２３６位および２９７位、２３４位、２３５位、２３７位および２９７位、２３４位、２３６位、２３８位および２９７位、２３４位、２３５位、２３７位、２３８位および２９７位、２３６〜２３８位および２９７位、または２３４〜２３８位の２つ、３つ、４つまたは５つのアミノ酸の任意の組み合わせの置換を含むことができる。加えてまたは代替的に、改変ＣＨ２領域は、１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つまたは５つの）アミノ酸欠失、２３６位または２３７位等の２３４〜２３８位を含むことができる。追加の変異（１つまたは複数）は、改変ＣＨ２ドメインを含むポリペプチドヘテロ二量体の抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性またはＦｃ受容体結合能を低減または除去する。ある実施形態では、２３４〜２３８位の１つまたは複数位置のアミノ酸残基は、１つまたは複数のアラニン残基と置換されている。さらなる実施形態では、２３４〜２３８位のアミノ酸残基の１つのみが欠失しているが、２３４〜２３８位の残りのアミノ酸の１つまたは複数は、別のアミノ酸（例えば、アラニンまたはセリン）と置換されることができる。
ある実施形態では、２３４〜２３８位の１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、または５つの）アミノ酸置換に加えて、本明細書に開示の融合タンパク質中の変異ＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン）は、補体固定（例えば、Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、またはＰ３３１位）に関与する１つまたは複数の位置に１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの）追加のアミノ酸置換（例えば、アラニンとの置換）を含むことができる。変異免疫グロブリンＣＨ２領域例としては、２３４位、２３５位、２３７位（存在する場合）、３１８位、３２０位および３２２位にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびマウスＩｇＧ２ａ ＣＨ２領域を含む。例示的な変異免疫グロブリンＣＨ２領域は、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、およびＫ３２２にアラニン置換を有するマウスＩＧＨＧ２ｃ ＣＨ２領域である。
なおさらなる実施形態では、２９７位のアミノ酸置換ならびに２３４〜２３８位の追加の欠失（１つまたは複数）もしくは置換（１つまたは複数）に加えて、改変ＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン）は、２５３位、３１０位、３１８位、３２０位、３２２位、および３３１位に１つまたは複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つの）追加の置換をさらに含むことができる。例えば、免疫グロブリンＣＨ２領域は、（１）２９７位の置換、（２）２３４〜２３８位の１つもしくは複数の置換もしくは欠失またはそれらの組み合わせ、ならびにＥ３１８、Ｋ３２０およびＫ３２２位の１つ、２つ、３つの置換等のＩ２５３、Ｈ３１０、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、およびＰ３３１位の１つもしくは複数の（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの）アミノ酸置換を含むことができる。上記位置のアミノ酸は、アラニンまたはセリンによって置換されることができる。
ある実施形態では、免疫グロブリンＣＨ２領域ポリペプチドは、以下（ｉ）２９７位のアスパラギンのアミノ酸置換ならびに２３４位、２３５位、２３６位もしくは２３７位の１アミノ酸置換；（ｉｉ）２９７位のアスパラギンのアミノ酸置換および２３４〜２３７位の２つのアミノ酸置換；（ｉｉｉ）２９７位のアスパラギンのアミノ酸置換および２３４〜２３７位のうち３つのアミノ酸置換；（ｉｖ）２９７位のアスパラギンのアミノ酸置換、２３４位、２３５位および２３７位のアミノ酸置換、および２３６位のアミノ酸欠失；（ｖ）２３４〜２３７位のうち３つのアミノ酸置換、ならびに３１８位、３２０位および３２２位のアミノ酸置換；または（ｖｉ）２３４〜２３７位のうち３つのアミノ酸置換、２３６位のアミノ酸欠失、ならびに３１８位、３２０位および３２２位のアミノ酸置換を含む。
２９７位のアスパラギンでアミノ酸置換を有する例示的な改変免疫グロブリンＣＨ２領域としては、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７およびＮ２９７にアラニン置換を有し、Ｇ２３６で欠失しているヒトＩｇＧ１ ＣＨ２領域（ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号３２５、前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）、Ｖ２３４、Ｇ２３６、およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ２ＣＨ２領域（ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号３２６、前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）、Ｆ２３４、Ｌ２３５、Ｇ２３７およびＮ２９７にアラニン置換を有し、Ｇ２３６で欠失しているヒトＩｇＧ４ ＣＨ２領域（ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号３２２、前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）、Ｆ２３４およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４ ＣＨ２領域（ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号３４３、前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）、Ｌ２３５およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４ ＣＨ２領域（ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号３４４、前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）、Ｇ２３６およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４ ＣＨ２領域（ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号３４５、前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）、およびＧ２３７およびＮ２９７にアラニン置換を有するヒトＩｇＧ４ ＣＨ２領域（ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号３４６、前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
ある実施形態では、上記アミノ酸置換に加えて、改変ＣＨ２領域（例えば、改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン）は、１つまたは複数の追加のアミノ酸置換、上記位置以外の１つまたは複数の位置を含むことができる。かかるアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換であることも非保存的アミノ酸置換であることもできる。例えば、ある実施形態では、Ｐ２３３は、改変ＩｇＧ２ＣＨ２領域内のＥ２３３への変異であることができる（例えば、ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号３２６を参照されたい、前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）。加えてまたは代替的に、ある実施形態では、改変ＣＨ２領域は、１つまたは複数のアミノ酸挿入、欠失、または両方を含むことができる。挿入（１つまたは複数）、欠失（１つまたは複数）または置換（１つまたは複数）は、ヒンジを介したＣＨ２領域と別の領域（例えば、結合ドメインまたは免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン）との連結に起因する野生型免疫グロブリンＣＨ２領域のＮまたはＣ末端等の免疫グロブリンＣＨ２領域内の任意の箇所であることができる。
ある実施形態では、本明細書に開示のポリペプチド中の改変ＣＨ２領域は、野生型ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４、またはマウスＩｇＧ２ａ（例えば、ＩＧＨＧ２ｃ）のＣＨ２領域等の野生型免疫グロブリンＣＨ２領域を含むかまたは、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一の配列である。
本明細書に開示のＰＳＭＡ結合ポリペプチドの改変免疫グロブリンＣＨ２領域は、様々な種（ヒト、マウス、ラット、および他の哺乳動物等）のＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、およびＩｇＤ等の様々な免疫グロブリンアイソタイプのＣＨ２領域由来であることができる。ある実施形態では、本明細書に開示の融合タンパク質中の改変免疫グロブリンＣＨ２領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４、またはマウスＩｇＧ２ａ（例えば、ＩＧＨＧ２ｃ）のＣＨ２領域由来であることができ、この配列は、ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号１１５、１９９、２０１、および３２０（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）で表される。
ある実施形態では、改変ＣＨ２ドメインは、２３５位、３１８位、３２０位、および３２２位にアラニン置換を有し（すなわち、Ｌ２３５Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０ＡおよびＫ３２２Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン）（ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号５９５、前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）、任意にＮ２９７変異（例えば、アラニンへの置換）を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインである。ある他の実施形態では、改変ＣＨ２ドメインは、２３４位、２３５位、２３７位、３１８位、３２０位および３２２位（すなわち、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｇ２３７Ａ、Ｅ３１８Ａ、Ｋ３２０ＡおよびＫ３２２Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメイン）のアラニン置換（ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号５９６、前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）、ならびに任意にＮ２９７変異（例えば、アラニンへの置換）を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインである。
ある実施形態では、改変ＣＨ２ドメインは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＣＤＣ、補体固定、Ｆｃ受容体結合、または任意のそれらの組み合わせ等の免疫活性を高める当該技術分野において知られている変異を有する改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインである。
本明細書に開示のＰＳＭＡ結合ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域を形成することができるＣＨ３ドメインは、様々な種（ヒト、マウス、ラット、および他の哺乳動物等）のある免疫グロブリンクラスもしくはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ）由来の野生型免疫グロブリンＣＨ３ドメインであることもその改変免疫グロブリンＣＨ３ドメインであることもできる。ある実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号１１６、２０８〜２１０、２０４〜２０７、および２１２（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）にそれぞれ説明されるヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭの野生型ＣＨ３ドメイン等の野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ３ドメインである。ある実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号１１６（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）で表される野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインである。ある実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体の野生型ＣＨ３ドメインに基づくかまたは由来する改変ＣＨ３ドメイン等の改変ヒト免疫グロブリンＣＨ３ドメインである。例えば、改変ＣＨ３ドメインは、Ｈ４３３およびＮ４３４位（位置は、ＥＵ番号付けにより番号付ける）に１つまたは２つの変異を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインであることができる。かかる位置の変異は、補体固定に関与することができる。ある他の実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、Ｆ４０５またはＹ４０７位で１つまたは２つのアミノ酸置換を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインであることができる。かかる位置のアミノ酸は、別のＣＨ３ドメインとの相互作用に関与する。ある実施形態では、改変ＣＨ３ドメインは、最終リジンが欠失した改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインであることができる。この改変ＣＨ３ドメイン配列は、ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号７６１（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）で表される。
ある実施形態では、ポリペプチドヘテロ二量体を形成するＰＳＭＡ結合ポリペプチドは、いわゆる「ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」変異を含むＣＨ３対を含む（Ｍａｒｖｉｎ ａｎｄ Ｚｈｕ， Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ ２６：６４９−５８， ２００５； Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ９：６１７−２１， １９６６を参照されたい）。より具体的には、ＣＨ３／ＣＨ３結合に必要な立体補体が、これら２つのＣＨ３ドメインが互いに対となる偏性となるように、各ポリペプチド鎖の２つのＣＨ３ドメインのそれぞれに変異を導入できる。例えば、ポリペプチドヘテロ二量体の１つの単鎖ポリペプチド中のＣＨ３ドメインは、Ｔ３６６Ｗ変異（小さなアミノ酸を大きなアミノ酸と置換する「ｋｎｏｂ」変異）を含むことができ、ポリペプチドヘテロ二量体の他の単鎖ポリペプチド中のＣＨ３ドメインは、Ｙ４０７Ａ変異（大きなアミノ酸を小さなアミノ酸と置換する「ｈｏｌｅ」変異）を含むことができる。他の例示的なｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ変異としては、（１）あるＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｙ変異および他のＣＨ３ドメイン中のＹ４０７Ｔ、ならびに（２）あるＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｗ変異および他のＣＨ３ドメイン中のＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異が挙げられる。
本明細書に開示のＰＳＭＡ結合ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域を形成することができるＣＨ４ドメインは、ＩｇＥまたはＩｇＭ分子由来の野生型免疫グロブリンＣＨ４ドメインであることもその改変免疫グロブリンＣＨ４ドメインであることもできる。ある実施形態では、ＣＨ４ドメインは、ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号２１３および２１４（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）にそれぞれ説明されるヒトＩｇＥおよびＩｇＭ分子の野生型ＣＨ４ドメイン等の野生型ヒト免疫グロブリンＣＨ４ドメインである。ある実施形態では、ＣＨ４ドメインは、ＩｇＥまたはＩｇＭ Ｆｃ領域に関連することが知られている免疫活性を増大または低減する変異を有するヒトＩｇＥまたはＩｇＭ分子のＣＨ４ドメインに基づくかまたは由来する改変ＣＨ４ドメイン等の改変ヒト免疫グロブリンＣＨ４ドメインである。
ある実施形態では、本明細書に開示のＰＳＭＡ結合ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２、ＣＨ３またはＣＨ４ドメイン（すなわち、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４から選択される複数の定常領域ドメイン）の組み合わせを含む。例えば、免疫グロブリン定常領域は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むこともＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含むこともできる。ある他の実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、２つのＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２ドメインもＣＨ４ドメインも含まないことができる（すなわち、２つ以上のＣＨ３のみ）。免疫グロブリン定常領域を形成する複数の定常領域ドメインは、同一免疫グロブリン分子、または同一クラスもしくはサブクラスの免疫グロブリン分子に基づくことも由来することもできる。ある実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ ＣＨ２ＣＨ３（例えば、ＩｇＧ１ ＣＨ２ＣＨ３、ＩｇＧ２ ＣＨ２ＣＨ３、およびＩｇＧ４ ＣＨ２ＣＨ３）であり、ヒト（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４）ＣＨ２ＣＨ３であることができる。例えば、ある実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、（１）野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン、（２）Ｎ２９７Ａ置換を有するヒトＩｇＧ１ ＣＨ２（すなわち、ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ））および野生型ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３、または（３）ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２（Ｎ２９７Ａ）および最終リジンの欠失した改変ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３を含む。
あるいは、複数の定常領域ドメインは、異なる免疫グロブリン分子、または異なるクラスもしくはサブクラスの免疫グロブリン分子に基づくことも由来することもできる。例えば、ある実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、ヒトＩｇＭ ＣＨ３ドメインおよびヒトＩｇＧ１ ＣＨ３ドメインの両方を含む。免疫グロブリン定常領域を形成する複数の定常領域ドメインは、直接結合されていることも１つまたは複数の（例えば、約２〜１０の）アミノ酸を介して互いに連結することもできる。
例示的な免疫グロブリン定常領域は、ＷＯ２０１１／０９０７６２号の配列番号３０５〜３０９、３２１、３２３、３４１、３４２、および７６２（前記配列は、参照によって本明細書に組み込まれる）で表される。
ある実施形態では、ポリペプチドホモ二量体またはヘテロ二量体の両ＰＳＭＡ結合ポリペプチドの免疫グロブリン定常領域は互いに同一である。ある他の実施形態では、ヘテロ二量体タンパク質の一方のポリペプチド鎖の免疫グロブリン定常領域は、ヘテロ二量体の他方のポリペプチド鎖の免疫グロブリン定常領域と異なる。例えば、ヘテロ二量体タンパク質の一方の免疫グロブリン定常領域は、「ｋｎｏｂ」変異を有するＣＨ３ドメインを含むことができ、ヘテロ二量体タンパク質の他方の免疫グロブリン定常領域は、「ｈｏｌｅ」変異を有するＣＨ３ドメインを含むことができる。
ＩＶ．核酸、宿主細胞、および生成方法
本発明は、本明細書に記載のＰＳＭＡ結合ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）、または本明細書に記載の二量体もしくはヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質の１つもしくは複数のポリペプチド鎖も含む。本発明の核酸は、下表３に掲載されるポリヌクレオチドと実質的に同一である領域を有する核酸を含む。ある実施形態では、本発明による核酸は、表３に掲載されるポリヌクレオチドをコードするポリペプチドと少なくとも８０％、典型的には少なくとも約９０％、より典型的には少なくとも約９５％または少なくとも約９８％同一である。本発明の核酸は、補体核酸も含む。一部の場合、配列は整列時に完全に相補的である（ミスマッチなし）。他の場合、配列中、最大約２０％ミスマッチであることができる。本発明のいくつかの実施形態では、本発明のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質の第１および第２ポリペプチド鎖の両方をコードする核酸が提供される。本明細書に提供される核酸配列は、コドン至適化、縮退配列、サイレント変異、および特に宿主中の発現を至適化する他のＤＮＡ技術を用いて利用することができ、本発明はかかる配列改変を包含する。
所望のポリヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子は、ベクター内に分子を置くことによって繁殖する。プラスミドを含むウイルスおよび非ウイルスベクターが使用される。プラスミドの選択は、繁殖が所望される細胞種および繁殖目的による。あるベクターは、大量の所望のＤＮＡ配列の増幅および作製に有用である。他のベクターは、培養細胞内の発現に適している。さらに、他のベクターは、完全動物またはヒトの細胞内の移動および発現に適している。適切なベクターの選択は、十分に当該技術内である。多くのかかるベクターが市販されている。部分または全長ポリヌクレオチドは、典型的にはＤＮＡリガーゼをベクター中の切断した制限酵素部位に結合させる手段によってベクター内に挿入する。あるいは、所望のヌクレオチド配列は、ｉｎ ｖｉｖｏ相同再組み合わせによって挿入できる。典型的には、これは所望のヌクレオチド配列の側面上のベクターに対して相同領域を結合することによって成し遂げられる。相同領域は、例えば、オリゴヌクレオチド結紮によって、または相同領域および一部の所望のヌクレオチド配列を両方含むプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によって添加する。
発現において、発現カセットまたは系を適用してよい。本明細書に開示されたポリペプチドをコードする核酸を発現するため、発現ベクター中の転写発現を制御する調節配列に使用可能に連結しているポリペプチドをコードする核酸分子を宿主細胞内に導入する。プロモーターおよびエンハンサー等の転写の調節配列に加えて、発現ベクターは、発現ベクターを運ぶ細胞の選択に適した翻訳調節配列およびマーカー遺伝子を含むことができる。本発明のポリヌクレオチドによってコードされる遺伝子生成物は、例えば、バクテリア、酵母菌、昆虫、両生類および哺乳動物系等、任意の好都合な発現系において発現する。発現ベクターにおいて、ポリヌクレオチドをコードするポリペプチドは、所望の発現特性を得る上で適した調節配列に連結している。これらは、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、オペレーター、リプレッサー、および誘導体を含むことができる。プロモーターは、調節されていることも（例えば、ｐＩＮＤベクター導入可能なステロイド由来のプロモーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））かまたは構成的（例えば、ＣＭＶ、ＳＶ４０、伸長因子、またはＬＴＲ配列由来のプロモーター）であることもできる。これらは、ベクター連結のための上記技術を用いて所望のヌクレオチド配列に連結している。当該技術分野において知られている任意の技術を使用することができる。したがって、発現ベクターは、一般には、導入可能または構成的であることができる転写および翻訳開始領域を提供し、コード領域は、転写開始領域、ならびに転写および翻訳終了領域の転写制御下で使用可能に結合している。
発現カセット（「発現単位」）は、例えば、λ、Ｐ１、Ｍ１３等のプラスミド、ＢＡＣ、ＹＡＣ、バクテリオファージ、植物または動物ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベースのベクター、アデノウイルスベクター）等の様々なベクター内に導入でき、ベクターは、通常、発現ベクターを含む細胞選択を得る能力を特徴とする。ベクターは、特にプラスミドまたはウイルスとして、余剰染色体の維持、または宿主染色体内への統合のために提供することができる。余剰染色体の維持が所望される場合、起点配列がプラスミド複製に提供され、これは、低い転写数であることも高い転写数であることもできる。多種多様のマーカー、特に毒素から、より特に抗生物質から保護するものが選択において利用可能である。選択する特定のマーカーは、宿主の性質によって選択され、一部の場合、栄養要求性宿主と共に補足物を使用することができる。ＤＮＡ構築物の導入には、例えば、接合、バクテリアの形質転換、カルシウム沈殿ＤＮＡ、電気穿孔、融合、トランスフェクション、ウイルスベクター感染、微粒子銃等の任意の好都合な方法を使用することができる。
したがって、本発明において使用するタンパク質は、従来技術により遺伝学的操作した宿主細胞内に産生することができる。適切な宿主細胞は、形質転換することも外因性ＤＮＡでトランスフェクトすることもできる細胞種であり、培養中で増殖し、バクテリア、真菌細胞、および培養した高等真核細胞（多細胞生物の培養細胞等）、特に培養した哺乳動物細胞を含む。クローン化ＤＮＡ分子の操作および様々な宿主細胞内への外因性ＤＮＡ導入技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （３ｒｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， ＮＹ， ２００１）、およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （４ｔｈ ｅｄ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， １９９９）に開示されている。
例えば、本明細書に記載の２つの同一ＰＳＭＡ結合ポリペプチドを含むホモ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質の組換え発現において、発現ベクターは一般に、プロモーターに使用可能に連結しているＰＳＭＡ結合ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む。異なる第１および第２ポリペプチド鎖を含むヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質の組換え発現において、第１および第２ポリペプチド鎖は、完全ヘテロ二量体タンパク質発現のための宿主細胞内の別々のベクターから共発現することができる。あるいは、ヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質発現において、第１および第２ポリペプチド鎖は、完全ヘテロ二量体タンパク質発現のための宿主細胞内の同一ベクターの別々の発現単位から共発現する。発現ベクター（１つまたは複数）は、従来技術によって宿主細胞に移し、トランスフェクトした細胞は、次いで、従来技術によって培養し、相当するＰＳＭＡ結合タンパク質を産生するコードされたポリペプチド（１つまたは複数）を産生する。
宿主細胞の分泌経路内に組換えタンパク質を導くため、分泌シグナル配列（リーダー配列としても知られている）が発現ベクター内に提供される。分泌シグナル配列は、組換えタンパク質の天然形態であることも、別の分泌タンパク質もしくはｄｅ ｎｏｖｏ合成由来であることもできる。分泌シグナル配列は、ＤＮＡ配列をコードするポリペプチドに使用可能に結合されている、すなわち、２配列は、正確なリーディングフレーム中で結合し、新たに合成されるポリペプチドを宿主細胞の分泌経路内に導くように位置する。分泌シグナル配列は一般に目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５位に位置するが、あるシグナル配列は目的のＤＮＡ配列内の他の位置に位置することができる（例えば、Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，０３７，７４３号；Ｈｏｌｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，１４３，８３０号を参照されたい）。あるバリエーションでは、本発明によって使用される分泌シグナル配列は、ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号８５）アミノ酸配列を有する。
培養した哺乳動物細胞は、本発明において使用する組換えタンパク質の産生に適した宿主である。哺乳動物宿主細胞内への外因性ＤＮＡの導入方法としては、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ １４：７２５， １９７８； Ｃｏｒｓａｒｏ ａｎｄ Ｐｅａｒｓｏｎ， Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：６０３， １９８１： Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６， １９７３）、電気穿孔（Ｎｅｕｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ． １：８４１−８４５， １９８２）、ＤＥＡＥデキストラン媒介性トランスフェクション（上記Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．）、およびリポソーム媒介性トランスフェクション（Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｆｏｃｕｓ １５：７３， １９９３； Ｃｉｃｃａｒｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｆｏｃｕｓ １５：８０， １９９３）が挙げられる。培養した哺乳動物細胞内の組換えポリペプチドの産生は、例えば、Ｌｅｖｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，７１３，３３９号；Ｈａｇｅｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，７８４，９５０号；Ｐａｌｍｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，５７９，８２１号、ならびにＲｉｎｇｏｌｄ、米国特許第４，６５６，１３４号に開示されている。適切な哺乳動物宿主細胞例としては、アフリカミドリザル腎細胞（Ｖｅｒｏ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５８７）、ヒト胎児腎細胞（２９３−ＨＥＫ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５７３）、ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ−２１、ＢＨＫ−５７０；ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５４４、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０３１４）、犬科腎細胞（ＭＤＣＫ；ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１；ＡＴＣＣ ＣＣＬ６１；ＣＨＯ ＤＧ４４；ＣＨＯ ＤＸＢ１１（Ｈｙｃｌｏｎｅ， Ｌｏｇａｎ， ＵＴ）；例えば、Ｃｈａｓｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｏｍ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌｅｃ． Ｇｅｎｅｔ． １２：５５５， １９８６も参照されたい））、ラット下垂体性細胞（ＧＨ１；ＡＴＣＣ ＣＣＬ８２）、ＨｅＬａ Ｓ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２．２）、ラット肝細胞（Ｈ−４−ＩＩ−Ｅ；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １５４８）ＳＶ４０形質転換サル腎細胞（ＣＯＳ−１；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５０）およびマウス胎児細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３；ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５８）を挙げることができる。追加の適切な細胞系は当該技術分野において知られており、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Ｍａｎａｓｓａｓ， Ｖｉｒｇｉｎｉａ等の公開保管場所から利用可能である。ＳＶ−４０またはサイトメガロウイルス由来のプロモーター等の強い転写プロモーターを使用することができる。例えば、米国特許第４，９５６，２８８号を参照されたい。他の適切なプロモーターとしては、メタロチオネイン遺伝子（米国特許第４，５７９，８２１号および同第４，６０１，９７８号）およびアデノウイルス主要後期プロモーター由来のものが挙げられる。
薬剤選択は、外来ＤＮＡが挿入されている培養哺乳動物細胞を選択するために一般に使用される。かかる細胞は、一般に「トランスフェクタント」と呼ばれる。選択的薬剤の存在下で培養されている細胞は、目的の遺伝子をそれらの子孫に伝達可能であり、「安定したトランスフェクタント」と呼ばれる。例示的な選択マーカーとしては、ネオマイシンタイプ薬剤、例えばＧ−４１８およびその他の存在下で実施するために選択される抗生物質ネオマイシン耐性をコードする遺伝子；ミコフェノール酸／キサンチンの存在下で宿主細胞増殖を可能にするキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼのｇｐｔ遺伝子；ならびにゼオシン、ブレオマイシン、ブラストサイジン、およびハイグロマイシン耐性を提供するマーカーが挙げられる（例えば、Ｇａｔｉｇｎｏｌ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２０７：３４２， １９８７； Ｄｒｏｃｏｕｒｔ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：４００９， １９９０を参照されたい）。選択系は、目的の遺伝子発現レベルを増大する、「増幅」と呼ばれるプロセスに使用することもできる。増幅は、低レベルの選択的薬剤の存在下でトランスフェクタントの培養によって実施し、次いで、選択的薬剤の量を増大して、導入された遺伝子の高値の生成物を産生する細胞を選択する。例示的な増幅可能な選択マーカーは、メトトレキサート耐性を付与するジヒドロ葉酸レダクターゼである。他剤耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラーゼ）も使用することができる。
昆虫細胞、植物細胞および鳥細胞を含む他の高等真核細胞も宿主として使用することができる。植物細胞内の遺伝子を発現するベクターとしてのアグロバクテリウムリゾゲネスの使用については、Ｓｉｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｓｃｉ． （Ｂａｎｇａｌｏｒｅ） １１：４７−５８， １９８７に概説されている。昆虫細胞の形質転換およびそこでの外来ポリペプチドの産生については、ＧｕａｒｉＮＯｅｔ ａｌ．、米国特許第５，１６２，２２２号およびＷＩＰＯ公開ＷＯ９４／０６４６３号に開示されている。
昆虫細胞は、組換えバキュロウイルスへ感染させることができ、一般にオートグラファカリフォルニカ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）由来である。Ｋｉｎｇ ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｔｈｅ Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ （Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ， Ｌｏｎｄｏｎ）； Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｖｅｃｔｏｒｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９４）；およびＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ ｅｄ．， Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ， Ｔｏｔｏｗａ， ＮＪ， １９９５）を参照されたい。組換えバキュロウイルスは、Ｌｕｃｋｏｗ ｅｔ ａｌ． （Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７：４５６６−４５７９， １９９３）に記載されているトランスポゾンベース系の使用を介して産生することもできる。導入ベクターを使用するこの系は、キット形態（ＢＡＣ−ＴＯ−ＢＡＣキット；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）で市販されている。導入ベクター（例えば、ＰＦＡＳＴＢＡＣ１；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）はＴｎ７トランスポゾンを含み、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを「ｂａｃｍｉｄ」と呼ばれる大きなプラスミドとして大腸菌中に維持されたバキュロウイルスのゲノム内に移す。Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７１：９７１−９７６， １９９０； Ｂｏｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７５：１５５１−１５５６， １９９４；およびＣｈａｚｅｎｂａｌｋ ａｎｄ Ｒａｐｏｐｏｒｔ， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７０：１５４３−１５４９， １９９５を参照されたい。さらに、導入ベクターは、上に開示されたポリペプチド延長または親和性タグをコードするＤＮＡとのインフレーム融合物を含むことができる。当該技術分野において知られている技術を用いて、ＤＮＡ配列をコードするタンパク質を含む導入ベクターは大腸菌宿主細胞内に形質転換され、細胞は、組換えバキュロウイルスを標示する中断されたｌａｃＺ遺伝子を含むｂａｃｍｉｄについてスクリーニングされる。組換えバキュロウイルスのゲノムを含むｂａｃｍｉｄ ＤＮＡは共通の技術を用いて単離し、ツマジロク・サヨトウ細胞（Ｓｆ９細胞等）のトランスフェクトに使用される。続いて、興味のタンパク質を発現する組換えウイルスを産生する。組換えウイルスストックは、当該技術分野において一般に使用される方法により作製される。
タンパク質生成のため、宿主細胞を感染させるために使用される組換えウイルスは、典型的にはフォールアーミーワーム、スポドプテラ・フルギペルダ（例えば、Ｓｆ９またはＳｆ２１細胞）またはトリコプラシア・ニ（例えば、ＨＩＧＨ ＦＩＶＥ細胞；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）由来の細胞系である。一般にＧｌｉｃｋ ａｎｄ Ｐａｓｔｅｒｎａｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ （ＡＳＭ Ｐｒｅｓｓ， Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｃ．， １９９４）を参照されたい。米国特許第５，３００，４３５号も参照されたい。血清不含培地を用いて細胞を増殖および維持する。適切な培地製剤は、当該技術分野において知られており、市販供給者から得ることができる。細胞は、接種密度約２〜５×１０５細胞から密度１〜２×１０６細胞まで増殖し、この時点で感染多重度（ＭＯＩ）０．１〜１０、より典型的には３近くで組換えウイルスストックを追加する。使用される手順は、利用可能である実験室マニュアルに一般に記載されている（例えば、上記Ｋｉｎｇ ａｎｄ Ｐｏｓｓｅｅ；上記Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ ｅｔ ａｌ．；上記Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎを参照されたい）。
酵母細胞等の真菌細胞も本発明において使用することができる。これに関する酵母種としては、例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ、ピキア・パストリス、およびピキア・メタノリカが挙げられる。外因性ＤＮＡを用いたサッカロミセス・セレビシエ細胞の形質転換方法およびそこに由来する組換えポリペプチドの産生方法は、例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号；Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，９３１，３７３号；Ｂｒａｋｅ、米国特許第４，８７０，００８号；Ｗｅｌｃｈ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，０３７，７４３号、ならびにＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，８４５，０７５号に開示されている。形質転換細胞は、選択マーカー、一般に薬剤耐性または特定の栄養素（例えば、ロイシン）の不在下での増殖能によって決定された表現型により選択される。サッカロマイセス・セレヴィシエに使用する例示的なベクター系は、Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ（米国特許第４，９３１，３７３号）に開示されているＰＯＴ１ベクター系であり、これはグルコース含有培地中の増殖によって形質転換細胞を選択させる。酵母中の使用に適したプロモーターおよびターミネーターとしては、解糖系酵素遺伝子（例えば、Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４，５９９，３１１号；Ｋｉｎｇｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，６１５，９７４号、ならびにＢｉｔｔｅｒ、米国特許第４，９７７，０９２号を参照されたい）およびアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のものが挙げられる。米国特許第４，９９０，４４６号；同第５，０６３，１５４号；同第５，１３９，９３６号、ならびに同第４，６６１，４５４号も参照されたい。ハンセヌラポリモルファ、シゾサッカロミセスポンベ、クルイベロミセス・ラクチス、クルイベロミセス・フラギリス、ウスチラゴ・マイディス、ピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ピキア・ギリエルモンデイ、およびカンジダ・マルトーサ等の他の酵母菌の形質転換系が当該技術分野において知られている。例えば、Ｇｌｅｅｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３２：３４５９−３４６５， １９８６； Ｃｒｅｇｇ、米国特許第４，８８２，２７９号、ならびにＲａｙｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ．， Ｙｅａｓｔ １４：１１−２３， １９９８を参照されたい。アスペルギルス細胞は、ＭｃＫｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．、米国特許第４，９３５，３４９号の方法により使用することができる。アクレモニウム・クリソゲヌムの形質転換方法は、Ｓｕｍｉｎｏ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，１６２，２２８号に開示されている。ニューロスポーラの形質転換方法は、Ｌａｍｂｏｗｉｔｚ、米国特許第４，４８６，５３３号に開示されている。ピキア・メタノリカ中の組換えタンパク質の産生は、米国特許第５，７１６，８０８号；同第５，７３６，３８３号；同第５，８５４，０３９号、ならびに同第５，８８８，７６８号に開示されている。
バクテリア大腸菌、枯草菌株、および他属等の原核生物宿主細胞も本発明において有用な宿主細胞である。これら宿主の形質転換およびそこでクローニングした外来ＤＮＡ配列の発現技術については、当該技術分野において周知である（例えば、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌを参照されたい）。大腸菌等のバクテリア中の組換えタンパク質発現時、タンパク質は、典型的には不溶性顆粒として細胞質中に保持することも、バクテリア分泌配列による周辺腔を指向とすることもできる。前者の場合、細胞は溶解し、顆粒は例えば、グアニジンイソチオシアネートまたは尿素を用いて回収され変性する。変性タンパク質は、次いで、尿素液ならびに還元および酸化グルタチオンの組み合わせに対する透析、続いて、緩衝生理食塩水溶液に対する透析による等、変性剤の希釈によって、再折畳み、二量体化することができる。あるいは、タンパク質は細胞質から可溶形態で単離し、変性剤を使用せずに回収することができる。タンパク質は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水中、水性抽出物として細胞から回収する。目的のタンパク質を捕獲するため、抽出物は、固定化抗体またはヘパリンセファロースカラム等のクロマトグラフ培地に直接適用する。細胞を（例えば、超音波処理または浸透圧ショックによって）中断して周辺腔の中味を放出し、タンパク質を回収し、したがって、変性および再折畳みの必要を回避することによって、分泌タンパク質を可溶形態および官能形態で周辺腔から回収することができる。単鎖抗体を含む抗体は、既知の方法によりバクテリアの宿主細胞内に産生することができる。例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６， １９８８； Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９−５８８３， １９８８；およびＰａｎｔｏｌｉａｎｏ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３０：１０１１７−１０１２５， １９９１を参照されたい。
栄養剤および選択した宿主細胞の増殖に必要な他の成分を含む培養培地中で従来の手順によって形質転換されたまたはトランスフェクトした宿主細胞を培養する。定義した培地および複合体培地を含む様々な適切な培地が当該技術分野において知られており、一般に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよびミネラルを含む。培地は、必要に応じて増殖因子または血清等の成分を含むこともできる。増殖培地は、一般に、例えば、薬剤選択または発現ベクター上で行われる選択マーカーによって補充されるかまたは宿主細胞内に共トランスフェクトされる必須栄養素欠乏によって外的に添加されたＤＮＡを含む細胞のために選択される。
ＰＳＭＡ結合タンパク質は、従来のタンパク質精製方法により、典型的にはクロマトグラフ技術の組み合わせによって精製する。一般にＡｆｆｉｎｉｔｙ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ＆ Ｍｅｔｈｏｄｓ （Ｐｈａｒｍａｃｉａ ＬＫＢ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ， １９８８）； Ｓｃｏｐｅｓ， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９９４）を参照されたい。免疫グロブリンＦｃ領域を含むタンパク質は、固定化タンパク質Ａまたはタンパク質Ｇ上の親和性クロマトグラフィーによって精製することができる。追加の精製工程（ゲル濾過等）を用いて所望のレベルの純度を得ることも脱塩緩衝液交換等を得ることもできる。
Ｖ．治療法
別の実施形態では、本発明は、ＰＳＭＡ過剰発現を特徴とする障害の処置方法を提供する。一般に、かかる方法は、治療有効量の本明細書に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質をかかる治療を必要としている対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、対象中のＰＳＭＡ発現細胞に対して、ＰＳＭＡ結合タンパク質がＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを誘発するように抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）から選択される少なくとも１つのエフェクター機能を含む。他の実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質が、Ｔ細胞（例えば、ＴＣＲ複合体またはＣＤ３ε等のその成分）に特異的結合する第２結合ドメインを含む場合、ＰＳＭＡ結合タンパク質は対象中のＰＳＭＡ発現細胞に対して再指向Ｔ細胞の細胞傷害（ＲＴＣＣ）を誘発する。
方法のあるバリエーションでは、障害は癌である。本発明による治療が奏効する例示的な癌としては、例えば、前立腺癌（例えば、去勢抵抗性前立腺癌）、大腸癌、胃癌、淡明細胞型腎細胞癌、膀胱癌、および肺癌が挙げられる。他のバリエーションでは、障害は、例えば、前立腺癌または良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）等の前立腺障害である。さらに他の実施形態では、障害は、例えば、固体腫瘍成長を特徴とする癌等の新生血管障害である。ＰＳＭＡ過剰発現を特徴とし、本発明による治療が奏効する腫瘍血管系を有する例示的な癌としては、例えば、淡明細胞型腎細胞癌（ＣＣＲＣＣ）、大腸癌、乳癌、膀胱癌、肺癌、および膵癌が挙げられる（例えば、Ｂａｃｃａｌａ ｅｔ ａｌ．， Ｕｒｏｌｏｇｙ ７０：３８５−３９０， ２００７ （ＣＣＲＣＣ中のＰＳＭＡ発現）； Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５７：３６２９−３６３４， １９９７ （腎臓癌、尿路上皮癌、肺癌、結腸癌、乳癌、および腺癌から肝癌等の様々な非前立腺癌中のＰＳＭＡ発現）； およびＭｉｌｏｗｓｋｙ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２５：５４０−５４７， ２００７（例えば、腎臓、結腸、膀胱、および膵癌中の発現、ならびに抗ＰＳＭＡ ｍＡｂを用いたヒトの腫瘍血管系の特異的な標的の実証）を参照されたい。
本明細書に記載の治療法の各実施形態では、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、治療が探される疾患または障害管理に関する従来の方法と一致する方法で送達される。本明細書の開示によって、ＰＳＭＡ結合タンパク質の有効量は、一定時間かかる治療を必要としている対象に疾患または障害を予防または治療する上で十分な条件下で投与する。
本明細書に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質を投与する対象としては、ＰＳＭＡ過剰発現を特徴とする特定の障害の発現リスクが高い患者ならびに既存のかかる障害を呈する患者が挙げられる。典型的に、対象は、治療が探される障害を呈すると診断されている。さらに、対象は、障害における任意の変化について（例えば、障害の臨床症状の増大または低減について）治療経過中にモニタリングすることができる。また、一部のバリエーションでは、対象は、ＰＳＭＡ発現細胞の標的に関与する治療を必要とする別の障害を呈さない。
予防適応において、医薬組成物または薬剤は、特定の障害を呈しやすいか、あるいはリスクのある患者に、障害リスクを除去もしくは低減するかまたは障害の発現を遅延化する上で十分な量で投与する。治療適応において、組成物または薬剤は、かかる障害が疑われるかまたはすでに呈している患者に、障害の症状およびその合併症を治癒するかまたは少なくとも部分的に停止する上で十分な量で投与する。これに達する上で適した量は治療的有効投与量または治療的有効量と呼ばれる。予防レジメンと治療レジメンの両方において、薬剤は、通常、十分な反応（例えば、不適切な血管形成活性の阻害）に達するまで数回の投与量で投与する。典型的に、反応はモニタリングし、所望の反応が消え始めた場合に反復投与する。
本発明の方法により治療の対象患者を同定するため、承認されたスクリーニング方法を使用して、特定の障害関連リスク因子を決定することも対象に同定された既存障害の状態を決定することもできる。かかる方法は、例えば、個体に特定の障害が診断されている親類がいるかどうかの決定を含むことができる。スクリーニング方法は、例えば、従来のワークアップも含み、遺伝要素を有することが知られている特定の障害の家族状態を決定することもできる。例えば、様々な癌もある遺伝要素を有することが知られている。癌の遺伝要素としては、例えば、形質転換する複数遺伝子の変異（例えば、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＥＧＦＲ、ｃＭｅｔ、およびその他）、あるＨＬＡおよびキラー阻害受容体（ＫＩＲ）分子の存在もしくは不在、または癌細胞が、直接または間接的のいずれかでＮＫ細胞およびＴ細胞等の細胞の免疫抑制を調節可能である機序が挙げられる（例えば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ ａｎｄ Ｍａｌｍｂｅｒｇ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７：３２９−３３９， ２００７； Ｂｏｙｔｏｎ ａｎｄ Ａｌｔｍａｎｎ， Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４９：１−８， ２００７を参照されたい）。この目的のため、ヌクレオチドプローブは、目的の特定の障害に関連する遺伝子マーカーを保因する個体を同定するために日常的に使用することができる。さらに、特定の障害マーカーを同定する上で有用である多種多様の免疫方法が当該技術分野において知られている。例えば、特定の腫瘍に関する抗原を検出するモノクローナル抗体プローブを使用する様々なＥＬＩＳＡ免疫アッセイ方法が利用可能であり、当該技術分野において周知である。スクリーニングは、既知の患者症候、年齢因子、関連リスク因子等によって示されるように実施できる。これらの方法により、臨床医は、治療において本明細書に記載の方法を必要としている患者を日常的に選ぶことができる。これらの方法により、病的、ＰＳＭＡ発現細胞の標的は、独立した治療プログラムとして、またはフォローアップ、調整、もしくは他の治療に対する治療レジメン調整として実施できる。
投与において、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、医薬組成物として製法される。ＰＳＭＡ結合タンパク質を含む医薬組成物は、治療分子が医薬上許容される担体との混合物中に併用される製薬的に有用な組成物を調製するために既知の方法により製法することができる。投与がレシピエント患者に忍容可能であることができる場合、組成物は「医薬上許容される担体」と呼ばれる。滅菌リン酸緩衝生理食塩水は、医薬上許容される担体の１例である。他の適切な担体は当業者に周知である（例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ （ｅｄ．）， Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， １９ｔｈ ｅｄ． １９９５）を参照されたい）。製剤は、賦形剤、保存剤、可溶化剤、緩衝剤、アルブミンの１つまたは複数をさらに含み、バイアル表面上等のタンパク質損失を防ぐことができる。
ＰＳＭＡ結合タンパク質を含む医薬組成物は、治療的有効量で対象に投与する。本発明の方法により、ＰＳＭＡ結合タンパク質を、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、心房内、関節内、非経口、経鼻、肺内、経皮、胸膜内、髄腔内、および経口投与等の様々な投与経路によって対象に投与できる。予防および治療目的において、アンタゴニストは、長時間に渡る持続的な送達（例えば、持続的な経皮送達）を介して、対象に単一ボーラス送達で投与することも、反復投与プロトコルで（例えば、１時間１回、１日１回、または週１回）投与することもできる。
組成物の「治療的有効量」とは、疾患進行の統計的有意な低減または臓器機能の統計的有意な改善等、障害の１つまたは複数の症状の改善において統計的有意な効果を生じる量である。正確な用量は、治療する状態の性質および重症度、患者特性等を考慮して、承認された標準によって臨床医によって決定される。用量決定は、当該技術分野の通常技術レベル内である。
本文脈における有効投与量の決定は、典型的には動物モデル試験、続いてヒト臨床試験に基づき、モデル対象における対象障害の発現または重症度を有意に低減する有効投与量および投与プロトコルを決定することによって導かれる。本発明の組成物の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトか動物か、投与する他剤、治療が予防的か治療的か、ならびに組成物自体の特異的な活性および個体中で所望の反応を引き出す能力等の多くの異なる要因によって異なる。通常、患者はヒトであるが、一部の疾患において、患者は非ヒト哺乳動物であることができる。典型的に、投与量レジメンは、至適治療反応を得る、すなわち、安全性および有効性を至適化するように調節する。したがって、治療的有効量はまた、本明細書に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質を投与することの有益な効果の方が任意の望ましくない付帯効果に勝る量である。ＰＳＭＡ結合タンパク質投与において、投与量は、典型的には約０．１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたは１μｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、より通常は１０μｇ〜５ｍｇ／ｋｇの対象体重である。より具体的な実施形態では、薬剤有効量は、約１μｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。この範囲内の投与量は、単回投与によって達成することも複数回投与（例えば、１日複数回投与または１日１回、週１回、各週１回、または月１回投与等）によって達成することもできる。例えば、あるバリエーションでは、レジメンは、初回投与、続いて複数回、週１回または各週１回間隔の連続投与からなる。別のレジメンは、初回投与、続いて複数回、月１回または隔月１回間隔の連続投与からなる。あるいは、投与は、障害の臨床症状モニタリングによって示されるように不規則であることができる。
医薬組成物の投与量は、担当臨床医によって標的部位の所望の濃度を維持するように変更し得る。例えば、静脈内送達経路が選択される場合、標的組織の血流中の局所薬剤濃度は、対象の状態および投影測定反応に応じて、約１〜５０ナノモル組成物／リットル、場合によっては約１．０ナノモル／リットルならびに１０、１５、もしくは２５ナノモル／リットルであることもできる。送達経路、例えば、経皮送達対粘膜表面への送達に基づき、より高濃度を選択することもより低濃度を選択することもできる。投与量はまた、例えば、経鼻的スプレー対粉末、持続放出経口または注射粒子、経皮製剤等、投与する製剤の放出速度に基づき調節するべきである。同一血清濃度レベルに達するため、例えば、放出速度５ナノモルの低放出粒子（標準的な条件下）は放出速度１０ナノモル粒子の投与量の約２倍で投与する。
本明細書に記載の医薬組成物は、併用療法の文脈においても使用することができる。用語「併用療法」とは、対象に、少なくとも１つの治療的有効量のＰＳＭＡ結合タンパク質および別の治療薬を投与することを示すために本明細書で使用する。
例えば、癌免疫療法の文脈において、本発明のＰＳＭＡ結合タンパク質は化学療法または放射線との併用において使用することができる。本明細書に記載のＰＳＭＡ結合タンパク質は、従来タイプの化学療法または放射線と相乗的に作用することができる。ＰＳＭＡ結合タンパク質は、腫瘍負荷をさらに低減し、化学治療によってより効率的に殺傷させることができる。
本発明の組成物は、様々なサイトカインおよび共刺激／阻害性分子を含む免疫調節化合物との併用においても使用することができる。これらとしては、抗癌免疫反応を刺激するサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、またはＩＬ−２１）の使用が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＣＤ１３７活性化（Ｗｉｌｃｏｘ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． １０９：６５１−９， ２００２を参照されたい）またはＣＴＬＡ４阻害（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９：５６５−９４， ２００１を参照されたい）等の免疫ベースのエフェクター細胞上に見られる様々な細胞表面分子を共刺激する試薬と併用することができる。あるいは、ＰＳＭＡ結合タンパク質は、ＴＮＦスーパーファミリー受容体（例えば、ＴＲＡＩＬ関連受容体、ＤＲ４、ＤＲ５、Ｆａｓ、またはＣＤ３７）との相互作用によって腫瘍細胞アポトーシスを導入する試薬と使用可能である（例えば、Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９５：１６１−９， ２００２； Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ， Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ３：５３５−４６， ２００１を参照されたい）。かかる試薬としては、ＴＮＦスーパーファミリー受容体リガンド（リガンド−Ｉｇ融合物等）、およびＴＮＦスーパーファミリー受容体の抗体特異性（例えば、ＴＲＡＩＬリガンド、ＴＲＡＩＬリガンド−Ｉｇ融合物、抗ＴＲＡＩＬ抗体等）が挙げられる。
特に固形腫瘍治療に関して、評価項目および抗腫瘍活性を評価するプロトコルは、当該技術分野において周知である。各プロトコルは腫瘍反応評価を別々に定義し得るのに対し、ＲＥＣＩＳＴ（固形腫瘍中の反応評価基準）基準は、現在、米国国立癌研究所による腫瘍反応評価の推奨ガイドラインとみなされている（Ｔｈｅｒａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｎａｔｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ． ９２：２０５−２１６， ２０００を参照されたい）。ＲＥＣＩＳＴ基準により、腫瘍反応は、すべての測定可能な病変または転移の低減または除去を意味する。疾患は、医学的写真もしくはＸ線、コンピュータ軸トモグラフィー（ＣＴ）、核磁性共鳴画像（ＭＲＩ）、または臨床検査（病変が表面的である場合）によって明確に縁を定義する従来技術を用いて≧２０ｍｍまたはスパイラルＣＴスキャンで≧１０ｍｍとして少なくとも１つの寸法で正確に測定することができる病変を含む場合、一般に測定可能であるとみなされる。測定不能な疾患とは、従来技術を用いて＜２０ｍｍもしくはスパイラルＣＴスキャンで＜１０ｍｍの病変、ならびに文字通り測定不能な病変（正確に測定するには小さすぎる）を含む疾患を意味する。測定不能な疾患としては、胸水、腹水、および間接的証拠により記載された疾患が挙げられる。
客観状態基準は、固体腫瘍反応を評価するプロトコルを必要とする。代表的な基準は、下記の（１）すべての測定可能疾患の完全な消失と定義した完全奏効（ＣＲ）；新規病変なし；疾患関連症状なし；測定不能疾患の証拠なし；（２）標的病変の最長直径計３０％短縮と定義した部分奏効（ＰＲ）（３）標的病変の最長直径計２０％増長または任意の新規病変出現と定義した進行性疾患（ＰＤ）；（４）ＣＲ、ＰＲ、または進行性疾患に該当しないものと定義した安定または無奏効を含む（上記Ｔｈｅｒａｓｓｅ ｅｔ ａｌ．を参照されたい）。
腫瘍学分野において承認されている追加の評価項目としては、全体の生存率（ＯＳ）、無疾患生存率（ＤＦＳ）、客観奏効率（ＯＲＲ）、進行時間（ＴＴＰ）、および無進行生存率（ＰＦＳ）が挙げられる（Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ： Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｐｐｒｏｖａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ， Ａｐｒｉｌ ２００５， Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ＦＤＡ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤを参照されたい）。
医薬組成物は、本明細書に記載の医薬組成物を含む容器を含むキットとして供給することができる。医薬組成物は、例えば、単回または複数回用量用の注射液状で提供することも、注射前に再構成される滅菌粉末として提供することもできる。あるいは、かかるキットは、医薬組成物投与用の乾燥粉末ディスペンサー、液体エアロゾル発生器、またはネブライザーを含むこともできる。かかるキットは、医薬組成物の適応および使用に関する書面情報をさらに含むことができる。
実施例
実施例１
１０７−１Ａ４からのマウス可変ドメイン単離およびヒト化変異型の調製
ヒトＰＳＭＡ特異的１０７−１Ａ４モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ細胞からマウス可変ドメインをクローニングした（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ， １９９８， Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｐｒｏｓｔａｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅｓ． １： ２０８−２１５を参照されたい）。ＲＮｅａｓｙ（商標登録）保護ミニキット（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．、７４１２４）を製造業者の説明書に従い用いて総ＲＮＡをハイブリドーマから単離した。ＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， ６３４９１４）を製造業者の説明書に従い用いて、オリゴ（ｄＴ）プライマーと５’ＲＡＣＥ−ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡを生成した。異なるマウスＶＫまたはＶＨ遺伝子族に対して特異的な独占的縮退遺伝子プライマープールを用いてＳＭＡＲＴ（商標）ＲＡＣＥプロトコルによりｃＤＮＡから抗体のＶＨおよびＶＬ領域をＰＣＲ増幅した。ゲル電気泳動によりＰＣＲ増幅生成物を確認し、正確に測定したバンドを単離して、ＴＯＰＯ（商標登録）ＴＡクローニングキットを製造業者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に従い用いてｐＣＲ（商標登録）２．１−ＴＯＰＯ（商標登録）プラスミドベクター内にクローニングした。得られた組換えベクターをＴＯＰ１０ 大腸菌内に形質転換させた。クローン由来のＤＮＡシークエンスによって、マウス生殖系列フレームワークＬ１７１３４（Ｇｅｎｂａｎｋ）に対して高い相同（９２．７％）を有するマウスＶＨ１フレームワークを有する重鎖領域、およびマウス生殖系列フレームワークＡＪ２３５９３６（ＥＭＢＬ）に対して非常に高い相同（９８．６％）を有するマウスＶｋ１６フレームワークを有するκ鎖領域の複数の単離が示された。中性変異によって、親マウスκ（軽鎖）可変ドメインをコードするＤＮＡから２つの制限部位、１つのＨｉｎｄＩＩＩおよび１つのＥｃｏＲＩ部位を除去し、目的の哺乳動物発現ベクター内へのクローニングを簡略化し、ヒトＶｋ３リーダー配列のために天然マウス分泌／リーダー配列も用いなかった。ＰＳＭＡ特異的マウスＶＨ領域のポリヌクレオチド配列（１０７−１Ａ４）は配列番号１とし、アミノ酸配列は配列番号２とする。制限部位を有するＰＳＭＡ特異的マウスＶＬ領域のポリヌクレオチド配列（１０７−１Ａ４）は配列番号３とする。制限部位を除くように修飾されたＰＳＭＡ特異的マウスＶＬ領域のポリヌクレオチド配列（１０７−１Ａ４）は配列番号４とし、アミノ酸配列は配列番号５とする。
これらのマウスｓｃＦｖ配列をコードし、適切な足場（例えば、ＳＭＩＰ、ＳＣＯＲＰＩＯＮ、および単一特異性または多重特異性ヘテロ二量体ポリペプチド）内への挿入用にカセット化したＤＮＡ配列を設計した。構築物を次いで、Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ （Ｂｏｔｈｅｌｌ， ＷＡ）によって合成し、標準、制限消化ベースのクローニング技術を用いてＴＳＣ０８４（配列番号４４；アミノ酸配列の配列番号４６）、ＴＳＣ０８５（配列番号３６；アミノ酸配列の配列番号３８）、およびＴＳＣ０９２（配列番号３７；アミノ酸配列の配列番号３９）に相当する遺伝子配列を産生した。
ヒトフレームワークへのＣＤＲグラフトを介して設計されたヒト化配列を同様にＢｌｕｅ Ｈｅｒｏｎによって合成し、２つのアプローチを用いて以下の遺伝子配列を産生する制限消化を用いて類似のベクター内にクローニングした：（Ａ）ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ断片、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ断片、ならびにＴＳＣ１８８（配列番号４０個のアミノ酸配列の配列番号４２）およびＴＳＣ１８９（配列番号４１；アミノ酸配列の配列番号４３）に相当する遺伝子配列を産生するためにＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩで切断した目的ベクターを用いた３片の結紮、ならびに（Ｂ）ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩ断片ならびにＴＳＣ１９２（配列番号５３；アミノ酸配列の配列番号５８）、ＴＳＣ１９３（配列番号５４；アミノ酸配列の配列番号５９）、ＴＳＣ１９４（配列番号４８；アミノ酸配列の配列番号４９）、ＴＳＣ１９５（配列番号５５；アミノ酸配列の配列番号６０）、ＴＳＣ１９６（配列番号５６；アミノ酸配列の配列番号６１）、ＴＳＣ１９９（配列番号５０個のアミノ酸配列の配列番号５１）、ＴＳＣ２１０（配列番号６９；アミノ酸配列の配列番号７０）、ＴＳＣ２１１（配列番号７１；アミノ酸配列の配列番号７２）、ＴＳＣ２１２（配列番号７３；アミノ酸配列の配列番号７４）、ＴＳＣ２１３（配列番号７５；アミノ酸配列の配列番号７６）；ＴＳＣ２４９（配列番号７７；アミノ酸配列の配列番号７８）、ＴＳＣ２５０（配列番号７９；アミノ酸配列の配列番号８０）、ＴＳＣ２５１（配列番号８１；アミノ酸配列の配列番号８２）、およびＴＳＣ２５２（配列番号８３；アミノ酸配列の配列番号８４）に相当する遺伝子配列を産生するためにＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩで切断した目的ベクターを用いた２片の結紮、ならびに（Ｃ）ＢｓｒＧＩ／ＥｃｏＲＩ断片およびＴＳＣ２９５（配列番号１５７；アミノ酸配列の配列番号１５８）、ＴＳＣ２９６（配列番号１５９；アミノ酸配列の配列番号１６０）、ＴＳＣ３０１（配列番号１６１；アミノ酸配列の配列番号１６２）、およびＴＳＣ３０２（配列番号１６３；アミノ酸配列の配列番号１６４）に相当する遺伝子配列を産生するためにＢｓｒＧＩ／ＥｃｏＲＩで切断した２つの目的ベクターのうち１つを用いた２片の結紮。ヒト化ＰＳＭＡ特異的（１０７−１Ａ４）ＶＬ領域ポリヌクレオチド配列は配列番号２２とし、アミノ酸配列は配列番号２３とする。ヒト化ＰＳＭＡ特異的（１０７−１Ａ４）ＶＨ領域＃１ポリヌクレオチド配列は配列番号２４とし、アミノ酸配列は配列番号２５とする。ヒト化ＰＳＭＡ特異的（１０７−１Ａ４）ＶＨ領域＃２ポリヌクレオチド配列は配列番号２６とし、アミノ酸配列は配列番号２７とする。
様々なクローン化配列および成分の配列も表３に提示する。ポリペプチド構築物（例えば、ＳＭＩＰ、ＳＣＯＲＰＩＯＮ、単一または多重特異性ヘテロ二量体タンパク質）のアミノ酸配列は、ヒトＶｋ３リーダー配列を含まない。
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実施例２
ヘテロ二量体分子
ＰＣＴ国際出願／米国特許第２０１０／６２４３６号およびＰＣＴ／米国特許第２０１０／６２４０４号に一般に開示のようにインターセプター足場を用いてＰＳＭＡ特異的インターセプター分子を作製した。簡単に述べると、一方のポリペプチド鎖は免疫グロブリンＣＨ１ヘテロ二量体化ドメインを含み、他方のポリペプチド鎖は免疫グロブリンＣＬヘテロ二量体化ドメインを含む２つの異なるポリペプチド鎖を共発現させることによってＰＳＭＡ特異的ポリペプチドヘテロ二量体を作製した。トランスフェクション前日、ＨＥＫ２９３細胞をＧＩＢＣＯ（商標登録）ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中、細胞濃度０．５×１０６細胞／ｍｌで懸濁した。大きなトランスフェクションにおいて２５０ｍｌ細胞を用い、小さなトランスフェクションにおいて６０ｍｌ細胞を用いた。トランスフェクション当日、３２０μｌの２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）トランスフェクチン試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を８ｍＬの培地と混合した。同時に、各単鎖ポリペプチドの２５０μｇのＤＮＡを８ｍＬ培地と混合して、５分間インキュベートした。インキュベート１５分後、ＤＮＡ−２９３ｆｅｃｔｉｎ混合物を２５０ｍＬの２９３細胞に添加し、３７℃の振盪機に戻し、速度１２０ＲＰＭで撹拌した。６０ｍＬ細胞を使用する小さなトランスフェクションにおいて、第４ＤＮＡ、２９３ｆｅｃｔｉｎ、および培地を用いた。
タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー用いてタンパク質を純化した。２ｍｌの充てんしたタンパク質Ａアガロース（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）をＥｃｏｎｏ−Ｃｏｌｕｍｎ（商標登録）クロマトグラフィーカラム、サイズ２．５×１０ｃｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に加え、ＰＢＳ（１０倍カラム容積）で広範に洗浄し、上清を負荷して、ＰＢＳで再洗浄し、３カラム容積のＰｉｅｒｃｅ ＩｇＧ溶出緩衝液で溶出した。タンパク質を次いで、ＰＢＳに対して広範に透析した。タンパク質を次いで、Ａｍｉｃｏｎ（商標登録）Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ（商標登録）遠心濾過機（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）を用いて最終容積約０．５ｍｌに濃縮した。
ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ（商標）ミニ細胞電気泳動系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて精製したタンパク質を、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分析した。
二価ポリペプチドヘテロ二量体ＴＳＣ１２２を、単鎖ポリペプチドＴＳＣ０８４およびＴＳＣ０９３を共発現させることによって作製した。単鎖ポリペプチドＴＳＣ０８４は、そのアミノからカルボキシル末端で：マウス１０７−１Ａ４（抗ＰＳＭＡ）ＶＬ−ＶＨ ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３、およびヒトＣＨ１を含む。ＴＳＣ０８４のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４４および４６で表される。単鎖ポリペプチドＴＳＣ０９３は、そのアミノからカルボキシル末端で：Ｃｒｉｓ７（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３、およびヒトＣκ（ＹＡＥ）（すなわち、第一Ａｒｇまたは最終Ｃｙｓはないが、Ｎ３０Ｙ、Ｖ５５Ａ、およびＴ７０Ｅ置換基を有するヒトＣκ）を含む。ＴＳＣ０９３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４５および４７で表される。
二価ポリペプチドヘテロ二量体ＴＳＣ２００を、ポリペプチド鎖ＴＳＣ１９２およびＴＳＣ１２５を共発現させることによって作製した。ＴＳＣ１９２は、そのアミノからカルボキシル末端で：ヒト化１０７−１Ａ４（抗ＰＳＭＡ）ＶＬ−ＶＨ＃２ ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３、およびヒトＣκ（ＹＡＥ）を含む。ＴＳＣ１９２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５３および５８で表される。ＴＳＣ１２５は、そのアミノからカルボキシル末端で：Ｃｒｉｓ７（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３、およびヒトＣＨ１を含む。ＴＳＣ１２５のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５２および５７で表される。
二価ポリペプチドヘテロ二量体ＴＳＣ２０２を、ポリペプチド鎖ＴＳＣ１９３およびＴＳＣ１２５を共発現させることによって作製した。ＴＳＣ１９３は、そのアミノからカルボキシル末端で：ヒト化１０７−１Ａ４（抗ＰＳＭＡ）ＶＬ−ＶＨ＃１ ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３、およびヒトＣκ（ＹＡＥ）を含む。ＴＳＣ１９３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５４および５９で表される。ＴＳＣ１２５は、そのアミノからカルボキシル末端で：Ｃｒｉｓ７（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３、およびヒトＣＨ１を含む。ＴＳＣ１２５のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５２および５７で表される。
二価ポリペプチドヘテロ二量体ＴＳＣ２０４を、ポリペプチド鎖ＴＳＣ１９５およびＴＳＣ０９３を共発現させることによって作製した。ＴＳＣ１９５は、そのアミノからカルボキシル末端で：ヒト化１０７−１Ａ４（抗ＰＳＭＡ）ＶＬ−ＶＨ＃２ ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３、およびヒトＣＨ１を含む。ＴＳＣ１９５のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５５および６０で表される。ＴＳＣ０９３は、そのアミノからカルボキシル末端で：Ｃｒｉｓ７（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３、およびヒトＣκ（ＹＡＥ）を含む。ＴＳＣ０９３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４５および４７で表される。
二価ポリペプチドヘテロ二量体ＴＳＣ２０５を、ポリペプチド鎖ＴＳＣ１９６およびＴＳＣ０９３を共発現させることによって作製した。ＴＳＣ１９６は、そのアミノからカルボキシル末端で：ヒト化１０７−１Ａ４（抗ＰＳＭＡ）ＶＬ−ＶＨ＃１ ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３、およびヒトＣＨ１を含む。ＴＳＣ１９６のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５６および６１で表される。ＴＳＣ０９３は、そのアミノからカルボキシル末端で：Ｃｒｉｓ７（抗ＣＤ３）ｓｃＦｖ、ヒトＩｇＧ１ ＳＣＣ−Ｐヒンジ、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ２、ヒトＩｇＧ１ ＣＨ３、およびヒトＣκ（ＹＡＥ）を含む。ＴＳＣ０９３のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４５および４７で表される。
実施例３
ＳＣＯＲＰＩＯＮ分子構築
標準的な分子生物学技術を用いて、鋳型として既存のＳＣＯＲＰＩＯＮ足場で開始し、例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ２００７／１４６９６８号、米国特許出願第２００６／００５１８４４号、ＰＣＴ出願ＷＯ２０１０／０４０１０５号、ＰＣＴ出願ＷＯ２０１０／００３１０８号、および米国特許第７，１６６，７０７号に一般に開示された方法を用いて、ＰＳＭＡ特異的ＳＣＯＲＰＩＯＮ分子（ＴＳＣ１９４（配列番号４８（核酸）、配列番号４９（アミノ酸）；ＴＳＣ１９９（配列番号５０（核酸）、配列番号５１（アミノ酸））；ＴＳＣ２１２（配列番号７３（核酸）、配列番号７４（アミノ酸））；ＴＳＣ２１３（配列番号７５（核酸）、配列番号７６（アミノ酸））；ＴＳＣ２４９（配列番号７７（核酸）、配列番号７８（アミノ酸））；ＴＳＣ２５０（配列番号７９（核酸）、配列番号８０（アミノ酸））；ＴＳＣ２５１（配列番号８１（核酸）、配列番号８２（アミノ酸））、ならびにＴＳＣ２５２（配列番号８３（核酸）、配列番号８４（アミノ酸）））を作製した（表３も参照されたい）。Ｎ末端ｓｃＦｖ結合ドメインの挿入は、親鋳型の消化ならびに制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩもしくはＡｇｅＩおよびＸｈｏＩのいずれかで挿入したｓｃＦｖを介して成し遂げ、アガロースゲル精製、および結紮によって所望の断片を同定し、単離した。Ｃ末端ｓｃＦｖ結合ドメイン挿入は、親鋳型の消化ならびに制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで挿入したｓｃＦｖを介して成し遂げ、アガロースゲル精製、および結紮によって所望の断片を同定し、単離した。
実施例４
ＰＳＭＡ（＋）およびＰＳＭＡ（−）細胞系に対するキメラおよびヒト化分子の結合
モノクローナル抗体を標準的な手順によってハイブリドーマ細胞培養培地から精製した。本明細書に開示されたＳＭＩＰ、インターセプター、およびＳＣＯＲＰＩＯＮ分子をヒトＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションによって産生し、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。親和性クロマトグラフィー後に凝集が検出された場合、二次サイズ排除クロマトグラフィーも行ってタンパク質の均質性を確実にした。
ＰＳＭＡ＋（Ｃ４−２， Ｗｕ ｅｔ ａｌ．， １９９４ Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ５７：４０６−１２）およびＰＳＭＡ−（ＤＵ−１４５， Ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， １９７８， Ｉｎｔｌ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ２１：２７４−８１）前立腺癌細胞系上の結合試験を標準的なＦＡＣＳベースの染色手順によって行った。典型的な実験は、氷上で１００μＬ ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％正常なヤギ血清＋２％胎児性ウシ血清＋０．１％アジ化ナトリウム）中、３００，０００細胞／ウェルを２００ｎＭ〜０．１ｎＭ結合分子でラベル化し、続いて洗浄し、蛍光ラベル二次抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＃１１０１３＝５μｇ／ｍｌの１：４００希釈）でインキュベートする。細胞の二次抗体を洗浄後、細胞を７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）染色溶液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標）ｃａｔ＃５５９９２５）（６μＬ ７ＡＡＤ〜１００μＬ ＦＡＣＳ緩衝液）で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメトリー（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて結合分子シグナルを検出し、ＦｌｏｗＪｏフローサイトメトリー分析ソフトウェアによって分析した。７−ＡＡＤ＋細胞を分析から除外した。グラフパッドプリズム（商標登録）グラフ化および統計ソフトウェアにおいてＥＣ５０を決定する非線形回帰分析を行った。
結合試験（図１）を用いて、親１０７−１Ａ４マウス抗体（すなわち、ＴＳＣ０４５）をキメラＳＭＩＰ分子（ＴＳＣ０８５、ＴＳＣ０９２）および二重特異性、キメラインターセプター分子ＴＳＣ１２２と比較した。両キメラＳＭＩＰ分子がＰＳＭＡ＋細胞に対して親マウス抗体と同等の親和性を示したが、１つ（ＶＬ−ＶＨ ｓｃＦｖ配向のＴＳＣ０８５）は細胞表面上で飽和レベルがより低いことが示された。単一の１０７−１Ａ４結合ドメインのみ有する二重特異性、キメラインターセプター分子（ＴＳＣ１２２）は、ＰＳＭＡ＋細胞に対するより低い結合親和性を示した。ＰＳＭＡ細胞系ＤＵ−１４５への非結合においてすべて少ないことが示された。ヒト化ＳＭＩＰ分子ＴＳＣ１８８およびＴＳＣ１８９の結合試験（図２Ａ）によって、親モノクローナル抗体に対する先に決定した親和性と同等の親和性（データは示さない）、同様に高い飽和レベルおよびＰＳＭＡ−ＤＵ−１４５細胞に勝るＰＳＭＡ＋Ｃ４−２細胞選択性が示された。ヒト化ＳＣＯＲＰＩＯＮ分子ＴＳＣ１９４およびＴＳＣ１９９の結合試験によって、親ヒト化ＳＭＩＰ分子ＴＳＣ１８８およびＴＳＣ１８９と同等の親和性（図２Ｂ）、ＰＳＭＡ−ＤＵ−１４５細胞系への非結合が示された。
実施例５
１０７−１Ａ４抗体、ＳＭＩＰおよびインターセプター足場間で見られる差動細胞内在化
内在化試験用の結合タンパク質をＣｙｐＨｅｒ（商標）５Ｅ Ｍｏｎｏ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃ＰＡ１５４０１）で製造業者の説明書に従い直接ラベル化した。ＣｙｐＨｅｒ５Ｅは、低ｐＨで蛍光を発光するｐＨ感受性紅色励起染色であり、典型的にはエンドソームおよびリソソームの内側と衝突する；ＣｙｐＨｅｒ５Ｅ蛍光は結果として、細胞内在化の代替物として使用することができる。新規ＤＭＳＯ中で溶解させた染色を、ＰＢＳ／炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．３（９：１）中の精製したタンパク質、染色：タンパク質モル比２０：１に加えた。暗闇、室温で少なくとも１時間インキュベート後、ラベル化タンパク質を４℃で透析によって未反応染色から分離した。吸光度２８０ｎｍおよび５００ｎｍを用いて、ラベル材料におけるタンパク質および染色濃度を計算した。得られた染色：タンパク質比６〜１４であり、この値を用いて造影データを正常化した。各分子の凝集値（＞５％）が検出可能である場合、タンパク質凝集の存在を確実にすることは内在化データのバイアスにならず、二次サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分子を非常に高均質性（＞９５％）まで純化した。
実験２日前、通常の培養培地中でポリ−Ｄ−リジンでコーティングした９６ウェルプレート、黒色透明底（ＢＤ Ｂｉｏｃｏａｔ、３５６６４０）内の４０００細胞／ウェルで細胞をプレート化した。実験中、慎重に培地を変更して表面への細胞付着を維持した。血清不含フェノールレッド不含ＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１１８３５）＋２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５６３０）（ＰＲＦ−ＲＰＭＩと呼ばれる）中のヘキスト ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｈ３５７０）で核を１時間染色した。ウェルをＰＲＦ−ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで洗浄し、１００μｌ温ＰＲＦ−ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳを添加した。プレートを氷に５分間移してから、各種希釈したラベル化結合タンパク質を５倍原液から添加して氷上で１時間結合させた。プレートを３７℃のＣＯ２インキュベーターに６０分間移して内在化させて進行させた。造影前、培地をＰＲＦ−ＲＰＭＩ＋１％ＦＢＳと交換した。
ＩＮ Ｃｅｌｌ分析器１０００自己細胞および亜細胞画像系（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でウェルをスキャンし、内在化タンパク質を定量し、データを各ウェル中の８フィールドから収集した。ヘキストおよびＣｙｐＨｅｒ５Ｅに設置された適切なフィルターならびに明視野画像でデータを収集するため、取得プロトコルを設定した。各核を包囲し、それらの領域を測定する細胞質ゾーン内で蛍光顆粒を検出するために開発されたプロトコルを用いて、データをＩＮ Ｃｅｌｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒソフトウェアによって分析した。検出した総小粒領域を正常化して、染色置換／ラベル化タンパク質の相対的レベルを補填した。
親１０７−１Ａ４マウス抗体、またはキメラＳＭＩＰおよびインターセプター分子を用いた内在化実験によって、ＰＳＭＡ−ＤＵ−１４５細胞系に内在化は示されなかったが（データは示さない）、一部の内在化はＰＳＭＡ＋ＬＮＣａＰ（ＣＲＬ−１７４０（商標）、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）またはＣ４−２細胞系上に検出できた（図３）。親抗体の内在化は、試験したすべての濃度でＳＭＩＰまたはインターセプター分子より高かった。（一価）インターセプター分子からの明らかな内在化は、（二価）ＳＭＩＰ分子からより高かった。これは高い潜在的結合化学量論に起因する可能性がある。各インターセプター分子はＰＳＭＡの１分子のみに関与することができ、各ＳＭＩＰ分子はＰＳＭＡの２分子に関与することができ、細胞表面上に蓄積するインターセプター分子は潜在的に２倍となる。インターセプター分子とＳＭＩＰ分子の両内在化値が類似する場合、常にインターセプター分子からより高い明らかなシグナルが見える。
実施例６
ＰＳＭＡ（＋）細胞系に対する再指向Ｔ細胞の細胞傷害
標準的なフィコール勾配を用いて、（ＡＧまたはＶＶとしてラベルした）２つの異なるドナー由来のヒト血液から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。単離細胞を緩衝生理食塩水中で洗浄した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）製Ｐａｎ Ｔ細胞単離キットＩＩを製造業者のプロトコルを用いて使用し、Ｔ細胞をさらに単離した。別段の記載のない限り、図（図４〜６参照）に記したように、刺激したまたは刺激しないＴ細胞を用い、１０：１比（Ｔ細胞：標的細胞）で添加した。
それらをＴ細胞から区別するために、製造業者のプロトコルに従ってＣ４−２去勢抵抗性前立腺癌（ＣＲＰＣ）細胞をＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ細胞質染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ７０２５）でラベルした。Ｔ細胞およびインターセプター分子を添加する前日、実施例３に使用されるように、標準的な増殖培地中８０００細胞／ウェルで、ラベル化Ｃ４−２細胞をポリ−Ｄ−リジンでコーティングした９６ウェルプレート内に播種した。１０μＬの濃縮二重特異性インターセプター分子（ＴＳＣ１２２、ＴＳＣ２００、ＴＳＣ２０２、またはＴＳＣ２０４）を標準的な増殖培地中１００μｌ培地／ウェル＋５０μＬ Ｔ細胞（８０，０００細胞）に加えた。細胞培養をＣＯ２インキュベーター内で３７℃で一晩保持した。インターセプター分子への曝露２４時間後、細胞を７−ＡＡＤおよびヘキスト染色で染色して死細胞の定量を可能にした。培地は１００μｌ ＲＰＭＩ＋１％ＦＢＳ＋１０μｇ／ｍｌ ７−ＡＡＤ＋ヘキスト、１：１０００希釈ストックに変更し、さらに３０分間インキュベートした。
１０フィールド／ウェルからデータを収集するＩｎＣｅｌｌ分析顕微鏡（ＧＥ）を用いて造影および定量を行った。ａ）ヘキスト染色を介した核検出、ｂ）ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ検出を介した細胞種識別、ｃ）７−ＡＡＤ染色を介した生／死細胞状態決定のために設置された適切なフィルターならびに明視野画像でデータを収集するため、取得プロトコルを設定した。ＩｎＣｅｌｌ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎソフトウェアによって決定木適応を用いて定量を行った。ヘキスト核染色の存在により各細胞を検出した。グリーンチャネル（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）Ｇｒｅｅｎ）中のシグナル閾値を用いて、細胞をＣ４−２（正）とＴ細胞（負）集団に分けた。レッドチャネル（７−ＡＡＤ）中のシグナル閾値を用いて、細胞を死細胞（正）と生細胞（負）集団に分けた。
１０７−１Ａ４マウスｓｃＦｖまたはヒト化１０７−１Ａ４ ｓｃＦｖのいずれかならびに抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃｒｉｓ７）を特徴とする二重特異性インターセプター分子のＴ細胞を標的ＰＳＭＡ＋腫瘍細胞に交差して標的依存性細胞傷害Ｔ細胞反応（いわゆる「再指向Ｔ細胞の細胞傷害」、またはＲＴＣＣ）を可能にする能力を試験した。２つの異なるドナー由来のＴ細胞を有するキメラＴＳＣ１２２インターセプター分子（図４）で強力な標的依存性細胞傷害活性が２４時間に渡り観察された；１００ｐＭほどの少ないＴＳＣ１２２インターセプター分子を用いた治療によって約６０％の標的細胞を溶解させた。エフェクターＴ細胞の不在下のＰＳＭＡ＋細胞上で、直接的な細胞傷害は観察されなかった（図４）；同様に、エフェクターＴ細胞の存在下のＰＳＭＡ細胞上で、細胞傷害は観察されなかった（データは示さない）。親キメラインターセプター分子（ＴＳＣ１２２）と共にヒト化インターセプター分子（ＴＳＣ２００、ＴＳＣ２０２、およびＴＳＣ２０４）の細胞傷害活性も試験した（図５）。ヒト化インターセプター分子の２つ（ＴＳＣ２００、ＴＳＣ２０４）のＲＴＣＣ活性は親より低いことが示された；ヒト化インターセプター分子の１つ（ＴＳＣ２０２）のＲＴＣＣ活性は親キメラインターセプター分子（ＴＳＣ１２２）と等しく、類似した低いｐＭ効力を有することが示された。これらの結果は、あるヒト化インターセプター分子は親キメラインターセプター分子と類似のＴ細胞の細胞傷害を有することを示した。
キメラインターセプター分子ＴＳＣ１２２の活性と比較したヒト化ＳＣＯＲＰＩＯＮ分子（ＴＳＣ１９４、ＴＳＣ１９９、ＴＳＣ２１２、ＴＳＣ２１３）の細胞傷害活性も検討した（図６）。ＶＬ−ＶＨ配向の抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖを有するヒト化ＳＣＯＲＰＩＯＮ分子（ＴＳＣ１９４、ＴＳＣ１９９）は、二重特異性キメラインターセプター分子（同様にＶＬ−ＶＨ配向のｓｃＦｖを有し、抗ＣＤ３ ｓｃＦｖ（Ｃｒｉｓ７）も含む）と同等の細胞傷害活性を有した。一方、ＶＨ−ＶＬ配向の抗ＰＳＭＡ ｓｃＦｖを有するヒト化ＳＣＯＲＰＩＯＮ分子の全体の細胞傷害はより低かった。
実施例７
二重特異性１０７−１Ａ４由来分子に導かれたＰＳＭＡ＋細胞系に対して誘発された標的依存性Ｔ細胞活性化および増殖
標的依存性Ｔ細胞活性化および増殖誘発時に異なる二重特異性ポリペプチド分子効果を比較するため、ＴＳＣ１２２（キメラインターセプター分子）、ＴＳＣ２０２（ヒト化インターセプター分子）、ＴＳＣ１９４（ヒト化ＳＣＯＲＰＩＯＮ分子）、およびＴＳＣ１９９（ヒト化ＳＣＯＲＰＩＯＮ分子）を含む４つの異なる抗ＰＳＭＡおよび抗ＣＤ３二重特異性分子を比較した。
提供されるプロトコルにより、Ｃ４−２前立腺癌細胞（ＰＳＭＡ＋）をＭＤアンダーソン癌センター（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）から得て培養した。標準的なフィコール勾配を用いて、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をヒト血液から単離した。単離細胞を緩衝生理食塩水中で洗浄した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ｂｅｒｇｉｓｃｈ Ｇｌａｄｂａｃｈ， Ｇｅｒｍａｎｙ）製Ｐａｎ Ｔ細胞単離キットＩＩを製造業者のプロトコルを用いて使用し、Ｔ細胞をさらに単離した。
カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）を用いた単離されたＴ細胞集団のラベル化によって増殖を評価した。Ｕ底９６ウェルプレート内でそれぞれ１００，０００細胞／ウェル、３０，０００ Ｃ４−２腫瘍細胞／ウェルでＣＦＳＥラベル化Ｔ細胞をプレート化し、Ｔ細胞対腫瘍細胞比約３：１に達した。試験分子濃度１０ｎＭ〜０．１ｐＭを１０％ヒトまたはウシ血清、ピルビン酸ナトリウムおよび非必須アミノ酸で補充されたＲＰＭＩ １６４０培地中総２００μｌ／ウェル中の細胞混合物に添加した。プレートを加湿インキュベーター内で３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。３日後、フローサイトメトリー分析用に細胞を抗体でラベルした。細胞をラベル化し、それらの元のプレート内で洗浄して移動中の細胞損失を最小限に抑え、０．２％ウシ血清アルブミンを有する緩衝生理食塩水中ですべてのラベル化を行った。まず、細胞を１００μｇ／ｍｌヒトＩｇＧで、室温で１５分間、前インキュベートした。続いて、細胞を次の染色ラベル抗体：ＣＤ５−ＰＥ、ＣＤ４−ＡＰＣ、ＣＤ８−パシフィックブルー、ＣＤ２５−ＰＥ−Ｃｙ７、ならびに７−アミノアクチノマイシンＤ（以後、７ＡＡＤ）の混合物（総容積５０μｌ）で４０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄し、８０〜１２０μｌ容積中で再懸濁し、ＢＤ ＬＳＲＩＩフローサイトメトリー中で迅速に測定して各ウェルの中味８０％を得た。活性化した生ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞（それぞれ７ＡＡＤ−、ＣＤ５＋ＣＤ２５＋ＣＤ４＋または７ＡＡＤ−ＣＤ５＋ＣＤ２５＋ＣＤ８＋）上の連続ゲーティングにより、それらのＣＦＳＥプロファイルによって、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて試料ファイルを分析し、少なくとも１つの細胞分裂で細胞の割合および数を計算した。マイクロソフトエクセルソフトウェアを用いて平均値および標準偏差を計数した。マイクロソフトエクセルまたはグラフパッドプリズムを用いてグラフをプロットした。
Ｔ細胞で処理したＣ４−２細胞を有するウェルからの生ＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団の分析（図７Ａおよび図７Ｂ）は、標的ＰＳＭＡ抗原を示すＣ４−２細胞存在下で総細胞数および増殖細胞パーセントの両方の有意な上昇を示した。増殖はＣＤ４＋Ｔ細胞においてＣＤ８＋Ｔ細胞よりわずかに高く、インターセプター分子ＴＳＣ１２２およびＴＳＣ２０２により誘発された増殖は、ＳＣＯＲＰＩＯＮ分子ＴＳＣ１９４およびＴＳＣ１９９により誘発された反応より高レベルで飽和した。全分子が低濃度（１００ｐＭ）でＴ細胞増殖の誘発を示した。分子間にＣＤ４＋対ＣＤ８＋細胞増殖の相対的誘発の明らかな有意差はなかった。
実施例８
抗ＰＳＭＡ分子の競合結合試験は１０７−１Ａ４がＰＳＭＡ上の独特なエピトープに結合することを確認する
共通の文献抗体（Ｊ４１５、Ｊ５９１）によって認識されないＰＳＭＡ上で、抗ＰＳＭＡマウスモノクローナル抗体１０７−１Ａ４、キメラ１０７−１Ａ４ ＳＭＩＰ分子（ＴＳＣ０８５）およびヒト化１０７−１Ａ４ ＳＭＩＰ分子（ＴＳＣ１８９）が独特なエピトープに結合し、マウスモノクローナル抗体１０７−１Ａ４のＳＭＩＰ形態への変換によってその結合エピトープ中でシフトしなかったことを示すため、競合結合実験を実施した。Ｊ５９１、Ｈｕ５９１（ヒト化版Ｊ５９１）を産生するハイブリドーマおよびＪ４１５抗体をＴＣＣから得た。モノクローナル抗体を標準的な手順によってハイブリドーマ細胞培養培地から精製した。ＳＭＩＰ分子をヒト２９３細胞の一過性トランスフェクションによって産生し、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。親和性クロマトグラフィー後に凝集が検出された場合、二次サイズ排除クロマトグラフィーも行ってタンパク質の均質性を確実にした。
ＰＳＭＡ＋Ｃ４−２前立腺癌細胞系上の競合結合試験を標準的なＦＡＣＳベースの染色手順によって行った。結合測定を簡略化するため、マウスＦｃドメインを有する分子に対する競合にヒトＦｃドメインを有する分子を用いて、抗ヒト抗体または抗マウス抗体のいずれかを用いて標的細胞系への結合を検出した。
典型的な実験では、分子Ｘ（結合剤）を分子Ｙ（競合物）と混合し、氷上に置き、次いで、氷上で４ｎＭ分子Ｘおよび１００μＬ ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％正常なヤギ血清＋２％胎児性ウシ血清＋０．１％アジ化ナトリウム）中２５０ｎＭ〜０．４ｎＭ分子Ｙで３００，０００細胞／ウェルのラベル化に用い、続いて洗浄し、分子Ｘに特異性の蛍光ラベル二次抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １１０１３＝５μｇ／ｍｌの１：４００希釈）またはヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ １１０１７の１：４００希釈）のいずれかでインキュベートした。細胞の二次抗体を洗浄後、細胞を７ＡＡＤ（６μＬ ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ ７ＡＡＤ、ｃａｔ＃５５９９２５）〜１００μＬ ＦＡＣＳ緩衝液）で２０分間インキュベートした。ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメトリーを用いて結合分子シグナルを検出し、ＦｌｏｗＪｏによって分析した。７ＡＡＤ＋細胞を分析から除外した。グラフパッドプリズムにおいてＥＣ５０を決定する非線形回帰分析を行った。
競合結合試験（図８Ａ）を用いて、ヒト化Ｊ５９１抗体、Ｈｕ５９１が１０７−１Ａ４、Ｊ５９１またはＪ４１５マウス抗体と細胞結合において競合し得るかどうかを見た。１０７−１Ａ４の結合において競合は観察されず、非競合エピトープに結合することを示唆する；しかしながら、Ｊ５９１およびＪ４１５抗体の両結合においては競合が観察された。次に、追加の結合試験を実施して、３つのマウス抗体がキメラ１０７−１Ａ４ ＳＭＩＰ分子ＴＳＣ０８５と細胞結合において競合し得るかどうかを見た（図８Ｂ）。親１０７−１Ａ４抗体の結合から強い競合が見え、ＳＭＩＰ分子が同一エピトープに結合することが確認された。Ｊ５９１またはＪ４１５マウス抗体から効果的な競合は見えなかった。最後に結合試験を実施して、３つのマウス抗体がヒト化１０７−１Ａ４ ＳＭＩＰ分子ＴＳＣ１８９と細胞結合において競合し得るかどうかを見た（図８Ｃ）。やはり、親１０７−１Ａ４抗体の結合から同様の強い競合が見えたが、Ｊ５９１またはＪ４１５マウス抗体から効果的な競合は見えなかった。これは、１０７−１Ａ４はＰＳＭＡ上の独特なエピトープに結合することを確認する。これは、１０７−１Ａ４ベースのＳＭＩＰおよび親１０７−１Ａ４抗体由来のインターセプター分子の行動におけるシフトはいずれも、結合エピトープ中のシフトによるものではないことも示す。
実施例９
抗ＰＳＭＡ二重特異性分子を用いたｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍成長の阻害
ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍成長の阻害における本明細書に開示の抗ＰＳＭＡ二重特異性分子（例えば、抗ＰＳＭＡおよび抗ＣＤ３二重特異性分子）の効果を確認するため、抗ＰＳＭＡ二重特異性分子を以下のとおり評価する。
皮下腫瘍の腫瘍移植の予防処置、または予防：培養したＰＳＭＡ発現腫瘍細胞系（ＬＮＣａＰ、ＬＮＣａＰ Ｃ４−２、ＬＮＣａＰ Ｃ４−２Ｂ、ＶＣａＰ、ＣＷＲ２２Ｒｖ１、ＬＡＰＣ４、ＭＤＡ−ＰＣａ−２ｂ、ＬｕＣａＰ２３．１、ＬｕＣａＰ５８、ＬｕＣａＰ７０、ＬｕＣａＰ７７等）をヒトリンパ球（ヒト末梢血単核細胞もしくは精製したＴ細胞のいずれか）と混合して、免疫欠損マウス（ＳＣＩＤ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ等）に皮下注射する。抗ＰＳＭＡ二重特異性分子は、注射日および連日数日間静脈内注射する。腫瘍容積によって評価した用量依存性の腫瘍成長阻害から、それぞれの分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ ＰＳＭＡ発現腫瘍に対して効果を有することが示される。
先に確立された皮下腫瘍の治療的処置、または退行：培養したＰＳＭＡ発現腫瘍細胞系（ＬＮＣａＰ、ＬＮＣａＰ Ｃ４−２、ＬＮＣａＰ Ｃ４−２Ｂ、ＶＣａＰ、ＣＷＲ２２Ｒｖ１、ＬＡＰＣ４、ＭＤＡ−ＰＣａ−２ｂ、ＬｕＣａＰ２３．１ＡＩ、ＬｕＣａＰ５８、ＬｕＣａＰ７０、ＬｕＣａＰ７７等）を免疫欠損マウス（ＳＣＩＤ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ等）に皮下注射する。腫瘍成長をモニタリングして、腫瘍が確立された増殖徴候（典型的には容積２００ｍｍ３）を示した時点で試験を開始する。ヒトリンパ球（ヒト末梢血単核細胞もしくは精製したＴ細胞のいずれか）を注射日に抗ＰＳＭＡ二重特異性分子と共に静脈内注射する。抗ＰＳＭＡ二重特異性分子は、連日数日間注射する。腫瘍容積によって評価した用量依存性の腫瘍成長阻害から、それぞれの分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ ＰＳＭＡ発現腫瘍に対して効果を有することが示される。
脛骨内腫瘍の腫瘍移植の予防処置、または予防：培養したＰＳＭＡ発現腫瘍細胞系（ＬＮＣａＰ Ｃ４−２、ＬＮＣａＰ Ｃ４−２Ｂ、ＶＣａＰ、ＣＷＲ２２Ｒｖ１、ＬＡＰＣ４、ＭＤＡ−ＰＣａ−２ｂ、ＬｕＣａＰ２３．１、ＬｕＣａＰ５８、ＬｕＣａＰ７０、ＬｕＣａＰ７７等）をヒトリンパ球（ヒト末梢血単核細胞もしくは精製したＴ細胞のいずれか）と混合して、免疫欠損マウス（ＳＣＩＤ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ等）に脛骨内注射する。抗ＰＳＭＡ二重特異性分子は、注射日および連日数日間静脈内注射する。血清生物指標、Ｘ線、蛍光造影、体重減少、および他の代替的な腫瘍容積測定によって評価した用量依存性の腫瘍成長阻害から、それぞれの分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ ＰＳＭＡ発現腫瘍に対して効果を有することが示される。
先に確立された脛骨内腫瘍の治療的処置、または退行：培養したＰＳＭＡ発現腫瘍細胞系（ＬＮＣａＰ Ｃ４−２、ＬＮＣａＰ Ｃ４−２Ｂ、ＶＣａＰ、ＣＷＲ２２Ｒｖ１、ＬＡＰＣ４、ＭＤＡ−ＰＣａ−２ｂ、ＬｕＣａＰ２３．１ＡＩ、ＬｕＣａＰ５８、ＬｕＣａＰ７０、ＬｕＣａＰ７７等）を免疫欠損マウス（ＳＣＩＤ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ等）に脛骨内注射する。腫瘍成長をモニタリングして、腫瘍が確立された増殖徴候（典型的には容積２００ｍｍ３）を示した時点で試験を開始する。ヒトリンパ球（ヒト末梢血単核細胞もしくは精製したＴ細胞のいずれか）を注射日に抗ＰＳＭＡ二重特異性分子と共に静脈内注射する。抗ＰＳＭＡ二重特異性分子は、連日数日間注射する。血清生物指標、Ｘ線、蛍光造影、体重減少、および他の代替的な腫瘍容積測定によって評価した用量依存性の腫瘍成長阻害から、それぞれの分子は、ｉｎ ｖｉｖｏ ＰＳＭＡ発現腫瘍に対して効果を有することが示される。

Claims (153)

  1. 前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）結合ポリペプチドであり、
    アミノ末端からカルボキシル末端側への順でまたはカルボキシル末端からアミノ末端側への順で、
    （ａ）ヒトＰＳＭＡと特異的結合するＰＳＭＡ結合ドメイン、
    （ｂ）ヒンジ領域、および
    （ｃ）免疫グロブリン定常領域、
    を含む、ＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  2. ＰＳＭＡ結合ドメインが、配列番号２１で表されるアミノ酸配列を有する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）とヒトＰＳＭＡ結合において競合する、請求項１のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  3. ＰＳＭＡ結合ドメインが、（ｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、ならびに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項１または２のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  4. ＬＣＤＲ３が、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３が、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有する、請求項３のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  5. ＬＣＤＲ１およびＬＣＤＲ２が、それぞれ配列番号１５および配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ２が、それぞれ配列番号９および配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する、請求項４のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  6. 軽鎖可変および重鎖可変領域の少なくとも１つがヒト化されている、請求項３乃至請求項５のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  7. 軽鎖可変領域が、配列番号５または配列番号２３で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３乃至請求項６のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  8. 軽鎖可変領域が、配列番号５または配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む、請求項７のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  9. 重鎖可変領域が、配列番号２、配列番号２５、または配列番号２７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３乃至請求項８のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  10. 重鎖可変領域が、配列番号２、配列番号２５、または配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む、請求項９のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  11. ＰＳＭＡ結合ドメインがｓｃＦｖである、請求項３乃至請求項１０のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  12. 前記ｓｃＦｖが、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、または配列番号３５で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１１のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  13. 前記ｓｃＦｖが、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、または配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１２のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  14. 前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域が、軽鎖可変領域に対するカルボキシ末端である、請求項１１のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  15. 前記ｓｃＦｖが、配列番号２１、配列番号３０、または配列番号３１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１４のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  16. 前記ｓｃＦｖが、配列番号２１、配列番号３０、または配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む、請求項１５のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  17. 前記ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域が、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、式中ｎ＝１〜５（配列番号１６５）を含むアミノ酸配列によって結合している、請求項１１または１４のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  18. ヒンジ領域が、免疫グロブリンのヒンジ領域由来である、請求項１乃至請求項１７のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  19. 免疫グロブリン定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２またはＩｇＤの免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、請求項１乃至請求項１８のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  20. 前記ヒンジ領域が、免疫グロブリンのヒンジ領域由来であり、免疫グロブリン定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、請求項１９のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  21. 前記ＰＳＭＡ結合ポリペプチドが、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）からなる群から選択される少なくとも１つのエフェクター機能を含む、請求項１乃至請求項２０のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  22. 前記ＰＳＭＡ結合ポリペプチドが、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号７０、または配列番号７２で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  23. 前記ＰＳＭＡ結合ポリペプチドが、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号７０、または配列番号７２で表されるアミノ酸配列を含む、請求項２２のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  24. （ｄ）免疫グロブリン定常領域に対する第２ヒンジ領域カルボキシ末端、および
    （ｅ）第２ヒンジ領域に対する第２結合ドメインカルボキシ末端をさらに含む、請求項１乃至請求項２３のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  25. 第２ヒンジ領域が、（ｉ）２型Ｃレクチンの軸領域または（ｉｉ）免疫グロブリンのヒンジ領域由来である、請求項２４のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  26. 前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）結合ポリペプチドであり、
    第１結合ドメインが（ｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、ならびに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む；
    ＬＣＤＲ３が配列番号１７で表されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３が配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有するヒトＰＳＭＡと特異的結合する第１結合ドメインを含む、ＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  27. ＬＣＤＲ１およびＬＣＤＲ２が、それぞれ配列番号１５および配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ２が、それぞれ配列番号９および配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する、請求項２６のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  28. 軽鎖可変および重鎖可変領域の少なくとも１つがヒト化されている、請求項２６または２７のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  29. 軽鎖可変領域が、配列番号５または配列番号２３で表されるアミノ酸配列を有する、請求項２７のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  30. 重鎖可変領域が、配列番号２、配列番号２５、または配列番号２７で表されるアミノ酸配列を有する、請求項２７または２９のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  31. 第１結合ドメインが単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項２６乃至請求項３０のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  32. 前記ｓｃＦｖが、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、または配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む、請求項３１のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  33. 前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域が、軽鎖可変領域に対するカルボキシ末端である、請求項３１のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  34. 前記ｓｃＦｖが、配列番号２１、配列番号３０、または配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む、請求項３３のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  35. ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域が、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、式中ｎ＝１〜５（配列番号１６５）を含むアミノ酸配列によって結合している、請求項３１または３３のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  36. 前記ＰＳＭＡ結合ポリペプチドが免疫グロブリン定常領域をさらに含む、請求項２６乃至請求項３５のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  37. 前記免疫グロブリン定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２またはＩｇＤの免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、請求項３６のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  38. 前記ＰＳＭＡ結合ポリペプチドが、（ｉ）２型Ｃレクチンの軸領域または（ｉｉ）免疫グロブリンのヒンジ領域由来である少なくとも１つのヒンジ領域をさらに含む、請求項３６のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  39. 前記ＰＳＭＡ結合ポリペプチドが第２結合ドメインをさらに含む、請求項２６乃至請求項３８のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  40. 前記ＰＳＭＡ結合ポリペプチドが、アミノ末端からカルボキシル末端側への順でまたはカルボキシル末端からアミノ末端側への順で、
    （ａ）第１結合ドメイン、
    （ｂ）第１ヒンジ領域、
    （ｃ）免疫グロブリン定常領域、
    （ｄ）第２ヒンジ領域、および
    （ｅ）第２結合ドメイン
    を含む、請求項３９のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  41. 前記ＰＳＭＡ結合ポリペプチドが、アミノ末端からカルボキシル末端側への順で、
    （ａ）第１結合ドメイン、
    （ｂ）ヒンジ領域、および
    （ｃ）免疫グロブリン定常領域
    を含む、請求項３６のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  42. 前記ＰＳＭＡ結合ポリペプチドが
    （ｄ）免疫グロブリン定常領域に対する第２ヒンジ領域カルボキシ末端、および
    （ｅ）第２ヒンジ領域に対する第２結合ドメインカルボキシ末端
    をさらに含む、請求項４１のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  43. 前記ＰＳＭＡ結合ポリペプチドが、アミノ末端からカルボキシル末端側への順で、
    （ａ）免疫グロブリン定常領域、
    （ｂ）ヒンジ領域、および
    （ｃ）第１結合ドメイン
    を含む、請求項３６のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  44. 前記ＰＳＭＡ結合ポリペプチドが、
    （ｄ）免疫グロブリン定常領域に対する第２ヒンジ領域アミノ末端、および
    （ｅ）第２ヒンジ領域に対する第２結合ドメインアミノ末端
    を含む、請求項４３のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  45. 第２結合ドメインが、Ｔ細胞と特異的結合している、請求項２４、２５、３９、４０、４２、および４４のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  46. 第２結合ドメインが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体またはその成分と特異的結合している、請求項４５のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  47. 第２結合ドメインが、ＣＤ３と特異的結合している、請求項４６のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  48. 第２結合ドメインが、ＣＤ３εと特異的結合している、請求項４７のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  49. 第２結合ドメインが、ＣＲＩＳ−７およびＨｕＭ２９１からなる群から選択されるモノクローナル抗体とＣＤ３ε結合において競合する、請求項４８のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  50. 第２結合ドメインが、ＣＲＩＳ−７およびＨｕＭ２９１からなる群から選択されるモノクローナル抗体由来である免疫グロブリン軽鎖可変領域および免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項４９のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  51. 第２結合ドメインの軽鎖および重鎖可変領域が、モノクローナル抗体の軽鎖および重鎖ＣＤＲをそれぞれ含むヒト化可変領域である、請求項５０のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  52. 第２結合ドメインの軽鎖および重鎖可変領域が、
    （ａ）配列番号４７の残基１３９〜２４５で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号４７の残基１〜１２１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
    （ｂ）配列番号７８の残基６３４〜７４０で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号７８の残基４９６〜６１６で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域からなる群から選択される、請求項５０のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  53. 第２結合ドメインの軽鎖および重鎖可変領域が、
    （ａ）配列番号４７の残基１３９〜２４５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号４７の残基１〜１２１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
    （ｂ）配列番号７８の残基６３４〜７４０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号７８の残基４９６〜６１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域からなる群から選択される、請求項５０のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  54. 第２結合ドメインがｓｃＦｖである、請求項３９、４０、４２、および４４乃至５３のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  55. 第２結合ドメインが、（ｉ）配列番号４７の残基１〜２４５で表されるアミノ酸配列、および（ｉｉ）配列番号７８の残基４９６〜７４２で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである、請求項５０のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  56. 第２結合ドメインが、（ｉ）配列番号４７の残基１〜２４５で表されるアミノ酸配列、および（ｉｉ）配列番号７８の残基４９６〜７４２で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５５のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  57. 前記ＰＳＭＡ結合ポリペプチドが、配列番号４９、配列番号５１、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、または配列番号１６４で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項５４のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  58. 前記ＰＳＭＡ結合ポリペプチドが、配列番号４９、配列番号５１、配列番号７４、配列番号７６、配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、または配列番号１６４で表されるアミノ酸配列を含む、請求項５４のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  59. 前記ポリペプチド鎖のそれぞれが、請求項１乃至請求項５８のいずれか一項のＰＳＭＡ結合ポリペプチドである、第１および第２ポリペプチド鎖を含む二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  60. アミノ末端からカルボキシル末端側への順で、
    （ａ）ヒトＰＳＭＡと特異的結合する結合ドメイン、
    （ｂ）ヒンジ領域、
    （ｃ）免疫グロブリン定常領域、および
    （ｄ）免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン
    を含む、ＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  61. 結合ドメインが、配列番号２１で表されるアミノ酸配列を有する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）とヒトＰＳＭＡ結合において競合する、請求項６０のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  62. 結合ドメインが、（ｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、ならびに（ｉｉ）およびＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項６０または６１のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  63. ＬＣＤＲ３が、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３が、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有する、請求項６２のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  64. ＬＣＤＲ１およびＬＣＤＲ２が、それぞれ配列番号１５および配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ２が、それぞれ配列番号９および配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する、請求項６３のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  65. 軽鎖可変および重鎖可変領域の少なくとも１つがヒト化されている、請求項６２乃至請求項６４のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  66. 軽鎖可変領域が、配列番号５または配列番号２３で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項６２乃至請求項６５のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  67. 軽鎖可変領域が、配列番号５または配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む、請求項６６のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  68. 重鎖可変領域が、配列番号２、配列番号２５、または配列番号２７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項６２乃至請求項６７のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  69. 重鎖可変領域が、配列番号２、配列番号２５、または配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む、請求項６８のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  70. 結合ドメインがｓｃＦｖである、請求項６２乃至請求項６９のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  71. 前記ｓｃＦｖが、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、または配列番号３５で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項７０のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  72. 前記ｓｃＦｖが、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、または配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む、請求項７１のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  73. 前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域が、軽鎖可変領域に対しカルボキシ末端である、請求項７０のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  74. 前記ｓｃＦｖが、配列番号２１、配列番号３０、または配列番号３１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項７３のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  75. ｓｃＦｖが、配列番号２１、配列番号３０、または配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む、請求項７４のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  76. ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域が、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、式中ｎ＝１〜５（配列番号１６５）を含むアミノ酸配列によって結合している、請求項７０または７３のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  77. 免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインが、免疫グロブリンＣＨ１ドメインまたは免疫グロブリンＣＬドメインを含む、請求項６０乃至請求項７６のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  78. 免疫グロブリン定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、もしくは任意のそれらの組み合わせの免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメイン；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭもしくは任意のそれらの組み合わせの免疫グロブリンＣＨ３ドメイン；またはＩｇＥ、ＩｇＭもしくはそれらの組み合わせの免疫グロブリンＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含む、請求項６０乃至請求項７７のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  79. ヒンジ領域が、免疫グロブリンのヒンジ領域由来であり、免疫グロブリン定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、請求項７８のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  80. ＰＳＭＡ結合ポリペプチドが、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）からなる群から選択される少なくとも１つのエフェクター機能を含む、請求項６０乃至請求項７９のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  81. 前記ＰＳＭＡ結合ポリペプチドが、配列番号４６、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、または配列番号６１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項６０のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  82. 前記ＰＳＭＡ結合ポリペプチドが、配列番号４６、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、または配列番号６１で表されるアミノ酸配列を含む、請求項８１のＰＳＭＡ結合ポリペプチド。
  83. （１）アミノ末端からカルボキシル末端側への順で、
    （ａ）ヒトＰＳＭＡと特異的結合する第１結合ドメイン、
    （ｂ）第１ヒンジ領域、
    （ｃ）第１免疫グロブリン定常領域、および
    （ｄ）第１免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン
    を含む第１ポリペプチド鎖、ならびに
    （２）アミノ末端からカルボキシル末端側への順で、
    （ａ’）第２ヒンジ領域、
    （ｂ’）第２免疫グロブリン定常領域、および
    （ｃ’）第１単鎖ポリペプチドの第１免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインと異なる第２免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメイン
    を含む第２ポリペプチド鎖
    を含むヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質であり、
    第１および第２免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインが互いに結合してヘテロ二量体を形成する、ヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  84. 第１結合ドメインが、配列番号２１で表されるアミノ酸配列を有する単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）とヒトＰＳＭＡ結合において競合する、請求項８３のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  85. ＰＳＭＡ結合ドメインが、（ｉ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む免疫グロブリン軽鎖可変領域、ならびに（ｉｉ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項８３または８４のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  86. ＬＣＤＲ３が、配列番号１７で表されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ３が、配列番号１１で表されるアミノ酸配列を有する、請求項８５のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  87. ＬＣＤＲ１およびＬＣＤＲ２が、それぞれ配列番号１５および配列番号１６で表されるアミノ酸配列を有し、ＨＣＤＲ１およびＨＣＤＲ２が、それぞれ配列番号９および配列番号１０で表されるアミノ酸配列を有する、請求項８６のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  88. 軽鎖可変および重鎖可変領域の少なくとも１つがヒト化されている、請求項８５乃至請求項８７のいずれかのヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  89. 軽鎖可変領域が、配列番号５または配列番号２３で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項８５乃至請求項８８のいずれかのヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  90. 軽鎖可変領域が、配列番号５または配列番号２３で表されるアミノ酸配列を含む、請求項８９のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  91. 重鎖可変領域が、配列番号２、配列番号２５、または配列番号２７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項８５乃至請求項９０のいずれかのヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  92. 重鎖可変領域が、配列番号２、配列番号２５、または配列番号２７で表されるアミノ酸配列を含む、請求項９１のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  93. ＰＳＭＡ結合ドメインがｓｃＦｖである、請求項８５乃至請求項９２のいずれかのヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  94. 前記ｓｃＦｖが、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、または配列番号３５で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９３のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  95. 前記ｓｃＦｖが、配列番号１９、配列番号２１、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、または配列番号３５で表されるアミノ酸配列を含む、請求項９４のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  96. 前記ｓｃＦｖの重鎖可変領域が、軽鎖可変領域に対しカルボキシ末端である、請求項９３のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  97. ｓｃＦｖが、配列番号２１、配列番号３０、または配列番号３１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９６のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  98. ｓｃＦｖが、配列番号２１、配列番号３０、または配列番号３１で表されるアミノ酸配列を含む、請求項９７のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  99. ｓｃＦｖの軽鎖可変領域および重鎖可変領域が、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ、式中ｎ＝１〜５（配列番号１６５）を含むアミノ酸配列によって結合している、請求項９３または９６のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  100. 第１免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインが、第１免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含み、第２免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインが、第１免疫グロブリンＣＬドメインを含み、または
    第１免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインが、第１免疫グロブリンＣＬドメインを含み、第２免疫グロブリンヘテロ二量体化ドメインが、第１免疫グロブリンＣＨ１ドメインを含む、請求項８３乃至請求項９９のいずれかのヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  101. 第１および第２免疫グロブリン定常領域の少なくとも１つが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、もしくは任意のそれらの組み合わせの免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメイン；ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭもしくは任意のそれらの組み合わせの免疫グロブリンＣＨ３ドメイン；またはＩｇＥ、ＩｇＭもしくはそれらの組み合わせの免疫グロブリンＣＨ３およびＣＨ４ドメインを含む、請求項８３乃至請求項１００のいずれかのヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  102. 第１および第２ヒンジ領域のそれぞれが、免疫グロブリンのヒンジ領域に由来し、第１および第２免疫グロブリン定常領域のそれぞれが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４の免疫グロブリンＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、請求項１０１のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  103. 第１および第２ポリペプチド鎖の少なくとも１つが、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）からなる群から選択される少なくとも１つのエフェクター機能を含む、請求項８３乃至請求項１０２のいずれかのヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  104. 前記第２ポリペプチド鎖が第２結合ドメインをさらに含む、請求項８３乃至請求項１０３のいずれかのヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  105. 第２結合ドメインが、第２ヒンジ領域に対するアミノ末端である、請求項１０４のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  106. 第２結合が、Ｔ細胞と特異的結合している、請求項１０４または１０５のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  107. 第２結合ドメインが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体またはその成分と特異的結合している、請求項１０６のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  108. 第２結合ドメインが、ＣＤ３と特異的結合している、請求項１０７のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  109. 第２結合ドメインが、ＣＤ３εと特異的結合している、請求項１０８のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  110. 第２結合ドメインが、ＣＲＩＳ−７およびＨｕＭ２９１からなる群から選択されるモノクローナル抗体とＣＤ３ε結合において競合する、請求項１０９のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  111. 第２結合ドメインが、ＣＲＩＳ−７およびＨｕＭ２９１からなる群から選択されるモノクローナル抗体由来である免疫グロブリン軽鎖可変領域および免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、請求項１１０のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  112. 第２結合ドメインの軽鎖および重鎖可変領域が、モノクローナル抗体の軽鎖ＣＤＲおよび重鎖ＣＤＲをそれぞれ含むヒト化可変領域である、請求項１１１のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  113. 第２結合ドメインの軽鎖および重鎖可変領域が、
    （ａ）配列番号４７の残基１３９〜２４５で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号４７の残基１〜１２１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
    （ｂ）配列番号７８の残基６３４〜７４０で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号７８の残基４９６〜６１６で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    からなる群から選択される、請求項１１１のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  114. 軽鎖および重鎖可変領域が、
    （ａ）配列番号４７の残基１３９〜２４５で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号４７の残基１〜１２１で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、ならびに
    （ｂ）配列番号７８の残基６３４〜７４０で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および配列番号７８の残基４９６〜６１６で表されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域
    からなる群から選択される、請求項１１１のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  115. 第２結合ドメインがｓｃＦｖである、請求項１０４乃至請求項１１４のいずれかのヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  116. 第２結合ドメインが、（ｉ）配列番号４７の残基１〜２４５で表されるアミノ酸配列、および（ｉｉ）配列番号７８の残基４９６〜７４２で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むｓｃＦｖである、請求項１１１のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  117. 第２結合ドメインｓｃＦｖが、（ｉ）配列番号４７の残基１〜２４５で表されるアミノ酸配列、および（ｉｉ）配列番号７８の残基４９６〜７４２で表されるアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１１６のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  118. （ａ）第１ポリペプチド鎖が、配列番号４６で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチド鎖が、配列番号４７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む；
    （ｂ）第１ポリペプチド鎖が、配列番号５８で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチド鎖が、配列番号５７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む；
    （ｃ）第１ポリペプチド鎖が、配列番号５９で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチド鎖が、配列番号５７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む；
    （ｄ）第１ポリペプチド鎖が、配列番号６０で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチド鎖が、配列番号４７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む；または
    （ｅ）第１ポリペプチド鎖が、配列番号６１で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチド鎖が、配列番号４７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、
    請求項１１５のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  119. （ａ）第１ポリペプチド鎖が、配列番号４６で表されるアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチド鎖が、配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む；
    （ｂ）第１ポリペプチド鎖が、配列番号５８で表されるアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチド鎖が、配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む；
    （ｃ）第１ポリペプチド鎖が、配列番号５９で表されるアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチド鎖が、配列番号５７で表されるアミノ酸配列を含む；
    （ｄ）第１ポリペプチド鎖が、配列番号６０で表されるアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチド鎖が、配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む；または
    （ｅ）第１ポリペプチド鎖が、配列番号６１で表されるアミノ酸配列を含み、第２ポリペプチド鎖が、配列番号４７で表されるアミノ酸配列を含む、
    請求項１１８のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質。
  120. ＰＳＭＡ結合タンパク質が、マウスモノクローナル抗体１０７−１Ａ４と比較してＰＳＭＡ発現細胞によって延長された血清半減期、低減した内在化、および／またはＰＳＭＡ発現細胞表面上の延長された持続時間を示す、請求項５９および請求項８３乃至請求項１１９のいずれかのＰＳＭＡ結合タンパク質。
  121. 請求項１乃至請求項５８および請求項６０乃至請求項８２のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチドをコードする単離核酸。
  122. 核酸が、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、または配列番号１６３で表されるヌクレオチド配列を含む、請求項１２１の単離核酸。
  123. 核酸セグメントが、宿主細胞内核酸セグメントの発現に適した調節配列に使用可能に結合されている、請求項１乃至請求項５８および請求項６０乃至請求項８２のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む発現ベクター。
  124. 核酸セグメントが、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３６、配列番号３７、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４４、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７５、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、または配列番号１６３で表されるヌクレオチド配列を含む、請求項１２３の発現ベクター。
  125. 請求項１２３または１２４の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
  126. 第１および第２発現単位がそれぞれ請求項８３乃至請求項１１９のいずれかに説明されるヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質の第１および第２ポリペプチド鎖をコードする第１および第２核酸セグメントを含み、
    第１および第２核酸セグメントが、宿主細胞内核酸セグメントの発現に適した調節配列に使用可能に連結している、第１および第２発現単位を含む発現ベクター。
  127. （ａ）第１核酸セグメントが、配列番号４４で表されるヌクレオチド配列を含み、第２核酸セグメントが、配列番号４５で表されるヌクレオチド配列を含む；
    （ｂ）第１核酸セグメントが、配列番号５３で表されるヌクレオチド配列を含み、第２核酸セグメントが、配列番号５２で表されるヌクレオチド配列を含む；
    （ｃ）第１核酸セグメントが、配列番号５４で表されるヌクレオチド配列を含み、第２核酸セグメントが、配列番号５２で表されるヌクレオチド配列を含む；
    （ｄ）第１核酸セグメントが、配列番号５５で表されるヌクレオチド配列を含み、第２核酸セグメントが、配列番号４５で表されるヌクレオチド配列を含む；または
    （ｅ）第１核酸セグメントが、配列番号５６で表されるヌクレオチド配列を含み、第２核酸セグメントが、配列番号４５で表されるヌクレオチド配列を含む、
    請求項１２６の発現ベクター。
  128. 請求項１２６または１２７の発現ベクターを含む組換え宿主細胞。
  129. ＰＳＭＡ結合ポリペプチドの産生方法であり、該方法が、
    核酸セグメントが発現する条件下で、請求項１２３または１２４の発現ベクターを含む組換え宿主細胞を培養し、したがって、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドを産生することを含む、ＰＳＭＡ結合ポリペプチドの産生方法。
  130. ＰＳＭＡ結合ポリペプチド回収をさらに含む、請求項１２９に記載の方法。
  131. 二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質の産生方法であり、該方法が、
    発現ベクターを含む組換え宿主細胞を培養することを含み、発現ベクターが、請求項１乃至請求項５８のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含み、核酸セグメントが、宿主細胞内核酸セグメントの発現に適した調節配列に使用可能に結合されている、および
    前記培養が、核酸セグメントが発現し、コードされたＰＳＭＡ結合ポリペプチドが、二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質として産生する条件下にある、二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質の産生方法。
  132. 二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質回収をさらに含む、請求項１３１に記載の方法。
  133. ヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質の産生方法であり、該方法が、
    第１および第２発現単位を含む組換え宿主細胞を培養することを含み、第１および第２発現単位がそれぞれ請求項８３乃至請求項１１９のいずれかに説明されるヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質の第１および第２ポリペプチド鎖をコードする第１および第２核酸セグメントを含み、第１および第２核酸セグメントが、宿主細胞内核酸セグメントの発現に適した調節配列に使用可能に連結している、および
    前記培養が、第１および第２核酸セグメントが発現し、コードされたポリペプチド鎖が、ヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質として産生する条件下にある、
    ヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質の産生方法。
  134. ヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質回収をさらに含む、請求項１３３に記載の方法。
  135. 請求項５９のＰＳＭＡ結合タンパク質、ならびに
    医薬上許容される担体、希釈液、または賦形剤
    を含む組成物。
  136. 請求項８３乃至請求項１１９のいずれかのヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質、ならびに
    医薬上許容される担体、希釈液、または賦形剤
    を含む組成物。
  137. 前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）発現細胞に対する抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の少なくとも１つの誘発方法であり、該方法が、
    前記ＰＳＭＡ発現細胞を第１および第２ポリペプチド鎖を含む二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質と接触させることを含み、前記ポリペプチド鎖のそれぞれが、請求項２０または２１のＰＳＭＡ結合ポリペプチドであり、前記接触が、ＰＳＭＡ発現細胞に対してＡＤＣＣおよびＣＤＣの少なくとも１つを誘発する条件下にある、
    ＡＤＣＣおよびＣＤＣの少なくとも１つの誘発方法。
  138. 前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）発現細胞に対する抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の少なくとも１つの誘発方法であり、該方法が、
    前記ＰＳＭＡ発現細胞を請求項１０２または１０３のヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質と接触させることを含み、前記接触が、ＰＳＭＡ発現細胞に対してＡＤＣＣおよびＣＤＣの少なくとも１つを誘発する条件下にある、
    ＡＤＣＣおよびＣＤＣ誘発方法の少なくとも１つの誘発方法。
  139. 前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）発現細胞に対する再指向Ｔ細胞の細胞傷害（ＲＴＣＣ）誘発方法であり、該方法が、
    前記ＰＳＭＡ発現細胞を、第１および第２ポリペプチド鎖を含む二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質と接触させることを含み、前記ポリペプチド鎖のそれぞれが、請求項４５乃至請求項５８のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチドであり、前記接触が、ＰＳＭＡ発現細胞に対してＲＴＣＣを誘発する条件下にある、
    ＲＴＣＣ誘発方法。
  140. 前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）発現細胞に対する再指向Ｔ細胞の細胞傷害（ＲＴＣＣ）誘発方法であり、該方法が、
    前記ＰＳＭＡ発現細胞を請求項１０６乃至請求項１１９のいずれかのヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質と接触させることを含み、前記接触が、ＰＳＭＡ発現細胞に対してＲＴＣＣを誘発する条件下にある、
    ＲＴＣＣ誘発方法。
  141. 前記障害が、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の過剰発現を特徴とし、該方法が、
    治療有効量の請求項５９の二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質を対象に投与することを含む、対象の障害の処置方法。
  142. 二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質の第１および第２ポリペプチド鎖が、請求項４５乃至請求項５８のいずれかのＰＳＭＡ結合ポリペプチドであり、二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質が対象中の再指向Ｔ細胞の細胞傷害（ＲＴＣＣ）を誘発する、請求項１４１に記載の方法。
  143. 前記障害が、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の過剰発現を特徴とし、該方法が、
    治療有効量の請求項８３乃至請求項１１９のいずれかのヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質を対象に投与することを含む、対象の障害の処置方法。
  144. ヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質が、請求項１０６乃至請求項１１９のいずれかのタンパク質であり、ヘテロ二量体ＰＳＭＡ結合タンパク質が対象中の再指向Ｔ細胞の細胞傷害（ＲＴＣＣ）を誘発する、請求項１４３に記載の方法。
  145. 障害が、癌である、請求項１４１乃至請求項１４４のいずれかに記載の方法。
  146. 癌が、前立腺癌、大腸癌、および胃癌からなる群から選択される、請求項１４５に記載の方法。
  147. 癌が、前立腺癌である、請求項１４６に記載の方法。
  148. 前立腺癌が、去勢抵抗性前立腺癌である、請求項１４７に記載の方法。
  149. 障害が、前立腺障害である、請求項１４１乃至請求項１４４のいずれかに記載の方法。
  150. 前立腺障害が、前立腺癌および良性前立腺肥大症からなる群から選択される、請求項１４９に記載の方法。
  151. 障害が、新生血管障害である、請求項１４１乃至請求項１４４のいずれかに記載の方法。
  152. 新生血管障害が、固体腫瘍成長を特徴とする癌である、請求項１５１に記載の方法。
  153. 癌が、淡明細胞型腎細胞癌、大腸癌、膀胱癌、および肺癌からなる群から選択される、請求項１５２に記載の方法。
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