KR20140036905A - 이중특이 항체를 포함하는 단백질 복합체 - Google Patents

Abstract

이중특이 항체를 포함하는 단백질 복합체 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 일 구체예에 따른 단백질 복합체를 이용하면, 2개의 항원을 동시에 표적으로 하는 시스템을 효과적으로 구축할 수 있다.

Description

이중특이 항체를 포함하는 단백질 복합체{Protein complex comprising bi-specific antibody}

이중특이 항체를 포함하는 단백질 복합체 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.

단일 클론 항체가 신약 시장의 강자로 자리매김하면서 다양한 표적에 대한 치료제로 개발되고 있으나, 많은 경우 만족할 만한 약효를 보이지 못하거나, 항체 생산에 고비용이 드는 등 신약 개발에 있어 한계를 지니고 있다. 이러한 문제점 해결을 위한 하나의 방법으로 1980년 중반 이후 이중특이 항체에 대한 연구가 꾸준히 진행되고 있으나, 많은 노력에도 불구하고 아직 주도적인 기술은 나타나지 않고 있다.

기존의 이중특이 항체 제조법은 동질의 이중특이 항체를 대량 생산하는데 어려움이 있거나, 낮은 효능과 부작용으로 인해 실용화에 어려움이 있었다. 최근 들어 항체 공학 기술의 발달에 힘입어 경쟁력이 있는 새로운 항체 플랫폼들이 나타나고 있으나, 아직 검증 단계에 머무르고 있는 실정이다.

따라서, 종래 기술에 의하더라도, 새로운 2 이상의 이종 항원에 특이성을 갖는 단백질 복합체의 개발이 요구된다.

일 구체예는 이중특이 항체의 제작을 위한 단백질 복합체를 제공한다.

다른 구체예는 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 재조합 벡터 및 이를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

또 다른 구체예는 상기 단백질 복합체를 이용한 이중특이 항체의 제조 방법을 제공한다.

일 양상은 N-말단에 제1 항원 결합 부위를 포함하는 제1 폴리펩티드; N-말단에 제2 항원 결합 부위를 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 서로 연결하는 링커를 포함하는 것으로서, 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위에 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 이량체를 형성하기 위해 서로 상호 결합할 수 있는 하나 이상의 노브(knob) 또는 홀(hole)을 포함하는 도메인을 포함하며, 상기 링커는 양 말단에 제1 태그 및 제2 태그를 포함하고, 상기 제1 태그는 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에, 상기 제2 태그는 상기 제2 폴리펩티드의 N-말단에 연결되며, 상기 제1 태그 및 제2 태그는 각각 절단 가능한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질 복합체를 제공한다.

다른 양상은 N-말단에 제1 항원 결합 부위를 포함하는 제1 폴리펩티드; N-말단에 제2 항원 결합 부위를 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 서로 연결하는 링커를 포함하는 것으로서, 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위에 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 이량체를 형성하기 위해 서로 상호 결합할 수 있는 하나 이상의 노브(knob) 또는 홀(hole)을 포함하는 도메인을 포함하며, 상기 링커는 하나의 말단에 태그를 포함하고, 상기 태그는 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단 또는 상기 제2 폴리펩티드의 N-말단에 연결되며, 절단 가능한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질 복합체를 제공한다.

상기 단백질 복합체는 제1 항원 결합 부위를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 부위를 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

용어, "항원 결합 부위(antigen binding site)"는 면역글로불린 분자 내에서 항원(antigen) 또는 에피토프(epitope)가 결합하는 부위를 총칭하는 개념으로 해석되며, 상기 항원 결합 부위는 CDR(complementarity determining region)을 포함할 수 있다. CDR은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있으며(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3 개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

일 구체예에 따르면, 상기 단백질 복합체는 서로 동일하거나, 서로 다른 항원 결합 부위를 가질 수 있다. 즉, 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드의 항원 결합 부위인 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는 서로 동일하거나, 서로 다른 항원의 항원 결합 부위로 이루어질 수 있다. 또한, 이는 항원이 동일한 경우라도, 서로 다른 에피토프(epitope)에 결합할 수 있는 항원 결합 부위를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 상기 항원 결합 부위에 결합될 수 있는 항원은 예를 들어, DLL4, VEGFR2, Notch1, Notch2, Notch3, Notch4, Notch(pan), JAG1, JAG2, DLL(pan), JAG(pan), ERBB(pan), c-Met, IGF-1R, PDGFR, Patched, Hedgehog family polypeptides, Hedgehog(pan), WNT family polypeptides, WNT(pan), FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, FZD(pan), LRP5, LRP6, CD20, IL-17, CD86, Muc16, PSCA, CD44, c-Kit, DDR1, DDR2, RSPO1, RSPO2, RSPO3, RSPO4, RSPO(pan), BMP family polypeptides, BMP(pan), BMPR1a, BMPR1b 및 그의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 또한, 상기 항원 결합 부위에 결합될 수 있는 항원은 예를 들어, EpCAM, tumor-associated glycoprotein-72 (TAG-72), tumor-associated antigen CA 125, Prostate specific membrane antigen (PSMA), High molecular weight melanoma-associated antigen (HMW-MAA), tumor-associated antigen expressing Lewis Y related carbohydrate, Carcinoembryonic antigen (CEA), CEACAM5, HMFG PEM, mucin MUC1, MUC18 and cytokeratin tumor-associated antigen, bacterial antigens, viral antigens, allergens, fluorescein, lysozyme, toll-like receptor 9, erythropoietin, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD11, CD11a, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD33 (p67 protein), CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD80, CD147, GD3, IL-1, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6R, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, interferon alpha, interferon beta, interferon gamma; TNF-alpha, TNF-beta2, TNF-alpha, TNF-alphabeta, TNF-R1, TNF-R11, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, TRAIL, RANKL, TWEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEG1, OX40L, TRAIL Receptor-1, A1 Adenosine Receptor, Lymphotoxin Beta Receptor, TACI, BAFF-R, EPO; LFA-3, ICAM-1, ICAM-3, integrin beta1, integrin beta2, integrin alpha4/beta7, integrin alpha2, integrin alpha3, integrin alpha4, integrin alpha5, integrin alpha6, integrin alphav, alphaVbeta3 integrin, FGFR-3, Keratinocyte Growth Factor, VLA-1, VLA-4, L-selectin, anti-Id, E-selectin, HLA, HLADR, CTLA-4, T cell receptor, B7-1, B7-2, VNRintegrin, TGFbeta1, TGFbeta2, eotaxin1, BLyS (B-lymphocyte Stimulator), complement C5, IgE, factor VII, CD64, CBL, NCA 90, EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB4), Tissue Factor, VEGF, VEGFR, endothelin receptor, VLA-4, blood group antigen과 같은 carbohydrate 및 그와 관계된 carbohydrate, Galili-Glycosylation, Gastrin, Gastrin receptors, tumor associated carbohydrate, Hapten NP-cap or NIP-cap, T cell receptor alpha/beta, E-selectin, digoxin, placental alkaline phosphatase (PLAP) 및 testicular PLAP-like alkaline phosphatase, transferrin receptor, Heparanase I, human cardiac myosin, Glycoprotein IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), human cytomegalovirus (HCMV) gH envelope glycoprotein, HIV gpl20, HCMV, respiratory syncital virus RSV F, RSVF Fgp, VNR integrin, Hep B gp120, CMV, gpIIbIIIa, HIV IIIB gp120 V3 loop, respiratory syncytial virus (RSV) Fgp, Herpes simplex virus (HSV) gD glycoprotein, HSV gB glycoprotein, HCMV gB envelope glycoprotein, Clostridium perfringens toxin 및 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

일 구체예에 따르면, 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fab, Fab' 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택된 항원 결합 부위 및 Fc 도메인으로 구성된 폴리펩티드일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 단백질 복합체는 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 서로 연결하는 링커를 포함할 수 있다. 상기 링커는 펩티드 링커일 수 있다. 상기 펩티드 링커는 당업계에 공지된 다양한 링커를 이용할 수 있으며, 예를 들어, 복수의 아미노산으로 이루어진 링커일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 링커는 예를 들어, 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다.

상기 펩티드 링커는 상기 2 이상의 융합 단백질 사이를 충분한 거리로 이격시켜 각각의 융합 단백질이 적절한 기능을 하기 위한 적합한 이차 및 삼차 구조로 폴딩되도록 할 수 있다. 예를 들어, 상기 펩티드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩티드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 융합 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위에 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 이량체를 형성하기 위해 서로 상호 결합할 수 있는 하나 이상의 노브(knob) 또는 홀(hole)을 포함하는 도메인을 포함할 수 있다.

세포 내에서 일반적으로 항체가 형성되는 과정에서는 2개 중쇄의 Fc 영역이 상호결합되면서 이량체(dimer)를 형성하게 된다. 특히, 이중특이 항체를 제조하는 과정에 있어서는 상기와 같이 일반적인 항체 생성 방법에 의하면 호모이량체(homodimer)와 헤테로이량체(heterodimer)가 형성되는 확률이 유사하기 때문에 이중특이 항체의 형성률이 낮아질 수 있다. 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드에 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위에 서로 상호 결합할 수 있는 하나 이상의 노브(knob) 또는 홀(hole)을 포함하는 도메인을 포함하는 것은 이와 같은 이중특이 항체의 형성률을 향상시키기 위한 것이다.

용어, “노브 (knob)” 또는 “홀(hole)”은 상기 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드의 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위에 위치하는 하나 이상의 아미노산으로 이루어진 서열을 의미하는 것으로서, 단백질의 3차 구조에서, 노브는 돌출된 구조를 만들 수 있는 하나 이상의 아미노산을 포함하며, 홀은 함몰된 구조를 만들 수 있는 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있다.

따라서, 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 서로 인접한 위치에 존재할 때, 노브를 포함하는 도메인과 홀을 포함하는 도메인의 상호 결합을 통해 이량체를 형성하도록 할 수 있다. 상기 노브 또는 홀은 제1 폴리펩티드 또는 제2 폴리펩티드의 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 내의 염기 서열을 치환시킴으로써 도입할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 노브 아미노산에 포함될 수 있는 아미노산은 Arg, Phe, Tyr 및 Trp으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산이며, 상기 홀 아미노산에 포함될 수 있는 아미노산은 Ala, Ser, Thr 및 Val으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산일 수 있다. 상기 노브 또는 홀은 상기 노브 또는 홀을 포함하는 도메인 내 아미노산의 잔기끼리 서로 상호 결합할 수 있는 아미노산 서열의 쌍이면 어떠한 아미노산의 조합도 가능하며, 이러한 아미노산에는 천연 또는 비천연 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 아미노산 서열의 쌍은 예를 들어, Arg/Ala, Phe/Ser, Tyr/Thr 또는 Trp/Val일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

일 구체예에 따르면, 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위는 항체의 Fc 부분의 CH3 도메인일 수 있다. 상기와 같이 서로 상호 결합할 수 있는 하나 이상의 노브 또는 홀을 포함하는 도메인을 포함함으로써, 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드 사이의 결합력을 높여, 이량체(dimer)의 형성률을 높이도록 한다.

일 구체예에 따르면, 상기 링커는 양 말단 중 적어도 하나의 말단에 태그를 포함할 수 있다. 또한, 상기 태그는 상기 폴리펩티드의 말단에 연결되며, 절단 가능한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

용어, "태그(tag)"는 상기 링커의 말단에 결합되어 있으며, 서로 다른 상기 폴리펩티드 사이를 연결하기 위한 매개가 되는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미하는 것으로, 일 구체예에 따르면, 상기 태그는 상기 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 연결된 것일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 태그는 인 비트로 또는 인 비보로 절단 가능한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 인 비트로 또는 인 비보에서의 절단은 프로테아제에 의한 것일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 태그는 유비퀴틴, 유비퀴틴-유사 단백질 및 TEV 절단 펩티드(TEV cleavage peptide) 및 퓨린(furin) 절단 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

한편, 유비퀴틴(ubiquitin, Ub)은 자연계에서 발견되는 가장 보존적인 단백질로 76개의 아미노산 서열로 이루어져 있으며, 곤충, 송어 및 인간처럼 진화적으로 다양한 종들간의 완벽한 상동성을 보이는 수용성 단백질이다. 또한, 유비퀴틴은 pH의 변화에 대해 안정하고, 고온에서도 쉽게 변성되지 않으며, 프로테아제에 대해서도 안정성이 있는 단백질로 알려져 있다. 따라서, 유비퀴틴은 상기 단백질 복합체의 불용성을 개선할 수 있으며, 인 비트로 또는 인 비보에서 용이하게 절단될 수 있다.

상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질(ubiquitin-like protein)은 야생형 유비퀴틴, 야생형 유비퀴틴-유사 단백질, 돌연변이 유비퀴틴 및 돌연변이 유비퀴틴-유사 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 돌연변이 유비퀴틴은 야생형 유비퀴틴의 아미노산 서열을 다른 아미노산 서열로 바꾼 것을 의미하며, 예를 들면, 야생형 유비퀴틴의 Lys을 Arg으로 치환한 유비퀴틴, 야생형 유비퀴틴 C-말단 RGG를 RGA로 변경시킨 유비퀴틴을 포함한다. 일 구체예에 따르면, 상기 야생형 유비퀴틴의 Lys을 Arg으로 치환한 돌연변이형 유비퀴틴에서, 상기 치환은 야생형 유비퀴틴의 6, 11, 27, 29, 33, 48 및 63번째에 존재하는 Lys에서 이루어질 수 있으며, 치환은 상기 Lys의 위치에서 독립적으로 또는 조합하여 이루어질 수 있다. 상기 유비퀴틴-유사 단백질은 유비퀴틴과 그 특성이 유사한 단백질로, 예를 들어, Nedd8, SUMO-1, SUMO-2, NUB1, PIC1, UBL3, UBL5 및 ISG15로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

일 구체예에 따르면, 상기 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질은 상기 인 비트로 또는 인 비보에서의 절단을 위해 C-말단에 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 프로테아제에 의해 절단 가능한 아미노산 서열은 당 업계에 공지된 검색 데이터베이스를 통해 확인할 수 있다. 예를 들어, http://www.expasy.org/tools/peptidecutter/peptidecutter_enzymes.html에서 검색되는 프로테아제 및 그의 절단 가능한 아미노산 서열을 이용할 수 있다. 상기 절단 가능한 아미노산 서열이 포함되는 경우, 상기 단백질 복합체는 인 비트로 또는 인 비보에서 상기 단백질 복합체에 포함된 상기 태그가 절단됨으로써, 2 이상의 융합 단백질이 이중 또는 다중 특이적 항원 결합 부위를 갖는 단백질 복합체로써 그 기능을 할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 서열번호 3의 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

다른 양상은 N-말단에 제1 항원 결합 부위를 포함하는 제1 폴리펩티드; N-말단에 제2 항원 결합 부위를 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 서로 연결하는 링커를 포함하는 것으로서, 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위에 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 이량체를 형성하기 위해 서로 상호 결합할 수 있는 하나 이상의 노브(knob) 또는 홀(hole)을 포함하는 도메인을 포함하며, 상기 링커는 양 말단에 제1 태그 및 제2 태그를 포함하고, 상기 제1 태그는 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에, 상기 제2 태그는 상기 제2 폴리펩티드의 N-말단에 연결되며, 상기 제1 태그 및 제2 태그는 각각 절단 가능한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질 복합체 또는 N-말단에 제1 항원 결합 부위를 포함하는 제1 폴리펩티드; N-말단에 제2 항원 결합 부위를 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 서로 연결하는 링커를 포함하는 것으로서, 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위에 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 이량체를 형성하기 위해 서로 상호 결합할 수 있는 하나 이상의 노브(knob) 또는 홀(hole)을 포함하는 도메인을 포함하며, 상기 링커는 하나의 말단에 태그를 포함하고, 상기 태그는 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단 또는 상기 제2 폴리펩티드의 N-말단에 연결되며, 절단 가능한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

용어 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 중합체이다. RNA 게놈 서열, DNA(gDNA 및 cDNA) 및 이로부터 전사되는 RNA 서열을 포괄하며, 특별하게 다른 언급이 없는 한 자연의 폴리뉴클레오티드의 유사체를 포함한다.

상기 폴리뉴클레오티드는 상기 단백질 복합체의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 그 서열에 상보적인(complementary) 서열도 포함한다. 상기 상보적인 서열은 완벽하게 상보적인 서열뿐만 아니라, 실질적으로 상보적인 서열도 포함하며, 이는 당업계에 공지된 엄격 조건(stringent conditions) 하에서, 예를 들어, 상기 단백질 복합체의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 서열과 혼성화될 수 있는 서열을 의미한다.

또한, 상기 단백질 복합체의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오티드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. 상기 단백질 복합체의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 최소 90%의 상동성 또는 최소 95%의 상동성을 나타내는 서열일 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4 내지 서열번호 6의 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

또 다른 양상은 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들명, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.

상기 재조합 벡터에서 상기 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오티드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오티드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 따라서, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 뉴클레오티드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.

상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.

상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pL^λ프로모터, CMV promoter, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.

다른 양상은 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다.

상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주 등이 이용될 수 있다.

상기 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

또 다른 양상은 상기 재조합 벡터를 발현시켜 상기 단백질 복합체를 생산하는 단계를 포함하는 이중특이 항체의 제조 방법을 제공한다.

상기 이중특이 항체를 제조하는 방법은 인 비보 또는 인 비트로에서 이루어질 수 있다.

상기 이중특이 항체가 인 비보에서 제작되는 경우, 상기 재조합 벡터를 세포 내에서 발현시켜 단백질 복합체를 생산하게 되면, 상기 단백질 복합체는 세포 내에서 완전한 이중특이 항체의 형태로 세포 외부로 방출될 수 있다. 즉, 상기 단백질 복합체는 소포체(endoplasmic reticulum)에서 번역(translation)이 일어난 후, 상기 2 이상의 폴리펩티드가 서로 인접하여 자발적으로 이량체를 형성하여 이중특이 항체를 형성할 수 있다. 이후 상기 단백질 복합체는 세포 내에 존재하는 프로테아제에 의해 상기 태그에 존재하는 절단 가능한 아미노산 서열이 절단됨으로써, 완전한 형태의 이중특이 항체가 생성될 수 있다. 이때, 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드에 존재하는 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위에 하나 이상의 서로 상호 결합하는 아미노산 서열로 인하여, 이중특이 항체의 형성률은 더욱 증가될 수 있다. 이후, 상기 생성된 이중특이 항체는 당업계에 잘 알려진 정제 방법에 따라 정제하여 사용할 수 있다.

상기 이중특이 항체가 인 비트로로 제작되는 경우, 상기 재조합 벡터를 세포 내에서 발현시켜 상기 단백질 복합체를 생산하는 단계 이후, 상기 태그를 절단시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

인 비트로에서 상기 단백질 복합체는 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 링커로 연결된 상태로 존재하며, 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 서로 인접하여 자발적으로 다량체를 형성할 수 있다. 이때, 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드에 존재하는 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위에 하나 이상의 서로 상호 결합하는 아미노산 서열로 인하여, 이중특이 항체의 형성률은 더욱 증가될 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 절단시키는 단계는 단백질 복합체의 태그에 포함된 절단 가능한 아미노산 서열을 인식하는 프로테아제를 첨가하여 절단시키는 것일 수 있다. 또한, 상기 태그는 유비퀴틴, 유비퀴틴-유사 단백질, TEV 절단 펩티드 및 퓨린 절단 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 예를 들어, 상기 TEV 절단 펩티드 또는 퓨린 절단 펩티드를 절단할 수 있는 프로테아제를 상기 단백질 복합체에 첨가함으로써, 상기 TEV 절단 펩티드 또는 퓨린 절단 펩티드는 프로테아제에 의해 절단되어 분리되므로, 상기 단백질 복합체로부터 이중특이 항체를 생성할 수 있게 된다.

일 구체예에 따른 단백질 복합체를 이용하면, 2개의 항원을 동시에 표적으로 하는 시스템을 효과적으로 구축할 수 있다.

도 1 및 도 2는 일 구체예에 따른 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 포함하는 단백질 복합체 및 이중특이 항체가 제조되는 방법에 대한 개략도이다.
도 3은 일 구체예에 따른 단백질 복합체의 아미노산 서열 구조를 나타낸 것이다.
도 4는 일 구체예에 따른 단백질 복합체를 β-머캅토에탄올 처리군(+), 미처리군(-)으로 나누어 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이다.
도 5는 일 구체예에 따른 단백질 복합체의 이중특이적 항원-항체 반응 효과를 나타낸 센소그램(sensorgram)이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

도 1 및 도 2는 일 구체예에 따른 제1 항원 결합 부위를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 부위를 포함하는 제2 폴리펩티드로 이루어진 단백질 복합체의 개략도이다. 도 1에서 보는 바와 같이, 제1 항원 결합 부위(101)를 포함하는 제1 폴리펩티드(100) 및 제2 항원 결합 부위(201)를 포함하는 제2 폴리펩티드 (200)는 각각 그 말단에 제1 태그(102) 및 제2 태그(202)가 연결되어 있으며, 폴리펩티드로 이루어진 링커(300)의 말단에 상기 제1 태그(102) 및 제2 태그(202)가 연결되어 있다. 상기 제1 태그(102) 및 제2 태그(202)는 유비퀴틴 또는 유비퀴틴-유사 단백질과 같은 단백질로 이루어져 있으므로, 인 비트로 또는 인 비보로 절단이 가능하다. 인 비트로 또는 인 비보 상에서 상기 제1 항원 결합 부위(101)를 포함하는 제1 폴리펩티드(100) 및 제2 항원 결합 부위(201)를 포함하는 제2 폴리펩티드(200)는 서로 인접하여 완전한 자발적 결합을 통해서 결합되며, 이때, 제1 폴리펩티드(100)에서 제1 항원 결합 부위(101)를 제외한 부위에 존재하는 아미노산 서열이 형성하는 노브(knob)(400) 및 제2 폴리펩티드(200)에서 제2 항원 결합 부위(201)를 제외한 부위에 존재하는 아미노산 서열이 형성하는 홀(hole)(500)은 상호 결합하므로, 서로 다른 항원 결합 부위를 갖는 이중특이적 단백질 복합체를 형성률을 더욱 높일 수 있다.

도 2는 도 1에 개시된 일 구체예에 따른 제1 항원 결합 부위를 포함하는 제1 폴리펩티드 및 제2 항원 결합 부위를 포함하는 제2 폴리펩티드로 이루어진 단백질 복합체에서 제2 태그(201)가 없는 형태의 예를 나타낸다. 상기 설명한 바와 같이, 단백질 복합체의 인 비트로 또는 인 비보로 절단을 통해, 서로 다른 항원 결합 부위를 갖는 이중특이적 단백질 복합체를 형성하게 되며, 다만, 도 2에서 개시된 단백질 복합체는 제2 태그(201)이 없기 때문에, 제2 항원 결합 부위(201)를 포함하는 제2 폴리펩티드(200)에 링커(300)가 결합된 형태로 존재하지만, 상기 링커(300)는 2 내지 50개의 짧은 아미노산 서열을 포함하므로, 상기 제2 항원 결합 부위(201)를 포함하는 제2 폴리펩티드(200)의 기능에 영향을 미치지 않게 된다.

실시예 1: 2 종류의 항원 결합 부위를 포함하는 단백질 복합체의 발현 벡터의 제조

혈관 내피 성장인자(VEGF) 및 상피 성장인자 수용체(EGFR)에 대해 각각 특이적인 결합 부위를 포함하는 이중특이항체의 전구 단백질 복합체를 제조하기 위해, 상기 단백질 복합체의 발현 벡터를 Genotech에 의뢰하여 제조하였으며, 단백질 과발현을 위한 벡터는 pCDNA 3.1 myc/his A (Invitrogen)를 사용하였다.

구체적으로, 도 3의 (A)에 개시된 바와 같이, 분비 신호 서열(signal sequence, ss), 혈관 내피 성장인자(VEGF) 결합 부위인 V2 및 힌지(hinge)를 포함하며, 노브(knob)를 형성하는 아미노산 서열이 포함된 Fc 도메인으로 구성된 단일 사슬 폴리펩티드, 상피 성장인자 수용체(EGFR) 결합 부위인 E2를 포함하며, 홀(hole)을 형성하는 아미노산 서열이 포함된 Fc 도메인로 구성된 단일 사슬 폴리펩티드, 적어도 하나의 유비퀴틴 태그 및 링커로 구성된 단백질 복합체의 아미노산 서열에 해당하는 단일 서열 DNA 3종을 합성하였다. 상기 단백질 복합체를 발현시키기 위해 플라스미드에 삽입되는 상기 DNA 3종의 뉴클레오티드 서열을 서열번호 4 내지 서열번호 6에 나타내었다.

상기 삽입 DNA 절편은 5' 말단에 EcoRI로 절단될 수 있는 뉴클레오티드 서열을, 3' 말단에 XhoI으로 절단될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하여, pcDNA3.1 myc/his A 벡터의 EcoRI-Xho1 절단 서열에 삽입될 수 있다.

또한, 상기 단백질 복합체를 통해 유도되는 이중특이항체와 각각의 단일 사슬 폴리펩티드에 의해 생성되는 이중특이항체의 비교 실험을 위해 하기와 같이 DNA 2종을 합성하였다.

도 3의 (B)에 개시된 바와 같이, 분비 신호 서열, 혈관 내피 성장인자(VEGF) 결합 부위인 V2 및 힌지(hinge)를 포함하며, 노브(knob)를 형성하는 아미노산 서열이 포함된 Fc 도메인과 유비퀴틴 태그로 구성된 단일 사슬 폴리펩티드의 아미노산 서열에 해당하는 DNA 1종(서열 번호 7)을 합성하여 HindIII-XhoI의 절단 서열을 통해 pCEP4 벡터에 삽입하였다.

또한, 도 3의 (C)에 개시된 바와 같이, 분비 신호 서열, 상피 성장인자 수용체(EGFR) 결합 부위인 E2를 포함하며, 홀(hole)을 형성하는 아미노산 서열이 포함된 Fc 도메인로 구성된 단일 사슬 폴리펩티드의 아미노산 서열에 해당하는 DNA 1종(서열 번호 8)을 합성하여 HindIII-XhoI의 절단 서열을 통해 pCEP4 벡터에 삽입하였다.

실시예 2: 단백질 복합체의 발현 및 이중특이 항체의 정제

상기 실시예 1에서 제조한 벡터를 이용하여 단백질 복합체를 과발현시키기 위해, 상기 벡터로 형질 전환된 Human embryonic kidney cell (HEK293-F, 한국 세포주 은행)를 이용하였다. HEK293-F 세포는 130 rpm의 오비탈 쉐이커(orbital shaker) 내 37 ℃, 8 % CO₂ 조건에서 유지하였다. 형질 전환을 위해 먼저 원심 분리를 통해 세포를 배지와 분리시키고 1 x 10⁶ 개의 세포를 다시 Freestyle 293 Expression media (Invitrogen)에 부유시킨 뒤, FreeStyle^TM MAX reagent (Invitrogen)를 이용, 상기 벡터 100 ㎍을 사용하여 위 HEK293-F 세포를 형질 전환하였다. 형질 전환 후 7~8일 뒤에 원심 분리 (4000 x g, 10 min, 4 ℃)를 통해 상등액을 수집하고, 포어 사이즈 0.22 micron의 필터를 이용해 여과하였다. 이렇게 얻어진 상등액을 이중특이 항체의 정제에 사용하였다. 이중특이 항체는 Protein A affinity column (GE Healthcare)을 이용하여 분리하였다. 먼저, Protein A affinity column을 1X PBS (Invitrogen) 용액으로 평형화 시키고, 상기 상등액을 상기 용액으로 평형화된 Protein A affinity column에 적용시킨 다음, 컬럼 부피의 5배에 해당하는 세척 완충액(1X PBS)으로 세척하고, 10 % 글리세롤을 포함하는 용출 완충액(IgG elution buffer, Thermo Scientific)으로 상기 이중특이 항체를 용출하였다. 용출된 용액은 1 M Tris-HCl (pH 9.0) 용액으로 즉시 중화시켰다. 상기 용출된 용액을 Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter(Milipore)를 이용한 반복적 원심 분리를 통해 용액을 1X PBS로 전환하였다. 정제된 단백질 농도는 Herceptin 항체를 표준 물질로 사용하여 측정하였다. 이후, 상기 농축한 이중특이 항체를 SDS-PAGE를 통해 최종 확인하였다. 젤에 로딩하기 전에, 상기 이중특이 항체를 둘로 나누어, 한쪽은 1 mM의 β- 머캅토에탄올을 처리(환원 조건: R)하였고, 다른 한쪽은 β- 머캅토에탄올을 처리하지 않은 상태(비환원 조건: NR)로 로딩하였다. 그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, R/NR 조건에서의 비교를 통해 항체 고유의 성격인 이황화 결합의 생성을 확인하였으며, 호모이량체(homodimeric)의 항체가 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 단백질 복합체로부터 제작된 이중특이 항체의 비율 분석

실시예 2에서 정제된 단백질 복합체 중 이중특이 항체(헤테로 이량체)의 비율을 분석하기 위해 질량 분석을 실시하였다. 질량 분석은 High pressure liquid chromatgorapy(HPLC)와 LTQ Orbitrap MS system (Thermo Scientific)을 이용하여 이루어졌다. Presto FF-C18 컬럼(Imtakt)을 LC system에 연결하여 온도는 37 ℃, flow rate은 150 mL/min으로 설정하였으며, 20 mg의 단백질 복합체를 컬럼에 로딩하였다. 물을 용매로 하는 0.1 % trifluoroacetic acid 용액을 buffer A로 acetonitrile를 용매로 하는 0.1 % trifluoroacetic acid 용액을 buffer B로 하여 32 분간 buffer B를 전체 (buffer A + buffer B) 용액 내 비율을 3 %에서 70 %로 올려 가며 단백질을 분리해 내었으며, 이를 LTQ Orbitrap MS system에 도입하여 단백질 복합체의 질량을 분석하였다. 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

항체 이름	헤테로이량체 비율 (%)
서열 번호 1 (V2E2-GS30 (KiH))	90.47
서열 번호 2 (V2E2-2 (KiH))	95.88
서열 번호 3 (V2E2-GS30+5 (KiH))	96.92

실시예 4: 단백질 복합체로부터 제작된 이중특이 항체의 이중특이적 항원-항체 반응 확인

실시예 2에서 제조한 이중특이 항체의 이중특이적 항원-항체 반응의 결합 친화도 (binding affinity)를 측정하기 위해, BiacoreT100 instrument (GE healthcare)를 이용하여 표면 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon resonance) 실험을 수행하였다. 런닝(running) 완충액 및 희석 완충액으로는 1X HBS-EP (GE healthcare)를 사용하였다. Anti-human IgG 항체 (Jackson Immuno Research)를 standard amine-coupling 반응을 이용하여 CM5 칩 (GE healthcare)의 표면에 약 5000 RU (response unit)로 고정하였다. 약 500 RU의 이중특이 항체를 흘려주어 표면에 결합하게 한 후, 여러 농도 (6.25 ~ 100 nM)의 인간 EGFR의 세포외 도메인 (Prospec) 또는 인간 VEGF (pangen)을 50 μL/min의 속도로 흘려주었다. 접촉 시간 (association phase)은 180초였고, 분리 시간 (런닝 완충액으로 세척)은 600초였다. 각각의 결합 싸이클이 끝난 후, 재생 용액인 Glycine-HCl pH 2.0 (GE healthcare)를 1분 동안 50 μL/min의 속도로 흘려주어 결합된 항원 및 항체를 칩으로부터 제거하였다. 이로부터 생성된 센소그램(sensorgram)은 EGFR의 경우 1:1 Langmuir binding model을, VEGF의 경우 bivalent analyte model을 사용하여 BIA evaluation software에서 fitting을 수행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

100: 제1 폴리펩티드
101: 제1 항원 결합 부위
102: 제1 태그
200: 제2 폴리펩티드
201: 제2 항원 결합 부위
202: 제2 태그
300: 링커
400: 노브(knob)
500: 홀(hole)

<110> Samsung Electronics. Co. Ltd. <120> Protein complex comprising bi-specific antibody <130> PN095357 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 881 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V2E2-GS30 (KiH) <400> 1 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Lys Ile 35 40 45 Phe Asn Gly Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr His Ser Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Leu Leu 100 105 110 Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Glu 115 120 125 Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 130 135 140 Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 145 150 155 160 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 165 170 175 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 180 185 190 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 195 200 205 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 210 215 220 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 225 230 235 240 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 245 250 255 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys 260 265 270 Asn Gln Val Ser Leu Tyr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 275 280 285 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 290 295 300 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 305 310 315 320 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 325 330 335 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 340 345 350 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr 355 360 365 Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn 370 375 380 Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln 385 390 395 400 Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser 405 410 415 Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu 420 425 430 Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 435 440 445 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 450 455 460 Ser Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu 465 470 475 480 Glu Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln 485 490 495 Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly 500 505 510 Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys 515 520 525 Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Asp Ile Gln 530 535 540 Met Thr Gln Ser Pro Thr Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val 545 550 555 560 Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Asn Leu Leu Asp Trp 565 570 575 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala 580 585 590 Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Gly Gly Phe 595 600 605 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe 610 615 620 Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Pro Ala Pro Leu Thr Phe Gly 625 630 635 640 Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 645 650 655 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 660 665 670 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 675 680 685 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 690 695 700 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 705 710 715 720 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 725 730 735 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 740 745 750 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 755 760 765 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 770 775 780 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 785 790 795 800 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 805 810 815 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 820 825 830 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Thr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 835 840 845 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 850 855 860 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 865 870 875 880 Lys <210> 2 <211> 777 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> V2E2-2 (KiH) <400> 2 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Lys Ile 35 40 45 Phe Asn Gly Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr His Ser Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Leu Leu 100 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Claims (17)

1. N-말단에 제1 항원 결합 부위를 포함하는 제1 폴리펩티드; N-말단에 제2 항원 결합 부위를 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 서로 연결하는 링커를 포함하는 것으로서,
   상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위에 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 이량체를 형성하기 위해 서로 상호 결합할 수 있는 하나 이상의 노브(knob) 또는 홀(hole)을 포함하는 도메인을 포함하며,
   상기 링커는 양 말단에 제1 태그 및 제2 태그를 포함하고, 상기 제1 태그는 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단에, 상기 제2 태그는 상기 제2 폴리펩티드의 N-말단에 연결되며, 상기 제1 태그 및 제2 태그는 각각 절단 가능한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질 복합체.
2. N-말단에 제1 항원 결합 부위를 포함하는 제1 폴리펩티드; N-말단에 제2 항원 결합 부위를 포함하는 제2 폴리펩티드; 및 상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드를 서로 연결하는 링커를 포함하는 것으로서,
   상기 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드는 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위에 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드가 이량체를 형성하기 위해 서로 상호 결합할 수 있는 하나 이상의 노브(knob) 또는 홀(hole)을 포함하는 도메인을 포함하며,
   상기 링커는 하나의 말단에 태그를 포함하고, 상기 태그는 상기 제1 폴리펩티드의 C-말단 또는 상기 제2 폴리펩티드의 N-말단에 연결되며, 절단 가능한 아미노산 서열을 포함하는 것인 단백질 복합체.
3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위는 서로 동일하거나, 서로 다른 항원 결합 부위인 것인 단백질 복합체.
4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 제1 항원 결합 부위 및 제2 항원 결합 부위를 제외한 나머지 부위는 항체 Fc 부분의 CH3 도메인인 것인 단백질 복합체.
5. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 제1 폴리펩티드는 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fab, Fab' 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택된 항원 결합 부위 및 Fc 도메인으로 구성된 폴리펩티드인 것인 단백질 복합체.
6. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 제2 폴리펩티드는 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fab, Fab' 및 scFv로 이루어진 군으로부터 선택된 항원 결합 부위 및 Fc 도메인으로 구성된 폴리펩티드인 것인 단백질 복합체.
7. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 태그는 유비퀴틴, 유비퀴틴-유사 단백질 및 TEV 절단 펩티드(TEV cleavage peptide) 및 퓨린(furin) 절단 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단백질 복합체.
8. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 링커는 1 내지 100개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드인 것인 단백질 복합체.
9. 청구항 1에 있어서, 상기 단백질 복합체는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것인 단백질 복합체.
10. 청구항 2에 있어서, 상기 단백질 복합체는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 것인 단백질 복합체.
11. 청구항 1 또는 청구항 2의 단백질 복합체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4 내지 서열번호 6으로 이루어진 군으로부터 선택되는 염기서열을 갖는 것인 폴리뉴클레오티드.
13. 청구항 11의 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된(operatively linked) 프로모터를 포함하는 재조합 벡터.
14. 청구항 13의 재조합 벡터를 포함하는 숙주세포.
15. 청구항 13의 재조합 벡터를 발현시켜 상기 단백질 복합체를 생산하는 단계를 포함하는 이중특이 항체의 제조 방법.
16. 청구항 15에 있어서, 상기 생산하는 단계 이후, 상기 태그를 절단시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
17. 청구항 16에 있어서, 상기 절단시키는 단계는 상기 단백질 복합체의 태그에 포함된 절단 가능한 아미노산 서열을 인식하는 프로테아제를 첨가하여 절단시키는 것인 방법.

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