KR101312339B1

KR101312339B1 - 융합 단백질 분리를 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR101312339B1
Application number: KR1020077024073A
Authority: KR
Inventors: 김수정; 김종묵; 송 샨 슈
Original assignee: 주식회사 바이로메드
Priority date: 2005-04-20
Filing date: 2006-04-20
Publication date: 2013-09-27
Also published as: US20100285526A1; US20060276625A1; WO2006126102A8; WO2006126102A2; JP2008539696A; ATE466868T1; EP1871785A2; JP4897792B2; US20080171852A9; KR20080002845A; CN101287748A; CN101287748B; DE602006014126D1; EP1871785B1; EP1871785A4; US7585943B2; HK1125387A1; US8106158B2

Abstract

본 발명은 신규한 트롬빈 절단 부위를 포함하는 펩티드 결합자를 사용하는 융합 단백질 분리를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

융합 단백질 분리를 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR FUSION PROTEIN SEPARATION}

본 발명은 융합 단백질 분리를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

융합 단백질을 사용하는 발현 시스템은 재조합 단백질의 제조에 있어서 잘 수용되는 방법이다. 상기 시스템에서, 융합 짝은 목적하는 단백질의 발현 및 정제를 촉진한다. 융합 짝은 종종 융합 단백질의 후속적인 정제를 촉진시킬 수 있는 "태그(tag)"를 제공하기 위해 사용된다. 그러나, 목적하는 단백질을 천연 형태로 또는 약학적으로 허용가능한 형태로 회수하기 위하여, 융합 단백질이 일단 단리되면 융합 짝은 제거되어야 한다. 융합 짝을 제거하는데 가장 널리 사용되는 방법은 트롬빈, 인자(factor) Xa 또는 엔테로키나제와 같은 특정 절단 효소의 사용을 포함한다(문헌[Wassenberg et al, Protein Sci 6:1718 (1997); Schlumpberger et al, Protein Sci 9:440 (2000); Zaitseva et al, Protein Sci 5:1100 (1996)]). 이는 목적하는 단백질과 융합 짝 사이에서의 절단 효소에 의한 절단에 특이적인 고유 아미노산 서열의 삽입을 포함한다. 목적하는 단백질은 절단 효소(예를 들어, 트롬 빈)를 사용한 융합 단백질의 절단에 의해 회수될 수 있다.

트롬빈은 세린 아미노산을 사용하는 펩티드 결합을 절단하는 트립신-유사 세린 단백분해효소이다. 트롬빈의 특이성은 다수의 연구자들에 의해 연구되어 왔다. 종래 공지된 트롬빈 절단 부위는 다음과 같다(문헌[Chang, Eur. J. Biochem. 151:211 (1985); GST gene fusion system handbook, Amersham Biosciences, Edition AA, p.88-89]):

1) P4-P3-Pro-Arg/Lys↓P1'-P2'

이때, P3 및 P4는 소수성 아미노산이고, P1' 및 P2'는 비산성 아미노산이다. Arg/Lys↓P1' 결합은 절단된다.

예:

서열 번호: 1 내지 3)

2) P2-Arg/Lys↓P1'

이때, P2 또는 P1' 중 하나는 Gly이다. Arg/Lys↓P1' 결합은 절단된다.

예:

가장 자주 사용되는 트롬빈 절단 서열은 소 인자(bovine factor) XIII의 서 열로부터 유래되는 Leu-Val-Pro-Arg-Gly(서열 번호: 4) 또는 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(서열 번호: 1)이다(문헌[Takagi et al, Biochemistry 13:750 (1974)]). 절단은 아르기닌 잔기에서 일어나며, 관심 단백질의 아미노 말단이 Gly 또는 Gly-Ser에 의해 연장된다. 또한, 상기 트롬빈 절단 서열은 pGEX 시리즈(아머샴 바이오사이언시스(Amersham Biosciences)) 및 pET 시리즈(노바겐(Novagen))를 비롯한 다수의 상업적으로 입수가능한 발현 플라스미드에 수용된다.

더욱 최근에, Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(서열 번호: 1) 서열은 트롬빈 절단 부위 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (서열 번호: 1)의 바로 앞 또는 뒤에 위치하는 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly (서열 번호: 5) 서열을 함유하는 글리신-풍부 결합자를 포함하도록 추가로 개질된다(문헌[Guan et al, Anal. Biochem. 192:262 (1991); Hakes et al, Anal. Biochem. 202:293 (1992)]).

현재 공지된 결합자 서열 영역에서의 트롬빈에 의한 절단은 적당하게 특이적이나, 절대적이지는 않다. 트롬빈이 적당하게 특이적인 효소이지만, 절단 부위로서 다양한 다른 아미노산 서열을 사용할 수 있다. 목표 단백질이 트롬빈 절단 부위를 함유한다면, 트롬빈 절단 부위에서 절단이 일어나 목적하는 전체 길이 단백질이 아닌 내부적으로 절단된 단백질을 생성할 수 있다.

예를 들어, 내부 트롬빈 절단 서열을 함유하는 할로박테리움 할로븀(Halobacterium halobium) L11 단백질이 GST(glutathione-S-transferase) 태그와 L11 사이에 트롬빈 절단 부위인 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser(서열 번호: 1)을 함유하는 GST 융합 단백질로서 발현된 경우, 트롬빈 처리는 L11과 GST 태그 사이가 아닌 목표 단백질 L11 내의 절단을 야기하였다(문헌[Porse et al, J. MoI. Biol. 276:391 (1998)]). 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)의 Cdc14p 단백질 또한 내부 트롬빈 절단 서열을 갖는다. Cdc14p 단백질이 Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (서열 번호: 6) 트롬빈 절단 부위를 함유하는 GST 융합 단백질로서 발현된 경우, 융합 단백질은 트롬빈 절단 결합자 내의 부위뿐만 아니라 Cdc14p 내의 내부 부위에서 절단되었다(문헌[Taylor et al, J. Biol. Chem. 272:24054 (1997)]).

본 발명은 당해분야에 공지된 것들보다 우수한 특이성을 제공하는, 트롬빈 절단에 대한 신규한 결합자 서열을 제공한다.

발명의 개요

본 발명은 관심 단백질을 포함하는 융합 단백질의 재조합 생성 및 융합 단백질로부터 관심 단백질의 분리에 유용한 신규한 트롬빈 절단 부위를 포함하는 펩티드 결합자를 제공한다. 한 실시양태에서, 펩티드 결합자는 하기 서열을 포함한다:

Xl-X2-Ser-Pro-X3-X4-X5

상기 서열에서,

X1은 서로 동일하거나 상이한 둘 이상의 아미노산 잔기이고;

X2는 소수성 아미노산이고;

X3은 아르기닌 또는 리신이고;

X4는 알라닌 또는 글리신이고;

X5는 비산성 아미노산이다.

본 발명은 관심 단백질, 융합 짝 및 이들 사이에 삽입된 본 발명의 펩티드 결합자를 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명은, 상기 융합 단백질을 펩티드 결합자의 절단이 일어나기에 충분한 양의 트롬빈과 접촉시킴을 포함하는, 융합 단백질로부터 관심 단백질을 분리하는 방법을 제공한다. 절단 반응이 일어난 후, 관심 단백질은 융합 단백질로부터 생성된다. 관심 단백질은 당해분야의 일반적인 기술을 가진 이들에게 공지된 간단한 기술을 이용하여 회수될 수 있다.

본 발명은 숙주 세포 내에서 재결합 DNA 기술의 생성물로서 발현될 수 있는 임의의 원핵 또는 진핵 단백질을 정제하는데 이용될 수 있다. 상기 재결합 단백질 생성물은 시토카인, 케모카인, 호르몬, 수용체, 효소, 저장 단백질, 혈액 단백질, 단백질 공학 기술에 의해 생성되는 돌연변이 단백질, 또는 합성 단백질을 포함한다.

또한, 본 발명은 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 상기 물질을 함유하는 벡터, 및 상기 벡터를 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 융합 단백질의 제조 방법 및 관심 단백질의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 벡터를 포함하는 키트를 제공한다.

도 1은 본 발명의 펩티드 결합자(서열 번호: 8)를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 pGEX4T-hIL11(A)의 개략도를 나타낸다.

도 2a는 GST-IL11(A)의 트롬빈 절단을 나타낸다.

도 2b는 GST-IL11(A)의 트롬빈 절단을 나타낸다.

도 3은 말디-토프(MALDI-TOF, Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometer)에 의한 IL-11(A)의 분석을 나타낸다.

도 4는 본 발명의 펩티드 결합자(서열 번호: 8)를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 pGEX-티모신β4의 개략도를 나타낸다.

도 5는 GST-티모신β4의 트롬빈 절단을 나타낸다.

도 6은 말디-토프에 의한 티모신β4의 분석을 나타낸다.

도 7은 본 발명의 펩티드 결합자(서열 번호: 8)를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 pGEX-IL6의 개략도를 나타낸다.

도 8은 GST-IL6의 트롬빈 절단을 나타낸다.

도 9는 본 발명의 펩티드 결합자(서열 번호: 8)를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 pGEX-PAR4의 개략도를 나타낸다.

도 10은 본 발명의 펩티드 결합자(서열 번호: 7)를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 pGEX-IL11(LV-)의 개략도를 나타낸다.

도 11은 GST-IL11(LV-)의 트롬빈 절단을 나타낸다.

도 12는 본 발명의 펩티드 결합자(서열 번호: 7)를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 pMAL-c2-IL11의 개략도를 나타낸다.

도 13은 MBP-IL11의 트롬빈 절단을 나타낸다.

도 14는 본 발명의 펩티드 결합자(서열 번호: 7)를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 pET19b-IL11의 개략도를 나타낸다.

도 15는 His-IL11의 트롬빈 절단을 나타낸다.

본 발명은 트롬빈 등을 사용하여 절단가능한 트롬빈 절단 부위를 포함하는 결합자 펩티드를 제공한다. 한 실시양태에서, 펩티드 결합자는 하기 서열을 포함한다;

Xl-X2-Ser-Pro-X3-X4-X5

상기 서열에서,

X1은 서로 동일하거나 상이한 둘 이상의 아미노산 잔기이고;

X2는 소수성 아미노산이고;

X3은 아르기닌 또는 리신이고;

X4는 알라닌 또는 글리신이고;

X5는 비산성 아미노산이다.

한 실시양태에서, X1은 서로 동일하거나 상이한 4개 이상의 아미노산 잔기이다. 다른 실시양태에서, X1은 10개 이하의 아미노산 잔기, 예를 들면 8개 이하의 아미노산 잔기, 6개 이하의 아미노산 잔기이다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, X1은 2 내지 6, 2 내지 8, 2 내지 10, 4 내지 6, 4 내지 8 또는 4 내지 10개의 아미노산 잔기일 수 있다.

펩티드 결합자가 트롬빈으로 처리되는 경우, 절단은 X3과 X4 사이의 결합에서 일어난다. 절단 부위에 상대적으로, X1이 2개의 아미노산 잔기인 경우 X1은 5 및 6 위치(P5 내지 P6)를 차지하고, X1이 4개의 아미노산 잔기인 경우 5 내지 8 위치(P5 내지 P8)를 차지한다. X2, Ser, Pro, X3, X4 및 X5는 각각 4, 3, 2, 1, 1' 및 2' 위치(P4, P3, P2, P1, P1', P2')를 차지한다. 한 실시양태에서, X1은 Pro 및 Arg을 포함한다. 한 실시양태에서, X3은 Arg 또는 Lys일 수 있다. 트롬빈은 Arg 또는 Lys이 카복실기를 앞서는 경우 펩티드 결합을 절단한다. 다른 실시양태에서, X4는 Ala 또는 Gly일 수 있다. Ala 및 Gly의 특성은 매우 유사하여, 둘 다 작고 비극성 아미노산이다. 한 실시양태에서, X2는 Gly, Ala, Pro, Val, Leu, Ile, Met, Phe, Tyr 및 Trp으로 이루어진 군으로부터 선택되는 소수성 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X2는 Gly이다. 다른 실시양태에서, X5는 Ser, Ala, Asn, VaI, Leu, He, Lys, Phe, Tyr 및 Trp으로 이루어진 군으로부터 선택되는 비산성 아미노산일 수 있다. 특정 실시양태에서, X5는 Ser이다. 한 실시양태에서, X1은 임의의 아미노산 2개 이상일 수 있다. 다른 실시양태에서, X1은 임의의 아미노산 4개 이상일 수 있다. X1의 정확한 아미노산 서열은 트롬빈 절단에 중요한 영향을 미치지 않는다.

한 실시양태에서, 펩티드 결합자는 서열 Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser (서열 번호: 7)을 포함한다. 다른 실시양태에서, 펩티드 결합자는 서열 Leu-Val-Pro- Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser (서열 번호: 8)을 포함한다. 상기 절단 부위를 함유하는 융합 단백질이 트롬빈으로 처리되는 경우, 절단 부위내의 Arg↓Ala 결합은 절단된다. 한 실시양태에서, 펩티드 결합자는 Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser (서열 번호: 7)이 아닌 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 펩티드 결합자는 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser (서열 번호: 8)이 아닌 서열을 포함한다.

펩티드 결합자 서열 Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser (서열 번호: 7) 및 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser (서열 번호: 8)은 P3 아미노산인 Ser이 소수성이 아니므로 기존에 알려진 트롬빈 절단 부위와 상이하다. 기존의 연구에 따르면, 최적의 트롬빈 절단 부위는 P3 위치에 소수성 아미노산을 함유한다(문헌[Chang, Eur. J. Biochem. 151:211 (1985)]). P3 위치의 비소수성 아미노산의 존재는 트롬빈 절단의 시간을 연장하는 것으로 알려져 있다. 라프테리(Raftery) 등은 쥐(murine) MRP14 단백질에서 발견된 아미노산 서열 Asn-Asn-Pro-Arg-Gly-His (서열 번호: 9)이 트롬빈의 기질이 될 수 있으나 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (서열 번호: 1)과 비교하면 불량한 기질이라고 보고하였다(문헌[Raftery et al, Protein Expr. Purif. 15:228 (1999)]). 트롬빈의 천연 기질인 피브리노젠의 경우, 피브리노펩티드 A(Gly-Gly-Val-Arg↓Gly-Pro, 서열 번호: 10)에서는 P3 위치에 Gly가 위치하는 반면, 피브리노펩티드 B(Phe-Ser-Ala-Arg↓Gly-His, 서열 번호: 11)에서는 P3 위치에서 Ser이 발견되었다. 피브리노펩티드 A는 트롬빈에 의해 피브리노펩티드 B보다 더욱 빠르게 절단된다(문헌[Binnie et at, Blood. 81:3186 (1993)]).

본 발명은 관심 단백질, 융합 짝 및 이들 사이에 삽입된 본 발명의 펩티드 결합자를 포함하는 융합 단백질을 제공한다.

본원에서 사용되는 용어 "융합 단백질" 및 "키메라 단백질"은 상호 교환가능하며 관심 단백질, 융합 짝 및 이들 사이에 삽입된 트롬빈 절단 부위를 갖는 결합자 펩티드를 포함하는 폴리펩티드 및 단백질을 지칭한다. 한 실시양태에서, 관심 단백질은 펩티드 결합자의 N-말단에 결합되고 융합 짝은 펩티드 결합자의 C-말단에 결합된다. 다른 실시양태에서, 관심 단백질은 펩티드 결합자의 C-말단에 결합되고 융합 짝은 펩티드 결합자의 N-말단에 결합된다. 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 펩티드 결합자에 의해 각각 분리된 하나 이상의 관심 단백질 및/또는 하나 이상의 융합 짝을 포함할 수 있다. 이들 실시양태에서, 복수의 관심 단백질은 동일하거나 상이할 수 있으며, 복수의 융합 짝은 동일하거나 상이할 수 있으며, 복수의 펩티드 결합자는 동일하거나 상이할 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "관심 단백질," "목적하는 폴리펩티드," "목적하는 단백질" 또는 "목표 단백질"은 상호 교환가능하며 생성되기를 원하는 임의의 단백질 또는 펩티드를 지칭한다. 한 실시양태에서, 단백질 또는 펩티드는 생물학적으로 활성이다. 관심 단백질의 예로는 인터루킨(interleukin, IL)-11, 티모신 β4, 티모신 α1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-13, IL-15, IL-18, 단백분해효소-활성화된 수용체 1(Protease-activated receptor 1, PAR1), PAR3, PAR4, RANTES, 간질 세포-유도된 인자-1α, 단구화학주성단백질, 줄기 세포 인자, FLT-3L, 부갑상샘 호르몬, 혈소판증식촉진인자, 표피성장인자, 섬유아세포성장인자, 인슐린-유사 성장인자, 과립구-대식구 집락 자극인자, 과립구 집락 자극인자, 대식구 집락 자극인자, 혈소판-유도된 성장인자, 전환성장인자(transforming growth factor, TGF)-β1, 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)-α, 인터페론(interferon, IFN)-α, IFN-β, IFN-γ, 간세포성장인자, 혈관내피성장인자 및 면역글로불린 중쇄를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 관심 단백질은 인간 IL-11, 티모신 β4, IL-6 및 PAR4로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 관심 단백질은 인간 IL11이다.

본원에서 사용되는 용어 "융합 짝"은 융합 단백질에 포함됨이 바람직한 임의의 단백질 또는 펩티드를 지칭한다. 한 실시양태에서, 융합 짝은 융합 단백질에 예를 들어 정제의 용이함, 안정성, 가용성 등과 같은 개선된 특징을 부여한다. 한 실시양태에서, 융합 짝은 친화성 펩티드이다. 친화성 펩티드의 예로는 글루타티온-S-트랜스퍼라제(Glutathione-S-transferase, GST), 말토즈 결합 단백질(MBP), 헥사히스티딘, T7 펩티드, 유비퀴틴, 플래그(Flag) 펩티드, c-myc 펩티드, 폴리아르기닌, 폴리시스테인, 폴리페닐알라닌, B태그(BTag), 갈락토스 결합 도메인, 셀룰로스 결합 도메인(cellulose binding domain, CBD), 티오레독신, 포도알균 단백질 A, 포도알균 단백질 G, 칼모듈린, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, S-펩티드, 스트렙타비딘, His-태그 및 스트렙(Strep)-태그를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "펩티드 결합자"는 트롬빈에 의해 인식되고 절단되는 트롬빈 절단 부위를 포함하는 특정 아미노산 서열을 지칭한다.

본원에서 사용되는 용어 "트롬빈"은 본 발명의 펩티드 결합자를 절단할 수 있는 임의의 형태의 트롬빈을 지칭한다. 트롬빈은 단백질에 의해 일정 수준의 절단 활성이 유지되는 한 천연 발생 트롬빈, 재결합 트롬빈, 트롬빈 조각 및 트롬빈 유사체를 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 트롬빈은 천연 발생 트롬빈을 포함하는 인간 트롬빈 또는 소 트롬빈, 재결합 트롬빈, 또는 인간 또는 소의 서열로부터 유도되는 트롬빈 조각 및 유사체일 수 있다.

본 발명은 관심 단백질, 융합 짝 및 이들 사이에 삽입된 펩티드 결합자를 포함하는 융합 단백질로부터 관심 단백질을 분리하는 방법을 제공하며, 이 방법은 상기 융합 단백질을 펩티드 결합자의 절단이 일어나기에 충분한 양의 트롬빈과 반응시킴을 포함한다. 한 실시양태에서, 융합 단백질은 펩티드 결합자의 X3과 X4 사이에서 절단된다. 상기 방법은 관심 단백질을 융합 단백질의 다른 부분으로부터 예를 들어 친화성 정제 또는 크기 분리에 의해 분리시키는 방법을 추가로 포함할 수 있다.

한 실시양태에서, 트롬빈은 인간 트롬빈이고 융합 단백질은 약 0.1 USP 단위 내지 약 1.0 USP 단위의 트롬빈, 예를 들어 약 0.2 단위 내지 약 0.7단위의 트롬빈, 약 0.2 단위 내지 약 0.5 단위의 트롬빈, 약 0.2 단위 내지 약 0.3 단위의 트롬빈과 반응한다. 다른 실시양태에서, 트롬빈은 인간 트롬빈이고 융합 단백질은 약 5분 내지 약 1.5 시간, 예를 들어 약 8분 내지 약 1.2 시간, 약 10분 내지 약 1.0 시간 동안 트롬빈과 반응한다. 다른 실시양태에서, 트롬빈은 인간 트롬빈이고 융합 단백질은 약 0.25 단위의 트롬빈과 약 30분 동안 반응한다.

한 실시양태에서, 트롬빈은 소 트롬빈이고 융합 단백질은 약 0.1 단위 내지 약 1.0 단위의 트롬빈, 예를 들어 약 0.2 단위 내지 약 0.7 단위의 트롬빈과 반응한다. 다른 실시양태에서, 트롬빈은 소 트롬빈이고 융합 단백질은 약 5분 내지 약 1.5 시간, 예를 들어 약 8분 내지 약 1.2 시간, 약 10분 내지 약 1.0 시간 동안 트롬빈과 반응한다. 다른 실시양태에서, 트롬빈은 소 트롬빈이고 융합 단백질은 약 0.5 단위의 트롬빈과 약 1.0 시간 동안 반응한다.

본 발명은 본 발명의 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 상기 폴리뉴크레오티드는 화학적 합성 또는 클로닝에 의해 제조될 수 있다.

본 발명은 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명에 따르면, 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열이 단리되고, 합성되거나 아니면 수득되어 결합자 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 조작가능하게 결합된다. 결합자 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열에 조작가능하게 결합된, 목적하는 단백질의 유전자를 함유하는 혼성 폴리뉴클레오티드는 키메라 폴리뉴클레오티드로서 지칭된다. 한 실시양태에서, 키메라 폴리뉴클레오티드는 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 혼입시키는 프라이머를 사용하여, 예를 들어 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)과 같은 증폭에 의해 증폭 생성물이 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 조작가능하게 결합된 펩티드 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하도록 제조된다. 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 리가제를 사용하여 함께 연결된다. 이어서, 키메라 폴리뉴클레오티드는 융합 짝을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 조작가능하게 결합하여 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 생성한다. 다른 실시양태에서, 융합 짝을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 조작가능하게 결합하여 키메라 폴리뉴클레오티드를 형성하며, 이어서 키메라 폴리뉴클레오티드는 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 결합하여 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 생성한다.

본원에서 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 2개의 폴리뉴클레오티드를 지칭하기 위해 사용되는 용어 "조작가능하게 결합된"은 2개의 폴리뉴클레오티드가 연속적 개방 리딩 프레임(continuous open reading frame)이 존재하는 방식으로 결합되어 2개의 폴리뉴클레오티드를 연결함을 의미한다. 조절 인자와 관련하여, 용어 "조작가능하게 결합된"은 조절 인자가 폴리뉴클레오티드의 전사 및/또는 번역에 영향을 미치는 방식으로 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 결합된 조절 인자를 지칭한다.

본 발명은 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터(예를 들어, 플라스미드, 바이러스 또는 박테리오파지 벡터)를 제공한다. 한 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터이다. 바람직하게는, 벡터는 숙주 세포내에서 자율적으로 복제가능하며 약제 내성(예를 들어, 암피실린 또는 테트라사이클린) 또는 영양요구성 컴플리먼트(complement) 유전자와 같은 선택가능한 표지(marker)를 함유한다. 한 실시양태에서, 벡터는 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 (예를 들어, 동일한 리딩 프레임에서 업스트림 또는 다운스트림으로) 조작가능하게 결합된 융합 짝을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 벡터는 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 (예를 들어, 동일한 리딩 프레임에서 업스트림 또는 다운스트림으로) 조작가능하게 결합된 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 벡터는 관심 단백질, 융합 짝 및 이들 사이에 삽입된 펩티드 결합자를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 하나 이상의 클로닝 부위, 예를 들어 제한 효소 인식 부위를 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 업스트림 및/또는 다운스트림에 추가로 포함하여, 관심 단백질 또는 융합 짝을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 펩티드 결합자와 프레임을 이루며 벡터로 클로닝시키는 것을 촉진한다.

벡터는 필수 조절 서열(예를 들어, 전사 및 번역 요소)을 제공하여 적절한 숙주 세포내에서의 융합 단백질의 발현을 조절한다. 조절 서열은 프로모터 영역, 인헨서 영역, 전사 종결 부위, 리보솜 결합 부위, 개시 코돈, 스플라이스 신호, 인트론, 폴리아데닐화 신호, 샤인/달가노(Shine/Dalgarno) 번역 서열 및 코작 공통 서열(Kozak consensus seqeunce) 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 조절 서열은 융합 단백질이 생성될 숙주 세포를 고려하여 선택된다. 적절한 박테리아 프로모터는 박테리오파지 λ pL 또는 pR, T6, T7, T7/lacO, lac, recA, gal, trp, ara, hut 및 trp-lac을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 적절한 진핵 프로모터는 PRBI, GAPDH, 메탈로티오네인, 티미딘 키나제, 바이럴 LTR, 사이토메갈로바이러스, SV40, 또는 조직-특이적 또는 종양-특이적 프로모터, 예컨대 α-태아단백질, 아밀라제, 카텝신 E, M1 무스카린 수용체 또는 γ-글루타밀 트랜스퍼라제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

숙주 세포로부터 배지 또는 숙주 세포의 페리플라즘(periplasm)내로 분비될 융합 단백질은 또한 신호 서열을 함유할 수 있다. 신호 서열은 융합 짝 또는 융합 짝 외의 것일 수 있다. 신호 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 5' 말단에 조작가능하게 결합될 수 있다. 또한, 추가적인 펩티드 결합자는 신호 서열이 트롬빈을 사용한 절단에 의해 융합 단백질로부터 제거될 수 있도록 신호 서열과 융합 단백질의 나머지 사이에 삽입될 수 있다. 적절한 신호 서열은 종래 기술에 공지되어 있으며, 예를 들어 MBP, GST, TRX, DsbA, 이 콜라이(E. coli)의 LamB 및 효모의 α-인자를 포함한다.

적절한 발현 벡터의 추가적인 예는 본원에 참고로 인용된 미국 특허 제 5,814,503 호에 개시되어 있다.

본 발명은 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 제조 방법을 제공하며, 이는 상기 폴리뉴클레오티드가 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 업스트림 또는 다운스트림에 있고 프레임을 이루도록 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 벡터의 클로닝 부위로 삽입시킴을 포함한다. 다른 실시양태에서, 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 업스트림 또는 다운스트림에 있고 프레임을 이루도록 융합 짝을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 조작가능하게 결합된 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터의 클로닝 부위로 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킨다.

본 발명은 본 발명의 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 원핵(예를 들어, 박테리아) 및 진핵(예를 들어, 곰팡이, 효모, 동물, 곤충, 식물) 세포를 포함하는, 융합 단백질의 발현에 적절한 임의의 세포일 수 있다. 적절한 원핵 숙주 세포는 이.콜라이(예를 들어, DH5, HB101, JM109 또는 W3110 계통), 바실루스(Bacillus), 스트렙토마이시스(Streptomyces), 살모넬라(Salmonella), 세라티아(Serratia) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 종을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 적절한 진핵 숙주 세포는 COS, CHO, HepG-2, CV-1, LLC-MK₂, 3T3, HeLa, RPMI8226, 293, BHK-21, Sf9, 사카로마이세스, 피치아(Pichia), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 아스페르길루스(Aspergillus) 또는 트리코데르마(Trichoderma) 종을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

재조합 벡터의 제조, 이를 사용한 숙주 세포의 형질전환, 숙주 세포내에서의 벡터의 복제 및 생물학적으로 활성인 외부 폴리펩티드 및 단백질의 발현을 위한 방법 및 물질은 본원에 각각 참고로서 인용된 문헌[Old et al, Principles of Gene Manipulation, 2nd edition, (1981); Sambrook et al, Molecular Cloning, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, 2001 및 Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York 3rd edition, (2000)]에 개시되어 있다. 벡터는 형질전환, 칼슘 포스페이트 침전, 전기천공법, 리포펙션(lipofection), 미량주사(microinjection) 및 바이러스 감염을 포함하나 이에 한정되지 않는 종래기술에 공지된 임의의 방법에 의해 숙주 세포내로 도입될 수 있다.

본 발명은 융합 단백질을 생성하는 방법을 제공하며, 이는 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조하고, 벡터를 숙주 세포내로 전달하고, 융합 단백질이 발현되는 조건하에서 숙주 세포를 배양하고, 융합 단백질을 분리함을 포함한다. 상기 방법은 분리된 융합 단백질을 트롬빈과 접촉시켜 융합 단백질을 절단하고 관심 단백질을 분리시킴을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 관심 단백질을 생성하는 방법을 제공하며, 이는 본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조하고, 벡터를 숙주 세포내로 전달하고, 융합 단백질이 발현되는 조건하에서 숙주 세포를 배양하고, 융합 단백질을 분리하고, 분리된 융합 단백질을 트롬빈과 접촉시켜 융합 단백질을 절단하고 관심 단백질을 분리시킴을 포함한다.

융합 단백질은 종래기술에 공지된 임의의 방법에 의해 숙주 세포로부터 분리될 수 있다. 융합 단백질이 숙주 세포로부터 분비되는 경우, 융합 단백질을 함유하는 배지가 수거될 수 있다. 융합 단백질이 숙주 세포로부터 분비되지 않는 경우, 숙주 세포는 융합 단백질을 방출하기 위해 분해될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 세포는 고압(예를 들어, 고압 혼합기(high pressure homogenizer)를 사용하여)의 적용 또는 초음파 분해에 의해 분해될 수 있다.

바람직하게는, 융합 단백질은 융합 짝을 기준으로 친화성 정제에 의해 분리된다. 예를 들어, GST를 포함하는 융합 단백질은 글루타티온-함유 컬럼에서 분리될 수 있으며, 헥사히스티딘 태그를 포함하는 융합 단백질은 금속-함유 컬럼에서 분리될 수 있다.

친화성 정제가 융합 단백질의 분리에 있어서 바람직하지만, 용매 추출, 초여과, 암모늄 설페이트 분류법, HPLC, 겔 여과 그로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 결합 크로마토그래피, 전기영동 및 등전점 전기영동을 비롯한 단백질을 분리시키는 임의의 공지된 기술이 친화성 정제 대신 또는 함께 이용될 수 있다.

한 실시양태에서, 융합 짝은 컬럼에 결합하고 관심 단백질은 통과하여 수거되도록, 분리된 융합 단백질을 트롬빈 및 친화성 크로마토그래피에 의해 절단된 단백질과 접촉시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 분리되고, 이어서 친화성 매질로부터 용출된 이후 트롬빈과 접촉할 수 있다. 다른 실시양태에서, 융합 단백질은 친화성 매질에 결합되어 있는 동안 트롬빈과 접촉함으로써 관심 단백질을 방출할 수 있다. 트롬빈의 농도는 약 0.1 내지 약 100 USP 단위/ml, 예를 들어 약 1 내지 약 50 단위/ml, 약 10 단위/ml의 범위일 수 있다. 유속은 펌프를 정지시킴으로써 0 ml/분으로 조절하고 이어서 약 5 내지 약 60분, 예를 들어 약 10 내지 약 15분 동안 유지시킬 수 있다.

트롬빈에 의해 융합 단백질을 절단하는 조건은 전형적으로 다음과 같이 종래기술에 잘 공지되어 있다: pH 약 7 내지 약 9, 약 4 내지 약 37℃, 약 5:1 내지 약 125:1의 기질:효소 비율(몰비), 약 1 내지 약 24 시간 동안.

상기 기재된 단백질 정제 기술은 트롬빈에 의한 융합 단백질의 절단에 이어 관심 단백질의 분리에도 이용될 수 있다. 한 실시양태에서, 관심 단백질에 양이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, CM 세파로스(SEPHAROSE)) 및/또는 음이온 교환 크로마토그래피(예를 들어, Q 세파로스)을 실시할 수 있다. 한 실시양태에서, 관심 단백질에 양이온 교환 크로마토그래피를 우선 실시하고, 후속적으로 음이온 교환 크로마토그래피를 실시한다.

예를 들어, 친화성 크로마토그래피로부터 단리된 재조합 IL-11 단백질은 우선 양이온 교환 컬럼, 예를 들어 CM 세파로스 고속 유동 매질(CM Sepharose Fast Flow medium)을 사용하여 정제될 수 있다. 매질과 함께 패킹된 컬럼은 25 mM의 트리스-HCl을 함유하는 완충액 B를 사용하여 평형을 이룰 수 있다. IL-11 단백질을 함유하는 샘플은 완충액 B를 사용하여 약 4배 희석되고, 이어서 컬럼에 로딩될 수 있다. 컬럼을 세척하기 위해, 완충액 B가 로딩되고, 이어서 0.15 M Gly-NaOH를 함유하는 pH 9.5의 완충액 E가 적용될 수 있다. 목표 단백질은 0.15 M Gly-NaOH 및 0.15 M NaCl을 함유하는 pH 9.5의 완충액 F를 사용하여 용출될 수 있다. 상기 단계의 모든 절차는 약 4℃에서 수행될 수 있다. 완충액 B의 pH 값은 약 7.5 내지 약 8.5일 수 있다. 완충액 E 및 완충액 F의 경우, pH는 약 9.2 내지 약 9.7일 수 있다.

양이온 교환 컬럼으로부터 용출된 재조합 IL-11 단백질은 음이온 교환 컬럼, 예를 들어 Q 세파로스 고속 유동 매질을 사용하여 추가로 정제될 수 있다. 상기 매질과 함께 패킹된 컬럼은 1 M Gly-NaOH를 함유하는 pH 9.5의 완충액 G를 사용하여 평행을 이룰 수 있다. 상기 컬럼은 40 mM Gly-NaOH를 함유하는 pH 9.5의 완충액 H를 사용하여 재평형을 이룬다. 이전 단계로부터 수득된 샘플은 물을 사용하여 약 4배 희석된 후 컬럼으로 로딩될 수 있다. 이어서, 목표 단백질을 함유하는 유동(Flow-through)이 수거될 수 있다. 40mM Gly-NaOH를 함유하는 pH 9.5의 완충액 H가 컬럼에 적용되고 유동이 또한 수거된다. 상기 단계 동안의 pH 값은 약 9.2 내지 약 9.7 또는 약 9.5일 수 있다. 상기 음이온 교환 크로마토그래피의 모든 절차는 대략 실온에서 수행될 수 있다. 이러한 절차를 통해 내독소(endotoxin)가 효율적으로 제거될 수 있다.

본 발명은 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 키트를 제공한다. 한 실시양태에서, 키트는 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함한다. 다른 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터이다. 한 실시양태에서, 벡터는 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 조작가능하게 결합된, 예를 들어 동일한 리딩 프레임에서 업스트림 또는 다운스트림인 융합 짝을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 벡터는 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 조작가능하게 결합된, 예를 들어 동일한 리딩 프레임에서 업스트림 또는 다운스트림인 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 벡터는 관심 단백질, 융합 짝 및 이들 사이에 삽입된 펩티드 결합자를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터는 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 업스트림 및/또는 다운스트림에 하나 이상의 클로닝 부위, 예를 들어 제한 효소 인식 부위를 추가로 포함하여 펩티드 결합자와 프레임을 이루는 관심 단백질 또는 융합 짝을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 벡터로의 클로닝을 촉진시킨다. 추가적인 실시양태에서, 벡터는, 펩티드 결합자를 암호화하고, 융합 짝을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 조작가능하게 결합되며, 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 업스트림 또는 다운스트림에 하나 이상의 클로닝 부위를 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 한 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드의 순서는 융합 짝, 펩티드 결합자, 클로닝 부위이다. 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드의 순서는 클로닝 부위, 펩티드 결합자, 융합 짝이다. 한 실시양태에서, 키트는, 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 벡터 중 하나로 펩티드 결합자와 프레임을 이루며 삽입될 수 있도록 펩티드 결합자와 상이한 리딩 프레임에 펩티드 결합자 및 복수의 클로닝 부위를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 복수의 벡터를 포함한다.

상기 키트는 벡터의 사용과 관련된 다른 첨가제, 예를 들어 완충액, 제한 효소, 리가제, 포스포릴라제(phosphorylase), 숙주 세포 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 벡터의 사용, 예를 들어 관심 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 삽입 또는 융합 단백질의 제조에 대한 지침을 포함할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명의 방법의 예시를 위한 것이며 한정하고자 하는 것이 아니다. 의학적 치료 및 약학에서 통상적으로 나타나며 당업자에게 명백한 다른 적절한 개질, 및 다양한 조건 및 파라미터의 변형은 본 발명의 진의 및 범위 내에 포함된다.

실시예 1

GST-IL11(A)

본 실시예에서, GST-IL11(A) 융합 단백질을 제조하였다. GST-IL11(A) 융합 단백질은 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST), 인간 IL-11 및 이들 사이에 삽입된 트롬빈 절단 부위로 구성된다. GST-IL11(A)의 트롬빈 절단 부위는 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser (서열 번호: 8)이다.

GST-IL11(A)를 제조하기 위해, 이.콜라이 발현 플라스미드인 pGEX4T-hIL11(A)을 제조하였다(도 1). 인간 IL11(A)를 암호화하는 DNA 서열은 인간 IL-11 cDNA로부터 PCR 및 사이트-디렉티드 뮤타제네시스(site-directed mutagenesis)에 의해 수득하였다. PCR에 사용된 하기 프라이머 쌍은 하기와 같다:

5': GGA TCC CCG CGA GCT TCC CCA GAC CCT (서열 번호: 12)

BamHI

3': GTC GAC CCC TTA TCA CAG CCG AGT CTT CAG (서열 번호: 13)

SalI

하기 프라이머 쌍을 사이트-디렉티드 뮤타제네시스에 사용하였다:

5'DN: CCA GCC ACC CCC GAA CCC GCC GGC GCC (서열 번호: 14)

3'DN: GGC GCC GGC GGG TTC GGG GGT GGC TGG (서열 번호: 15)

PCR 용 5' 프라이머는 Pro-Arg-Ala-Ser (서열 번호: 16) 잔기를 암호화하도록 고안되었다. BamHI/SalI 처리된 DNA 조각을 pGEX4T-1 플라스미드의 BamHI/SalI 부위로 클로닝시켜 pGEX4T-hIL11(A)를 제조하였다. 플라스미드 pGEX4T-1은 원래 GST 태그 뒤에 트롬빈 절단 부위 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (SEQ ED NO:1)을 갖는다. 따라서, pGEX4T-hIL11(A)는 글루타티온 S-트랜스퍼라제와 인간 IL-11 서열 사이에 새로운 트롬빈 절단 부위 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser (서열 번호: 8)을 갖는다.

야생형 IL-11(NCBI 수탁 번호: AAA59132)의 Asp155를 Asn으로 바꾸기 위해 사이트-디렉티드 뮤타제네시스를 수행하였다.

트롬빈 절단 부위를 포함하는 hIL11(A)의 아미노산 서열을 하기 나타낸다:

Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓-Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asn-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Trp-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu- Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu (서열 번호: 17)

발현 플라스미드 pGEX4T-hIL11(A)를 이.콜라이 BL21로 형질전환시켰다. 형질전환주를 암피실린(최종 농도 50㎍/ml)이 공급된 LB 브로스(Broth)에서 접종시키고, OD 600이 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 배양하였다. 이어서, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)를 최종 농도 0.4 mM에 첨가하여 단백질 발현을 유도하였으며, 세포를 추가로 3시간 동안 37℃에서 성장시켰다. GST-IL11의 발현을 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. 세포를 원심분리에 의해 수득하고, pH 8.0의 50mM 트리스-HCl 완충액에서 재현탁하고 초음파 분해로 분해시켰다. 트리스 분말을 사용하여 pH 8.0을 유지시키면서 암모늄 설페이트를 최종 농도 5.6%에서 첨가하였다. 암모늄 설페이트의 첨가는 4℃에서 수행하였다. 목표 단백질을 함유하는 상청액을 pH 8.0의 25 mM 트리스-HCl 완충액으로 예비 평형화시킨 글루타티온 세파로스 4 고속 유동(아머샴 바이오사이언시스) 친화성 컬럼에 적용시켰다. 수차례 세척한 후, 결합된 융합 단백질을 150 mM NaCl 및 10 mM의 환원된 글루타티온을 함유하는 pH 8.0의 25mM 트리스-HCl 완충액을 사용하여 용출시켰다.

정제된 융합 단백질을 트롬빈으로 분해시켰다. 단백질 샘플 100 ㎍을 20℃에서 150 mM NaCl을 함유하는 pH 8의 25 mM 트리스-HCl 완충액에서 소 또는 인간 트롬빈 0.1 단위, 0.25 단위 또는 0.5 단위에 의해 절단하였다. 일정부분을 각각의 반응으로부터 다양한 시점(반응 후 10분, 30분, 1시간, 2시간 및 5시간)에 제거 하고 5분 동안 비등함으로써 열-불활성화시켜 반응을 중지시켰다. 결과를 SDS-PAGE에 의해 분석하고 쿠마시 밝은 청색(Coomassie brilliant blue)으로 염색하여 가시화시켰다. 융합 단백질 GST-hIL11(A)는 반응이 진행됨에 따라 점차 2개의 주 생성물인 GST 융합 짝(26 kDa) 및 IL-11(18.2 kDa)로 분리되며(도 2a 및 2b) IL-11 내에서의 내부 절단은 관찰되지 않았다. GST 융합 짝은 시험된 농도 범위 및 시점에서 소 및 인간 트롬빈 둘 다에의해 효율적으로 절단되었다(도 2a 및 2b).

트롬빈을 사용한 절단에 이어서, IL-11을 글루타티온 세파로스 4 고속 유동을 사용하여 재-크로마토그래피하여 융합 단백질의 GST 부분을 제거하였다. IL-11의 N-말단 아미노산 서열을 프로사이즈 491A HT 단백질 서열기(Procise 491A HT protein sequencer, 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems), 미국)를 사용하여 분석하였다. 단리된 IL11(A)가 그 N-말단에 Ala-Ser- Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu (서열 번호: 42) 서열을 가짐을 확인하였다.

다르게는, 융합 단백질이 결합능이 약 10mg/ml인 글루타티온 세파로스 4 고속 유동 매질을 함유하는 컬럼에 결합된 반면 융합 단백질의 GST 부분은 제거되었다. 컬럼은 글루타티온 세파로스 4 고속 유동 매질로 패킹되고 25mM 트리스-HCl을 함유하는 pH 8.0의 완충액 B의 약 5배의 컬럼 부피(CV)로 평형을 이루었다. 박테리아 용해질로부터 수득된 상청액을 로딩시킨 후, 컬럼을 완충액 B의 약 20 CV로 세척하고, 이어서 25 mM 트리스-HCl 및 0.15 M NaCl을 함유하는 pH 8.0의 완충액 C의 약 5 CV로 평형을 이루었다. 이어서, 완충액 C에 용해된 트롬빈을 매질 ml 당 약 10 단위(또는 매질의 결합능 mg 당 약 1 단위)로 적용시켰다. 후속적으로, 완 충액 C의 약 3 CV를 컬럼에 적용시키고 융합 짝으로부터 분리된 IL11(A)를 수거하였다. 모든 절차는 실온(약 20 내지 25℃)에서 수행하였다.

IL-11내에서 임의의 내부 절단이 발생하는지를 확인하기 위해, IL-11을 양이온 교환 크로마토그래피로 추가로 정제한 후 음이온 크로마토그래피를 실시하고, 말디-토프/MS(MALDI-TOF/MS)(프로테오믹스 솔루션(Proteomics Solution) I(보야저(Voyager)-DE STR), 어플라이드 바이오시스템스)에 의해 분석하였다. 컴퓨트(Compute) pI/MW 장치(au.expasy.org/tools/pi_tool.html에서 입수가능함)에 따른 IL-11의 예상 분자량은 18.26 kDa이었으며, 18264 Da 피크가 관찰되었다(도 3). 이러한 결과로부터, 순수 IL-11 단백질이 GST-IL11(A)의 트롬빈 절단후에 생성된다는 것이 확인되었다.

더욱 구체적으로, 친화성 크로마토그래피로부터 단리된 재조합 IL-11 단백질을 CM 세파로스 고속 유동 매질을 사용하여 우선 정제하였다. 매질로 패킹된 컬럼은 완충액 B를 사용하여 평형을 이루었다. IL-11 단백질을 함유하는 샘플을 완충액 B를 사용하여 약 4배로 희석시키고 컬럼에 로딩시켰다. 컬럼을 세척하기 위해, 완충액 B를 로딩시키고 이어서 0.15 M Gly-NaOH를 함유하는 pH 9.5의 완충액 E를 적용시켰다. 목표 단백질을 0.15 M Gly-NaOH 및 0.15 M NaCl을 함유하는 pH 9.5의 완충액 F를 사용하여 용출시켰다. 상기 단계의 모든 절차는 약 4℃에서 수행하였다.

이어서, 양이온 교환 컬럼으로부터 용출된 재조합 IL-11 단백질을 Q 세파로스 고속 유동 매질을 사용하여 추가로 정제시켰다. 상기 매질로 패킹된 컬럼은 1 M Gly-NaOH를 함유하는 pH 9.5의 완충액 G를 사용하여 평행을 이루었다. 상기 컬럼은 40 mM Gly-NaOH를 함유하는 pH 9.5의 완충액 H를 사용하여 재평형을 이루었다. 상기 단계로부터 수득된 샘플을 물로 약 4배 희석하고 컬럼으로 로딩하였다. 이어서, 목표 단백질을 함유하는 유동을 수거하였다. 40 mM Gly-NaOH를 함유하는 pH 9.5의 완충액 H를 컬럼에 적용시키고 유동을 또한 수거하였다. 이 단계 동안의 pH 값은 약 9.5였다. 상기 음이온 교환 크로마토그래피의 모든 절차는 대략 실온에서 수행하였다. 이러한 절차를 통해 내독소가 효율적으로 제거되었다.

GST-IL11(A) 융합 단백질은 새로운 트롬빈 절단 서열인 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser (서열 번호: 8)을 함유한다. 서열 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser (서열 번호: 8)이 종래 공지된 서열 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (서열 번호: 1)을 포함하지만, 트롬빈 절단은 Arg↓Gly가 아닌 Arg↓Ala에서 일어난다. 이는 트롬빈이 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser (서열 번호: 1)보다 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser (서열 번호: 8)을 더 선호함을 보여준다.

실시예 2

GST-티모신 β4

pGEX4T-1-Kan에 티모신 β4의 cDNA를 삽입하여 GST-티모신 β4 발현 플라스미드인 pGEX-티모신 β4를 제조하였다(도 4). 역전사 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR, reverse transcription-polymerase chain reaction)에 의해, K562 세포로부터 제조된 토탈 RNA로부터 인간 티모신 β4를 암호화하는 cDNA를 클로닝하였다. PCR에 사용된 올리고뉴클레오티드는 하기와 같다:

5': GGA TCC CCT CGA GCT TCT GAC AAA CCC GAT ATG (서열 번호: 18)

BamHI

3': GTC GAC TTA CGA TTC GCC TGC TTG CTT CTC (서열 번호: 19)

SalI

5' 프라이머는 PCR 생성물이 pGEX4T-1 발현 플라스미드로 클로닝될 때 서열 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser (서열 번호: 8)이 생성될 수 있도록 GIy-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser (서열 번호: 20)의 암호 서열을 함유하도록 고안되었다.

135 bp cDNA 생성물을 PCR에 의해 제조하였다. 증폭된 생성물은 pGEM-T 이지(Easy) 플라스미드(프로메가(Promega), 미국 위스콘신주)로 클로닝되어 pGEM-티모신 β4를 생성하였다. 서열 확인 후, pGEM-티모신 β4의 BamHI/SalI 조각을, pGEX4T-1로부터 암피실린 내성 유전자를 카나마이신 내성 유전자로 치환하여 제조된 pGEX4T-1-Kan 벡터의 상응하는 부위로 클로닝하였다.

트롬빈 절단 부위를 포함하는 티모신 β4의 아미노산 서열은 하기와 같다:

Leu-Val-Pro-Arg-GIy-Ser-Pro-Arg↓-Ala-Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala- Glu-Ile-Glu-Lys-Phe-Asp-Lys-Ser-Lys-Leu-Lys-Lys-Thr-Glu-Thr-Ghi-Glu- Lys-Asn-Pro-Leu-Pro-Ser-Lys-Glu-Tlir-Ile-Glu-Gm-Glu-Lys-Gln-Ala-Gly- Glu-Ser (서열 번호: 21)

발현 벡터를 이.콜라이 DH5α로 형질전환시켰다. 형질전환주를 LB 브로스에서 접종시키고 OD 600이 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 배양하고, IPTG를 0.4 mM의 최종 농도에 첨가하였다. 배양을 3시간 동안 지속하고 세포를 원심분리에 의해 수 득하였다. GST-티모신 β4의 발현을 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. 박테리아 펠렛을 pH 8.0 완충액인 50 mM 트리스-HCl 완충액에서 재현탁시키고 초음파 분해에 의해 분해시켰다. GST-티모신 β4를 용해성 조각으로부터 글루타티온 세파로스 4 고속 유동에 의해 정제하였다.

정제된 융합 단백질을 트롬빈으로 분해하고 15% 트리신 분리 겔을 사용하여 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 100 ㎍의 단백질 샘플을 20℃에서 150 mM NaCl 및 환원된 글루타티온 10 mM을 함유하는 pH 8.0의 25 mM의 트리스-HCl 완충액에서 트롬빈 0.5 단위에 의해 절단하였다. 일정부분을 각각의 반응으로부터 다양한 시점(반응 후 10분, 30분, 1시간 및 3시간)에 제거하고 5분 동안 비등함으로써 열-불활성화시켜 반응을 중지시켰다. 융합 단백질인 GST-티모신 β4(31 kDa)가 점차 사라졌으며, 티모신 β4(5 kDa)의 양은 반응 시간이 지남에 따라 증가하였다(도 5).

트롬빈을 사용한 절단에 이어서, 티모신 β4를 글루타티온 세파로스 4 고속 유동을 사용하여 재-크로마토그래피하여 융합 단백질의 GST 부분을 제거하였다. 티모신 β4의 N-말단 아미노산 서열을 프로사이즈 491A HT 단백질 서열기(어플라이드 바이오시스템스, 미국)를 사용하여 분석하였다. 단리된 티모신 β4가 그 N-말단에 서열 Ala-Ser-Asp-Lys-Pro-Asp-Met-Ala-Glu-Ile (서열 번호: 22)을 가짐을 확인하였다.

티모신 β4내에서 임의의 내부 절단이 발생하는지를 확인하기 위해, 티모신 β4를 양이온 교환 크로마토그래피 및 음이온 크로마토그래피로 추가로 정제하고, 말디-토프/MS(프로테오믹스 솔루션 I(보야저-DE STR), 어플라이드 바이오시스템스) 에 의해 분석하였다. 컴퓨트 pI/MW 장치(au.expasy.org/tools/pi_tool.html에서 입수가능함)에 따른 티모신 β4의 예상 분자량은 5.02 kDa이었으며, 4992 Da 피크가 관찰되었다(도 6). 이러한 결과로부터, 순수 티모신 β4 단백질이 GST-티모신 β4의 트롬빈 절단후에 생성된다는 것이 확인되었다.

실시예 3

GST-IL6

pGEX4T-1에 쥐 IL-6의 cDNA를 삽입하여 GST-IL6 발현 플라스미드인 pGEX-IL6을 제조하였다(도 7). RT-PCR에 의해, 생쥐 수지상세포로부터 제조된 토탈 RNA로부터 쥐 IL-6을 암호화하는 cDNA를 클로닝하였다. PCR에 사용된 올리고뉴클레오티드는 하기와 같다:

5': GGA TCC CCT CGA GCT TCT TTC CCT ACT TCA (서열 번호: 23)

BamHI

3': GTC GAC CTA GGT TTG CCG AGT AGA TCT (서열 번호: 24)

SalI

588 bp cDNA 생성물을 PCR에 의해 제조하였다. 증폭된 생성물은 pGEM-T 이지 플라스미드로 클로닝되어 pGEM-IL6을 생성하였다. 서열 확인 후, pGEM-IL6의 BamHI/SalI 조각을 pGEX4T-1 벡터의 상응하는 부위로 클로닝하였다.

트롬빈 절단 부위를 포함하는 IL-6의 아미노산 서열은 하기와 같다:

Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓-Ala-Ser-Phe-Pro-Thr-Ser-Gln-Val-Arg-Arg-Gly-Asp-Phe-Thr-Glu-Asp-Thr-Thr-Pro-Asn-Arg-Pro-Val-Tyr-Thr-Thr-Ser-Gln-Val-Gly-Gly-Leu-Ile-Thr-His-Val-Leu-Trp-Glu-Ile-Val-Glu-Met-Arg-Lys-Glu-Leu-Cys-Asn-Gly-Asn-Ser-Asp-Cys-Met-Asn-Asn-Asp-Asp-Ala-Leu-Ala-Glu-Asn-Asn-Leu-Lys-Leu-Pro-Glu-Ile-Gln-Arg-Asn-Asp-Gly-Cys-Tyr-Gln-Thr-Gly-Tyr-Asn-Gln-Glu-Ile-Cys-Leu-Leu-Lys-Ile-Ser-Ser-Gly-Leu-Leu-Glu-Tyr-His-Ser-Tyr-Leu-Glu-Tyr-Met-Lys-Asn-Asn-Leu-Lys-Asp-Asn-Lys-Lys-Asp-Lys-Ala-Arg-Val-Leu-Gln-Arg-Asp-Thr-Glu-Thr-Leu-Ile-His-Ile-Phe-Asn-Gln-Glu-Val-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ile-Val-Leu-Pro-Thr-Pro-Ile-Ser-Asn-Ala-Leu-Leu-Thr-Asp-Lys-Leu-Glu-Ser-Gln-Lys-Glu-Trp-Leu-Arg-Thr-Lys-Thr-Ile-Gln-Phe-Ile-Leu-Lys-Ser-Leu-Glu-Glu-Phe-Leu-Lys-Val-Thr-Leu-Arg-Ser-Thr-Arg-Gln-Thr (서열 번호: 25)

발현 벡터를 이.콜라이 BL21로 형질전환시켰다. 형질전환주를 암피실린(최종 농도 50㎍/ml)이 공급된 LB 브로스에서 접종시키고 OD 600이 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 배양하고, IPTG를 0.4 mM의 최종 농도에 첨가하였다. 배양을 3시간 동안 지속하고 세포를 원심분리에 의해 수득하였다. GST-IL6의 발현을 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. 박테리아 펠렛을 pH 8.0의 50 mM 트리스-HCl 완충액에서 재현탁시키고 초음파 분해에 의해 분해시켰다. GST-IL6을 용해성 조각으로부터 글루타티온 세파로스 4 고속 유동에 의해 정제하였다.

정제된 융합 단백질을 트롬빈으로 분해하고 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 100 ㎍의 단백질 샘플을 20℃에서 150 mM NaCl 및 환원된 글루타티온 10 mM을 함유하는 pH 8.0의 25 mM의 트리스-HCl 완충액에서 트롬빈 0.5 단위에 의해 절단하였다. 일정부분을 각각의 반응으로부터 다양한 시점(반응 후 10분, 30분, 1시간, 2시간 및 3시간)에 제거하고 5분 동안 비등함으로써 열-불활성화시켜 반응을 중지시켰다. 융합 단백질인 GST-IL6(46 kDa)이 점차 사라졌으며, IL-6(22 kDa)의 양은 반응 시간이 지남에 따라 증가하였다(도 8).

트롬빈 처리에 의해 어디에서 절단이 발생하는지를 확인하기 위해, IL-6 단백질을 함유하는 단백질 밴드를 수득하고 아미노산 시퀀싱(sequencing)을 수행하였다. 우선, 정제된 GST-IL6 단백질을 트롬빈으로 3시간 동안 처리하고 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 이어서, 폴리아크릴아마이드 겔내의 단백질을 PVDF 막으로 전이시켰다. IL-6 단백질을 함유하는 밴드를 확인한 후, 이를 PVDF 막으로부터 잘라내어 아미노산 시퀀싱을 수행하였다. IL-6이 그 N-말단에 서열 Ala-Ser-Phe-Pro-Thr-Ser-Gln-Val-Arg-Arg (서열 번호: 26)을 가짐을 확인하였다.

실시예 4

GST-PAR4

단백분해효소-활성화된 수용체(PAR)는 N-말단 엑소도메인(exodomain)의 단백질 분해에 의해 활성화되는 것으로 알려져 있다(문헌[Kahn et ah, J. Clin. Invest. 103:879 (1999)]). 이러한 부류의 단백질을 구성하는 4개의 PAR(PAR1 내지 4)가 존재하며 PAR1, 3 및 4는 트롬빈에 의해 활성화된다(문헌[Coughlin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 11023 (1999)]). PAR4의 트롬빈 절단 부위의 아미노산 서열은 Leu⁴³-Pro-Ala-Pro-Arg↓-Gly-Tyr (서열 번호: 27)이다. 본 발명자들은 다른 트롬빈 절단 부위로서 서열 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓-Ala-Ser (서열 번호: 8)을 함유하는 GST-PAR4 단백질을 제조하여 어떤 부위가 트롬빈에 의해 선호되는지를 시험하였다.

pGEX4T-1-Kan에 인간 PAR4의 cDNA를 삽입하여 GST-PAR4 발현 플라스미드인 pGEX-PAR4를 제조하였다(도 9). RT-PCR에 의해, K562 세포로부터 제조된 토탈 RNA로부터 인간 PAR4를 암호화하는 cDNA를 클로닝하였다. PCR에 사용된 올리고뉴클레오티드는 하기와 같다:

5': GGA TCC CCT CGA GCT TCT ATG TGG GGG CGA (서열 번호: 28)

BamHI

3': GTC GAC TCA GTG CAC CAG GGC CAG GTA (서열 번호: 29)

SalI

5' 프라이머는 PCR 생성물이 pGEX4T-1-Kan 플라스미드로 클로닝될 때 서열 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓-Ala-Ser (서열 번호: 8)이 생성될 수 있도록 GIy-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser (서열 번호: 20)의 암호 서열을 함유하도록 고안되었다.

540 bp cDNA 생성물을 PCR에 의해 제조하였다. 증폭된 생성물은 pGEM-T 이지 플라스미드로 클로닝되어 pGEM-PAR4를 생성하였다. 서열 확인 후, pGEM-PAR4의 BamHI/SalI 조각을 pGEX4T-1-Kan 벡터의 상응하는 부위로 클로닝하였다.

트롬빈 절단 부위를 포함하는 PAR4의 아미노산 서열은 하기와 같다:

Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓-Ala-Ser-Met-Trp-Gly-Arg-Leu-Leu-Leu-Trp-Pro-Leu-Val-Leu-Gly-Phe-Ser-Leu-Ser-Gly-Gly-Thr-Gln-Thr-Pro-Ser-Val-Tyr-Asp-Glu-Ser-Gly-Ser-Thr-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp-Ser-Thr-Pro-Ser-Ile-Leu-Pro-Ala-Pro-Arg-Gly-Tyr-Pro-Gly-Gln-Val-Cys-Ala-Asn-Asp-Ser-Asp-Thr-Leu-Glu-Leu-Pro-Asp-Ser-Ser-Arg-Ala-Leu-Leu-Leu-Gly-Tyr-Val-Pro-Thr-Arg-Leu-Val-Pro-Ala-Leu-Tyr-Gly-Leu-Val-Leu-Val-Val-Gly-Leu-Pro-Ala-Asn-Gly-Leu-Ala-Leu-Trp-Val-Leu-Ala-Thr-Gln-Ala-Pro-Arg-Leu-Pro-Ser-Thr-Met-Leu-Leu-Met-Asn-Leu-Ala-Thr-Ala-Asp-Leu-Leu-Leu-Ala-Leu-Ala-Leu-Pro-Pro-Arg-Ile-Ala-Tyr-His-Leu-Arg-Gly-Gln-Arg-Tyr-Pro-Phe-Gly-Glu-Ala-Ala-Cys-Arg-Leu-Ala-Thr-Ala-Ala-Leu-Tyr-Gly-His-Met-Tyr-Gly-Ser-Val-Leu-Leu-Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Leu-Asp-Arg-Tyr-Leu-Ala-Leu-Val-His (서열 번호: 30)(내부 트롬빈 절단 부위에 밑줄침)

발현 벡터를 이.콜라이 BL21로 형질전환시켰다. 형질전환주를 카나마이신(최종 농도 50㎍/ml)이 공급된 LB 브로스에서 접종시키고 OD 600이 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 배양하고, IPTG를 0.4 mM의 최종 농도에 첨가하였다. 배양을 3시간 동안 지속하고 세포를 원심분리에 의해 수득하였다. GST-PAR4의 발현을 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. 박테리아 펠렛을 pH 8.0의 50 mM 트리스-HCl 완충액에서 재현탁시키고 초음파 분해에 의해 분해시켰다. GST-PAR4를 용해성 조각으로부터 글루타티온 세파로스 4 고속 유동에 의해 정제하였다.

정제된 융합 단백질을 트롬빈으로 분해하고 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 100 ㎍의 단백질 샘플을 20℃에서 150 mM NaCl 및 환원된 글루타티온 10 mM을 함유하는 pH 8.0의 25 mM의 트리스-HCl 완충액에서 트롬빈 0.5 단위에 의해 절단하였다. 일정부분을 각각의 반응으로부터 다양한 시점(반응 후 10분, 30분, 1시간, 2시간 및 3시간)에 제거하고 5분 동안 비등함으로써 열-불활성화시켜 반응을 중지시켰다.

실시예 5

GST-IL11(LV-)

효율적인 트롬빈 절단에 서열 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser (서열 번호: 8) 전체가 요구되는지를 시험하기 위해, 트롬빈 절단 부위로서 Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser (서열 번호: 7)을 암호화하는 발현 플라스미드를 제조하였다. 우선, IL-11(A)을 함유하는 BamHI/SalI 조각을 실시예 1에 개시된 pGEX4T-IL11(A)로부터 수득하였다. 이어서, 이를 pGEX6P-2의 BamHI/SalI 부위로 삽입하여 pGEX6P-IL11을 수득하였다. 상기 플라스미드 pGEX6P-2는 BamHI 부위의 업스트림에 "Pro-Leu" 서열을 함유한다. 따라서, IL-11(A)를 함유하는 BamHI/SalI 조각이 서열 Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser (서열 번호: 20)으로 시작하므로 pGEX6P-IL11은 서열 Pro-Leu-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser (서열 번호: 31)을 가질 수 있다. 두 번째 아미노산 Leu는 사이트-디렉티드 뮤타제네시스에 의해 Arg으로 변환되어 서열 Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser (서열 번호: 7)을 생성하였다. 사이트-디렉티드 뮤타제네시스에 사용된 올리고뉴클레오티드는 하기와 같다;

5': CAG GGG CCC CGG GGA TCC CCT CGA GCT (서열 번호: 32)

3': AGC TCG AGG GGA TCC CCG GGG CTG(서열 번호: 33)

생성된 플라스미드는 pGEX-IL11(LV-)로 명명되었으며 GST-IL11(LV-)의 제조에 사용되었다.

트롬빈 절단 부위를 포함하는 IL-11(LV-)의 아미노산 서열은 하기와 같다:

Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓-Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asp-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Trp-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu (서열 번호: 34)

발현 벡터를 이.콜라이 BL21로 형질전환시켰다. 형질전환주를 암피실린(최종 농도 50㎍/ml)이 공급된 LB 브로스에서 접종시키고 OD 600이 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 배양하고, IPTG를 0.4 mM의 최종 농도에 첨가하였다. 배양을 3시간 동안 지속하고 세포를 원심분리에 의해 수득하였다. GST-IL11(LV-)의 발현을 SDS- PAGE에 의해 확인하였다. 박테리아 펠렛을 pH 8.0의 50 mM 트리스-HCl 완충액에서 재현탁시키고 초음파 분해에 의해 분해시켰다. GST-IL11(LV-)을 용해성 조각으로부터 글루타티온 세파로스 4 고속 유동에 의해 정제하였다.

정제된 융합 단백질을 트롬빈으로 분해하고 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 100 ㎍의 단백질 샘플을 20℃에서 150 mM NaCl을 함유하는 pH 8.0의 25 mM의 트리스-HCl 완충액에서 트롬빈 0.5 단위에 의해 절단하였다. 일정부분을 각각의 반응으로부터 다양한 시점(반응 후 10분, 30분, 1시간, 2시간 및 3시간)에 제거하고 5분 동안 비등함으로써 열-불활성화시켜 반응을 중지시켰다. 융합 단백질인 GST-IL11(LV-)(44 kDa)이 점차 사라졌으며, IL-11(LV-)(18 kDa)의 양은 반응 시간이 지남에 따라 증가하였다(도 11).

트롬빈 처리에 의해 어디에서 절단이 발생하는지를 확인하기 위해, IL-11(LV-) 단백질을 함유하는 단백질 밴드를 수득하고 아미노산 시퀀싱을 수행하였다. 우선, 정제된 GST-IL11(LV-) 단백질을 트롬빈으로 3시간 동안 처리하고 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 이어서, 폴리아크릴아마이드 겔내의 단백질을 PVDF 막으로 전이시켰다. IL-11(LV-) 단백질을 함유하는 밴드를 확인한 후, 이를 PVDF 막으로부터 잘라내어 아미노산 시퀀싱을 수행하였다. IL-11(LV-)이 그 N-말단에 서열 Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp (서열 번호: 35)을 가짐을 확인하였으며, 이는 서열 Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser (서열 번호: 7)이 효율적인 트롬빈 절단에 충분함을 의미한다.

실시예 6

MBP-IL11

pMAL-c2에 인간 IL-11의 cDNA를 삽입하여 MBP-IL11 발현 플라스미드인 pMAL-c2-IL11을 제조하였다(도 12). PCR에 의해, 인간 IL-11을 암호화하는 cDNA를 pGEX4T-IL11(A)로부터 수득하였다. PCR에 사용된 올리고뉴클레오티드는 하기와 같다:

5': GAA TTC CCT CGA GGT TCA CCT CGA GCT TCC (서열 번호: 36)

BamHI

3': GTC GAC TCA CAG CCG AGT CTT CAG CAG (서열 번호: 37)

SalI

5' 프라이머는 서열 Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser (서열 번호: 7)의 암호 서열을 함유하도록 고안되었다. IL-11 서열을 함유하는 EcoRI/SalI 조각을 pMAL-c2 벡터의 EcoRI/SalI 부위로 클로닝시켜 pMAL-c2-IL11을 제조하였다. 따라서 pMAL-c2-IL11은 말토즈 결합 도메인과 인간 IL-11 서열 사이에 pGEX-IL11(LV-)과 동일한 트롬빈 절단 부위를 갖는다.

트롬빈 절단 부위를 포함하는, 말토즈 결합 도메인의 다운스트림의 IL-11의 아미노산 서열은 하기와 같다:

Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓-Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala- Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asp-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Tyr-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu (서열 번호: 34)

발현 벡터를 이.콜라이 BL21로 형질전환시켰다. 형질전환주를 암피실린(최종 농도 50㎍/ml)이 공급된 LB 브로스에서 접종시키고 OD 600이 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 배양하고, IPTG를 0.4 mM의 최종 농도에 첨가하였다. 배양을 3시간 동안 지속하고 세포를 원심분리에 의해 수득하였다. MBP-IL11의 발현을 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. 박테리아 펠렛을 200 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 1mM 나트륨 아자이드를 함유하는 pH 7.4의 20 mM 트리스-HCl 완충액에서 재현탁시키고 초음파 분해에 의해 분해시켰다. 목표 단백질을 함유하는 상청액을 200 mM NaCl 및 1 mM EDTA를 함유하는 pH 7.4의 20 mM 트리스-HCl 완충액으로 예비-평형을 이룬 아밀로즈(뉴잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)) 친화성 컬럼에 적용하였다. 수차례 세척한 후, 결합된 융합 단백질을 200 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 10 mM 말토즈를 함유하는 pH 7.4의 20 mM 트리스-HCl 완충액을 사용하여 용출시켰다.

정제된 융합 단백질을 트롬빈으로 분해하고 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 100 ㎍의 단백질 샘플을 20℃에서 200 mM NaCl, 1 mM EDTA 및 10 mM 말토즈를 함유 하는 pH 7.4의 20 mM 트리스-HCl 완충액에서 트롬빈 0.5 단위에 의해 절단하였다. 일정부분을 각각의 반응으로부터 다양한 시점(반응 후 10분, 30분, 1시간, 2시간 및 3시간)에 제거하고 5분 동안 비등함으로써 열-불활성화시켜 반응을 중지시켰다. 융합 단백질인 MBP-IL11(60 kDa)이 점차 사라졌으며, IL11(18 kDa)의 양은 반응 시간이 지남에 따라 증가하였다(도 13).

트롬빈 처리에 의해 어디에서 절단이 발생하는지를 확인하기 위해, IL-11 단백질을 함유하는 단백질 밴드를 수득하고 아미노산 시퀀싱을 수행하였다. 우선, 정제된 MBP-IL11 단백질을 트롬빈으로 3시간 동안 처리하고 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 이어서, 폴리아크릴아마이드 겔내의 단백질을 PVDF 막으로 전이시켰다. IL-11 단백질을 함유하는 밴드를 확인한 후, 이를 PVDF 막으로부터 잘라내어 아미노산 시퀀싱을 수행하였다. IL-11(LV-)이 그 N-말단에 서열 Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp (서열 번호: 38)을 가짐을 확인하였으며, 이는 서열 Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser (서열 번호: 7)이 효율적인 트롬빈 절단에 충분함을 의미한다.

실시예 7

HIS-IL11

pET-19b에 인간 IL-11의 cDNA를 삽입하여 His-IL11 발현 플라스미드인 pET19b-IL11을 제조하였다(도 14). PCR에 의해, 인간 IL-11을 암호화하는 cDNA를 pGEX4T-IL11(A)로부터 수득하였다. PCR에 사용된 올리고뉴클레오티드는 하기와 같다:

5': CAT ATG CCT CGA GGT TCA CCT CGA GCT TCC (서열 번호: 39)

NdeI

3': GGA TCC TCA CAG CCG AGT CTT CAG CAG (서열 번호: 40)

BamHI

5' 프라이머는 서열 Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓Ala-Ser (서열 번호: 7)의 암호 서열을 함유하도록 고안되었다. IL-11 서열을 함유하는 NdeI/BamHI 조각을 pET19b 벡터의 NdeI/BamHI 부위로 클로닝시켜 pET19b-IL11을 제조하였다. 따라서 pET19b-IL11은 His 태그와 인간 IL-11 서열 사이에 pGEX-IL11(LV-)과 동일한 트롬빈 절단 부위를 갖는다.

트롬빈 절단 부위를 포함하는, His 태그의 다운스트림의 IL-11의 아미노산 서열은 하기와 같다:

Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg↓-Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asp-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu- Leu-Lys-Thr-Arg-Leu (서열 번호: 34)

발현 벡터를 이.콜라이 BL21(DE3)로 형질전환시켰다. 형질전환주를 암피실린(최종 농도 50㎍/ml)이 공급된 LB 브로스에서 접종시키고 OD 600이 0.5에 도달할 때까지 37℃에서 배양하고, IPTG를 1 mM의 최종 농도에 첨가하였다. 배양을 3시간 동안 지속하고 세포를 원심분리에 의해 수득하였다. His-IL11의 발현을 SDS-PAGE에 의해 확인하였다. 박테리아 펠렛을 0.5 M NaCl을 함유하는 pH 7.4의 20 mM 나트륨 포스페이트 완충액에서 재현탁시키고 초음파 분해에 의해 분해시켰다. 목표 단백질을 함유하는 상청액을 0.5 M NaCl 및 20 mM 이미다졸을 함유하는 pH 7.4의 20 mM 나트륨 포스페이트 완충액으로 예비-평형을 이룬 Ni-세파로스 하이 퍼포먼스(Ni-Sepharose High Performance)(아머샴 사이오사이언시스) 친화성 컬럼에 적용하였다. 수차례 세척한 후, 결합된 융합 단백질을 0.5 M NaCl 및 500 mM 이미다졸을 함유하는 pH 7.4의 20 mM 나트륨 포스페이트 완충액을 사용하여 용출시켰다.

정제된 융합 단백질을 트롬빈으로 분해하고 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 100 ㎍의 단백질 샘플을 20℃에서 0.5 M NaCl 및 500 mM 이미다졸을 함유하는 pH 7.4의 20 mM 나트륨 포스페이트 완충액에서 트롬빈 0.5 단위에 의해 절단하였다. 일정부분을 각각의 반응으로부터 다양한 시점(반응 후 10분, 30분, 1시간, 2시간 및 3시간)에 제거하고 5분 동안 비등함으로써 열-불활성화시켜 반응을 중지시켰다. 융합 단백질인 His-IL11(22 kDa)이 점차 사라졌으며, IL11(18 kDa)의 양은 반응 시간이 지남에 따라 증가하였다(도 15).

트롬빈 처리에 의해 어디에서 절단이 발생하는지를 확인하기 위해, IL-11 단백질을 함유하는 단백질 밴드를 수득하고 아미노산 시퀀싱을 수행하였다. 우선, 정제된 His-IL11 단백질을 트롬빈으로 3시간 동안 처리하고 SDS-PAGE에 의해 분리하였다. 이어서, 폴리아크릴아마이드 겔내의 단백질을 PVDF 막으로 전이시켰다. IL-11 단백질을 함유하는 밴드를 확인한 후, 이를 PVDF 막으로부터 잘라내어 아미노산 시퀀싱을 수행하였다. IL-11이 그 N-말단에 서열 Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp (서열 번호: 41)을 가짐을 확인하였으며, 이는 서열 Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser (서열 번호: 7)이 효율적인 트롬빈 절단에 충분함을 의미한다.

지금까지 본 발명을 모두 설명하였으며, 본 발명의 범위 및 어떤 실시양태에도 영향을 미치지 않으면서 다양하고 동등한 범위의 조건, 배합 및 기타 파라미터들을 사용하여 동일한 수행을 할 수 있음이 일반적 당업자에게 이해될 것이다. 본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 문헌은 그 전체가 참고로서 인용된다.

SEQUENCE LISTING <110> Viromed Co., Ltd. Kim, Sujeong Kim, Jong-Mook Xu, Song Shan <120> Compositions and Methods for Fusion Protein Separation <130> PCA70967/VML/PCT/KR <140> PCT/IB2006/002378 <141> 2006-04-20 <150> 60/672,879 <151> 2005-04-20 <160> 42 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Thrombin cleavage site <400> 1 Leu Val Pro Arg Gly Ser 1 5 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Thrombin cleavage site <400> 2 Met Tyr Pro Arg Gly Asn 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Thrombin cleavage site <400> 3 Ile Arg Pro Lys Leu Lys 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Thrombin cleavage site <400> 4 Leu Val Pro Arg Gly 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide linker <400> 5 Ser Gly Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Cdc14p thrombin cleavage site <400> 6 Ser Gly Gly Gly Gly Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide linker <400> 7 Pro Arg Gly Ser Pro Arg Ala Ser 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide linker <400> 8 Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Arg Ala Ser 1 5 10 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> MRP14 thrombin cleavage site <400> 9 Asn Asn Pro Arg Gly His 1 5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fibrinopeptide A thrombin cleavage site <400> 10 Gly Gly Val Arg Gly Pro 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Fibrinopeptide B thrombin cleavage site <400> 11 Phe Ser Ala Arg Gly His 1 5 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> IL-11 PCR primer <400> 12 ggatccccgc gagcttcccc agaccct 27 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> IL-11 PCR primer <400> 13 gtcgacccct tatcacagcc gagtcttcag 30 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> IL-11 mutagenesis primer <400> 14 ccagccaccc ccgaacccgc cggcgcc 27 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> IL-11 mutagenesis primer <400> 15 ggcgccggcg ggttcggggg tggctgg 27 <210> 16 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Partial thrombin cleavage site <400> 16 Pro Arg Ala Ser 1 <210> 17 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> hIL11(A) <400> 17 Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Arg Ala Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu 1 5 10 15 Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg 20 25 30 Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His 35 40 45 Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly 50 55 60 Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu 65 70 75 80 Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser 85 90 95 Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp 100 105 110 Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro 115 120 125 Gln Pro Pro Pro Asn Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser 130 135 140 Ala Trp Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His 145 150 155 160 Leu Thr Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg 165 170 175 Leu <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> GST-Thymosin Beta 4 PCR primer <400> 18 ggatcccctc gagcttctga caaacccgat atg 33 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> GST-Thymosin Beta 4 PCR primer <400> 19 gtcgacttac gattcgcctg cttgcttctc 30 <210> 20 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Partial thrombin cleavage site <400> 20 Gly Ser Pro Arg Ala Ser 1 5 <210> 21 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Thymosin Beta 4 <400> 21 Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Arg Ala Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala 1 5 10 15 Glu Ile Glu Lys Phe Asp Lys Ser Lys Leu Lys Lys Thr Glu Thr Gln 20 25 30 Glu Lys Asn Pro Leu Pro Ser Lys Glu Thr Ile Glu Gln Glu Lys Gln 35 40 45 Ala Gly Glu Ser 50 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Thymosin Beta 4 N-terminal sequence <400> 22 Ala Ser Asp Lys Pro Asp Met Ala Glu Ile 1 5 10 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> GST-IL6 PCR primer <400> 23 ggatcccctc gagcttcttt ccctacttca 30 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> GST-IL6 PCR primer <400> 24 gtcgacctag gtttgccgag tagatct 27 <210> 25 <211> 197 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-6 <400> 25 Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Arg Ala Ser Phe Pro Thr Ser Gln Val 1 5 10 15 Arg Arg Gly Asp Phe Thr Glu Asp Thr Thr Pro Asn Arg Pro Val Tyr 20 25 30 Thr Thr Ser Gln Val Gly Gly Leu Ile Thr His Val Leu Trp Glu Ile 35 40 45 Val Glu Met Arg Lys Glu Leu Cys Asn Gly Asn Ser Asp Cys Met Asn 50 55 60 Asn Asp Asp Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Lys Leu Pro Glu Ile Gln 65 70 75 80 Arg Asn Asp Gly Cys Tyr Gln Thr Gly Tyr Asn Gln Glu Ile Cys Leu 85 90 95 Leu Lys Ile Ser Ser Gly Leu Leu Glu Tyr His Ser Tyr Leu Glu Tyr 100 105 110 Met Lys Asn Asn Leu Lys Asp Asn Lys Lys Asp Lys Ala Arg Val Leu 115 120 125 Gln Arg Asp Thr Glu Thr Leu Ile His Ile Phe Asn Gln Glu Val Lys 130 135 140 Asp Leu His Lys Ile Val Leu Pro Thr Pro Ile Ser Asn Ala Leu Leu 145 150 155 160 Thr Asp Lys Leu Glu Ser Gln Lys Glu Trp Leu Arg Thr Lys Thr Ile 165 170 175 Gln Phe Ile Leu Lys Ser Leu Glu Glu Phe Leu Lys Val Thr Leu Arg 180 185 190 Ser Thr Arg Gln Thr 195 <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-6 N-terminal sequence <400> 26 Ala Ser Phe Pro Thr Ser Gln Val Arg Arg 1 5 10 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> PAR4 thrombin cleavage site <400> 27 Leu Pro Ala Pro Arg Gly Tyr 1 5 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> GST-PAR4 PCR primer <400> 28 ggatcccctc gagcttctat gtgggggcga 30 <210> 29 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> GST-PAR4 PCR primer <400> 29 gtcgactcag tgcaccaggg ccaggta 27 <210> 30 <211> 190 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> PAR4 <400> 30 Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Arg Ala Ser Met Trp Gly Arg Leu Leu 1 5 10 15 Leu Trp Pro Leu Val Leu Gly Phe Ser Leu Ser Gly Gly Thr Gln Thr 20 25 30 Pro Ser Val Tyr Asp Glu Ser Gly Ser Thr Gly Gly Gly Asp Asp Ser 35 40 45 Thr Pro Ser Ile Leu Pro Ala Pro Arg Gly Tyr Pro Gly Gln Val Cys 50 55 60 Ala Asn Asp Ser Asp Thr Leu Glu Leu Pro Asp Ser Ser Arg Ala Leu 65 70 75 80 Leu Leu Gly Tyr Val Pro Thr Arg Leu Val Pro Ala Leu Tyr Gly Leu 85 90 95 Val Leu Val Val Gly Leu Pro Ala Asn Gly Leu Ala Leu Trp Val Leu 100 105 110 Ala Thr Gln Ala Pro Arg Leu Pro Ser Thr Met Leu Leu Met Asn Leu 115 120 125 Ala Thr Ala Asp Leu Leu Leu Ala Leu Ala Leu Pro Pro Arg Ile Ala 130 135 140 Tyr His Leu Arg Gly Gln Arg Tyr Pro Phe Gly Glu Ala Ala Cys Arg 145 150 155 160 Leu Ala Thr Ala Ala Leu Tyr Gly His Met Tyr Gly Ser Val Leu Leu 165 170 175 Leu Ala Ala Val Ser Leu Asp Arg Tyr Leu Ala Leu Val His 180 185 190 <210> 31 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL11 thrombin cleavage site <400> 31 Pro Leu Gly Ser Pro Arg Ala Ser 1 5 <210> 32 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> IL11 mutagenesis primer <400> 32 caggggcccc ggggatcccc tcgagct 27 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> IL11 mutagenesis primer <400> 33 agctcgaggg gatccccggg gctg 24 <210> 34 <211> 175 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-11(LV) <400> 34 Pro Arg Gly Ser Pro Arg Ala Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp 1 5 10 15 Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu 20 25 30 Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu 35 40 45 Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu 50 55 60 Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr 65 70 75 80 Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys 85 90 95 Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu 100 105 110 Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro 115 120 125 Pro Pro Asn Pro Pro Ala Pro Pro Leu Ala Pro Pro Ser Ser Ala Trp 130 135 140 Gly Gly Ile Arg Ala Ala His Ala Ile Leu Gly Gly Leu His Leu Thr 145 150 155 160 Leu Asp Trp Ala Val Arg Gly Leu Leu Leu Leu Lys Thr Arg Leu 165 170 175 <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-11(LV) N-terminal sequence <400> 35 Ala Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp 1 5 10 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> IL-11(A) PCR primer <400> 36 gaattccctc gaggttcacc tcgagcttcc 30 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> IL-11(A) PCR primer <400> 37 gtcgactcac agccgagtct tcagcag 27 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-11 N-terminal sequence <400> 38 Ala Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp 1 5 10 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> His-IL11 PCR primer <400> 39 catatgcctc gaggttcacc tcgagcttcc 30 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> His-IL11 PCR primer <400> 40 ggatcctcac agccgagtct tcagcag 27 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL-11 N-terminal sequence <400> 41 Ala Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp 1 5 10 <210> 42 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> IL11(A) <400> 42 Ala Ser Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu 1 5 10 15

Claims

하기 서열로 구성되는 단리된 펩티드 결합자:

Xl-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser

상기 서열에서,

X1은 서로 동일하거나 상이한 2개 내지 10개의 아미노산 잔기이다.
제 1 항에 있어서,

X1이 4개 이상의 아미노산 잔기인 단리된 펩티드 결합자.
삭제
제 1 항에 있어서,

X1이 프롤린 및 아르기닌을 포함하는 단리된 펩티드 결합자.
삭제
삭제
삭제
삭제
제 1 항에 있어서,

서열 Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser (서열 번호: 7)으로 구성되는 단리된 펩티드 결합자.
제 1 항에 있어서,

서열 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser (서열 번호: 8)으로 구성되는 단리된 펩티드 결합자.
관심 단백질, 융합 짝 및 이들 사이에 삽입된 펩티드 결합자를 포함하는 융합 단백질로서, 상기 펩티드 결합자가 하기 서열로 구성되는 융합 단백질:

Xl-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser

상기 서열에서,

X1은 서로 동일하거나 상이한 2개 내지 10개의 아미노산 잔기이다.
제 11 항에 있어서,

관심 단백질이 인터루킨(interleukin, IL)-11, 티모신 β4, 티모신 α1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-13, IL-15, IL-18, 단백분해효소-활성화된 수용체 1(Protease-activated receptor 1, PAR1), PAR3, PAR4, RANTES, 간질 세포-유도된 인자-1α, 단구화학주성단백질, 줄기 세포 인자, FLT-3L, 부갑상샘 호르몬, 혈소판증식촉진인자, 표피성장인자, 섬유아세포성장인자, 인슐린-유사 성장인자, 과립구-대식구 집락 자극인자, 과립구 집락 자극인자, 대식구 집락 자극인자, 혈소판-유도된 성장인자, 전환성장인자(transforming growth factor, TGF)-β1, 종양괴사인자(tumor necrosis factor, TNF)-α, 인터페론(interferon, IFN)-α, IFN-β, IFN-γ, 간세포성장인자, 혈관내피성장인자 및 면역글로불린 중쇄로 이루어진 군으로부터 선택되는 융합 단백질.
제 12 항에 있어서,

관심 단백질이 인간 IL11, 티모신 β4, IL-6 및 PAR4로 이루어진 군으로부터 선택되는 융합 단백질.
제 12 항에 있어서,

관심 단백질이 인간 IL11인 융합 단백질.
제 11 항에 있어서,

융합 짝이 친화성 펩티드인 융합 단백질.
제 15 항에 있어서,

융합 짝이 글루타티온-S-트랜스퍼라제(Glutathione-S-transferase, GST), 말토즈 결합 단백질(MBP), 헥사히스티딘, T7 펩티드, 유비퀴틴, 플래그(Flag) 펩티드, c-myc 펩티드, 폴리아르기닌, 폴리시스테인, 폴리페닐알라닌, B태그(BTag), 갈락토스 결합 도메인, 셀룰로스 결합 도메인(cellulose binding domain, CBD), 티오레독신, 포도알균 단백질 A, 포도알균 단백질 G, 칼모듈린, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제, S-펩티드, 스트렙타비딘, His-태그 및 스트렙(Strep)-태그 로 이루어진 군으로부터 선택되는 융합 단백질.
제 16 항에 있어서,

융합 짝이 GST인 융합 단백질.
펩티드 결합자의 분할이 일어나도록 융합 단백질을 충분한 양의 트롬빈과 접촉시킴을 포함하는, 제 11 항의 융합 단백질로부터 관심 단백질을 분리시키는 방법.
제 18 항에 있어서,

융합 단백질이 펩티드 결합자의 Arg과 Ala 사이에서 분할되는 방법.
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제 1 항의 펩티드 결합자를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
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제 36 항에 있어서,

펩티드 결합자가 서열 Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser (서열 번호: 7)으로 구성되는 폴리뉴클레오티드.
제 36 항에 있어서,

펩티드 결합자가 서열 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser (서열 번호: 8) 으로 구성되는 폴리뉴클레오티드.
제 11 항의 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
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제 43 항에 있어서,

융합 짝이 GST인 폴리뉴클레오티드.
제 43 항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
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제 49 항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
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(a) 관심 단백질, 융합 짝 및 이들 사이에 삽입된 제 1 항의 펩티드 결합자를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;

(b) 숙주 세포로 상기 벡터를 전달하는 단계;

(c) 융합 단백질이 발현되는 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계; 및

(d) 상기 융합 단백질을 분리시키는 단계

를 포함하는 융합 단백질의 제조 방법.
(a) 관심 단백질, 융합 짝 및 이들 사이에 삽입된 제 1 항의 펩티드 결합자를 포함하는 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제조하는 단계;

(b) 숙주 세포로 상기 벡터를 전달하는 단계;

(c) 융합 단백질이 발현되는 조건하에서 상기 숙주 세포를 배양하는 단계;

(d) 상기 융합 단백질을 분리시키는 단계;

(e) 상기 융합 단백질을 트롬빈과 접촉시켜 융합 단백질을 분할시키는 단계; 및

(f) 상기 관심 단백질을 분리하는 단계

를 포함하는 관심 단백질의 제조 방법.
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제 63 항에 있어서,

융합 단백질의 분리를 친화성 컬럼을 사용하여 수행하는 제조 방법.
제 69 항에 있어서,

융합 단백질의 트롬빈과의 접촉을 상기 융합 단백질이 친화성 컬럼에 결합되어 있는 동안 수행하는 제조 방법.
제 69 항에 있어서,

융합 단백질의 분리가 관심 단백질을 양이온 교환 크로마토크래피하는 것을 추가로 포함하는 제조 방법.
제 69 항에 있어서,

융합 단백질의 분리가 관심 단백질을 음이온 교환 크로마토그래피하는 것을 추가로 포함하는 제조 방법.
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제 49 항의 벡터를 포함하는 키트.
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