CN1666995A - 一种经切割后能产生多种有效成分的前体蛋白 - Google Patents

一种经切割后能产生多种有效成分的前体蛋白 Download PDF

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CN1666995A CN 200410004796 CN200410004796A CN1666995A CN 1666995 A CN1666995 A CN 1666995A CN 200410004796 CN200410004796 CN 200410004796 CN 200410004796 A CN200410004796 A CN 200410004796A CN 1666995 A CN1666995 A CN 1666995A
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Abstract

本发明涉及一种经切割后能产生多种有效成分的前体蛋白，本发明可以使该前体蛋自在大肠杆菌基因工程菌中得到稳定高效的表达。经过表达后的前体蛋白经过切割加工后，得到了超高效生物活性的有效成分蛋白，可用于癌症的辅助治疗。

Description

一种经切割后能产生多种有效成分的前体蛋白
一.技术领域
本发明属于重组蛋白质药物领域。通过对前体蛋白的基因工程构建，实现了高效表达；通过前体蛋白不同位点的氨基酸变化，以及控制凝血酶酶切工艺，可以得到成熟白细胞介素11的多种突变体，该方法具有表达量高，操作简便，成熟蛋白活性高的特点。
二.背景技术
本发明中的前体蛋白是白细胞介素11前体蛋白。白细胞介素11是在人体内有多种功能的一类细胞因子，其主要功能是：(1)使造血干细胞分化为巨核系细胞，使巨核细胞增殖并成熟，促进血小板生成；(2)保护胃肠粘膜受损细胞；(3)促进骨髓集落的形成；(4)促进白细胞生成等。白细胞介素11的最主要功能是促进血小板生成从而提高外周血血小板的数量。美国的Genetics Institute公司生产的重组人白细胞介素11(商品名neumega)已于1997年11月由FDA批准上市，适应症为化疗引起的肿瘤病人血小板减少症。
由于天然的白细胞介素11含量非常微小，难以得到，并且白细胞介素11的分子量约为19kD，也难以进行化学合成，所以基因工程表达的方法就成为了生产重组人白细胞介素11的主要方法。
实验证明，白细胞介素11单独在大肠杆菌中表达对菌体的毒性较大，可造成工程菌的死亡。一种方法是采用包涵体表达的方法(见专利99125600.X)，但由于白细胞介素11所含疏水氨基酸较多，疏水氨基酸占总氨基酸数量的60％左右，所以包涵体变性后复性难度较大且收率较低。另一种方法是采用甲醇酵母直接表达重组人白细胞介素11(见专利99118279.0)，这种方法白细胞介素11直接表达到甲醇酵母培养基中，方便了下游的纯化，但是由于其发酵的时间较长(大于3天)，增加了时间及其他成本，并且表达后的白细胞介素11在发酵液中高温停留的时间较长也增加了一些不利的因素。
鉴于此，用表达前体蛋白的方法纯化后，再进行切割得到目的的重组白细胞介素11的方法更为可行。美国Genetics Institute公司生产的重组人白细胞介素11(商品名neumega)的方法是使用PTHUS质粒，得到Thioredoxin融合蛋白，然后使用羟胺进行切割，多步纯化得到了目的蛋白(见US 5,760,189)。然而该种方法的融合蛋表达量仅占总蛋白的约10％，另外，其纯化步骤较为繁复，包括多步超滤和层析，本发明通过构建另一种前体蛋白，采用了凝血酶进行切割，而得到成熟白细胞介素11蛋白的多种突变体，具有高表达，高活性的特点，适用于临床上血小板减少症的治疗。
三.发明内容
本发明的主要特点是构建并表达了白细胞介素11的一种前体蛋白，采用的凝血酶进行切割，得到高活性的成熟白细胞介素11重组蛋白突变体，更适于血小板减少症的治疗。
鉴于白细胞介素11直接表达有很多困难，本发明设计的前体蛋白的前10位氨基酸组成的肽(His-Pro-Pro-Lys-Ser-Aso-Leu-Val-Pro-Arg)起到了分子伴侣的作用，减少了白细胞介素11对大肠杆菌细胞的毒性，并且在大肠杆菌胞质中可以稳定目的蛋白的结构，从而使其表达量大大提高，达到总蛋白的35％以上。
前体蛋白采用大肠杆菌偏爱的密码子，可采用如pET，pBV，pGEX等多种表达载体进行表达，宿主菌可采用BL21，BL21(DE3)，JM109，DH5α等多种宿主菌进行胞内可溶性表达发酵。表达后的前体蛋白可以通过菌体机械破碎的方法释放并用离心或超滤的方法进行固液分离。然后前体蛋白通过常规的层析方法进行纯化，本发明采用样品先分子筛脱盐后阳离子交换层析的方法，进行纯化可使前体蛋白的纯度达到90％以上。
通过控制前体蛋白第15位X和第139位Y氨基酸的变化与纯化后凝血酶的酶切条件，可以得到一系列白细胞介素11的突变体。具体方法如下：
当X为Val时，Y为Asp时，凝血酶浓度为2U/mL，得到的人白细胞介素11是前体蛋白的第10位到第183位，此为白细胞介素11-NO1。
当X为Ala时，而Y为Asp和Asn时，凝血酶的浓度为5U/mL，得到的人白细胞介素11是前体蛋白的第15位到第183位，此分别为白细胞介素11-NO2和NO3。
当X为Ser时，而Y为Asp和Gln时，凝血酶的浓度为8U/mL，得到的人白细胞介素11是前体蛋白的第15位到第183位，此分别为白细胞介素11-NO4和NO5。
以上的前体蛋白经过凝血酶切割后，进行2步纯化，分别使阳离子交换层析和阴离子交换层析后，得到了纯度大于95％的重组人白细胞介素11。总收率大于50％。
得到的各种白细胞介素11突变体细胞活性采用MTT法，用B911细胞，应用美国已上市的重组白细胞介素11(neumega)作为参照品进行生物活性的测定，结果如下：
白细胞介素11种类            比活性
neumega：                   6.2×106U/mg
NO1：                       5.3×106U/mg
NO2：                       8.8×106U/mg
NO3：                       8.6×106U/mg
NO4：                       7.7×106U/mg
NO5：                       7.4×106U/mg
从结果可以看出，本发明的白细胞介素11-NO2-NO5与标准品比较活性都有了明显的提高，由此这些白细胞介素11突变体在临床治疗血小板减少症的情况下就有可能降低剂量，减少毒性，从而达到更好的治疗效果。
四.具体实施方式
实例1
用PCR方法，从人肝细胞文库中扩增出目的基因，合成引物时引入前10个氨基酸(His-Pro-Pro-Lys-Ser-Aso-Leu-Val-Pro-Arg)并嵌入酶切位点，再用测序质粒pBSK筛选出完整的目的基因片段备用，最后从重组pBSK质粒中切下序列测定正确的目的基因片段，定向地嵌入表达质粒pET21b中，得到重组质粒pET-pro，经过酶切、测序、鉴定后的重组质粒pET-pro，用CaCl2法转入表达菌BL21(DE3)中，该重组工程菌经过表达，纯化得到最终白细胞介素11蛋白突变体。
前体蛋白的氨基酸序列为：
His-Pro-Pro-Lys-Ser-Aso-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Val-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-
Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-
Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-
Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-
Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-
Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-
Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asp-Pro-
Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-
Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-
Thr-Arg-Leu
具体方法如下：
1.表达：从转化好的工程菌平面上挑取3个单菌落，接种到50mL LB液体培养基中，37度，200转/分钟，12小时后，把50mL菌液转接入1升LB液体培养基中，37度，200转/分钟，3小时后，当OD600约等于0.8时，加入IPTG使其终浓度为1mM，3小时后离心收集菌体。
2.裂菌：收集的菌体按1∶5的比例加入裂菌缓冲液，20mM Tris，pH8，然后使用超声波法进行破菌，破菌后15000rpm/分钟进行离心20分钟，收集上清。
3.纯化：
a.凝胶过滤层析
采用Sephadex G25 Medium介质，平衡液采用20mM PB，pH7，收集蛋白峰。
b.阳离子交换层析
采用CM Sehparose Fast Flow层析介质，平衡液为20mM PB，pH7，上样并平衡后采用20mMPB，pH7，0.25M NaCl洗脱，收集蛋白洗脱峰。
c.酶切
采用凝血酶，比例为样品1mL：2U，进行酶切，时间为2小时，温度为25度。
d.阳离子交换层析
酶切液用20mM PB，pH7缓冲液稀释3倍，上CM Sehparose Fast Flow层析介质，平衡液采用20mM PB，pH7，洗脱液采用20mM PB，pH7，0.25M NaCl洗脱，收集蛋白洗脱峰。
e.阴离子交换层析
上一步层析得到的洗脱液用20mM PB，pH7稀释3倍，上DEAE Sepharose Fast Flow层析介质，收集透过峰。即为白细胞介素11-NO1纯品。
4.检测
得到的白细胞介素11-NO1通过SDS-PAGE纯度检测和反相HPLC检测，纯度大于95％。
5.活性检测
得到的白细胞介素11-NO1采用MTT法，应用美国已上市的重组白细胞介素11(neumega)作为参照品，用B911细胞进行生物活性的测定，结果neumega的比活性为6.2×106U/mg，白细胞介素11-NO1的比活性为5.3×106U/mg。
实例二
采用PCR定点突变的方法，将实例一中的前体蛋白的第15位氨基酸突变为Ala，并从重组pBSK质粒中切下序列测定正确的目的基因片段，定向地嵌入表达质粒pBV中，得到重组质粒pBV-pro，经过酶切、测序、鉴定后的重组质粒pBV-pro，用CaCl2法转入表达菌DH5α中，该重组工程菌经过表达，纯化得到最终白细胞介素11蛋白突变体。
前体蛋白的氨基酸序列为：
His-Pro-Pro-Lys-Ser-Aso-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-
Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-
Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-
Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-
Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-
Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-
Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asp-Pro-
Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-
Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-
Thr-Arg-Leu
具体方法如下：
1.表达：从转化好的工程菌平面上挑取3个单菌落，接种到50mL LB液体培养基中，30度，200转/分钟，12小时后，把50mL菌液转接入1升LB液体培养基中，30度，200转/分钟，3小时后，当OD600约等于0.8时，温度升到42度，3小时后离心收集菌体。
2.裂菌：收集的菌体按1∶5的比例加入裂菌缓冲液，20mM Tris，pH8，然后使用超声波法进行破菌，破菌后15000rpm/分钟进行离心20分钟，收集上清。
3.纯化：
a)凝胶过滤层析
采用Sephadex G25 Medium介质，平衡液采用20mM PB，pH7，收集蛋白峰。
b)阳离子交换层析
采用CM Sehparose Fast Flow层析介质，平衡液为20mM PB，pH7，上样并平衡后采用20mM PB，pH7，0.25M NaCl洗脱，收集蛋白洗脱峰。
c)酶切
采用凝血酶，比例为样品1mL∶5U，进行酶切，时间为2小时，温度为25度。
d)阳离子交换层析
酶切液用20mM PB，pH7缓冲液稀释3倍，上CM Sehparose Fast Flow层析介质，平衡液采用20mM PB，pH7，洗脱液采用20mM PB，pH7，0.25M NaCl洗脱，收集蛋白洗脱峰。
e)阴离子交换层析
上一步层析得到的洗脱液用20mM PB，pH7稀释3倍，上DEAE Sepharose Fast Flow层析介质，收集透过峰。即为白细胞介素11-NO2纯品。
4.检测
得到的白细胞介素11-NO2通过SDS-PAGE纯度检测和反相HPLC检测，纯度大于95％。
5.活性检测
得到的白细胞介素11-NO2采用MTT法，应用美国已上市的重组白细胞介素11(neumega)作为参照品，用B911细胞进行生物活性的测定，结果白细胞介素11-NO2的比活性为8.8×106U/mg。
实例三
采用PCR定点突变的方法，将实例二中的前体蛋白的第139位氨基酸改变为Asn，从重组pBSK质粒中切下序列测定正确的目的基因片段，定向地嵌入表达质粒pKK中，得到重组质粒pKK-pro，经过酶切、测序、鉴定后的重组质粒pKK-pro，用CaCl2法转入表达菌BL21中，该重组工程菌经过表达，纯化得到最终白细胞介素11蛋白突变体。
前体蛋白的氨基酸序列为：
His-Pro-Pro-Lys-Ser-Aso-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-
Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-
Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-
Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-
Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-
Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-
Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asn-Pro-
Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-
Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-
Thr-Arg-Leu
具体方法如下：
1.表达：从转化好的工程菌平面上挑取3个单菌落，接种到50mL LB液体培养基中，37度，200转/分钟，12小时后，把50mL菌液转接入1升LB液体培养基中，37度，200转/分钟，3小时后，当OD600约等于0.8时，加入IPTG使其终浓度为1mM，3小时后离心收集菌体。
2.裂菌：收集的菌体按1∶5的比例加入裂菌缓冲液，20mM Tris，pH8，然后使用超声波法进行破菌，破菌后15000rpm/分钟进行离心20分钟，收集上清。
3.纯化：
a)凝胶过滤层析
采用Sephadex G25 Medium介质，平衡液采用20mM PB，pH7，收集蛋白峰。
b)阳离子交换层析
采用CM Sehparose Fast Flow层析介质，平衡液为20mM PB，pH7，上样并平衡后采用20mM PB，pH7，0.25M NaCl洗脱，收集蛋白洗脱峰。
c)酶切
采用凝血酶，比例为样品1mL∶5U，进行酶切，时间为2小时，温度为25度。
d)阳离子交换层析
酶切液用20mM PB，pH7缓冲液稀释3倍，上CM Sehparose Fast Flow层析介质，平衡液采用20mM PB，pH7，洗脱液采用20mM PB，pH7，0.25M NaCl洗脱，收集蛋白洗脱峰。
e)阴离子交换层析
上一步层析得到的洗脱液用20mM PB，pH7稀释3倍，上DEAE Sepharose Fast Flow层析介质，收集透过峰。即为白细胞介素11-NO3纯品。
4.检测
得到的白细胞介素11-NO3通过SDS-PAGE纯度检测和反相HPLC检测，纯度大于95％。
5.活性检测
得到的白细胞介素11-NO3采用MTT法，应用美国已上市的重组白细胞介素11(neumega)作为参照品，用B911细胞进行生物活性的测定，结果白细胞介素11-NO3的比活性为8.6×106U/mg。
实例四
采用PCR定点突变的方法，将实例一中的前体蛋白的第15位氨基酸改变为Ser，从重组pBSK质粒中切下序列测定正确的目的基因片段，定向地嵌入表达质粒pET21b中，得到重组质粒pET-pro，经过酶切、测序、鉴定后的重组质粒pET-pro，用CaCl2法转入表达菌BL21(DE3)中，该重组工程菌经过表达，纯化得到最终白细胞介素11蛋白突变体。
前体蛋白的氨基酸序列为：
His-Pro-Pro-Lys-Ser-Aso-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ser-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-
Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-
Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-
Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-
Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-
Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-
Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asp-Pro-
Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-
Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-
Thr-Arg-Leu
具体方法如下：
1.表达：从转化好的工程菌平面上挑取3个单菌落，接种到50mL LB液体培养基中，37度，200转/分钟，12小时后，把50mL菌液转接入1升LB液体培养基中，37度，200转/分钟，3小时后，当OD600约等于0.8时，加入IPTG使其终浓度为1mM，3小时后离心收集菌体。
2.裂菌：收集的菌体按1∶5的比例加入裂菌缓冲液，20mM Tris，pH8，然后使用超声波法进行破菌，破菌后15000rpm/分钟进行离心20分钟，收集上清。
3.纯化：
a)凝胶过滤层析
采用Sephadex G25 Medium介质，平衡液采用20mM PB，pH7，收集蛋白峰。
b)阳离子交换层析
采用CM Sehparose Fast Flow层析介质，平衡液为20mM PB，pH7，上样并平衡后采用20mM PB，pH7，0.25M NaCl洗脱，收集蛋白洗脱峰。
c)酶切
采用凝血酶，比例为样品1mL∶8U，进行酶切，时间为2小时，温度为25度。
d)阳离子交换层析
酶切液用20mM PB，pH7缓冲液稀释3倍，上CM Sehparose Fast Flow层析介质，平衡液采用20mM PB，pH7，洗脱液采用20mM PB，pH7，0.25M NaCl洗脱，收集蛋白洗脱峰。
e)阴离子交换层析
上一步层析得到的洗脱液用20mM PB，pH7稀释3倍，上DEAE Sepharose Fast Flow层析介质，收集透过峰。即为白细胞介素11-NO4纯品。
4.检测
得到的白细胞介素11-NO4通过SDS-PAGE纯度检测和反相HPLC检测，纯度大于95％。
5.活性检测
得到的白细胞介素11-NO4采用MTT法，应用美国已上市的重组白细胞介素11(neumega)作为参照品，用B911细胞进行生物活性的测定，结果白细胞介素11-NO4的比活性为7.7×106U/mg。
实例五
采用PCR定点突变的方法，将实例四中的前体蛋白的第139位氨基酸改变为Gln，从重组pBSK质粒中切下序列测定正确的目的基因片段，定向地嵌入表达质粒pGEX中，得到重组质粒pGEX-pro，经过酶切、测序、鉴定后的重组质粒pGEX-pro，用CaCl2法转入表达菌JM105中，该重组工程菌经过表达，纯化得到最终白细胞介素11蛋白突变体。
前体蛋白的氨基酸序列为：
His-Pro-Pro-Lys-Ser-Aso-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ser-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-
Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-
Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-
Thr-Leu-Ala-Me-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-
Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-
Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-
Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Gln-Pro-
Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-
Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-
Thr-Arg-Leu
具体方法如下：
1.表达：从转化好的工程菌平面上挑取3个单菌落，接种到50mL LB液体培养基中，37度，200转/分钟，12小时后，把50mL菌液转接入1升LB液体培养基中，37度，200转/分钟，3小时后，当OD600约等于0.8时，加入IPTG使其终浓度为1mM，3小时后离心收集菌体。
2.裂菌：收集的菌体按1∶5的比例加入裂菌缓冲液，20mM Tris，pH8，然后使用超声波法进行破菌，破菌后15000rpm/分钟进行离心20分钟，收集上清。
3.纯化：
a)凝胶过滤层析
采用Sephadex G25 Medium介质，平衡液采用20mM PB，pH7，收集蛋白峰。
b)阳离子交换层析
采用CM Sehparose Fast Flow层析介质，平衡液为20mM PB，pH7，上样并平衡后采用20mM PB，pH7，0.25M NaCl洗脱，收集蛋白洗脱峰。
c)酶切
采用凝血酶，比例为样品1mL∶8U，进行酶切，时间为2小时，温度为25度。
d)阳离子交换层析
酶切液用20mM PB，pH7缓冲液稀释3倍，上CM Sehparose Fast Flow层析介质，平衡液采用20mM PB，pH7，洗脱液采用20mM PB，pH7，0.25M NaCl洗脱，收集蛋白洗脱峰。
e)阴离子交换层析
上一步层析得到的洗脱液用20mM PB，pH7稀释3倍，上DEAE Sepharose Fast Flow层析介质，收集透过峰。即为白细胞介素11-NO5纯品。
4.检测
得到的白细胞介素11-NO5通过SDS-PAGE纯度检测和反相HPLC检测，纯度大于95％。
5.活性检测
得到的白细胞介素11-NO5采用MTT法，应用美国已上市的重组白细胞介素11(neumega)作为参照品，用B911细胞进行生物活性的测定，结果白细胞介素11-NO5的比活性为7.4×106U/mg。

Claims (6)

1.一种前体蛋白，其氨基酸序列为
His-Pro-Pro-Lys-Ser-Aso-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-X-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-
Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-
Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-
Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-
Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-
Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-
Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Y-Pro-
Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-
Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-
Thr-Arg-Leu
2.权利要求1中第15位的X代表氨基酸Val，Ala，Gly。
3.权利要求1中第139位的Y代表氨基酸Asp，Asn，Gln。
4.权利要求1中的前体蛋白以大肠杆菌或酵母为宿主菌用基因工程的方法进行表达。
5.权利要求1中的前体蛋白可独立表达、也可与其它肽段融合表达。
6.权利要求1中的前体蛋白通过凝血酶切割的工艺得到高活性的成熟蛋白。
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