CN1190493C - 可逆光致变色胆素蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可逆光致变色胆素蛋白的制备方法，通过基因工程表达光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白的脱辅基蛋白、相应的催化藻蓝胆素从藻蓝蛋白裂解的藻蓝蛋白裂合酶，然后应用此裂合酶或光敏色素类脱辅基蛋白催化藻蓝胆素从藻蓝蛋白及其亚基转移，并同时与胆素蛋白脱辅基蛋白体外重组，从而制备可逆光致变色胆素蛋白。本专利发明的方法中，整个反应过程不涉及使用有机溶剂和去污剂，只使用蛋白质与水溶液，是一种环境友好的绿色生产工艺。因此，此可逆光致变色胆素蛋白的制备方法更适合应用于食品、保健与医药功能领域中。
Description
技术领域
本发明属于生物技术中色素蛋白质材料领域，具体涉及一种可逆光致变色胆素蛋白的制备方法。
技术背景
胆素蛋白(biliprotein)类的光敏色素(phytochrome)是存在于植物中的功能色素蛋白质。根据其吸收光谱特征和生理功能，光敏色素可分为五类：光敏色素A、光敏色素B、光敏色素C、光敏色素D、光敏色素E。目前发现的细菌光敏色素(cyanobacterial phytochrome)主要有细菌光敏色素1(cyanobacterial phytochrome 1，简称Cph1)和细菌光敏色素A(cyanobacterial phytochrome A，简称AphA)等。胆色素(bilin)通过硫醚键与光敏色素脱辅基蛋白巯基共价结合，其种类及其与脱辅基蛋白的相互作用决定光敏色素的光谱性质。胆色素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象，使得光敏色素主要吸收650～750nm范围内的可见光。光敏色素结合的辅基色素主要为光敏胆色素(phytochromobilin，简称PΦB)。在藻蓝蛋白(phycocyanin，简称PC)，辅基色素为藻蓝胆素(phycocyanobilin，简称PCB)，它通过硫醚键与脱辅基蛋白84位的半胱氨酸巯基共价结合。
胆素蛋白具有广泛的应用前景。目前制备胆素蛋白的方法之一是从藻或植物中提取。另一种方法是应用有机溶剂，从藻类提取PCB，再利用光敏色素类胆素蛋白自身的裂合酶活性，与PCB进行重组而获得可逆光致变色的光敏色素类胆素蛋白(Lamparter，T.，Mittmann，F.，Gartner，W.，etal.，Characterization of recombinant phytochrome from thecyanobacterium synechocystis.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1997，94，11792-11797)。这种方法由于必须利用有机溶剂和去污剂，因此在食品、化妆品、医药领域的应用受到限制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能克服上述缺陷的可逆光致变色胆素蛋白的制备方法，该方法不使用有机溶剂和去污剂，而可在体外重组制备可逆光致变色胆素蛋白。
为实现上述发明目的：一种可逆光致变色胆素蛋白的制备方法，其步骤为：
(1)应用基因工程方法表达光敏色素类脱辅基蛋白；
(2)将步骤(1)得到的脱辅基蛋白与PC、α-PC或β-PC混合，按如下反应条件反应：反应温度20～45℃，pH值7.0～8.5；反应所需的辅助因子：①二价锰离子、镁离子或钙离子中的一种或几种，其总浓度为0.1～5mmol/L，和②巯基乙醇、二硫苏糖醇、还原型谷胱甘肽或其它巯基化合物中的一种或几种，其总浓度为0.1～10mmol/L。
上述步骤(2)还可以包括PcE/F，将其与脱辅基蛋白与PC、α-PC、或β-PC混合，所述PcE/F的制备方法为：
(1)采用基因工程方法，分别将pcE和pcF克隆于表达载体中，将此表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF；
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
在现有的可逆光致变色胆素蛋白光敏色素制备方法中，由于使用PCB这种胆色素小分子，所以需要使用有机溶剂和去污剂。本发明方法通过基因工程表达光敏色素类胆素蛋白的脱辅基蛋白、相应的催化PCB从PC或α-PC裂解开的PC裂合酶，然后应用此裂合酶催化PCB从PC或α-PC裂解，同时生成的PCB与胆素蛋白的脱辅基蛋白体外重组，从而制备光敏色素类的可逆光致变色胆素蛋白。或利用克隆表达的光敏色素类脱辅基蛋白自身的裂合酶作用直接从PC夺取PCB，制备可逆光致变色胆素蛋白。在此新方法中，不涉及使用任何有机溶剂。总之，本发明使用PC而不是PCB作反应物，应用克隆表达的PC裂合酶或光敏色素类脱辅基蛋白本身催化PC中的PCB转移，并与光敏色素类脱辅基蛋白重组，从而生成可逆光致变色的胆素蛋白。本发明方法中，整个反应过程不涉及使用有机溶剂和去污剂，只使用蛋白质与水溶液。因此，此种可逆光致变色胆素蛋白制备方法更适合应用于食品、保健与医药功能领域中。
可以应用吸收光谱检测以上方法制备的可逆光致变色胆素蛋白(见说明书附图)。
对于本专利所得到的光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白，当用650nm光辐射时，表现为700nm吸收增强；当用700nm光辐射时，表现为650nm吸收增强，即可逆光致变色范围650700nm。本发明方法中，整个反应过程不涉及使用有机溶剂和去污剂，只使用蛋白质与水溶液，是一种环境友好的绿色生产工艺。因此，此种可逆光致变色胆素蛋白制备方法更适合应用于食品、保健与医药功能领域中。
附图说明
图1为本发明制备的光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白的吸收光谱检测图。
具体实施方式
下面以实例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1：
(1)将GenBank中编号为AB028873的aphA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA。如此生产的AphA具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯AphA。
(2)将步骤(1)得到的脱辅基蛋白AphA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①5mmol/L的镁离子，②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例2：
(1)将GenBank中编号为AB028873的aphA克隆于Novagen公司的表达载体pGEMEX中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA。
(2)将步骤(1)得到的脱辅基蛋白AphA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①5mmol/L的镁离子，②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例3：
(1)将GenBank中编号为D64001的cph1克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产Cph1。如此生产的Cph1具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯Cph1。
(2)将步骤(1)得到的脱辅基蛋白Cph1与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①5mmol/L的镁离子，②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白Cph1。
实施例4：
(1)用PCR扩增GenBank中编号为AB028873的aphA之N端缺失25个氨基酸，C端缺失445氨基酸的AphA片段(简称AphA-N25-C445)，将AphA-N25-C445克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA-N25-C445。
(2)将步骤(1)得到的脱辅基蛋白AphA-N25-C445与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①5mmol/L的镁离子，②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA-N25-C445。
实施例5：
(1)将GenBank中编号为AB028873的aphA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA。
(2)将步骤(1)得到的脱辅基蛋白AphA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①0.1mmol/L的镁离子，②0.1mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例6：
(1)将GenBank中编号为AB028873的aphA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA。
(2)将步骤(1)得到的脱辅基蛋白AphA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的钙离子，②5mmol/L的还原型谷胱甘肽。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例7：
(1)将GenBank中编号为AB028873的aphA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA。
(2)将步骤(1)得到的脱辅基蛋白AphA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①5mmol/L的镁离子，②10mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例8：
(1)分别将GenBank中编号为AF506031的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。如此生产的pcE与pcF具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯PcE与PcF。
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)将GenBank中编号为AB028873的aphA基因克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产光敏色素类脱辅基蛋白AphA。如此生产的AphA具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯AphA。
(4)将步骤(2)得到的PcE/F、步骤(3)得到的脱辅基蛋白与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例9：
(1)分别将GenBank中编号为AF506031的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)将GenBank中编号为AB028873的aphA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA。
(4)将步骤(2)得到的PcE/F、步骤(3)得到的脱辅基蛋白AphA与α-PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值8.0；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例10：
(1)分别将GenBank中编号为AF506031的pcE、pcF克隆于Stratagene公司的表达载体pGEMEX中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)将GenBank中编号为AB028873的aphA克隆于Stratagene公司的表达载体pGEMEX中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA。
(4)将步骤(2)得到的PcE/F、步骤(3)得到的脱辅基蛋白AphA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例11：
(1)分别将GenBank中编号为AF506031的pcE、pcF克隆于Stratagene公司的表达载体pGEMEX中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)将GenBank中编号为AB028873的aphA克隆于Stratagene公司的表达载体pGEMEX中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA。
(4)将步骤(2)得到的PcE/F、步骤(3)得到的脱辅基蛋白AphA与α-PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值8.0；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例12：
(1)分别将GenBank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。如此生产的pcE与pcF具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯PcE与PcF。
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)将GenBank中编号为AB028873的aphA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA。如此生产的AphA具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯AphA。
(4)将步骤(2)得到的PcE/F、步骤(3)得到的脱辅基蛋白AphA与β-PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例13：
(1)分别将GenBank中编号为AF506031的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)用PCR扩增GenBank中编号为AB028873的aphA之N端缺失25个氨基酸的AphA片段(简称AphA-N25)，将AphA-N25克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA-N25。如此生产的AphA具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯AphA-N25。
(4)将步骤(2)得到的PcE/F、步骤(3)得到的脱辅基蛋白AphA-N25与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA-N25。
实施例14：
(1)分别将GenBank中编号为AF506031的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)用PCR扩增GenBank中编号为AB028873的aphA之C端缺失445个氨基酸的AphA片段(简称AphA-C445)，将AphA-C445克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA-C445。如此生产的AphA-C445具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯AphA-C445。
(4)将步骤(2)得到的PcE/F、步骤(3)得到的脱辅基蛋白AphA-C445与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA-C445。
实施例15：
(1)分别将GenBank中编号为AF506031的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)用PCR扩增GenBank中编号为AB028873的aphA之C端缺失275个氨基酸的AphA片段(简称AphA-C275)，将AphA-C275克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA-C275。如此生产的AphA-C275具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯AphA-C275。
(4)将步骤(2)得到的PcE/F、步骤(3)得到的脱辅基蛋白AphA-C275与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA-C275。
实施例16：
(1)分别将GenBank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)将GenBank中编号为AB028873的aphA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA。
(4)将步骤(2)得到的PcE/F、步骤(3)得到的脱辅基蛋白AphA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度20℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例17：
(1)分别将GenBank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)将GenBank中编号为AB028873的aphA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA。
(4)将步骤(2)得到的PcE/F、步骤(3)得到的脱辅基蛋白AphA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度45℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例18：
(1)分别将GenBank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)将GenBank中编号为AB028873的aphA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA。
(4)将步骤(2)得到的PcE/F、步骤(3)得到的脱辅基蛋白AphA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度35℃，pH值7.0；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例19：
(1)分别将GenBank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)将GenBank中编号为AB028873的aphA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA。
(4)将步骤(2)得到的PcE/F、步骤(3)得到的脱辅基蛋白AphA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值8.5；反应所需的辅助因子：①3mmol/L的二价锰离子，②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例20：
(1)分别将GenBank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)将GenBank中编号为AB028873的aphA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA。
(4)将步骤(2)得到的PcE/F、步骤(3)得到的脱辅基蛋白AphA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①5mmol/L的镁离子，②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例21：
(1)分别将GenBank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)将GenBank中编号为AB028873的aphA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA。
(4)将步骤(2)得到的PcE/F、步骤(3)得到的脱辅基蛋白AphA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①5mmol/L的二价钙离子，②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例22：
(1)分别将GenBank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)将GenBank中编号为AB028873的aphA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA。
(4)将步骤(2)得到的PcE/F、步骤(3)得到的脱辅基蛋白AphA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①0.1mmol/L的二价锰离子，②0.1mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例23：
(1)分别将GenBank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)将GenBank中编号为AB028873的aphA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA。
(4)将步骤(2)得到的PcE/F、步骤(3)得到的脱辅基蛋白AphA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①5mmol/L的二价锰离子，②10mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例24：
(1)分别将GenBank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)将GenBank中编号为AB028873的aphA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA。
(4)将步骤(2)得到的PcE/F、步骤(3)得到的脱辅基蛋白AphA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①5mmol/L的镁离子，②5mmol/L的二硫苏糖醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例25：
(1)分别将GenBank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)将GenBank中编号为AB028873的aphA克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产AphA。
(4)将步骤(2)得到的PcE/F、步骤(3)得到的脱辅基蛋白AphA与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①5mmol/L的镁离子，②5mmol/L的还原型谷胱甘肽。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白AphA。
实施例26：
(1)分别将GenBank中编号为AF178757的pcE、pcF克隆于Ncvagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF。如此生产的pcE与pcF具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯PcE与PcF。
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
(3)将GenBank中编号为D64001的cph1克隆于Novagen公司的表达载体pET30中，将此重组表达载体转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产Cph1。如此生产的Cph1具有6个组氨酸构成的亲和标记，因此，这里可以应用与该亲和标记匹配的金属离子螯合亲和层析柱分离提纯Cph1。
(4)将步骤(2)得到的PcE/F、步骤(3)得到的脱辅基蛋白Cph1与PC混合，按如下反应条件反应：反应温度37℃，pH值7.5；反应所需的辅助因子：①5mmol/L的镁离子，②5mmol/L的巯基乙醇。
反应得到光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白Cph1。
上述制备方法适用于采用各种pcE、pcF和光敏色素基因来制备光敏色素类可逆光致变色胆素蛋白，但涉及到微生物菌种公开的问题，本发明只选用了GenBank中已公开的微生物为例对本发明方法加以说明，本领域的一般技术人员可以根据上述公开的内容采用其它原料实施本发明。
Claims (2)
1.一种可逆光致变色胆素蛋白的制备方法，其步骤为：
(1)应用基因工程方法表达光敏色素类脱辅基蛋白；
(2)将步骤(1)得到的脱辅基蛋白与PC、α-PC或β-PC混合，按如下反应条件反应即可：反应温度20～45℃，pH值7.0～8.5；反应所需的辅助因子：①二价锰离子、镁离子或钙离子中的一种或几种，其总浓度为0.1～5mmol/L，和②巯基乙醇、二硫苏糖醇、还原型谷胱甘肽或其它巯基化合物中的一种或几种，其总浓度为0.1～10mmol/L。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：上述步骤(2)还可以包括PcE/F，将其与脱辅基蛋白与PC、α-PC、或β-PC混合，所述PcE/F的制备方法为：
(1)采用基因工程方法，分别将pcE和pcF克隆于表达载体中，将此表达载体分别转入大肠杆菌，从而得到相应的大肠杆菌工程菌，应用此工程菌生产PcE与PcF；
(2)将PcE与PcF混合，得到PC裂合酶PcE/F。
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