CN101061835A

CN101061835A - 低变态反应性蜂王浆的制造方法

Info

Publication number: CN101061835A
Application number: CNA2007100967062A
Authority: CN
Inventors: 山田英生; 菅野智子; 柳原美弥子; 桥本健; 松浦幸永; 冲原清司; 雪吉晃子
Original assignee: Yamada Bee Farm Corp
Current assignee: Yamada Bee Farm Corp
Priority date: 2006-04-06
Filing date: 2007-04-06
Publication date: 2007-10-31

Abstract

本发明涉及一种可以减低变态反应性的蜂王浆的制造方法，其特征在于，利用肽链内切酶作用和肽链外切酶作用，同时或依次对蜂王浆进行处理。

Description

低变态反应性蜂王浆的制造方法

技术领域

本发明涉及一种低变态反应性蜂王浆的制造方法。

背景技术

已知蜂王浆是有用的天然原材料，另一方面，有时引起变态反应。

作为低变态反应性蜂王浆，已知有：通过对蜂王浆施行糖酵解处理及蛋白分解酶处理，使变态反应性减低至基本上不能显示的程度的低变态反应性蜂王浆(参照特开2002-112715号公报)。在特开2005-287411号公报中，公开有使用中性肽链内切酶降低蜂王浆的变态反应性。但是，由于用这些方法进行过酶处理的蜂王浆依然具有变态反应性，故谋求进一步减低了变态反应性的蜂王浆。

特开2001-333794号公报记载有了用肽链内切酶和肽链外切酶两者对引起食物变态反应的蛋白质进行处理。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种低变态反应性蜂王浆的制造方法，该方法一方面抑制蜂王浆具有的有用的生理活性的降低，另一方面减低变态反应性。

为了完成上述目的反复进行了研究，结果发现：通过利用肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两方面作用对蜂王浆进行处理，意外地得到一方面维持蜂王浆的有用的生理活性，另一方面使变态反应性进一步减低的低变态反应性蜂王浆。

即，本发明是提供以下的低变态反应性蜂王浆的制造方法。

1.一种降低变态反应性的蜂王浆的制造方法，其特征在于，利用肽链内切酶作用和肽链外切酶作用，同时或依次对蜂王浆进行处理。

2.如1所述的方法，其特征在于，用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的至少1种酶，对蜂王浆进行处理。

3.如1所述的方法，其特征在于，用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的至少1种酶及肽链外切酶，同时或依次对蜂王浆进行处理。

4.如1所述的方法，其特征在于，用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的至少1种酶及肽链内切酶，同时或依次对蜂王浆进行处理。

发明效果

依据本发明，可以解决维持蜂王浆的有用性和减低变态反应性两者难以均衡的课题。

在对蛋白质进行肽酶处理时，如果同时使用肽链内切酶作用和肽链外切酶作用，则在肽链的内部和末端这两者被彻底切断。通常认为，在像专利文献3那样想要消除引起食物变态反应的蛋白质的抗原性时，即使用这种方法处理蛋白质也没问题，但如果对蜂王浆之类的有用物质同时使用肽链内切酶和肽链外切酶，则其生理活性会大幅度降低或消失。

但是，依据本发明，可以得到无法预料的结果：通过肽链内切酶作用和肽链外切酶作用的同时使用，不仅其抗原性可以降低，而且维持有用的生理活性。

即，如后述实验例所示，本发明的蜂王浆处理物具有发挥如下优良作用效果的特征：在看不出被称为主要生理活性成分的癸烯酸含量损失的基础上，显示出降压作用及抗抑郁作用，而且显著地抑制抗原性。

特别是用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的酶对蜂王浆进行处理后，再用肽链外切酶进行处理，可以得到抗原性进一步降低、有用的生理活性得以维持的蜂王浆处理物。

附图说明

图1：经酶处理的RJ游离组胺的试验结果

图2：经酶处理的RJ的抗抑郁作用评价

图3：经酶处理的RJ的ACE抑制作用的比较

具体实施方式

下面，将蜂王浆略记为“RJ”。

RJ是将蜜蜂中日龄3～12日的工蜂从下咽头腺及大颚腺分泌的分泌物混合而成的乳白色胶状物质。作为RJ中的主要生理活性成分，可以列举例如：以RJ中特有的10-羟基癸烯酸(下面，记载为癸烯酸)等为代表的有机酸类；蛋白质、脂质、糖类、维生素B类或叶酸、烟酸、泛酸等维生素类；各种矿物质类等。作为该RJ的生理活性及药理作用，已知有抗菌作用、增强免疫作用、抗抑郁作用、抗肿瘤作用、抗炎作用、促进血液循环作用等。另外，也有报告称有减低抗癌剂的副作用及放射线伤害时的延长寿命效果。

作为用于制造低变态反应性RJ的原料，可以使用生RJ或使用生RJ进行干燥、粉末化的RJ粉末。RJ的产地可以是日本、中国、巴西、欧洲各国、大洋洲各国、美国等任意一国。

在本发明中，利用肽链内切酶作用和肽链外切酶作用，同时或依次对RJ原料进行处理。

作为本发明中使用的肽链内切酶，只要是至少具有肽链内切酶活性的蛋白分解酶，任何物质都可以，可以广泛例示来源于动物(例如：胰蛋白酶、肝胰蛋白酶等)、来源于植物(例如木瓜蛋白酶等)或来源于微生物(例如乳酸菌、酵母、真菌、枯草杆菌、放线菌等)的肽链内切酶。

作为肽链外切酶，只要是至少具有肽链外切酶活性的蛋白分解酶都可以，可以例示羧基肽酶、氨基肽酶或来源于微生物(例如乳酸菌、曲霉属菌、根霉属菌)的肽链外切酶、或同时还具有肽链内切酶活性的胰酶、胃蛋白酶等。

肽酶包括实质上仅具有肽链外切酶作用的酶、实质上仅具有肽链内切酶作用的酶、具有肽链外切酶作用和肽链内切酶作用这两种作用的酶。其中，具有肽链外切酶作用和肽链内切酶作用这两种作用的酶当肽链内切酶作用较强时，可以作为“肽链内切外切酶”使用，而当其肽链外切酶活性强时，可以作为“肽链外切酶”使用，当肽链外切酶作用和肽链内切酶作用等同或几乎等同时，可以作为同时具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用的酶使用。

在这样的各种酶内，作为具有肽链外切酶活性和肽链内切酶活性这两者的酶优选的实例，可以列举：灰色链霉菌(Streptomyces griseus)产生的肽酶(商品名：アクチナ一ゼAS)、米曲霉(ASpergillus oryzae)产生的肽酶(商品名：プロテア一ゼA、フレ一バ一ザイム)、蜂蜜曲霉(ASpergillus melleus)产生的肽酶(商品名：プロテア一ゼP)，另外，作为具有肽链外切酶作用的酶优选的实例，可以列举：米曲霉(ASpergillusoryzae)产生的肽酶(商品名：ウマミザイムG、Promod 192P、Promod194P、スミチ一ムFLAP)、酱油曲霉(ASpergillus sojae)产生的肽酶(商品名：Sternzyme BP15024)、曲霉属产生的肽酶(商品名：コクラ一ゼP)、米根霉(Rhizopus oryzae)产生的肽酶(商品名：ペプチダ一ゼR)。而且，具有肽链内切酶作用的酶优选的实例，可以列举：枯草杆菌(Bacillussubtilis)产生的肽酶(商品名：ォリエンタ一ゼ22BF、ヌクレイシン)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)产生的肽酶(商品名：アルカラ一ゼ)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermopHilus)产生的肽酶(商品名：プロテア一ゼS)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)产生的肽酶(商品名：ニユ一トラ一ゼ)、杆菌属产生的肽酶(商品名：プロタメツクス)。

依据本发明的RJ原料的酶处理是将肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两者进行组合。作为其实施方式，例如如下方法：

(1)利用肽链内切酶作用处理后，利用肽链外切酶作用进行处理；

(2)利用肽链内切酶作用和肽链外切酶这两者的作用同时进行处理；

(3)利用肽链内切酶作用处理后，利用肽链内切酶和肽链外切酶这两者的作用进行处理；

(4)利用肽链内切酶作用和肽链外切酶这两者的作用处理后，利用肽链外切酶作用进行处理；

(5)利用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶这两者作用的酶和肽链内切酶这两者同时进行处理。

即，本发明中的酶处理可以以一阶段酶反应及二阶段酶反应中的任意一种实施，从低变态反应性效果及操作简便性方面来考虑，优选以一阶段酶反应实施。但是，在以2阶段进行酶处理时，在第1阶段用具有肽链内切酶作用的酶(可以进一步具有肽链外切酶作用)进行处理，在第2阶段用具有肽链外切酶作用的酶(可以进一步具有肽链内切酶作用)进行处理。当利用肽链内切酶和肽链外切酶这两者的作用进行的处理为第1阶段时，优选肽链内切酶作用足够强，当其为第2阶段时，优选肽链外切酶作用足够强。

肽链内切酶作用可以是一种酶的肽链内切酶作用，也可以是两种以上酶的肽链内切酶作用的总和。同样，肽链外切酶作用可以是一种酶的肽链外切酶作用，也可以是两种以上酶的肽链外切酶作用的总和。

需要说明的是，所谓“利用肽链内切酶作用和肽链外切酶的这两者的作用的处理”，包含同时使用肽链内切酶和肽链外切酶进行处理的情况和用含有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的一种酶进行处理的情况。

肽链内切酶/肽链外切酶的使用量，相对于RJ原料，因RJ原料浓度、酶效价、反应温度及反应时间而异，但一般来讲，通过添加单独或组合多个能充分分解RJ原料蛋白质的量的酶，进行水解。另外，酶的添加可以是一次性添加，也可以是少量多次添加。

进行肽酶处理的RJ原料的pH值，可以与使用酶的最佳pH相对应，从pH2～10的范围中选择。具体而言，在前述肽酶溶液中添加酶之前，根据使用酶的种类不同，实施在pH2～10的范围内通过添加酸或碱液、或缓冲剂以调整为所希望的pH。此时，酸可以例示盐酸、柠檬酸、磷酸等；碱液可以例示氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾等；缓冲剂可以例示磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等。

肽酶处理的温度没有特别限制，可以从包含显现酶作用的最佳温度范围的可供实用的范围，即通常在30～70℃的范围中选择。通过将温度维持在比肽酶的最佳温度高一些或低一些，例如50～60℃的范围，还可以防止在酶处理工序中的腐败。

肽酶处理的时间依赖于所用酶的种类以及组合、反应温度、pH等反应条件，没有特别限定。

通过将酶失活或除去来终止酶处理。可以通过加热处理(例如在80℃，15分钟等)进行失活操作。

实施例

下面，根据实施例更详细地说明本发明，但不用说本发明不限定于这些实施例。

实施例1

在500ml烧杯中量取生RJ200g，加入离子交换水100ml搅拌至均匀，配制成RJ稀释液。加入2N NaOH水溶液，将RJ稀释液的pH调整为8.7～8.9。然后，将在20ml离子交换水中溶解有具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的アクチナ一ゼAS(科研制药)2g、作为肽链外切酶的ウマミザイムG(天野エンザイム)1g的溶液加入到RJ稀释液中，再加入离子交换水，以使离子交换水的总量为200ml。将反应混合物一边用螺旋桨式搅拌器进行搅拌，一边在50℃(恒温水槽)下使其反应4小时进行水解。将恒温水槽的温度上升至80℃使酶失活后，进行水冷。

实施例2

取代アクチナ一ゼAS和ウマミザイムG，使用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的アクチナ一ゼAS(科研制药)作为酶，除此之外，与实施例1同样操作，得到RJ酶分解物。

实施例3

在50ml三角烧瓶中量取生RJ 3g，加入离子交换水1ml搅拌至均匀，配制成RJ稀释液。加入10N NaOH水溶液，将RJ稀释液的pH调整为7.8～8.0。然后，将具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的アクチナ一ゼAS(科研制药)30mg和同样具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的フレ一バ一ザイム(ノボザイムズ)15mg分别加入到RJ稀释液中，再加入离子交换水，使离子交换水的总量为3ml。将反应混合物一边在恒温水槽振荡，一边在40℃下使其反应16小时，进行水解。将恒温水槽的温度上升至80℃使酶失活后，进行水冷。

实施例4

使用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的アクチナ一ゼAS(科研制药)30mg、具有肽链内切酶作用的プロタメツクス(ノボザイムズ)30mg、以及具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的フレ一バ一ザイム(ノボザイムズ)30mg作为酶，除此之外，与实施例1同样操作，得到RJ酶分解物。

实施例5

取代アクチナ一ゼAS和フレ一バ一ザイム，使用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的プロテア一ゼP(天野エンザイム)作为酶，除此之外，与实施例3同样操作，得到RJ酶分解物。

实施例6

取代アクチナ一ゼAS和フレ一バ一ザイム，使用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的プロテア一ゼA(天野エンザイム)作为酶，除此之外，与实施例3同样操作，得到RJ酶分解物。

实施例7

取代アクチナ一ゼAS和フレ一バ一ザイム，使用具有肽链内切酶作用的ォリエンタ一ゼ22BF(エイチビイアイ)和具有肽链外切酶作用的ウマミザイムG(天野エンザイム)作为酶，除此之外，与实施例3同样操作，得到RJ酶分解物。

实施例8

使用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的アクチナ一ゼAS(科研制药)和同样具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的プロテア一ゼA(天野エンザイム)作为酶，除此之外，与实施例3同样操作，得到RJ酶分解物。

实施例9

使用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的アクチナ一ゼAS(科研制药)和具有肽链外切酶作用的SternzymeBP15024(SternEnzyme)作为酶，除此之外，与实施例3同样操作，得到RJ酶分解物。

实施例10

使用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的アクチナ一ゼAS(科研制药)和具有肽链内切酶作用的プロタメツクス(ノボザイムズ)作为酶，除此之外，与实施例3同样地操作，得到RJ酶分解物。

实施例11

使用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的アクチナ一ゼAS(科研制药)和具有肽链内切酶作用的ォリエンタ一ゼ22BF(エイチビイアイ)作为酶，除此之外，与实施例3同样操作，得到RJ酶分解物。

实施例12

使用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的フレ一バ一ザイム(ノボザイムズ)和具有肽链内切酶作用的アルカラ一ゼ(ノボザイムズ)作为酶，除此之外，与实施例3同样操作，得到RJ酶分解物。

实施例13

使用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的フレ一バ一ザイム(ノボザイムズ)和具有肽链内切酶作用的プロタメツクス(ノボザイムズ)作为酶，除此之外，与实施例3同样操作，得到RJ酶分解物。

实施例14

使用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的アクチナ一ゼAS(科研制药)、具有肽链内切酶作用的アルカラ一ゼ(ノボザイムズ)、以及具有肽链外切酶作用的Promod194P(Biocatalysts)作为酶，除此之外，与实施例1同样操作，得到RJ酶分解物。

实施例15

使用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的アクチナ一ゼAS(科研制药)、具有肽链内切酶作用的プロタメツクス(ノボザイムズ)、以及具有肽链外切酶作用的Promod192P(Biocatalysts)作为酶，除此之外，与实施例1同样操作，得到RJ酶分解物。

实施例16

使用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的アクチナ一ゼAS(科研制药)、具有肽链内切酶作用的プロタメツクス(ノボザイムズ)、以及具有肽链外切酶作用的Promod194P(Biocatalysts)作为酶，除此之外，与实施例1同样操作，得到RJ酶分解物。

实施例17

使用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的アクチナ一ゼAS(科研制药)、具有肽链内切酶作用的プロタメツクス(ノボザイムズ)，以及具有肽链外切酶作用的ウマミザイムG(天野エンザイム)作为酶，除此之外，与实施例1同样操作，得到RJ酶分解物。

实施例18

使用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的アクチナ一ゼAS(科研制药)、具有肽链内切酶作用的プロタメツクス(ノボザイムズ)，以及具有肽链内切酶作用的アルカラ一ゼ(ノボザイムズ)作为酶，除此之外，与实施例1同样操作，得到RJ酶分解物。

实施例19

使用具有肽链内切酶作用的ニユ一トラ一ゼ(ノボザイムズ)和具有肽链外切酶作用的コクラ一ゼP(三京ライフテツク)作为酶，除此之外，与实施例3同样操作，得到RJ酶分解物。

实施例20

使用具有肽链内切酶作用的ヌクレイシン(エイチビイアイ)和具有肽链外切酶作用的ペプチダ一ゼR(天野エンザイム)作为酶，除此之外，与实施例3同样操作，得到RJ酶分解物。

实施例21

使用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的アクチナ一ゼAS(科研制药)和具有肽链外切酶作用的スミチ一ムFLAP(新日本化学工業)作为酶，除此之外，与实施例3同样操作，得到RJ酶分解物。

比较例

使用作为肽链内切酶的プロテア一ゼN(天野エンザイム)和β-甘露糖苷酶(新日本化学工業社製スミチ一ムACH)作为酶，除此之外，与实施例1同样操作，得到RJ酶分解物。

实验例1

<对蜂王浆的肽酶处理物的抗原蛋白消失的确认>

对由实施例1～21得到的分解物进行免疫印迹，确认抗原蛋白质的消失。将各样本用3×样本缓冲液(187.5mMTris-盐酸pH6.8、6％SDS、75％甘油、0.03％溴酚蓝、1.5M 2-巯基乙醇)稀释3倍，在95℃下加热5分钟。然后，使用15％丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE。使用SDS-PAGE标准品，Low Range(BIO RAD社)作为分子量标记。将在凝胶上展开的蛋白质用半干燥式印迹装置转印在PVDF薄膜(BIO RAD社)上，浸入封闭缓冲液(2％脱脂奶粉、10mM Tris-盐酸pH7.5、100mM氯化钠、0.05％吐温(tween)20)中，在室温下振荡1小时。然后，将薄膜浸入用封闭缓冲液稀释的患者血清中，在4℃静置过夜。而且，浸入用封闭缓冲液稀释的抗人IgE抗体(KPL社)中，在37℃静置1小时。最后，使用ECLplus试剂盒(GEバイォサイエンス社)，将薄膜浸入按照附属的实验方案配制而成的发光液中，用ECL Mini-Camera(GEバイォサイエンス社)检测。

对试验过的全部样本，目测确认与患者血清发生反应的抗原蛋白质是否消失。

需要说明的是，对血清提供者发放记载有本试验内容的说明书，在充分说明了试验的旨意及内容的基础上，仅将根据本人意愿参加、签订意向同意书的人所得到的血清用于本试验。

实验例2

<游离组胺试验>

对未处理RJ、由实施例1～4、比较例得到的RJ酶分解物、变态反应原mix(阳性对照)、抗IgE受体抗体(阳性对照)，利用CAST法(cellularantigen stimulation test)测定游离的组胺量。

具体来讲，相对于生RJ，对经历过变态反应的某受试者的血液样本，使生RJ或该酶水解物或阳性对照发挥作用，测定游离的组胺量。对受试者发放记载有本试验内容的说明书，充分说明试验的旨意及内容，仅对根据受试者本人意愿参加、签订意向同意书的人进行了本试验。

使用市售的ELISA试剂盒(Histamine ELISA(由IMMUNO-BIOLOGICAL LABORATORIES社制造))进行游离组胺的测定。需要说明的是，变态反应原mix含有下述变态反应原。

变态反应原mix：鸭茅、宽叶牛毛草(ヒロハウシノケグサ)、黑麦草、梯牧草、肯塔基蓝草、绒毛草、黑麦、桦树、榛树、艾蒿、长叶车前草、链格孢、屋尘螨、粉尘螨、猫的毛皮、狗的毛皮、卵白蛋白、牛奶、鳕鱼、花生、大豆。

将结果示于表1及图1。

表1

经酶处理的RJ的游离组胺

		未处理的RJ	比较例处理的RJ	实施例2处理的RJ	实施例1处理的RJ
		未处理的RJ	比较例处理的RJ	实施例2处理的RJ	实施例1处理的RJ	EC₅₀(μg/ml)	受试者1	35.2	334		911
受试者2	19.3	234	362				受试者1	35.2	334		911
受试者2	19.3	234	362		平均		27.25	284	362	911
SD	11.24	70.7			平均		27.25	284	362	911
SD	11.24	70.7			EC₅₀比		1.0	10.4	13.3	33.4

表1及图1中的EC₅₀(50％有效浓度)是指使最大值的50％的组胺游离的试验物质的浓度。

由上述结果表明，通过同时使用肽链内切酶作用和肽链外切酶作用，能有效降低RJ的抗原性。

实验例3

<酶处理RJ的癸烯酸量>

对实施例1的样本，用使用有反相柱的HPLC进行癸烯酸量的测定。HPLC的条件为：柱，YMC-Pack ODS-AM(内径4.6mm、长150mm)；移动相，10mM磷酸缓冲液和甲醇的混合液(56∶44，pH2.6)；流速，1ml/分钟；检测波长，210nm。将结果示于表2。

表2

	酶处理0小时(未处理RJ)	酶处理2小时	酶处理4小时
	酶处理0小时(未处理RJ)	酶处理2小时	酶处理4小时	癸烯酸量(％)	4.37	3.78	4.08

没有看到经酶处理(实施例1)的癸烯酸量的降低。

实验例4

<酶处理RJ的抗抑郁作用评价>

为了确认未处理的RJ及由实施例2得到的RJ酶分解物的抗抑郁效果，测定小鼠恐怖条件诱发不动时间。

方法

在フエア一ドコンデイション計測装置(Acti Metrics社)中对小鼠施行电刺激负荷后，对试验检体给药7天。给药后，再放入フエア一ドコンデイシヨン計測装置中，在无电刺激的条件下测定4分钟的不动时间。将结果示于表3及图2。

表3

		介质对照(无电刺激)	介质对照	未处理RJ	实施例2处理RJ
		介质对照(无电刺激)	介质对照	未处理RJ	实施例2处理RJ	％不动状态(0～240sec)	mean	3.47	74.88	34.93	31.56
SD	3.41	11.38	29.34	26.45			mean	3.47	74.88	34.93	31.56
SD	3.41	11.38	29.34	26.45	只数		15	10	10	10

观察到介质对照组相对于介质对照(无电刺激)组，在0～240秒的所有时间中的不动时间的有意延长。另外，观察到未处理及实施例2处理RJ相对于介质对照组，有效缩短不动时间。而且，没有看到经酶处理后作用的降低。

实验例5

<经酶处理的RJ的ACE抑制>

对由实施例1、实施例2及比较例得到的RJ分解物测定ACE抑制作用。

○：试剂的配制

硼酸缓冲液(pH8.3)：200mM硼酸(H₃BO₃)、50mM四硼酸钠(Na₂B₄O₇)

基质溶解液：200mM硼酸(H₃BO₃)、50mM四硼酸钠(Na₂B₄O₇)、1M氯化钠(NaCl)

基质溶液：将Bz-Gly-His-Leu·H₂O(ペプチド研究所)溶解于基质溶解液，作成12.5mM。

酶溶液：将来源于兔肺的血管紧张素转换酶(Sigma)溶解于硼酸缓冲液，作成25mU/ml。

○：实验操作

在25μL试样溶液中加入酶溶液50μL进行搅拌，且在37℃下静置5分钟。进一步加入50μL基质溶液进行搅拌，且在37℃下静置1小时。在该溶液中加入0.5N盐酸溶液125μL进行搅拌，使反应停止，将由此而成的溶液作为试验液。另一方面，将试样溶液25μL、酶溶液50μL、0.5N盐酸溶液125μL混合，在37℃下静置5分钟后，加入50μL基质溶液进行搅拌，且在37℃下静置1小时，将由此而成的溶液作为空白溶液。然后，在试验液及空白溶液中分别加入750μL醋酸乙酯，使用涡流剧烈搅拌15秒后，进行离心分离(在室温、2,000rpm下10分钟)，分别分取上层液250μL(醋酸乙酯层)。利用减压加热干燥法完全除去醋酸乙酯后，将析出物溶解于1M氯化钠溶液500μL中。此外，使用对纯化水进行同样操作而成的液体取代试样溶液作为对照液。对这些液体用紫外可见吸光光度测定法测定波长为228nm下的吸光度。

○：ACE抑制率的计算

抑制率(％)＝100-100×(As-Abs)/(Ac-Abc)

Ac：加入水进行操作而成的液体取代试样溶液的吸光度

As：试样溶液的吸光度

Abc：加入水进行操作而成的液体的空白液取代试样溶液的吸光度

Abs：试样溶液的空白液的吸光度

将结果示于表4及图3。

表4

	实施例1处理RJ	实施例2处理RJ	比较例处理RJ
	实施例1处理RJ	实施例2处理RJ	比较例处理RJ	IC50(mg/ml)	0.876	0.810	1.29

可以看出实施例1及实施例2处理RJ比比较例处理RJ的ACE抑制作用高。

Claims

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的至少1种酶，对蜂王浆进行处理。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的至少1种酶及肽链外切酶，同时或依次对蜂王浆进行处理。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，用具有肽链内切酶作用和肽链外切酶作用这两种作用的至少1种酶及肽链内切酶，同时或依次对蜂王浆进行处理。