CN1198185A - 乳头瘤趾皮炎的检测、预防和治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及将蛇形菌(Serpens spp.)细菌或菌苗用于检测、预防和/或治疗反刍动物的乳头瘤趾皮炎的组合物如疫苗以及方法。本发明还提供了生物学上纯的蛇形菌菌株HBL－112以及生物学上纯的蛇形菌菌株HBL－112菌苗。

Description

乳头瘤趾皮炎的检测、预防和治疗
根据35 USC 119(e)(1)，本申请要求1996年8月1日申请的临时申请60/022,915的优先权。
发明领域
本发明涉及用于检测、预防和/或治疗反刍动物的乳头瘤趾皮炎的方法和组合物，还涉及用于该目的的新的蛇形菌(Serpens spp.)细菌株。
发明背景
乳头瘤趾皮炎(PDD)是一种牛蹄和/或下肢的慢性传染病，而且明显地是接触传染病。这种疾病有几种常见名称和科学名称，其中包括：趾皮炎、趾间乳头瘤病、趾乳头瘤病、疣状皮炎、足疣(footwart)、毛状足疣、毛状跟疣(heelwart)、树莓跟(raspberry heel)、草莓足病(strawberry foot disease)和草莓烂足病(footrot)。它已被确定是目前牛奶业面临的最主要疾病之一。这种疾病会导致变瘸，从而在经济上导致牛奶产量的大幅下降并伴随着动物健康的下降，如体重和生育力的下降。据信，这种物质是通过引入新家畜、或来自修蹄器、牛奶场测试仪器、兽医泥泞的靴子的formite传播等而被带到牛奶场的。在目前因疾病而受损失的牛奶场中，据估算牛奶产量、生产性损失和更高的淘汰率都造成的损失平均每天至少100美元。
目前为止，仅有两种控制方法是有效的：局部地施用(对每只足进行清洗、刮除和包扎)或肠胃外施用(因牛奶下降而有问题)抗生素，以及使用杀菌的足浴(抗生素、甲醛、碘等)。尽管许多损伤对于抗生素或含有杀菌化合物的足浴反应良好，但是已知会复发，而且某些证据表明导致了抗生素抗性。这些方法是费力的、易人为出错、昂贵(对于400头牛的牛奶场而言，30天足浴需要的抗生素为$2,500)、受到政府限制、而且既不能保持环境干净也不能最终防止复发。
考虑到乳头瘤趾皮炎所造成的巨大经济危害性，非常需要一种有效的检测和治疗受该疾病感染的动物，以及防止它们免受未来感染的手段。
发明概述
本发明涉及检测、预防和/或治疗反刍动物的乳头瘤趾皮炎的组合物和方法。
本发明现在提供了一种预防和/或治疗反刍动物乳头瘤趾皮炎的方法，它包括：给反刍动物施用治疗有效量的蛇形菌细菌或蛇形菌菌苗和/或其免疫活性成分和/或与蛇形菌交叉反应的抗原表位。
本发明还提供了一种预防和/或治疗反刍动物乳头瘤趾皮炎的药物组合物，它包括治疗有效量的蛇形菌细菌或蛇形菌菌苗和/或其免疫活性成分和/或与蛇形菌交叉反应的抗原表位，以及兽医学上可接受的稀释剂或载体。
本发明还提供了一种检测反刍动物血清样品中是否存在PDD抗体的方法，它包括将该样品与选自下组的抗原进行接触：蛇形菌属细菌或菌苗、或其免疫活性成分和/或与蛇形菌交叉反应的抗原表位，然后检测样品中与抗原结合的抗体。本发明还可用于确定PDD抗原或抗-蛇形菌抗体。
本发明还包括使用诊断试剂盒来检测PDD抗体的存在与否，其中该试剂盒含有抗原和一种或多种结合配对物(partner)。
本发明还提供了生物学上纯的蛇形菌菌株HBL-112，以及生物学上纯的蛇形菌菌株HBL-112菌苗。蛇形菌菌株HBL-112细菌保藏物No.1和蛇形菌菌株HBL-112菌苗保藏物No.2已被保藏在Hygieia Biological Laboratories，Post OfficeBox 8300，Woodland，California，95776。蛇形菌菌株HBL-112是蛇形菌属的一个成员，它具有下述的生物学和形态学特征。
菌株HBL-112细菌于1997年7月25日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，命名为“菌株HBL-112/1”并且保藏号为ATCC-202,005。菌株HBL-112细菌和菌株HBL-112/1细菌是相同的。在上下文和下面的实施例中，仅用名称“菌株HBL-112”来称本发明的蛇形菌细菌。
附图简述
结合附图阐述本发明，其中：
图1显示，与对照相比，根据本发明用蛇形菌菌株HBL-112菌苗进行疫苗接种时，观察到临床上已有足疣的奶牛中总足疣面积的下降。疣面积单位为平方厘米，它是根据临床上在病牛足上的损伤的两个方向上测得的毫米数计算而得的。时间为编入试验之后的天数。总时间为76天；
图2是在疫苗和对照中最初测量和接种后(第49天)测量得到的疣面积柱状图，其中相关Games-Howell post hoc分析表明了疫苗接种效果的显著性；图3是在随机抽取的约一半登记动物样本中，在疫苗和对照中最初测量和接种后(第49天)测量得到的血清效价的相互作用柱状图和Games-Howell分析；
图4a显示了捕获ELISA测定效价的阳性牛血清样本的典型标准曲线；
图4b显示了用恒量抗体和被测效价的抗原，得到的竞争性ELISA典型标准曲线；
图5为显微照片，它显示了蛇形菌，菌株HBL-112的可诱导的螺旋形式；
图6是与图5相同的蛇形菌菌株HBL-112纯培养物的显微镜照片，它显示了蛇形菌属的长杆、短杆和螺旋体；
图7是与图5相同的蛇形菌菌株HBL-112纯培养物的显微镜照片，它显示了与蛇形菌菌株HBL-112相关的鞭毛(flagella)；
图8显示了本发明的疫苗可用于预防毛状足疣；和
图9显示了在幼小母牛中本发明疫苗的血清反应。
发明详述
蛇形菌菌株HBL-112的分离和纯化
在本发明之前，蛇形菌属中唯一已知的种是屈挠蛇形菌，它是从富营养化的新鲜水塘中淤泥(污泥)上方数厘米部分中分离出的。屈挠蛇形菌是杆形细胞，宽约0.3-0.4微米，长8-12微米。它们单个或成对地出现。在生长静止期中的细胞是较长形的，而且常常具有泡(bleb)或球形凸起。屈挠蛇形菌具有很独特的灵活移动性。它们在两端具有多丛4-10根鞭毛构成的簇，而且还具有一些侧鞭毛。关于该有机体的出版文献中没有一篇指出有致病倾向，而且甚至没有提及与动物的相关性。
蛇形菌菌株HBL-112是由本发明人，从患PDD的牛疣组织中分离出的。将疣组织弄碎，过滤入液体培养基中，还直接接种到软琼脂平板上切好的孔中。在各种不同气氛中，如10％CO2(烛罐)、有氧的、厌氧的和微需氧(CampyPak)气氛中，于25-37℃的条件下，完成平行培养物的温育。菌株的最后纯化是通过在软琼脂(0.8％)和标准琼脂(1.5-2％)平板上的交替传代而实现的。
另一种分离蛇形菌菌株HBL-112的方法是，弄碎疣组织，将其置于软琼脂平板上的滤盘(0.45微米孔径)，然后在减氧条件下(烛罐)温育2-6小时。在短时间的温育之后将滤盘取出，这样可降低游动细胞(能够横穿滤盘但是不能穿过滤盘的细胞)造成污染的可能性。在琼脂平板中用较低琼脂浓度，可允许快速游动的螺旋体(和蛇形菌)移动穿越琼脂，远离移动性较差的细菌，从而得以纯化。重复地在通过过滤器/软琼脂进行的一系列传代，会形成纯化的细菌培养物，不论该细菌是螺旋体还是蛇形菌物种，如蛇形菌菌株HBL-112。
移动通过软琼脂的速度可用于区别螺旋体和蛇形菌。在非常软的琼脂(0.5％)中，屈挠蛇形菌移动4毫米/小时，并且在约12小时内(从中心)到达100毫米琼脂平板的边缘，而非常快的螺旋体仅移动0.5-0.8毫米/小时。在软琼脂(0.8％)中，屈挠蛇形菌移动2毫米/小时，而蛇形菌菌株HBL-112移动约1.5毫米/小时。
显微形态和移动性
对蛇形菌菌株HBL-112的光学显微镜观察揭示，有非常弱染色的革兰氏阴性杆，而常常是弯曲的，并常有0.5-5％细胞(可高到100％，这取决于培养基组成和生长条件)表现出刚性螺旋(图5)。如图6所示，蛇形菌，菌株HBL-112进行是高度多形的，可见的有3种主要形式：直的或弯的杆形、“蝌蚪”或球囊样结构、以及刚性螺旋。杆形可以有或没有刚性的螺旋区段，这些螺旋区段可被直区段所隔开。生长条件的改变，会诱导在“标准”条件下看到一种或另一种形式占更大比例。
对软琼脂块切割边缘处蛇形菌菌株HBL-112弯曲的和直的杆菌进行湿固定相差显微镜观察，揭示了对屈挠蛇形菌所报道的特有和独特的易弯曲性和蛇形运动性。杆菌(但不是蝌蚪或刚性螺旋形式)表现出蛇行泳动，在更高的粘度条件下蛇行和易弯曲性尤为明显。方向的反转是很快的，而且该生物体可沿其长轴中任一方向进行运动。刚性螺旋常常是非运动的。“蝌蚪”和囊形式表现出与真蝌蚪相似的游动/蠕动状运动。使用从标准琼脂平板上取得的湿固定载玻片时，新培养物的形态主要是杆状。较老的培养物表现出很不同的杆形式，以及粒状体和蝌蚪形式。
用“软”琼脂培养基时，通过切取一小块琼脂然后切片并置于载玻片上，来观察蛇形菌。观察到在琼脂中的以及与琼脂接触的蛇形菌，表现出蛇形运动。从琼脂上洗涤下的蛇形菌一般为杆形，尽管它们表现出弯曲性和螺旋状运动。
如图5所示，蛇形菌菌株HBL-112的刚性螺旋形式，在许多培养基中是很少存在的，但是在含有更高浓度硫化合物如半胱氨酸和硫代乙醇酸盐的培养基中，会变得更常见。当加入更高浓度的这些化合物时，该生物体可近乎100％地被转变成螺旋形。
透射电镜证实了三种主要的形态表型。用于鉴定有机体是否为螺旋体所必需的以及作为其特征的轴向丝状物(在细菌细胞附近、位于细胞膜内的鞭毛)不存在于屈挠蛇形菌中，也不存在于蛇形菌菌株HBL-112中。鞭毛端生于直形和弯曲形杆菌，并存在于有机体两侧(侧向鞭毛)；每一端(末端或稍前末端)的鞭毛数目约为2-4根，如图7所示。
生物化学
用下表1a和1b中所述的标准生化反应，对生物学上纯的屈挠蛇形菌和本发明蛇形菌菌株HBL-112进行定性研究。表1a为屈挠蛇形菌和本发明的蛇形菌菌株HBL-112，以及3种认为与蛇形菌属紧密相关的细菌属(根据Bergey′s Manual ofDeterminative Bacteriology(鉴定细菌学手册)，目前还未被分入某个细菌科)的生化反应数据。
表1b为屈挠蛇形菌、蛇形菌菌株HBL-112、CVDLS(California VeterinaryDiagnostic Laboratory System)提出的作为PDD可能致病物质的2种螺旋体株、以及与这2种CVDLS螺旋体株相关的更广泛螺旋体属样本的酶反应数据。“CVDLS分离株”事实上是用毛状足疣损伤分离出的7个螺旋体株，所有这些分离株都有相同的酶反应。CVDLS 1-9185 MED是第8个螺旋体株，它的酶谱不同于其他的CVDLS分离株。
                             表    1a  生化反应总结
    生化反应 HBL#112 ATCC29606    Pesudomonas Alcaligenes Vibrio蛇形菌   S.fiexibilis    spp．        spp． hollisae
ONPG精氨酸二水解酶赖氨酸脱羧酶鸟氨酸脱羧酶将柠檬酸盐作为唯一碳源硫化氢的产生脲水解色氨酸脱氨酶吲哚产生VP明胶水解发酵：葡萄糖甘露糖肌醇山梨糖醇鼠李糖蔗糖蜜二糖扁桃苷阿拉伯糖氧化酶；将硝酸盐还原成亚硝酸盐将亚硝酸盐还原成氮气运动性过氧化氢酶    -          -           -            -       --          -           -            -       --          -           -            -       --          -           -            -       --          -           -            -       --          -           -            -       --          -           -            -       --          -           -            -       --          -           -            -       +-          +           -            -       --          -           +            -       --          -           -            -       --          -           -            -       --          -           -            -       --          -           -            -       --          -           -            -       --          -           -            -       --          -           -            -       --          -           -            -       --          -           -            -       ++          +           +            +       ++          +           +            +       +-          +           -            -       -+          +           +            +       ++          +           N*          N       N
*N=未得到
表    1b酶反应的比较   HBL   AT   CVD   CVD   Borr-   Lepto-   Trepo-   Serp-   人   人分    CC   LS    LS    ella    spira     nema    ullna   肠    &离   菌株， 分  1-9185  spp.  Interr-     spp.    spp.   螺   鸟株，29606   离   MED    (6)    ogans     (口)            旋   螺菌    (1)   株   (1)            (12)      (1)     (8)    体   旋株          (7)                                          (2)  体#                                                            (4)112(1)*
-＝测不出酶反应.5＝＜5纳摩尔酶1＝5纳摩尔酶2＝10纳摩尔酶3＝20纳摩尔酶4＝30纳摩尔酶5＝40+纳摩尔酶+＝阳性，但未给出水平 相关的细菌品种
酶组
碱性磷酸酶酯酶(C4)酯酶脂酶(C8)脂酶(C14)亮氨酸芳基酰胺酶缬氨酸芳基酰胺酶半胱氨酸芳基酰胺酶胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶酸性磷酸酶綦酚-AS-BI-磷酸水解酶α-半乳糖苷酶β-半乳糖苷酶β-葡糖醛酸酶α-葡糖苷酸β-葡糖苷酸N-乙酰基-β-葡糖胺苷酶α-甘露糖苷酶α-果糖苷酶   .5    .5   +     +     .5-2    2-4      2        3-5     1   1-22     2   +     +    0-0.5     .5     .5        1-4     1   0-24     4   +     +       1     2-3    .5-1       1-4     1    21    .5   -     -       -     1-2      -         -      -    -3     4   -     -      2-4     .3      -         -      -    -.5    .5   -     -       -    .5-1      -         -      -    --    -    -     -       -    .5-1      -         -      -    --    -    -     +       -      -       -        0-2     -    --    -    -     +       -      -       -        0-5     -    -.5    .5   +     +      1-2     3      3-4       3-5     1   2-4.5     1   +     +     .5-1   .5-2      .5       0-2     -  0-.5-     -    -     -       -    .5-2      -        3-5     -  .5-3-     -    +     -       -      1       5         5      1    4-     -    +     -       -      -       5        3-4     -    --     -    -     -       -      1       -        2-5     -   .5-     -    -     -       -      1       -        3-5     -   .5-     -    +     -       -      -       4         -      -   .5-     -    -     -       -      -       -         -      -    --     -    -     -       -      -       1         -      -    -
*(#)＝#测试的分离株或菌株
如表1a所示，本发明的蛇形菌菌株HBL-112，用过氧化物测定有非常弱的过氧化氢酶阳性，用斑点氧化酶测试法(Difco Spot-test)测定为氧化酶阳性，并且在API 20E测试片(strips)(bioMerieux)上温育(35-36℃)48小时之后，得到下列反应结果：ONPG(邻-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷)阴性、精氨酸二水解酶阴性、赖氨酸脱羧酶阴性、鸟氨酸脱羧酶阴性、不利用柠檬酸盐、不从硫代硫酸盐产生硫化氢、脲酶阴性、色氨酸脱氨酶阴性、不从色氨酸产生吲哚、不从丙酮酸盐产生乙偶姻、不使明胶液化、以及不使任何的20E糖(葡萄糖、甘露糖、肌醇、山梨糖醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、扁桃苷、L+阿拉伯糖)发酵；它将硝酸盐还原成亚硝酸盐，但是不还原成氮气。
如表1a所示，蛇形菌菌株HBL-112与屈挠蛇形菌的截然不同之处在于，蛇形菌菌株HBL-112给出阴性Voges-Proskauer(VP)反应，而屈挠蛇形菌给出阳性反应。Voges-Proskauer测试法被用于确定细菌将丙酮酸盐转化为乙偶姻(一种中间的葡萄糖代谢产物)的能力。另一个明显差别是蛇形菌菌株H-BL-112能够迁移通过软琼脂(0.8％)平板。屈挠蛇形菌以约2毫米/小时进行迁移，而蛇形菌菌株HBL-112迁移速度约为其70-80％。屈挠蛇形菌更快的通过软琼脂的速度，与其在几种培养基(包括Mueller Hinton肉汤和TSBA平板)中更高的生长速度是相符的。
如表1b所示，在胰蛋白酶大豆琼脂血平板上或在OTI肉汤或Mueller Hinton肉汤中有氧生长48小时之后，并在35-36℃与API-ZYM(bioMerieux)测试片上的酶温育4小时后，蛇形菌菌株HBL-112给出下列反应结果：对碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶和缬氨酸芳基酰胺酶为弱阳性；对C4酯酶和C14脂酶为阳性；对C8酯酶-脂酶和亮氨酸芳基酰胺酶为强阳性。对该测试片上测试的其余11种酶为阴性。在相同生长条件下，屈挠蛇形菌产生相同结果。
生长参数
蛇形菌菌株HBL-112能够在固相标准胰蛋白酶大豆血琼脂(tryptic soy bloodagar，TSBA)、Mueller Hinton，以及巧克力琼脂(1.5-2％琼脂)或软BSK-H(0.8％琼脂平板)上，于有氧、厌氧、10％二氧化碳(烛罐)和微需氧(BBL Campypak或Campypak Plus)条件下生长。有更多氧气时，该生物体的迁移通过琼脂表面顶部的能力稍强。在这些气氛中，于TSBA和BSK-H琼脂上的生长可在25℃、30℃和35-36℃进行；然而温度范围还没有被完全确定。
在35-36℃，蛇形菌菌株HBL-112能够在悬浮于液体培养基中进行生长，如在改良的Eagle培养基(MEM)、Mueller Hinton肉汤和流体硫代乙醇酸盐(FTG)培养基中。添加2-5％(v/v)无菌供体马血清不影响在这些培养基中的生长。
蛇形菌菌株HBL-112能够在标准的微生物液体培养基中，于pH 6.8-9.4范围内生长，其中在pH约7.4时生长最佳。
如本文所用，所用“蛇形菌菌株HBL-112”指具有表1a和1b中所述的生化反应的蛇形菌菌株HBL-112。
本发明包括将蛇形菌菌株HBL-112、屈挠蛇形菌、或其他蛇形菌种细菌，和/或其免疫活性成分、和/或与蛇形菌种细菌的免疫活性成分基本上交叉反应的抗原表位，用于在反刍动物物种中激发针对PDD的保护性免疫应答，以预防和/或治疗PDD。
可以将含有细菌或菌苗的疫苗施用于具有PDD症状的动物，或者施用于没有该疾病症状的动物。
本发明提供了一种在反刍动物如牛、绵羊、和山羊等中，预防和/或治疗PDD的方法和组合物，其中包括有效量的蛇形菌细菌(活的或杀灭的)或其免疫活性成分，以及免疫学上合理的载体、佐剂、乳化基和/或稀释剂。合适的蛇形菌细菌是蛇形菌菌株HBL-112和屈挠蛇形菌细菌，较佳地是蛇形菌菌株HBL-112。杀灭的细菌可以常规制备，即在常规的微生物培养基上繁殖蛇形菌的纯培养物，用任何合适的已知方法杀灭细菌，然后对抗原物质进行标准化处理以形成合适的CFU/毫升当量。当需要活的疫苗时，可以省略杀灭步骤，但是其余的制备过程可如杀灭型悬浮物一样进行。当目的是制备疫苗时，合适的载体、佐剂、乳化剂和/或稀释剂可接着被加入到(活的或死的)细菌悬浮物中。
本发明用于预防和/或治疗PDD的组合物可用常规方式进行制备，即将杀灭的或活的蛇形菌细菌悬浮物或其免疫活性成分，与免疫学上合理的载体、佐剂、乳化基和/或稀释剂进行混合，如氢氧化铝或药物级矿物油和乳化剂。
较佳地，将本发明组合物通过皮下给药进行施用，尽管肠胃外给药或口服给药也可使用。口服组合物，可在饮用水或饲料中掺入蛇形菌细菌或其免疫活性成分或基本上与蛇形菌细菌免疫活性成分发生交叉反应的抗原表位。
尽管，出于职业判断并考虑到动物重量，在每例中所用的剂量和方案会加以调节，但是一般情况下对于5毫升皮下施用的剂型，剂量约为1×108-1×1011CFU/毫升，较佳地约为1×109-1×1010CFU/毫升。在某些情况下，可在更低的剂量上获得足够的治疗剂量，而在另一些情况下会需要更大的剂量。
尽管图1显示，在第0、8、和35天施用疫苗剂型，但是目前优选的是施用2-3个剂型，第一个在第0天，第二个剂型在3-4周后，而且当需要时，可在第二次给药之后3-4周施用第三个剂型。合适地，剂型含有相同数量的细菌或菌苗。
肠胃外给药可通过使用液态剂量单元形式而实现，如用于皮下注射或肌内注射的无菌溶液和悬浮液。它们可通过将一定数量制备的细菌悬浮物悬浮或溶解在适用于注射的无毒灭菌液态载体中，如无菌的水或油介质。或者，将一定数量的无菌细菌悬浮物置于无菌小管并密封，或者冻干并密封。可同时提供无菌小管或载体，以便在施用前进行混合。可加入无毒的盐类和盐溶液，以赋予注射等渗性。还可加入佐剂、稳定剂、防腐剂和乳化剂。
本发明提供了一种用常规的免疫分析方法进行PDD诊断和检测蛇形菌抗体或蛇形菌抗原的方法。来自临床上被感染或暴露但是未被疫苗接种的动物的血清，如果含有针对细菌的抗体，那么会与蛇形菌抗原进行反应。可对结合的抗体进行检测。因此，可将蛇形菌抗原用于诊断测试，以筛选需要优先暴露于药剂的未疫苗接种动物。类似地，这样的诊断测试还可被用于评估疫苗接种的动物对蛇形菌抗原的免疫状态。
相反，在用蛇形菌细菌疫苗接种过的动物中所制备和收获的抗体，可用于检测蛇形菌细菌。
一种在反刍动物组织样品中确定是否存在PDD抗原的方法，它包括将蛇形菌细菌或蛇形菌菌苗和/或其免疫活性成分和/或与蛇形菌交叉反应的抗原表位，施用于反刍动物，收获形成的抗体或收获产生抗体的细胞再从这些细胞中收获抗体，将抗体结合于结合配对物，以及直接或间接地测定结合反应。
蛇形菌抗原、或抗-蛇形菌抗体、或者它们的免疫活性成分，可用于一种工艺，这种工艺是被设计用于浓缩和纯化用作试剂的、具有推断性的结合配对物。
一种在反刍动物血清样品中检测PDD抗体是否存在的方法，它可适当地包括：将该样品与蛇形菌细菌、较佳地与蛇形菌菌株HBL-112接触，然后在该样品中测试结合与该抗原的抗体。一种通过在反刍动物血清样品中测定蛇形菌抗体的存在与否，而检测PDD、或曾暴露于蛇形菌细菌的方法，它可合适地包括：将样品与含有至少一种能够结合于蛇形菌抗体的结合配对物的溶液接触，然后直接或间接地确定样品中偶联的结合配对物的存在与否。
尽管本发明将血清样品和蛇形菌抗原用作各自的结合配对物，但是可使用特异性的结合反应来检测其中任一种配对物，因此其他样品如组织切片、细胞涂片及其部分，或者环境样品、蛇形菌本身或其部分都可用这种方法进行研究。
任一种结合配对物都可掺入一种或多种可检测的标记如放射性同位素、金属或荧光染料、或者被间接地检测，如在底物检测法中使用偶联的酶。
或者，在任何一种初级结合配对物都没有掺入可供直接检测的标记或其他物质的情况下，可形成次级结合配对关系以供随后检测，其中用蛇形菌组抗原或其互补抗体和/或抗-蛇形菌抗体，或者使用并不与蛇形菌相关但是可直接或间接地检测初级结合配对物的结合配对物(如亲和素-生物素)。
随后对上述标记物、结合配对关系或其他可测介质的检测和定量工作，可用方法学上任何合适的常规手段进行。
或者，在样品中检测蛇形菌，可通过直接或间接地测定蛇形菌独特的或特有的物理特征。这种测量手段包括检测和测量化合物、或化合物的混合物，其中包括脂类、蛋白质或核酸，如用于DNA扩增或鉴别技术、或色谱分离和鉴别技术如气相或液相色谱。
在本发明的另一发明，提供了一种用于进行本发明方法的诊断试剂盒，该试剂盒包括蛇形菌抗原和一种或多种结合配对物。该诊断试剂盒还可含有样品制备所需的试剂和任选的用于检测结合抗体的试剂。
结合下面实施例中的优选例子来阐述本发明。所有的温度是摄氏度，所有的份数和比例按重量计算，除非另外说明。
实施例1
制备全细胞的蛇形菌菌株HBL-112、屈挠蛇形菌或其他的蛇形菌菌苗(杀灭的培养物)，即在标准的微生物培养基上繁殖细菌细胞，用甲醛杀灭细胞，用无菌盐水洗涤以去除细胞碎屑、未使用的培养基组份、细菌废产物等，然后将菌苗悬浮在含10％(v/v)氢氧化铝(佐剂)和0.01％硫柳汞(防腐剂)的无菌磷酸盐缓冲液中。
实施例2
制备全细胞的蛇形菌菌株HBL-112或屈挠蛇形菌或其他的蛇形菌菌苗(杀灭的培养物)，即在标准的微生物培养基上繁殖细菌细胞，用甲醛杀灭细胞，用无菌盐水洗涤以去除细胞碎屑、未使用的培养基组份、细菌废产物等，然后将菌苗乳化在含25％(v/v)药物级矿物油和乳化剂(佐剂)和0.01％硫柳汞(防腐剂)的无菌磷酸盐缓冲液中。
实施例3
将非强毒的蛇形菌或其他具有交叉保护的蛇形菌样抗原的非致病细菌株，在标准条件下繁殖(例如：用数种常规微生物培养基中的一种，在pH 6.8-9.4，于25-37℃温度下，并在各种不同气氛中的某一种下，温育几天-几周)，然后用合适的测试方法，如显微形态和菌落形态、通过软琼脂的速度、在相差显微镜下特征性的运动、和/或生化测试等确定为纯培养物，然后收获。收获的细胞被洗涤，并悬浮在无菌载体(如盐缓冲液)(其中含有疫苗制备中典型使用的常规防冻剂)，装入无菌小管中，用冷冻或冻干法进行保存。保存的材料可被冻融或重新构成，以便按合适的剂量通过皮下、口服或肠胃外而施用于反刍动物。
实施例4
将总计76头具有活跃的、未处理过的PDD损伤的奶牛编入以治疗为基础的疫苗试验中。其中50头动物是第一产奶系列(最高产的牛)，26头为医院系列。因为来自医院的牛可能经过乳腺炎治疗，这可能会改变它们的免疫情况，所以仅第一系列的牛在血清学上被采集样本并继续。
在试验开始时，对所有的动物的跛瘸性和所涉及的腿数目进行评估；在跛瘸性/腿组别中，每头牛被随机指定接受试验的疫苗或安慰剂。在第一天以及此后每隔约2周时间，对每头动物的腿用来自软管端喷水器的中等压力淡水进行冲洗，然后评估PDD损伤的存在与否、疼痛性、数目和大小；在每次造访中，记录牛奶产量作为可能的协变量(covariate)加以评估，并获得妊娠状态、年龄、哺乳次数和牛奶天数等信息，以评估可能的协变量或混淆因素(confounder)。评估用“盲法”方式进行：牲口栏的牌子并不显示哪些动物是被接种过的，哪些是对照，并且被编入动物的数目排除了记住它们状态的可能性。
将0.5剂量的疫苗或安慰剂施用于每头动物。疫苗含有2×109CFU/毫升的蛇形菌菌株HBL-112菌苗，它被悬浮于含10％(v/v)氢氧化铝和0.01％硫柳汞的无菌磷酸盐缓冲液中。安慰剂不含有菌苗、细菌或细菌抗原，但是除此之外与疫苗相同。在第0、8、和35天将疫苗或安慰剂施用于每头在编的动物；最初两个剂量间紧密间隔是为了确定疫苗是否可用于治疗。在3-4周期间，在许多试验动物中看到了临床上的改善，如图1所示。临床上，在持续的改善过程中似乎有一“平稳段”，因此决定在试验的第5周施用“加强”剂量的疫苗。后来发现，部分平稳段是因为有永久性疤痕组织被错误性地作为疣组织进行评估。
对照组在第40天后出现改善的原因，是因为对疫苗接种的牛和对照牛进行了土霉素足浴。尽管对照组的改善可完全归结于土霉素足浴，但是在疣面积减小方面，疫苗组仍维持相对对照组有统计学上显著的优势。
有3头具有跛瘸特征的动物，在编入时没有损伤的证据。当它们在8周试验中没有患损伤时，将它们从试验的损伤分析部分中剔除。这些动物中的2头的确提供了一些有用信息：用蛇形菌菌株HBL-112作为抗原进行ELISA测试时，2头中没有一头是血清阳性，这暗示早先该生物没有暴露于表位。这些没有损伤的动物在ELISA中不识别蛇形菌菌株HBL-112，而具有损伤的非疫苗(对照)组却识别，这强烈暗示蛇形菌细菌与PDD损伤的致病形成有关。
图2和3显示了在抗生素足浴产生效果之前发生的效果；这样，在疫苗接种组中看到的临床效果(在对照中无此效果)可完全归结为使用了蛇形菌菌株HBL-112菌苗。此外，将柱状图中的数据限于仅在49天中观察到的结果，就没有充分反映出在第36天施用第3次疫苗制剂后的临床改善情况。
在试验期间，总计45头动物被放血3次以测定针对PDD的抗体。22头被进行血清监测的牛是用疫苗接种过的，其中包括2头没有疣的动物；23头动物是对照。如图3所示，所有具有疣的动物(疫苗接种组和对照组)，在最初(接种前)的ELISA测试中，都对蛇形菌菌株HBL-112呈血清阳性，这表明早已或同时接触过HBL疫苗株的相同表位或交叉反应的表位。图3还显示，当对照动物在试验期间内ELISA效价是下降的，接种组显示效价是上升的，这表明免疫促进了免疫应答。因为该效价的上升可在早在第一次接种(此时仅接种一次)后8天就可检测到，所以这强烈暗示，疫苗在接种组中促进了回忆应答，而不仅仅是促进初次应答(初次应答一般需要14-21天才能被检测到)。
总体而言，23头对照动物中20头构成的对照组的绝对效价值，与接种组相比，在试验开始时是较高的(尽管并不显著，.460对.441)，而且在试验期间维持不变或下降。表现出效价轻微上升的3头对照动物，是属于试验过程中具有损伤面积最大的动物；暴露于损伤中的物质可能导致了这种轻微的上升。在对疫苗接种作出的应答中，22头接种动物中的21头显示出相当大的效价上升(从.441增加到.560)；1头动物有小的效价增加。
下表2为因变量(dependent variables)疣面积和效价的III型平方和表，其中显示对疫苗接种的应答中，接种组和对照组之间有统计学上显著差异。尽管牛群作为一个整体表现出，在试验开始时和49天后之间损伤大小(疣面积)有显著改善(p值＝0.042)，但是最显著的效果归功于接种组：对于疫苗接种状态的前-后相关系，p值＝0.0155(＝组的)。在整个牛群中看到的试验开始时和49天之间的效价变化，完全归结于接种组中的观察的增加情况(对于组别的前-后p值是非常显著的，p值＝0.0001，而单独的前-后效应p值为0.2682)。
下表3，为一系列在疫苗试验分析中检测的因变量的接种前和接种后的平均值表。
在所有测量的因素中，只有总疣面积显示了在接种组和对照组之间有统计学上显著差异(@p＜0.05)。接种动物中明确没有发展成大损伤，而且它们仍有疣的时间也没有象对照组那么长。参见图1-3。
                                      表    2III型平方和来源                                df         平方和            平方的平均值               F-值             P-值
组        1        185.306        185.306        2.005        .1643
牛奶产量        1          5.012          5.012         .054        .8170
对象(组)       41       3789.260         92.421
前/后        1        114.663        114.663        4.474        .0420
前/后*组        1        166.998        166.998        6.516        .0155
前/后*牛奶产量        1        102.986        102.986        4.018        .0533
前/后*对象(组)       33        845.727         25.628
因变量：损伤区域III型平方和来源                                df          平方和           平方的平均值              F-值             P-值
组        1           .057           .057        1.774        .1902
牛奶产量        1           .001           .001         .037        .8492
对象(组)       41          1.310           .032
前/后        1           .004           .004        1.268        .2682
前/后*组        1           .099           .099       35.402        .0001
前/后*牛奶产量        1       8.995E-5       8.995E-5         .032        .8584
前/后*对象(组)       33           .092           .003
因变量：效价
                  表    3平均值表效果：前/后*组因变量：损伤面积
                                         计数                    平均值                  标准差                标准误差
      20       10.850        7.252       1.622
      23       11.504        6.614       1.379
      15       8.220        9.115       2.353
      22       15.345        9.005       1.920
前，疫苗前，对照后，疫苗后，对照平均值表效果：前/后*组因变量：损伤#
                                         计数                   平均值                  标准差                标准误差
      20       1.850       .988       .221
      23       2.087       1.276       .266
      15       2.333       1.397       .361
      22       3.000       1.574       .335
前，疫苗前，对照后，疫苗后，对照平均值表效果：前/后*组因变量：受感染的足
                                          计数                   平均值                 标准差               标准误差
      20       1.750       .967       .216
      23       1.783       .736       .153
      15       2.067       1.100       .284
      22       2.227       .813       .173
前，疫苗前，对照后，疫苗后，对照平均值表效果：  前/后*组因变量：跛瘸性
                                         计数                     平均值                 标准差                 标准误差
      20        1.400       .883         .197
      23        1.261       .810         .169
      15         .533       .516         .133
      22         .818       .733         .156
前，疫苗前，对照后，疫苗后，对照平均值表效果：前/后*组因变量：效价
                                         计数                    平均值                 标准差                标准误差
      20       .441       .134       .030
      23       .460       .123       .026
      15       .560       .173       .045
      22       .444       .130       .028
前，疫苗前，对照后，疫苗后，对照
实施例5
存在于疫苗蛇形菌菌株HBL-112菌苗中的相同抗原还被用于ELISA测试，以检测对接种的血清学应答。将浓缩的被杀灭和洗涤过的蛇形菌菌株HBL-112细菌全细胞在包被缓冲液(一种碳酸钠/碳酸氢钠缓冲液，pH 9.6)中的抗原悬浮液(约5×108细胞/毫升)，置于96孔微量滴定板的孔中，于室温下过夜。该滴定板用洗涤缓冲液(一种含有洗涤剂如Tween或Triton(pH 7.5)的磷酸钠缓冲液)轻柔地洗涤。加入牛血清样品(初级抗体)，并在板上于室温下温育1小时。再用洗涤缓冲液轻柔地洗涤滴定板，以去除未结合的抗体。加入偶联于碱性磷酸酶的抗-牛抗体构成的次级抗体(如来自羊的抗体)，在滴定板上于室温下温育1小时。再用洗涤缓冲液轻柔地洗涤滴定板。将板与10％二乙醇胺缓冲液(pH 9.8)中的磷酸对-硝基苯酯底物接触，然后在室温下显色直到最大的孔O.D.约为0.8-1.0，不加入终止剂。连于次级抗体上的碱性磷酸酶会转变磷酸对-硝基苯酯底物，从而使板上的无色溶液变成黄色。初级抗体、次级抗体的结合以及O.D.强度的读数，与牛血清中存在的、针对蛇形菌菌株HBL-112抗原的抗体数量是成比例的。
该方法对于ELISA而言基本上是标准的，而且预计任何其他ELISA法和该程序的许多种变化形式都会产生类似的结果。该程序与典型ELISA法的差别在于，温育步骤是在室温下进行。该操作的目的仅仅是为了减少因温度导致的边缘效应而产生的孔内变化。
来自未接种动物的血清会结合于蛇形菌菌株HBL-112细菌抗原，如果它含有针对细菌的抗体的话。
实施例6
经常需要施用多价(多抗原)疫苗制剂，以便减少必须给动物注射的次数。使用掺入了多抗原的单一药物制剂可减少动物的痛苦和感染危险(在注射部位发生脓肿)，并且对于业主和雇员而言可降低劳力成本和人受伤的危险(操作时受伤和/或偶然的自我注射)。
如实施例1和2所示的用于生产疫苗的相同抗原，还被用于与其他抗原组合使用，以产生多价疫苗，以便用于治疗和/或预防除PDD之外的反刍动物的其他细菌感染。蛇形菌疫苗日程表的灵活性，可允许几乎任何其他目前使用的反刍动物疫苗抗原与蛇形菌一起有利地掺入到疫苗中而同时施用。或者，蛇形菌抗原可被掺入到任何其他反刍动物的药物制剂(该制剂以除静脉内途径之外的任何方式给药)中。
例如，可将厌氧细菌(如类杆菌(Bacteroides)和/或梭形杆菌(Fusobacterium)属的细菌，它们是牛和羊中烂足病的致病物)与蛇形菌抗原一起掺入到药物制剂中，这样当施用于易感的反刍动物时可预防PDD和烂足病两种病。在另一例子中，在奶牛中预防PDD，可在不产奶的“非生产”期获得最佳的蛇形菌抗原接种，因为该疾病的爆发在哺乳开始后前几个月中达到高峰。因为许多其他疫苗是在该期间施用于奶牛以引起高母体抗体效价，以便通过初乳传给小牛，所以可有利地在该非生产期，将蛇形菌抗原与这些其他种类的疫苗一起施用于牛。
或者，已知某些其他抗原，当它们被掺入到主抗原疫苗中时，具有通用的免疫刺激特性，如在葡萄球菌(Staphylococcus)属成员中存在的“超抗原”或大肠菌类细菌的某些成员如大肠杆菌J-5株的“核心抗原”。在这种情况下，将任一种合适的免疫刺激抗原与蛇形菌菌株HBL-112或相关抗原掺合在一起，可形成具有更高免疫预防性能的疫苗。
实施例7
该研究采用双盲的、随机划组、前瞻性群组设计。已有PDD损伤的牛，根据跛瘸性评分和患病腿的数目，被分成2个相同的组。一组被随机地挑选出，用5.0毫升的疫苗进行接种，该疫苗含有3.3×108 CFU/毫升蛇形菌菌株HBL-112菌苗，其悬浮于含10％(v/v)氢氧化铝和0.01％硫柳汞的无菌磷酸盐缓冲液中。而给另一组施用5.0毫升剂量的与疫苗相同但不含菌苗的安慰剂。
对于每次测量，用水清洗牛的腿，由不知晓牛接种状态的人用毫米尺测量疣的二维面积。在研究开始后6个半月再次评估疣。文献报道，在对损伤进行包扎后7-12周，预计有60％以上的复发率。
下表4列出了与对照组相比，施用3个剂量的疫苗后的结果。当总疣面积是仅对有疣的动物而不是对整个组进行平均时，可以在下表4中看到，所有的34头接种动物在损伤大小的减小方面有改善，而仅13头对照动物因土霉素和林可辛足浴而治愈，从而显示出平均疣面积的减少。所有的接种动物对于综合疗法(疫苗和足浴)有反应，而2/3的对照动物对于仅用足浴没有改善。
          在用蛇形菌物种的菌苗接种后毛状足疣流行率下降
          疫苗     对照
日期    时间   损伤 #牛  流行率   平均疣数目 #牛  流行率    平均疣数目
Apr-96   0周    疣总计   34 100.0％        10.334   37 100.0％          10.237
Jun-96  10周    疣接种后  5周    无疣未见*总计   11  32.4％        4.622  64.7％1   2.9％34   23  63.9％          11.713  36.1％0   0.0％36
Sep-96  24周    疣接种后 19周后  无疣未见*出售总计    9  26.5％        6.519  55.9％5  14.7％1   2.9％34   16  44.4％          5.813  36.1％1   2.8％6  16.7％36
*干母中
平均而言，所有的接种动物在试验期间都改善了；而仅1/3对照动物在损伤大小的减小方面有改善。11头在10周试验结束时具有疣的接种动物中，有5头在6个月时进展到完全消退。在6个月的检查中，有3头接种动物出现了新的损伤，表明复发率仅10.7％(3/28)。对照组在6个月时还没有足够多的治愈动物来测定复发率。在6个月时，因使用林可辛足浴，在对照组中疣流行率已降至44.4％(16/37)，但是这一表面上的改善没有考虑5头动物因难以控制的足疣而被剔除的因素。
实施例8
根据年龄、对称性、DIM、产量和最近的DHIA测试数据中的SCC，将总计88头Holstein牛和未生育过的小母牛(heifer)分成相等的3组。每个组被随机地指定其接种状态(F1＝29头动物；F2＝29头动物；对照＝30头动物)。在F1和F2组中的动物以每月间隔接种5毫升疫苗，总计3个疫苗剂量。该疫苗含有7.9×108CFU/毫升蛇形菌菌株HBL-112菌苗，其悬浮于含10％(v/v)氢氧化铝和0.01％硫柳汞的无菌磷酸盐缓冲液中。对照组使用5.0毫升剂量的实施例7中使用的安慰剂。在试验开始时用肉眼观察而确定每个组中疣的流行率，然后每周用肉眼观察确定新病例的发病情况。
如图8所示，在14周期间内，相对对照组，两个接种组F1和F2都表现出对疣发展的保护效果。(组F1有3个新疣病例发生(3/24风险＝12.5％)，而组F2有2个新疣病例发生(2/23风险＝8.7％))。在相同时间内对照组有11个新疣病例(11/26风险＝42.3％)，这意味着，在14周内对照组得疣病的可能性比接种组高接近4倍。继续该试验，如图8所示，没有迹象表明在对照组中的新病例会停止，而接种组在接受了第三次剂量的疫苗之后没有新的病例。因此，图8表明，在整个牛群疫苗试验中，蛇形菌菌苗疫苗在防止新疣病例的发生方面是有效的。
实施例9
根据年龄、对称性、DIM、产量和最近的DHIA测试数据中的SCC，将总计88头Holstein牛和未生育过的小母牛(heifer)分成相等的3组。为每个组指定接种状态时随机进行的。在对照组中，总计有4头小母牛，在F1疫苗组中有5头，在F2疫苗组中有6头。动物以每月间隔接种5毫升实施例8中所用的疫苗，总计3个疫苗剂量。对照组使用5.0毫升剂量的实施例8中使用的安慰剂。对每头动物的全部4个血清样品，在同一时刻测定全细胞抗原ELISA效价，以减少滴定板间、操作者、和试剂的可变因素。通过与已建立的该抗原的标准曲线比较，得出效价。
图9显示了没有疣的新生小牛对疫苗接种的血清学应答，这时在3次施用菌苗中每一次后1个月进行评估的并与基线水平和对照动物比较。在第二次施用菌苗后出现了主效价上升；第三次施用剂型并不使效价增加很多。
所有3个组的基线值是不可区别的。对照动物的效价在研究期间维持在基线值。两个接种组因第一次施用菌苗而使效价平均上升3倍，随后在第二次施用后效价上升3-6倍。第三次施用菌苗所形成的效价上升可很小。

Claims (17)

1.一种生物学上纯的蛇形菌(Serpens spp.)菌株HBL-112。
2.一种预防和/或治疗反刍动物乳头瘤趾皮炎的药物组合物，其特征在于，它包括治疗有效量的蛇形菌细菌或蛇形菌菌苗和/或其免疫活性成分和/或与蛇形菌交叉反应的抗原表位，以及兽医学上可接受的稀释剂或载体。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，该反刍动物有乳头瘤趾皮炎症状。
4.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，该反刍动物没有乳头瘤趾皮炎症状。
5.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，含有蛇形菌菌株HBL-112或蛇形菌菌株HBL-112菌苗。
6.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，含有屈挠蛇形菌(Serpens flexibilis)或屈挠蛇形菌菌苗。
7.一种预防和/或治疗反刍动物乳头瘤趾皮炎的方法，其特征在于，它包括：给反刍动物施用治疗有效量的蛇形菌细菌或蛇形菌菌苗和/或其免疫活性成分和/或与蛇形菌交叉反应的抗原表位。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该反刍动物有乳头瘤趾皮炎症状。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，该反刍动物没有乳头瘤趾皮炎症状。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将蛇形菌菌株HBL-112或蛇形菌菌株HBL-112菌苗施用于该反刍动物。
11.如权利要求7所述的方法，其特征在于，将屈挠蛇形菌或屈挠蛇形菌菌苗施用于该反刍动物。
12.一种检测反刍动物血清样品中是否存在PDD抗体的方法，其特征在于，它包括将该样品与选自下组的抗原进行接触：蛇形菌属细菌或菌苗、或其免疫活性成分和/或与蛇形菌交叉反应的抗原表位；然后检测样品中与抗原结合的抗体。
13.一种检测反刍动物血清样品中是否存在PDD抗体的方法，其特征在于，它包括将该样品与含有至少一种结合配对物溶液进行接触，该结合配对物能结合于蛇形菌菌株HBL-112、或其免疫活性成分和/或与蛇形菌交叉反应的抗原表位；去除未结合的结合配对物；然后检测样品中是否有结合的结合配对物。
14.一种检测反刍动物是否存在抗-蛇形菌抗体的方法，其特征在于，它包括将蛇形菌抗原与反刍动物的血清样品接触，加入偶联有酶的抗-反刍动物抗体，然后加入底物，该底物会被该酶转变成易检测的产物。
15.一种检测反刍动物血清样品中是否存在PDD抗原的方法，其特征在于，它包括将该样品与选自蛇形菌属的抗体进行接触；然后检测样品中与该抗体结合的抗原。
16.一种用于权利要求14所述方法，以确定PDD抗体是否存在的的诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒含有抗原和一种或多种结合配对物。
17.如权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，还包括用于样品制备的试剂和用于检测结合抗体的试剂。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6241992B1 (en) * 1997-09-08 2001-06-05 University Technologies International, Inc. Bovine footrot treatment and prevention
US6667040B2 (en) 1997-09-08 2003-12-23 University Technologies International, Inc. Bovine footrot treatment and prevention
US6287575B1 (en) * 1997-10-03 2001-09-11 The Regents Of The University Of California Vaccine against papillomatous digital dermatitis (PDD)
US7097861B1 (en) 2003-02-07 2006-08-29 Jones-Hamilton Co. Method of treating livestock footbath solutions
US8703104B2 (en) * 2007-10-25 2014-04-22 Ecolab Usa Inc Use of metal astringents for the treatment of hairy heel warts
US8697753B1 (en) 2013-02-07 2014-04-15 Polichem Sa Method of treating onychomycosis
US10022458B2 (en) 2015-03-05 2018-07-17 Iowa State University Research Foundation, Inc. Animal model protocol, diagnostic, therapeutic and vaccine against digital dermatitis

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1175516A (en) * 1966-04-15 1969-12-23 Science Union & Cie New Phenyl-Aminopropane Derivatives and Preparations Containing them
US3673205A (en) * 1970-03-25 1972-06-27 American Cyanamid Co 6-(m-AMINO AND SUBSTITUTED-AMINO PHENYL)-2,3,5,6-TETRAHYDRO{8 2,1-b{9 THIAZOLES AND METHOD OF USE
US4029763A (en) 1974-08-05 1977-06-14 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Influenza vaccine containing purified neuraminidase antigen and method of using the same
DE2930706A1 (de) * 1979-07-28 1981-02-05 Medac Klinische Spezialpraep Verfahren zum nachweis von erregerspezifischen antikoerpern
JPS6067474A (ja) * 1983-09-24 1985-04-17 Wakamoto Pharmaceut Co Ltd 新規な１，３，４−チアジアゾ−ル誘導体及びそれを有効成分とする抗潰瘍剤
US4746613A (en) * 1984-03-02 1988-05-24 Wichmann Robert W Poultry diseases bacterin preparation
US4879213A (en) * 1986-12-05 1989-11-07 Scripps Clinic And Research Foundation Synthetic polypeptides and antibodies related to Epstein-Barr virus early antigen-diffuse
US5630379A (en) * 1996-02-12 1997-05-20 Ssi Corporation Electrically controlled spraying device for cleaning and treating animals
US6287575B1 (en) * 1997-10-03 2001-09-11 The Regents Of The University Of California Vaccine against papillomatous digital dermatitis (PDD)

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