ES2336285T3 - Deteccion, prevencion y tratamiento de dermatitis digital papilomatosa. - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE AL USO DE BACTERIAS O BACTERINAS SERPENS SPP. EN COMPOSICIONES, TALES COMO VACUNAS, Y METODOS PARA LA DETECCION, PREVENCION Y/O TRATAMIENTO DE LA DERMATITIS DIGITAL PAPILLOMATOSA EN RUMIANTES. LA PRESENTE INVENCION TAMBIEN PROPORCIONA SERPENS SPP. CEPA HBL-112 BIOLOGICAMENTE PURA, Y BACTERINA DE SERPENS SPP. CEPA HBL-112 BIOLOGICAMENTE PURA.
Description
Detección, prevención y tratamiento de
dermatitis digital papilomatosa.
La presente solicitud de patente reivindica
prioridad, de acuerdo con 35 USC 119(e)(1), de la solicitud
de patente provisional de EE.UU. 60/022.915, presentada el 1 de
agosto de 1996.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a métodos y
composiciones útiles en la detección, prevención y/o tratamiento de
la dermatitis digital papilomatosa en rumiantes y a una nueva cepa
de bacterias Serpens spp. útil para tal fin.
\vskip1.000000\baselineskip
La dermatitis digital papilomatosa
(abreviadamente PDD por la expresión inglesa Papillomatous
Digital Dermatitis) es una enfermedad crónica infecciosa y
aparentemente contagiosa de las patas y/o las partes inferiores de
las piernas de ganado. La enfermedad es conocida por varios nombres
comunes y científicos que incluyen dermatitis digital,
papilomatosis interdigital, papilomatosis digital, dermatitis
verrugosa, verrugas de las patas, verrugas pilosas de las patas,
verrugas pilosas de los talones, talón frambuesa, enfermedad de la
pata de fresa y podredumbre de la pata de fresa. Se ha identificado
como una de las enfermedades más significativas con las que tiene
que enfrentarse hoy día la industria láctea. La enfermedad da como
resultado cojera lo cual conduce a reducciones económicamente
significativas en la producción de leche y disminución consiguiente
de la salud animal, tal como pérdida de peso y de fertilidad. Se
cree que el agente causante puede ser llevado a una granja láctea
por introducción de ganado nuevo o transmisión fortuita desde
residuos de pezuñas, personal probador de lecherías, botas
enlodadas de veterinarios, etc. Actualmente en las granjas lechera
se producen pérdidas debidas a esta enfermedad, habiéndose estimado
el coste por producción de leche perdida, pérdidas reproductivas y
aumento de la selección de ganado en valores medios de al menos de
100 dólares por día.
Hasta la fecha, solo han demostrado ser
prometedores dos métodos de control, a saber: el uso de antibióticos
por vía tópica (limpieza, curado con raspado, y vendado de cada
pata) o por vía parenteral (problemática por razones relacionadas
con la retirada de la leche), y el uso de líquidos bacteriocidas
para baños de las patas (antibióticos, formaldehído, yodo, etc.).
Aunque muchas lesiones pueden responder bien a los antibióticos o a
los líquidos para baños de las patas que contienen compuestos
antibacterianos, se sabe que ocurren recidivas y hay pruebas de
desarrollo de resistencia a los antibióticos. Estos métodos son muy
laboriosos, propensos a errores humanos, costosos (los antibióticos
durante 30 días para los líquidos de baños de las patas cuestan
2.500 dólares para una granja láctea de 400 vacas), están sometidos
a restricciones gubernamentales, y no confieren ni limpieza
ambiental ni protección duradera frente a las recidivas.
En vista del daño económico significativo
causado por la PDD, es altamente deseable un modo eficaz de detectar
y tratar animales infectados con la enfermedad, así como medios de
protegerlos contra una infección futura.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a la detección,
prevención y/o tratamiento de la dermatitis digital papilomatosa en
rumiantes.
La presente invención comprende además un método
de determinar la presencia de anticuerpos contra la PDD en una
muestra de suero de rumiantes que comprende poner en contacto la
muestra con la cepa de Serpens spp. HBL-112
y detectar en la muestra anticuerpos que se unan al antígeno. La
presente invención también puede ser usada para determinar la
presencia de antígeno de la PDD o anticuerpos anti-Serpens
spp.
La presente invención proporciona la cepa de
Serpens spp. HBL-112 biológicamente pura. La
bacterina de la cepa de Serpens spp.
HBL-112, Depósito Nº 1 y la bacterina de la cepa de
Serpens spp. HBL-112, Depósito Nº 2 han sido
depositadas en Hygieia Biological Laboratories, Post Office Box
8300, Woodland, California, 95776. La cepa de Serpens spp.
HBL-112 es un miembro del género Serpens spp.
y tiene las características biológicas y morfológicas definidas más
adelante.
La bacteria de la cepa de
HBL-112 se depositó en The American Type Culture
Collection el día 25 de Julio de 1997 bajo la designación "cepa
HBL-112/1" y se le dio el número de acceso
ATCC-202.005. Las bacterias de la cepa
HBL-112 y las bacterias de la cepa
HBL-112/1 son idénticas. En el texto y los Ejemplos
que siguen sólo se usará la designación "cepa
HBL-112" para identificar la bacteria Serpens
ssp. de la invención.
La presente invención comprende el uso de la
cepa para la fabricación de un medicamento para prevenir y/o tratar
la dermatitis digital papilomatosa en rumiantes.
La presente invención se ilustra por los
siguientes dibujos, en los cuales:
La Figura 1 es un gráfico que muestra la
reducción clínica de la superficie total de las verrugas de la patas
vistas en ganado productor de leche con verrugas en las patas
preexistentes en respuesta a la vacunación usando bacterina de la
cepa de Serpens spp. HBL-112, de acuerdo con
la presente invención en comparación con un animal de control. La
superficie de las verrugas se da en centímetros cuadrados,
calculados a partir de medidas en milímetros realizadas en dos
dimensiones de las lesiones de las patas del ganado afectado
clínicamente. El tiempo se muestra en días desde el enrolamiento en
la prueba. El tiempo total transcurrido fue 76 días.
La Figura 2 es un diagrama de barras de
interacciones de las medidas de la superficie de las verrugas
iniciales y post-vacunación (en el día 49) en
animales vacunados y animales de control, con el análisis post
hoc de Games-Howell asociado que demuestra el
significado del efecto de la vacunación.
La Figura 3 es un diagrama de barras de
interacciones y un análisis de Games-Howell para los
títulos serológicos en una muestra aleatoria de aproximadamente la
mitad de los animales incluidos en la prueba por medidas iniciales
y post-vacunación (en el día 49) en animales
vacunados y de control.
La Figura 4a es un gráfico que muestra una curva
estándar típica de una muestra de suero bovino positiva titulada en
una captura ELISA.
La Figura 4b es una gráfica que muestra una
curva estándar de un ensayo ELISA competitivo que usa anticuerpo
constante y antígeno titulado.
La Figura 5 es una fotomicrografía que ilustra
la forma espiral inducible de la cepa de Serpens spp.
HBL-112.
La Figura 6 es una fotomicrografía del mismo
cultivo puro de la cepa de Serpens spp.
HBL-112 que el de la Figura 5 que muestra bacilos
grandes, bacilos pequeños y cuerpos esféricos típicos del género
Serpens.
La Figura 7 es una fotomicrografía del mismo
cultivo puro de la cepa de Serpens spp.
HBL-112 que la Figura 5 que muestra flagelos
asociados con la cepa de Serpens spp.
HBL-112.
La Figura 8 es un gráfico que muestra el uso de
la vacuna de la presente invención para la prevención de verrugas
pilosas en las patas de los animales; y
La Figura 9 muestra la respuesta serológica de
la vacuna de la presente invención en vaquillas sanas.
\vskip1.000000\baselineskip
Antes de la presente invención, la única especie
conocida del género Serpens era Serpens flexibilis
que se aisló de los centímetros superiores del sedimento (lodo)
encontrado en estanques de agua dulce eutróficos. S.
flexibilis son células en forma de bacilos, de
0,3-0,4 \mum de ancho por 8-12
\mum de largo. Se presentan solas o en parejas. Las células en la
fase de crecimiento estacionaria son mayores y frecuentemente
poseen vesículas o protuberancias esféricas. S. flexibilis
tiene un movimiento único flexible. Poseen penachos bipolares de
4-10 flagelos y también unos cuantos flagelos
laterales. Ninguna de la bibliografía publicada sobre este
microorganismo indica proclividad a patogénesis, ni incluso
asociación con animales.
La cepa de Serpens spp.
HBL-112 se aisló por los autores de la presente
invención de tejido de verrugas de ganado que sufría POD. El tejido
de las verrugas se picó y filtró en medios líquidos, así como por
inoculación directa en pocillos recortados en placas de agar
blando. La incubación de cultivos paralelos se consiguió a
25-37ºC bajo una variedad de atmósferas, tales como,
CO_{2} al 10% (tarro con vela), aerobias, anaerobias y
microaerófilas (CampyPak). La purificación final de la cepa se
consiguió por pase alternativo entre placas de agar blando (0,8%) y
agar estándar (1,5-2%).
Un método alternativo para aislar la cepa de
Serpens spp. HBL-112 es picar el tejido de
verrugas, colocarlo en un disco filtrante (tamaño de poros 0,45
\mum) en una placa de agar blando, e incubarlo durante
2-6 horas en condiciones pobres en oxígeno (tarro
con vela). Retirar el disco filtrante después de una corta
incubación reduce el riesgo de contaminación por enjambres capaces
de nadar de una parte a otra del disco pero no a través de él. Usar
una concentración disminuida en agar en la placa de agar permite
nadar rápidamente a las espiroquetas (y a Serpens spp.)
moviéndose a través del agar alejándose de las bacterias menos
móviles, llegando a ser purificado. Los pases secuenciales repetidos
a través del filtro/agar blando dan como resultado un cultivo
bacteriano purificado, si la bacteria es una espiroqueta o una
especie de Serpens, tal como la cepa de Serpens spp.
HBL-112.
\newpage
La velocidad de movimiento a través de agar
blando se puede usar para distinguir entre espiroquetas y Serpens
spp. En agar muy blando (0,5%) Serpens flexibilis se
mueve a 4 mm/hora, alcanzando el borde (desde el centro) de una
placa de agar de 100 mm en aproximadamente 12 horas, mientras que
las espiroquetas muy rápidas se mueven sólo a 0,5 a 0,8 mm/hora. En
agar blando (0,8%) S. flexibilis se mueve a 2 mm/hora,
mientras que la cepa de Serpens spp. HBL-112
se mueve a aproximadamente 1,5 mm/hora.
\vskip1.000000\baselineskip
La microscopía óptica de la cepa de Serpens
spp. HBL-112 revela un bacilo
gram-negativo que se tiñe pobremente,
frecuentemente curvado, con típicamente 0,5% a 5% de las células
(hasta 100% dependiendo de los constituyentes de los medios y de
las condiciones de crecimiento) que presentan espirales rígidas
(Figura 5). Como se muestra en la Figura 6, las bacterias de la
cepa de Serpens spp. HBL-112 son altamente
pleomorfas, viéndose tres formar principales: bacilos rectos o
curvados, "polliwogs" o estructuras similares a
vesículas esféricas revestidas con membrana, y espirales rígidas.
Los bacilos pueden tener o no tener secciones de espirales rígidas
interdispersadas con secciones rectas. Las variaciones en las
condiciones de crecimiento inducirán una mayor preponderancia de
una u otra forma vista en condiciones "estándares".
La microscopía con contraste de fases y montaje
en húmedo de la cepa de Serpens spp. HBL-112
curvada y bacilos rectos en el borde cortado de un bloque de agar
blando revela el doblamiento único característico y la motilidad
serpenteante descrita para Serpens flexibilis. Los bacilos, pero no
los polliwogs o formas espirales rígidas demuestran una
natación de tipo serpenteante, siendo el movimiento serpenteante y
la flexibilidad especialmente evidentes en condiciones de alta
viscosidad. La inversión de la dirección es rápida, con organismos
capaces de movimiento en cualquier dirección a lo largo de su eje
longitudinal. Las espirales rígidas frecuentemente aparecen como no
móviles. "Polliwogs" y las formas de vesículas
revestidas esféricas con membranas exhiben una motilidad de tipo
natación/retorcimiento similar a los verdaderos polliwogs.
Usando portaobjetos de montaje en húmedo tomados de placas de agar
estándares, la morfología de cultivos jóvenes es predominantemente
la de bacilos. Los cultivos más viejos exhiben diferentes formas de
bacilos, así como formas de cocos y polliwogs.
Con el medio de agar "blando", se observan
las Serpens spp. cortando un pequeño bloque de agar y
colocándolo cortado en cubitos en el portaobjetos. Las Serpens
spp. que se observan dentro del agar, o en contacto con él,
exhiben la motilidad serpenteante. Las Serpens spp. que son
arrastradas por lavado fuera del agar tienen generalmente forma de
bacilo, aunque exhiben doblamiento y una motilidad similar a
espirales.
Una forma de espiral rígida de la cepa de
Serpens spp. HBL-112, como se muestra en la
Figura 5, ocurre raramente en muchos medios, pero llega a ser más
frecuente en medios que contienen concentraciones mayores de
compuestos de azufre, tales como cisteína y tioglicolato. Cuando
estos compuestos se añaden en concentraciones incluso mayores, el
microorganismo puede ser convertido a una forma casi 100%
espiral.
La microscopía electrónica de transmisión
confirma los tres fenotipos morfológicos predominantes. Filamentos
axiales (flagelos que caen adyacentes a la célula bacteriana, dentro
de una membrana celular) característicos y esenciales para
identificar un microorganismo como una espiroqueta, no están
presentes en Serpens flexibilis ni en la cepa de Serpens
spp. HBL-112. Se ven flagelos unidos
terminalmente en algunos de los bacilos rectos y curvados, y
también a lo largo de los lados del organismo (flagelos laterales);
el número de flagelos en cada extremo (terminal o subterminal) se
espera que sea aproximadamente 2-4 como se muestra
en la Figura 7.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa de Serpens spp.
HBL-112 biológicamente pura de la presente invención
y Serpens flexibilis se caracterizaron por las reacciones
bioquímicas estándares descritas en las Tablas 1a 1b a continuación.
La Tabla 1a presenta datos sobre las reacciones bioquímicas de
Serpens flexibilis, la cepa de Serpens spp.
HBL-112, de la presente invención, así como tres
géneros bacterianos generales que se cree que están estrechamente
relacionados con el género Serpens, que actualmente siguen
sin estar asignados a una familia de baterías de acuerdo con el
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology.
La Tabla 1b presenta datos de las reacciones
enzimáticas de Serpens flexibilis, la cepa de Serpens
spp. HBL-112, dos cepas de espiroquetas
propuestas por CVDLS (California Veterinary Diagnostic Laboratory
System) como posibles agentes etiológicos para POD, y una
amplia muestra de géneros de espiroquetas relacionados con dos
espiroquetas de CVDLS. El "aislado de CVDLS" está constituido
realmente por siete cepas de espiroquetas aisladas junto con
lesiones de verrugas pilosas de las patas, que tienen todas las
mismas reacciones enzimáticas. CVDLS 1-9185 MED es
una octava cepa de espiroqueta que tiene un diferente perfil
enzimático que el de los otros aislados de CVDLS.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Los números entre paréntesis que figuran a
continuación de las diversas bacterias indican el número de aislados
o cepas ensayados.
Como se muestra en la Tabla 1a, la cepa de
Serpens spp. HBL-112 de la invención es muy
débilmente positiva a la catalasa por peróxido, positiva a la
oxidasa por ensayo de la mancha con oxidasa (ensayo Difco Spot), y
da las siguientes reacciones después de cuarenta y ocho horas
después de la incubación (a 35-36ºC) en tiras de
API 20E (BioMérieux): negativa para ONPG
(o-nitrofenil-\beta-D-galactopiranósido),
negativa para la arginina-dihidrolasa, negativa
para la lisina-descarboxilasa, negativa para la
ornitina-descarboxilasa, no usa citrato, no produce
sulfuro de hidrógeno a partir de tiosulfato, negativa para la
ureasa, negativa para triptófano-desaminasa, no
forma indol a partir de triptófano, no produce acetoína a partir de
piruvato, no licúa la gelatina, y no fermenta ninguno de los
azúcares 20E (glucosa, manitol, inositol, sorbitol, rhamnosa,
sacarosa, melibiosa, amigdalina, L+arabinosa); reduce el nitrato a
nitrito, pero no a nitrógeno gaseoso.
Como se ilustra en la Tabla 1a, la cepa de
Serpens spp. HBL-112 es distinta de S.
flexibilis porque da una reacción de
Voges-Proskauer (VP) negativa mientras que la S.
flexibilis_{,} da una reacción positiva. El ensayo de
Voges-Proskauer se usa para determinar la capacidad
de las bacterias para metabolizar piruvato a acetoína, un
metabolito intermedio de la glucosa. Otra diferencia clara es la
capacidad de la cepa de Serpens spp. HBL-112
de emigrar a través de placas de agar blando (0,8%). S.
flexibilis migra a aproximadamente 2 mm/hora, mientras que la
cepa de Serpens spp. HBL-112 migra
aproximadamente 70-80% de rápido. La velocidad más
rápida de S. flexibilis a través de agar blando es igualada
por su mayor velocidad de crecimiento en diversos medios incluyendo
tanto caldo de Mueller-Hinton como placas de
TSBA.
Como se muestra en la Tabla 1b, la cepa de
Serpens spp. HBL-112 da las siguientes
reacciones después de una incubación de una hora a
35-38ºC para las enzimas en la tira de ensayo
API-ZYM (BioMérieux) después de cuarenta y ocho
horas de crecimiento aerobio en placas de agar con sangre y soja
tríptica o en caldo OTI o caldo de Mueller Hinton: débilmente
positiva a la fosfatasa alcalina, fosfatasa ácida,
naftol-AS-BI-fosfohidrolasa,
y valina-arilamidasa; positiva a la esterasa C4 y
la lipasa C14; fuertemente positiva a la
esterasa-lipasa C8 y a la
leucina-arilamidasa. Las once enzimas restantes
ensayadas con esta tira fueron negativas. En las mismas condiciones
de crecimiento, Serpens flexibilis proporcionó idénticos
resultados.
La cepa de Serpens spp.
HBL-112, es capaz de crecer en placas de agar con
sangre y soja tríptica estándar (TSBA) en fase sólida, caldo de
Mueller Hinton, y agares de chocolate (agar al
1,5-2%) o agar blando BSK-H (agar
al 0,8%) en condiciones aerobias, anaerobias, con CO_{2} al 10%
(tarro con vela), y microaerófilas (BBL Campypak o Campypak Plus).
Con más oxígeno, el microorganismo tiene una capacidad ligeramente
mayor de migrar hacia la parte superior de la superficie del agar.
El crecimiento en agar TSBA y BSK-H en estas
atmósferas ocurre a 25ºC, 30ºC y 35-36ºC; sin
embargo el intervalo de temperatura no está completamente
definido.
La cepa de Serpens spp.
HBL-112 es capaz de crecer suspendida en medios
líquidos, en medios de Eagle modificados (MEM), caldo de Mueller
Hinton, y medios de tioglicolato fluido (FTG) a
35-36ºC. La adición de suero de caballo donador
estéril a 2-5% (v/v) no parece afectar al
crecimiento en estos medios.
La cepa de Serpens spp.
HBL-112 es capaz de crecer en medios líquidos
microbiológicos estándares en un intervalo de pH de 6,8 a 9,4, con
un crecimiento óptimo a aproximadamente pH 7,4.
Como se usa en la presente memoria, la
expresión, "cepa de Serpens spp.
HBL-112" significa bacterias de la cepa
Serpens spp. HBL-112 que tienen las
reacciones bioquímicas expuestas en las Tablas 1a y 1b.
La presente invención abarca el uso de la cepa
de Serpens spp. HBL-112, Serpens
flexibilis, o de otras bacterias de la especie Serpens, y/o una
porción inmunológicamente activa de la misma, y/o un epítopo
antigénico que tiene sustancialmente reacción cruzada con
una(s) porción(es) inmunológicamente activa(s)
de bacterias de la especie Serpens para provocar una
respuesta inmune protectora contra la PDD en especies de rumiantes
para la prevención y/o tratamiento de la PDD.
Una vacuna que contiene las bacterias o
bacterina (una suspensión de bacterias muertas o atenuadas para uso
como vacuna) se puede administrar a animales que tengan síntomas de
PDD, o se puede administrar a animales que no tengan signos de la
enfermedad.
La presente invención proporciona métodos y
composiciones para la prevención y/o tratamiento de PDD en
rumiantes, tales como especies de ganado bovino, ovino y caprino,
que comprende una cantidad eficaz de bacterias Serpens
(vivas o muertas) o una de sus porciones inmunológicamente activas y
un vehículo, adyuvante, emulsionante y/o diluyente
inmunológicamente activo para los mismos. Las bacterias Serpens
adecuadas son la cepa de Serpens spp.
HBL-112 y bacterias S. flexibilis,
preferiblemente la cepa de Serpens spp.
HBL-112. Las bacterias muertas se pueden preparar
convenientemente por propagación de un cultivo puro de Serpens
spp. en medios microbiológicos convencionales, matando las
bacterias por cualquier método adecuado, y estandarizando la masa
antigénica hasta un equivalente apropiado de UFC/ml. Cuando se
desean vacunas vivas, se omite la etapa de matar las bacterias,
pero el resto de la formulación transcurre como para la suspensión
de bacterias muertas. Cuando el objeto es preparar una vacuna, se
pueden añadir a la suspensión de bacterias (vivas o muertas)
vehículo(s), adyuvante(s), emulsionante(s),
y/o diluyente(s) aceptable(s).
La composición de la presente invención para la
prevención y/o tratamiento de la PDD se puede preparar de un modo
convencional mezclando la suspensión de bacterias muertas o vivas de
Serpens spp. o una de sus porciones inmunológicamente
activas con un adyuvante, emulsionante y/o diluyente,
inmunológicamente aceptable, tal como hidróxido de aluminio o un
aceite mineral o emulsionante de calidad farmacéutica.
Actualmente se prefiere administrar la
composición de la presente invención por administración subcutánea,
aunque también pude usarse administración parenteral u oral. Las
composiciones orales pueden incorporar las bacterias Serpens
spp. o una de sus porciones inmunológicamente activa o un
epítopo antigénico que tenga una reacción sustancialmente cruzada
con porción(es) inmunológicamente activas de bacterias
Serpens spp en agua de beber o
alimentos.
alimentos.
Aunque la dosificación y el régimen deben en
cada caso ajustarse, usando criterios profesionales y considerando
el peso del animal, generalmente la dosis será de aproximadamente
1x10^{8} a aproximadamente 1x10^{11} UFC/ml, preferiblemente
desde aproximadamente 1x10^{9} a aproximadamente 1x10^{10}
UFC/ml basadas en una dosis de 5 ml administrada subcutáneamente.
En algunos casos, puede obtenerse una dosis terapéutica suficiente
a una dosis inferior, mientras que en otros se requerirá una dosis
mayor.
Aunque la Figura 1 muestra dosis de vacuna
administradas en el día 0, el día 8 y el día 35, actualmente se
prefiere administrar dos a tres dosis, la primera en el día cero, la
segunda tres a cuatro semanas más tarde y cuando sea deseable puede
administrarse una tercera dosis alrededor de tres a cuatro semanas
después de la segunda dosis. Adecuadamente, las dosis contendrán la
misma cantidad de bacterias o de bacterina.
La administración parenteral se puede efectuar
utilizando formas farmacéuticas unitarias líquidas, tales como
soluciones estériles y suspensiones destinadas para inyección
subcutánea o intramuscular. Se preparan poniendo en suspensión o
disolviendo una cantidad medida de la suspensión bacteriana
preparada en un vehículo líquido, estéril, no tóxico adecuado para
inyección, tal como un medio acuoso estéril o un medio oleaginoso.
Alternativamente, se coloca una cantidad medida de la suspensión
bacteriana en un vial estéril y se cierra herméticamente, o se
liofiliza y se cierra herméticamente. Se puede proporcionar un vial
o vehículo estéril de acompañamiento para mezclamiento antes de la
administración. Se pueden añadir sales no tóxicas y soluciones
salinas para hacer a la inyección isotónica. También se pueden
añadir adyuvantes, estabilizadores, conservantes y
emulsionantes.
La presente invención proporciona un método para
la diagnosis de PDD y la detección de anticuerpos contra
Serpens o antígenos de Serpens usando métodos de
inmunoensayo convencionales. Los sueros de animales clínicamente
afectados o expuestos pero no vacunados reaccionan con el antígeno
de Serpens si contienen anticuerpos para la bacteria. Los
anticuerpos unidos pueden ser medidos. Por tanto el antígeno de
Serpens se puede usar en un ensayo de diagnóstico para el
escrutinio de animales no vacunados antes de la exposición al
agente. Similarmente, dicho ensayo de diagnóstico también puede
usarse para determinar el estado inmune de un animal vacunado con
respecto al antígeno de Serpens.
Inversamente, los anticuerpos producidos en, y
recogidos de, animales vacunados con bacterias Serpens se
puede utilizar para la detección de bacterias Serpens.
Un método para determinar la presencia de
antígeno PDD en una muestra de tejido de rumiante comprende
administrar bacterias Serpens spp. o bacterina de Serpens
spp, y/o una de sus porciones inmunológicamente activas y/o un
epítopo antigénico que tiene reacción cruzada con Serpens
spp. a un rumiante, recoger los anticuerpos resultantes o
recoger las células productoras de anticuerpos y subsiguientemente
recoger los anticuerpos de dichas células, unir los anticuerpos a
parejas de unión y medir directa o indirectamente la reacción de
unión.
Los antígenos de Serpens, o los
anticuerpos anti-Serpens, o fracciones inmunológicamente
activas de cualquiera de ellos, se pueden usar en un proceso
diseñado para la concentración o purificación de la pareja de unión
correspondiente para uso como un reactivo.
Un método para determinar la presencia de
anticuerpos para la PDD en una muestra de suero de rumiante puede
comprender adecuadamente poner en contacto la muestra con las
bacterias Serpens spp. preferiblemente la cepa de Serpens
spp, HBL-112, y detectar anticuerpos en dicha
muestra que se unen a dicho antígeno. Un método para detectar PDD o
exposición a sus bacterias Serpens, vía determinar la
presencia de anticuerpos Serpens en una muestra de suero de
rumiante puede comprender adecuadamente la incubación de la muestra
con una solución que contiene al menos una pareja de unión capaz de
unirse a los anticuerpos contra Serpens, y determinar
directamente o indirectamente la presencia de parejas de unión
conjugadas en la muestra.
La presente invención usa suero para las
muestras y antigeno de Serpens como la pareja de unión
respectiva, sin embargo la reacción de unión específica se puede
utilizar para detectar cualquier pareja; por tanto usando este
método se pueden estudiar otras muestras, tales como secciones de
tejidos, frotis de células y sus partes, o muestras ambientales,
Serpens per se o sus fracciones.
Cualquier pareja de unión puede incorporar uno o
más marcadores detectables, tales como radioisótopos, metal o
fluorocromo, o puede ser detectada indirectamente, como a través del
uso de una enzima conjugada con detección del sustrato.
Alternativamente, en casos en donde ninguna de
las parejas de unión primarias incorpora un marcador u otros medios
para la detección directa, los pares de unión secundarias se pueden
formar para la detección subsiguiente usando antígenos del grupo de
Serpens o sus anticuerpos complementarios y/o anticuerpos
anti-Serpens o a través del uso de
anticuerpos, o a través del uso de parejas de unión que no están
relacionadas con Serpens, (tales como
avidina-biotina) pero que pueden ser usadas directa
o indirectamente para la detección de las parejas de unión
primarias.
La detección y cuantificación subsiguiente de
los marcadores anteriores, pares de unión u otro medio medible
puede ser cualquier medio convencional apropiado para la
metodología.
Alternativamente, la detección de
Serpens, en una muestra se puede realizar por medio de
medidas directas o indirectas de características físicas distintas
de o características de Serpens. Tales medidas pueden
incluir detección y medidas de compuestos o mezclas de compuestos,
incluyendo lípidos, proteínas o ácidos nucleicos, tales como los
usados en técnicas de amplificación e identificación de DNA, o
técnicas de separación e identificación cromatográficas, tales como
cromatografía de líquidos y gases.
En un aspecto adicional de la invención, se
proporciona un kit de diagnóstico para uso en realizar el método de
acuerdo con la invención, comprendiendo dicho kit antígeno de
Serpens y uno o más parejas de unión. El kit de diagnóstico puede
incluir además reactivos requeridos para la preparación de la
muestra y opcionalmente reactivos para la detección del anticuerpo
unido.
La presente invención se ilustra en términos de
sus realizaciones preferidas en los ejemplos siguientes. Todas las
temperaturas están en grados centígrados y todas las partes y
proporciones están en peso, salvo que se indique otra cosa.
Se preparan bacterinas (cultivos muertos) de
células enteras de la cepa de Serpens spp
HBL-112, de Serpens flexibilis u otras
Serpens spp. por un método que comprende propagar las células
bacterianas en un medio microbiológico estándar, matar las células
con formaldehído; lavar con solución salina estéril para eliminar
los residuos celulares, los componentes del medio no usados, los
productos de desecho bacteriano y similares; y poner en suspensión
la bacterina en solución salina estéril tamponada con fosfato con
hidróxido de aluminio al 10% (v/v) (adyuvante) y timerosal al 0,01%
(conservante).
Se preparan bacterinas (cultivos muertos) de
células enteras de la Serpens spp. HBL-112 o
Serpens flexibilis u otra Serpens spp. por un método
que comprende propagar las células bacterianas en un medio
microbiológico estándar; matar las células con formaldehído; lavar
con solución salina estéril para eliminar los residuos celulares,
los componentes del medio no usados, los productos de desecho
bacteriano y similares; y emulsionar la bacterina en solución
salina tamponada con fosfato estéril con aceite mineral de calidad
farmacéutica y emulsionantes al 25% (v/v) (adyuvante) y timerosal
al 0,01% (conservante).
Una cepa de Serpens spp. no virulenta u
otra cepa bacteriana no patógena que lleva antígenos similares de
Serpens de protección cruzada se propaga en condiciones
estandarizadas (por ejemplo, usando uno de diversos medios
microbiológicos convencionales con un pH entre 6,8 y 9,4, se incuba
a una temperatura de aproximadamente 25-37ºC en una
de una variedad de atmósferas durante un periodo de unos cuantos
días hasta varias semanas) se estableció como cultivo puro por un
ensayo adecuado, tal como examen microscópico y morfológico de las
colonias, velocidad a través de agar blando, motilidad
característica bajo microscopía con contraste de fases, y/o ensayos
bioquímicos y luego se cosechó. Las células cosechadas se
suspendieron en un vehículo estéril (por ejemplo, solución salina
tamponada) que contenía un citoprotector convencional usado
típicamente en fabricación de vacunas, se cargó en viales estériles
y se conservó por congelación o por liofilización. El material
conservado se descongeló o reconstituyó para administración
subcutánea, oral o parenteral a rumiantes en las dosis
apropiadas.
Un total de 76 vacas lecheras con lesiones de
PDD activas y no tratadas se enrolaron en una prueba con vacunas
basada en tratamiento. Cincuenta animales procedían de la primera
cadena de ordeño (las vacas de producción más alta), y veintiséis
eran de la cadena hospitalaria. Puesto que las vacas hospitalizadas
estaban probablemente en tratamiento por mastitis, lo que podía
haber alterado su perfil inmunológico, solo se tomaron muestras de
suero y se vigilaron serológicamente las vacas de la primera
cadena.
\newpage
Todos los animales fueron puntuados según la
cojera y el número de patas implicadas al comienzo de la prueba;
dentro de los grupos cojera/pata, a cada vaca se le asignó recibir
aleatoriamente, durante la prueba, vacuna o placebo. En el primer
día y aproximadamente dos veces a la semana después cada una de las
patas de los animales fue limpiada con agua del grifo pulverizada
bajo una presión moderada con un pulverizador situado en el extremo
de una manguera y se evaluaron en cuanto a la presencia de lesión,
dolor agudo, número y tamaño de las lesiones de PDD; en cada visita
de se registró la producción de leche para evaluación como posible
variable correlacionada, e información sobre el estado de
gestación, edad, número de lactancias y días en los que se obtuvo la
leche para evaluar posibles variables correlacionadas o
confusiones. La puntuación se realizó de una forma "ciega":
las hojas del establo no mostraron que animales estaban vacunados y
cuáles eran los de control, y el número de animales enrolados en la
prueba impidió la memorización de su estatus.
A cada animal se administró una dosis de 5,0 ml
de vacuna o placebo. La vacuna contenía 2x10^{9} UFC por ml de
bacterina de la cepa de Serpens spp HBL-112
suspendida en solución salina tamponada con fosfato estéril con
hidróxido de aluminio al 10% (v/v) y timerosal al 0,01%. El placebo
no contenía bacterina, bacterias ni antígenos bacterianos, pero por
lo demás era idéntico a la vacuna. La vacuna o el placebo se
administraron a cada animal, enrolado en la prueba el día 0, el día
8, y el día 35; inicialmente, se buscó una secuencia espaciada
estrechamente de dos dosis para determinar si la vacuna podía o no
podía ser usada terapéuticamente. En el curso de tres o cuatro
semanas, se vieron mejoras clínicas en muchos de los animales de la
prueba como se muestra en la Figura 1. Clínicamente, pareció haber
una "meseta" en una mejoría continuada, de modo que se tomó la
decisión de administrar una dosis de "refuerzo" en la quinta
semana de la prueba. Parte de la meseta se encontró
subsiguientemente debido a la presencia de tejido cicatrizado
persistente el cual estaba siendo erróneamente puntuado como tejido
de verrugas.
La razón por la que el grupo de control empieza
a mostrar mejoría después del día 40 (Figura 1) fue debido a que a
las vacas vacunadas y a las de control se les administró el baño de
patas que contenía oxitetraciclina. Sin embargo, las vacas
vacunadas mantenían su ventaja estadísticamente significativa sobre
las vacas de control en reducción de la superficie de las verrugas
a pesar de la mejoría en las vacas de control atribuible solamente
al baño de patas que contenía oxitetraciclina.
Tres animales que mostraban signos de cojera no
mostraban signos de lesiones tras el enrolamiento. Cuando dichas
vacas no desarrollaron lesiones a las ocho semanas de comenzada la
prueba fueron apartadas de las porciones de análisis de lesiones de
la prueba. Dos de estos animales proporcionaron una información
útil: ninguno era serológicamente positivo en el ensayo ELISA
usando la cepa de Serpens spp. HBL-112 como
antígeno, lo que sugiere que no estuvieron expuestos previamente a
los epítopos de este organismo. Que estos animales no portadores de
lesiones no reconocieran la cepa de Serpens spp.
HBL-112 en un ensayo ELISA, mientras que si lo
hicieran los animales no vacunados (controles) portadores de
lesiones, sugiere claramente que una bacteria Serpens spp.
está implicada en la patogénesis de la lesión por PDD.
Las Figuras 2 y 3 muestran los efectos que
ocurren antes del efecto resultante del baño con antibiótico; los
efectos clínicos vistos en animales vacunados (y de los cuales
carecen los de control) son atribuibles por tanto exclusivamente al
uso de la bacterina de la cepa Serpens spp.
HBL-112. Además, limitar los datos en los diagramas
de barras a los resultados vistos solamente en el día 49 informa por
defecto de la mejoría clínica vista después de la tercera dosis de
vacuna administrada el día 36.
Un total de cuarenta y cinco animales fueron
sangrados tres veces durante la prueba para medir los anticuerpos
contra PDD. Se vacunaron veintidós vacas serológicamente
monitorizados, incluyendo dos animales que no tenían verrugas; los
animales de control fueron veintitrés. Como se muestra en la Figura
3, todos los animales que portaban verrugas (tanto vacunados como
de control) eran seropositivos a la cepa Serpens spp.
HBL-112 en el ensayo ELISA inicial (prevacunación),
lo que indica una exposición previa o simultánea a los mismos
epítopos o a epítopos de reacción cruzada con la cepa de la vacuna
de HBL. La Figura 3 ilustra además que mientras que los animales de
control presentaban en el ensayo ELISA un título disminuido en el
curso de la prueba, los animales vacunados mostraban aumentos de
título, lo que indica que la vacuna estaba promoviendo una
respuesta inmunológica. Puesto que este aumento de título era
detectable tan pronto como ocho días después de la primera (y
solamente en ese tiempo) vacunación, ello sugiere claramente que la
vacuna estaba provocando una respuesta de anamnesis (de
rememoración) en los animales vacunados, y no simplemente una
respuesta primaria (que típicamente requiere 14-21
días para llegar a ser detectable).
Generalmente, el valor absoluto del título fue
superior (aunque no significativamente: 0,460 frente a 0,441) entre
los animales de control comparado con los animales vacunados al
comienzo de la prueba, y se mantenía en el mismo valor o disminuía
en el curso de la prueba para veinte de los veintitrés animales de
control. Los tres animales de control que mostraban pequeños
aumentos del título estaban también entre aquellos que tenían la
superficie de lesión total más grande durante la prueba; la
exposición al agente en las lesiones daría cuenta del ligero
aumento. Veintiuno de los veintidós animales vacunados mostraron un
aumento bastante grande en el título (0,441 aumentó a 0,560) en
respuesta a la vacunación; un animal mostró una pequeña disminución
en el título.
La Tabla 2 siguiente presenta Sumas de Cuadrados
de tipo Ill para las variables dependientes superficie de la
verruga y título, mostrando diferencias estadísticamente
significativas entre animales vacunados y animales de control en
respuesta a la vacunación. Aunque la manada de vacas como conjunto
mejoró significativamente en lo que respecta al tamaño de la lesión
(superficie de las verrugas) entre el comienzo de la prueba y
después de 49 días (valor p = 0,0420), el efecto más significativo
se atribuye a los animales vacunados: valor p = 0,0155 por la
interacción de pre-post con el estatus de vacunación
(=grupo). El cambio de título observado en la manada como conjunto
entre el comienzo de la prueba y el día 49 solamente es atribuible a
los aumentos observados en los animales vacunados (el valor p para
pre-post por grupo es altamente significativo a un
valor p = 0,0001 frente a los efectos pre-post
solos a un valor p = 0,2682).
La Tabla 3 siguiente, presenta una serie tablas
de significado de pre-y
post-vacunación para las variables dependientes
examinadas en el análisis de la prueba con vacunas.
De los factores medidos, solamente la superficie
total de las verrugas muestra diferencias estadísticamente
significativas (@ p<0,05) entre los animales vacunados y los de
control. Los animales vacunados definitivamente no desarrollaron
lesiones grandes, ni permanecieron lesionados tanto tiempo como
ocurrió con los animales de control. Véase las Figuras
1-3.
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El mismo antígeno presente en la vacuna, la
bacterina de la cepa de Serpens spp. HBL-112
se usa también en un ensayo ELISA para monitorizar la respuesta
serológica a la vacunación. El antígeno (una suspensión al 5% de
bacterias muertas concentradas, con las células enteras lavadas de
la cepa Serpens spp. HBL-112,
aproximadamente 5x10^{8} células/ml, en un tampón de
revestimiento, un tampón de carbonato/bicarbonato de sodio a pH
9,6) se coloca en los pocillos de una placa de microtitulación de 96
pocillos durante una noche a temperatura ambiente. La placa se lava
moderadamente usando un tampón de lavado, (un tampón de fosfato de
sodio que contenía un detergente, tal como Tween o Triton (pH 7,5)).
Se añade una muestra de suero bovino (anticuerpo primario) y se
incuba en la placa a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa
se lava moderadamente otra vez usando tampón de lavado para
eliminar los anticuerpos no unidos. Un anticuerpo secundario hecho
de un anticuerpo anti-vaca, tal como de cabra,
conjugado con fosfatasa alcalina se incuba en la placa durante una
hora a temperatura ambiente. La placa se lava moderadamente usando
de nuevo tampón de lavado. Luego se incuba la placa con sustrato de
fosfato de p-nitrofenilo en un tampón de
dietanolamina al 10% (pH 9,8) y se deja desarrollar a temperatura
ambiente hasta que la densidad óptica (D.O,) máxima seas
aproximadamente 0,8 a 1,0, no usándose agentes de detención de la
reacción. La enzima fosfatasa alcalina unida al anticuerpo
secundario convierte al sustrato de fosfato de
p-nitrofenilo y vuelve transparente la disolución en
la placa amarilla. La unión del anticuerpo primario, anticuerpo
secundario y por tanto la concentración de la lectura de la D.O. es
proporcional a la cantidad de anticuerpo presente en el suero de la
vaca contra el antígeno de la cepa de Serpens spp.
HBL-112.
Este método es esencialmente estándar para
ELISA, y se esperaría que cualquier otro método ELISA y numerosas
variaciones de este método produzcan resultados similares. El método
difiere de los métodos ELISA típicos en las etapas de incubación se
realizan a temperatura ambiente. El fin de esto es solamente reducir
la variación intrapozos debida a los efectos de borde inducidos por
la temperatura.
Los sueros de animales no vacunados se unen al
antígeno bacteriano de la cepa de Serpens spp.
HBL-112 si contienen anti-cuerpos
para la bacteria.
Frecuentemente es deseable usar una preparación
de vacuna multivalente (antígeno múltiple) para minimizar el número
de veces que debe ser inyectado un animal. Usando una sola
preparación farmacéutica que incorpora múltiples antígenos se
minimiza el dolor y el riesgo de infección (abscesos en el sitio de
inyección) para el animal, y se disminuye los costes de trabajo y
el riesgo de daño a seres humanos (daños por manipulación y/o
auto-inyección accidental) para el propietario de la
granja y sus empleados.
El mismo antígeno usado solo para producir las
vacunas descrito en los Ejemplos 1 y 2 también se puede usar en
combinación con cualesquiera antígenos para producir un vacuna
multivalente útil para tratar y/o prevenir otras infecciones
bacterianas de rumiantes además de la PDD. La flexibilidad del
programa de vacunas de Serpens spp. permitiría virtualmente
que cualquier otro antígeno de vacuna para rumiantes corrientemente
usado sea incorporado ventajosamente con Serpens spp. en una
vacune para administración simultánea. Alternativamente, el
antígeno de Serpens spp. podría ser incorporado en cualquier
otra preparación farmacéutica para rumiantes administrada por
cualquier método distinto de la vía intravenosa.
Por ejemplo, las cepas de bacterias anaerobias
tales como los miembros de los géneros Bacteroides y/o
Fusobacterium que son los agentes causantes de la afección
conocida como pudrición de las patas (denominada footrot en
inglés) del ganado y ovejas pueden ser incorporada con antígenos de
Serpens spp. en una preparación farmacéutica que cuando se
administra a rumiantes susceptibles impedirá tanto la PDD como la
pudrición de las patas. En otro ejemplo, la prevención de la PDD en
vacas lecheras puede requerir óptimamente la vacunación con
antígenos de Serpens spp. durante el periodo "seco" sin
ordeño puesto que los brotes de la enfermedad parecen producirse al
máximo durante los primeros meses después de que empieza la
lactancia. Puesto que muchas otras vacunas se administran a las
vacas durante este periodo para provocar altos títulos de
anticuerpos maternos para la transmisión a los terneros vía el
calostro, el antígeno de Serpens spp. puede ser
ventajosamente administrado a las vacas con estos otros antígenos
de vacunas durante este periodo seco.
Alternativamente, se sabe que ciertos antígenos
tienen propiedades generales de estimulación del sistema inmune,
tales como el "superantígeno" presente en miembros del género
Staphylococcus o el "antígeno de núcleo" de ciertos
miembros de bacterias coliformes, tales como la cepa
J-5 de Escherichia coli, cuando se incorpora
en vacunas con el antígeno primario. En este caso, la incorporación
de cualquier antígeno estimulador del sistema inmune con la cepa de
Serpens spp. HBL-112 o antigeno(s)
relacionado(s), da como resultados una vacuna con
propiedades inmunoprofilácticas mejoradas.
El estudio utilizó un diseño de cohortes
prospectivo aleatorizado y doble ciego. Las vacas con lesiones de
PDD existentes se dividieron en dos grupos iguales sobre la base de
la cojera y el número de patas afectadas. Al azar se eligió un
grupo para ser vacunado con tres dosis de 5,0 ml de una vacuna que
contenía 3,3 x 10^{8} UFC por ml de bacterina de la cepa
de Serpens spp. HBL-112 suspendida en
solución salina tamponada con fosfato estéril con hidróxido de
aluminio al 10% (V/V) y timerosal al 0,01% y al otro grupo se le
administró una dosis de 0,5 ml de un placebo idéntico a la vacuna
pero que no contenía la bacterina.
Para cada medida las patas de las vacas fueron
limpiadas con agua y se midió la superficie bidimensional de las
verrugas con una regla divida en milímetros por personas que
desconocían el estatus de vacunación de cada vaca. La
re-evaluación de las verrugas se realizó seis meses
y medios después de iniciar el estudio. Los informes de la
bibliografía indican una tasa de recidivas esperada de 60% incluso a
las siete a doce semanas después de vendar las lesiones.
La Tabla 4 siguiente recoge los resultados del
uso de las tres dosis de la vacuna en comparación con los animales
de control. Cuando la superficie total de las verrugas es promediada
sobre la de los animales que solo llevan verruga en lugar de sobre
el grupo en su conjunto, puede verse en la Tabla 4 siguiente que
todos los treinta y cuatro animales vacunados mejoraron en términos
de disminución del tamaño de la lesión, mientras que solamente los
13 animales de control que sanaron mostraban disminuciones en la
superficie media de las verrugas en respuesta a los tratamientos
con baños para patas de oxitetraciclina y lincocina. Todos los
animales vacunados respondieron a la terapia de combinación (vacuna
con baño para patas), mientras que dos tercios de los animales de
control no mejoraron con solamente el baño para patas.
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Por término medio, todos los animales vacunados
mejoraron en el curso de la prueba; solo un tercio de los animales
de control mejoró en términos de disminuir el tamaño de las
lesiones. De los once animales vacunados que tenían verrugas al
final de la décima semana de la prueba, cinco habían progresado
hasta la curación completa en seis meses. En una comprobación el
sexto mes, tres animales vacunados habían desarrollado nuevas
lesiones lo que indica una tasa de recidiva de sólo 10,7% (3/28).
Los animales de control en el sexto mes tenían heridas
insuficientemente curadas para medir una tasa de recidiva. En el
sexto mes, la prevalencia de verrugas entre los animales de control
había disminuido a 44,4% (16/37) usando baños para patas con
lincocina, sin embargo, la aparente mejoría no tiene en cuenta que
cinco animales seleccionados tuvieron verrugas intratables de las
patas.
Un total de 88 vacas y vaquillas Holstein se
dividieron en tres grupos iguales basados en la edad, paridad, días
que producen leche (abreviadamente DIM por la expresión inglesa
days in milk), producción, y recuento de células somáticas
(abreviadamente SCC por la expresión inglesa Somatic Cell
Counts) a partir de los datos de ensayo más recientes de la
Asociación para la Mejora de los Rebaños Lácteos (abreviadamente
DHIA por la expresión inglesa Dairy Herd Improvement
Association). A cada grupo se le asigno un estatus de
vacunación (F1 = 29 animales; F2 = 29 animales; animales de control
= 30 animales) aleatoriamente. Los animales de los grupos F1 y F2
se vacunaron a intervalos de un mes con 5,0 ml de una vacuna que
contenía 7,9 x 10^{8} UFC por ml de bacterina de la cepa de
Serpens ssp. HBL-112 suspendida en solución
salina tamponada con fosfato y estéril con hidróxido de aluminio al
10% (V/V) y timerosal al 0,1% para un total de tres dosis de
vacuna. Con los animales de control se usaron dosis de 5,0 ml del
placebo empleado en el Ejemplo 7. La prevalencia de las verrugas en
cada grupo se determinó por inspección visual al comienzo de la
prueba, y la incidencia de nuevos casos se determinó por inspección
visual a intervalos de una semana.
Como se muestra en la Figure 8, ambos grupos F1
y F2 vacunados exhibieron efectos protectores contra el desarrollo
de verrugas en un periodo de catorce semanas comparados con los
controles. (El grupo F1 tuvo una incidencia de 3 nuevos casos de
verrugas (3/24 con un riesgo = 12,5%), mientras que el grupo F2 tuvo
una incidencia de 2 nuevos caso de verrugas (2/23 con un riesgo =
8,7%). En el mismo periodo de tiempo, la incidencia en los animales
de control fue 11 nuevos casos de verrugas (11/26 con un riesgo de =
42,3%), lo que significa que era casi cuatro veces más probable que
desarrollaran verrugas los animales de control que los animales
vacunados en catorce semanas. Esta prueba se continuó y como
muestra la Figure 8, ya no hay signos de que cesaran los nuevos
casos de verrugas en los animales de control, mientras que en los
animales vacunados no hubo desarrollo de nuevos casos desde que
recibieron la tercera dosis de la vacuna. La Figura 8 muestra por
tanto la eficacia de la vacuna de bacterina de Serpens spp
en prevenir el desarrollo de nuevos casos de verrugas en una prueba
con vacunas en un rebaño completo.
Un total de 88 vacas y vaquillas Holstein se
dividieron en tres grupos equivalentes basados en la edad, paridad,
DIM, producción y SCC a partir de los datos de ensayo más recientes
de DHIA. La asignación del estatus de vacunación a cada grupo se
realizó aleatoriamente. Hubo un total de cuatro vaquillas en el
grupo de control, cinco en el grupo de vacunadas F1, y seis en el
grupo de vacunadas F2. Los animales se vacunaron a intervalos de un
mes con dosis de 5,0 ml de la vacuna usada en el Ejemplo 8 para un
total de tres dosis de vacuna, a los animales de control se les
administraron dosis de 5,0 ml del placebo del Ejemplo 8. Los títulos
por ELISA de antígenos de células completas se determinaron en
cuatro muestras de suero al mismo tiempo para minimizar la
variabilidad entre placas, la debida al operador y la del reactivo.
Los títulos se determinaron en comparación con una curva patrón
establecida para este antígeno.
La Figura 9 muestra la respuesta serológica a la
vacunación en las primeras vaquillas que no tienen verrugas
evaluadas un mes después de cada una de las tres dosis de bacterina,
y comparada con los niveles de la línea base y los animales de
control. El principal aumento del título en los vacunados ocurrió
después de la segunda dosis de bacterina; una tercera dosis no
parece añadir mucho al aumento de título.
Los valores de la línea base para todos los tres
grupos fueron indistinguibles. Los títulos de los animales de
control permanecían en los valores de la línea base en la duración
del estudio. Ambos grupos vacunados experimentaron un aumento del
título de tres veces la media en respuesta a la primera dosis de
bacterina, con un aumento subsiguiente de tres a seis veces después
de la segunda dosis. Una tercera dosis de bacterina dio como
resultado aumentos despreciables en los títulos.
Claims (5)
1. La cepa de Serpens spp.
HBL-112 ATCC 202.005 biológicamente pura.
2. Uso de la cepa de la reivindicación 1 para la
fabricación de un medicamento para impedir y/o tratar la dermatitis
digital papilomatosa (PPD) en rumiantes.
3. El uso de la reivindicación 2, en donde dicho
rumiante tiene los síntomas de la dermatitis digital
papilomatosa.
4. El uso de la reivindicación 2, en donde dicho
rumiante no tiene los síntomas de la dermatitis digital
papilomatosa.
5. Un método para determinar la presencia de
anticuerpos contra la PDD en una muestra de suero de rumiantes que
comprende poner en contacto dicha muestra de suero de rumiante con
la cepa de la reivindicación 1 y detectar anticuerpos en dicha
muestra que se unen a dicha cepa.
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