JPH09506625A

JPH09506625A - サルモネラの調節用の共生体

Info

Publication number: JPH09506625A
Application number: JP7516945A
Authority: JP
Inventors: ニスベト，デビット・ジェイ; コリエル，ドナルド・イー; デロウチ，ジョン・ビー
Original assignee: US Department of Agriculture USDA
Current assignee: US Department of Agriculture USDA
Priority date: 1993-12-13
Filing date: 1994-12-13
Publication date: 1997-06-30
Also published as: AU693146B2; FI962429A; EP0785800A1; HU9601621D0; PL314986A1; AU1402095A; HUT74951A; BR9408295A; CN1142773A; WO1995016461A1; CZ173396A3; SK281141B6; CA2178192A1; EP0785800A4; KR960706355A; FI962429A0; PL178535B1; NZ278508A; US5478557A; SK76596A3

Abstract

(57)【要約】家禽のサルモネラ集落形成を調節または抑制するために有効な規定された共生体すなわち嫌気性細菌の組成物。この共生体は２９種の実質的に生物学的に純粋な細菌の集団すなわち培養物を含む。使用時には、共生体を当該家禽にそのサルモネラ集落嫌気性に対する抵抗性増加に有効な量で投与する。本発明はまた成長した動物の糞便、盲腸内容物または大腸から家畜のサルモネラ集落形成を調節または抑制するのに有効である共生体を単離するための新規な方法にも関する。便、盲腸内容物または大腸を培養培地と組み合わせそして希釈せずに（すなわちバッチ培養）嫌気性条件下で培養する。この予備培養後に、生じた培養物を定常状態が得られるまで連続流条件にかけ、その時間後に定常状態の培養物を共生体としての使用のために回収できる。

Description

【発明の詳細な説明】サルモネラの調節用の共生体関連出願に関するクロス−リファレンスこれは１９９２年７月２９日に出願された出願番号０７／９２１，１７３の一部継続出願であり、その内容はここに引用することにより本発明の一部となる。発明の背景発明の分野本発明は家禽および特に鶏を含む家畜におけるサルモネラ集落形成の調節用の規定された共生体に関するものである。研究者および公衆衛生機関の努力にもかかわらず、人間のサルモネラ症の発生数は過去２０年間に増加している。人間の感染の実際に報告された症例数は１年当たり４０，０００件を越えている。しかしながら、Communicable Disease Cen terは米国における人間のサルモネラ感染症の真の発生数は２００〜４００万程度の高さであろうと推定している。飼鳥を含む動物食品は依然として人間の感染主要源である。先行技術の記述環境におけるサルモネラの広範な存在を考えると、飼鳥をサルモネラに対する露呈から完全に保護できるとは思えない。従って、研究者はサルモネラに露呈される飼鳥における集落形成に対する抵抗性を増加させる手段を研究し続けている。研究はワクチンの評価、保護的な正常な腸叢の制定、並びにサルモネラの成長および集落形成を抑制するであろう飼料添加剤の同定に焦点が向けられていた。サルモネラ集落形成に対する宿主免疫の役割は明らかでなく、そして免疫応答の刺激がサルモネラ集落形成抵抗性を効果的に増加させるとしてもそれは明らかでないままである。実験用ワクチンは常に有効であるとは証明されていない。正常な腸の微小叢がサルモネラ集落形成に対して抵抗性を高めることはかなり記載されている。成長した鶏の盲腸内容物または糞便から製造された共生体（それらを投与する動物に対して有利な効果を有する細菌培養物であると定義される）としても知られている微小叢の嫌気性細菌培養物の若鶏への経口的接種がサルモネラ集落形成を効果的に減じることが証明されている［Snoeyenbos et al.，A vian Dis.，23:904-913，(1979)，Schneitz et al.，Acta Pathol．Microbiol． Scand．Sect．B.，89:109-116，（1981）、およびStavric et al.，J．Food Pro t.，48:778-782，(1985)］。逆に、これらの盲腸嫌気性物質により鶏が集落形成し始めることを防止する飼鳥飼育法により、鶏をサルモネラ集落形成に対してさらに敏感性にすることもできる［Pivnick et al.，J．Food Prot.，44:909-916 ，（1981）］。これらの共生体は若鶏の腸管を急速に集落形成することにより（ Pivnick et al.，同上）、または腸病原体の成長を抑制する静菌性もしくは殺菌性の短鎖揮発性脂肪酸を生成することにより［Barnes et al.，J．Hyg．Camb.， 82:263-283，(1979)およびAm．J．Clin．Nutr.，33:2426-2433，(1980)，Corrie r et al.，Avian Dis.，34:668-676，（1990）およびAvian Dis.，34:617-625， (1990),およびHinton et al.，Avian Dis.，34:626-633，(1990)］サルモネラ集落形成を減少させることができる。しかしながら、数百種の微生物の混合集団を含有する通常の微小叢の培養だけではサルモネラの成長を効果的に抑制することが証明された。微生物の混合培養物を使用して生まれたての鶏における正常な腸叢の制定はヨーロッパの数カ国でサルモネラ集落形成を調節するために広く使用されている。しかし、混合培養物中の存在する微生物の規定されていない数およびタイプのために、このシステムは米国では広く認められていない。この方法の広範な使用にとっての１つの欠点は、生成物の組成を標準化できないため生成物を組成および有効性における変動なしに大規模に貯蔵または製造できないことである。また、出発物質は常に成長した家禽の腸内容物であるため、生成物が病原体ウイルス、細菌、または寄生体を含有しているかもしれず、それらは鶏の健康にとって危険である。さらに、米国食品および薬品局は最近では、全ての規定されていない培養物は認可されなければならないと要求している。鶏の飼料または水に加えられたラクトースおよび他の乳砂糖製品がサルモネラ集落形成に対する抵抗性を増加させることが最近報告されている［Oyodo et al. ，Avian Dis.，33:531-534，(1989)およびPoultry Sci.，68:1357-1360，(1989) ，Corrier et al.,同上，およびHinton et al.，同上］。飼料のラクトースが盲腸内容物の酸性度を増加させそして正常な腸微小叢の成長および発酵生成物に影響する。ラクトースが補充された飼料はある種の正常な腸細菌により製造される例えば酢酸、プロピオン酸、および酪酸の如き短鎖揮発性脂肪酸の静菌作用を増加させることによってサルモネラ集落形成抵抗性を増加させうる［Corrier et a l.，同上］。鶏に飼料のラクトースとラクトース含有ブロス中で成長した盲腸嫌気物質の培養との組み合わせが与えられるなら、鶏におけるサルモネラ集落形成に対する抵抗性はさらに増加するであろう。発明の要旨我々は家禽のサルモネラ集落形成を調節または抑制するために有効な細菌の規定された共生体または組成物を今回発見した。この共生体は実質的に生物学的に純粋な細菌の規定された集団または培養物からなっている。これらには下記の細菌株が含まれる：エンテロコッカス・フェカリス、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・アヴィウム、ラクトコッカス・ラクチス、大腸菌、シトロバクター・フレウンディイ、シュードモナス、セタリア・リクエファシエンス、プロピオニバクテリウム、ビフィドバクテリウム（またはラクトバシルス）、ユウバクテリウム、ヴェイロネラ、およびフソバクテリウム種、並びにエンテロバクテリアセア族に属する他の細菌、および株ＯＡＧＰＢ−５と指定された未知の細菌。使用時には、共生体は対象家禽にそのサルモネラ集落形成を抑制するのに有効な量で投与される。好適な態様では、ラクトースを共生体に加えることによりサルモネラの抑制増加が得られる。上記の共生体は一般的な飼料と組み合わせて、家禽により経口的に摂取できる新規な飼料製品としてもよい。本発明は成長した動物の糞便または盲腸もしくは大腸内容物から家禽を含む家畜のサルモネラ集落形成を調節または抑制するのに有効な共生体を単離するための新規な方法にも関する。糞便または盲腸もしくは大腸内容物を養分または培養培地と組み合わせそして希釈せずに（すなわちバッチ培養）嫌気性条件下で培養する。この予備培養後に、生じた培養物を定常状態が得られるまで連続流条件にかけ、その時間後に定常状態の培養物を共生体として使用するために回収できる。この発見によると、本発明の目的は家禽におけるサルモネラ集落形成を調節するための改良された方法および組成物を提供することである。本発明の他の目的は容易に標準化できる家禽におけるサルモネラ集落形成を調節するための嫌気性細菌の規定された培養物を提供することである。さらに他の目的は家畜、特に家禽のサルモネラ集落形成を調節するための共生体として使用するための細菌組成物を単離する改良方法を提供することである。本発明の他の目的および利点は以下の記述から明らかになるであろう。発明の詳細な記述本発明の共生体は家禽に投与された時にそのサルモネラ集落形成を調節し、家禽集団中の平均サルモネラ濃度を減少させおよび／または病原体により集落形成される家禽の百分率を低下させるために有効である。本発明はいずれのタイプの家禽に対しても実施することができ、それらには例えば鶏、七面鳥、鴨、鶉および鵞鳥の如き飼鳥が包含されるがそれらに限定されるものではない。家禽に投与すると、共生体は種々のサルモネラ、特にＳ．チフィムリウムおよびＳ．エンテリジチスに対する不変の保護を与える。共生体はサルモネラを含まない鶏の盲腸から開発された。実施例１にさらに詳細に記載されているように、鶏から盲腸を回収し、適当な培養培地中で接種しそして嫌気性条件下でバッチ培養で培養した。培養物を次に連続流培養条件下で特定の培地反転下で定常状態すなわち平衡が得られるまで培養した。回収されそして家禽に投与される時には、生じた定常状態培養物は処置した鳥のサルモネラ集落形成調節用の共生体としてかなりの有効性を示した。分析では、１５種の通気性および１４種の偏性嫌気菌を含む２９種の実質的に純粋な細菌単離体が定常状態の培養物から回収された。培養物の組成物は以下の通りであると判定された：Ｉ．通気嫌気性グラム陽性球菌：（１）第一エンテロコッカス・フェカリス株、（２）第二エンテロコッカス・フェカリス株、（３）第一エンテロコッカス・フェシウム株、（４）第二エンテロコッカス・フェシウム株、（５）第三エンテロコッカス・フェシウム株、（６）エンテロコッカス・アヴィウム、（７）第三エンテロコッカス・フェカリス株、 II．通気嫌気性グラム陽性球棹菌：（８）ラクトコッカス・ラクチス、（９）第一ラクトバシルス株、 III.通気嫌気性グラム陰性棹菌：（１０）第一大腸菌株、（１１）シトロバクター・フレウンディイ、（１２）エンテロバクテリアセア族に属する細菌、（１３）シュードモナス種、（１４）セラチア・リクエファシエンス、（１５）第二大腸菌株、 IV．偏性嫌気性グラム陽性棹菌：（１６）第一プロピオニバクテリウム種、（１７）第二プロピオニバクテリウム種、（１８）第二ラクトバシルス株、（１９）第一ビフィドバクテリウム株または第三ラクトバシルス株、（２０）第三プロピオニバクテリウム株、（２１）第一ユウバクテリウム株、（２２）第二ユウバクテリウム株、（２３）株ＯＡＧＰＢ−５と指定された未知の細菌、（２４）第三ユウバクテリウム株、（２５）第二ビフィドバクテリウム株または第四ラクトバシルス株、（２６）第三ビフィドバクテリウム株または第五ラクトバシルス株、（２７）第四プロピオニバクテリウム株、Ｖ．偏性嫌気性グラム陰性球菌：（２８）ヴェイロネラ種、および VI．偏性嫌気性グラム陰性棹菌：（２９）フソバクテリウム種。上記の細菌株の２９種全てを含む共生体組成物はAmerican Type Culture Collec tion（12301 Parklawn Drive，Rckville，MD 20852，USA）中のBudapest Treaty にCompetitive Exclusion Culture，CF3として寄託されており、そして寄託番号ＡＴＣＣ５５５１５と指定されている。個々の株は実施例１および２で同定されている。生じた定常状態の培養物は共生体として直接使用してもよくまたはその後の使用のために貯蔵してもよい。後者に関しては、培養物は指定に従い混合物状で貯蔵してもよく、または個々の細菌を単離し、貯蔵しそしてその後の再構成してもよい。好適な態様に従うと、共生体は実施例１および２を参考にして寄託された定常状態培養物からの細菌からなる。しかしながら、別の態様では、使用される細菌の多くを既知のすなわち標準化された株からまたは家禽から回収された単離体から得てもよい。例えば、それらに限定されるものではないが、エンテロコッカス、ラクトコッカス、大腸菌、シトロバクター、シュードモナス、セラチア、プロピオニバクテリウム、ビフィドバクテリウム、ユーバクテリウム、ベイロネラ、フソバクテリウまたは特にラクトバシルスを実施例の寄託された培養物の中で同じ属または種の株と置換してもよい。既知株の株培養物を使用する時の効率を高めるためには、細菌を家禽に好適には定常状態の培養物からの他の有機体と一緒に通過させることにより適用してもよく、その後にそれらの回収および糞便または盲腸内容物からの単離が続く。家禽単離体を使用する時には、細菌は個別に単離されそして成長した家禽の糞便または盲腸内容物から当技術で一般的な技術を用いてまたはDeLoach［米国特許出願番号０７／８２２，５０５］により記載されている通りにして回収され、それらは引用することにより本発明の内容となる。本発明は上記の２９種全てより少ない細菌株を有する共生体で実施してもよいこと並びに細菌の１種、２種または３種をわずかな効果の減少だけを伴って共生体から除去できることも予想される。例えば、それらに限定されるものではないが、シュードモナスすなわち還元剤である細菌株、すなわち存在する複数の株または種を有する属をあまり効率を減少させずに削除することができる。しかしながら、好適な態様によると、２９種全てを含む共生体を用いると最適なサルモネラ集落形成の調節が得られる。本発明の細菌株の一部は場合により、引用することにより本発明の内容となる Nurmi et al.,の米国特許第４，６８９，２２６号の教示に従い、対象家禽の栄養管の上皮細胞に付着する能力に関して選択される。本発明はまた家禽並びに馬、豚および牛を含むがそれらに限定されない種々の家畜のサルモネラ集落形成を調節または抑制するのに有効な共生体を得るための新規な方法にも関する。既知の株培養物または純粋な細菌単離体から共生体を製造するのではなく、我々は成長した目標動物の糞便、盲腸および／または大腸内容物から規定された共生体を直接製造できるということを予期せぬことに見いだした。この方法によると、糞便または盲腸もしくは大腸内容物を最初にバッチ培養物用の接種材料として使用し、そして次に連続流条件下で指定された培地反転およびｐＨにおいて定常状態すなわち平衡が得られるまで培養する。生じた定常状態の培養物は共生体として回収することができる。盲腸内容物という語はここでは盲腸の内境界内の物質並びに例えば粘膜層の如きその一部を含む盲腸自身全体を包括すると定義される。バッチ培養段階は一般的な発酵器の中で行ってもよい。しかしながら、その後の段階のための培養物の移動を省くためおよび培養物の起こりうる汚染を減じるためには、希釈（すなわち新しい培養培地の添加および使いきった培養培地の除去）なしの恒成分培養槽の使用が好ましい。それらの収集後に、動物からの盲腸もしくは大腸内容物またはその糞便を適当な培養培地と一緒にしそして嫌気性条件下で培養する。このバッチ培養は（１）約６−１８時間、好適には約１２−１８時間にわたり、または（２）光学密度（６００ｎｍで測定）が少なくとも約１．０に達するまで、および／または（３）ｐＨが約４．２に達した後の約２時間以内にわたり続けなければならなず、その時間後にバッチ培養を停止しそして連続培養を開始しなければならない。培養期間が条件（１）または特に条件（２）により決められる時には、当技術で一般的なようにｐＨ調節剤を用いてｐＨを約５．５に調節することが好ましい。さらに、このｐＨ調節を使用しない場合には、細胞の一部の死滅を避けるために、バッチ培養は約４．２以下のｐＨとなるまで好ましくは続けるべきである。次にバッチ培養段階の終了直後に新しい培地の連続的供給および使いきったブロスの除去を伴う恒成分培養槽中での連続的培養を開始する。適当な恒成分培養槽は容易に決めることができ、そしてそれらには例えばWangにより記載されたもの［Fermentation and Enzyme Technology，John Wiley & Sons，New York，197 9，pages 98-137、それはここで引用されることにより本発明の内容となる］が包含される。驚くべきことに、特定の希釈または培地反転速度および特定のｐＨを用いる連続的培養中の混合物の成長により培養物が平衡すなわち定常状態になる。接種源として使用される動物、特定の培地および培養条件によるが、最初に存在する細菌の数は相対的に少ない実質的に生物学的に純粋な細菌の容易に規定できる安定な培養物にまで減じられる。例えば、家禽を使用する時には、接種材料中に最初に存在する約５００個の細菌は約１０〜４０個の細菌の安定な培養物にまで減じられる。この段階のための適当な条件は、約０．０２９〜約０．１０ｈｒ^-1、好適には約０．０４１６ｈｒ^-1の反転速度、および約４．７〜６．５の間の、好適には約５．５のｐＨを含む。バッチおよび連続的培養に使用される温度および培地は重要ではなくそして容易に決めることができる。適当な温度は約２６°〜４７℃の間で変動できる。異なるエネルギー源を有する種々の適当な培養培地を使用することもできる。それらに限定されるものではないが、好適なエネルギー源にはグルコースまたはガラクトースおよび特にラクトースが包含される。培養ｐＨ、ＯＤ₆₀₀および揮発性脂肪酸濃度がほぼ一定のままである特に定常状態であると推定される。定常状態に達したら、記載されている通りにして培養物を使用するいずれの時にも回収することができる。理想的には、当技術で一般的な技術を用いて内部の細菌集団を単離しそして同定して定常状態培養物を同定すなわち規定すべきである。単離されたら、細菌は例えば１９９２年７月２９日に出願された特許出願番号０７／９２１，１７３に記載されている通りにしてその後の使用のために一般的技術を用いて無期限に貯蔵することができる。当技術の専門家は、最初の接種材料として単離されたすなわち生物学的に純粋な細胞を用いて上記のバッチ／連続的培養方法を使用できることも認識するであろう。この方法に従い製造された定常状態の培養物を場合によりふるいわけて目標動物のサルモネラ集落形成の抑制用の最適な効果を示す組成物を選択することもできる。一態様では、ふるいわけは当技術で一般的でありそして実施例３および４に記載されているように、生体内でサルモネラ抗原投与を行うことができる。簡単に述べると、定常状態の培養物をここで記載されているようなサルモネラを含まない動物に投与する。培養物が腸内で確立するのに十分な時間の期間後に、一般的には２または４日後に、動物にサルモネラの生存培養物を抗原投与し、培養し、そして引き続き殺しそして盲腸内容物をサルモネラ集落形成に関して分析する。サルモネラ集落形成の有効な抑制は、処置された集団中での未処置の対照と比べて減じられた平均サルモネラ濃度（ＣＦＵ）または集団形成された動物の低い百分率により示される。我々はまた、本発明に従いまたは他の方法により製造された共生体を盲腸中の揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）特性の分析により生体内で正確にふるいわけできることも発見した。この技術は一般的なサルモネラ抗原投与を必要としない。培養物の効果を評価するために、それを目標動物に投与し、そして前記の通りにして培養を腸内で始める。処置後約２−３日に、好適には３日に、動物を殺しそして盲腸内容物中のプロピオン酸並びに合計揮発性脂肪酸（酢酸およびプロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、吉草酸およびイソ吉草酸）濃度を測定する。酸の測定用に使用できる技術は当技術で一般的でありそして引用することにより本発明の内容となる Corrier et al．（Avian Dis.，34:617-625，1990）により記載されているような気体−液体クロマトグラフィーを含む。（１）プロピオン酸の濃度が約１０ミリモル／ｇの盲腸内容物より大きいかもしくは等しい時、および／または（２）合計揮発性脂肪酸濃度が１００％であるかもしくは未処置の対照より大きい時に、サルモネラ集落形成抑制用の共生体としての効果が示される。プロピオン酸濃度は２日目後に測定してもよいが、３日後に行われる合計揮発性脂肪酸濃度に基づくと効果の予測率は低下する。上記の２９株の共生体を用いた場合のように、本発明に従い製造される定常状態培養物は共生体として直接使用してもよく、またはその後の使用のために貯蔵してもよい。同様に、培養物を含んでなる細菌を単離しそして同定してもよく、そして既知のすなわち標準的な株または同じ目標動物からの単離体を上記のように定常状態の培養物中で同じ属または種の細菌と置換してもよい。当技術で一般的な嫌気性培養技術を用いる適当な培養培地中での細菌のバッチまたは連続的培養により、大量の本発明の共生体を製造することができる。これらの中では、定常状態の培養物が非常に安定でありそして定常状態の培養下で無期限に維持できるため、連続的培養が特に有利である。大規模培養用の接種材料は定常状態の培養物、寄託物、または細菌の株培養物もしくは実質的に生物学的に純粋な単離体のサンプルまたは種であってよい。細菌は一緒にしてもよくまたは標準化の容易さのために別個の培養培地中で培養しそして引き続き一緒にしてもよい。しかしながら、当技術の専門家は濃度は重要でなく変動可能であることを認識するであろう。一般的には、大規模製造がバッチ培養で行われる時には、培養物は回収前に約１６−７２時間、好適には約２４−４８時間の間培養される。しかしながら、我々はいずれの場合にも下記の発酵助変数が得られるまでバッチ培養を続けなければならないことを見いだした：（１）酢酸の濃度が約２０ｍＭより大きいかまたはそれと等しい、（２）プロピオン酸の濃度が約１０ｍＭより大きいかまたはそれと等しい、（３）酪酸およびイソ酪酸の濃度が約１５ｍＭより大きいかまたはそれと等しい。本発明の共生体の使用は特別な製造方法により影響を受けず、いずれの上記の方法により製造された共生体でも同じ方法で使用することができる。製造後に、細菌の培養物を対象動物に単独でまたは組み合わせて直接投与することができる。場合により、共生体をラクトースもしくはスキムミルクを含むがそれらに限定されない適当な担体と共にさらに調合するか、または少量の予備混合物としての使用のための飼料と一緒にしてもよい。培養物は貯蔵安定性および取り扱いの容易さのために凍結乾燥してもよい。そのような凍結乾燥された培養物は動物に直接投与してもよく、或いは使用前に再構成してもよい。細菌の１種または全てをアルギネートゲル中でのカプセル化を含むがそれに限定されない当技術で一般的な技術を使用してカプセル化してもよいことも特に注目される。理論により拘束することは望まないが、この方法でのカプセル化が一部の細菌が上部腸管中の乳酸濃度の望ましくない水準まで減少させるのを防ぐと信じられている。それはまた細菌を保護しそしてそれらが乳酸利用が望まれる盲腸に達するのを助ける。本発明の共生体は家畜または家禽におけるサルモネラ並びに特に乳酸または揮発性脂肪酸を生成する細菌の調節のために有効な共生体中で使用される他の実質的に生物学的に純粋な細菌と組み合わせてもよい。それらに限定されるものではないが、他の細菌にはペプトストレプトコッカス種、または引用することにより本発明の内容となるDeLoachの文献［米国特許出願番号０７／８２２，５０５］に記載されているものが包含される。家畜および家禽の処置用にそして特にエンテロ病原体の抑制用に当技術で一般的なすなわち既知である他の助剤を共生体に加えてもよい。適当な助剤には例えば、グラム陽性菌に対して有効でないコクシジオスタトが包含される。ラクトースの添加が特に好ましい。当技術で一般的なように非治療水準の抗生物質を動物または家禽に投与してもよい。そのような抗生物質は共生体と組み合わされてまたは別個に投与してもよくできる。或いは、これらの抗生物質を家禽に治療水準であるが孵化後約３日以内に非治療水準に減少するような水準で卵内に投与することもできる。本発明の共生体は主として動物の飼料または水と組み合わせることにより栄養管に投与または加えられ、その後に経口的に摂取されるが、当技術で一般的なように調合物を動物に直接噴霧または散布することによりそれを経口的および経鼻的に投与してもよい。さらに他の変法は胃腸管中への直接的注入を含み、または総排泄腔に投与してもよい。後者に関すると、共生体は家禽の肛門上に直接噴霧するかまたは畜舎の床の葉積に適用され、そこでそれが家禽の正常な生活工程を通して肛門部分と接触するであろう。肛門部分と接触すると、共生体は逆蠕動により総排泄腔に加えられるであろう。共生体の投与は動物の一生のうちのいずれの時点でも可能である。しかしながら、好適な態様では共生体は生後約１〜１４日の孵化したての家禽に投与される。共生体は処置された動物におけるサルモネラ集落形成を未処置の動物と比べて実質的に抑制するのに有効な量で投与される。適量は当技術の専門家が容易に決めることができ、そして動物の年令および大きさにより幾分変動するであろう。下記の実施例は本発明をさらに説明するものであるが、請求の範囲により規定されている課題の範囲を限定しようとするものではない。実施例１共生体の製造最初の接種材料。孵化から薬品の入っていない飼料および水で飼育された３羽の生後１０週間のサルモネラのないブロイラー鶏から最初の接種材料を得た。鳥を殺しそして盲腸を無菌的に除去しそして直ちに嫌気室（Goy Laboratory Products，Ann Arbor，MI）に移した。各々の盲腸を数個の片に切断しそしてLab Blender（Tekmar，Cincinnati，OH）の中で解離させた。解離させた盲腸組織および内容物を一緒にしそして十分均質化しそしてグリセロールを加えて２０％の最終濃度にした。最終的な盲腸均質物混合物を使用するまで−７０℃において凍結した。１０ｍｌの凍結された盲腸均質物を解凍しそして１００ｍｌのビアンデ・レブレ（ＶＬ）ブロスの中で３９℃において嫌気培養しそしてその後の連続流（ＣＦ）培養用の種培養物として使用した。連続流装置。バッチおよび連続流培養段階の両者はBioFloIII発酵器（New B runswick Scientific Co.，Edison，NJ）の１１５０ｍｌ恒成分培養槽容器の中で行われた。培養物が連続流条件下で成長する時には、下記の助変数が使用された： −− ０．０４１６^-1の希釈速度（０．８０ｍｌ／分の流速および２４時間の容器反転時間に相当する）、 −− ３９℃の温度、並びに −− ２００ｒｐｍの撹拌速度。容器にＯ₂を含まないＣＯ₂の定常流を流すことにより嫌気性条件は保たれていた。連続流条件下での盲腸菌の成長。恒成分培養槽容器に１，０５０ｍｌの殺菌性ビアンデ・レブレ（ＶＬ）ブロスを充填しそして１００ｍｌの種培養物を接種しそしてバッチ培養で３９℃において２００ｒｐｍの撹拌速度で嫌気培養した。バッチ培養における６時間後に、養分ポンプを始動させそして培養物を連続流条件下で培養した。約５日間の連続流培養後に定常状態条件が得られた。培養ｐＨ、ＯＤ₆₀₀および揮発性脂肪酸濃度がほぼ一定のままである時に定常状態条件となる。連続流培養物のサンプルを無菌的に５日間および６１日間の培養後に集めそして５％の牛血液、マッコンキー寒天、および疾病調節血液寒天用センター（ＣＤＣＢＡ）が補充されたトリプトース寒天上で板培養した。トリプトース寒天およびマッコンキー寒天板は空気中で３７℃において７日間にわたり培養した。ＣＤＣＢＡ板は８０％の窒素、１０％の水素、および１０％の二酸化炭素の雰囲気を含有する嫌気室（Goy Laboratory Products，Ann Arbor，MI）の中で３７℃において７日間培養した。１０種の属を代表する、１５種の通気性および１４種の偏性嫌気性菌からなる２９種の細菌単離体を５日間の連続流培養で同定しそして６１日間の連続流培養で再び同定した。２９種の細菌単離体は当技術において一般的な生化学的および発酵工程並びに抗細菌敏感性特性を利用して同定された（Ho ldeman et al.，1977，Anaerobe Laboratory Manual，4th ed.，Virginia Polyt echnic Institute and State University，Blacksburg，VA; Farmer et al.，19 85，J. Clin．Microbiol.，21:46-76; Lennette et al.，1985，Clinical Micro biology，4th ed.，American Society for Microbiology，Washington，D.C.;およびDevriese et al.，1987，Int．J．Syst．Bacteriol.，37: 257-259、これらの各々の内容はここに引用することにより加えられる）。結果は実施例２に記載されている。細菌は、Ｉ．（１）株Ｍと指定されたエンテロコッカス・フェカリス、（２）株Ｎと指定されたエンテロコッカス・フェカリス、（３）株Ｙと指定されたエンテロコッカス・フェシウム、（４）株Ｚと指定されたエンテロコッカス・フェシウム、（５）株Ｘと指定されたエンテロコッカス・フェシウム、（６）エンテロコッカス・アヴィウム、（７）株Ｏと指定されたエンテロコッカス・フェカリス、 II．通気嫌気性グラム陽性球棹菌：（８）ラクトコッカス・ラクチス副種ジアセチラクチス、（９）ラクトバシルス種（株番号１）、 III.通気嫌気性グラム陰性棹菌：（１０）株ＣＣ−３Ａと指定された大腸菌、（１１）ＣＣ−３と指定されたシトロバクター・フレウンディイ株、（１２）エンテロバクテリアセア族に属する細菌（試験的にエンテロバクター種、大腸菌、またはルイヴェラ・クリオクレセンス）、（１３）シュードモナス種、（１４）セラチア・リクエファシエンス、（１５）株ＣＣ−３Ｂと指定された大腸菌、 IV．偏性嫌気性グラム陽性棹菌：（１６）プロピオニバクテリウム種（株番号１、試験的にＰ．ジェンセニイまたはＰ．トエニイ）、（１７）プロピオニバクテリウム種（株番号２、試験的にＰ．グラヌロスム）、（１８）ラクトバシルス種（株番号２）、（１９）ビフィドバクテリウム種（株番号１）またはラクトバシルス種（株番号３）、（２０）プロピオニバクテリウム種（株番号３）、（２１）ユウバクテリウム種（株番号１）、（２２）ユウバクテリウム種（株番号２）、（２３）株ＯＡＧＰＢ−５と指定された未知の細菌、（２４）ユウバクテリウム種（株番号３）、（２５）ビフィドバクテリウム種（株番号２）またはラクトバシルス種（株番号４）、（２６）ビフィドバクテリウム種（株番号３）またはラクトバシルス種（株番号４）、（２７）プロピオニバクテリウム種（株番号４）、Ｖ．偏性嫌気性グラム陰性球菌：（２８）ヴェイロネラ種、および VI．偏性嫌気性グラム陰性棹菌：（２９）フソバクテリウム種であると同定された。このようにして２９種の細菌単離体からなると同定された連続流培養物は混合媒体中での匹敵する成長、酸環境（ｐＨ５．０〜６．５）中での生存率、および発酵最終生成物としての揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）の生成を示した。上記の細菌株の２９種全てを含む共生体組成物はAmerican Type Culture Coll ection（12301 Parklawn Drive，Rckville，MD 20852，USA）中のBudapest Trea tyにCompetitive Exclusion Culture，CF3として寄託されており、そして寄託番号ＡＴＣＣ５５５１５と指定されている。実施例２細菌の同定気体液体クロマトグラフィー。ＣＤＣＢＡからの２９種の細菌株の各々をペプトン−酵母（ＰＹ）およびＰＹ＋１％グルコース（ＰＹＧ）ブロス中で接種し、次に３７℃において２日間嫌気培養した。揮発性脂肪酸類（ＶＦＡ類）および非揮発性脂肪酸類（ＮＶＦＡ類）を標準的工程を用いて抽出し、次にGowMac GLCで検出した。商業的なＶＦＡ類およびＮＶＦＡ類の標準を用いてＧＬＣを目盛りつけした。結果は表１Ａ−Ｃに示されている。細胞、集団、および培養特性。通気性嫌気性細菌１−１５のグラム反応および形態学を空気中で３７℃において２４時間培養した血液寒天からのグラム−染色塗抹を使用して測定した。細菌の死亡率をテトラゾリウム塩を含む軟質寒天（０．４％）移動培地を用いて測定した。移動培地を血液寒天から接種し、次に空気中で３７℃において２４時間培養した。各試験は２回行われた。培養特性を測定するために、細菌１−９を２つの血液寒天、２つのマッコンキー培地、２つのナトリウムアジド血液寒天、および２つのバイルエスクリン寒天板に接種した。１つの血液寒天、１つのマッコンキー寒天、１つのナトリウムアジド血液寒天、および１つのバイルエスクリン寒天板を空気中で３７℃において培養した。１つのナトリウムアジド血液寒天および１つのバイルエスクリン寒天板を空気中で４５℃において２日間培養した。成長能力、集団特性および血液寒天上の溶血パターン、マッコンキー寒天上のラクトース反応、およびバイルエスクリン寒天上のエスクリン加水分解反応を１日間および２日間の培養後に記録した。各試験は２回行われた。通気性嫌気性グラム−陰性細菌１０−１５の培養特性を測定するために、ナトリウムアジド血液寒天およびバイルエスクリン寒天板が削除されたこと以外は同じ工程を繰り返した。偏性嫌気性細菌１６−２９に関しては、細菌のグラム反応および細胞形態学は８０％の窒素、１０％の水素、および１０％の二酸化炭素の雰囲気中で３７℃において２日間培養されたヘミンおよびメナジオンに富んだ脳心臓灌流血液寒天（ＣＤＣＢＡ）からのグラム−染色塗抹を使用して測定した。培養特性を測定するために、細菌１６−２９を２つのＣＤＣＢＡおよび２つのマッコンキー寒天板に接種した。１つのＣＤＣＢＡおよび１つのマッコンキー寒天を空気中で３７℃において培養し、そして１つのＣＤＣＢＡおよび１つのマッコンキー寒天を嫌気的に３７℃において培養した。成長能力、並びに集団特性およびＣＤＣＢＡ上の溶血パターンを１、３および５日間の培養後に記録した。各試験は２回行われた。結果は表２Ａ−Ｃに示されている。カタラーゼ、オキシダーゼ、およびナイトレート還元試験。空気中で３７℃において２日間培養された血液寒天からの集団である通気性嫌気性細菌１−９を使用してカタラーゼおよびオキシダーゼ試験を行った。カタラーゼ試験およびオキシダーゼ試験用の試薬はそれぞれ３％Ｈ₂Ｏ₂およびテトラメチル−ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩の１％溶液であった。オキシダーゼおよびカタラーゼ反応は陰性または陽性として記録された。各試験は２回行われた。培養物が２４時間だけ培養されたこと以外は同じ工程を通気性嫌気性グラム−陰性細菌１０−１５用に使用した。３７℃において２日間にわたり嫌気的に培養されたＣＤＣＢＡからの集団である偏性嫌気性細菌１６−２９を使用してカタラーゼおよびオキシダーゼ試験を行った。カタラーゼおよびオキシダーゼ試験用の試薬は以上のものと同じであった。カタラーゼ試験およびオキシダーゼ試験用の細菌は試薬を加える前に３０分間空気に露呈された。全ての反応は陽性または陰性として記録された。各試験は２回行われた。２つの方法を使用して通気性嫌気性細菌１−１５においてナイトレートレダクターゼを検出した。ナイトレート寒天法では、０．１％ＫＮＯ₃を含有するナイトレート寒天を空気中で３７℃において２４時間培養された血液寒天から接種した。３７℃における２４時間の培養後に、試薬ＡおよびＢ（Ｎ，Ｎ−ジメチル−ナフチルアミンおよびスルファニリン酸）を適用した。嫌気性血液寒天−ディスク法では、菌を血液寒天上で画線し、次に０．４％ＫＮＯ₃溶液を含浸させた紙ディスクをたくさん画線された部分に置いた。板を３７℃において２４時間嫌気培養し、次に試薬ＡおよびＢを紙ディスクに適用した。ナイトレートがナイトレートを越えて還元されたかどうかを測定するために、亜鉛粉を試薬処理されたディスクに加えた。全ての反応は陰性または陽性として記録された。各試験は２回行われた。偏性嫌気性細菌１６−２０に関しては、血液寒天でなくＣＤＣＢＡを使用したこと以外は上記の嫌気性血液寒天−ディスク法を使用してナイトレートレダクターゼを測定した。結果は表３Ａ−Ｃに示されている。好気性炭水化物利用試験。通気性嫌気性細菌１−９に関しては、グルコース、ダルシトール、ラクトース、マルトース、マンニトール、サリシン、およびスクロースからの酸生成をフェノールレッドブロスベース中の１％基質を使用して測定した。グルコース、ブロスベース中のダルハム管を使用して気体生成を検出した。各管に空気中で３７℃において２４時間培養された血液寒天からの試験菌を接種した。ブロスを空気中で３７℃において２日間培養した。各管を色の変化に関して観察した。赤色の管は陰性であると記録され、黄色の管は陽性であると記録された。各試験は２回行われた。グルコース、ラクトースおよびスクロースだけを評価したこと以外は通気性嫌気性グラム−陰性細菌１０−１５に関するのと同じ工程を行った。トリプル糖鉄（ＴＳＩ）寒天を空気中で３７℃において２４時間培養された血液寒天上の全ての通気性嫌気物１−１５の培養物から接種した。空気中での３７ ℃における２４時間の培養後に、ＴＳＩ寒天反応は陽性または陰性として記録された。試験は２回行われた。通気性嫌気性細菌１−９に関しては、フォーガス−プロスカウエルブロスを血液寒天から接種し、次に空気中で３７℃において２４時間培養した。試薬ＡおよびＢ（４０％ＫＯＨおよびアルファ−ナフトール）を加え、そして反応は陽性または陰性として記録された。試験は２回行われた。通気性嫌気性グラム−陰性細菌１０−１５に関しては、２つのメチルレッド− フォーガスプロスカウエルブロス管（ＡおよびＢ）を血液寒天板から接種し、次に空気中で３７℃において２４時間培養した。メチルレッド試験用には、メチルレッド染料の溶液を管Ａに加えた。フォーガス−プロスカウエル試験用には、試薬ＡおよびＢ（４０５ＫＯＨＡおよびアルファ−ナフトール）を管Ｂに加えた。反応は陽性または陰性として記録された。各試験は２回行われた。結果は表３Ａ−Ｃに示されている。アミノ酸利用およびウレアーゼ試験。通気性嫌気性グラム−陰性細菌１０− １５をリシンデカルボキシラーゼ、およびウレアーゼに関して評価し、そして細菌１−１５をインドール生成に関して評価した。リシン鉄寒天（ＬＩＡ）を使用してリシンデカルボキシラーゼを検出した。ＬＩＡを血液寒天板から接種し、次に空気中で３７℃において２４時間培養した。反応は陽性または陰性として記録された。試験は２回繰り返した。２つの方法を使用してトリプトファンからのインドール生成を検出した。血液寒天から接種されたトリプトファンブロスを空気中で３７℃において２４時間培養し、次にエルリッヒ試薬と反応させた。嫌気性寒天−ディスク法では、血液寒天板を菌では画線し、次に紙ディスクを寒天表面上に置いた。血液寒天板を３７ ℃において２４時間嫌気培養し、次にｐ−ジメチルアミノシンナムアルデヒドをディスクに適用した。全ての結果は陽性または陰性として記録された。トリプトファンブロス試験は２回繰り返されそして嫌気性寒天−ディスク法は１回であった。ウレア寒天を血液寒天板から接種し、次に空気中で３７℃において２４時間培養した。反応は陽性または陰性として記録された。試験は２回繰り返した。これらの結果も表３Ａ−Ｃに示されている。商業用ＡＰＩ２０Ｅシステム。通気性嫌気性グラム−陰性細菌１０−１５も２０回の生化学反応（表４）に関して商業用システムを使用して製造業者（Anal ytab Products，Plainview，NY）が記載している通りにして評価した。試験は２回繰り返した。結果は表４に示されている。炭水化物発酵、ゼラチン液化、およびアミノ酸利用試験。商業的な予備還元され嫌気殺菌された（ＰＲＡＳ）ブロス培地（表５）に血液寒天上の通気性嫌気性細菌１−１５の濃い懸濁液を接種した。ブロスを空気中で３７℃において５日間培養しそして各培養物のｐＨを１、３、および５日間の培養後にｐＨ計を使用して測定した。≦６．５のｐＨを有する培養物は陽性として記録され、そして≧ ６．６のｐＨを有する培養物は陰性として記録された。アルギニン培地を高められたｐＨに関して評価し、一方ゼラチン培地を液化に関して評価した。各試験は１回行われた。接種物がＣＤＣＢＡ上で成長した菌から製造されそして全ての培養が嫌気的であったこと以外は同じ工程を偏性嫌気性細菌１６−２９で繰り返した。結果は表５Ａ−Ｃおよび３Ａ−Ｃに示されている。商業的ＡＰＩ急速ＡＴＲＥＰシステム試験。腸球菌および連鎖球菌の同定のための商業的システムを使用して通気性嫌気性細菌１−９を２０種の生化学性質（表６）に関して製造業者（Analytab Products，Plainview，NY）により記載されている通りにして評価した。簡単に述べると、空気中で３７℃において２４時間培養された血液寒天からの集団を３ｍｌの殺菌蒸留水中に懸濁させてマックファルランド番号５標準と同等な細菌懸濁液を与えた。各吸盤を接種し、そして片を空気中で３７℃において２４時間培養した。２４時間の培養後に、アセトイン生成、ヒップレート加水分解、並びにピロリドニル−２−ナフチルアミド、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、およびロイシンアリールアミダーゼに関する酵素反応のための試薬を加えた。反応は室温における１０分間の培養後に陽性または陰性として記録された。エスクリン加水分解、アルギニンジヒドロラーゼ、並びにリボース、アラビノース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、トレハロース、イヌリン、ラフィノーズ、澱粉、およびグリコーゲンからの酸生成は陽性または陰性のいずれかとして記録された。結果は表６に示されている。商業的ＡＰＩＳＴＡＰＨＴｒａｃシステム試験。腸球菌および連鎖球菌の同定のための商業的システムを使用して通気性嫌気性細菌１−９を１９種の生化学（表７）に関して製造業者（Anal ytab Products，Plainview，NY）により記載されている通りにして評価した。簡単に述べると、空気中で３７℃において２４時間培養された血液寒天からの集団を３ｍｌの殺菌蒸留水中に懸濁させてマックファルランド番号５標準と同等な細菌懸濁液を与えた。各吸盤を接種し、そして片を空気中で３７℃において２４時間培養した。２４時間の培養後に、アセトイン生成、アルカリ性ホスファターゼ、ナイトレートリダクターゼ、並びにアルファ−メチル−グルコシド、アルギニンジヒドロラーゼ、グルコース、フルクトース、マルトース、マンニトール、マンノース、メリビオース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、ラフィノーズ、サッカロース、トレハロース、ウレアーゼ、キシリトール、およびキシロース用の酵素反応に関して試験するための試薬を加えた。反応は陽性または陰性のいずれかとして記録された。結果は表７に示されている。商業的ＡＰＩＸＹＭシステム試験。商業的な半定量的酵素システムを使用して全ての通気性嫌気性細菌１−１５を１９種の基質の酵素活性（表８）に関して製造業者（Analytab Products，Plainview，NY）が記載している通りにして評価した。簡単に述べると、空気中で３７℃において２４時間培養された血液寒天からの集団を３ｍｌの殺菌蒸留水中に懸濁させてマックファルランド番号５標準と同等な細菌懸濁液を与えた。各吸盤に細菌懸濁液を接種した。暗所で３７℃における４時間の培養後に、試薬ＡおよびＢを各吸盤に加え、そして反応を室温で５分間そのまま進めた。反応の色強度を製造業者の注釈スキームと比較し下記の通り等級つけした：０＝色変化なし、痕跡量＝＜５ナノモル（ｎモル）、１＝５ｎモル、２＝１０ｎモル、３＝２０ｎモル、４＝３０ｎモル、および５≧４０ｎモル。接種物をＯＤＣＢＡ上で嫌気的に成長させた菌から製造したこと以外は同じ工程を偏性嫌気性細菌１６−２９に関して繰り返した。結果は表８Ａ−Ｃに示されている。商業的プレサンプト板Ｉ、II、およびIII。偏性嫌気性細菌１６−２９に関して、プレサンプト板Ｉ、II、およびIIIをＣＤＣＢＡから接種し、次に３７℃ において２日間嫌気培養した。試験を行いそして結果は製造業者により記載されている通りに記録した（表９）。各試験は２回行われた。結果は表９Ａ−Ｃに示されている。抗微生物敏感性試験。標準的なディスク−拡散工程を使用して通気性嫌気性細菌１−１５を表１０に示されているような選択された抗微生物剤に対するそれらの抗微生物敏感性に関して試験した。結果は抵抗性または敏感性（中程度の敏感性を含む）として記録された。各試験は１回行われた。ＣＤＣＢＡを使用しそして培養物を嫌気培養したこと以外は同じ工程を偏性嫌気性細菌１６−１９で繰り返した。結果は表１０Ａ−Ｃに示されている。結果。特性の結果は表１−１０に示されている。全ての細菌は標準的な培養および生化学基準に従い同定された。実施例３ブロイラー鶏を用いる生体内実験サルモネラ。 National Veterinary Services Laboratory，Ames，IA 50010 から得られたＳ．チフィムリウムの主要な飼鳥単離体を我々の研究室でノボビオシン（ＮＯ）およびナリジキシン酸（ＮＡ）に対する抵抗性に関して選択しそして２５ｍｇのＮＯおよび２０ｍｇのＮＡ／ｍｌを含有する培地中に保った。抗原投与接種材料は、予めトリプチカーゼ大豆ブロスの中に３回移されそして殺菌性のホスフェート−緩衝された食塩水中で４×１０⁴ｃｆｕ／１．０ｍＬの濃度に殺菌的に希釈した。抗原投与接種材料の生存細胞濃度は明るい緑色の寒天（ＢＧＡ）板上での集団数により確認された。実験研究において抗原投与を受けた鶏からのＮＯ−ＮＡ抵抗性単離体を培養するために使用された培地は、他の細菌および非抵抗性サルモネラの成長を抑制するために、２５ｍｇのＮＯおよび２０ｍｇのＮＡ／ｍＬを含有していた。実験設定。雄のブロイラー鶏を孵化１日目に商業的な孵化場から得てそして畜舎の床の松葉積の上に入れた。鶏を連続的照射下に保ちそしてそれは水および National Research Council（1984）により推奨された水準の臨界養分を含有しているかまたはそれを越えた薬品の入っていないトウモロコシおよび大豆ひきわり飼料は自由に摂取できた。鶏輸送箱からの紙ライナーおよび３つの不規則的に選択された２５ｇの配給飼料サンプルを緩衝ペプトン水、セレナイトシスチンブロス中で、そしてＢＣＡ板上で以上で記載されている通りに連続的に培養し（An drews et al.，1978，Isolａtion and Identification of Salmonella，In: Che m.，Washington，D.C.，Chapter 6，1-24）そしてサルモネラに関して試験した。サルモネラ種は紙ライナーまたは配給飼料の中では検出されなかった。鶏を無作為に二群に指定しそして１）処置なし（対照）または２）特性培養（ＣＣ）をそれらの最初の飲料水で与えた。ＣＣは実施例１の連続流培養物からの流出液として集められ、約１０⁸の嫌気性ｃｆｕ／ｍＬを含有しており、そして飲料水に１．５の比で（１部のＣＣ、４部の水）加えられた。処置された鶏は処置された水を１８時間与えられ、そして各々の鶏は１０ｍＬのＣＣ処置された水を飲んだと推定された。１８時間後に、残りの処置された水を除去しそして新しい水道水と交換した。３日目、ＣＣ処置後２日間およびサルモネラ抗原投与前に、各群中の１０羽の鶏を無作為に選択しそして頸部脱臼により安楽死させた。盲腸内容物中のプロピオン揮発性脂肪酸（ＶＦＡ）の濃度および合計ＶＦＡ濃度（酢酸＋プロピオン酸＋酪酸＋イソ酪酸＋吉草酸＋イソ吉草酸）を気体液体クロマトグラフィーにより以前に報告されている通りにして測定した（Corrier et al.，1990，Avian Dis.，34:617-625）。全ての残りの鶏は盲腸細菌の新しく製造された培養物の効果を評価するために推奨されている１０⁴ｃｆｕのＳ．チフィムリウムを生後３日間にわたり作物胃管栄養法により抗原投与した（Mead et al.，1989，J．Food Protect.，52:500- 502）。生後１０日に、各群の２０匹の鶏を安楽死させそして各々の鶏からの盲腸内容物を無菌的に集めそして以下に記載されている通りにしてＳ．チフィムリウム集落形成に関して評価した。生後１０日の安楽死した鶏のうちの１０羽からの盲腸内容物を無作為に選択しそしてＶＦＡ濃度を上記の通り測定した。この実験設定を新しく孵化した鶏を用いて別個の４回の試験で繰り返しそして同定された盲腸細菌を連続流培養において５日間（試験１）、２６日間（試験２）、４０日間（試験３）、および６１日間（試験４）保った。盲腸内容物中のＶＦＡの濃度を試験２、３、および４で測定したが試験１では測定しなかった。処置した鶏の盲腸内容物中のプロピオン酸の濃度は試験２、３、および４において３日目および１０日目に対照と比較して意義あるほど（Ｐ＜．００５）上昇した（表１１）。さらに、生後３日の処置された鶏における盲腸プロピオン酸の増加した濃度と生後１０日の処置された鶏の盲腸内容物におけるサルモネラの数におけるｌｏｇ₁₀減少（ｒ＝−．９９）との間に意義ある相互関連性（Ｐ＜．００５）が生じた。３日目に、処置された鶏の盲腸内容物中の合計ＶＦＡの濃度は対照鶏と比較して意義あるほど（Ｐ＜．０１）上昇した（表１２）。さらに、生後３日の処置された鶏における盲腸プロピオン酸の増加した濃度と生後１０日の処置された鶏の盲腸内容物におけるサルモネラの数におけるｌｏｇ₁₀減少（ｒ＝−．６７）との間に意義ある相互関連性（ＰＰ＜．０１）が生じた。１０日目に、処置された鶏の盲腸中の合計ＶＦＡの濃度は試験３および４において対照鶏と比較して意義あるほど上昇した（Ｐ＜．０５）。Ｓ．チフィムリウムによる盲腸集落形成。上記の如く、各鶏からの１つの盲腸を無菌的に除去し、はさみで砕き、そして３０ｍＬのセレナイト−シスチンブロス中で３７℃において２４時間培養した。培養後に、ブロスをＢＧＡ板上で画線し、２４時間培養しそして典型的なＳ．チフィムリウムに関して試験した。残りの盲腸からの内容物の一部（．２ｇ）を順次希釈しそしてＢＧＡ板上で１：１００、１：１０００、および１：１０，０００の希釈度で塗抹−板培養した。板を３７℃において２４時間培養しそしてＳ．チフィムリウムのｃｆｕ数を自動的集落計（Biotran III，New Brunswick Scientific，Edison，NJ）を用いて測定した。典型的なサルモネラ集落がトリプル糖鉄寒天およびリシン鉄寒天（Difco Laboratories，Detroit，MI）上での生化学試験により確認されそしてさらにサルモネラＯ抗血清、１３群、因子１、４、１２、１５（Difco Laboratories，De troit，MI）を用いて血清学的にＳ．チフィムリウムであると同定された。サルモネラ集落板数は盲腸内容物のグラム当たりのｌｏｇ₁₀サルモネラとして表示された。１：１００希釈度においてサルモネラ−培養−陰性であったがセレナイト −シスチン中での培養後に陽性であった盲腸内容物は自由裁量で１．５０のｌｏｇ₁₀サルモネラ／ｇの盲腸内容物の値が指定された。ＢＧＡ板上で陰性であったセレナイトシスチン培養物は０のｌｏｇ₁₀ サルモネラ／ｇの盲腸内容物の値が指定された。サルモネラ抗原投与に対する抵抗性に関するＣＣ処置の効果を評価するために、「保護因子」（ＰＦ）を上記の通りにして計算した（Pivnick and Nurmi，198 2，The Nurmi Concept and its Role in the Control of Salmonellae in Poult ry，In: Developments in Food Microbiology，Davies(ed.)，Applied Sciences Publishers，London，41-70; Mead et al.，1989，J．Food Protect.，52:500- 502）。ＰＦ＝（平均ｌｏｇ₁₀サルモネラ対照群／平均ｌｏｇ₁₀サルモネラ処置群）。群の間のＳ．チフィムリウム培養−陽性鶏の数における差をｃｈｉ−平方分析により分析した。平均間の差をスチューデントｔ試験を使用して測定した。相互関連性の意義および全ての統計学的工程は記載されている通りにして行われた（ Snedecor and Cochran，1967，Statistical Methods，６th ed.，Iowa Atate Un iversity Press，Ames，IA）。対照と比較して、処置された鶏の盲腸内容物におけるＳ．チフィムリウムの数はそれぞれ試験１、２、３および４の各々において６．３５、５．３９、３．８４、および５．７７ｌｏｇ₁₀だけ意義あるほど（Ｐ＜．００５）減少した（表１３）。同定された培養物の効果を評価するために計算された保護因子はそれぞれ試験１、２、３および４に関しては６２．５、７．１４、１５．２、および１０．６であると測定された。１０⁴のＳ．チフィムリウムの実験的抗原投与量は生後１０日間で３種の試験で対照において９０％〜１００％で盲腸集落形成を生じた（表６）。対照と比較して、処置群のサルモネラ盲腸培養−陽性鶏の数はそれぞれ試験１、２、３、および４の各々において１００％、６５％、７５％、および６０％だけ意義あるほど（Ｐ＜．０１）減少した。実施例４共生体の製造引用することにより本発明の内容となる１９９２年７月２９日に出願された特許出願番号０７／９２１，１７３に記載されている通りにして、本発明の連続的培養方法を用いて第二の定常状態培養物を製造した。ＣＦＩＩと指定された定常状態の培養物は４種の通気性嫌気性グラム−陽性球菌、２種の通気性嫌気性グラム−陽性棹菌、１種の偏性嫌気性グラム−陽性棹菌、および１種の偏性嫌気性グラム−陽性球棹菌を含む１１種の細菌からなっていた。細菌は、（１）エンテロコッカス・フェカリス（株Ａと指定された）、（２）エンテロコッカス・フェカリス（株Ｂと指定された）、（３）エンテロコッカス・アヴィウム、（４）ラクトコッカス・ラクチス、（５）ラクトバシルス種（ＣＭＳと指定された）、（６）ラクトバシルス・アニマリス、（７）シトロバクター・フレウンディイ、（８）大腸菌、（９）エシャリチア・フェルグソニイ、（１０）ビフィドバクテリウム・アニマリス、および（１１）プロピオニバクテリウム・アシジプロピオニシであると同定された。定常状態の培養物は家禽に投与された時に共生体としてかなりの有効性を示し、サルモネラ・チフィムリウムおよびＳ．エンテリチジスによる家禽の集落形成を未処置の鳥と比較して意義あるほど減少させた。前記の詳細な記述は単に説明用に示されていること並びに本発明の精神および範囲から逸脱しない限り修正および変更をここで行えることは理解されよう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ，

Claims

【特許請求の範囲】１．実質的に生物学的に純粋な細菌の集団を含む家禽のサルモネラ集落形成を抑制するための組成物であって、該細菌がＩ．通気嫌気性グラム陽性球菌：（１）第一エンテロコッカス・フェカリス株、（２）第二エンテロコッカス・フェカリス株、（３）第一エンテロコッカス・フェシウム株、（４）第二エンテロコッカス・フェシウム株、（５）第三エンテロコッカス・フェシウム株、（６）エンテロコッカス・アヴィウム、（７）第三エンテロコッカス・フェカリス株、 II．通気嫌気性グラム陽性球棹菌：（８）ラクトコッカス・ラクチス、（９）第一ラクトバシルス株、 III.通気嫌気性グラム陰性棹菌：（１０）第一大腸菌株、（１１）シトロバクター・フレウンディイ、（１２）エンテロバクテリアセア族に属する細菌、（１３）シュードモナス種、（１４）セラチア・リクエファシエンス、（１５）第二大腸菌株、 IV．偏性嫌気性グラム陽性棹菌：（１６）第一プロピオニバクテリウム種、（１７）第二プロピオニバクテリウム種、（１８）第二ラクトバシルス株、（１９）第一ビフィドバクテリウム株または第三ラクトバシルス株、（２０）第三プロピオニバクテリウム株、（２１）第一ユウバクテリウム株、（２２）第二ユウバクテリウム株、（２３）株ＯＡＧＰＢ−５と指定された未知の細菌、（２４）第三ユウバクテリウム株、（２５）第二ビフィドバクテリウム株または第四ラクトバシルス株、（２６）第三ビフィドバクテリウム株または第五ラクトバシルス株、（２７）第四プロピオニバクテリウム株、Ｖ．偏性嫌気性グラム陰性球菌：（２８）ヴェイロネラ種、および VI．偏性嫌気性グラム陰性棹菌：（２９）フソバクテリウム種の全てを含む、組成物。２．該組成物がＡＴＣＣ預託番号５５５１５を含むか、および／または該組成物が該細菌の２６を含むか、および／または該組成物が該細菌の２７を含むか、および／または該組成物が該細菌の２８を含むか、および／または該組成物が該細菌の全てを含むか、および／または該組成物がさらにラクトースを含むか、および／または該組成物がさらにグラム陽性細菌に対して活性でないコクシジオスタトを含むか、および／または該組成物がさらに担体を含むか、および／または該組成物の該細菌がカプセル化されている、請求の範囲第１項記載の組成物。３．請求の範囲第１項記載の組成物と組み合わされた動物飼料を含む飼料製品。４．実質的に生物学的に純粋な細菌の集団を含む組成物を家禽に投与することを含む家禽のサルモネラ集落形成を抑制する方法であって、該細菌がＩ．通気嫌気性グラム陽性球菌：（１）第一エンテロコッカス・フェカリス株、（２）第二エンテロコッカス・フェカリス株、（３）第一エンテロコッカス・フェシウム株、（４）第二エンテロコッカス・フェシウム株、（５）第三エンテロコッカス・フェシウム株、（６）エンテロコッカス・アヴィウム、（７）第三エンテロコッカス・フェカリス株、 II．通気嫌気性グラム陽性球棹菌：（８）ラクトコッカス・ラクチス、（９）第一ラクトバシルス株、 III.通気嫌気性グラム陰性棹菌：（１０）第一大腸菌株、（１１）シトロバクター・フレウンディイ、（１２）エンテロバクテリアセア族に属する細菌、（１３）シュードモナス種、（１４）セラチア・リクエファシエンス、（１５）第二大腸菌株、 IV．偏性嫌気性グラム陽性棹菌：（１６）第一プロピオニバクテリウム種、（１７）第二プロピオニバクテリウム種、（１８）第二ラクトバシルス株、（１９）第一ビフィドバクテリウム株または第三ラクトバシルス株、（２０）第三プロピオニバクテリウム株、（２１）第一ユウバクテリウム株、（２２）第二ユウバクテリウム株、（２３）株ＯＡＧＰＢ−５と指定された未知の細菌、（２４）第三ユウバクテリウム株、（２５）第二ビフィドバクテリウム株または第四ラクトバシルス株、（２６）第三ビフィドバクテリウム株または第五ラクトバシルス株、（２７）第四プロピオニバクテリウム株、Ｖ．偏性嫌気性グラム陰性球菌：（２８）ヴェイロネラ種、および VI．偏性嫌気性グラム陰性棹菌：（２９）フソバクテリウム種の全てを含み、該組成物が該家禽の腸のサルモネラ集落形成を抑制するのに有効な量で投与される、方法。５．該組成物がＡＴＣＣ預託番号５５５１５を含むか、および／または該組成物が該細菌の２６を含むか、および／または該組成物が該細菌の２７を含むか、および／または該組成物が該細菌の２８を含むか、および／または該組成物が該細菌の全てを含む、請求の範囲第４項記載の方法。６．該家禽が飼鳥である、請求の範囲第４項記載の方法。７．該飼鳥が鶏、七面鳥、鴨、鶉および鵞鳥よりなる群から選択され、並びに／または該飼鳥が生後１４日以内である、請求の範囲第６項記載の方法。８．さらにラクトースを該家禽に投与し、および／またはグラム陽性細菌に対して実質的に活性でないコクシジオスタトを投与する、請求の範囲第４項記載の方法。９．細菌の該集団が担体と共に投与され、および／または該細菌がカプセル化されている、請求の範囲第４項記載の方法。１０．投与段階が、該集団を該家禽に好適には該家禽用の飼料および／または水と組み合わせて経口的に投与すること、並びに／或いは該集団を該家禽に噴霧すること、並びに／或いは該集団を該家禽の総排泄腔と接触させることを含む、請求の範囲第４項記載の方法。１１．（ａ）培養培地に成長した家畜の糞便、盲腸内容物または台帳内容物を接種し、そしてバッチ培養で嫌気性条件下で培養して中間体培養物を与え、（ｂ）該中間体培養物を連続的培養で約０．０２９〜約０．１０時間^-1の間の反転速度、約４．７〜６．５の間のｐＨにおいて、嫌気性条件下で定常状態を制定するのに十分な時間にわたり培養し、そして（ｃ）定常状態の培養物を段階（ｂ）から回収することを含む、家畜のサルモネラ集落形成を抑制するために有効な共生体の単離方法。１２．さらに（ｄ）（ｃ）から回収された該定常状態の培養物を該家畜におけるサルモネラ集落形成の抑制に関してふるいわけることも含む、請求の範囲第１１項記載の方法。１３．該家畜が家禽である、請求の範囲第１１項記載の方法。１４．該バッチ培養物の培養段階が約６−１８時間続けられ、および／または該バッチ培養物中のｐＨが約５．５に保たれ、および／または該バッチ培養物の培養段階が光学密度が少なくとも約１．０に達するまで続けられ、および／または該バッチ培養物の培養段階がｐＨが約４．２に達した後に約２時間以内にわたり続けられ、および／または反転速度が約０．０４１６時間^-1でありそして該連続的培養における該ｐＨが約５．５であり、および／または該バッチ培養物中のｐＨが４．２以下であり、および／または該バッチ培養物および該連続的培養の温度が約２６℃〜４７℃の間である、請求の範囲第１１項記載の方法。１５．該培養培地がラクトースを含有する、請求の範囲第１１項記載の方法。１６．ふるいわけ段階が、（１）試験家畜を準備しそしてそれに（ｃ）からの該定常状態の培養物を投与し、（２）未処置の対照動物を準備し、（３）該試験動物および該対照動物を２−３日間保ち、（４）該試験動物および該対照動物の盲腸内容物のプロピオン酸濃度および合計揮発性脂肪酸濃度を測定し、そして（５）該試験動物からのプロピオン酸濃度および合計揮発性脂肪酸濃度を該対照動物と比較することを含み、（１）該試験動物におけるプロピオン酸の濃度が約１０ミリモル／ｇの盲腸内容より大きいかまたは等しい、および／または（２）該試験動物における合計揮発性脂肪酸濃度が該対照動物より約１００％またはそれ以上である時に、該定常状態の培養物が該家畜におけるサルモネラ集落形成を抑制するために有効であると判定される、請求の範囲第１２項記載の方法。１７．該合計脂肪酸濃度が酢酸およびプロピオン酸および酪酸およびイソ酪酸および吉草酸およびイソ吉草酸の濃度を含む、請求の範囲第１６項記載の方法。１８．請求の範囲第１２項記載の方法により製造される共生体。１９．（ａ）試験家畜を準備しそしてそれに試験しようとする細菌の組成物を投与し、（ｂ）未処置の対照動物を準備し、（ｃ）該試験動物および該対照動物を２−３日間保ち、（ｄ）該試験動物および該対照動物の盲腸内容物のプロピオン酸濃度および合計揮発性脂肪酸濃度を測定し、そして（ｅ）該試験動物からのプロピオン酸濃度および合計揮発性脂肪酸濃度を該対照動物と比較することを含む家畜のサルモネラ集落形成を抑制するための共生体としての有効性に関して細菌の組成物をふるいわける方法であって、（１）該試験動物におけるプロピオン酸の濃度が約１０ミリモル／ｇの盲腸内容より大きいかまたは等しい、および／または（２）該試験動物における合計揮発性脂肪酸濃度が該対照動物より約１００％またはそれ以上である時に、該定常状態の培養物が該家畜におけるサルモネラ集落形成を抑制するために有効であると判定される、方法。２０．該合計脂肪酸濃度が酢酸およびプロピオン酸および酪酸およびイソ酪酸および吉草酸およびイソ吉草酸の濃度を含む、請求の範囲第１９項記載の方法。２１．該動物が家禽である、請求の範囲第１９項記載の方法。２２．請求の範囲第１９項の方法により製造される、家畜のサルモネラ集落形成を抑制するために有効な細菌の組成物。