CN1063091C

CN1063091C - 一种功能食品免疫牛奶

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Publication number: CN1063091C
Application number: CN97116846A
Authority: CN
Inventors: 黄河
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-09-01
Filing date: 1997-09-01
Publication date: 2001-03-14
Anticipated expiration: 2017-09-01
Also published as: CN1210017A

Abstract

本发明公开了一种免疫牛奶，该牛奶是以甲肝、乙肝抗原和幽门螺旋杆菌抗原制备的复合疫苗免疫奶牛而生产的免疫牛奶，具有抗甲肝病毒、乙肝病毒和幽门螺旋杆菌的作用，其免疫活性效价高，特异性强。无任何毒副作用。

Description

一种功能食品免疫牛奶

本发明涉及一种功能食品免疫牛奶，本发明还涉及一种制备免疫牛奶的方法，具体涉及以免疫方法生产具有抗病毒和抗幽门螺旋杆菌免疫能力的功能性食品免疫牛奶的方法，属于食品领域。

牛奶的营养价值与健身美容价值自古以来一直为人类所重视。在现代生活中，为了提高牛奶的饮用价值与营养价值，特别是因中小学生与老年人的需要，更注重了提高保健价值的研究，在口味、品种与方法上精益求精。以生物科技研制的免疫牛奶，成为当今食品科技的基本方向，是世纪交替时代的最新科技成果。

对于免疫牛奶的研究，经历了多年的探索与实践过程。Sharpe-SJ等人以一种多价疫苗为抗原，反复免疫奶牛制成了一种可以降低血浆胆固醇及血压的脱脂免疫奶粉；Ishda-A等人以各种人类肠道杆菌，包括E.Coli，S.typhimurium，S.dysenteriae等26种细菌，为抗原，免疫奶牛，用所得的免疫牛奶让AKR/J小鼠口服，结果表明这种免疫牛奶可以减少细菌从肠道侵袭到其他器官中的数目，加强同肠道相关的淋巴组织对抗肠道细菌侵袭的能力。EP0143345公开了一种超免疫牛奶，可用于治疗心血管疾病和肺部疾病。EP0330521公开了一种抗高血压的免疫牛奶，该文献是利用常规的生物化学方法从牛奶中分离抗高血压因子的方法。尽管以往对免疫牛奶进行了多方面的研究，但是，对免疫牛奶的研究多数只停留在单疫苗免疫或“双抗法”免疫的方法上，实践证明，单个疫苗免疫后效果不佳，产生的抗体主要集中在血液中，乳液中抗体含量不高，所制备的免疫牛奶不能达到实用商业价值。而且，到目前为止，尚未见有关使用采自人体的甲肝、乙肝病毒和幽门螺旋杆菌作为复合抗原来制备免疫牛奶的文献报道。特别是，幽门螺旋杆菌的发现，对治疗该细菌相关性疾病，如胃炎、胃十二指肠溃疡、胃癌等，产生了重大的技术性突破，然而，由于幽门螺旋杆菌的特殊生长环境，到目前为止，也没有找到一种能够对幽门螺旋杆菌具有特异性的抗菌素，来有效的杀死该细菌，给该细菌相关性疾病的治疗带来了许多困难。寻求一种对幽门螺旋杆菌有免疫特异性的活性物质是一种较好的治疗途径。

幽门螺旋杆菌(Helicobacterpylori，HP)是一种螺旋型的革兰氏阴性微需氧菌，存在于人类的胃部。这种细菌经口侵入人体后存在于胃粘膜上皮表面的粘液层中，能直接穿透这层粘液层粘附于下面的上皮细胞，存活多年甚至使宿主终生携带，在我国感染率达70％以上。在临床及流行病学上具有重要意义。

在HP中，有一种大分子蛋白位于其表面，即表面暴露蛋白，也就是幽门螺旋杆菌外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)，OMP除起到结构作用外，还决定着细菌的活性性质，例如，担负着决定什么物质可以进入细菌，什么物质可以分泌出细胞，以及细菌同它所在环境的相互作用等方面的重要作用，而且，OMP具有较强的免疫原性。尤其是HP外膜蛋白具有抑制人类白细胞趋化的作用，从而干扰机体的免疫功能，这是HP的真正致病机理。HP是通过一种粘附素紧紧地粘附于人胃上皮细胞表面，尤其特异性地粘附于含有甘油脂的受体表面，无粘附素的HP菌株则不象有粘附素的那样粘附紧密，而这粘附素就是OMP成分之一。因此，具有HP特异性抗原的制备非常重要，不仅在HP感染的特异性血清学诊断上有巨大价值，而且在研究HP致病机理，以致于HP免疫制剂的制备也具有重大意义。但是，在HP菌株表面抗原中存在着与空肠弯曲菌的交叉抗原，在组织学检菌和细菌培养的正确性，特别是在HP免疫制剂的制备应用上，受到很大影响。研究表明，第一代全菌抗原和第二代超声粉碎抗原均易与空肠弯曲菌等成分发生交叉反应，因此，目前在提取HP种特异性纯化抗原方面存在一定的难度，限制了幽门螺旋杆菌疫苗的制备，也给具有抗HP活性的免疫牛奶的制备带来了困难。到目前为止，还没有一种能够有效的抗HP免疫制剂，也没有一种抗HP的免疫牛奶问世。

本发明目的是克服现有技术的缺陷，提供一种能够有效地抵抗甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒以及幽门螺旋杆菌的免疫牛奶；

本发明的另一个目的是提供一种制备所述抵抗甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒以及幽门螺旋杆菌的免疫牛奶的方法；

本发明的另一个目的是提供一种制备幽门螺旋杆菌纯化抗原的方法。

本发明的另一个目的是提供一种制备免疫牛奶所用的复合疫苗的制备方法。

本发明免疫牛奶的制备技术方案包括如下步骤：

一、奶牛质量的挑选

选择一至二胎，产后一至二个月的健康并强壮的奶牛，须有防疫证明。特别注意间隔开每头牛的平均干奶期。一般要求奶牛的牛奶日产量不小于15-25KG。

二、饲养场的要求

符合卫生防疫的要求；饲料充足，新鲜；水质、空气、饲料无污染；有足够的阳光与空地；牛舍卫生，水源充足，排泄冲洗系统良好；通风、冬天保暖；有实验室。

三、复合疫苗的制备

(一)、乙肝抗原的制备：

因为乙肝病毒(BHV)目前还不能进行细胞培养，我们的乙肝疫苗制备采用常规方法。(见《乙型肝炎与疫苗问答》第97页，1987年黑龙江人民出版社出版)

由人类无症状HBsAg携带者血浆提取HBsAg，菌种的筛选与纯化非常重要，完全排除外来的和潜在的病毒及各种微生物，经纯化、提炼、层析，除去人血浆蛋白质，纯化出HBsAg，再进行灭活，最后加佐剂吸附后制成，浓度为10-30微克/ML。其基本工艺流程如下：

人类无症状HBsAg携带者血浆--除纤维蛋白--硫酸铵沉淀--等密度区带离心--速率区带离心--胃蛋白酶消化--灭活--吸附--防腐--疫苗。

由该方法制得的疫苗可在市场上获得，其商品名为“乙型肝炎血源疫苗”，卫生部武汉生物制品研究所制，批号(91)卫药准字(汉)S-06号。

(二)、甲肝抗原的制备(所用方法见专利文献89106580.6和92114998.0)

(1)、于甲肝爆发点筛取甲肝患者，筛取甲肝IgM检测阳性者，于急性黄疸出现前，取其粪便。

(2)、以PBS洗涤液制成悬液，以PEG沉淀，以差速离心进行抽提，再以超高速离心沉淀，以50倍浓缩于PBS中。

(3)、以上初步纯化的提取物直接在分离培养基上划线接种。于牛心、牛脑浸出液琼脂培养，在37℃微需氧条件(75％N₂，15％O₂，10％CO₂)饱和湿度下吸附培养2小时，然后用2％小牛血清及1％乳清蛋白维持。置36℃培养箱中培养。

(4)、连续培养5周，每周换维持液一次，最后去维持液，用胰蛋白-乙二胺四乙酸液消化。细胞被离心收集后，以超声破壳处理，抽提HAV。

(5)、以上方法连续传15代。每代以直接免疫荧光监视HAV病毒的增值。

(6)、以后用32℃继续连续再培养5代。

(7)、将上述病毒株接种于人胚肺二倍体细胞中，置32℃恒温培养箱中培养，每28天传一代，连续传5代。得甲型肝炎病毒H2减毒株。将病毒减毒株冻存在-70℃培养基中。

实验证明，用以上方法制取的甲肝减毒疫苗，已不能引起肝细胞病变，失去口服感染的能力，毒力已几乎不存在。人与动物接触后，血清谷丙转氨酶均无异常升高，证明以上疫苗是相当安全的。但却具有相当强的免疫原性，能诱导抗体产生，是一种较为理想的，实用的甲肝免疫疫苗。而且，遗传性相当稳定，连续传代不发生返祖现象。

将上述甲肝病毒减毒株于人胚肺二倍体细胞中连续培养2代，溶于含氨基酸的盐平衡溶液中，再经纯化，抽提，消毒，最后制得甲肝疫苗。上述方法制得的疫苗可在市场上获得，商品名为“甲型肝炎减毒活疫苗(H₂减毒株)”，由浙江省医学科学院普康生物技术公司制造，批准文号为(95)卫药准字(浙医科院)S-01号。

(三)、幽门螺旋杆菌抗原的制备：

1、试剂、材料、仪器

A、培养基

(1)、牛心、牛脑浸出液琼脂

(2)、WCG无血清培养基

(3)、空肠弯曲菌选择性琼脂基础

(4)、胎儿弯曲杆菌琼脂基础(Campylobacter AgarBase)

以上2、3、4培养基均为美国Sigma公司及美国BIORAD等公司产品。

B、菌株

HP菌株来自胃镜活检标本的分离培养，包括慢性胃炎和消化性溃疡病例。

C、试剂

(1)、分子量标准蛋白(17.5-94KD)

(2)、三羟甲基氨基甲烷

(3)、三硝基甲苯

(4)、辛基吡喃葡糖苷

(5)、十二烷基肌氨酸钠

(6)、EDTA：乙二氨四乙酸

(7)、Tween-20 TEMED烯酰氨，双撑丙烯酰氨

(8)、硫酸氨、氯化钠、PBS洗涤液等。

(9)、抗生素组合(万古霉素、二性霉素、TMP、多粘菌素B等)

D、仪器

电泳槽与电泳仪、分光光度计、离心机、磁力搅拌机、恒温水浴仪等。

2、菌株与培养条件

HP分离培养的关键在于及时处理标本，培养基和微需氧培养条件的选择。

培养基利用脑、心浸出液的血琼脂固体培养基(培养基为自制培养基，其基本组成为：利用新鲜小牛脑、心组织，其比例为6∶4，粉碎，匀浆，超声粉碎后过滤，6000转15分钟离心取上清液)加入10％的小牛血清，琼脂粉(琼脂干粉0.5％)，加热，在未凝结前加入以下物质，物质数量为总量的10％左右：半胱氨酸、蛋白胨及抗生素组合，所述的抗生素组合是在1604常规培养液(其比例为：

每1000ml中加入

L-精氨酸 200mg L-组氨酸 15mg

L-天冬酰胺 50mg L-天冬氨酸 20mg

L-胱氨酸 50mg L-羟基脯氨酸 20mg

L-谷氨酸 20mg L-谷酰氨 300mg

谷胱甘肽 1.0mg 甘氨酸 10mg

L-异白氨酸 50mg L-白氨酸 50mg

L-赖氨酸盐酸盐 40mg L-蛋氨酸 15mg

L-苯基代丙氨酸 15mg L-脯氨酸 20mg

L-丝氨酸 30mg L-苏氨酸 20mg

L-色氨酸 5mg L-酪氨酸 20mg

L-异戊氨酸 20mg 维生素H 0.2mg

泛酸钙 0.25mg 胆碱 3mg

叶酸 1mg i-肌醇 35mg

淤酰胺 1mg 对氨基安息香酸1mg

盐酸维生素B6 1mg 核黄素 0.2mg

盐酸硫胺素 1mg KCL 400mg

CuCL 600mg 硝酸钙 100mg

磷酸氢钠 1512mg 硫酸镁 100mg

葡萄糖 2000mg 酚红 5mg

以上组合以干冰或CO₂调节PH值到7-7.2为止。)中再加入总量为5％-10％的万古霉素(约10％)，二性霉素(20％)，TMP(5％)，多粘菌素B(55％)。在空肠弯曲菌选择性琼脂基础，WCG无血培养基和胎儿弯曲杆菌琼脂基础(Campylobacter AgarBase)中补充以10％马血和羊血，抗生素组合(组成同上)。制成平板后，置4℃冰箱待用。

将活检组织直接在分离培养基(即以上培养基)上划线接种。在37℃微需氧条件(85％N₂，10％O₂，5％CO₂)饱和湿度下培养72小时，菌株冻存在-2℃含15％甘油的布氏肉汤培养基中。

在无菌条件下，用棉签轻轻刮取血平板表面的HP洗在0.05M的PBS(PH7.1)液体中，离心3000r/min×10min，用PBS洗涤3-4次，备用。

3、粗提全菌蛋白

取HP备用菌离心2000转/分×15分，去上清液，加入20ml0.05M PBS使细菌充分悬浮后，移至烧杯中，水浴震荡，缓慢滴加约2ml 10％的SDS，至菌液澄清透亮后，置于冰浴中进行超声粉碎(300mA×1分钟，间隔1分钟，4-5次)，离心8000r/min×20min，取上清液。以紫外分光光度计检测上清液中蛋白含量(OD₂₆₀及OD₂₈₀)，按下面公式计算其浓度(mg/ml)。

C(蛋白)=1.45×OD₂₈₀-0.74×OD₂₆₀加入等量甘油分装，置-20℃备用。

4、外膜蛋白的制备(纯化外膜蛋白OMP)

ODG(辛基吡喃葡糖苷)提取：

取HP备用菌培养48小时，培养方法是按常规培养条件，即取上述粗提的全菌蛋白，加等量1604培养液，无菌条件下，恒温37℃培养。用PBS洗涤，离心沉淀后使之悬浮于0.6％W/L ODG(辛基吡喃葡糖苷)中，震荡1小时提取外膜蛋白，离心2次6000r/min×15分钟，取上清液，二次取得的上清液相加再离心30000r/min×30分钟，在取上清液，加入硫酸铵至5％浓度，4℃过夜孵育离心35000r/min×25分钟，取沉淀悬浮于含0.15M NaCL的0.05M三羟甲基氨基甲烷中。

5、硫酸铵分段盐析

将提取的外膜蛋白进行提纯，提纯方法如下：用0.05M PBS(PH7.2条件)稀释蛋白质，缓慢加入硫酸铵，同时用磁力搅拌机搅拌，4℃过夜，离心2000r/min×30分钟，取上清液。按1∶0.5-1∶1的比例加入0.05M PBS溶解，再次以硫酸铵按不同的饱和度(最终饱和度分别为：30％，50％，80％，100％)进行盐析，分别取得不同纯度的外膜蛋白。(盐析按下表)

硫酸铵起始饱和度硫酸铵最终饱和蛋白体体积固体硫酸铵用量

％度％ ml g

0 30 15 2.64

30 50 15 1.905

50 80 15 3.210

80 100 15 2.295

测定OD260及OD280，按上述公式计算蛋白含量，分别为2.4mg/ml，3.2mg/ml，3.8mg/ml，和1.1mg/ml。加入等量灭菌甘油分装后置-20℃备用。

6、蛋白凝胶电泳(SDS-PAGE)：

采用SDS-PAGE不连续缓冲系统，分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为5％。

取以上粗提全菌蛋白及以上四种浓度的外膜蛋白各15μl，加入等量2×SDS样品缓冲液，蛋白最终浓度分别为1.2mg/ml，1.6mg/ml，1.9mg/ml，和0.6mg/ml，混匀后置100℃水浴3-5分钟。采用Tris-甘氨酸缓冲系统恒流电泳，浓缩胶20mA，分离胶30mA，待溴酚蓝指示剂移至凝胶下缘1cm处，终止电泳，染色后，观测结果如下：

HP全菌蛋白的不同菌株超声粉碎后经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，共有7条主要蛋白条带，其分子量分别为128KD，74KD，64KD，61KD，43KD，34KD，31KD和12KD。次要蛋白条带略有差异。但具有HP特异免役原性的抗原只有61KD，48KD与31KD。因此，未经提纯的HP全菌蛋白特异性不强。

而提取的HP外膜蛋白(OMP)经SDS-PAGE结果显示，纯化的OMP只含有分子量为31KD和61KD二条主要蛋白带。并且其主要蛋白带61KD不与空肠弯曲菌发生交叉反应，具有HP外膜蛋白特异抗原性。

将提取的OMP蛋白液和粗提的全菌蛋白作CLO试验，可知也包含了尿素酶成分。证实了是HP外膜蛋白的有效成分。

7、将提纯的HP菌OMP抗原，于56℃1小时水浴灭活，饱和硫酸氨溶液沉淀，透析后低温(4-6℃)保存备用。

(四)复合疫苗的制备：

将羊毛脂与石蜡油按3∶1混合，然后取与抗原体积总量相等的体积比例倒入研钵，逐步磨进抗原。甲肝、乙肝抗原各约60-90μg，最后加进幽门螺旋杆菌抗原300-500μg，同样磨合。抗原总量的体积总共约7-10ml，制成不完全佐剂。最后按总体积的约2％研磨进结核菌或卡介苗与同体积的多聚核苷酸、水杨酸、镁盐，制成完全佐剂。最后组成复合疫苗制剂，并必须在6小时内使用完毕，备用时储存于4-6℃冰箱中。

四、奶牛的免疫学处理

将制备好的复合疫苗于奶牛颈部颈椎两边分3-4点皮下注射。

第一阶段：每隔7-10天进行一次注射，这一过程延续4-5次。然后休息约45天。

第二阶段：再按每隔7-10天连续二次注射等量的不含佐剂的抗原疫苗。最后一次注射后第9天采样检测。如合格即可进入正常生产。

如不合格，休息一个月，再按第二阶段进行一次注射，检测再不合格，则认为牛的体质与免疫反应的个体差异，此牛只能淘汰。

五、免疫牛奶中活性物质效价检测：

采用酶标法检测。

1、试剂

1)、包被缓冲剂(PH9.6)

Na₂CO₃ 1.59克

NaHCO₃ 2.93克

蒸馏水至 1000毫升

2)、洗涤液

1M Tris(24.2克/200毫升) 10毫升

1M Hcc 8.4毫升

吐温-20 0.25毫升

蒸馏水至 500毫升

3)、稀释液

Ha₂HPO₄·12H₂O 2.9克

KH₂PO₄ 0.2克

NaCL 8.5克

吐温-20 0.5毫升

卵蛋白 1-5毫克

蒸馏水至 1000毫升

4)、底物溶液

0.05M柠檬酸(2.1克/200毫升)48.6毫升

0.1M Na₂HPO₄(7.0毫克/200毫升)51.4毫升

3％双氧水 100微升

邻苯二胺 40毫克

5)、2M H₂SO₄

2、包被

抗原：甲肝抗原；乙肝抗原；幽门螺旋杆菌抗原；

用包被液缓冲稀释(最好用96孔进口酶标板包被)，4℃过夜。包被这一步一定不能省。用作对照的普通白奶也须在冰箱内过夜。

其中：免疫奶与对照组普通白奶的稀释用稀释剂，最好先按1∶10稀释，充分搅拌，再按比例继续稀释；乙肝抗原浓度为10MG/ML，实用为200微升乙肝抗原加包被液至2毫升；甲肝抗原浓度为10MG/ML，实用为200微升乙肝抗原加包被液至2毫升；幽门螺旋杆菌抗原浓度为0.026MG/ML，实用为50微升幽门螺旋杆菌抗原加包被液至2毫升。

第二天用洗涤液洗板二至三次。用卵清蛋白(1-2％)封闭。每孔300微升。过夜。

用洗涤剂洗板二至三次，把免疫奶充分摇匀。洗清后将免疫奶作一抗加入。按比例稀释的免疫奶，与对照组的按同比例稀释的普通白奶，均用稀释剂稀释，稀释比例一般按1∶10；1∶20；1∶40；1∶80；1∶160；1∶320；1∶640等按比例上去。充分搅拌，每孔100微升，37℃温浴1-1.5小时。

用洗涤剂洗板二至三次，加二抗(羊抗牛辣根标记的，或兔抗牛的都可以，1∶1000稀释，可从市场上获得)每孔100微升，37℃温浴1-1.5小时。

用洗涤剂彻底洗板，三次以上，加底物溶液(邻苯二胺)100微升/孔，37℃温浴30分钟。

终止，用2M硫酸，50微升/孔。读板，波长492MM。

计算：样品实测OD平均数除以对照组按同比例稀释白奶的OD平均数，得出相对活性效价数。相对活性效价数大于1.2为阳性，大于1.5为合格。

六、免疫牛奶的正常生产

每次免疫学处理后第8天开始至第9天结束，是免疫奶牛乳汁中对抗对应抗原的抗体(即各种特异性免疫活性球蛋白)的生成峰值期，也就是免疫牛奶的采集期。

每次免疫学处理的间隔周期为10天以上。也就是说，当正常生成时，每10天中有2天可以采集到符合标准的免疫牛奶。非峰值期采集的牛奶一般不符合标准。

七、免疫牛奶的采集、储运、消毒、保存

按甲级牛奶的国际规定，牛奶离体2小时内必须进行快速冷冻处理。如果不具备此条件，尽可能做到牛奶离体后尽快风吹散热，并尽快分装进入冰箱(4℃)，在4℃条件下，不超过10小时内进行同位素辐射，辐射强度一般在4K左右。辐射后的牛奶效价要跌去5-10％。

八、免疫牛奶的混合、消毒、均质。

按照上述方法生产的免疫牛奶，称作免疫原乳，免疫原乳须经稀释才能形成产品，而稀释是以同类产品普通牛奶按需要以一定比例稀释。稀释比例一般为1∶1-1∶1000，优选为1∶10-1∶1000，更优选为1∶100-1∶1000。由生产厂家决定，只要求消毒时按常规牛奶巴氏消毒法，120℃时不超过半分钟(常规为4秒)。效价跌去不会超过10％，能达到免疫牛奶的监测规范的基本要求。

本发明生产的免疫牛奶其优点为：

抗病毒：特别是抗肠道病毒，包括甲肝及乙肝病毒。长期服用，可有效的抵御与降低甲型及乙型肝炎特别是肝癌的发病率，对其他病毒性疾病也有抗病毒作用。

抗幽门螺旋杆菌：长期服用，可有效地抵御与降低胃炎、消化性溃疡，特别是胃癌的发病率。任何胃炎，消化性溃疡，胃癌患者均有减轻症状的作用。本发明由于采用特定的工艺，制备的幽门螺旋杆菌抗原纯度高，纯化的HP外膜蛋白具有较强的有效的HP特异抗原性，与空肠弯曲菌无交叉反应，因此，所生产的免疫牛奶能够特异性地有效地预防与治疗幽门螺旋杆菌相关性疾病，如消化性溃疡等。

免疫活性强：本发明采用“复合疫苗-多次免疫疫苗接种法”，提高了牛奶中活性物质的含量。实践证明单个疫苗免疫后效果不佳，产生的抗体主要集中在血液中，乳液中的抗体含量不高。不能进行工业化生产而产生商业价值。由于本发明的复合疫苗相互间的作用与复杂的生理反应，乳液中抗体的含量大幅上升，免疫效价提高，达到商业价值。由于本发明采用多次疫苗接种法，使奶牛接受反复刺激，不断加强抗体的产生，比一般的疫苗接种法能得到更高浓度的免疫牛奶。

本发明的复合疫苗具有以下优点：

一是可将几种抗原聚合成大分子颗粒，激发巨噬细胞吞噬，增强免疫作用；二是油性的佐剂研磨水性的抗原，实行油包水，可在局部延缓吸收，刺激作用较持久，从而不断产生免疫作用；三是本发明所使用的佐剂，本身又称免疫诱出剂，可直接兴奋网状内皮系统，激活免疫活性细胞，增加抗原的免疫原性。

实施例

第一步，制备复合疫苗：

将羊毛脂与石蜡油按3∶1混合，然后取与抗原体积总量相等的体积比例倒入研钵，逐步磨进抗原。甲肝、乙肝抗原各约60-90μg，最后加进幽门螺旋杆菌抗原300-500μg，同样磨合。抗原总量的体积总共约7-10ml，制成不完全佐剂。最后按总体积的约2％研磨进结核菌或卡介苗与同体积的多聚核苷酸、水杨酸、镁盐，制成完全佐剂。最后组成复合疫苗制剂，备用储存于4-6℃冰箱中。

第二步，奶牛的免疫学处理：

将制备好的复合疫苗于奶牛颈部颈椎两边分3-4点皮下注射。

第二阶段：再按每隔7-10天连续二次注射等量的不含佐剂的抗原疫苗。最后一次注射后第9天采样检测。

第三步，采集免疫原乳：

在每次免疫学处理后第8天开始至第9天结束，采集符合标准的免疫牛奶。按甲级牛奶的国际规定，牛奶离体2小时内进行快速冷冻处理。

第四步，免疫牛奶的混合、消毒、均质。

按照上述方法生产的免疫原乳，按1∶1000比例用普通白奶进行稀释，按常规牛奶巴氏消毒法，120℃常规消毒4秒。制得达到免疫牛奶监测规范基本要求的免疫牛奶。

Claims

1、一种免疫牛奶，其特征在于它含有抗甲型肝炎病毒抗体、抗乙型肝炎病毒抗体和抗幽门螺旋杆菌的抗体。

2、根据权利要求1所述的免疫牛奶，其特征在于它是以甲型肝炎病毒疫苗、乙型肝炎病毒疫苗和幽门螺旋杆菌疫苗组成的复合疫苗免疫奶牛而制备的免疫牛奶，所使用的复合疫苗是按照下述方法制备的疫苗：

将羊毛脂与石蜡油按3∶1混合，然后取与抗原体积总量相等的体积比例倒入研钵，逐步磨进抗原，甲肝、乙肝抗原各约60-90μg，最后加进幽门螺旋杆菌抗原300-500μg，同样磨合，抗原总量的体积总共约7-10ml，制成不完全佐剂，最后按总体积的约2％研磨进结核菌或卡介苗与同体积的多聚核苷酸、水杨酸、镁盐，制成完全佐剂，最后组成复合疫苗制剂。

3、根据权利要求2所述的免疫牛奶，其特征在于它是以复合疫苗按照下述方法免疫接种奶牛而制得的牛奶：

将制备好的复合疫苗于奶牛颈部颈椎两边分3-4点皮下注射；

第一阶段：每隔7-10天进行一次注射，延续4-5次，然后休息约45天；

第二阶段：再按每隔7-10天进行一次注射，共注射两次，每次注射等量的不含佐剂的抗原疫苗，最后一次注射后第9天采样检测；

在每次免疫学处理后第8天开始至第9天结束，采集符合标准的免疫原乳，用普通牛奶稀释后制得免疫牛奶。

4、根据权利要求3所述的免疫牛奶，其特征在于它是以普通牛奶按1∶1-1∶1000的比例稀释免疫原乳制得的牛奶。

5、根据权利要求4所述的免疫牛奶，其特征在于它是以普通牛奶按1∶10-1∶1000的比例稀释免疫原乳制得的牛奶。

6、根据权利要求4所述的免疫牛奶，其特征在于所述的稀释比例为100-1∶1000。

7、根据权利要求2所述的免疫牛奶，其特征在于制备复合疫苗所用的幽门螺旋杆菌抗原的制备方法是：取人体幽门螺旋杆菌活体，经纯化后第三代细胞培养，采用分段盐析法一次提纯幽门螺旋杆菌的外膜蛋白，56℃1小时水浴灭活，饱和硫酸氨溶液沉淀，透析后保存备用。

8、根据权利要求7所述的免疫牛奶，其特征在于所述的分段盐析法是：将提取的外膜蛋白用0.05M PBS，PH7.2，稀释，缓慢加入硫酸铵，同时用磁力搅拌机搅拌，4℃过夜，离心2000r/min×30分钟，取上清液，按1∶0.5-1∶1的比例加入0.05M PBS溶解，再次以硫酸铵按不同的饱和度进行盐析，最终饱和度分别为30％，50％，80％，100％，分别取得不同纯度的外膜蛋白。