CN1569895A - 预防仔猪腹泻的特异性卵黄抗体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及预防仔猪腹泻的特异性卵黄抗体及其制备方法与应用。采用TSB液体培养基培养菌株和纯化获得特异菌毛黏附素蛋白，与弗氏佐剂混合制成免疫源，将该免疫原免疫产蛋鸡，获得了预防仔猪腹泻的K88ac特异性卵黄抗体。使用本发明的卵黄抗体能极显著地抑制了产肠毒素大肠杆菌K88ac对肠上皮细胞的黏附作用(p＜0.01)；添加1％的卵黄抗体粉能显著地降低了仔猪的料肉比和腹泻率(p＜0.05)，同时对仔猪的生长有一定促进作用。
Description
技术领域
本发明属于家畜疾病预防与控制技术领域，具体涉及基因工程技术的应用，涉及制备产肠毒素的大肠杆菌K88ac菌毛抗原和特异菌毛抗原卵黄抗体，它们的制备方法以及卵黄抗体用于预防仔猪腹泻，与仔猪的营养免疫有关。
技术背景
大肠杆菌既是人和动物肠道中的正常寄居菌，又能够引起疾病。在规模化养猪生产中，由大肠杆菌所引起的以仔猪腹泻为主要症状的胃肠疾病所造成的经济损失不容忽视。据报道，大肠杆菌引起的仔猪腹泻的发病率和死亡率分别占我国整个仔猪泻痢发病率和死亡率的56.2％和24.7％，给养猪业带来了巨大的损失(施启顺，猪肠毒性大肠杆菌(ETEC)病抗病育种研究.国外畜牧科技，1999，26(4)：51～54)。而肠道产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是引起幼畜腹泻为主要症状的胃肠疾病主要病原菌(Hampson.D.L.，Escherichia coil in domestic animals and humans.CAB.InternationalWallingford UK，pp：629～647，1994)。我国猪、牛、羊等幼畜ETEC性腹泻发生的比例分别为35％、26％和17％，死亡率为10％～30％(杨正时.，动物病原性大肠杆菌与大肠杆菌病。中国兽医科技，1987(6)：25～29)。猪源ETEC定居因子(colonization factor)或粘附素(adhesion)主要包括K88(F4)、K99(F5)、987P(F6)和F41，其中K88是主要致病因子。K88具有三种变异体K88ab、K88ac、K88ad。从武汉及其周边地区规模化猪场采集的腹泻仔猪粪样，通过分子生物学方法进行鉴定，大肠杆菌K88占总数的9.3％，且均为K88ac变异体。
Yokoyama等首次进行用卵黄抗体控制仔猪大肠杆菌病，他们将提纯的ETEC宿主特异性菌K88、K99和987P制成纤毛蛋白疫苗，胸部肌肉注射免疫产蛋母鸡，抗体水平达到高效价后，收集鸡蛋，分离和喷雾干燥卵黄抗体，对感染不同ETEC菌株的未吃乳初生仔猪进行卵黄抗体治疗，结果显示所有仔猪接受不同菌株感染后12小时内均发生腹泻；用效价为625和2500的抗体治疗仔猪全部存活，而对照组仔猪死亡率超过80％(Passive protective effect of chicken egg-yolk immunoglobulins against experimentalenterotoxigenic Escherichia coil infection in neonatal pigs.Infect Immun，1992，60：998～1007)。Erhard等(Prophylactic effect of specific egg yolk antibodies in diarrhea of weaned piglets caused by Escherichia coil K88.J Vet Med A，1996，43：217～223)、Imberechts等(chicken egg yolk antibodies against F18ab fimbriae ofEscherichia coil inhibit shedding of F18 positive E.coli by experimentally infected pigs.Vet.Microbiol.1997，54：329-341)和Zuniga等(Reduced intestinal colonization with F18-positive Escherichia coil in weaned pigsfed chicken egg antibody against the fimbriae.FEMS.Immunology and Medical Microbiology，1997，18：153-161)都进行了相关的研究均得到了类似的结论。胡子信等(鸡抗猪大肠杆菌卵黄抗体的研制，中国畜禽传染病，1994，2：26-27)用K88、K99、987P三价灭活苗试制了四批鸡抗猪ETEC卵黄抗体，在北京近郊五个县9个猪场近900头仔猪中进行防治试验。对于确诊为大肠杆菌引起的仔猪黄痢，白痢的治疗和预防有效率为100％(鸡抗猪大肠杆菌卵黄抗体的研制，中国畜禽传染病，1994，2：26-27)。
发明内容
本发明的目的是研制一种特异性卵黄抗体，它能预防由产肠毒素大肠杆菌K88ac引起的仔猪腹泻。该抗体的制备具有产量高、特异性强、操作简单、对环境无污染等优点，是一种绿色的抗生素替代品。
本发明通过以下技术方案实现：
一种预防仔猪腹泻的特异性卵黄抗体，是将产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichiacoli，ETEC)K88ac菌毛黏附素蛋白与弗氏佐剂混合制成特异免疫源，用该免疫源免疫健康开产母鸡，并收集被免疫的鸡所产的鸡蛋，所述鸡蛋蛋黄中含有预防仔猪腹泻的特异性卵黄抗体。
制备预防仔猪腹泻的特异性卵黄抗体的方法，其中制备特异免疫源的方法采用TSB液体培养基，37℃振荡培养产肠毒素大肠杆菌K88ac菌株，18小时后，用60℃加热-冰浴匀浆法及等电点连续沉淀法提取和纯化菌毛黏附素蛋白，然后与弗氏佐剂混合而成。
所述的从特异免疫源免疫的健康产蛋母鸡所产之鸡蛋中，分离蛋黄，喷雾干燥制成卵黄粉，该鸡蛋蛋黄中含有所述的能够预防仔猪腹泻的特异性卵黄抗体。
所述的免疫产蛋母鸡的免疫步骤是：在健康开产蛋鸡胸肌两侧分别注射500μl浓度为400μg/ml的特异免疫原，2周后胸肌两侧再分别注射500μl浓度为600μg/ml的特异免疫原。
一种预防仔猪腹泻的特异性卵黄抗体，它被作为抗生素的替代品应用于饲料，预防由产肠毒素大肠杆菌K88ac引起的仔猪腹泻。
本发明的细节由下列步骤所示：
一、K88ac菌毛抗原的制备
1.培养K88ac菌株、测定菌毛表达量
产肠毒素大肠杆菌K88ac菌株(C83715(O8：K88ac)购自中国兽药监察所。菌株复活后，以1％的接种量分别接种于装有300ml TSB培养基(即胰酶消化大豆肉汤培养基，参见：房海主编，《大肠埃希氏菌》，河北科学技术出版社，1997，)培养基成分如下：胰酪蛋白胨17g、大豆蛋白胨3g、氯化钠5g、磷酸氢二钾3.27g、葡萄糖2.5g，pH7.4，双蒸馏水定溶至1000ml的三角瓶中，于37℃震荡培养。每隔2小时取出3ml样品于5倍稀释后，在420nm处比色，记录吸光值。培养18小时后，离心收取菌液，血球计数板显微计数，调整菌液浓度为50亿菌/毫升。采用甘露糖抵抗血凝反应(Mannose-resistant hemagglutination，MRHA)检查黏附素表达情况。MRHA方法按房海主编，《大肠埃希氏菌》，河北科学技术出版社，1997，409～429报道的方法测定菌毛表达量，要求每1L菌液提取纯黏附素蛋白1.0mg以上。
2.产肠毒素大肠杆菌K88ac菌毛抗原的提取和纯化
选择复活的甘露糖抵抗血凝反应阳性K88ac菌株按0.5％的接种量接种于装有500ml TSB(胰酶消化大豆肉汤)培养基的1000ml三角瓶中37℃震荡培养18小时后，再按1％的接种量接种于装有2500mlTSB培养基的5000ml三角瓶中37℃震荡培养18小时。收集菌液，4℃离心(6,000×g)15分钟，弃去上清，用适量PBS(磷酸缓冲液)悬浮菌苔。将细菌悬液置60℃水浴锅内孵化30分钟，间断摇晃悬液；然后将菌液置于冰浴中低速匀浆5分钟；在4℃下以14000×g离心15分钟除去菌体，收集无菌体的上清液。
上清液经0.4um的滤膜过滤，在滤液中加入2.5％的柠檬酸调整pH值至4.0，在4℃下放置2小时或过夜，然后在4℃下以14000×g离心15分钟取沉淀，重新悬浮于PBS1(磷酸缓冲液1)缓冲液中；上述步骤重复2-3次，最后将沉淀物溶解于1ml 0.1M PBS2(磷酸缓冲液2)中，用SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)方法鉴定蛋白质纯度。用总蛋白测定试剂盒(购自上海科欣生物技术研究所)测定蛋白质含量。纯化后-20℃保存。
二、卵黄抗体的制备
1.K88ac菌毛抗原的提取
用接种环挑取K88ac MRHA阳性菌落接种于装有10mlTSB培养基的50ml三角瓶，37℃震荡培养18小时；分别取1ml培养液接种于6个装有2500mlTSB培养基的5000ml三角瓶37℃震荡培养18小时；重复批次培养，收集菌液，按Jin等(In vitro inhibition of adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli K88 to pigletintestinal mucus by egg-yolk antibodies.FEMS Immunology and Medical Microbiology，1998 21(4)：313-321)报道改进的方法提取和纯化K88黏附素。用总蛋白测定试剂盒(购自上海科欣生物技术研究所)测定蛋白质含量。
2.无菌检验
取上述提取菌毛液0.5ml接种于营养肉汤中37℃震荡培养18小时观察有无细菌生长。无细菌生长的K88ac菌毛悬液用于以下油乳疫苗的制备。
3.油乳疫苗的制备
K88ac菌毛悬液与等体积的弗氏佐剂(弗氏完全佐剂购自Sigma公司，弗氏不完全佐剂购自北京鼎国生物技术发展中心)充分混合乳化成蛋白质浓度为400μg/ml和600μg/ml的油包水型油乳疫苗。
4.实验动物和免疫
在20周龄开产蛋鸡胸肌两侧分别注射500μl浓度为400μg/ml的免疫原，22周龄胸肌两侧再分别注射500μl浓度为600μg/ml的免疫原。二免后一周开始收集鸡蛋。
5.卵黄抗体效价的测定
采用间接ELISA方法：100μl K88ac黏附素(用包被液稀释成15μg/ml)包被96孔聚乙烯板，4℃过夜(18h-24h)，弃去，用洗涤液冲洗3次，然后用150μl的稀释液37℃包被1h，弃去，如前洗涤3次，每孔加入100μl卵黄液(1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160……用PBSII稀释)37℃包被1h，弃去，如前洗涤5次，每孔加入100μl鼠抗鸡IgG辣根过氧化物酶(1∶15,000，洗涤液稀释)25℃包被30min，弃去，如前洗涤5次，最后每孔加入100μl底物液，显色后用50μl终止液终止反应。以颜色反应深于对照组判为阳性，并以出现阳性反应的最高稀释度为抗体效价。
三、卵黄抗体应用效果的评价
1.卵黄抗体体外抑制ETEC(产肠毒素大肠杆菌)K88ac黏附试验
□空肠上皮细胞的准备：屠宰后30分钟内取约50cm空肠，用37℃生理盐水冲洗数次去除肠腔内容物，再用含1Mm二硫苏糖醇的生理盐水冲洗2次，然后灌入pH7.4的柠檬酸钠缓冲液(Nacl96mM，Kcl 1.5mM，KH2PO48mM，Na2HPO45.6mM，柠檬酸钠27mM)，在38℃下温育10分钟，再用pH7.4的EDTA溶液(1.5mM EDTA+PBS液)在38℃下温育15分钟，将收集的细胞离心5分钟(900g)使细胞沉淀。再用pH7.4的PBS缓冲液(Nacl 130mM，Kcl 8.1mM，KH2PO4 1.5mM，Na2HPO48.1mM)冲洗两次，最后将收集的细胞悬浮在PBS液(含0.2％葡萄糖，200IU/ml青霉素，200IU/ml链霉素)中。血球计数板计数，调整细胞浓度为106个/ml。
□细菌培养物的制备：细菌培养物经离心沉淀，用PBS洗涤两次，沉淀物悬浮于PBS中，调节菌体浓度约为109个/ml。
□黏附试验：1ml上皮细胞悬液+1ml菌体细胞悬液，37℃作用30分钟，取一小滴制成压滴标本片，于显微镜下观察。记录20个上皮细胞上吸附的总菌数，计算平均每个细胞黏附的细菌数，上述试验重复三次。
□卵黄抗体体外抑制黏附试验：将1ml菌液与1ml卵黄抗体混合(效价：1：1280)，37℃作用30分钟，再加入1ml上皮细胞悬液，37℃作用30分钟，如前观察，记录结果，上述试验重复三次。
2.预防断奶仔猪腹泻试验
选择30±2日龄断奶仔猪120头，按血缘、体重、胎次、日龄等相对一致的原则随机分成4组，每组30头。日粮中分别给予0％、0.5％、1％、2％的喷雾干燥卵黄粉。试验结束后添加1％的卵黄抗体粉虽然对仔猪的生长性能有较显著影响(p＝0.059)，但显著降低了料肉比和腹泻率(p＜0.05)，同时对仔猪的后期生长有一定促进作用。
附图说明
图1：是本发明的工艺流程图。
具体实施方式
实施例1：制备产肠毒素大肠杆菌K88ac菌毛抗原
一、材料与方法
1.1.菌株
K88ac菌株购自中国农科院兽药监察所
1.2.培养基和试剂
TSB培养基(pH7.4)：胰酪蛋白胨17g、大豆蛋白胨3g、氯化钠5g、磷酸氢二钾3.27g、葡萄糖2.5g。双蒸馏水定溶至1000ml；
缓冲液PBS1(pH 7.2)：NaCL 10g、KH2PO4 0.25g、Na2HPO412H2O 3.58g、KCL 0.25g，双蒸馏水定溶至1000ml；
0.1M缓冲液PBS2(pH7.2)：NaH2PO42H2O 4.37g、Na2HPO412H2O 25.81g，双蒸馏水定溶至1000ml；
1.3产肠毒素大肠杆菌K88ac菌株菌毛黏附素表达效果的测定
菌株复活后，以1％的接种量分别接种于装有300ml TSB培养基的1000ml三角瓶，于37℃震荡培养。每隔2小时取出3ml样品于5倍稀释后，在420nm处比色，记录吸光值。培养18小时后，离心收取菌液，血球计数板显微计数，调整菌液浓度为50亿菌/毫升。采用甘露糖抵抗血凝反应(Mannose-resistanthemagglutination，MRHA)检查黏附素表达情况。MRHA方法按房海(大肠埃希氏菌。河北科学技术出版社，1997，409～429)报道方法测定菌毛表达量，要求每1L菌液提取纯黏附素蛋白1.0mg以上。
2.产肠毒素大肠杆菌K88ac菌毛抗原的提取和纯化
选择复活的甘露糖抵抗血凝反应阳性K88ac菌株按0.5％的接种量接种于装有500mlTSB培养基的1000ml三角瓶中37℃震荡培养18小时后，再按1％的接种量接种于装有2500mlTSB培养基的5000ml三角瓶中37℃震荡培养18小时。收集菌液，4℃离心(6,000×g)15分钟，弃去上清，用适量PBS悬浮菌苔。将细菌悬液置60℃水浴锅内孵化30分钟，间断摇晃悬液；然后将菌液置于冰浴中低速匀浆5分钟；在4℃下以14000×g离心15分钟除去菌体，收集无菌体的上清液。
上清液经0.4um的滤膜过滤，在滤液中加入2.5％的柠檬酸调整pH值至4.0，在4℃下放置2小时或过夜，然后在4℃下以14000×g离心15分钟取沉淀，重新悬浮于PBS1缓冲液中；上述步骤重复2-3次，最后沉淀物溶解于1ml 0.1M PBS2中，用SDS-PAGE鉴定蛋白质纯度。双缩脲法测定蛋白质含量，-20℃保存。
二、实施效果
在振荡培养条件下，K88ac在接种后4-6小时进入对数生长期，16-20小时结束；培养18小时后收集的菌体其菌毛血凝效价为26。
采用TSB液体培养基振荡培养18小时，用60℃加热与冰浴匀浆法及等电点连续沉淀法提取、纯化菌毛蛋白，从2.5毫升的菌液中提取纯化的菌毛蛋白3.75毫克，平均一毫升菌液收获纯菌毛蛋白1.5毫克。
实施例2：制备抗产肠毒素大肠杆菌K88ac特异菌毛抗原卵黄抗体
1.1试剂
弗氏完全佐剂购自Sigma公司
弗氏不完全佐剂购自北京鼎国生物技术发展中心
0.02 MPBS(pH7.4)：Nacl8g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO412H2O 2.9g、Kcl 0.2g，双蒸水定溶至500ml；
0.01 MPBS(pH7.4)：Nacl8g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO412H2O2.9g、Kcl0.2g，双蒸水定溶至1000ml；
包被液：0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6，NaHCO3 2.93g、Na2CO3 1.95g，双蒸水定溶至1000ml)；
洗涤液(PBS-T)：含0.05％吐温-20的0.01MPBS；
稀释液(PBS-BSA：含3％牛血清白蛋白的0.01 MPBS；
底物液：邻苯二胺40mg，溶于pH5.0的磷酸盐-柠檬酸缓冲液(0.2MNa2HPO4(28.4g/l)51.4ml，0.1M柠檬酸(19.2g/l)48.6ml，加双蒸馏水100ml混匀)100ml，在加入30％H2O2 0.15ml即可，现配现用。
终止液：2M H2SO4溶液(浓硫酸22.2ml，蒸馏水177.8ml，混匀即可)1.2K88ac菌毛抗原的提取
用接种环挑取K88acMRHA阳性菌落接种于装有10mlTSB培养基的50ml三角瓶，37℃震荡培养18小时；分别取1ml培养液接种于6个装有2500mlTSB培养基的5000ml三角瓶37℃震荡培养18小时；重复批次培养，收集菌液，按Jin等(In vitro inhibition of adhesion of enterotoxigenic Escherichia coli K88 to pigletintestinal mucus by egg-yolk antibodies.FEMS Immunology and Medical Microbiology，1998 21(4)：313-321)报道改进的方法提取和纯化K88黏附素。用总蛋白测定试剂盒(购自上海科欣生物技术研究所)测定蛋白质含量。
1.3无菌检验
取上述提取菌毛液0.5ml接种于营养肉汤中37℃震荡培养18小时观察有无细菌生长。无细菌生长的K88ac菌毛悬液进行油乳疫苗的制备
1.4油乳疫苗的制备
K88ac菌毛悬液与等体积的弗氏佐剂(弗氏完全佐剂购自Sigma公司，弗氏不完全佐剂购自北京鼎国生物技术发展中心)充分混合乳化成蛋白质浓度为400μg/ml和600μg/ml的油包水型油乳疫苗。
1.5实验动物和免疫
20周龄开产蛋鸡胸肌两侧分别注射500μl浓度为400μg/ml的免疫原，22周龄胸肌两侧再分别注射500μl浓度为600μg/ml的免疫原。二免后一周开始收集鸡蛋。
1.6卵黄抗体效价的测定
采用间接ELISA方法：100ulK88ac黏附素(用包被液稀释成15μg/ml)包被96孔聚乙烯板，4℃过夜(18h-24h)，弃去，用洗涤液冲洗3次，然后用150μl的稀释液37℃包被1h，弃去，如前洗涤3次，每孔加入100μl卵黄液，用PBSII稀释(稀释倍数1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160……)，37℃包被1h，弃去，如前洗涤5次，每孔加入100μl鼠抗鸡IgG辣根过氧化物酶(1∶15,000，洗涤液稀释)25℃包被30min，弃去，如前洗涤5次，最后每孔加入100μl底物液，显色后用50μl终止液终止反应。以颜色反应深于对照组判为阳性，并以出现阳性反应的最高稀释度为抗体效价。
实施例3：卵黄抗体应用效果的评价
一、材料与方法
1.卵黄抗体体外抑制ETEC K88ac黏附试验
1.1空肠上皮细胞的准备：屠宰后30分钟内取约50cm空肠，用37℃生理盐水冲洗数次去除肠腔内容物，再用含1Mm二硫苏糖醇(DTT)的生理盐水冲洗2次，然后灌入pH7.4的柠檬酸钠缓冲液(Nacl 96mM，Kcl1.5mM，KH2PO4 8mM，Na2HPO4 5.6mM，柠檬酸钠27mM)，在38℃下温育10分钟，再用pH7.4的EDTA溶液(1.5mM EDTA+PBS液)在38℃下温育15分钟，将收集的细胞离心5分钟(900g)使细胞沉淀。再用pH7.4的PBS缓冲液(Nacl 130mM，Kcl 8.1mM，KH2PO4 1.5mM，Na2HPO4 8.1mM)冲洗两次，最后将收集的细胞悬浮在PBS液(含0.2％葡萄糖，200IU/ml青霉素，200IU/ml链霉素)中。血球计数板计数，调整细胞浓度为106个/ml
1.2细菌培养物的制备：细菌培养物经离心沉淀，用PBS洗涤两次，沉淀物悬浮于PBS中，调节菌体浓度约为109个/ml
1.3黏附试验：1ml上皮细胞悬液+1ml菌体细胞悬液，37℃作用30分钟，取一小滴制成压滴标本片，于显微镜下观察。记录20个上皮细胞上吸附的总菌数，计算平均每个细胞黏附的细菌数，上述试验重复三次。
1.4卵黄抗体体外抑制黏附试验：将1ml菌液与1ml卵黄抗体混合(效价：1：1280)，37℃作用30分钟，再加入1ml上皮细胞悬液，37℃作用30分钟，如前观察，记录结果，上述试验重复三次。
3.预防断奶仔猪腹泻试验
4.2.1试猪的选择和分组
选择30±2日龄断奶仔猪120头，按血缘、体重、胎次、日龄等相对一致的原则随机分成4组，每组30头，每组分三栏饲养。
2.2试验设计和试验日粮组成
试验采用单因子设计。对照组用商品日粮，在基础配方中分别添加0.5％、1％、2％的喷雾干燥卵黄粉形成试验一组、试验二组和三组的试验日粮。
2.3饲养管理
饮水器自由饮水，干粉料自由采食，日喂4次，次日晨称剩余料，按栏统计料量。阉割、防疫注射等其他管理照常规进行。病程超过3天，程度严重不能继续参加试验的猪及时退出试验，并扣除其耗料量。
2.4称重
仔猪断奶重作为入试重，断奶后14天和21天，逐头空腹称重1次，共称重3次。
2.5腹泻情况
每日晨记录仔猪粪便状况，按干、软、稀、水样分成0、1、2、3四级记录。统计时干便及软便为正常，稀便和水样便记为腹泻。
2.6.数据处理和分析
对平均日增重、采食量和料肉比进行方差分析，腹泻率用卡方检验
二、结果与分析
1卵黄抗体对细菌体外细胞黏附的抑制作用
从表1可以看出在K88ac体外细胞黏附试验中，平均每个上皮细胞黏附16.4个K88ac；在卵黄抗体抑制黏附试验中，抗体效价分别为640和1280的卵黄抗体较对照组均极显著抑制了K88ac对肠上皮细胞的黏附作用，平均每个上皮细胞仅黏附8.5和2.4个细菌(p＜0.01)，二者之间也存在极显著差异(p＜0.01)。抗体效价为320的抗体组相对对照组有一定抑制细菌粘附作用，但差异不显著(p＝0.15)。
表1卵黄抗体对细菌体外细胞黏附的抑制作用
抗K88ac抗体滴度 黏附细菌数
0 16.4±9.6aA
320 13.7±7.4aAB
640 8.5±5.7bB
1280 2.4±1.1C
2卵黄抗体对断奶仔猪腹泻情况的影响
从表2可以看出，试验二组和试验三组腹泻头数和头次数均低于对照组和试验一组；相对对照组和试验一组，试验二组和试验三组的腹泻率极显著降低(p＜0.01)，对照组和试验一组，试验二组和试验三组之间腹泻率差异不显著(p＞0.05)。
表2试验期各组腹泻情况
组别 猪头数 腹泻头次 腹泻率
对照组 28 54(22*) 13.8％A
1 28 48(21) 12.2％A
2 28 20(14) 5.1％B
3 28 26(14) 6.7％B
*：括号内数字为发生过腹泻的仔猪数
3卵黄抗体对断奶仔猪生长性能的影响
3.1.卵黄抗体对断奶仔猪平均日增重的影响
从表3中可以看出，在整个试验期中，各组平均日增重均没有显著差异；但试验后期试验二组相对对照组、试验一组和试验三组平均日增重均有一定的改善作用(p＝0.078，p＝0.059，p＝0.132)。
表3试验期各组平均日增重(g/d)
断奶后阶段
组别 猪头数
前期 后期 全期
对照 28 306.2±62.4 469.2±108.4 385.4±56.5
1 28 290.8±50.6 466.4±92.2 378.6±49.1
2 28 295.1±73.9 522.1±80.4 409.5±61.2
3 28 291.6±51.4 476.9±105.6 384.3±67.3
3.2卵黄抗体对断奶仔猪平均采食量的影响
从表4中可以看出，无论是试验前期、后期或全期，各组平均采食量均无显著差异，但随着卵黄抗体添加量的增加，平均采食量有递减趋势。在试验后期，试验三组相对对照组和试验一组有明显减少(p＝0.071，p＝0.195)。
表4试验期各组平均采食量(g/d)
断奶后阶段
组别 猪头数
前期 后期 全期
对照 28 35.5±45.8 873.1±78.3 646.9±53.6
1 28 433.0±50.3 845.5±44.9 639.3±47.6
2 28 429.1±38.8 797.3±18.8 618.7±22.3
3 28 411.0±11.7 787.1±41.4 597.5±22.4
2.3.卵黄抗体对断奶仔猪料肉比的影响
从表5中可以看出，试验各组试验前期(断奶后两周)料肉比无显著差异；但从试验后期和试验全期来看，试验二组和试验三组相对其他两组料肉比均均显著降低(其中试验二组达到极显著水平(p＜0.01)。
表5试验期各组料肉比
断奶后阶段
组别 猪头数
前期 后期 全期
对照 28 1.40±0.07 1.82±0.04aA 1.70±0.02A
1 28 1.48±0.06 1.80±0.05aAC 1.71±0.05A
2 28 1.40±0.15 1.54±0.05bB 1.51±0.03aB
3 28 1.47±0.17 1.68±0.06bC 1.60±0.05bB
Claims (5)
1、一种预防仔猪腹泻的特异性卵黄抗体，其特征是将产肠毒素大肠杆菌(EnterotoxigenicEscherichia coli，ETEC)K88ac菌毛黏附素蛋白与弗氏佐剂混合制成特异免疫源，用该免疫源免疫健康开产母鸡，并收集被免疫的鸡所产的鸡蛋，所述鸡蛋蛋黄中含有预防仔猪腹泻的特异性卵黄抗体。
2、实现权利要求1产品的方法，其特征在于制备特异免疫源的方法采用TSB液体培养基，37℃振荡培养产肠毒素大肠杆菌K88ac菌株，18小时后，用60℃加热-冰浴匀浆法及等电点连续沉淀法提取和纯化菌毛黏附素蛋白，然后与弗氏佐剂混合而成。
3、权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的从特异免疫源免疫的健康产蛋母鸡所产之鸡蛋中，分离蛋黄，喷雾干燥制成卵黄粉，该鸡蛋蛋黄中含有所述的能够预防仔猪腹泻的特异性卵黄抗体。
4、权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的免疫产蛋母鸡的免疫步骤是：在健康开产蛋鸡胸肌两侧分别注射500μl浓度为400μg/ml的特异免疫原，2周后胸肌两侧再分别注射500μl浓度为600μg/ml的特异免疫原。
5、一种预防仔猪腹泻的特异性卵黄抗体其特征在于，作为抗生素的替代品应用于饲料，预防由产肠毒素大肠杆菌K88ac引起的仔猪腹泻。
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