CN106035672A - 一种抗仔猪etec性腹泻的功能性蛋乳粉及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉及其制备方法，所述蛋乳粉是由抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳液进行干燥制得，其中，以制备3L的功能性蛋乳液计算，所述乳液包括以下组分：牛奶0.5‑1.5L；卵黄抗体液1.5‑3L；添加剂0.1‑1g。本发明提供一种抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉及其制备方法，所述功能性蛋乳粉不仅含有丰富的ETEC卵黄抗体，能高效防治仔猪ETEC性腹泻，并且所述乳粉营养丰富、适口性好，饲喂方法简单，适合应用于工厂化养猪，所述制备方法简单、易掌握，易于进行大批量生产。

Description

一种抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉及其制备方法
技术领域
本发明涉及家畜疾病预防与控制技术领域，尤其涉及一种抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉及其制备方法。
背景技术
由肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichla coli，ETEC）引起的仔猪腹泻，给养猪业带来巨大经济损失。通过母乳获得抗体，可以较好的防治仔猪ETEC感染性腹泻。但仔猪获得母乳抗体受多方面因素的影响，抗体在断奶后将很快消失，抗生素治疗常引发细菌耐药性等问题。高效的ETEC卵黄抗体粉可以用于防治仔猪大肠杆菌性腹泻，但是因适口性差，往往需要灌服，操作费时费力，不适合工厂化养猪工艺。目前，还没有适合工厂化养猪工艺、有效防治仔猪ETEC感染性腹泻的方法。
因此，现有技术还有待于进一步改进。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明在于提供一种抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉及其制备方法，旨在解决目前抗生素治疗常引发细菌耐药性及ETEC卵黄抗体粉的适口性差、操作费时费力，不适合工厂化养猪工艺。
本发明的技术方案如下：
一种抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉，其中，所述蛋乳粉是由抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳液进行干燥制得，以制备3L的功能性蛋乳液计算，所述乳液包括以下组分：
牛奶 0.5-1.5L；
卵黄抗体液 1.5-3L；
添加剂0.1-1g。
所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉，其中，所述添加剂包括甜味剂和香味剂，所述甜味剂和香味剂的质量比为1:1。
所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉，其中，所述3L的蛋乳液包括以下含量的组分：牛奶1-1.5L，卵黄抗体液2-3L，甜味剂为0.5g，香味剂为0.5g。
所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉，其中，所述卵黄抗体液由体积比为1：1-1：3的ETEC免疫鸡蛋卵黄与无机盐稀释液组成。
所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉，其中，所述无机盐稀释液包括以下含量的成分：氯化钙0.1-0.5g/L，氯化钾0.1-0.5g g/L，氯化钠0.1-1 g/L，乳酸钠0.1-0.5 g/L。
所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉，其中，所述ETEC免疫鸡蛋卵黄含有抗ETEC的四个菌株987P、K99、K88、F41的四联卵黄抗体。
一种如上所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉的制备方法，其中，所述制备方法为：
S1:将四种产肠毒素大肠埃希氏菌菌株 987P、K99、K88、F41的菌毛蛋白混合疫苗多点注射免疫初产母鸡，12-16天后以同样的方式第二次注射免疫母鸡，二免5-10天后收集鸡蛋的卵黄；
S2：配制无机盐稀释液，将卵黄与无机盐稀释液按比例混合，获得卵黄抗体液；
S3：将相应含量的牛奶、甜味剂、香味剂混匀溶解，再加入卵黄抗体液，混合均匀，制得蛋乳液；
S4：对所述得到的蛋乳液进行喷雾干燥。
所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉的制备方法，其中，所述菌毛蛋白混合疫苗的制备方法为：将培养好的987P、K99、K883种菌株的菌液分别进行离心，离心后的沉淀用1mL生理盐水清洗3次；将沉淀物以0.1g/mL的悬浮于含2M尿素的PBS缓冲液中，60℃水浴震30min脱沉淀物上的细菌，16000r/min离心15min，去细菌沉淀，上清即为粗提的菌毛蛋白，对粗提的菌毛蛋白进行纯化，纯化后得到的四种菌毛蛋白进行混合，再向菌毛蛋白混合液中加入等体积的Marcol 52佐剂乳化，得到菌毛蛋白混合疫苗。
所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉的制备方法，其中，对粗提的菌毛蛋白进行纯化的方法为：将粗提的菌毛蛋白在磁力搅拌的情况下，缓慢加入固体硫酸铵使其质量浓度达到30％，4℃放置沉淀过夜；将沉淀好的菌毛蛋白在4℃下，8000r/min离心30min，并收集蛋白沉淀；将蛋白沉淀溶于pH7.4的含2M尿素的100mM Tris-Hcl缓冲液中，并用相同的缓冲液搅拌透析48小时，更换透析液两次，得到纯化后的菌毛蛋白。
所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉的制备方法，其中，对蛋乳液进行喷雾干燥时，入口温度为110-130℃，出口温度为60-80℃。
有益效果：本发明提供一种抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉及其制备方法，所述功能性蛋乳粉不仅含有丰富的ETEC卵黄抗体，能高效防治仔猪ETEC性腹泻，并且所述乳粉营养丰富、适口性好，饲喂方法简单，适合应用于工厂化养猪，，所述制备方法简单、易掌握，易于进行大批量生产。
具体实施方式
本发明提供一种抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉及其制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉，其中，所述蛋乳粉是由抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳液进行干燥制得，以制备3L的功能性蛋乳液计算，所述乳液包括以下组分：
牛奶 0.5-1.5L；
卵黄抗体液 1.5-3L；
添加剂0.1-1g。
向乳液中加入上牛奶，不仅有效提高乳液的口味和香味，提高蛋乳粉的适口性，并且由于牛奶营养丰富，富含蛋白质、脂肪、多种矿物质（钙磷比例恰当，有利于钙的吸收）等，制备的蛋乳粉可以作为一种功能性辅食对仔猪进行营养补充。加入牛奶的体积控制在0.5-1.5L范围内，不会过渡稀释卵黄抗体液，降低抗体的活性，影响其防治效果，并保证较佳的适口性。
其中，所述卵黄抗体液由体积比为1：1-1：3的ETEC免疫鸡蛋卵黄与无机盐稀释液组成。所述卵黄抗体液选用ETEC免疫的鸡蛋卵黄，而不是直接采用分离纯化好的ETEC免疫抗体，不仅降低了原料成本（商品化的ETEC免疫抗体比较昂贵），并且省去了从卵黄中分离纯化ETEC免疫抗体的工艺步骤，简化制备方法。并且，ETEC免疫的鸡蛋卵黄不仅含有丰富的抗体，并且营养价值高，具有鸡蛋的鲜味，提高乳粉的营养价值和口感。
将ETEC免疫鸡蛋卵黄用上述比例的无机盐稀释，可以有效将卵黄中的抗体和其他营养物质分散开来，充分溶解在无机盐溶液中，有利于制备分散均匀、有利于消化吸收的蛋乳粉。
优选地，所述无机盐稀释液包括以下含量的成分：氯化钙0.1-0.5g/L，氯化钾0.1-0.5g g/L，氯化钠0.1-1 g/L，乳酸钠0.1-0.5 g/L。选择这种配比的无机盐稀释液有效防止ETEC蛋黄抗体在乳粉的制备过程中变性、失效，使其保持很高活性，提高制备的蛋乳粉的防止腹泻的功效。此外，也进一步提高蛋乳粉中的无机盐的含量。
其中，所述ETEC免疫鸡蛋卵黄含有抗ETEC的四个菌株987P、K99、K88、F41的四联卵黄抗体。这四种菌株是引起仔猪腹泻的主要的ETEC菌株，用这四种菌株的菌毛蛋白的混合疫苗免疫产生的四联卵黄抗体的免疫效果明显优于其他菌体苗及多价苗的免疫效果，具有显著的仔猪ETEC性腹泻的防治效果。
此外，向乳粉中加入添加剂0.1-1g，能有效提高乳粉的适口性，诱使仔猪能主动进食蛋乳粉，使饲喂变得简单，降低人工成本，使蛋乳粉可以用于工业化养殖。所述添加剂可以是甜味剂、香味剂、葡萄糖或其他诱食剂。
优选地，所述添加剂包括甜味剂和香味剂，所述甜味剂和香味剂的质量比为1:1。这样配比的添加剂不仅诱食效果好，并且原料简单易获取、成本低廉。
较佳实施例中，所述3L的蛋乳液包括以下含量的组分：牛奶1-1.5L，卵黄抗体液2-3L，甜味剂为0.5g，香味剂为0.5g。所述制备出的蛋乳粉的不仅防止效果好、口感最佳、适口性好，且营养丰富。
一种如上所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉的制备方法，其中，所述制备方法为：
菌毛蛋白混合疫苗的制备：将培养好的987P、K99、K883种菌株的菌液分别进行离心，离心后的沉淀用1mL生理盐水清洗3次；将沉淀物以0.1g/mL的悬浮于含2M尿素的PBS缓冲液中，60℃水浴震30min脱沉淀物上的细菌，16000r/min离心15min，去细菌沉淀，上清即为粗提的菌毛蛋白，对粗提的菌毛蛋白进行纯化，纯化后得到的四种菌毛蛋白进行混合，再向菌毛蛋白混合液中加入等体积的Marcol 52佐剂乳化，得到菌毛蛋白混合疫苗。
其中，菌毛蛋白的纯化方法为：将粗提的菌毛蛋白在磁力搅拌的情况下，缓慢加入固体硫酸铵使其质量浓度达到30％，4℃放置沉淀过夜；将沉淀好的菌毛蛋白在4℃下，8000r/min离心30min，并收集蛋白沉淀；将蛋白沉淀溶于pH7.4的含2M尿素的100mM Tris-Hcl缓冲液中，并用相同的缓冲液搅拌透析48小时，更换透析液两次，得到纯化后的菌毛蛋白。
采用上述的菌毛蛋白的提取方法及透析纯化方法，菌毛蛋白的提取量高、纯度高，并且菌毛蛋白的变性率低，保持高活性的免疫原性。
接着进行蛋乳粉的制备，具体步骤为：
S1:将四种产肠毒素大肠埃希氏菌菌株 987P、K99、K88、F41的菌毛蛋白混合疫苗多点注射免疫初产母鸡，12-16天后以同样的方式第二次注射免疫母鸡，二免5-10天后收集鸡蛋的卵黄。
S2：配制无机盐稀释液，将卵黄与无机盐稀释液按比例混合，获得卵黄抗体液。
S3：将相应含量的牛奶、甜味剂、香味剂混匀溶解，再加入卵黄抗体液，混合均匀，制得蛋乳液。
S4：对所述得到的蛋乳液进行喷雾干燥。
优选地，初次免疫初产母鸡14天后以同样的方式第二次注射免疫母鸡，二免7天后收集鸡蛋的卵黄，这样免疫得到的卵黄中抗体含量高，防治仔猪腹泻的效果好。
其中，对蛋乳液进行喷雾干燥时，入口温度为110-130℃，出口温度为60-80℃。这种温度条件下制备的蛋乳粉不仅粉末均匀、不易成结，并且对蛋乳粉中的卵黄抗体的活性没有太大影响，也能很大程度上保持了乳粉中其他营养物质的营养价值。
最佳实施例中，喷雾干燥时，入口温度为120℃，出口温度为72℃℃。
喷雾干燥前后，对抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉中卵黄抗体效价的测定实验，实验结果见表1和表2。
表1蛋乳液喷粉前效价
表2蛋乳液喷粉后效价
上述实验结果表明：喷雾干燥后，卵黄抗体效价平均只下降一个倍比度，卵黄抗体具有很好的高温稳定性，喷雾干燥法制粉工艺适用于抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉的生产。制备的功能性蛋乳粉中，卵黄抗体的活性高，具有很好的防治仔猪腹泻的作用。
所述抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉的应用方法为：取抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉5-15g，加温开水90ml摇均。每头仔猪2-4ml乳瓶喂服或料盘自食。
为了更详尽的描述本发明的制备方法，以下列举几个实施例更进一步的说明。
实施例1
本发明提供的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉是由抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳液进行干燥制得，以制备3L的功能性蛋乳液计算，所述乳液包括以下组分：
牛奶 1L；
卵黄抗体液 2L；
甜味剂0.5g。
香味剂0.5g
所述卵黄抗体液中，卵黄与无机盐稀释液的比例为1:2。
无机盐稀释液的组分为：氯化钙0.2g，氯化钾0.3g，氯化钠0.6g，乳酸钠0.31g，蒸馏水1000 ml。
菌株的培养：将987P、K99、K883种菌株分别接种到TSB培养基中，在37℃培养条件下震荡48小时后，分别收集987P、K99、K88菌毛蛋白；将F41菌株在Minca培养基培养24小时后，收集F41菌毛蛋白。
菌毛蛋白的提取：用2mL生理盐水洗下由固体培养基培养的菌苔，8000r/min离心10分钟，液体培养基可直接吸取离心，离心后的沉淀悬浮在1mL生理盐水中，再离心，重复3次。称量沉淀物的湿重，将沉淀物以0.1g/mL悬浮于含2M尿素的PBS缓冲液中。60℃水浴震30min脱沉淀物上的细菌，16000r/min离心15min，去细菌沉淀，上清即为粗提的菌毛蛋白。
菌毛蛋白的纯化：将粗提的菌毛蛋白在磁力搅拌的情况下，缓慢加入固体硫酸铵使之达到质量占比为30％，4℃放置沉淀过夜。将沉淀好的菌毛蛋白4℃8000r/min离心30min，并收集沉淀。将沉淀溶于10mL100mM pH7.4含2M尿素的Tris-Hcl缓冲液中，并用相同的缓冲液搅拌透析48小时，更换透析液两次，除去硫酸铵，即为纯化后的菌毛蛋白。
所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉的制备方法为：
S1:将浓度分别为1135 μg/ml、1246μg/ml、1086μg/ml、1190μg/ml四种产肠毒素大肠埃希氏菌菌株 987P、K99、K88、F41的菌毛蛋白各2ml，混合均匀，再用等体积的Marcol 52佐剂乳化，取2ml多点注射免疫初产母鸡，14天后以同样的方式第二次注射免疫母鸡，二免7天后收集鸡蛋的卵黄。
S2：配制无机盐稀释液，将卵黄与无机盐稀释液按比例混合，获得卵黄抗体液。
S3：将相应含量的牛奶、甜味剂、香味剂混匀溶解，再加入卵黄抗体液，混合均匀，制得蛋乳液。
S4：对所述得到的蛋乳液进行喷雾干燥。
对蛋乳液进行喷雾干燥时，入口温度120℃，出口温度72℃。
实施例2
本发明提供的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉是由抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳液进行干燥制得，以制备3L的功能性蛋乳液计算，所述乳液包括以下组分：
牛奶 1.5L；
卵黄抗体液 1.5L；
甜味剂0.1g。
香味剂0.1g
所述卵黄抗体液中，卵黄与无机盐稀释液的比例为1:1。
无机盐稀释液的组分为：氯化钙0.1g，氯化钾0.1g，氯化钠0.6g，乳酸钠0.5g，蒸馏水1000 ml。
所述抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉的制备方法与实施例1相同。
实施例3
本发明提供的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉是由抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳液进行干燥制得，以制备3L的功能性蛋乳液计算，所述乳液包括以下组分：
牛奶 0.5L；
卵黄抗体液2.5L；
甜味剂1g。
香味剂1g
所述卵黄抗体液中，卵黄与无机盐稀释液的比例为1:3。
无机盐稀释液的组分为：氯化钙0.5g，氯化钾0.5g，氯化钠1g，乳酸钠0.1g，蒸馏水1000 ml。
所述抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉的制备方法与实施例1相同。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉，其特征在于，所述蛋乳粉是由抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳液进行干燥制得，其中，以制备3L的功能性蛋乳液计算，所述乳液包括以下组分：
牛奶 0.5-1.5L；
卵黄抗体液 1.5-3L；
添加剂0.1-1g。
2.根据权利要求1所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉，其特征在于，所述添加剂包括甜味剂和香味剂，所述甜味剂和香味剂的质量比为1:1。
3.根据权利要求2所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉，其特征在于，所述3L的蛋乳液包括以下含量的组分：牛奶1-1.5L，卵黄抗体液2-3L，甜味剂为0.5g，香味剂为0.5g。
4.根据权利要求1所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉，其特征在于，所述卵黄抗体液由体积比为1：1-1：3的ETEC免疫鸡蛋卵黄与无机盐稀释液组成。
5.根据权利要求4所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉，其特征在于，所述无机盐稀释液包括以下含量的成分：氯化钙0.1-0.5g/L，氯化钾0.1-0.5g g/L，氯化钠0.1-1 g/L，乳酸钠0.1-0.5 g/L。
6.根据权利要求4所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉，其特征在于，所述ETEC免疫鸡蛋卵黄含有抗ETEC的四个菌株987P、K99、K88、F41的四联卵黄抗体。
7.一种如权利要求1-6中任一项所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：
S1:将四种产肠毒素大肠埃希氏菌菌株 987P、K99、K88、F41的菌毛蛋白混合疫苗多点注射免疫初产母鸡，12-16天后以同样的方式第二次注射免疫母鸡，二免5-10天后收集鸡蛋的卵黄；
S2：配制无机盐稀释液，将卵黄与无机盐稀释液按比例混合，获得卵黄抗体液；
S3：将相应含量的牛奶、甜味剂、香味剂混匀溶解，再加入卵黄抗体液，混合均匀，制得蛋乳液；
S4：对所述得到的蛋乳液进行喷雾干燥。
8.根据权利要求7所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉的制备方法，其特征在于，所述菌毛蛋白混合疫苗的制备方法为：将培养好的987P、K99、K883种菌株的菌液分别进行离心，离心后的沉淀用1mL生理盐水清洗3次；将沉淀物以0.1g/mL的悬浮于含2M尿素的PBS缓冲液中，60℃水浴震30min脱沉淀物上的细菌，16000r/min离心15min，去细菌沉淀，上清即为粗提的菌毛蛋白，对粗提的菌毛蛋白进行纯化，纯化后得到的四种菌毛蛋白进行混合，再向菌毛蛋白混合液中加入等体积的Marcol 52佐剂乳化，得到菌毛蛋白混合疫苗。
9.根据权利要求8所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉的制备方法，其特征在于，对粗提的菌毛蛋白进行纯化的方法为：将粗提的菌毛蛋白在磁力搅拌的情况下，缓慢加入固体硫酸铵使其质量浓度达到30％，4℃放置沉淀过夜；将沉淀好的菌毛蛋白在4℃下，8000r/min离心30min，并收集蛋白沉淀；将蛋白沉淀溶于pH7.4的含2M尿素的100mM Tris-Hcl缓冲液中，并用相同的缓冲液搅拌透析48小时，更换透析液两次，得到纯化后的菌毛蛋白。
10.根据权利要求7所述的抗仔猪ETEC性腹泻的功能性蛋乳粉的制备方法，其特征在于，对蛋乳液进行喷雾干燥时，入口温度为110-130℃，出口温度为60-80℃。
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