CN102304182B - 一种肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种安全环保型的大肠杆菌蛋黄抗体粉的制备方法及其应用。选择健康商品蛋鸡，以猪ETEC三联苗为抗原免疫蛋鸡，肌肉注射0.5-2ml/羽，获得特异性IgY，首次免疫50d后可开始收集鸡蛋制备大肠杆菌蛋黄抗体粉，其后每隔40d再加强免疫一次，即可得到持续高效价IgY的鸡蛋。采用喷雾干燥技术将新鲜卵黄浆在数秒钟内迅速脱水干燥成大肠杆菌蛋黄抗体粉，喷雾干燥温度应控制在进口温度120℃-155℃、出口温度60℃-80℃之间，在干燥塔内存留2-3h。优点：可作为各种畜禽动物的饲料添加剂，广泛用于畜禽生产；提高早期断奶仔猪生产性能，并对预防、治疗仔猪腹泻具有显著效果，克服了粗制蛋黄抗体的缺点。

Description

一种肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种蛋黄抗体，具体涉及一种从鸡蛋中提取纯化的肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉剂的制备方法及其应用。

背景技术

蛋黄抗体是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体，当禽类机体受到外来抗原刺激后，法氏囊内的B细胞分化成为浆细胞，分泌特异性抗体进入血液循环，当血液流经卵巢时，特异性抗体（主要是IgG）在卵细胞中逐渐蓄积，形成蛋黄抗体。由于卵细胞受体的作用，禽蛋黄中存在的抗体含量与血清相似甚至更高，但一直未引起足够的重视。

在兽医领域，人们长期以来是从动物（如兔、鸡、牛、猪、羊、小鼠、大鼠、豚鼠等）的血清、初乳或单克隆抗体分离IgG。近十几年来，国内外学者就卵黄抗体的研究和开发做了很多工作，证明了免疫鸡的蛋是提供特异性IgG抗体既方便又廉价的来源。

肠毒性大肠杆菌（ETEC）蛋黄抗体是将K88、K99、987P的大肠杆菌抗原免疫产蛋母鸡后，使血清产生相应抗体，产蛋母鸡又以产蛋方式将含有抗大肠杆菌K88、K99、987P的高效价血清免疫球蛋白（IgG）有效地转移到蛋黄中，即免疫球蛋白，简称IgY，再采用理化方法从高免鸡蛋中提取纯化IgY，即肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉。

肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉作为特异抗体IgY的来源有许多优点。如：母鸡易于饲养，费用不高；收集鸡蛋方便，无需抽动物血，无损伤，符合现代动物保护规则；产生有效免疫反应所需抗原量小，尤其是高度保守的哺乳动物蛋白质对种系发生学上距离较远的禽类通常有较强的免疫原性。

畜禽产品的安全与饲料密切相关。研究表明，饲料中长期添加抗生素、化学合成药物，会造成畜产品中药物残留超标，污染环境，产生抗药性，从而危害人类健康。因此，研制开发环保型饲料添加剂、生产绿色动物食品，已成为国内外饲料科学领域的研究热点。蛋黄抗体可提高早期断奶仔猪的采食量、日增重，促进仔猪生长，改进断奶仔猪的饲料转化效率，减少腹泻和死亡率，降低乳猪断奶综合症的发生，提高经济效益，因而在提倡健康养殖和保护动物健康，保障畜禽产品安全，保障人类健康的今天，蛋黄抗体具有良好的开发和应用前景。

本发明通过饲养试验，人工接种肠毒性大肠杆菌抗原自制抗大肠杆菌蛋黄抗体粉，用于防治仔猪腹泻具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明目的在于，提供一种安全环保型的大肠杆菌蛋黄抗体粉，另一目的在于提供一种大肠杆菌蛋黄抗体粉的制备方法及其应用，这种大肠杆菌蛋黄抗体可用于防治仔猪腹泻，提高早期断奶仔猪生产性能，克服了粗制蛋黄抗体的缺点，更加安全、有效、使用方便。

本发明是通过以下技术途径来实现的：

一种肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉的制备方法，包括以下步骤：

选择健康商品蛋鸡，以仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗为抗原免疫蛋鸡，肌肉注射0.5-2ml/羽，获得特异性IgY，首次免疫50d后可开始收集鸡蛋制备大肠杆菌蛋黄抗体粉，其后每隔40d再加强免疫一次，即可得到持续高效价IgY的鸡蛋。采用喷雾干燥技术将新鲜卵黄浆在数秒钟内迅速脱水干燥成大肠杆菌蛋黄抗体粉，喷雾干燥温度应控制在进口温度120℃-155℃、出口温度60℃-80℃之间，在干燥塔内存留2-3h。在加工过程中应及时清理附积在机器干燥塔内的粉末，以保证大肠杆菌蛋黄抗体粉的高效价、高生产效率和低生产成本。

其中，本发明所涉及到的仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗由哈药集团生物疫苗有限公司提供，并且仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗的名称还可以是其他类似的名称，例如也叫仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗。为了简化，本发明将仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗简称为猪ETEC三联苗。

仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗也被下列文献报道：《黑龙江畜牧兽医》 2011年04期 加入收藏 获取最新 提高仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗抗原单位的试验尹尧、礼颖。摘要：正仔猪大肠杆菌病病原为产肠毒素大肠杆菌,该菌致病力主要由粘附素性菌毛和肠毒素两类毒力因子构成,主要危害1周龄内的仔猪。仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗用分别带有K88、K99、987P纤毛抗原的大肠埃希菌,接种于适宜培养基上培养,将培养物。作者单位：哈药集团生物疫苗有限公司。

喷雾干燥技术工作原理：空气通过过滤器和加热器，进入干燥塔顶部的空气分配器，然后呈螺旋状均匀地进入干燥塔。料液由料液槽经过过滤器由泵送至干燥塔顶的离心雾化器，使料液喷成极小的雾状液滴，料液与热空气并流接触，水分迅速蒸发，在极短的时间内干燥，进行打包即为成品。

本发明具体的技术方案为：

1、免疫程序：首次免疫，鸡胸部或腿部肌肉注射猪ETEC三联苗0.5-2ml/羽，每隔15d加强免疫1次，剂量为1-2ml/羽，共强化免疫2次。首次免疫50d后，抽检蛋样滴度，达到规定标准后即可作为高免鸡蛋收集，4℃贮存，5d之内制备成大肠杆菌蛋黄抗体粉。

2、卵黄液样品的处理：先清水刷拭干净后，再用酒精棉球消毒鸡蛋壳，然后用0.5%新洁尔灭水溶液浸泡20min-30min，晾干，于无菌条件下分离卵黄与卵白，加入1.5倍体积的生理盐水，在胶体磨中匀浆。

3、大肠杆菌蛋黄抗体粉的制备：采用喷雾干燥技术将新鲜卵黄浆在数秒钟内迅速脱水干燥成大肠杆菌蛋黄抗体粉，喷雾干燥温度应控制在进口温度120℃-155℃、出口温度60℃-80℃之间，在干燥塔内存留2-3h，在加工过程中应及时清理附积在机器干燥塔内的粉末，以保证大肠杆菌蛋黄抗体粉的高效价、高生产效率和低生产成本。将制成的大肠杆菌蛋黄抗体粉，装入塑封袋中即可。

大肠杆菌蛋黄抗体粉的作用机理：特定病原菌的蛋黄抗体能黏附于病原菌的细胞壁上，直接抑制病原菌的生长；蛋黄抗体还可黏附于细菌的菌毛上，使之不能黏附于肠道黏膜上皮细胞；蛋黄抗体在肠道消化酶作用下，降解为可结合片段，进入血液后能与特定的病原菌黏附因子结合，使病原菌不能黏附易感细胞而失去致病性。蛋黄抗体还可以中和相应的病毒或毒素，终止病原对机体的危害，缓解症状，恢复健康。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、本发明大肠杆菌蛋黄抗体粉是利用蛋鸡生产抗体，采样方便；无需放血或屠宰动物，就可连续获得高滴度抗体；对动物的应激小，符合动物福利要求；而且还省工、省时，不受时间、地域和季节的限制，适合大规模生产，可以大大降低抗体的生产成本。

2、由于禽类与哺乳动物生物系统间的差距，两者的亲缘关系较疏远，哺乳动物的蛋白质抗原在禽体内更易产生特异性较高的抗体，所以本发明免疫测定时干扰小，检测的特异性、准确性均较高。

3、本发明大肠杆菌蛋黄抗体粉具有良好的加工和贮存性能，耐热、抗高压、易保存。

4、本发明大肠杆菌蛋黄抗体粉在pH4.0-11.0时比较稳定，耐酸、耐碱、对蛋白水解酶稳定性好。所以胃液对本产品效价影响不大。特别对幼龄动物而言，其胃内pH值不是很低的情况下，口服卵黄抗体不会遭到太大的破坏，故在幼畜日粮中添加大肠杆菌蛋黄抗体粉可获得有效的被动保护免疫力。

5、本发明是鸡蛋中天然存在的一种物质，化学成分是蛋白质，发挥作用后即可被机体作为营养物质吸收利用，纯品不会残留任何有害物质。用其抑杀病原体，只对产生该抗体的抗原起作用。而使用广谱抗生素，使用后有益微生物也被一起杀死、致使机体内微生物区系失调、引起继发反应的现象，所以大肠杆菌蛋黄抗体粉是一种很好的抗生素替代品，绿色、安全、无残留。

本发明所述的大肠杆菌蛋黄抗体粉可作为各种畜禽动物的饲料添加剂，广泛用于畜禽生产。

本发明所述的大肠杆菌蛋黄抗体粉，可以提高早期断奶仔猪生产性能，并对预防、治疗仔猪腹泻具有显著效果。

下面结合具体的实施例进一步说明本发明。

具体实施方式：

实施例1：一种肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉的制备方法，包括以下步骤：

选择健康商品蛋鸡600只，以猪ETEC三联苗为抗原免疫蛋鸡，肌肉注射1ml/羽，获得特异性IgY，每隔15d加强免疫1次，剂量为1ml/羽，共强化免疫2次。首次免疫50d后可开始收集鸡蛋制备大肠杆菌蛋黄抗体粉，其后每隔40d再加强免疫一次，即可得到持续高效价IgY的鸡蛋。采用喷雾干燥技术将新鲜卵黄浆在数秒钟内迅速脱水干燥成大肠杆菌蛋黄抗体粉，喷雾干燥温度应控制在进口温度155℃、出口温度80℃，在干燥塔内存留2h。获得肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉。

实施例2：一种肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉的制备方法，包括以下步骤：

选择健康商品蛋鸡600只，以猪ETEC三联苗为抗原免疫蛋鸡，肌肉注射0.25ml/羽，获得特异性IgY，每隔18d加强免疫1次，剂量为0.5ml/羽，共强化免疫2次。首次免疫55d后可开始收集鸡蛋制备大肠杆菌蛋黄抗体粉，其后每隔40d再加强免疫一次，即可得到持续高效价IgY的鸡蛋。采用喷雾干燥技术将新鲜卵黄浆在数秒钟内迅速脱水干燥成大肠杆菌蛋黄抗体粉，喷雾干燥温度应控制在进口温度140℃、出口温度78℃，在干燥塔内存留2.5h。获得肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉。

肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉在猪饲料中的应用，其重量配方为：肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉0.2份，玉米59.1份，豆粕30.3份，鱼粉2份，乳清粉3.5份，大豆油0.9份，赖氨酸0.4份，磷酸氢钙1.5份，食盐0.5份，石粉0.6份，预混料1.0份。

预混料是添加剂预混合饲料的简称，它是将一种或多种微量组分（包括各种微量矿物元素、各种维生素、合成氨基酸、某些药物等添加剂）与稀释剂或载体按要求配比，均匀混合后制成的中间型配合饲料产品。预混料是全价配合饲料的一种重要组分。预混料是饲料领域的通用成分，对本发明的治疗腹泻影响关联度小，不是本发明的重点。

实施例3：一种肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉的制备方法，包括以下步骤：

选择健康商品蛋鸡600只，以猪ETEC三联苗为抗原免疫蛋鸡，肌肉注射1ml/羽，获得特异性IgY，每隔15d加强免疫1次，剂量为1ml/羽，共强化免疫2次。首次免疫50d后可开始收集鸡蛋制备大肠杆菌蛋黄抗体粉，其后每隔40d再加强免疫一次，即可得到持续高效价IgY的鸡蛋。采用喷雾干燥技术将新鲜卵黄浆在数秒钟内迅速脱水干燥成大肠杆菌蛋黄抗体粉，喷雾干燥温度应控制在进口温度135℃、出口温度68℃，在干燥塔内存留3h。获得肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉。

实施例4：一种肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉的制备方法，包括以下步骤：

选择健康商品蛋鸡600只，以猪ETEC三联苗为抗原免疫蛋鸡，肌肉注射1ml/羽，获得特异性IgY，每隔15d加强免疫1次，剂量为1ml/羽，共强化免疫2次。首次免疫50d后可开始收集鸡蛋制备大肠杆菌蛋黄抗体粉，其后每隔40d再加强免疫一次，即可得到持续高效价IgY的鸡蛋。采用喷雾干燥技术将新鲜卵黄浆在数秒钟内迅速脱水干燥成大肠杆菌蛋黄抗体粉，喷雾干燥温度应控制在进口温度190℃、出口温度94℃，在干燥塔内存留2h。获得肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉。

实施例5：一种肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉的制备方法，包括以下步骤：

选择健康商品蛋鸡600只，以猪ETEC三联苗为抗原免疫蛋鸡，肌肉注射1ml/羽，获得特异性IgY，每隔15d加强免疫1次，剂量为1ml/羽，共强化免疫2次。首次免疫50d后可开始收集鸡蛋制备大肠杆菌蛋黄抗体粉，其后每隔40d再加强免疫一次，即可得到持续高效价IgY的鸡蛋。采用喷雾干燥技术将新鲜卵黄浆在数秒钟内迅速脱水干燥成大肠杆菌蛋黄抗体粉，喷雾干燥温度应控制在进口温度160℃、出口温度83℃，在干燥塔内存留4h。获得肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉。

实施例6：一种肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉的制备方法，包括以下步骤：

选择健康商品蛋鸡600只，以猪ETEC三联苗为抗原免疫蛋鸡，肌肉注射0.2ml/羽，获得特异性IgY，每隔15d加强免疫1次，剂量为0.2ml/羽，共强化免疫2次。首次免疫50d后可开始收集鸡蛋制备大肠杆菌蛋黄抗体粉，其后每隔40d再加强免疫一次，即可得到持续高效价IgY的鸡蛋。采用喷雾干燥技术将新鲜卵黄浆在数秒钟内迅速脱水干燥成大肠杆菌蛋黄抗体粉，喷雾干燥温度应控制在进口温度160℃、出口温度94℃，在干燥塔内存留4h。获得肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉。

实施例7、本发明所涉及到的仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗均为仔猪大肠杆菌病三价灭活疫苗，其余同实施例1-6所述。

其中，上述各组实施例中，在加工过程中应及时清理附积在机器干燥塔内的粉末，以保证大肠杆菌蛋黄抗体粉的高效价、高生产效率和低生产成本。

实验例

本实验例涉及本发明大肠杆菌蛋黄抗体粉对断奶仔猪生长和腹泻的影响。

材料与方法

大肠杆菌蛋黄抗体粉

大肠杆菌蛋黄抗体粉由双胞胎饲料有限公司制备，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的大肠杆菌蛋黄抗体粉按实施例2制得，试验Ⅳ组按实施例4制得，试验Ⅴ组按实施例5制得，试验Ⅶ组按实施例6制得。

试验动物与试验设计

试验动物选择双胞胎饲料有限公司下属养殖场平均体重为（7.46±0.15）kg的健康断奶仔猪384头，经统计分析体重差异不显著。采用单因子随机化设计，将384头健康断奶仔猪，按公母各半，分成8个组，每组6个重复，每个重复8头猪。

试验日粮

各组仔猪分别采食相应的试验日粮。其中对照组为基础日粮，试验Ⅰ组为基础日粮+大肠杆菌蛋黄抗体粉0.1%，试验Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ组为基础日粮+大肠杆菌蛋黄抗体粉0.2%，试验Ⅲ组为基础日粮+大肠杆菌蛋黄抗体粉0.3%，试验Ⅵ组为基础日粮+抗生素0.15%。添加卵黄粉的日粮中减少相应比例的豆粕。日粮均为粉状饲料。配方组成和营养水平见表1：

表1  各组饲料配方

饲养管理

所有试验仔猪自由采食和饮水，每周消毒一次，定期清扫卫生。试验期内每天观察并记录腹泻情况和猪只的精神状况。试验期共30天。试验结束时称体重，并结料。记录腹泻发病情况。计算每个处理组日增重、采食量、料肉比（采食量/增重）和腹泻率。

数据统计分析

试验数据采用SSPS13.0统计软件进行单因子方差分析。

结果（如表2）

表2  大肠杆菌蛋黄抗体粉对断奶仔猪生长和腹泻的影响

 

结论：试验结果表明，在断奶仔猪日粮中添加0.1%、0.2%和0.3%的大肠杆菌蛋黄抗体粉，仔猪的日增重比对照组分别提高11.1%、20.3%和15.1%；料肉比分别降低了0.09、0.15和0.12；腹泻率分别降低了18%、25%和24.8%，分析可知，添加0.2%和0.3%的大肠杆菌蛋黄抗体粉的改善效果均很明显，但添加0.3%的大肠杆菌蛋黄抗体粉的成本较高，所以0.2%是最佳添加量。添加抗生素组虽然仔猪的生长和腹泻都有所改善，但添加的成本高，而且有残留，食品的安全性得不到保障。试验结果还表明，试验Ⅳ、Ⅴ组和Ⅶ组的改善效果不明显，说明大肠杆菌蛋黄抗体粉的效价降低，进一步说明其效价与喷雾干燥温度、干燥塔内存留时间及免疫剂量密切相关，喷雾干燥温度偏高会导致部分大肠杆菌蛋黄抗体粉生物活性丧失，致使效价低；大肠杆菌蛋黄抗体粉在干燥塔内存留2-3h效价正常，超出存留范围其效价随着其在干燥塔内存留时间的延长而持续下降。

另外，从上述结果试验数据结果可以看出，由于本发明中的试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的大肠杆菌蛋黄抗体粉按实施例2制得，同时由实施例2制得的大肠杆菌蛋黄抗体粉的效价较高，但是本发明经试验验证得到，由实施例1及实施例3制得的大肠杆菌蛋黄抗体粉效价也较高。

小结：

大肠杆菌蛋黄抗体粉生产成本低、使用方便、容易保存，可以经口服而在小肠内局部发挥作用，不存在药物残留和耐药性的问题；而且大肠杆菌蛋黄抗体粉本身也是蛋白质，有促生长作用。如将大肠杆菌蛋黄抗体粉用于饲料添加剂，既可用于疾病的防治，降低腹泻率，又能提高动物的增重和饲料转化率，促进生长发育，而且还能克服药物治疗的某些缺点，并可以替代部分抗生素，因此具有很大的开发前景。

Claims (1)

1.一种肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉的制备方法，包括以下步骤：选择健康商品蛋鸡600只，以猪ETEC三联苗为抗原免疫蛋鸡，肌肉注射0.25ml/羽，获得特异性IgY，每隔18d加强免疫1次，剂量为0.5ml/羽，共强化免疫2次；首次免疫55d后可开始收集鸡蛋制备大肠杆菌蛋黄抗体粉，其后每隔40d再加强免疫一次，即可得到持续高效价IgY的鸡蛋；采用喷雾干燥技术将新鲜卵黄浆在数秒钟内迅速脱水干燥成大肠杆菌蛋黄抗体粉，喷雾干燥温度应控制在进口温度140℃、出口温度78℃，在干燥塔内存留2.5h；获得肠毒性大肠杆菌蛋黄抗体粉。