CN1622815B - 包含甲烷营养菌的生物质的免疫刺激物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种组合物作为免疫刺激物的用途，所述组合物包含源自含有甲烷营养菌的培养物的生物质。该生物质的免疫刺激作用使得该组合物特别适合用来防止动物体内的疾病或病情，所述疾病或病情与任何外源性异质物质如病原性微生物相关，或由其引起或由其促成。优选用于本发明的生物质来自包含荚膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB 11132)，DB3(菌株NCIMB 13287)和DB5(菌株NCIMB 13289)微生物培养物，可选地还包含DB4(菌株NCIMB 13288)的微生物培养物。

Description

包含甲烷营养菌的生物质的免疫刺激物
本发明总体涉及增强人和非人动物内的免疫应答，例如，免疫刺激。更具体地，本发明涉及使用源自含有甲烷营养菌的培养物的生物质(biomass)作为免疫刺激物，例如来增强人或非人动物对感染的抵抗力。 
任何动物中免疫系统的角色对于消灭感染，例如在控制由于外部原因例如病毒，细菌和其它病原体引起的疾病中都是极为重要的。 
目前对利用能够在任何非人动物中产生免疫刺激效应从而能够保持和/或增强免疫系统的应答的试剂有很大的兴趣。这样，动物消除感染的能力提高从而使其整体健康和生存力增强。 
已知一些细菌及其提取物经口服给药动物后可以提高对一些抗原的免疫应答。例如，据报道有一些细菌肽聚糖可以增强免疫应答。也发现属于酿酒酵母(Saccaromyces cerevisiae)属的多种酵母菌及其例如不可溶的葡聚糖等提取物显示非特异性免疫刺激特性。然而，仍然需要其他可以刺激(例如增强)免疫应答的物质，尤其是也显示良好的营养特性的物质。 
本发明提供了一种免疫刺激剂，它来自含有甲烷营养菌的微生物培养物，优选来自含有细菌荚膜甲基球菌(Methylococcus capsulatus)，以及Ralstonia sp.，土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)和Aneurinibacillus sp.的培养物。 
因此，根据一方面，本发明提供了从含有甲烷营养菌的培养物中获得的生物质用作免疫刺激剂，例如用于保持和/或增强人或非人动物体的免疫系统的方法中。 
根据本发明的另一方面，本发明提供了本文的生物质在生产用作免疫刺激物的制剂中的用途，例如用于保持和/或增强人或非人动物的免疫系统的方法。 
本发明的另一方面提供了保持和/或增强人或非人动物体内的免疫系统的方法，所述方法包括给药所述机体治疗有效量的本文所述的生物质。 
本文术语“免疫刺激的”指参与正常免疫应答的细胞增强的功能。因此，观察到动物体内由淋巴细胞介导的细胞和/或体液应答增强。增强的应答可以通过以后描述的增强的补体活性，溶菌酶活性，细胞免疫应答或免疫球蛋白水平反映。方便地，在适当的样品中检测免疫球蛋白水平，例如IgG水平，并且和正常人或非人动物(即没有给药根据本发明的免疫刺激物的人或非人动物)中相应样品中的这种水平进行比较。可检测具体免疫球蛋白类型(例如IgG或IgA)的免疫球蛋白水平或对一种或多种特异性抗原特异的免疫球蛋白的水平。上述一种或多种免疫球蛋白的水平或者免疫应答水平的其它适当标志物在统计学上显著升高(例如大于约5％，优选10％)反映了功能增强。 
用于本发明的方法的生物质源自包含甲烷营养菌的微生物培养物，可选地与一种或多种异养菌组合，尤其优选甲烷营养菌和异养菌的组合。本文的“甲烷营养的”包含任何利用甲烷，甲醇或甲醛生长的细菌。术语“异养的”用于利用除了甲烷，甲醇或甲醛以外的有机基质生长的细菌。 
用于本发明所述方法的细菌生物质可通过细菌在适宜的培养基或底物上生长形成。用于生产该生物质的生长培养基的确切性质不是关键的，而且可以使用多种适宜的底物。 
方便地，通过发酵法可生产该生物质，在该方法中，将氧气和适宜的底物例如液体或气体碳氢化物，乙醇或碳水化合物，例如甲烷，甲醇或天然气以及营养性的含矿物质的溶液给予含有该微生物的管状反应器。本领域已知多种这样的方法并在例如WO01/60974，DK-B-170824，EP-A-418187和EP-A-306466中描述，其内容包含在本文中作为参考。 
用于本发明描述的方法中的生物质物质将优选来自碳氢化物级分或天然气的发酵。尤其优选的是来自天然气发酵的生物质物质。通常在这种方法中，随着发酵器内微生物的浓度升高，取出部分反应器内容物或培养基，并且通过本领域已知的技术分离该微生物，例如离心和/或超滤。方便地，在这种发酵方法中，连续从发酵器中取出培养基，并且细胞的浓度在1到5％的重量比之间，例如重量比为约3％。 
用于本发明的优选细菌包括荚膜甲基球菌(Bath)，这是一种最早在英格兰Bath的温泉中分离的嗜热菌，并在The National Collections of Industrialand Marine Bacteria，Aberdeen，Scotland中保藏，保藏号为NCIMB11132。荚膜甲基球菌(Bath)的最佳生长温度为约45℃，但也可以在37℃和52℃之间生长。它是革兰氏阴性的不运动的球型细胞，通常成对出现。细胞内膜 通常排列成泡状圆盘(vesicular disc)的束，这是I型甲烷营养菌的特征。荚膜甲基球菌(Bath)是一种遗传非常稳定的微生物并已知没有质粒。它可利用甲烷或甲醇来生长，并利用氨，硝酸盐，或分子氮作为蛋白质合成的氮源。 
其他适宜用于本发明的细菌包括异养菌DB3，菌株NCIMB13287(Ralstonia sp.以前称为Alcaligenes acidovorans DB3)，DB5，菌株NCIMB13289(土壤短芽孢杆菌(Brevibacillus agri)以前称为坚强芽孢杆菌(Bacillusfirmus)DB5)和DB4，菌株NCIMB13288(Aneurinibacillus sp.以前称为短芽孢杆菌(Bacillus brevis)DB4)，每种细菌在约45℃时均具有最佳生长。 
DB3是一种革兰氏阴性的，需氧的可运动的杆菌，属于Ralstonia属，它利用乙醇，乙酸盐，丙酸盐和丁酸盐生长。DB4是一种革兰氏阳性的，形成内生孢子的需氧杆菌，它属于Aneurinibacillus属，可以利用乙酸盐，D-果糖，D-甘露糖，核糖和D-塔格糖。DB5是一种革兰氏阳性的内生孢子形成的可运动的需氧杆菌，属于短芽孢杆菌(Brevibacillus)属，可以利用乙酸盐，N-乙酰-葡萄糖胺，柠檬酸盐，葡糖酸盐，D-葡萄糖，甘油和甘露醇。 
利用天然气作为唯一的碳源和能量源的发酵法的一个实例在EP-A-306466(Dansk Bioprotein)中描述。该方法以利用甲烷生长的甲烷营养菌荚膜甲基球菌的连续发酵为基础。空气或纯氧气用于氧化且氨气用作氮源。除了这些底物以外，细菌培养通常还需要水，磷酸盐(例如磷酸)和多种矿物质，包括镁，钙，钾，铁，铜，锌，锰，镍，钴和钼，通常用其硫酸盐，氯化物或硝酸盐。 
尽管来自不同油田的天然气的成分不同，天然气主要由甲烷组成。通常，预期天然气含有约90％的甲烷，约5％的乙烷，约2％的丙烷和更高级的碳氢化物。在天然气的发酵中，通过甲烷营养细菌将甲烷氧化成生物质和一氧化碳。甲醇，甲醛，和甲酸通常是代谢中间体，甲醛和一部分二氧化碳被同化成为生物质。然而，甲烷营养菌不能利用包含碳-碳键的底物生长，而且天然气的剩余成分，即乙烷，丙烷，和一部分更高级的碳氢化物被甲烷营养菌氧化产生相应的羧酸(例如乙烷被氧化成乙酸)。这种产物可以抑制甲烷营养菌并因此需要在生产生物质的过程中保持低浓度，优选低于50mg/l。这一问题可以通过联合使用一种或多种异养菌解决，所述异养菌可以利用甲烷营养菌的代谢产物。这种细菌还能够利用细胞裂解释放到发酵培养基中的有机物质。这对于避免泡沫形成很重要，并且可以最小化培 养基被不需要的细菌污染的危险性。甲烷营养菌和异养菌的组合使培养稳定且高产，并尤其优选用于本发明的方法中。 
在生物质的生产过程中，发酵混合物的pH值通常可以被调节到约6到7之间，例如调节到6.5±0.3。本领域熟练技术人员可轻易选出适宜调节pH的酸/碱。尤其适合本发明的是氢氧化钠和硫酸。在发酵中，发酵器内的温度应该优选保持在40℃-50℃之间，最优选45℃±2℃。 
尤其优选用于根据本发明的方法中的微生物培养包含甲烷营养菌荚膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB11132)，和异养菌DB3(菌株NCIMB13287)和DB5(菌株NCIMB13289)，可选与DB4(菌株NCIMB13288)相组合。DB3的作用是利用荚膜甲基球菌(Bath)从天然气中的乙烷和丙烷产生的乙酸和丙酸。DB3可达到产生的生物质的细胞总数的10％，例如约6到8％。DB4和DB5的作用是利用培养基中的裂解产物和代谢物。通常，DB4和DB5各占连续发酵中细胞计数的1％以下。 
用于制备所述生物质的适宜发酵器是例如DK1404/92，EP-A-418187和EP-A-306466(授权Dansk Bioprotein)中描述的环型的(loop type)发酵器，或气提反应器(air-lift reactors)。具有静力混合器(static mixer)的环形发酵器的气体利用率较高(例如达95％)，这是由于该发酵器的塞式流动(plug-flow)特性。气体在沿环的多个位置引入，并与液体保持接触直到所述气体被分离进入该环的末端头部空间。通过使用2-3％的生物质(基于干重)和0.02到0.50h-1，例如0.05-0.25h-1的稀释率可实现连续发酵。 
可用其他发酵器制备该生物质并且这些发酵器可包括管状和搅拌槽式发酵器(stirred tank fermentors)。 
通常，天然气发酵制备的生物质可包含60-80％重量的粗蛋白，5-20％重量的粗脂肪，3-10％重量的灰，3-15％重量的核酸(RNA和DNA)；10-30g/kg的磷，达350mg/kg的铁，达120mg/kg的铜。尤其优选，所述生物质包含68-73％，例如约70％重量的粗蛋白，9-11％，例如约10％重量的粗脂肪；5-10％，例如约7％重量的灰；8-12％，例如约10％重量的核酸(RNA和DNA)；10-25g/kg的磷；达310mg/kg的铁；和达110mg/kg的铜。所述蛋白的氨基酸分布可预期为含有高比例的在营养上更重要的氨基酸，所述氨基酸例如半胱氨酸，蛋氨酸，苏氨酸，赖氨酸，色氨酸和精氨酸。通常这些氨基酸分别以大约0.7％，3.1％，5.2％，7.2％，2.5％和6.9％的量存 在(以氨基酸总量的百分比表示)。通常脂肪酸将主要包含饱和棕榈酸(大约50％)和单不饱和棕榈油酸(大约36％)。该产物的矿物质含量通常包含高百分含量的磷(约1.5％重)，钾(约0.8％重)和镁(约0.2％重)。 
通常，产生的生物质是易流动的水性糊状或浆状物。通常该生物质基本由完整的细胞物质组成，但也可以存在部分破裂的细胞物质。 
来自发酵器的产物可直接(即不进一步加工)用作本文所述的任何方法中使用的组合物或其组分或前体物质。然而，通常要经过离心和/或过滤(例如超滤)的组合加工从而在使用之前降低水的含量。在离心中，生物质的干物质含量通常增加重量的约2到约15％，例如增加重量的约12％。超滤可在40和50℃之间完成，例如42和46℃之间，进一步将产物中生物质的比重浓缩到10-30％，优选15到25％，例如15到22％。在超滤中使用的大小排除法通常在约100,000道尔顿的范围内。超滤后冷却该生物质优选到10-30℃，例如到约15℃，可通过例如将浓缩的蛋白浆通过热交换器上的超滤单位，然后存留在pH5.5-6.5，温度10-20℃，更优选5-15℃的恒温缓冲槽中，存留例如1-24小时，优选5-15小时，例如5-12小时。 
离心和/或超滤后该生物质物质将成为相对较粘的蛋白浆或糊。尽管可直接将该物质用作本发明所述方法中所用的产物或其组分或前体，通常进一步处理该物质从中去除过多的水分。任何一步或几步附加干燥步骤的选择有赖于该物质的水含量以及终产物的所需湿度。 
通常，根据本领域已知的喷雾干燥技术(spray drying techniques)来进一步加工该产物。可使用有或没有流体床单位(fluid bed units)的任何传统的喷雾干燥器。例如可用自APV Anhydro，Denmark购得的3-SPD型喷雾干燥器。优选喷雾干燥器入口的空气温度约300℃而出口温度约90℃。优选生成的产物具有的水含量比重约2到10％，优选6到8％，例如约5％。生成的产物通常是自由流动的颗粒物，其颗粒大小为0.1到0.5mm，优选0.15到0.2mm.。 
本文的生物质物质的免疫刺激作用使得它适合用于提高动物(即人和非人动物)的健康和总体生存力。例如，可使用该生物质预防任何动物体内的疾病或病情，所述疾病或病情与例如病原性微生物等任何外源性异质物质有关，由其造成或促成。这种疾病或病情的实例包括任何病毒或细菌源性感染的疾病，例如胃肠道疾病，如沙门氏菌病，痢疾和寻常腹泻(例如由 于感染了诸如大肠杆菌，肠杆菌，沙门氏菌和变形菌之类的微生物引起)。 
该物质尤其适用的是作为动物饲料，用于其中或作为其添加剂，尤其是喂养用作“食品”食用的动物，即通常为人类食用而饲养的动物。可根据本发明所述的方法饲养和/或处理的“食品”动物的实例包括猪，家禽(例如鸡)和鱼(例如鲑鱼，鳟鱼，鳕鱼，大比目鱼等)。本文所述的物质可给予健康的动物来提高饲料利用率并改善该动物的总体健康和生存力。例如，该物质可降低动物对疫苗和抗生素的依赖性。 
当用于饲养“食物”动物时，在生产时可以任何适宜的方式将该生物质掺入传统的动物饲料(例如肉，球丸，挤压的球丸，以肉类为基础的产品，谷类饲料，以大豆为基础的产品等)。可选地，还可以饲料添加剂的形式提供该生物质，并以足以提供所需免疫刺激效果的量与传统动物饲料混合，或者在动物食用前即刻添加到其中。 
本发明所述的物质也可用于保持和/或增强宠物的健康和生存力。相应地，该物质也可用于生产宠物食品或宠物食品添加剂。 
本文术语“宠物食品”通常指任何本打算给宠物食用的食品。具体地，包括营养平衡的食品组合物，所述食品组合物意图为动物提供基本上唯一的饮食。营养平衡的食物含有蛋白质，碳水化合物，脂肪，微生物和矿物质，其量足以使动物充分生长和维持(即健康)。本文术语“宠物”主要意欲包含猫和狗，特别是狗。然而，本文所述的产物还可用作食物，用于食物中，或用作食物添加剂，所述食物意图被例如兔子，豚鼠，热带鱼，鸟等任何基本上是家养的或驯化的动物或鸟类食用。术语“宠物”不打算包括牲畜例如猪，鸡，牛等，或者任何主要为人类食用饲养的动物，例如鲑鱼等鱼。 
本文术语“宠物食物添加剂”指例如生产过程中或使用该食物前即刻打算添加到(例如掺入和/或用于)宠物食物中的任何产品。例如，本文所述生物质的物质可分散在宠物食物中或存在于宠物食物的任何组分(例如肉汁或调味汁)中，或包被在食物的外表面(完全或部分)。可选地，该生物质物质可在动物食用前即刻以宠物食物添加剂的形式与传统的宠物食物混合或用于其中。例如，可大量地撒在或喷在事物的表面，其量足以产生所需的免疫刺激效果。 
所述生物质的物质可添加或应用的典型的宠物食物组合物包括家禽或 牛肉副产品，和以大豆为基础的制品。优选的组合物是商业上销售并且营养上均衡的组合物。 
本文所述免疫刺激剂将用于动物食物(宠物食物和“食品”动物食用的饲料)中，其量足以有效提供免疫刺激效果。该物质的适当掺入水平有赖于多种因素，例如动物种类，年龄和目的动物的体积。本领域熟练技术人员可轻易确定适宜的水平。通常，当加入传统的动物饲料或宠物食物中时，掺入的水平在1到40重量％，例如2-20重量％的范围，可提供免疫刺激效果。 
本文所述的物质也可用于改善人的免疫系统。例如，可将该物质作为饮食增补剂掺入正常饮食中，或者加入一些用于人食用的食品中，以便提供所需的免疫刺激效果。含有适当量的所述产品的食品产品的实例包括例如，烤制产品，肉产品等。所述产品也可用作素食品中的肉类替代品。 
以食品增补剂提供的该产物可以是液体。然而，通常以粉末的形式提供，该形式存储的时间较长且不会降解，并可以适当的量加入食品中或者在食用前即刻溶解成液体形式(例如通过加入水)。可选地，还可将该物质配制成组合物经肠内(例如经口)给予。可以任何口服给药形式提供适宜的组合物，例如作为胶囊或片剂。当以液体的形式提供该产品时，通常将该产品悬浮于例如无菌水的适当液体介质中并置于安瓿中。 
尽管主要描述的用途是作为口服制剂，本文的免疫刺激物还可通过任何其它本领域已知的适宜方法给药，包括例如肠胃外(例如肌肉内，皮下，腹膜内或经静脉内)，经直肠或局部给药。 
任何包含该产品的组合物可单独或与至少一种生理上可接受的载体组合给药予接受者(例如人或非人动物)。本文术语“生理上可接受的载体”意图包含任何可与该产品共同给药并使该产品行使其目的功能的物质。这种载体的实例包括溶液，溶剂，分散剂，推迟剂(delay agents)，乳剂等。 
本发明另一方面提供了包含本文所述的生物质和至少一种生理上可接受的载体的组合物。 
本领域熟练技术人员可轻易确定能够在人体内提供免疫刺激效应的适宜的剂量。适宜的剂量有赖于多种因素，包括病人的年龄和体重，和给药途径。通常口服给药的日剂量的范围是0.1-0.25g，例如0.12-0.2g每公斤体重。
本文所述的产品和组合物也可用于和其它对抗感染的方法组合，例如与疫苗组合以增强其活性。因此，本文的免疫刺激剂可以单独或以混合物的形式和另一种药物产品组合，例如与对抗耶尔森氏鼠疫杆菌肠道病(yersiniosis)或疖病(furunculosis)的疫苗组合。 
本发明的另一方面提供了包含本文所述的生物质和至少一种疫苗的组合物。 
本文的另一方面提供了含有本文所述的生物质和分开存在的疫苗的产品，所述生物质和疫苗同时，分别或序贯的用于保持和/或增强人或非人动物体的免疫系统的方法中。 
在以下非限制性实施例中将更详细地描述本发明，同时参考附图： 
图1a显示了累计死亡率，表示为相对于实施例2所述研究开始时鱼总数的百分比。 
图1b显示了累计死亡率，表示为在实施例2所述研究的最后8周中的第10周存活的鱼的百分比。 
图2显示了大西洋鲑血清中的补体的溶血活性，该鱼用含有各种剂量的所述生物质的饲料喂养。 
图3显示了大西洋鲑血清中的溶菌酶活性，该鱼用含有各种剂量的所述生物质的饲料喂养。 
图4显示了大西洋鲑血清免疫球蛋白总量，该鱼用含有各种剂量的所述生物质的饲料喂养。结果显示为样品的光密度(OD)与正常血清的光密度的比值。 
图5显示了接种疫苗后大西洋鲑的血清中对鲁氏耶尔森氏菌(Y.ruckeri)的抗体应答，该鱼用含有各种剂量的所述生物质的饲料喂养。结果显示为样品的光密度(OD)与阳性对照血清的光密度的比值。 
图6显示了接种疫苗后大西洋鲑的血清中对杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)的抗体应答，该鱼用含有各种剂量的所述生物质的饲料喂养。结果显示为样品的光密度(OD)与阳性对照血清的光密度的比值；以及 
图7显示了大西洋鲑体内对大肠杆菌脂多糖(LPS)和植物凝集素(pHA)这两种有丝分裂原和鲁氏耶尔森氏菌和杀鲑气单胞菌的两种抗原性制品的体外淋巴细胞应答，该鱼用含有各种剂量的所述生物质的饲料喂养。在试验开始8周(图7a)和18周(图7b)测定样品。
图8显示了各种喂养组中的大鼠血中生物质特异的抗体的平均滴度值(2Y)。对于FO，每组n＝8而对F1，n＝5。各组分别计算标准差。 
实施例1：制备生物质 
在45℃，pH6.5的铵/矿物盐介质(AMS)中于环型发酵器中进行天然气的连续有氧发酵，生成含有荚膜甲基球菌(Bath)(菌株NCIMB11132)，DB3(菌株NCIMB13287)，DB5(菌株NCIMB13289)，和DB4(菌株NCIMB13288)的微生物培养物。每升AMS介质含有以下物质：10mg NH3，75mgH3PO4·2H2O，380mg MgSO4·7H2O，100mg CaCl2·2H2O，200mg K2SO4，75mg FeSO4·7H2O，1.0mg CuSO4·5H2O，0.96mg ZnSO4·7H2O，120μgCOCl2·6H2O，48μg MnCl2·4H2O，36μg H3BO3，24μgNiCl2·6H2O和1.20mg NaMoO4·2H2O。 
发酵器内充满在125℃下热消毒10秒的水。根据消耗调节其它营养成分。由于一段时间后逐步增量(build-up)，用1-3％的生物质(基于干重)进行连续发酵的操作。 
生物质经工业离心机离心，其中的干物质含量比重从约2％增加到15％。使用排除大小为100,000道尔顿的超滤单元进一步浓缩该生物质生成的产物含有15-22％重的生物质。超滤过程中的温度保持在40-50℃之间。超滤后通过使浓缩的蛋白浆通过热交换器上的超滤单元冷却该生物质到10-30℃。产生的产物是不含不需要的细菌污染的稳定培养物。 
超滤后，相对较粘的蛋白浆经喷雾干燥器干燥。喷雾干燥器的入口空气温度约300，而出口温度约90℃，产生的终产物的水含量重约5％。 
产生的生物质具有以下特性： 
组合物(产品中的％)                矿物质 
粗蛋白*         66                磷             1.0％ 
粗脂肪          9                 氯             0.7％ 
灰              7                 硫             0.5％ 
水              6                 钙             0.4％ 
粗纤维          1                 钾             0.4％ 
不含N的提取物   11                镁             0.2％ 
总量            100               钠             0.1％
                                        铁                  200ppm 
氨基酸(产品中的％)                      铜                  90ppm 
赖氨酸        4.3                       锌                  15ppm 
蛋氨酸        1.9                       砷                  0.05ppm 
半胱氨酸      0.4                       硒                  0.02ppm 
苏氨酸        3.1                       铅                  0.0002ppm 
色氨酸        1.5                       镉                  0.00002ppm 
亮氨酸        5.2                       汞                  <0.02ppm 
异亮氨酸      3.2 
缬氨酸        4.2                       维生素              mg/kg 
酪氨酸        2.8                       烟酸                123 
苯丙氨酸      3.1                       核黄素              69 
组氨酸        1.7                       肌醇                28 
精氨酸        4.1                       硫胺素 B1           11 
丙氨酸        4.9 
天冬氨酸      6.2                       能量                MJ/Kg 
谷氨酸        7.3                       总能量              22.1 
甘氨酸        3.4 
脯氨酸        3.0                       其他资料 
丝氨酸        2.5                       颜色                浅褐色 
总量          62.8                      气味                中性 
                                        颗粒 
                                        大小                100-300μm 
*表示在干重基础上的粗蛋白含量是大约70％ 
实施例2：研究 
研究的目的是检验实施例1中生成的生物质对免疫系统的影响。对大西洋鲑进行了非特异的和特异的体液免疫应答，细胞免疫应答和试验性感染的研究。在为期18周的研究中，给予各组鱼的饲料中的标准蛋白被20％，40％和60％的生物质取代。对照组接受标准饲料。
通过血清中溶菌酶活性，补体活性和免疫球蛋白总量测定非特异性体液免疫应答。 
通过测定接种疫苗后鲁氏耶尔森氏菌和杀鲑气单胞菌的抗体水平研究特异性体液免疫应答的形成。 
通过未接种疫苗的鱼中的淋巴细胞刺激实验研究细胞免疫应答。 
材料和方法 
鱼 
鱼保存在Felleskjpet，Norsk Bioakva A/S，Dirdal的研究站。将共4080条未接种大西洋鲑(Salmo salar L.)的一岁幼鲑分成4组，试验开始时体重平均为50克。每组分布在3个平行的4平方米大小的水池中，每个水池中共有340条鱼。在自然光的条件下，鱼新近已二龄化(smoltified)。试验持续18周。 
水 
用来自90米深的海水为水池供水，其盐度为30-33％，平均温度为9.0℃(范围7.8-11.3℃)。由于渗透调节的问题，水的盐度在8周后被调节到20-23％。 
喂养 
四组鱼接受四种不同的喂养(表1和2)。对照饲料中鱼肉(Norse LT94，Nordsildmel，Bergen)是主要的蛋白来源，据此制备了三种试验饲料，其中20％，40％和60％的粗蛋白由实施例1中的生物质组成。通过Kjeldahl-N*6.25法进行所有蛋白测定，且并不校正存在于生物质中的核酸。生物质中碳水化合物的量由非热处理的小麦平衡。含有高水平生物质的饲料中补充了DL-蛋氨酸。在Norsk Bioakva AS，Sandnes，Norway，通过实验室的造粒机(lab-pelletizer)生产饲料而不加入蒸汽。通过Soxleths方法(表2)分析脂肪(脂类)的量。测定包括纤维素部分在内的碳水化合物的量表示为100％减所测产品的剩余成分的差。 
通过自动进料器喂养鱼。水槽分成各区，且每种饲料随机分配在各区内。根据基于温度和鱼的大小的生长表计算日喂养量。根据鱼的实际体重每4周调整喂养方案。 
表1：试验饮食中原料组分占总饲料的百分比 
  
饲料 0％生物质*对 20％生物质* 40％生物质* 60％生物质*
  
  照      
鱼肉-LT 58.2 45.7 33.2 20.7
DL-蛋氨酸 0.0 0.0 0.01 0.06
小麦 30.6 29.6 28.6 27.7
鱼油 9.9 9.9 9.9 9.8
维生素/矿物质预混合料      1.3 1.3 1.3 1.3
生物质acc.Ex.1 0.0 13.5 27.0 40.5
*表示为饮食中总粗蛋白的％ 
表2：试验饮食的化学组分占总饲料的百分比 
  
饲料 0％生物质* 20％生物质* 40％生物质* 60％生物质*
脂类 16.3 16.7 16.9 17.0
蛋白 41.9 42.3 43.2 43.6
碳水化合物 23.4 24.4 24.0 24.5
灰 9.4 8.3 6.7 5.8
水 9.0 8.3 9.2 9.1
*表示为饮食中总粗蛋白的％ 
免疫 
试验饲料喂养8周后，标记来自三个平行水池之一的各喂养组的100条鱼，并通过腹膜内注射用耶尔森氏鼠疫杆菌肠道病的商业疫苗(Ermvaks，Leo vet.，Lovens Kemiske fabrik，Denmark)进行免疫。标记同一水池中各组另外的100条鱼并用疖病疫苗(Furogen，Aqua Health，Canada)进行免疫。 
取样 
接种疫苗时，接种后4，8和10周后从鱼中取血样。从尾静脉收集血液，并分离血清，在干冰上运输并保存在-70℃直到进一步分析。接种时和接种10周后取样来自前肾的组织。在冰上的组织培养基中保存该组织4到6小时直到进一步分析。 
死亡率 
在试验中，死亡出现在两个不同的时间段。当地的兽医检查了鱼。在死亡的第二个时间段，对死鱼取样并检验感染性胰腺坏死病毒(IPNV)的存 在。完整的鱼保存在冰冻状态下直到进行分析。切下仍在冰冻状态下的来自胰腺的组织，然后由磷酸盐缓冲的福尔马林固定24小时，并用石蜡包埋。用多克隆兔抗IPNV Sp抗血清温育该组织。使用碱性磷酸酶偶联物和固红(Fast red)作为生色原进行反应。 
免疫参数 
各种免疫参数的实验在The National Veterinary Institute，Oslo进行。 
补体活性
通过羊红细胞(SRBC)的自发溶血活性(SH)测定补体活性。在56℃0.094M蔗糖-巴比妥缓冲液中混合含有0.25％的包装SRBC的1％琼脂糖，并倒在琼脂糖包被的载玻片上。将10μl血清样品加入样品孔。在22℃下温育该玻片20小时，用福尔马林固定，并干燥。测定溶解环(lysed zone)的直径。以稀释两倍的鲑鱼血清样品作为标准。溶血活性被定量为与标准品溶血活性的百分比。 
溶菌酶活性
使用微球菌溶菌板实验(Micrococcus lysoplate assay)测定血清溶菌酶活性。在56℃0.06M磷酸钠(pH6.6)中混合含有溶壁微球菌(Micrococcuslysodeicticus)的1％琼脂糖，并倒在琼脂糖包被的载玻片上。将10μl以1：10稀释的血清样品加入样品孔。在22℃温育该玻片20小时，在蒸馏水中洗涤，并干燥。用1.25％的甲基紫然后用鲁戈氏液对该板进行染色，之后用乙醇进行脱色直至出现清楚的环。测定裂解环的直径。以稀释两倍的正常鲑鱼血清样品作为标准。溶菌酶活性被定量为与对照血清的溶菌酶活性的百分比。 
总免疫球蛋白
通过酶联免疫吸附试验(ELISA)测定各喂养组中未经过接种的鱼血清中免疫球蛋白的总量。在包被缓冲液中，用稀释度为1∶1000的多克隆兔抗鲑鱼Ig抗血清的包被缓冲液包被聚苯乙烯微滴定板。加入适当稀释度的鱼血清并在4℃温育过夜。用单克隆抗鲑鱼Ig抗体和酶标的绵羊抗小鼠Ig偶联物进一步进行显色反应。结果表示为试验样品与参考血清的光密度(OD)的比值。 
特异性抗体应答
使用ELISA测定接种前后对鲁氏耶尔森氏菌和杀鲑气单胞菌的特定抗 体应答，其中的板用鲁氏耶尔森氏菌或杀鲑气单胞菌的超声处理物(sonicate)包被。实验如上述进行。结果表示为试验样品和阳性对照血清的OD读数的比值。 
细胞免疫应答
开始喂养检测饲料后两个月(接种时)和四个月对未经接种的鱼进行淋巴细胞刺激实验，并且如试验第一年的报告所述进行。使用以下刺激物： 
1.大肠杆菌的脂多糖(LPS) 
2.植物凝集素(pHA) 
3.完整的福尔马林杀死的鲁氏耶尔森氏菌 
4.完整的福尔马林杀死的杀鲑气单胞菌 
统计学方法 
使用双尾Wilcoxon’s秩合检验分析不同喂养组和不同时间点的总免疫球蛋白，特异性抗体应答和淋巴细胞刺激之间的差异的统计学意义。不同喂养组和不同时间点的溶菌酶和补体活性差异的统计学意义通过t检验进行分析。所有试验的显著性水平均设为p＝0.05。 
结果 
死亡率 
在试验的两个不同阶段中可观察到高死亡率(图1a)。在第一阶段，从第5周到11周，观察到严重的鱼鳞丢失，脱水和皮肤损伤。因此将死亡诊断为由渗透调节中的缺陷造成。为避免更多的死亡，降低了水的盐度。立刻观察到死亡率降低。从第14周起，死亡率再次增加(图1b)，鱼显示了IPNV感染的临床征象。18周后，存活的鱼只剩下总量的约50％。 
从下表3可见，在12个不同水池的10个水池中的鱼对IPNV抗原呈阳性反应。在6个水池中，所有取样的鱼均呈阳性反应。然而，增加饲料中生物质的量，呈阴性反应的鱼的数量呈增加趋势。 
表3：第二次死亡爆发中死亡的鱼体内IPNV抗原的存在情况 
  
饲料 阳性鱼的数目/不同槽中测试的鱼的数目(阳性％)
0％生物质*，对照 17/17　　15/15　　15/15(100％)
20％生物质* 18/18　　0/4　　　15/15(89％)
40％生物质* 13/16　　0/16     15/18(56％)
60％生物质* 6/15     15/15    1/15(49％)
*表示为食物中总粗蛋白的％ 
可推论IPNV感染是造成试验中第二阶段的死亡中所观察到的死亡率的最主要原因。 
免疫参数 
补体活性
随试验饲养的时间增加，溶血活性也显著增加，而接种疫苗并不影响补体活性(图2)。生物质在饲料中的量的增加使得活性的边界(borderline)显著增加。 
溶菌酶活性
通过增加饲料中生物质的量和增加试验饲料饲养的时间，溶菌酶的量显著增加(图3)。疫苗接种不影响溶菌酶的量。 
总免疫球蛋白
总血清免疫球蛋白的浓度随时间的增加而显著增加，但不受饲料中生物质的量的影响(图4)。每组的每条鱼之间有大的差异。 
特异性抗体应答
对鲁氏耶尔森氏菌和杀鲑气单胞菌的特异性抗体应答分别显示在图5和6中。在一个或多个时间点，40％和60％的生物质饲料组中的应答低于对照组中的应答。每条鱼之间有大的差异，且抗体应答，尤其是对杀鲑气单胞菌的抗体应答，比阳性对照血清中的抗体应答低得多。 
细胞免疫应答
体外淋巴细胞刺激表示为图7中的每分钟的总计数(cpm)。所有组在试验喂养开始后8周反应良好，而试验喂养后18周的反应有些低。然而，除鲁氏耶尔森氏菌刺激的培养物以外，各试验喂养组和对照喂养组之间没有统计学差异，但与对照喂养组相比，40％和60％生物质组中有更高的刺激，有显著意义。 
讨论 
死亡率 
第5-11周内的死亡率由皮肤损伤造成的脱水造成。皮肤损伤和鱼鳞丢失在此阶段常出现在二龄鲑中，而且这种鱼对处理(handling)极脆弱。 
第二次死亡爆发首先被兽医诊断为由于IPNV感染。为证实诊断，检验死亡的鱼中IPNV抗原的存在，并在大多数鱼中发现了特异性抗原。然而， 有这样一个趋势：增加饲料中生物质的量可增加对IPNV阴性的鱼的数量。在这次爆发期间，还有一个趋势：随饮食中生物质的增加，死亡率降低。免疫参数 
结果显示，通过增加试验饲养的时间或增加饮食中生物质的量或同时增加二个因素，测定的各种非特异性体液和细胞免疫参数增加。这种增加可部分由于部分检验期间感染的进行造成。已知溶菌酶活性在诸如疖病等的感染期间增加，因此IPNV的感染绝对可能产生同样类型的效果。发现溶菌酶的活性比通常观察到的高，此外还看到各活性之间的差异较大，表明有感染存在。据信接受实施例1的生物质的鱼的非特异性免疫应答增高，对IPNV爆发期间这些组显示更强的感染抵抗力有一定作用。 
在总血清免疫球蛋白的结果以及对鲁氏耶尔森氏菌和杀鲑气单胞菌的特异性抗体应答中也观察到了个体之间很大的差异。与以前的结果相比有一个趋势：接受40％和60％的生物质的鱼中应答较低。所有喂养组中抗杀鲑气单胞菌抗体应答的水平尤其低于通常在接种了抗疖病疫苗的二龄鲑中所见的水平。脱水和IPNV感染对这些结果都有一定影响。 
实施例3：研究 
研究的目的是分析大鼠血清中实施例1制备的称为生物质的物质(这里称“生物质”)特异的抗体。 
材料和方法 
测定FO代8个组中每组8只大鼠的血清中生物质特异抗体的水平，其中用含有0％，5.5wt.％，11wt.％和22wt.％的饲料喂养FO：雄性和雌性大鼠。此外，断奶后12周测定F1代动物体内上述抗体的水平：4个组中每组5只雄性大鼠(表4)。 
表4：F1代大鼠及其母鼠的饮食 
  
母鼠的饮食(F0) 子代的饮食(F1)
0％生物质 0％生物质
0％生物质 16.5％生物质
22％生物质 0％生物质
22％生物质 16.5％生物质
选择F1代大鼠的样品使得每窝中一只动物被检测。 
使用酶联免疫吸附试验(Elisa)按照P-01-011法进行测定。Elisa缓冲液的配方如下： 
碳酸盐缓冲液：pH9.6 
14mM Na2CO3，35mM NaHCO3
存储条件：4℃1个月 
温育缓冲液，pH7.4 
17mM Na2HPO4
3.0mM NaH2PO4
145mM NaCl 
1％三硝基甲苯X-100 
存储条件：4℃2个月 
洗涤缓冲液 
温育缓冲液稀释x10 
TMP标准溶液 
1.0g TMB 
20mlCH3COCH3
180ml CH3OH 
存储条件：-20℃1年 
过氧化物标准溶液(III) 
I：1.47M CH3CO2H 
II：1.4M CH3CO2Na，由I液调节到pH5.0 
III：4.3g NaBO2H2O2+250ml的II液 
存储条件：4℃避光6个月 
过氧化物缓冲液 
14.3ml过氧化物标准溶液 
加入蒸馏水到0.5升 
存储条件：4℃避光1周 
TMB/过氧化物溶液 
340μl　TMB标准溶液 
加入过氧化物缓冲液至12ml
存储条件：无 
在碳酸缓冲液，pH9.6中按1/68稀释生物质的过滤提取物。用100μl提取物包被Maxi-sorp Elisa微过滤板(Nunc442404A，批号052550)的各孔，并在4℃温育过夜。 
使用洗涤缓冲液洗涤该板4次。测定血清样品两次，并将具有预期高水平和预期低水平的生物质特异性抗体的十只动物的血清的两份标准混合物置于板上(每孔100μl)，26-213连续稀释。在振动工作台(shaker table)(100rpm)上于室温温育该板1小时，然后用洗涤缓冲液洗涤4次。然后将过氧化酶偶联抗体(兔抗大鼠抗体，Sigma A5795，用温育缓冲液1∶5000稀释)，加入各孔，每孔100μl，在室温于摇床(vibrating table)(100rpm)上温育该板1小时。使用洗涤缓冲液洗涤4次并用蒸馏水洗涤一次后，每孔加入100μlTMB/过氧化物溶液，在室温温育该板20分钟。将100μl2M H3PO4加入各孔。然后在450nm在酶免疫分析仪(microplate reader)(Bio-Tek Instruments，Inc.Elx808)上测定吸光度。 
使用KC4程序(Bio-TekInstruments，Inc.)处理原始数据。使用空白对照校正原始数据，并算出不同的特定吸光度值所对应的滴度值。所有分析中选定吸光度所对应的滴度值通过标准混合物中的吸光度校正。较少几例的滴度值在选定的吸光度以外，其结果通过标准混合物的滴度曲线外推得到。 
结果 
选定组的滴度值显示于附表8。 
雄性和雌性FO代大鼠中，0％和22％的滴度值有显著差异，然而其他组没有显著偏离对照组(α＝0.05)。F1代的四个组之间没有显著差异。 
讨论 
结果显示动物饮食中加入22wt.％的生物质导致生物质特异的抗体水平增加。无论亲代是否接受了含有生物质的饮食，在下一代中没有见到类似的差异。 
实施例4：研究 
小鼠对实施例1的称生物质的物质(这里称“生物质”)的免疫应答通过两种方法测定。第一种是ELISA试验，用来测定血液中生物质特异的总Ig和IgA和唾液中生物质特异的IgA。第二种方法是细胞增生试验，测定生物 质刺激脾细胞体外增生的能力。 
试验中给药不同浓度的生物质，给药低剂量与高剂量相比需要更多时间来诱导应答。试验中喂给小鼠生物质14天后喂给正常饲料，血液中生物质特异性IgA水平降低，而唾液中生物质特异性IgA的恒定水平保持不变。停止喂养生物质42天后，仍保持局部免疫应答，但没有系统应答。

Claims (14)

1.用作免疫刺激药物的一种组合物，所述组合物包含源自含有荚膜甲基球菌Bath菌株NCIMB 11132、DB3菌株NCIMB 13287、DB5菌株NCIMB13289和DB4菌株NCIMB 13288的微生物培养物的生物质，其中所述微生物培养物通过在包含水、磷酸盐和选自镁，钙，钾，铁，铜，锌，锰，镍，钴和钼的矿物质的营养性的含矿物质的溶液存在下空气或纯氧气用于氧化且氨用作氮源，对甲烷发酵产生，且发酵器内的温度保持在40℃-50℃之间，发酵混合物的pH调节到6-7之间。
2.权利要求1要求的组合物，其中所述微生物培养物通过对碳氢化物级分或天然气发酵产生。
3.权利要求2要求的组合物，其中所述微生物培养物通过对天然气发酵产生。
4.权利要求1到3中任一项要求的组合物，所述组合物用作免疫刺激剂。
5.权利要求4要求的组合物，所述组合物作为免疫刺激剂用于保持和/或增强人或非人动物体的免疫系统的方法中。
6.权利要求1到3中任一项要求的组合物，所述组合物用于防止任何疾病或病情，所述疾病或病情与病原性微生物相关，或由其引起或由其促成，其中所述疾病或病情是病毒或细菌源性的。
7.权利要求1到3中任一项要求的组合物用于生产一种用作免疫刺激物的试剂的用途。
8.权利要求7要求的用途，所述试剂用于保持和/或增强人或非人动物体的免疫系统的方法中。
9.一种组合物，所述组合物包含源自含有荚膜甲基球菌Bath菌株NCIMB 11132、DB3菌株NCIMB 13287、DB5菌株NCIMB 13289和DB4菌株NCIMB 13288的微生物培养物的生物质和至少一种疫苗，其中所述微生物培养物通过在包含水、磷酸盐和选自镁，钙，钾，铁，铜，锌，锰，镍，钴和钼的矿物质的营养性的含矿物质的溶液存在下空气或纯氧气用于氧化且氨用作氮源，对甲烷发酵产生，且发酵器内的温度保持在40℃-50℃之间，发酵混合物的pH调节到6-7之间。
10.权利要求9要求的组合物，其中所述微生物培养物通过对碳氢化物级分或天然气发酵产生。
11.权利要求10要求的组合物，其中所述微生物培养物通过对天然气发酵产生。
12.一种制品，它包含源自含有荚膜甲基球菌Bath菌株NCIMB 11132、DB3菌株NCIMB 13287、DB5菌株NCIMB 13289和DB4菌株NCIMB 13288的微生物培养物的生物质，并且另外包含疫苗，所述生物质和疫苗同时、分开或序贯地用于保持和/或增强人或非人动物体的免疫系统的方法中，其中所述微生物培养物通过在包含水、磷酸盐和选自镁，钙，钾，铁，铜，锌，锰，镍，钴和钼的矿物质的营养性的含矿物质的溶液存在下空气或纯氧气用于氧化且氨用作氮源，对甲烷发酵产生，且发酵器内的温度保持在40℃-50℃之间，发酵混合物的pH调节到6-7之间。
13.权利要求12要求的制品，其中所述微生物培养物通过对碳氢化物级分或天然气发酵产生。
14.权利要求13要求的制品，其中所述微生物培养物通过对天然气发酵产生。
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