JP2015534831A - 脂肪酸誘導体の生物学的生産のための組成物および方法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、供給原料としてＣ１基質（メタンまたは天然ガスなど）を利用する組換えＣ１代謝微生物から、脂肪酸誘導体（脂肪アルコールなど）を生物学的に産生するための組成物および方法を提供する。関連する態様では、本開示は、脂肪酸変換酵素をコードする組換え核酸分子を含む非天然メタン資化性菌であって、前記メタン資化性菌がＣ１基質をＣ８〜Ｃ２４脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、またはその組み合わせに変換することができる、非天然メタン資化性菌を提供する。

Description

本開示は、脂肪酸誘導体を生物学的に産生するための組成物および方法、より具体的には、組換えＣ１代謝微生物を使用してＣ１基質（メタンまたは天然ガスなど）から脂肪アルコール、ヒドロキシ脂肪酸、またはジカルボン酸を産生するための組成物および方法を提供する。
脂肪アルコールは、主に直鎖で１水酸基を有する脂肪族アルコールである。脂肪アルコールは、通常はＣ６からＣ２４までの非極性で親油性の飽和または不飽和炭化水素鎖および末端炭素に付着した極性で親水性のヒドロキシル基から構成される。脂肪アルコールは、界面活性物質、界面活性剤、潤滑油添加剤、消泡剤、溶解遅延剤、および稠度付与因子などとして広く適用される価値の高い化学物質である。２００９年の脂肪アルコール製造能力は、年間およそ２００万メートルトンであった。この製造能力にはＣ１２／Ｃ１４アルコール、Ｃ１６／Ｃ１８アルコール、およびＣ１５／Ｃ１８アルコールが含まれる。界面活性物質の世界市場規模は、２０１２年までに１６６億５０００万ドルに到達すると予想される。非イオン性界面活性物質は、界面活性物質市場において２番目に大きな製品群を構成している。脂肪酸ベースの界面活性物質は、非イオン性型の界面活性物質のおよそ２０％を占める。
現在、脂肪アルコール市場は、天然アルコール製品および合成アルコール製品が独占している。天然アルコールは、エステル交換プロセスおよび水素化プロセスを使用して植物または動物の天然の油、脂肪、およびワックス（ヤシ油またはパーム油など）から調製する。合成アルコールは、エテン、オレフィン、およびパラフィンなどの石油化学供給原料から、主にチーグラーアルコールプロセス、ＳＨＯＰプロセス、およびＯｘｏプロセスによって生産される。しかし、これらのプロセスは、過酷な生産環境、問題の有る土地利用慣行、または環境に有害な副生成物のいずれかを伴う。
豊富且つ費用効果のある再生可能資源からの脂肪アルコールの微生物生産を可能にする努力が払われている。特に、バイオマス由来の供給原料を脂肪アルコール（ラウリルアルコールなど）に変換するために組換え微生物（大腸菌および種々の酵母など）が使用されてきた。しかし、比較的安価なセルロース性バイオマスを供給原料として使用した場合でさえ炭水化物供給原料の質量の半分以上が酸素から構成され、このことが変換効率を著しく制限している。長鎖脂肪酸およびその誘導体（脂肪アルコール、ヒドロキシ−脂肪酸、脂肪アルデヒドなど）は供給原料より酸素含有量が有意に低く、酸素を廃棄物として除去しなければならない場合に理論収量が制限される。したがって、炭水化物供給原料からの脂肪酸およびその誘導体の生産費用は非常に高い。
脂肪アルコールおよび関連化合物の生産のための炭水化物ベースの発酵方法に関連する制限を考慮して、代替の費用効果が高く環境に優しい脂肪アルコールの生産方法が当該分野で必要である。本開示は、かかるニーズを満たし、他の関連する利点をさらに提供する。
一定の態様では、本開示は、非天然Ｃ１代謝非光合成微生物のＣ１基質供給原料との培養および脂肪酸誘導体の回収による脂肪酸誘導体の作製方法であって、前記Ｃ１代謝非光合成微生物が脂肪酸変換酵素をコードする組換え核酸分子を含み、前記Ｃ１代謝非光合成微生物がＣ１基質を脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、またはその組み合わせを含むＣ８〜Ｃ２４脂肪酸誘導体に変換する、作製方法を対象とする。
関連する態様では、本開示は、脂肪酸変換酵素をコードする組換え核酸分子を含む非天然メタン資化性菌であって、前記メタン資化性菌がＣ１基質をＣ８〜Ｃ２４脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、またはその組み合わせに変換することができる、非天然メタン資化性菌を提供する。一定の実施形態では、異種アシル−ＣｏＡ依存性または非依存性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子、異種チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子、および異種アシル−ＣｏＡシンセターゼをコードする組換え核酸分子を含む非天然メタン資化性菌であって、前記メタン資化性菌がＣ１基質をＣ８〜Ｃ２４脂肪アルコールに変換することができる、非天然メタン資化性菌を提供する。
さらなる実施形態では、カルボン酸レダクターゼをコードする組換え核酸分子、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ ｔｒａｎｆｅｒａｓｅ）をコードする組換え核酸分子、およびアルコールデヒドロゲナーゼをコードする組換え核酸分子を含む非天然メタン資化性菌であって、前記メタン資化性菌がＣ１基質をＣ８〜Ｃ２４脂肪アルコールに変換することができる、非天然メタン資化性菌を提供する。
なおさらなる実施形態では、異種脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子、異種チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子、および異種Ｐ４５０またはモノオキシゲナーゼをコードする組換え核酸分子を含む非天然メタン資化性菌であって、未変性アルコールデヒドロゲナーゼが阻害され、前記メタン資化性菌がＣ１基質をＣ８〜Ｃ２４ω−ヒドロキシ脂肪酸に変換することができる、非天然メタン資化性菌を提供する。
なおさらなる実施形態では、異種脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子および異種チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子を含む非天然メタン資化性菌であって、前記メタン資化性菌が、未変性アルコールデヒドロゲナーゼの通常の発現レベルと比較して未変性アルコールデヒドロゲナーゼを過剰発現するか、異種アルコールデヒドロゲナーゼをコードする組換え核酸分子で形質転換されているか、またはその両方であり、前記メタン資化性菌がＣ１基質をＣ８〜Ｃ２４ジカルボン酸アルコールに変換することができる、非天然メタン資化性菌を提供する。
別の態様では、本開示は、脂肪酸誘導体組成物を含むＣ１代謝微生物バイオマスであって、前記脂肪酸誘導体含有バイオマスまたはそれ由来の脂肪酸誘導体組成物のδ１３Ｃが、約−３５‰〜約−５０‰、−４５‰〜約−３５‰、または約−５０‰〜約−４０‰、または約−４５‰〜約−６５‰、または約−６０‰〜約−７０‰、または約−３０‰〜約−７０‰である、Ｃ１代謝微生物バイオマスを提供する。一定の実施形態では、脂肪酸誘導体組成物は、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、またはその任意の組み合わせを含む。なおさらなる実施形態では、脂肪酸誘導体組成物は、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪アルコール、Ｃ８〜Ｃ２４分枝鎖脂肪アルコール、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪アルデヒド、Ｃ８〜Ｃ２４ω−ヒドロキシ脂肪酸、またはＣ８〜Ｃ２４ジカルボン酸アルコールを含む。なおさらなる実施形態では、脂肪酸誘導体組成物は、脂肪酸の大部分（５０％ｗ／ｗ超）がＣ８〜Ｃ１４、Ｃ１０〜Ｃ１６、またはＣ１４〜Ｃ２４の範囲の炭素鎖長を有する脂肪酸、脂肪酸誘導体の大部分がＣ１８未満の炭素鎖長を有する脂肪酸誘導体、または総脂肪アルコールの少なくとも７０％がＣ１０〜Ｃ１８脂肪アルコールを含む脂肪アルコール含有組成物を含む。
図１は、脂肪アルコール産生のためのアシル−ＣｏＡ依存性ＦＡＲ経路の概要を示す。
図２は、脂肪アルコール産生のためのアシル−ＣｏＡ非依存性ＦＡＲ経路の概要を示す。
図３は、脂肪アルコール産生のためのアシル−ＣｏＡ非依存性ＣＡＲ経路の概要を示す。
図４は、ω−ヒドロキシ脂肪酸産生経路の概要を示す。
図５は、ジカルボン酸産生経路の概要を示す。
図６は、脂肪エステル産生のためのアシル−ＣｏＡ依存性ＦＡＲ経路の概要を示す。
図７は、種々の炭素源のδ１３Ｃ分布の概略図を示す。
本開示は、脂肪酸誘導体生成のための組成物および方法を提供する。例えば、組換えＣ１代謝微生物を、Ｃ１基質供給原料（例えば、メタン）と培養して、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、またはその任意の組み合わせを生成する。この新規のアプローチにより、例えば、界面活性物質、潤滑剤、溶剤、または界面活性剤の産生のための脂肪酸誘導体を生成するための新規の宿主系としてメチロトローフ菌またはメタン資化細菌を使用可能である。
背景として、種々の供給源（天然ガスが含まれる）由来のメタンは、豊富な国内資源の一例である。上述の通り、炭水化物ベースの供給原料は、その質量の半分以上が酸素であり、長鎖脂肪アルコールの酸素含有量がこれらの供給原料より有意に低いので、変換効率を有意に制限する。現在のシステムの制限についての解決策は、変換用供給原料としてメタンまたは天然ガスを利用することである。天然ガス由来のメタンは安価且つ豊富であり、重要なことに酸素を含まず、理論上の変換効率が有意に改善される。さらに、Ｃ１炭素源は炭水化物供給原料と比較して安価かつ豊富であり、これも脂肪アルコール産生の費用の改善に寄与する。
脂肪酸産生は、膜生合成に必要であるので、実質的に全ての生物において重要な経路である。本開示では、代謝工学的技術を適用して、例えば、脂肪酸生合成（例えば、アシル−ｃｏＡシンターゼ、アセチル−ｃｏＡカルボキシラーゼ、アシルキャリアタンパク質、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ）に関連する遺伝子を過剰発現すると同時に脂肪酸分解または代謝経路の競合に関連する酵素を阻害、下方制御、または排除することによって脂肪酸産生への全炭素流を増加させる。さらなる実施形態では、脂肪酸の組成および鎖長を、所望の鎖長に特異的な異種チオエステラーゼ遺伝子を導入する一方で、未変性のチオエステラーゼ遺伝子を任意選択的に阻害、下方制御、または排除する（例えば、細菌中で、Ｃ１２脂肪酸鎖を選択的に産生するＵｍｂｅｌｌｕｌａｒｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ由来のｆａｔＢ１チオエステラーゼを導入し、細菌中で鎖長Ｃ１６〜Ｃ１８を典型的に産生する未変性のチオエステラーゼを排除する）ことによって調節する。なおさらなる実施形態では、分枝鎖脂肪酸を、分枝鎖α−ケト酸合成経路（分枝鎖はまた、いくつかの界面活性物質および界面活性剤への適用に有意な利点を提供する）への種々の酵素の導入によって産生する。
１つの態様では、本開示は、脂肪酸誘導体の作製方法であって、Ｃ１基質供給原料の存在下で非天然Ｃ１代謝非光合成微生物を培養し、脂肪酸誘導体を回収する工程を含み、前記Ｃ１代謝非光合成微生物が脂肪酸変換酵素をコードする組換え核酸分子を含み、前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、Ｃ１基質を、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、またはその組み合わせを含むＣ８〜Ｃ２４脂肪酸誘導体に変換する、作製方法を提供する。別の態様では、本開示は、脂肪酸変換酵素をコードする組換え核酸分子を含む非天然メタン資化性菌であって、前記メタン資化性菌がＣ１基質をＣ８〜Ｃ２４脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、またはその組み合わせに変換することができる、非天然メタン資化性菌を提供する。
本開示をより詳細に説明する前に、本明細書中で使用すべき一定の用語を定義することがその理解の一助となるかもしれない。本開示を通して、さらなる定義を説明する。
本説明において、任意の濃度範囲、百分率の範囲、比の範囲、または整数範囲は、他で示さない限り、引用した範囲内の任意の整数値および、適切な場合、その分数（整数の１／１０および１／１００など）が含まれると理解すべきである。また、任意の物理的特徴（ポリマーサブユニット、サイズ、または厚さなど）に関する本明細書中に引用した任意の数字範囲は、他で示さない限り、引用した範囲内の任意の整数が含まれると理解すべきである。本明細書中で使用する場合、用語「約」は、他で示さない限り、表示の範囲、値、または構造の±２０％を意味する。用語「本質的に〜からなる」は、特定の材料もしくは工程、または特許請求の範囲に記載の発明の基本的特徴および新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料もしくは工程に特許請求の範囲の範囲を制限する。用語「ａ」および「ａｎ」は、本明細書中で使用する場合、列挙した成分の「１つまたは複数」をいうとい理解すべきである。選択肢（例えば、「ｏｒ」）の使用は、選択肢の一方、両方、またはその任意の組み合わせを意味すると理解すべきである。本明細書中で使用する場合、用語「ｉｎｃｌｕｄｅ」、「ｈａｖｅ」、および「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」を、同意語として使用し、これらの用語およびその異形が本発明を制限しないと解釈することを意図する。
本明細書中で使用する場合、用語「組換え」また「非天然」は、少なくとも１つの遺伝子変化を含むか、外因性核酸の導入によって改変されている生物、微生物、細胞、核酸分子、またはベクターをいうか、内因性の核酸分子または遺伝子の発現を調節することができるように変化した細胞をいい、かかる変化または改変は遺伝子工学によって導入される。遺伝子変化には、例えば、タンパク質もしくは酵素をコードする発現可能な核酸分子を導入する改変、または他の核酸付加、核酸欠失、核酸置換、または細胞の遺伝子材料の他の機能破壊が含まれる。かかる改変には、例えば、基準の種について異種または相同なポリペプチドのコード領域およびその機能的フラグメントが含まれる。さらなる改変には、例えば、改変によって遺伝子またはオペロンの発現が変化する非コード調節領域が含まれる。例示的なタンパク質または酵素には、脂肪酸生合成経路内のタンパク質または酵素（すなわち、成分）（例えば、脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ、チオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、またはその組み合わせ）が含まれる。酵素またはその機能的部分をコードする核酸分子に対する遺伝子改変により、その天然に存在する状態から変化した組換え細胞に生化学反応能力または代謝経路能力を付与することができる。
以下の酵素名の略語を本明細書中で使用する：「脂肪酸アシルレダクターゼ」または「脂肪アルコール形成アシル−ＣｏＡレダクターゼ」を「ＦＡＲ」といい、「アシルキャリアタンパク質」を「ＡＣＰ」といい、「補酵素Ａ」を「ＣｏＡ」といい、「チオエステラーゼ」を「ＴＥ」といい、「脂肪酸シンターゼ」または「脂肪酸シンセターゼ」を「ＦＡＳ」といい、「脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ」を「ＦＡＣＲ」といい、「脂肪酸アシル−ＣｏＡシンターゼ」または「脂肪酸アシル−ＣｏＡシンセターゼ」または「アシル−ＣｏＡシンターゼ」または「アシル−ＣｏＡシンセターゼ」を本明細書中で交換可能に使用し、且つ「ＦＡＣＳ」といい、「アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ」を「ＡＣＣ」という。
脂肪酸アシルレダクターゼ（ＦＡＲ）は、図１に示し、且つ本明細書中で使用する場合、脂肪酸アシル−ＣｏＡ、脂肪酸アシル−ＡＣＰ、または他の脂肪酸アシルチオエステル複合体（それぞれ、構造Ｒ−（ＣＯ）−Ｓ−Ｒ１（式Ｉ）を有する）の脂肪アルコール（構造Ｒ−ＯＨ、式ＩＩ）への還元を触媒する酵素をいう。例えば、Ｒ−（ＣＯ）−Ｓ−Ｒ１（式Ｉ）は、ＮＡＤＰＨの２分子がＮＡＤＰ＋に酸化された時にＲ−ＯＨ（式ＩＩ）およびＲ１−ＳＨ（式ＩＩＩ）に変換され、ここで、Ｒは、Ｃ８〜Ｃ２４の飽和、不飽和、直鎖、分枝鎖、または環状の炭化水素であり、Ｒ１は、ＣｏＡ基質、ＡＣＰ基質、または他の脂肪酸アシルチオエステル基質を示す。ＣｏＡは、脂肪酸の合成および酸化に関与する非タンパク質アシルキャリア基である。「ＡＣＰ」は、脂肪酸合成で使用されるＦＡＳのポリペプチドまたはタンパク質のサブユニットである。ＦＡＲはＦＡＣＲと異なる。ＦＡＣＲは、脂肪酸アシル−ＣｏＡ中間体のみを脂肪アルデヒドに還元し、対応する脂肪アルコールを生成するためにさらなるオキシドレダクターゼ酵素を必要とする。脂肪アルデヒドは、本明細書中で使用する場合（図１を参照のこと）、飽和または不飽和の脂肪族アルデヒド（式中、Ｒは上記定義のとおりである）をいう。
用語「脂肪酸」は、本明細書中で使用する場合、構造Ｒ−ＣＯＯＨ（式ＩＶ）（式中、Ｒは、Ｃ８〜Ｃ２４の飽和、不飽和、直鎖、分枝鎖、または環状の炭化水素であり、カルボキシル基は１位にある）の化合物をいう。飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸を「Ｃｘ：ｙ」として記載することができ、ここで、「ｘ」は総炭素原子数を示す整数であり、「ｙ」は炭素鎖中の二重結合の数をいう整数である。例えば、Ｃ１２：０または１−ドデカン酸と称される脂肪酸は、化合物が１２個の炭素および０個の二重結合を有することを意味する。
用語「ヒドロキシル脂肪酸」は、本明細書中で使用する場合、構造ＯＨ−Ｒ−ＣＯＯＨ（式Ｖ）（式中、Ｒは、Ｃ８〜Ｃ２４の飽和、不飽和、直鎖、分枝鎖、または環状の炭化水素である）の化合物をいう。オメガヒドロキシ脂肪酸（ω−ヒドロキシ酸としても公知）は、１位がカルボキシル基であり、且つｎ位がヒドロキシルである一定数の炭素原子長を有する天然に存在する直鎖状の脂肪族有機酸のクラスである。例えば、例示的なＣ１６ω−ヒドロキシ脂肪酸は、１６−ヒドロキシパルミチン酸（１位がカルボキシル基であり、且つ１６位がヒドロキシル基である１６個の炭素原子を有する）および１０，１６−ジヒドロキシパルミチン酸（１位がカルボキシル基であり、１０位が第１のヒドロキシル基であり、および１６位が第２のヒドロキシル基である１６個の炭素原子を有する）である。
用語「脂肪アルコール」は、本明細書中で使用する場合、式ＩＩ（式中、Ｒは、Ｃ８〜Ｃ２４の飽和、不飽和、直鎖、分枝鎖、または環状の炭化水素である）の脂肪族アルコールをいう。飽和または不飽和の脂肪アルコールを、「Ｃｘ：ｙ−ＯＨ」として記載することができ、ここで、「ｘ」は脂肪アルコール中の総炭素原子数を示す整数であり、「ｙ」は炭素鎖中の二重結合の数をいう整数である。
不飽和脂肪酸または脂肪アルコールを、「ｃｉｓΔｚ」または「ｔｒａｎｓΔｚ」ということができ、ここで、「ｃｉｓ」および「ｔｒａｎｓ」は二重結合周囲の炭素鎖の立体配置をいい、「ｚ」は二重結合の最初の炭素の番号を示し、ここで、番号付けは脂肪酸のカルボン酸を有する炭素または脂肪アルコールの−ＯＨ基に結合した炭素から開始される。
用語「脂肪酸アシル−チオエステル」または「脂肪酸アシル−チオエステル複合体」は式Ｉ（式中、脂肪酸アシル部分は、チオエステル連結を介してキャリア部分に共有結合性に連結している）の化合物をいう。脂肪酸アシル−チオエステルは、本明細書中に記載のＦＡＲ酵素の基質である。
用語「脂肪酸アシル−ＣｏＡ」は、式Ｉ（式中、Ｒ１は補酵素Ａである）の化合物をいい、用語「脂肪酸アシル−ＡＣＰ」は、式Ｉ（式中、Ｒ１はアシルキャリアタンパク質ＡＣＰである）の化合物をいう。
句「アシル−ＣｏＡ非依存性経路」は、脂肪酸アシル−ＡＣＰ基質の脂肪アルコールへの直接酵素変換による脂肪アルコール産生をいい、遊離脂肪酸や脂肪酸アシル−ＣｏＡ中間体の使用を含まない。この生合成経路は、２つの脂肪酸アシル−ＣｏＡ依存性経路型（アシル転移反応を介して脂肪酸アシル−ＡＣＰを脂肪酸アシル−ＣｏＡに直接変換する第１の経路、および遊離脂肪酸中間体を介して脂肪酸アシル−ＡＣＰを脂肪酸アシル−ＣｏＡに変換する第２の経路（図１を参照のこと））と異なる。アシル−ＣｏＡ非依存性経路は、ＡＴＰの使用を必要とする遊離脂肪酸から脂肪酸アシル−ＣｏＡ基質を形成する工程を回避するという利点を有する。したがって、アシル−ＣｏＡ非依存性経路は、遊離脂肪酸中間体を利用するアシル−ＣｏＡ依存性経路より使用エネルギーが少量でよい。
本明細書中で使用する場合、「アルコールデヒドロゲナーゼ」（ＡＤＨ）は、アルコールをその対応するアルデヒド、ケトン、または酸に変換することができる任意の酵素をいう。アルコールデヒドロゲナーゼは、一般的な特異性を有し得、少なくとも数種のアルコール基質を変換することができるか、狭い特異性範囲を有し得、アルコール基質の許容が１種、２種、または数種であり得る。
本明細書中で使用する場合、「粒子状メタンモノオキシゲナーゼ」（ｐＭＭＯ）は、メタン資化性細菌中でのメタンのメタノールへの酸化を触媒する膜結合型粒子状酵素をいう。用語ｐＭＭＯは、多成分酵素または酵素活性部位を含むサブユニットのいずれかを意味する。
本明細書中で使用する場合、「可溶性メタンモノオキシゲナーゼ」（ｓＭＭＯ）は、メタン資化性細菌中でのメタンのメタノールへの酸化を触媒する細胞ライセート（細胞質）の可溶性画分中に見出される酵素をいう。用語ｓＭＭＯは、多成分酵素または酵素活性部位を含むサブユニットのいずれかを意味する。
本明細書中で使用する場合、「シトクロムＰ４５０」または「ＣＹＰ」としても公知の「Ｐ４５０」は、有機化合物（脂質、ステロイド系ホルモン、および生体異物が含まれる）の酸化を触媒する広範な基質特異性を有する酵素群をいう。Ｐ４５０酵素は、最も一般的には、酸素原子を有機基質のＲ−Ｈ結合に挿入することによってモノオキシゲナーゼ（ｍｏｎｏｏｘｇｅｎａｓｅ）反応を触媒する。
「変換」は、基質の１つまたは複数の対応する生成物への酵素変換をいう。「変換率」は、特定の条件下で時間内に１つまたは複数の生成物に還元される基質の百分率をいう。したがって、ポリペプチド酵素の「酵素活性」または「活性」を、基質の生成物への「変換率」として表すことができる。
本明細書中で使用する場合、用語「宿主」は、Ｃ１基質供給原料をＣ８〜Ｃ２４脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、またはその任意の組み合わせに変換するために脂肪酸生合成成分（例えば、チオエステラーゼ、脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ）を使用して遺伝子改変される微生物（例えば、メタン資化性菌）をいう。宿主細胞は、本明細書中に開示の脂肪酸生合成経路に関連しない所望の性質を付与する他の遺伝子改変を任意選択的に既に保有し得る。例えば、宿主細胞は、高成長、夾雑物質または特定の培養条件に対する耐性、さらなる炭素基質を代謝する能力、または所望の生成物もしくは中間体を合成する能力を付与する遺伝子改変を有し得る。
本明細書中で使用する場合、用語「メタン資化性菌」、「メタン資化性細菌」または「メタン資化性細菌（複数）」は、その主要なまたは唯一の炭素源およびエネルギー源としてＣ１基質（メタンまたは非在来型天然ガスなど）を利用することができるメチロトローフ性細菌をいう。本明細書中で使用する場合、「メタン資化性細菌（複数）」には、炭素源およびエネルギー源のためにＣ１基質のみを利用することができる「偏性メタン資化性細菌（複数）」およびその唯一の炭素源およびエネルギー源としてのＣ１基質に加えて、多炭素基質（酢酸塩、ピルビン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、またはエタノールなど）を天然に使用することができる「通性メタン資化性細菌（複数）」が含まれる。通性メタン資化性菌には、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、およびＭｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａのいくつかの種（例えば、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ ｔｕｎｄｒａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｄａｌｔｏｎａ ＳＢ２、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｂｒｙｏｐｈｉｌａ、およびＭｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａ ａｕｒｅａ ＫＹＧ）、ならびにＭｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ ２７，８８６）が含まれる。
本明細書中で使用する場合、用語「Ｃ１基質」または「Ｃ１化合物」は、炭素−炭素結合を欠く有機化合物をいう。Ｃ１基質には、シンガス、天然ガス、非在来型天然ガス、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸（ギ酸塩）、一酸化炭素、二酸化炭素、メチル化アミン（例えば、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミンなど）、メチル化チオール、メチルハロゲン（例えば、ブロモメタン、クロロメタン、ヨードメタン、ジクロロメタンなど）、およびシアン化物が含まれる。
本明細書中で使用する場合、「Ｃ１代謝微生物」または「Ｃ１代謝非光合成微生物」は、Ｃ１基質をエネルギー源としてか、その主要なエネルギー源としてか、エネルギーおよびバイオマスのその唯一の供給源として使用する能力を有する任意の微生物をいい、この微生物は他の炭素基質（糖および複合糖質など）をエネルギーおよびバイオマスのために使用してもしなくても良い。例えば、Ｃ１代謝微生物は、Ｃ１基質（メタン、天然ガス、またはメタノールなど）を酸化することができる。Ｃ１代謝微生物には、細菌（メタン資化性菌およびメチロトローフ菌など）および酵母が含まれる。一定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物には光合成微生物（藻類など）が含まれない。一定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、その主要なエネルギー源がＣ１基質であることを意味する「偏性Ｃ１代謝微生物」であろう。さらなる実施形態では、Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）を、Ｃ１基質供給原料の存在下で（すなわち、主要なまたは唯一のエネルギー源としてＣ１基質を使用して）培養するであろう。
本明細書中で使用する場合、用語「メチロトローフ菌」または「メチロトローフ性細菌」は、炭素−炭素結合を含まない有機化合物を酸化することができる任意の細菌をいう。一定の実施形態では、メチロトローフ性細菌は、メタン資化性菌であり得る。例えば、「メタン資化性細菌」は、炭素およびエネルギーのその主要な供給源としてメタンを酸化する能力を有する任意のメチロトローフ性細菌をいう。例示的なメタン資化性細菌には、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、またはＭｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓが含まれる。一定の他の実施形態では、メチロトローフ性細菌は「偏性メチロトローフ性細菌」であり、これは、エネルギーの生成がＣ１基質の使用に制限される細菌をいう。
本明細書中で使用する場合、用語「ＣＯ利用細菌」は、炭素およびエネルギーの供給源として一酸化炭素（ＣＯ）を酸化する能力を天然に保有する細菌をいう。一酸化炭素を、「合成ガス」または「シンガス」（任意の有機供給原料（石炭、石油、天然ガス、バイオマス、または廃棄有機物など）の気化によって生産される一酸化炭素と水素との混合物）から利用することができる。ＣＯ利用細菌には、その炭素源としてＣＯで成長するように遺伝子改変されなければならない細菌は含まれない。
本明細書中で使用する場合、「天然ガス」は、多孔質貯留層で形成された天然に存在するガス混合物をいい、従来のプロセス（例えば、掘削）によって取り出すことができ、天然ガスは主にメタンで構成されているが、他の成分（二酸化炭素、窒素、または硫化水素など）も有し得る。
本明細書中で使用する場合、「非在来型天然ガス」は、低浸透率の形成物中で作製された天然に存在するガス混合物をいい、このガスは非従来型の方法（水圧破砕、水平掘削、または傾斜掘削など）によって取り出さなければならない。例示的な非在来型天然ガス鉱床には、砂岩または炭酸塩中に形成されるタイトガスサンド、石炭鉱床中に形成され、且つ石炭粒子に吸着された炭層メタン、微粒子頁岩中で形成され、且つ粘度粒子中に吸着されているか、細孔内または微小穴内に保持されたシェールガス、海洋下および永久凍土層下などの場所に低温高圧で形成された天然ガスと水との結晶性の組み合わせであるメタンハイドレートが含まれる。
本明細書中で使用する場合、「シンガス」は、一酸化炭素（ＣＯ）と水素（Ｈ２）との混合物をいう。シンガスは、ＣＯ２、メタン、ならびにＣＯおよびＨ２より少量の他のガスも含むことができる。
本明細書中で使用する場合、「メタン」は、化学式がＣＨ４の最も単純なアルカン化合物をいう。メタンは、常温常圧で無色無臭のガスである。メタンの供給源には、天然供給源（天然ガス田など）、「非在来型天然ガス」供給源（シェールガスまたは炭層メタンなど（含有量は供給源によって変化するであろう））、ならびに、例えば、メタン生成微生物および工業的合成または実験的合成によって合成される生物学的供給源が含まれる。メタンには、純粋メタン、実質的に精製された組成物（「パイプライン品質の天然ガス」または「乾性天然ガス」（９５〜９８％がメタンである）など）、および非精製組成物（「湿性天然ガス」（他の炭化水素が依然として除去されておらず、組成物の６０％超がメタンである）など）が含まれる。
本明細書中で使用する場合、ポリヌクレオチドとしても公知の「核酸分子」は、ヌクレオチドと呼ばれる共有結合性に連結したサブユニットから構成される高分子化合物をいう。核酸分子には、ポリリボ核酸（ＲＮＡ）、ポリデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）（共に一本鎖または二本鎖であり得る）が含まれる。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または半合成ＤＮＡなどが含まれる。
本明細書中で使用する場合、「形質転換」は、核酸分子（例えば、外因性または異種の核酸分子）の宿主への移入をいう。形質転換された宿主は、外因性または異種の核酸分子を染色体外に保有することができるか、核酸分子を染色体内に取り込むことができる。宿主ゲノムへの取り込みおよびベクターの自己複製により、一般に、形質転換された核酸分子が遺伝的に安定に遺伝する。形質転換された核酸を含む宿主細胞を、「組換え」細胞、「天然に存在しない」細胞、「遺伝子操作された」細胞、「形質転換された」細胞、または「トランスジェニック」細胞（例えば、細菌）という。
本明細書中で使用する場合、用語「内因性」または「未変性」は、宿主細胞内に通常存在する遺伝子、タンパク質、化合物、または活性をいう。
本明細書中で使用する場合、「異種」核酸分子、構築物、または配列は、類似の条件下における未変性発現レベルと比較して宿主細胞を起源としない核酸分子または核酸分子配列の一部をいうか、発現が変化した核酸分子である。例えば、異種調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）を使用して、未変性遺伝子または核酸分子が天然または培養において通常発現する方法と異なる方法で未変性遺伝子または核酸分子の発現を調節することができる。一定の実施形態では、異種核酸分子は、宿主細胞または宿主ゲノムに対して内因性でない可能性があるが、その代わりに接合、形質転換、トランスフェクション、またはエレクトロポレーションなどによって宿主細胞に付加されたかもしれず、付加した分子が宿主ゲノムに取り込まれ得るか、染色体外遺伝子材料として（例えば、プラスミドまたは他の自己複製ベクターとして）存在することができる。さらに、「異種」は、宿主細胞で見出される酵素、タンパク質、または他の活性と異なるか変化しているか、宿主細胞を起源としないが、その代わりに宿主細胞に導入した核酸分子によってコードされる酵素、タンパク質、または他の活性をいうことができる。用語「相同」または「ホモログ」は、宿主の細胞、種、または株で見いだされるか、これらに由来する分子または活性をいう。例えば、異種核酸分子は、未変性の宿主細胞遺伝子と相同であり得るが、変化した発現レベルを有し得るか、異なる配列を有し得るか、その両方であり得る。
一定の実施形態では、１つを超える異種核酸分子を、個別の核酸分子としてか、ポリシストロニック核酸分子としてか、融合タンパク質をコードする単一の核酸分子としてか、またはその任意の組み合わせとして宿主細胞に導入することができ、これを依然として１つを超える異種核酸と見なすことができる。例えば、本明細書中に開示するように、Ｃ１代謝微生物を、所望の脂肪酸生合成経路成分（例えば、チオエステラーゼ、脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ）をコードする２つ以上の異種または外因性の核酸分子を発現するように改変することができる。脂肪酸生合成経路成分をコードする２つ以上の外因性核酸分子を宿主Ｃ１代謝微生物に導入する場合、２つ以上の（ｔｗｏ ｍｏｒｅ）外因性核酸分子を、例えば、単一のベクター上、個別のベクター上の単一の核酸分子として導入することができ、宿主染色体内の単一の部位または複数の部位に取り込むことができ、依然として２つ以上の外因性核酸分子と見なすことができると理解される。したがって、基準となる異種核酸分子数またはタンパク質活性数はコード核酸分子数またはタンパク質活性数をいい、宿主細胞に導入される個別の核酸分子数をいわない。
用語「キメラの」は、内因性ではなく、且つ天然では通常は共に接合状態または連結状態で見出されない接合状態または連結状態の配列を含む任意の核酸分子またはタンパク質をいう。例えば、キメラ核酸分子は、異なる起源に由来する調節配列およびコード配列、または同一起源に由来するが、天然で見出される様式と異なる様式で配置された調節配列およびコード配列を含むことができる。
２つ以上の核酸配列間の「同一率」は、２つ以上の配列のアラインメントを最適にするために導入する必要があるギャップ数および各ギャップの長さを考慮した配列によって共有される同一の位置の数の関数（すなわち、同一率＝同一の位置の数／位置の総数×１００）である。２つ以上の配列の間の配列の比較および同一率の決定を、数学アルゴリズム（デフォルトパラメーターでのＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムなど）を使用して行うことができる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３，１９９０；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴでのＢＬＡＳＴＮも参照のこと）。
「保存的置換」は、当該分野で、あるアミノ酸の類似の性質を有する別のアミノ酸への置換と認識されている。例示的な保存的置換は、当該分野で周知である（例えば、１９９７年３月１３日公開のＷＯ９７／０９４３３号の第１０頁；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ：ＮＹ（１９７５），ｐｐ．７１−７７；Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ（１９９０），ｐ．８を参照のこと）。
「阻害する」または「阻害された」は、本明細書中で使用する場合、コントロール、内因性、または基準の分子と比較した標的遺伝子の発現または標的分子（例えば、チオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ）の活性の直接的または間接的な変更、減少、下方制御、または抑止をいい、ここで、変更、減少、下方制御、または抑止は、統計的、生物学的、産業的、または臨床的に有意である。
本明細書中で使用する場合、用語「誘導体」は、改変された化合物が親化合物と構造的に類似しており、（実際にまたは理論的に）その親化合物から誘導し得る、酵素を用いるか用いない化学的手段または生物学的手段による化合物の改変物をいう。誘導体は、親化合物と化学的性質、生物学的性質、または物理的性質が異なり得る（親化合物と比較して親水性が高いことまたは異なる反応性を有することなど）。誘導体化（すなわち、改変）は、分子内の１つまたは複数の部分の置換（例えば、官能基の変化）を含み得る。例えば、水素をハロゲン（フッ素または塩素など）と置換することができるか、ヒドロキシル基（−ＯＨ）をカルボン酸部分（−ＣＯＯＨ）と置換することができる。他の例示的な誘導体化には、グリコシル化、アルキル化、アシル化、アセチル化、ユビキチン化、エステル化、およびアミド化が含まれる。本明細書中で使用する場合、「脂肪酸誘導体」には、細胞内で見出される脂肪酸生合成経路の中間体および生成物（脂肪酸アシルキャリアタンパク質、活性化脂肪酸（例えば、アシルまたはＣｏＡ含有）、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、または分枝脂肪酸など）が含まれる。
用語「誘導体」はまた、全溶媒和物（例えば、親化合物の水和物または付加物（例えば、アルコール付加物）、活性代謝産物、および塩）をいう。調製することができる塩の型は、化合物内の部分の性質に依存する。例えば、酸性基（カルボン酸基など）は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、およびカルシウム塩）を形成することができ、生理学的に許容可能な第四級アンモニウムイオンとの塩およびアンモニアおよび生理学的に許容可能な有機アミン（例えば、トリエチルアミン、エタノールアミン、またはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミンなど）との酸付加塩も形成することができる。塩基性基は、例えば、無機酸（塩酸、硫酸、またはリン酸など）または有機のカルボン酸およびスルホン酸（酢酸、クエン酸、乳酸、安息香酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、メタンスルホン酸、またはｐ−トルエンスルホン酸など）と酸付加塩を形成することができる。塩基性基および酸性基（例えば、塩基性窒素原子に加えたカルボキシル基）を同時に含む化合物は、双性イオンとして存在することができる。塩を、当業者に公知の慣習的方法（例えば、溶媒または希釈剤中での無機または有機の酸または塩基との化合物の組み合わせ）によるか、陽イオン交換または陰イオン交換によって他の塩から得ることができる。
脂肪酸誘導体を作製するための組成物および方法
脂肪酸誘導体を産生するために使用されるＣ１代謝微生物を、目的のポリペプチドを発現するか過剰発現する核酸配列を含むように組換え的に改変することができる。例えば、Ｃ１代謝微生物を、アシル−ＣｏＡ産生を増加させるか、脂肪酸生合成経路中の脂肪酸の誘導体および中間体（アシル−ＣｏＡなど）の異化を減少させるか、脂肪酸生合成経路中の特定の点でのフィードバック阻害を減少させるように改変することができる。本明細書中に記載の遺伝子の改変に加えて、さらなる細胞資源を、脂肪酸を過剰産生するように流用することができる。例えば、乳酸経路、コハク酸経路、または酢酸経路を脆弱化させ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｃ）を過剰発現させることができる。本明細書中に記載のＣ１代謝微生物を、ゲノム変化、組換え発現系の付加、またはその組み合わせによって改変することができる。
関与する脂肪酸生合成経路を、図１〜６に示す。経路中の異なる工程は異なる酵素で触媒され、各工程は、より多くの酵素を産生し、したがって、より多くの脂肪酸および脂肪酸誘導体の産生を駆動するための遺伝子の過剰発現のための潜在的な場所である。経路に必要な酵素をコードする核酸分子を、かかる酵素を欠くＣ１代謝微生物に組換え的に付加することができる。最後に、所望の生成物の産生を増加させるために、脂肪酸および脂肪酸誘導体を産生させる経路と競合する工程を脆弱化または遮断することができる。
脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）は、アシル鎖の開始および伸長を触媒する酵素群である（Ｍａｒｒａｋｃｈｉら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ３０：１０５０，２００２）。アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）は、ＦＡＳ経路内の酵素と共に、産生された脂肪酸の長さ、飽和度、および分枝を調節する。この経路内の工程は、脂肪酸生合成（ｆａｂ）およびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｃ）の遺伝子ファミリーの酵素によって触媒される。所望の生成物に依存して、１つまたは複数のこれらの遺伝子を、脆弱化、発現、または過剰発現することができる（各酵素の酵素活性およびその酵素分類番号の表示については、図１〜６を参照のこと）。
産生宿主中の脂肪酸生合成経路は、前駆体であるアセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡを使用する（例えば、図１を参照のこと）。この経路中の工程は、脂肪酸生合成（ｆａｂ）およびアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ａｃｃ）の遺伝子ファミリーの酵素によって触媒される。この経路は、Ｈｅａｔｈら，Ｐｒｏｇ．Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４０：４６７，２００１に記載されている。
アセチル−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（Ａｃｃ、４つの異なる遺伝子ａｃｃＡＢＣＤによってコードされる多サブユニット酵素）によってカルボキシル化されてマロニル−ＣｏＡを形成する。マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰトランスアシラーゼ（ＦａｂＤ）によってマロン酸基がＡＣＰに転移して、マロニル−ＡＣＰが形成される。次いで、縮合反応が起こってマロニル−ＡＣＰがアセチル−ＣｏＡと混合されてβ−ケトアシル−ＡＣＰが得られる。β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩＩ（ＦａｂＨ）によってＦＡＳサイクルが開始される一方で、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ（ＦａｂＢ）およびβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（ＦａｂＦ）はその後のサイクルに関与する。
次に、工程のサイクルは、適切な長さの飽和脂肪酸が作製されるまで繰り返される。第１に、β−ケトアシル−ＡＣＰがＮＡＤＰＨによって還元されてβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰを形成する。この工程は、β−ケトアシル−ＡＣＰレダクターゼ（ＦａｂＧ）によって触媒される。次いで、β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰが脱水されてｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＡＣＰが形成される。β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ／イソメラーゼ（ＦａｂＡ）またはβ−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ（ＦａｂＺ）がこの工程を触媒する。ＮＡＤＰＨ依存性ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＡＣＰレダクターゼＩ、ＩＩ、またはＩＩＩ（それぞれ、ＦａｂＩ、ＦａｂＫ、およびＦａｂＬ）がｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＡＣＰを還元してアシル−ＡＣＰを形成する。その後のサイクルは、β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩまたはβ−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩＩ（それぞれ、ＦａｂＢおよびＦａｂＦ）によるマロニル−ＡＣＰのアシル−ＡＣＰとの縮合によって開始される。
本明細書中に記載のＣ１代謝微生物を、アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡを過剰産生するように操作することができる。Ｃ１代謝微生物に対するいくつかの異なる修飾を組み合わせまたは個別に行って、アセチル−ＣｏＡ／マロニル−ＣｏＡ／脂肪酸および脂肪酸誘導体の産生を増加させることができる。
例えば、アセチル−ＣｏＡ産生を増加させるために、１つまたは複数の以下の遺伝子を、Ｃ１代謝微生物中で発現させることができる：ｐｄｈ、ｐａｎＫ、ａｃｅＥＦ（ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体および２−オキソグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体のＥ１ｐデヒドロゲナーゼ成分およびＥ２ｐジヒドロリポアミドアシルトランスフェラーゼ成分をコードする）、ｆａｂＨ、ｆａｂＤ、ｆａｂＧ、ａｃｐＰ、またはｆａｂＦ。他の例では、脂肪酸−アシル−ＣｏＡレダクターゼおよびアルデヒドデカルボニラーゼをコードするさらなるＤＮＡ配列を、Ｃ１代謝微生物中で発現することができる。１つまたは複数の上記遺伝子の全てを構成性プロモーターまたはそうでなければ調節プロモーターの調節下で含むプラスミドを構築することができることが当該分野で周知である。これらの遺伝子の例示的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、ｐｄｈ（ＢＡＢ３４３８０、ＡＡＣ７３２２７、ＡＡＣ７３２２６）、ｐａｎＫ（ｃｏａＡとしても公知、ＡＡＣ７６９５２）、ａｃｅＥＦ（ＡＡＣ７３２２７、ＡＡＣ７３２２６）、ｆａｂＨ（ＡＡＣ７４１７５）、ｆａｂＤ（ＡＡＣ７４１７６）、ｆａｂＧ（ＡＡＣ７４１７７）、ａｃｐＰ（ＡＡＣ７４１７８）、ｆａｂＦ（ＡＡＣ７４１７９）である。
さらに、ｆａｄＥ、ｇｐｓＡ、ｌｄｈＡ、ｐｆｌｂ、ａｄｈＥ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ａｃｋＡ、またはａｃｋＢの発現レベルを、対応する遺伝子のヌル変異または欠失変異を含む条件的複製プラスミドまたは非複製プラスミドでの形質転換またはプロモーター配列またはエンハンサー配列の置換によって操作微生物中で減少、阻害、またはノックアウトすることができる。これらの遺伝子の例示的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、ｆａｄＥ（ＡＡＣ７３３２５）、ｇｓｐＡ（ＡＡＣ７６６３２）、ｌｄｈＡ（ＡＡＣ７４４６２）、ｐｆｌｂ（ＡＡＣ７３９８９）、ａｄｈＥ（ＡＡＣ７４３２３）、ｐｔａ（ＡＡＣ７５３５７）、ｐｏｘＢ（ＡＡＣ７３９５８）、ａｃｋＡ（ＡＡＣ７５３５６）、およびａｃｋＢ（ＢＡＢ８１４３０）である。得られた操作されたＣ１代謝微生物は、Ｃ１基質供給原料などを使用した適切な条件下で成長させた場合、アセチル−ＣｏＡ産生レベルを増加させるであろう。
さらに、ｄｅ ｎｏｖｏで合成されたプラスミド中に含まれるａｃｃＡＢＣＤ（例えば、受入番号ＡＡＣ７３２９６、ＥＣ６．４．１．２）を用いた本明細書中に記載のＣ１代謝微生物の操作によってマロニル−ＣｏＡ過剰産生に影響を及ぼすことができる。ｄｅ ｎｏｖｏで合成されたプラスミド中にリパーゼ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＣＡＡ８９０８７、ＣＡＡ９８８７６）をコードする核酸分子をさらに含めることによって脂肪酸を過剰産生させることができる。
結果として、いくつかの例では、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼは、その細胞内濃度を生来の発現レベルと比較して少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍に増加させるように過剰発現される。
いくつかの実施形態では、ｐｌｓＢ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＣ７７０１１）Ｄ３１１Ｅ変異を使用して、利用可能なアシル−ＣｏＡの量を増加させることができる。さらなる実施形態では、一価不飽和脂肪酸産生を増加させるためにｓｆａ遺伝子（ＦａｂＡのサプレサプレッサー、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＮ７９５９２）の過剰発現を、Ｃ１代謝微生物中に含めることができる（Ｒｏｃｋら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７８：５３８２，１９９６）。
本明細書中に記載のように、アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡを、アシル−ＡＣＰ鎖を形成するようにいくつかの工程でプロセシングすることができる。酵素ｓｎ−グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＰｌｓＢ）は、アシル−ＡＣＰまたはアシル−ＣｏＡからグリセロール−３−リン酸のｓｎ−１位へのアシル基の転移を触媒する。したがって、ＰｌｓＢは、脂肪酸経路の一部であるリン脂質合成における重要な調節酵素である。ＰｌｓＢの阻害によって長鎖アシル−ＡＣＰレベルを増加させ、フィードバックが経路の最初の段階（例えば、ａｃｃＡＢＣＤ、ｆａｂＨ、およびｆａｂＩ）を阻害するであろう。例えば、チオエステラーゼ過剰発現によるこの調節の開放により、脂肪酸産生が増加する。ｔｅｓおよびｆａｔ遺伝子ファミリーはチオエステラーゼを発現する。ＦａｂＩはまた、長鎖アシル−ＣｏＡによってｉｎ ｖｉｔｒｏで阻害される。
脂肪酸誘導体の均一集団または混合集団の産生のためにＣ１代謝微生物を操作するために、１つまたは複数の内因性遺伝子を脆弱化、阻害、または機能的に欠失させることができ、結果として、１つまたは複数のチオエステラーゼを発現することができる。例えば、Ｃ１０脂肪酸誘導体を、Ｃ１８：１−ＡＣＰを使用するチオエステラーゼＣ１８（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＣ７３５９６およびＰ０ＡＤＡ１）を脆弱化すると同時に、Ｃ１０−ＡＣＰを使用するチオエステラーゼＣ１０（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｑ３９５１３）を発現することによって産生することができる。これにより、炭素鎖長１０を有する比較的均一の脂肪酸誘導体集団が得られる。別の例では、Ｃ１４脂肪酸誘導体を、非Ｃ１４脂肪酸を産生する内因性チオエステラーゼを脆弱化し、チオエステラーゼ受入番号Ｑ３９４７３（Ｃ１４−ＡＣＰを使用する）を発現することによって産生することができる。さらに別の例では、Ｃ１２脂肪酸誘導体を、Ｃ１２−ＡＣＰを使用するチオエステラーゼ（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号Ｑ４１６３５）を発現させ、非Ｃ１２脂肪酸を産生するチオエステラーゼを脆弱化することによって産生することができる。アセチル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡ、および脂肪酸の過剰産生を、当該分野で公知の方法を使用して（例えば、細胞溶解の後に放射性前駆体、ＨＰＬＣ、およびＧＣ−ＭＳを使用することによって）検証することができる。特許請求の範囲に記載の方法および本開示のＣ１代謝微生物で有用なチオエステラーゼの非限定的な例は、米国特許第８，２８３，１４３号の表１（表の全体が本明細書中で参考として援用される）に列挙されている。
アシル−ＣｏＡシンターゼ（ＡＣＳ）は、２段階機構によって遊離脂肪酸をアシル−ＣｏＡにエステル化する。遊離脂肪酸は、最初に、ＡＴＰのピロリン酸関与分解反応によってアシル−ＡＭＰ中間体（アデニラート）に変換される。次いで、アデニラートの活性化されたカルボニル炭素がＣｏＡのチオール基にカップリングされ、ＡＭＰおよびアシル−ＣｏＡ最終産物が放出される。Ｓｈｏｃｋｅｙら，Ｐｌａｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２９：１７１０，２００２を参照のこと。
大腸菌ＡＣＳ酵素ＦａｄＤおよび脂肪酸輸送タンパク質ＦａｄＬは、脂肪酸取り込み系の不可欠な成分である。ＦａｄＬは脂肪酸の細菌細胞への輸送を媒介し、ＦａｄＤはアシル−ＣｏＡエステル形成を媒介する。他の炭素源が利用できない場合、細菌によって外因性脂肪酸が取り込まれ、アシル−ＣｏＡエステルに変換され、これが転写因子ＦａｄＲに結合し、脂肪酸の輸送を担うタンパク質（ＦａｄＬ）、活性化を担うタンパク質（ＦａｄＤ）、およびβ酸化を担うタンパク質（ＦａｄＡ、ＦａｄＢ、ＦａｄＥ、およびＦａｄＨ）をコードするｆａｄ遺伝子の発現を抑制する。別の炭素供給源が利用可能である場合、細菌は、リン脂質合成のために使用されるが、β酸化の基質ではないアシル−ＡＣＰとして脂肪酸を合成する。したがって、アシル−ＣｏＡおよびアシル−ＡＣＰは共に、異なる最終産物が得られる独立した脂肪酸供給源である。Ｃａｖｉｇｌｉａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１１６３，２００４を参照のこと。
Ｃ１代謝微生物を、公知のポリペプチドをコードする核酸分子を使用して種々の長さの脂肪酸が産生されるように操作し、次いで、アシル−ＣｏＡ、最終的に脂肪酸誘導体（脂肪アルコールなど）に変換することができる。脂肪酸誘導体の１つの作製方法は、１つまたは複数のアシル−ＣｏＡシンターゼペプチド（ＥＣ６．２．１．−）の発現を増加させる工程またはそのより活性の高い形態を発現させる工程を含む。アシル−ＣｏＡおよび脂肪酸誘導体を産生するように発現することができるアシル−ＣｏＡシンターゼのリストは、米国特許第８，２８３，１４３号の表２（表の全体が本明細書中で参考として援用される）に示されている。これらのアシル−ＣｏＡシンターゼを使用して、基質として脂肪酸−アシル−ＣｏＡを使用する任意の経路を改良することができる。
アシル−ＣｏＡを、ＮＡＤＨ依存性アシル−ＣｏＡレダクターゼ（例えば、Ａｃｒ１）によって脂肪アルデヒドに還元する。次いで、脂肪アルデヒドを、ＮＡＤＰＨ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（例えば、ＹｑｈＤ）によって脂肪アルコールに還元する。あるいは、脂肪アルコール形成アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ）は、アシル−ＣｏＡの脂肪アルコールおよびＣｏＡＳＨへの還元を触媒する。ＦＡＲは、この４電子還元における補因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを使用する。アルコール生成ＦＡＲ反応がアルデヒド中間体を介して進行するにもかかわらず、遊離アルデヒドは放出されない。したがって、アルコール形成ＦＡＲは、アシル−ＣｏＡの２電子還元を行い、生成物として遊離脂肪アルデヒドが得られる酵素と異なる（Ｃｈｅｎｇ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９：３７７８９，２００４；Ｍｅｔｚら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２２：６３５，２０００を参照のこと）。
Ｃ１代謝微生物を、公知のポリペプチドを使用してアシル−ＣｏＡから脂肪アルコールが産生されるように操作することができる。脂肪アルコールの１つの作製方法は、脂肪アルコール形成アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ（ＥＣ１．２．１．５０／１．１．１）由来のａｃｒ１などの遺伝子によってコードされる）またはアシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．５０）およびアルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１）の発現を増加させるか、これらのより活性な形態を発現する工程を含む。例示的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、米国特許第８，２８３，１４３号の図１（図は、その全体が本明細書中で参考として援用される）に列挙されている。
脂肪アルコールを、炭化水素ベースの界面活性物質として記載することができる。界面活性物質産生のために、Ｃ１代謝微生物を、Ｃ１基質供給原料から界面活性物質を産生するように改変する。かかるＣ１代謝微生物は、脂肪酸を脂肪アルデヒドに変換することができるタンパク質をコードする第１の外因性核酸分子および脂肪アルデヒドをアルコールに変換することができるタンパク質をコードする第２の外因性核酸分子を含む。いくつかの例では、第１の外因性核酸分子は、脂肪酸レダクターゼ（ＦＡＲ）をコードする。１つの実施形態では、第２の外因性核酸分子は、哺乳動物ミクロソームアルデヒドレダクターゼまたは長鎖アルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする。さらなる例では、第１および第２の外因性核酸分子は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ＡＫ １９、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｌｕｔｉｎｉｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｍ−１、またはＣａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａに由来する。１つの実施形態では、第１および第２の異種核酸分子は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．Ｍ−１またはＣａｎｄｉｄａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来の多酵素複合体に由来する。
界面活性物質産生で使用することができる長鎖アルコール変換タンパク質に対する脂肪酸をコードする異種核酸分子のさらなる供給源には、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ（ＡＴＣＣ ３２２２２）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ、（Ａｐｉｏｔｒｉｃｕｍ ｃｕｒｖａｔｕｍとも呼ばれる）、Ａｋａｎｉｖｏｒａｘ ｊａｄｅｎｓｉｓ（Ｔ９Ｔ＝ＤＳＭ １２７１８＝ＡＴＣＣ ７００８５４）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＨＯ１−Ｎ（ＡＴＣＣ １４９８７）、およびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ（ＰＤ６３０ ＤＳＭＺ ４４１９３）が含まれる。
１つの例では、脂肪酸誘導体は、約８〜約２４個の炭素原子、約８〜約１８個の炭素原子、約８〜約１４個の炭素原子、約１０〜約１８個の炭素原子、または約１２〜約１６個の炭素原子の炭素鎖長を有する飽和または不飽和の界面活性物質産物である。別の例では、界面活性物質産物は、約１０〜約１４個の炭素原子、または約１２〜約１４個の炭素原子の炭素鎖長を有する。
界面活性物質の産生に適切なＣ１代謝微生物は、真核微生物または原核微生物のいずれかであり得る。脂肪酸誘導体の形態のＣ１供給原料から高レベルの界面活性物質前駆体を合成する生得的能力が証明されたＣ１代謝微生物（アセチルＣｏＡカルボキシラーゼを発現するように操作されたメタン生成菌など）を使用する。
産生宿主を、公知のポリペプチドを使用して種々の長さの脂肪エステルを産生するように操作することができる。脂肪エステルの１つの作製方法は、１つまたは複数のアルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチド（ＥＣ２．３．１．８４）の発現またはそのより活性の高い形態の発現を増加させる工程を含む。これらのペプチドは、アセチル−ＣｏＡおよびアルコールをＣｏＡおよびエステルに変換することによってアルコールのアセチル化を触媒する。いくつかの例では、アルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチドを、選択されたチオエステラーゼペプチド、ＦＡＳペプチド、および脂肪アルコール形成ペプチドと併せて発現することができ、従って、炭素鎖の長さ、飽和、および分枝度を制御可能である。いくつかの場合、ｂｋｄオペロンを同時発現して、分枝脂肪酸前駆体を産生することができる。
本明細書中で使用する場合、アルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチドには、酵素分類番号ＥＣ２．３．１．８４のペプチドならびにアセチル−ＣｏＡおよびアルコールを変換してＣｏＡおよびエステルを形成する変換を触媒することができる任意の他のペプチドが含まれる。さらに、当業者は、アルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチドが他の反応を触媒すると認識するであろう。
例えば、いくつかのアルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチドは、脂肪アルコールまたはアセチル−ＣｏＡチオエステルに加えて他の基質（他のアルコールおよび他のアシル−ＣｏＡチオエステルなど）を許容するであろう。したがって、かかる非特異性または多特異性のアルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチドも含まれる。アルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチド配列を公的に利用可能であり、例示的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、米国特許第８，２８３，１４３号の図１（図は、その全体が本明細書中で参考として援用される）に列挙されている。特定のアルコールＯ−アセチルトランスフェラーゼペプチドの活性を特徴付けるためのアッセイは、当該分野で周知である。Ｏ−アシルトランスフェラーゼを、ドナーアシル基またはアクセプターアルコール部分に新規の活性および特異性を持たせるように操作することができる。十分に裏付けされた合理的且つ進化的なアプローチによって操作した酵素を生成することができる。
脂肪エステルは、エステル結合を介して長鎖脂肪アルコールが脂肪酸アシル−ＣｏＡに抱合しているアシル−ＣｏＡ：脂肪アルコールアシルトランスフェラーゼ（例えば、エステルシンターゼ）によって合成される。エステルシンセターゼおよびコード遺伝子は、ホホバ植物および細菌Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＤＰ１（以前はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ ＡＤＰ１）由来のものが知られている。細菌エステルシンターゼは二機能性酵素であり、エステルシンターゼ活性およびジアシルグリセロール基質および脂肪酸アシル−ＣｏＡからトリアシルグリセロールを形成する能力（アシル−ＣｏＡ：ジグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）活性）を示す。遺伝子ｗａｘ／ｄｇａｔは、エステルシンターゼおよびＤＧＡＴの両方をコードする。Ｃｈｅｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：３７７９８，２００４；Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：８０７５，２００３を参照のこと。エステルシンセターゼを使用して、一定の脂肪エステルを産生することもできる。
アシル−ＣｏＡおよびアルコールからの脂肪エステル（ワックスが含まれる）の産生を、公知のポリペプチドを使用して操作することができる。脂肪エステル１つの作製方法は、１つまたは複数のエステルシンターゼ（ＥＣ２．３．１．２０、２．３．１．７５）の発現またはそのより活性の高い形態の発現を増加させる工程を含む。エステルシンセターゼペプチド配列を公的に利用可能であり、例示的なＧｅｎＢａｎｋ受入番号は、米国特許第８，２８３，１４３号の図１（図は、その全体が本明細書中で参考として援用される）に列挙されている。エステルシンターゼ活性の同定方法は、米国特許第７，１１８，８９６号に提供されている。
特定の例では、所望の産物が脂肪酸エステルワックスである場合、Ｃ１代謝微生物を、エステルを産生するように改変する。かかるＣ１代謝微生物は、Ｃ１代謝微生物にＣ１基質供給原料由来の飽和、不飽和、または分枝鎖の脂肪エステルを合成する能力を付与するために発現されるエステルシンターゼをコードする外因性核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ１代謝微生物はまた、以下の例示的なタンパク質をコードする核酸分子を発現することができる：脂肪酸エロンガーゼ、アシル−ＣｏＡレダクターゼ、アシルトランスフェラーゼ、エステルシンターゼ、脂肪酸アシルトランスフェラーゼ、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ、アシル−ｃｏＡワックスアルコールアシルトランスフェラーゼ、またはその任意の組み合わせ。１つの代替的な実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、二官能性エステルシンターゼ／アシル−ＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードする核酸分子を含む。例えば、二官能性エステルシンターゼ／アシル−ＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼは、Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＤＰ１（以前はＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｃａｌｃｏａｃｅｔｉｃｕｓ ＡＤＰ１）、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ ｂｏｒｋｕｍｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｆｕｎｄｉｂａｃｔｅｒ ｊａｄｅｎｓｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、またはＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ（以後にＲａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａに改名）由来の多酵素複合体から選択することができる。１つの実施形態では、脂肪酸エロンガーゼ、アシル−ＣｏＡレダクターゼ、またはワックスシンターゼは、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｅｕｔｒｏｐｈａまたはエステル（ワックスまたは脂肪エステルなど）を産生するための文献中で公知の他の生物由来の多酵素複合体に由来する。
脂肪エステル産生で有用なエステル合成タンパク質をコードする異種核酸分子のさらなる供給源には、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ（例えば、ＡＴＣＣ ３２２２２）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｃｕｒｖａｔｕｓ（Ａｐｉｏｔｒｉｃｕｍ ｃｕｒｖａｔｕｍとも呼ばれる）、Ａｌｃａｎｉｖｏｒａｘ ｊａｄｅｎｓｉｓ（例えば、Ｔ９Ｔ＝ＤＳＭ １２７１８＝ＡＴＣＣ ７００８５４）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＨＯ１−Ｎ（例えば、ＡＴＣＣ １４９８７）、およびＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ（例えば、ＰＤ６３０、ＤＳＭＺ ４４１９３）が含まれる。１つの例では、遺伝子座ＡＡ０１７３９１のＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＡＤＰ１由来のエステルシンターゼ（Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒ ａｎｄ Ｓｔｅｉｎｂｕｃｈｅｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：８０７５，２００３に記載）を使用する。別の例では、遺伝子座ＡＡＤ３８０４１のＳｉｍｍｏｎｄｓｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ由来のエステルシンターゼを使用する。
任意選択的に、ＦＡＴＰファミリーメンバーなどのエステル排出輸送体を使用して、細胞外環境へのエステルの放出を容易にすることができる。使用することができるエステル排出輸送体の非限定的な例は、脂肪酸（長鎖）輸送タンパク質ＣＧ７４００−ＰＡ（イソ型Ａ、キイロショウジョウバエ由来、遺伝子座ＮＰ＿５２４７２３）である。
輸送タンパク質は、Ｃ１代謝微生物から脂肪酸誘導体を排出する。多数の輸送タンパク質および排出タンパク質は、多種多様な化合物を排出する働きをし、特定の脂肪酸誘導体型に選択性を示すように天然に改変され得る。適切な輸送タンパク質の非限定的な例は、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送タンパク質、排出タンパク質、および脂肪酸輸送体タンパク質（ＦＡＴＰ）である。適切な輸送タンパク質のさらなる非限定的な例には、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌａｎｉａ、Ａｌｋａｌｉｇｅｎｅｓ ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓなどの生物由来のＡＢＣ輸送タンパク質が含まれる。使用することができる例示的なＡＢＣ輸送タンパク質は、ＣＥＲ５、ＡｔＭＲＰ５、ＡｍｉＳ２、またはＡｔＰＧＰ１である。１つの好ましい実施形態では、ＡＢＣ輸送タンパク質はＣＥＲ５（例えば、ＡＹ７３４５４２）である。適切な輸送タンパク質を発現する遺伝子を含むベクターをタンパク質産生宿主に挿入して脂肪酸誘導体の放出を増加させることができる。
Ｃ１代謝微生物を、内因性の脂肪酸誘導体を放出する能力について選択することもできる。産物の産生効率および発酵ブロスへの放出を、細胞内産物対細胞外産物の比として示すことができる。いくつかの例では、比は、約５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、または１：５であり得る。
特定の分岐点、飽和レベル、炭素鎖長、およびエステルの特性を有する脂肪酸誘導体を、必要に応じて産生することができる。特定の誘導体を天然に産生するＣ１代謝微生物を、初期宿主細胞として選択することができる。あるいは、特定の脂肪酸誘導体を産生するであろう酵素を発現する遺伝子を、本明細書中に記載のＣ１代謝微生物に挿入することができる。
いくつかの例では、異なる種または操作されたバリアントを起源とする外因性ＦＡＳ遺伝子の発現を、未変性の宿主細胞と構造的に（長さ、分枝、不飽和度など）異なる脂肪酸を生合成するようにＣ１代謝微生物に導入することができる。これらの異種遺伝子産物を、宿主細胞内の天然の調節機構に影響を受けないように選択または操作することもでき、したがって、所望の商品の生産を制御することが可能である。例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、または油性酵母など由来のＦＡＳ酵素を、Ｃ１代謝微生物内で発現することができる。かかる外因性酵素の発現は、産生された脂肪酸、最終的には脂肪酸誘導体の構造を変化させるであろう。
Ｃ１代謝微生物を特定レベルの不飽和、分枝、または炭素鎖長を有する脂肪酸を産生するように操作する場合、得られた操作された脂肪酸を、脂肪酸誘導体の産生で使用することができる。かかるＣ１代謝微生物から生成された脂肪酸誘導体は、操作された脂肪酸の特徴を示し得る。
例えば、産生宿主を、分枝短鎖脂肪酸を産生するように操作することができ、次いで、分枝短鎖脂肪アルコールを産生するために産生宿主が分枝短鎖脂肪酸を使用することができる。同様に、所定レベルの分枝、不飽和、または炭素鎖長を有する脂肪酸が産生されるように産生宿主を操作することによって炭化水素を産生することができ、したがって、均一な炭化水素集団を産生することができる。さらなる工程を使用して、得られた産物の均一性を改善することができる。例えば、不飽和アルコール、脂肪エステル、または炭化水素を所望する場合、Ｃ１代謝微生物を、低レベルの飽和脂肪酸が産生されるように操作することができ、さらに、さらなる不飽和化酵素を発現して飽和産物の産生を軽減または減少させるように改変することができる。
脂肪酸は、脂肪酸誘導体産生における重要な中間体である。脂肪酸誘導体を、脂肪酸誘導体を作製するために分枝鎖または環状の脂肪酸を使用することにより、分岐点、環状部分、およびその組み合わせを含むように産生することができる。
例えば、Ｃ１代謝微生物は、直鎖脂肪酸を天然に産生することができる。分枝鎖脂肪酸を産生するようにＣ１代謝微生物を操作する場合、分枝前駆体（例えば、ｂｋｄオペロン）を提供する数個の遺伝子を、Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン生成菌）に導入し、分枝前駆体（例えば、ｆａｂＨ）から脂肪酸生合成を開始するように発現することができる。ｂｋｄ、ｉｌｖ、ｉｃｍ、およびｆａｂの遺伝子ファミリーを発現または過剰発現させて分枝鎖脂肪酸誘導体を産生することができる。同様に、環状脂肪酸を産生するために、環状前駆体を提供する遺伝子を産生宿主に導入し、環状前駆体から脂肪酸生合成を開始させるように発現することができる。ａｎｓ、ｃｈｃ、およびｐｌｍの遺伝子ファミリーを発現または過剰発現させて環状脂肪酸を産生することができる。本方法で使用することができるこれらの遺伝子ファミリー中の遺伝子および本開示のＣ１代謝微生物の非限定的な例は、米国特許第８，２８３，１４３号（図１、図は、本明細書中で参考として援用される）に列挙されている。
さらに、産生宿主を、分枝脂肪酸（例えば、ＡＣＰ、ＦａｂＦなど）の伸長のタンパク質をコードする遺伝子を発現するか、通常は直鎖脂肪酸が得られる対応遺伝子を欠失または脆弱化するように操作することができる。これに関して、導入した遺伝子（例えば、ｆａｂＨ、ｆａｂＦ）と競合するであろう内因性遺伝子を、欠失、阻害、または脆弱化する。
分枝アシル−ＣｏＡ（例えば、２−メチル−ブチリル−ＣｏＡ、イソバレリル−ＣｏＡ、イソブチリル−ＣｏＡなど）は、分枝脂肪酸の前駆体である。分枝脂肪酸を含むほとんどの微生物では、分枝脂肪酸を、２工程で分枝アミノ酸（例えば、イソロイシン、ロイシン、およびバリン）から合成する（Ｋａｄｅｎａ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５５：２８８，１９９１）。Ｃ１代謝微生物を、これら２つの工程に関与する１つまたは複数の酵素を発現または過剰発現して分枝脂肪酸誘導体を産生するか、分枝脂肪酸誘導体を過剰産生するように操作することができる。例えば、Ｃ１代謝微生物は、分枝脂肪酸誘導体が得られる１工程を達成することができる内因性酵素を有することができ、したがって、第２の工程に関与する酵素をコードする遺伝子のみを組換え的に導入することが必要である。
分枝脂肪酸誘導体形成の第１工程は、分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼによる対応するα−ケト酸の産生である。Ｃ１代謝微生物（メタン資化性菌など）は、内因性に、かかる酵素をコードする遺伝子を含むことができるか、かかる遺伝子を組換え的に導入することができる。いくつかのＣ１代謝微生物では、異種分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼを発現することができない。それ故、一定の実施形態では、大腸菌由来のＩｌｖＥまたは任意の他の分枝鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（例えば、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来のＩｌｖＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＦ３４４０６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ由来のＩｌｖＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿７４５６４８）、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のＩｌｖＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ＿６２９６５７））を、本開示のＣ１代謝微生物に導入することができる。アミノトランスフェラーゼ反応が選択されたＣ１代謝微生物における分枝脂肪酸生合成の律速段階である場合、アミノトランスフェラーゼを過剰発現することができる。
第２の工程は、対応する分枝鎖アシル−ＣｏＡへのα−ケト酸の酸化的脱カルボキシル化である。この反応は、分枝鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体（ｂｋｄ；ＥＣ１．２．４．４．）によって触媒することができ（Ｄｅｎｏｙａら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７：３５０４，１９９５）、この複合体はＥ１α／β（デカルボキシラーゼ）サブユニット、Ｅ２（ジヒドロリポイルトランスアシラーゼ）サブユニット、およびＥ３（ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ）サブユニットを含む。これらの分枝鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体およびα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体と類似する。分枝脂肪酸を保有するか、分枝鎖アミノ酸で成長するあらゆる微生物を、Ｃ１代謝微生物（メタン資化性菌など）中での発現のためのｂｋｄ遺伝子を単離するための供給源として使用することができる。さらに、Ｃ１代謝微生物がそのピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体（ｌｐｄ、ＥＣ１．８．１．４）の一部としてＥ３成分を有する場合、この微生物はＥ１α／β遺伝子およびＥ２ｂｋｄ遺伝子のみを発現するのに十分であり得る。
別の例では、イソブチリル−ＣｏＡを、クロトニル−ＣｏＡレダクターゼ（Ｃｃｒ、ＥＣ１．６．５．５、１．１．１．１）およびイソブチリル−ＣｏＡムターゼ（大サブユニットＩｃｍＡ、ＥＣ５．４．９９．２；小サブユニットＩｃｍＢ、ＥＣ５．４．９９．２）の同時発現によってＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）中で作製することができる（Ｈａｎ ａｎｄ Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９：５１５７，１９９７）。クロトニル−ＣｏＡは、大腸菌および他の微生物中での脂肪酸生合成における中間体である。
ｂｋｄ遺伝子の発現に加えて、ｂｒＦＡ生合成の開始には分枝鎖アシル−ＣｏＡに特異性を有するβ−ケトアシル−アシル−キャリア−タンパク質シンターゼＩＩＩ（ＦａｂＨ、ＥＣ２．３．１．４１）を利用する（Ｌｉら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７：３７９５，２００５）。任意の分枝脂肪酸含有微生物の脂肪酸生合成に関与するｆａｂＨ遺伝子を、本開示のＣ１代謝微生物中で発現することができる。分枝脂肪酸またはその誘導体を天然に作製しない産生宿主由来のＢｋｄ酵素およびＦａｂＨ酵素は分枝脂肪酸産生を補助することができず、したがって、ＢｋｄおよびＦａｂＨを組換え的に発現することができる。ｂｋｄ遺伝子およびｆａｂＨ遺伝子を含むベクターを、かかるＣ１代謝微生物に挿入することができる。同様に、ＢｋｄおよびＦａｂＨの内因性産生レベルは、分枝脂肪酸誘導体を産生するのに十分でないかもしれないので、一定の実施形態では、分枝脂肪酸誘導体を過剰発現させる。さらに、脂肪酸生合成経路の他の成分（アシルキャリアタンパク質（ＡＣＰ）およびβ−ケトアシル−アシル−キャリア−タンパク質シンターゼＩＩ（ｆａｂＦ、ＥＣ２．３．１．４１）など）を発現または過剰発現させることができる。これらの遺伝子の発現に加えて、内因性脂肪酸生合成経路中のいくつかの遺伝子を、本開示のＣ１代謝微生物中で脆弱化することができる。ｂｒＦＡが産生される経路の酵素と基質を競合する酵素をコードする遺伝子を、分枝脂肪酸誘導体産生を増加させるために脆弱化または阻害することができる。
上記のように、分枝鎖アルコールを、分枝脂肪酸合成およびアルコール合成を補助する遺伝子発現の組み合わせによって産生することができる。例えば、アルコールレダクターゼ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ ＡＤＰ１由来のＡｃｒ１など）をｂｋｄオペロンと同時発現させる場合、開示のＣ１代謝微生物は、イソペンタノール、イソブタノール、または２−メチルブタノールを合成することができる。同様に、Ａｃｒ１がｃｃｒ／ｉｃｍ遺伝子と同時発現される場合、本開示のＣ１代謝微生物はイソブタノールを合成することができる。
本開示のＣ１代謝微生物（メタン資化性菌など）をω−環状脂肪酸（ｃｙＦＡ）を合成することができる生物に変換するために、環状前駆体シクロヘキシルカルボニル−ＣｏＡ（ＣＨＣ−ＣｏＡ）を提供する遺伝子（Ｃｒｏｐｐら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１８：９８０，２０００）を導入し、本開示のＣ１代謝微生物中で発現させる。
ＣＨＣ−ＣｏＡを提供する遺伝子の非限定的な例には、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｌｌｉｎｕｓのアンサトリエニン遺伝子クラスター由来のａｎｓＪ、ａｎｓＫ、ａｎｓＬ、ｃｈｃＡ、およびａｎｓＭ（Ｃｈｅｎら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６１：９８、１９９９）またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．ＨＫ８０３のホスラクトマイシンＢ遺伝子クラスター由来のｐｌｍＪ、ｐｌｍＫ、ｐｌｍＬ、ｃｈｃＡ、およびｐｌｍＭ（Ｐａｌａｎｉａｐｐａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３５５５２，２００３）が、Ｓ．ｃｏｌｌｉｎｕｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、またはＳ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ由来のｃｈｃＢ遺伝子（Ｐａｔｔｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３９：７５９５、２０００）と共に含まれる。ＦａｂＨ、ＡＣＰ、およびｆａｂＦの各遺伝子を、共環状脂肪酸が産生開始および伸長されるように発現することができる。あるいは、相同遺伝子を、ｃｙＦＡを作製する微生物から単離し、本開示のＣ１代謝微生物中で発現させることができる
遺伝子ｆａｂＨ、ａｃｐ、およびｆａｂＦは、広範な基質特異性を有し得るのでω−環状脂肪酸の産生開始および伸長に十分である。これらの遺伝子のいずれかのａｎｓＪＫＬＭ／ｃｈｃＡＢ遺伝子またはｐｍｌＪＫＬＭ／ｃｈｃＡＢ遺伝子との同時発現によってｃｙＦＡが生成されない場合、ｃｙＦＡを作製する微生物由来のｆａｂＨ、ａｃｐ、またはｆａｂＦホモログを単離し（例えば、縮重ＰＣＲプライマーまたは異種ＤＮＡ配列プローブの使用による）、同時発現させることができる。
脂肪酸は、脂肪酸誘導体産生の重要な中間体である。脂肪酸誘導体の飽和度を、脂肪酸中間体の飽和度の制御によって調節することができる。ｓｆａ、ｇｎｓ、およびｆａｂの遺伝子ファミリーを、脂肪酸の飽和を調節するように発現または過剰発現することができる。本開示のＣ１代謝微生物と共に本方法で使用することができる遺伝子ファミリー中の遺伝子の非限定的な例は、米国特許第８，２８３，１４３号の図１（図は、その全体が本明細書中で参考として援用される）に列挙されている。
本開示のＣ１代謝微生物を、ｆａｂＢを過剰発現するようにＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）を操作するか、低温で（例えば、３７℃未満）でＣ１代謝微生物を成長させることによって不飽和脂肪酸誘導体を産生するように操作することができる。大腸菌では、ＦａｂＢは、ｃｉｓΔ３デセノイル−ＡＣＰを優先し、その結果、不飽和脂肪酸が産生される。ＦａｂＢの過剰発現により、有意な比率で不飽和脂肪酸が産生される（ｄｅ Ｍｅｎｄｏｚａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２０９８，１９８３）。ｆａｂＢをコードする核酸分子を、その遺伝子を天然に持たないＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）に挿入し、この微生物中で発現させることができる。次いで、これらの不飽和脂肪酸を、脂肪酸誘導体（脂肪アルコール、脂肪エステル、ワックス、ヒドロキシ脂肪酸、またはジカルボン酸など）を産生するように操作されたＣ１代謝微生物における中間体として使用することができる。
あるいは、脂肪酸生合成の抑制因子（例えば、ｆａｂＲ）を、Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）中で阻害または欠失することができ、それにより、大腸菌で認められるように、不飽和脂肪酸産生を増加させることもできる（Ｚｈａｎｇら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１５５５８，２００２）。例えば、ｆａｂＭ（ｔｒａｎｓ−２、ｃｉｓ−３−デセノイル−ＡＣＰ イソメラーゼ）を過剰発現し、且つ肺炎連鎖球菌由来のｆａｂＫ（ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＡＣＰレダクターゼＩＩ）を発現制御する一方で（Ｍａｒｒａｋｃｈｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４４８０９，２００２）、ｆａｂＩ（ｔｒａｎｓ−２−エノイル−ＡＣＰレダクターゼ）を欠失することによって不飽和脂肪酸をさらに増加させることができる。さらに、不飽和脂肪エステルの比率を増加させるために、Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）は、ｆａｂＢ（β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼＩ、受入番号ＥＣ：２．３．１．４１をコードする）、ｓｆａ（ｆａｂＡの抑制因子をコードする）、ならびにｇｎｓＡおよびｇｎｓＢ（共にｓｅｃＧヌル変異体抑制因子（すなわち、低温ショックタンパク質）をコードする）を過剰発現することもできる。いくつかの例では、内因性ｆａｂＦ遺伝子を脆弱化し、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）の産生比率を増加させることができる。
別の例では、所望の脂肪酸誘導体はヒドロキシル化脂肪酸である。特異的酵素を使用して、鎖全体にヒドロキシル修飾を行うことができる。特に、ω−ヒドロキシル化により、分子の両末端に官能基を含む特に有用な分子が産生される（例えば、直鎖重合してポリエステルプラスチックを産生可能である）。一定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）は、ＣＹＰ５２Ａ１３、ＣＹＰ５２Ａ１４、ＣＹＰ５２Ａ１７、ＣＹＰ５２Ａ１８、ＣＹＰ５２Ａ１２、およびＣＹＰ５２Ａ１２Ｂから選択される１つまたは複数の改変されたＣＹＰ５２Ａ型シトクロムＰ４５０を含むことができ、ここで、シトクロムは、脂肪酸を、例えば、ω−ヒドロキシ脂肪酸に改変する。異なる脂肪酸を、異なるシトクロムＰ４５０によって異なる比率でヒドロキシル化する。所望の脂肪酸供給原料の効率的なヒドロキシル化を行うために、Ｃ１代謝微生物を、広範な非常に豊富な脂肪酸基質をω−ヒドロキシル化することができる１つまたは複数のＰ４５０酵素を発現するように生成する。ラウリン酸（Ｃ１２：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）、およびα−リノレン酸（ω３、Ｃ１８：３）のω−ヒドロキシル化を触媒するＰ４５０酵素が特に興味深い。Ｃ１代謝非光合成微生物にクローン化することができる異なる脂肪酸に対して公知のω−ヒドロキシル化活性を有するＰ４５０酵素の例には、Ｖｉｃｉａ ｓａｔｉｖａ由来のＣＹＰ９４Ａ１（Ｔｉｊｅｔら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３３２：５８３，１９８８）；Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ由来のＣＹＰ ９４Ａ５（Ｌｅ Ｂｏｕｑｕｉｎら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６８：３０８３，２００１）；Ｚｅａ ｍａｙｓ由来のＣＹＰ７８Ａ１（Ｌａｒｋｉｎ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５：３４３，１９９４）；Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ由来のＣＹＰ ８６Ａ１（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２４３：６８８，１９９８）およびＣＹＰ８６Ａ８（Ｗｅｌｌｅｓｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：９６９４，２００１）；Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ由来のＣＹＰ ９２Ｂ１（Ｐｅｔｋｏｖａ−Ａｎｄｏｎｏｖａら，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：１８１９，２００２）；Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＣＹＰ１０２Ａ１（ＢＭ−３）変異体Ｆ８７（Ｏｌｉｖｅｒら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３６：１５６７，１９９７）；および哺乳動物および昆虫由来のＣＹＰ４ファミリー（Ｈａｒｄｗｉｃｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．７５：２２６３，２００８）が含まれる。
一定の実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、脂肪酸またはω−ヒドロキシ脂肪酸の特異的部位にさらなる内部ヒドロキシル化を導入することができるＰ４５０酵素をコードする核酸分子を含み、ここで、組換えＣ１代謝微生物は、内部酸化された脂肪酸またはω−ヒドロキシ脂肪酸またはアルデヒドまたはジカルボン酸を産生することができる。本開示のＣ１代謝微生物で使用することができる異なる脂肪酸に対して鎖内ヒドロキシル化活性を有する例示的なＰ４５０酵素の例には、ω−１〜ω−５ヒドロキシル化を有するＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ由来のＣＹＰ８１Ｂ１（Ｃａｂｅｌｌｏ−Ｈｕｒｔａｄｏら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：７２６０，１９９８）；ω−１およびω−２ヒドロキシル化を有するＨｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ由来のＣＹＰ７９０Ｃ１（Ｋａｎｄｅｌら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：３５８８１，２００５）；脂肪酸不飽和のエポキシ化を有するＥｕｐｈｏｒｂｉａ ｌａｇｓｃａｅ由来のＣＹＰ７２６Ａ１（Ｃａｈｏｏｎら，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２８：６１５，２００２）；α−ヒドロキシル化を有するＳｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｍｏｂｉｌｉｓ由来のＣＹＰ１５２Ｂ１（Ｍａｔｓｕｎａｇａら，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３５：３６５，２０００）；ω−１ヒドロキシル化を有するヒト肝臓由来のＣＹＰ２Ｅ１および４Ａ１（Ａｄａｓら，Ｊ．Ｌｉｐ．Ｒｅｓ．４０：１９９０，１９９９）；α−およびβ−ヒドロキシル化を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｓｔｉｌｉｓ由来のＰ４５０ＢＳβ（Ｌｅｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：９７６１，２００３）；ならびにω−１，ω−２、およびω−３ヒドロキシル化を有するＢａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ由来のＣＹＰ１０２Ａ１（ＢＭ−３）（Ｓｈｉｒａｎｅら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１３７３２，１９９３）が含まれる。
一定の実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、ω−ヒドロキシル化を含むように脂肪酸を改変することができるＰ４５０酵素をコードする核酸分子を含み、ω−ヒドロキシ脂肪酸誘導体をさらに酸化するようにさらに改変してジカルボン酸を得ることができる。多くの場合、まず第１にヒドロキシル化を行うことができるＰ４５０酵素は、さらなる酸化を行ってジカルボン酸を得ることもできる。他の実施形態では、宿主生物中の非特異的未変性アルコールデヒドロゲナーゼは、ω−ヒドロキシ脂肪酸をジカルボン酸に酸化することができる。さらなる実施形態では、Ｃ１代謝非光合成生物は、ジカルボン酸産生を容易にするための１つまたは複数の脂肪アルコールオキシダーゼ（ＦＡＯ１、ＦＡＯ１Ｂ、ＦＡＯ２、ＦＡＯ２Ｂなど）またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ−Ａ４、ＡＤＨ−Ａ４Ｂ、ＡＤＨ−Ｂ４、ＡＤＨ−Ｂ４Ｂ、ＡＤＨ−Ａ１０、およびＡＤＨ−Ｂ１１など）（例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２９１６５３号（リストはその全体が本明細書中で援用される）に列挙したＣａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ由来）をコードする核酸分子をさらに含む。
本明細書中に記載の方法により、種々の炭素鎖長を有する脂肪エステルおよび脂肪酸誘導体の産生が可能である。ｔｅｓおよびｆａｔ遺伝子ファミリーの発現によって産生されるチオエステラーゼによって鎖長を調節する。特異的チオエステラーゼの発現により、所望の炭素鎖長を有する脂肪酸誘導体を産生することができる。適切なチオエステラーゼの非限定的な例は、本明細書中に記載されており、且つ米国特許第８，２８３，１４３号（図１、図は本明細書中で参考として援用される）に列挙されている。特定のチオエステラーゼをコードする核酸分子を、特定の炭素鎖長の脂肪酸誘導体が産生されるようにＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）に導入することができる。一定の実施形態では、内因性チオエステラーゼの発現を、阻害、抑制、または下方制御する。
一定の実施形態では、脂肪酸誘導体は、約８〜２４個の炭素原子、約８〜１８個の炭素原子、約１０〜１８個の炭素原子、約１０〜１６個の炭素原子、約１２〜１６個の炭素原子、約１２〜１４個の炭素原子、約１４〜２４個の炭素原子、約１４〜１８個の炭素原子、約８〜１６個の炭素原子、または約８〜１４個の炭素原子の炭素鎖を有する。別の実施形態では、脂肪酸誘導体は、約２０個未満の炭素原子、約１８個未満の炭素原子、約１６個未満の炭素原子、約１４個未満の炭素原子、または約１２個未満の炭素原子の炭素鎖を有する。他の実施形態では、脂肪エステル生成物は、炭素原子含有量が８個と２４個との間の炭素原子の飽和または不飽和の脂肪エステル生成物である。さらなる実施形態では、脂肪エステル生成物の炭素原子含有量は、８炭素原子と１４炭素原子との間である。なおさらなる実施形態では、脂肪エステル生成物の炭素含有量は、１４炭素と２０炭素とのである。さらに他の実施形態では、脂肪エステルは、Ｃ１８：１のメチルエステルである。さらなる実施形態では、脂肪エステルは、Ｃ１６：１のエチルエステルである。他の実施形態では、脂肪エステルは、Ｃ１６：１のメチルエステルである。さらに他の実施形態では、脂肪エステルは、オクタノールのオクタデシルエステルである。
いくつかの微生物は、偶数または奇数の炭素鎖の脂肪酸および脂肪酸誘導体を優先的に産生する。例えば、大腸菌は、通常、偶数炭素鎖の脂肪酸および脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）を産生する。一定の実施形態では、本明細書中に開示の方法を使用して、奇数炭素鎖の脂肪酸誘導体を産生するようにＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）を作製することができるようにＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）における産生を変化させることができる。
エステルには「Ａ」サイドおよび「Ｂ」サイドと命名することができるものが含まれる。Ｂサイドは、本開示のＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）におけるｄｅ ｎｏｖｏ合成から産生された脂肪酸が寄与し得る。Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）がアルコール（脂肪アルコールが含まれる）を作製するようにさらに操作されたいくつかの実施形態では、ＡサイドはまたＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）によって産生される。さらに他の実施形態では、Ａサイドを培地中に得ることができる。所望の核酸分子をコードするチオエステラーゼの選択により、Ｂサイド（および脂肪アルコールが作製される場合はＡサイド）を、一定の炭素鎖の特徴を有するようにデザインすることができる。これらの特徴には、分岐点、不飽和、および所望の炭素鎖長が含まれる。
特定のチオエステラーゼ遺伝子を選択する場合、ＡサイドおよびＢサイドは、共に脂肪酸生合成経路中間体を使用したＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）が寄与する場合、類似の炭素鎖の特徴を有するであろう。例えば、産生された脂肪エステルの少なくとも約５０％、６０％、７０％、または８０％が、約２、４、６、８、１０、１２、または１４炭素長変化するＡサイドおよびＢサイドを有するであろう。ＡサイドおよびＢサイドはまた、類似の分枝レベルおよび飽和レベルを示し得る。
Ａサイドに寄与するための脂肪アルコールの産生に加えて、Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）は、Ａサイド上の組み込みのための他の短鎖アルコール（エタノール、プロパノール、イソプロパノール、イソブタノール、およびブタノールなど）を産生することができる。例えば、ブタノールをＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）によって産生することができる。ブタノール産生細胞を作製するために、Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）を、例えば、ｐｒｐＢＣＤＥプロモーター系下にてｐＢＡＤ２４発現ベクター中で、例えば、大腸菌Ｋ１２由来のａｔｏＢ（アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｆｉｂｒｉｓｏｌｖｅｎｓ由来のβ−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ由来のクロトナーゼ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ由来のブチリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖｕｍ由来のＣｏＡアシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ）、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのアルデヒド−アルコールデヒドロゲナーゼをコードするａｄｈＥを発現するようにさらに操作することができる。Ｃ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）を、他の短鎖アルコールを産生するように同様に改変することができる。例えば、エタノールを、Ｋａｌｓｃｈｅｕｅｒらによって教示された方法（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２：２５２９，２００６）を使用して、産生宿主中に産生することができる。
Ｃ１代謝微生物−宿主細胞
本開示のＣ１代謝微生物は、天然の株、適応株（例えば、親株と比較して成長速度が改善され、且つ総バイオマス収量が増加した株を選択するための発酵を行う）、または目的の脂肪酸誘導体を産生するか、成長速度が増加するか、その両方が得られるように組換え的に改変された株（例えば、脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ、チオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、またはその組み合わせを発現するように遺伝子改変された）であり得る。一定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、光合成微生物（藻類または植物など）ではない。
一定の実施形態では、本開示は、原核生物または細菌（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓなど）であるＣ１代謝微生物を提供する。
さらなる実施形態では、Ｃ１代謝細菌は、メタン資化性菌またはメチロトローフ菌である。例示的なメタン資化性菌には、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ、またはその組み合わせが含まれる。例示的なメチロトローフ菌には、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｕｌａｎｓ、またはその組み合わせが含まれる。
一定の実施形態では、メタン資化性細菌を、Ｃ１基質供給原料を脂肪アルコールに変換する能力を有するように遺伝子操作する。メタン資化性細菌は、炭素源およびエネルギー源としてメタンを酸化する能力を有する。メタン資化性細菌は、その炭素同化経路および内部膜構造に基づいて以下の３つの群に分類される：Ｉ型（γプロテオバクテリア綱）、ＩＩ型（αプロテオバクテリア綱）、およびＸ型（γプロテオバクテリア綱）。Ｉ型メタン資化性菌は炭素同化のためにリブロースモノリン酸（ＲｕＭＰ）経路を使用するのに対して、ＩＩ型メタン資化性菌はセリン経路を使用する。Ｘ型メタン資化性菌は、ＲｕＭＰ経路を使用するが、低レベルのセリン経路酵素も発現する。メタン資化性細菌には、炭素源およびエネルギー源のためにＣ１基質のみを利用することができる偏性メタン資化性菌、ならびに唯一の炭素源およびエネルギー源としていくつかの多炭素基質を利用する能力を天然に有する通性メタン資化性菌が含まれる。
例示的な通性メタン資化性菌には、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、およびＭｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａのいくつかの種（例えば、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ ｔｕｎｄｒａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｄａｌｔｏｎａ ＳＢ２株、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｂｒｙｏｐｈｉｌａ、およびＭｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａ ａｕｒｅａ ＫＹＧ）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、またはその高成長バリアントが含まれる。例示的な偏性メタン資化性細菌には、以下が含まれる：Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｂａｔｈ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ １６ａ（ＡＴＣＣ ＰＴＡ ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｆｌａｇｅｌｌａｔａ ｓｐ ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、およびＭｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、またはその高成長バリアント。
なおさらなる実施形態では、本開示は、シンガス代謝細菌であるＣ１代謝微生物（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｅｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、またはその組み合わせなど）を提供する。例示的なメチロトローフ菌には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎ、またはその組み合わせが含まれる。
一定の他の実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、酵母（Ｃａｎｄｉｄａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、またはＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａが含まれる）などの真核生物である。
一定の他の実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、偏性Ｃ１代謝非光合成微生物（偏性メタン資化性菌またはメチロトローフ菌など）である。さらなる実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物は、脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ、チオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、その組み合わせ、または３種全てをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換え微生物である。
Ｃ１代謝微生物−非天然または組換え
いくつかの実施形態では、本明細書中で使用する場合、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸誘導体（脂肪アルコールなど）を生成するためにＣ１基質供給原料（例えば、メタン）を利用する脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ＦＡＲ）を有し得る組換えＣ１代謝微生物（例えば、非天然メタン資化細菌）を提供する。種々の実施形態では、組換えＣ１代謝微生物は、ＦＡＲ酵素をコードする核酸分子を発現または過剰発現する。一定の実施形態では、ＦＡＲ酵素はＣ１代謝微生物に対して内因性であり得るか、ＦＡＲ酵素はＣ１代謝微生物に対して異種であり得る。
１つの態様では、本開示は、脂肪酸変換酵素をコードする組換え核酸分子を有する非天然メタン資化性菌であって、前記メタン資化性菌が、Ｃ１基質をＣ８〜Ｃ２４脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、またはその組み合わせに変換することができる、非天然メタン資化性菌を提供する。一定の実施形態では、非天然メタン資化性菌は、アシル−ＣｏＡ依存性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ（脂肪アルコールを形成することができるａｃｒ１、ＦＡＲ、ＣＥＲ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＪＮ３１５７８１．１）、またはＭａｑｕ＿２２２０など）である脂肪酸変換酵素を含む。一定の実施形態では、非天然メタン資化性菌は、脂肪アルデヒドを形成することができるアシル−ＣｏＡ依存性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ａｃｒ１など）である脂肪酸変換酵素を含む。いくつかの実施形態では、このプロセスにより、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０、Ｃ２２、またはＣ２４炭素長を含む脂肪アルコールが産生されるであろう。
本開示に含まれる脂肪酸誘導体（例えば、脂肪アルコール）を産生することができる任意の上記組換えＣ１代謝微生物では、非天然メタン資化性菌は、チオエステラーゼ（リーダー配列、ＵｃＦａｔＢ、またはＢＴＥを欠くｔｅｓＡなど）をコードする組換え核酸分子をさらに含む。一定の実施形態では、内因性チオエステラーゼ活性は、不変の内因性チオエステラーゼ活性と比較して減少するか、最小であるか、消失する。
本開示に含まれる脂肪酸誘導体（例えば、脂肪アルコール）を産生することができる任意の上記組換えＣ１代謝微生物では、非天然メタン資化性菌は、アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＦａｄＤ、ｙｎｇ１、またはＦＡＡ２など）をコードする組換え核酸分子をさらに含む。一定の実施形態では、内因性アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性は、不変の内因性アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性と比較して減少するか、最小であるか、消失する。
さらなる実施形態では、本開示は、異種アシル−ＣｏＡ依存性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子、異種チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子、および異種アシル−ＣｏＡシンセターゼをコードする組換え核酸分子を有する非天然メタン資化性菌であって、前記メタン資化性菌がＣ１基質をＣ８〜Ｃ２４脂肪アルコールに変換することができる、非天然メタン資化性菌を提供する。一定の実施形態では、脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼは、未変性の脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼの発現レベルと比較して非天然メタン資化性菌中で過剰発現される。一定の実施形態では、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、またはその両方を形成することができるアシル−ＣｏＡ依存性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼはａｃｒ１であるか、脂肪アルコールを形成することができるアシル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼは、ＦＡＲ、ＣＥＲ４、またはＭａｑｕ＿２２２０である。一定の実施形態では、アシル−ＣｏＡシンセターゼは、ＦａｄＤ、ｙｎｇ１、またはＦＡＡ２である。
なおさらなる実施形態では、異種アシル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子および異種チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子を有する非天然メタン資化性菌であって、前記メタン資化性菌がＣ１基質をＣ８〜Ｃ２４脂肪アルコールに変換することができる、非天然メタン資化性菌を提供する。一定の実施形態では、脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼは、未変性の脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼの発現レベルと比較して非天然メタン資化性菌中で過剰発現される。
任意の上記組換えＣ１代謝微生物（例えば、非天然メタン資化細菌）は、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒの種（Ｍ．ａｌｇｉｃｏｌａ、Ｍ．ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ、Ｍ．ａｑｕａｅｏｌｅｉ、Ｍ．ａｒｃｔｉｃｕｓ、Ｍ．ｂｒｙｏｚｏｏｒｕｍ、Ｍ．ｄａｅｐｏｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｅｘｃｅｌｌｅｎｓ、Ｍ．ｆｌａｖｉｍａｒｉｓ、Ｍ．ｇｕａｄｏｎｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｍ．ｋｏｒｅｅｎｉｓ、Ｍ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｍ．ｌｉｔｏｒａｌｉｓ、Ｍ．ｌｕｔａｏｅｎｓｉｓ、Ｍ．ｍａｒｉｔｉｍｕｓ、Ｍ．ｓｅｄｉｍｉｎｕｍ、Ｍ．ｓｑｕａｌｅｎｉｖｉｒａｎｓ、Ｍ．ｖｉｎｉｆｉｒｍｕｓなど）またはその等価な種および同義の種に由来するか、これらから得ることができるＦＡＲ酵素またはその機能的フラグメントを有し得る。一定の実施形態では、本開示の組成物および方法で用いるＦＡＲ酵素は、海洋細菌Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｌｇｉｃｏｌａ ＤＧ８９３（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＥＤＭ４９８３６．１、ＦＡＲ “Ｍａａ＿８９３”）またはＭａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｑｕａｅｏｌｅｉ ＶＴ８（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＹＰ＿９５９４８６．１、ＦＡＲ “Ｍａｑｕ＿２２２０”）またはＯｃｅａｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．ＲＥＤ６５（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＥＡＴ１３６９５．１、ＦＡＲ “Ｏｃｓ＿６５”）に由来する。
任意の上記組換えＣ１代謝微生物（例えば、非天然メタン資化細菌）のなおさらなる実施形態では、ＦＡＲ酵素またはその機能的フラグメントは、ＦＡＲ＿Ｈｃｈ（Ｈａｈｅｌｌａ ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓ ＫＣＴＣ ２３９６、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＹＰ＿４３６１８３．１）；ＦＡＲ＿Ａｃｔ（海洋Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＰＨＳＣ２０Ｃ１株、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＥＡＲ２５４６４．１由来）、ＦＡＲ＿Ｍｍｅ（海洋メタゲノム、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＥＤＤ４００５９．１）、ＦＡＲ＿Ａｅｃ（Ａｃｒｏｍｙｒｍｅｘ ｅｃｈｉｎａｔｉｏｒ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＥＧＩ６１７３１．１）、ＦＡＲ＿Ｃｆｌ（Ｃａｍｐｏｎｏｔｕｓ ｆｌｏｒｉｄａｎｕｓ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＥＦＮ６２２３９．１）、およびＦＡＲ＿Ｓｃａ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃａｔｔｌｅｙａ ＮＲＲＬ ８０５７、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＹＰ＿００６０５２６５２．１）である。他の実施形態では、ＦＡＲ酵素またはその機能的フラグメントは、Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ（ＦＡＲ＿Ｖｖｉ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＣＡＯ２２３０５．１またはＣＡＯ６７７７６．１）、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｂａｃｉｌｌｕｍ ａｌｋｅｎｉｖｏｒａｎｓ ＡＫ−０１（ＦＡＲ＿Ｄａｌ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＹＰ＿００２４３０３２７．１）、Ｓｉｍｍｏｎｄｓｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（ＦＡＲ＿Ｓｃｈ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＡＤ３８０３９．１）、Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ（ＦＡＲ＿Ｂｍｏ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＢＡＣ７９４２５．１）、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（ＦＡＲ＿Ａｔｈ；Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＤＱ４４６７３２．１またはＮＭ＿１１５５２９．１）、またはＯｓｔｒｉｎｉａ ｓｃａｐｕｌａｌｉｓ（ＦＡＲ＿Ｏｓｃ；Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＥＵ８１７４０５．１）から単離されるか、これらに由来する。
一定の実施形態では、ＦＡＲ酵素またはその機能的フラグメントは、Ｍ．ａｌｇｉｃｏｌａ ＤＧ８９３またはＭａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ａｑｕａｅｏｌｅｉ ＹＴ８に由来するかこれらから得られ、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＥＤＭ４９８３６．１またはＹＰ＿９５９４８６．１にそれぞれ記載の配列またはその機能的フラグメントと少なくとも７５％、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、コードされた組換えＦＡＲ酵素は、Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＥＤＭ４９８３６．１またはＹＰ＿９５９４８６．１に記載の配列と同一のアミノ酸配列を有する。
一定の実施形態では、本開示に含まれる脂肪酸誘導体（例えば、脂肪アルコール）を産生することができる組換えＣ１代謝微生物は、カルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）をコードする異種核酸分子を含むであろう。いくつかの実施形態では、組換え微生物は、本明細書中にさらに記載のアシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＴＥ）、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）、またはホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ＰＰＴアーゼ）から選択される１つまたは複数の異種核酸分子をさらに含むであろう。
本開示は、Ｃ１基質（例えば、天然ガス、メタン）をＣ８〜Ｃ２４脂肪アルコールに変換するための組換えＣ１代謝微生物または非天然メタン資化性菌の使用プロセスを提供する。微生物は、炭素源の脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、または分枝脂肪酸などへの効率的な変換プロセスを進化させてきた。本開示のプロセスは、このようにして産生された脂肪酸を流用して宿主Ｃ１代謝微生物の代謝操作によって誘導体（長鎖脂肪アルコールなど）を生成することによってかかる効率を利用する。１つの態様では、組換えＣ１代謝宿主細胞または非天然メタン資化性菌内の経路の開発によってこれを行う。例えば、経路の酵素は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＴＥ）、カルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）、およびケトレダクターゼ／アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）を含み得る。１つの好ましい実施形態では、ＣＡＲは、宿主細胞に対して異種であろう。いくつかの実施形態では、組換えＣ１代謝微生物または非天然メタン資化性菌は、アシル−ＡＣＰチオエステラーゼ（ＴＥ）、アルコールデヒドロゲナーゼ／ケトレダクターゼ（ＡＤＨ）、またはその両方を含む酵素組から選択されるポリペプチドをコードする少なくとも１つのさらなる異種核酸分子を含むであろう。いくつかの実施形態では、経路を、Ｃ１代謝細菌の宿主細胞（メタン資化性菌宿主細胞など）中で操作する。
カルボン酸レダクターゼ（ＣＡＲ）は、カルボン酸（脂肪酸など）を対応するアルデヒドに還元する固有のＡＴＰ依存性酵素およびＮＡＤＰＨ依存性酵素である。ＣＡＲは、レダクターゼドメイン；アデニル化ドメイン、およびホスホパンテテイン付着部位を含む多成分酵素である。本明細書中に開示するように、脂肪酸（８〜２４個の炭素原子を含む脂肪酸、特に、１２個の炭素原子（ドデカン酸）から１８個の炭素原子（ステアリン酸）を含む脂肪酸など）を、本開示のカルボン酸レダクターゼまたはそのバリアント（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＪＬＳ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ｓｐ．ＮＲＲＬ５６４６、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓのＣＡＲと少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％配列が同一のものなど）によって還元することができる。
いくつかの実施形態では、バリアントＣＡＲは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＪＬＳ由来のＣＡＲとアラインメントした場合、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＪＬＳ由来のＣＡＲと少なくとも９０％（例えば、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）の配列が同一であり、８２７０位、Ａ２７１位、Ｋ２７４位、Ａ２７５位、Ｐ４６７位、Ｑ５８４位、Ｅ６２６位、および／またはＤ７０１位に対応する位置にアミノ酸置換を含む。一定の実施形態では、バリアントＣＡＲは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＪＬＳ由来のＣＡＲと少なくとも８５％、（例えば、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％）同一のアミノ酸配列ならびにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＪＬＳ由来のＣＡＲ中のＲ２７０Ｗ、Ａ２７１Ｗ、Ｋ２７４（Ｇ／Ｎ／Ｖ／Ｉ／Ｗ／Ｌ／Ｍ／Ｑ／Ｓ）、Ａ２７５Ｆ、Ｐ４６７Ｓ、Ｑ５８４Ｒ、Ｅ６２６Ｇ、Ｄ７０１Ｇ、Ｋ２７４Ｌ／Ａ３６９Ｔ／Ｌ３８０Ｙ、Ｋ２７４ＬＮ３５８Ｈ／Ｅ８４５Ａ、Ｋ２７４Ｍ／Ｔ２８２Ｋ、Ｋ２７４Ｑ／Ｔ２８２Ｙ、Ｋ２７４Ｓ／Ａ７１５Ｔ、Ｋ２７４Ｗ／Ｌ３８０Ｇ／Ａ４７７Ｔ、Ｋ２７４Ｗ／Ｔ２８２Ｅ／Ｌ３８０Ｖ、Ｋ２７４Ｗ／Ｔ２８２Ｑ、Ｋ２７４Ｗ／Ｖ３５８Ｒ、および／またはＲ４３ｃ／Ｋ２７４Ｉに対応するアミノ酸置換を含み得る。一定の実施形態では、バリアントＣＡＲは、バリアントをＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＪＬＳ由来のＣＡＲとアラインメントした場合、Ｋ２７４位に１つのアミノ酸置換および１つまたは複数の（例えば、１、２、または３）さらなるアミノ酸置換を含むであろう。いくつかの実施形態では、バリアントのＣＡＲ活性は、基準配列または親配列のＣＡＲ活性より高いであろう。ＣＡＲ活性を、例えば、当該分野で公知のアッセイによって決定することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２９８６１２号を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、バリアントＣＡＲは、本明細書中に列挙した位置以外の位置にさらなるアミノ酸置換を含むことができる（例えば、１つまたは複数の保存的置換を有するバリアントが含まれる）。一定の実施形態では、ＣＡＲの保存的置換バリアントは、わずかの比率の置換（ＣＡＲポリペプチド配列のアミノ酸の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、または１％未満など）を含むであろう。
本明細書中に述べるように、本開示のカルボン酸レダクターゼの細胞内発現により、脂肪アルデヒドだけでなく対応する脂肪アルコールも産生されるであろう。これは、組換え宿主細胞内のアルコールデヒドロゲナーゼ活性の結果である。いくつかの実施形態では、このプロセスにより、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０、Ｃ２２、またはＣ２４炭素長を含む脂肪アルコールが産生されるであろう。
なおさらなる実施形態では、カルボン酸レダクターゼをコードする組換え核酸分子、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ｔｒａｎｆｅｒａｓｅ）をコードする組換え核酸分子、およびアルコールデヒドロゲナーゼをコードする組換え核酸分子を有するＣ１代謝微生物または非天然メタン資化性菌であって、前記メタン資化性菌がＣ１基質をＣ８〜Ｃ２４脂肪アルコールに変換することができる、Ｃ１代謝微生物または非天然メタン資化性菌を提供する。
別の態様では、本開示は、ω−ヒドロキシ脂肪酸を産生するためのＰ４５０酵素またはモノオキシゲナーゼ（ｍｏｎｏｘｙｇｅｎａｓｅ）酵素をコードする組換え核酸分子をさらに含む任意の上記Ｃ１代謝微生物または非天然メタン資化性菌を提供する。一定の実施形態では、内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、不変の内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性と比較して阻害される。他の実施形態では、内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、ジカルボン酸を産生するための不変の内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性と比較して増加または上昇する。
任意の上記非天然メタン資化性菌では、Ｃ８〜Ｃ１４またはＣ１０〜Ｃ１６またはＣ１２〜Ｃ１４またはＣ１４〜Ｃ１８またはＣ１４〜Ｃ２４脂肪アルコールの１つまたは複数を含む脂肪アルコールを産生する。一定の実施形態では、メタン資化性菌は、Ｃ１０〜Ｃ１８脂肪アルコールを含む脂肪アルコールを産生し、Ｃ１０〜Ｃ１８脂肪アルコールは、総脂肪アルコールの少なくとも７０％を構成する。さらなる実施形態では、メタン資化性菌は、分枝鎖脂肪アルコールを含む脂肪アルコールを産生する。
任意の上記非天然メタン資化性菌では、非天然メタン資化性菌による脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸、またはジカルボン酸の産生量は、約１ｍｇ／Ｌ〜約５００ｇ／Ｌの範囲である。一定の他の実施形態では、記載のＣ１代謝微生物または非天然メタン資化性菌のためのＣ１基質供給原料は、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸またはその塩、一酸化炭素、二酸化炭素、メチルアミン、メチルチオール、メチルハロゲン、天然ガス、または非在来型天然ガスである。一定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物または非天然メタン資化性菌は、天然ガス、非在来型天然ガスまたはシンガス（またはメタンを含むシンガス）をＣ８〜Ｃ１８脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、ヒドロキシ脂肪酸、またはジカルボン酸に変換することができる。
なおさらなる実施形態では、異種脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子、異種チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子、および異種Ｐ４５０またはモノオキシゲナーゼをコードする組換え核酸分子を有するＣ１代謝微生物または非天然メタン資化性菌であって、前記未変性アルコールデヒドロゲナーゼが阻害され、前記Ｃ１代謝微生物またはメタン資化性菌がＣ１基質をＣ８〜Ｃ２４ω−ヒドロキシ脂肪酸に変換することができる、Ｃ１代謝微生物または非天然メタン資化性菌を提供する。
なおさらなる実施形態では、異種脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子および異種チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子を有するＣ１代謝微生物または非天然メタン資化性菌であって、前記メタン資化性菌が、未変性アルコールデヒドロゲナーゼの通常の発現レベルと比較して未変性アルコールデヒドロゲナーゼを過剰発現するか、異種アルコールデヒドロゲナーゼをコードする組換え核酸分子で形質転換されているか、またはその両方であり、Ｃ１代謝微生物またはメタン資化性菌がＣ１基質をＣ８〜Ｃ２４ジカルボン酸アルコールに変換することができる、Ｃ１代謝微生物または非天然メタン資化性菌を提供する。
任意の上記Ｃ１代謝微生物または非天然メタン資化性菌では、宿主メタン資化性菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｂａｔｈ株、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ １６ａ（ＡＴＣＣ ＰＴＡ ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（ＡＴＣＣ ７００７９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ ｔｕｎｄｒａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｄａｌｔｏｎａ ＳＢ２株、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｂｒｙｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａ ａｕｒｅａ ＫＹＧ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、またはその組み合わせであり得る。
任意の上記Ｃ１代謝微生物または非天然メタン資化細菌はまた、組換え核酸分子の導入前後に脂肪酸誘導体産生の性質が改善されたバリアントを産生するために選択条件下で株適応を受けたかもしれない。改善された性質には、成長速度、所望の生成物（例えば、脂肪アルコール）の収量、またはプロセスもしくは培養夾雑物に対する耐性の増大が含まれ得る。特定の実施形態では、高成長バリアントＣ１代謝微生物またはメタン資化性菌は、主要な炭素源およびエネルギー源としてのメタン供給原料において成長することができ、その親細菌、基準細菌、または野生型細菌より速い対数期成長速度（すなわち、より短い倍加時間）を有する宿主細菌を含む（例えば、米国特許第６，６８９，６０１号を参照のこと）。
本開示の各微生物を、単離培養物として成長を補助し得る異種生物と共に成長させることができるか、１つまたは複数のこれらの細菌を組み合わせて混合培養物を生成することができる。なおさらなる実施形態では、本開示のＣ１代謝非光合成微生物は、偏性Ｃ１代謝非光合成微生物である。
Ｃ１代謝微生物−脂肪酸誘導体の産生
別の態様では、本明細書中で使用する場合、非天然Ｃ１代謝非光合成微生物のＣ１基質供給原料との培養および脂肪酸誘導体の回収による脂肪酸誘導体の作製方法であって、ここで、Ｃ１代謝非光合成微生物が脂肪酸変換酵素をコードする組換え核酸分子を含み、Ｃ１代謝非光合成微生物が、Ｃ１基質を、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、またはその組み合わせを含むＣ８〜Ｃ２４脂肪酸誘導体に変換する、作製方法を提供する。
一定の実施形態では、培養されるＣ１代謝非光合成微生物は、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、またはＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａである。さらなる実施形態では、培養されるＣ１代謝非光合成微生物は、細菌（メタン資化性菌またはメチロトローフ菌など）である。
メタン資化性菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．１６ａ（ＡＴＣＣ ＰＴＡ ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、またはその組み合わせであり得る。一定の実施形態では、メタン資化性菌培養物は、１つまたは複数の異種細菌をさらに含む。
メチロトローフ菌は、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｕｌａｎｓ、またはその組み合わせであり得る。
さらなる実施形態では、Ｃ１代謝微生物またはＣ１代謝細菌は、天然ガス、非在来型天然ガス、またはシンガスを代謝することができる。一定の実施形態では、シンガス代謝細菌には、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎ、またはその組み合わせが含まれる。一定の他の実施形態では、代謝非光合成微生物は偏性Ｃ１代謝非光合成微生物である。一定の他の実施形態では、代謝非光合成微生物は通性Ｃ１代謝非光合成微生物である。
任意の上記方法では、培養されたＣ１代謝微生物は、脂肪アルコールを形成することができるアシル−ＣｏＡ依存性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ａｃｒ１、ＦＡＲ、ＣＥＲ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＪＮ３１５７８１．１）、またはＭａｑｕ＿２２２０など）である脂肪酸変換酵素を含む。一定の実施形態では、培養されるＣ１代謝微生物は、脂肪アルデヒドを形成することができるアシル−ＣｏＡ依存性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ（ａｃｒ１など）である脂肪酸変換酵素を含む。いくつかの実施形態では、このプロセスにより、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４、Ｃ１６、Ｃ１８、Ｃ２０、Ｃ２２、またはＣ２４炭素長を含む脂肪アルコールが産生されるであろう。
本方法に含まれる脂肪酸誘導体（例えば、脂肪アルコール）を産生することができる任意の上記組換えＣ１代謝微生物では、Ｃ１代謝微生物は、チオエステラーゼ（リーダー配列、ＵｃＦａｔＢ、またはＢＴＥを欠くｔｅｓＡなど）をコードする組換え核酸分子をさらに含む。一定の実施形態では、内因性チオエステラーゼ活性は、不変の内因性チオエステラーゼ活性と比較して減少するか、最小であるか、消失する。
本方法に含まれる脂肪酸誘導体（例えば、脂肪アルコール）を産生することができる任意の上記組換えＣ１代謝微生物では、Ｃ１代謝微生物は、アシル−ＣｏＡシンセターゼ（ＦａｄＤ、ｙｎｇ１、またはＦＡＡ２など）をコードする組換え核酸分子をさらに含む。一定の実施形態では、内因性アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性は、不変の内因性アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性と比較して減少するか、最小であるか、消失する。
さらなる実施形態では、本方法は、異種アシル−ＣｏＡ依存性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子、異種チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子、および異種アシル−ＣｏＡシンセターゼをコードする組換え核酸分子を有するＣ１代謝微生物であって、前記Ｃ１代謝微生物がＣ１基質をＣ８〜Ｃ２４脂肪アルコールに変換することができる、Ｃ１代謝微生物を提供する。一定の実施形態では、脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼは、未変性の脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼの発現レベルと比較して培養Ｃ１代謝微生物中で過剰発現される。一定の実施形態では、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、またはその両方を形成することができるアシル−ＣｏＡ依存性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼはａｃｒ１であるか、脂肪アルコールを形成することができるアシル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼは、ＦＡＲ、ＣＥＲ４、またはＭａｑｕ＿２２２０である。一定の実施形態では、アシル−ＣｏＡシンセターゼは、ＦａｄＤ、ｙｎｇ１、またはＦＡＡ２である。
なおさらなる実施形態では、本方法は、異種アシル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子および異種チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子を有するＣ１代謝微生物であって、前記メタン資化性菌がＣ１基質をＣ８〜Ｃ２４脂肪アルコールに変換する、Ｃ１代謝微生物を提供する。一定の実施形態では、脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼは、未変性の脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼの発現レベルと比較してＣ１代謝微生物中で過剰発現される。
なおさらなる実施形態では、本方法は、カルボン酸レダクターゼをコードする組換え核酸分子、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼ（ｔｒａｎｆｅｒａｓｅ）をコードする組換え核酸分子、およびアルコールデヒドロゲナーゼをコードする組換え核酸分子を有する培養されたＣ１代謝微生物であって、前記メタン資化性菌がＣ１基質をＣ８〜Ｃ２４脂肪アルコールに変換することができる、培養されたＣ１代謝微生物を提供する。
別の態様では、本開示の方法は、ω−ヒドロキシ脂肪酸を産生するためのＰ４５０酵素またはモノオキシゲナーゼ（ｍｏｎｏｘｙｇｅｎａｓｅ）酵素をコードする組換え核酸分子をさらに含む任意の上記培養Ｃ１代謝微生物を提供する。一定の実施形態では、内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、不変の内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性と比較して阻害される。他の実施形態では、内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性は、ジカルボン酸を産生するための不変の内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性と比較して増加または上昇する。
任意の上記培養Ｃ１代謝微生物では、本方法は、のＣ８〜Ｃ１４またはＣ１０〜Ｃ１６またはＣ１２〜Ｃ１４またはＣ１４〜Ｃ１８またはＣ１４〜Ｃ２４脂肪アルコールの１つまたは複数を含む脂肪アルコールを産生する。一定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、Ｃ１０〜Ｃ１８脂肪アルコールを含む脂肪アルコールを産生し、Ｃ１０〜Ｃ１８脂肪アルコールは、総脂肪アルコールの少なくとも７０％を構成する。さらなる実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、分枝鎖脂肪アルコールを含む脂肪アルコールを産生する。
任意の上記培養Ｃ１代謝微生物では、Ｃ１代謝微生物による脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸、またはジカルボン酸の産生量は、約１ｍｇ／Ｌ〜約５００ｇ／Ｌの範囲である。一定の他の実施形態では、脂肪酸誘導体の作製方法で使用されるＣ１代謝微生物のためのＣ１基質供給原料は、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸またはその塩、一酸化炭素、二酸化炭素、メチルアミン、メチルチオール、メチルハロゲン、天然ガス、または非在来型天然ガスである。一定の実施形態では、Ｃ１代謝微生物は、メタンを含む天然ガス、非在来型天然ガス、またはシンガスをＣ８〜Ｃ１８脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、ヒドロキシ脂肪酸、またはジカルボン酸に変換する。
なおさらなる実施形態では、本方法は、異種脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子、異種チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子、および異種Ｐ４５０またはモノオキシゲナーゼをコードする組換え核酸分子を有するＣ１代謝微生物であって、前記未変性アルコールデヒドロゲナーゼが阻害され、前記Ｃ１代謝微生物がＣ１基質をＣ８〜Ｃ２４ω−ヒドロキシ脂肪酸に変換する、Ｃ１代謝微生物を提供する。
なおさらなる実施形態では、本方法は、異種脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子および異種チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子を有するＣ１代謝微生物であって、Ｃ１代謝微生物が、未変性アルコールデヒドロゲナーゼの通常の発現レベルと比較して未変性アルコールデヒドロゲナーゼを過剰発現するか、異種アルコールデヒドロゲナーゼをコードする組換え核酸分子で形質転換されているか、またはその両方であり、前記Ｃ１代謝微生物が、Ｃ１基質をＣ８〜Ｃ２４ジカルボン酸アルコールに変換することができる、Ｃ１代謝微生物を提供する。
任意の上記方法では、Ｃ１代謝微生物を、制御培養ユニット（発酵槽またはバイオリアクターなど）中で培養することができる。
コドン最適化
組換えタンパク質の発現は、その元の宿主の外部でしばしば困難である。例えば、異なる細菌種間でコドン使用頻度の偏りの変動が認められている（Ｓｈａｒｐら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．３３：１１４１，２００５）。組換えタンパク質の過剰発現は、その未変性の宿主内でさえも困難であり得る。本発明の一定の実施形態では、本明細書中に記載の宿主メタン資化性細菌に導入すべき核酸（例えば、脂肪アルコール形成酵素をコードする核酸）を、タンパク質発現を増強するためにコドン最適化に供することができる。コドン最適化は、ＤＮＡがコードするポリペプチドを変更することなく宿主細菌種の典型的なコドン使用頻度を反映するためのメタン資化性細菌の形質転換のための遺伝子または核酸のコード領域中のコドンの変更をいう。異種宿主中の最適な遺伝子発現のためのコドン最適化法は、以前に記載されている（例えば、Ｗｅｌｃｈら，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ４：ｅ７００２，２００９；Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎら，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：３４６，２００４；Ｗｕら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５：Ｄ７６，２００７；Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓら，ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ７：２８５，２００６；米国特許出願公開第２０１１／０１１１４１３号；同第２００８／０２９２９１８号（その開示全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと）。
形質転換法
本明細書中に記載の任意の組換えＣ１代謝微生物またはメタン資化性細菌を、新規または増強された活性（例えば、酵素活性）を有する宿主細菌を得るために少なくとも１つの外因性核酸を含むように形質転換することができるか、当該分野で公知の種々の方法を使用して内因性遺伝子機能を除去または実質的に低下させるように遺伝子改変することができる。
形質転換は、結果として遺伝的に安定に遺伝される核酸（例えば、外因性核酸）の宿主細胞のゲノムへの導入をいう。形質転換された核酸分子を含む宿主細胞を、「天然に存在しない」細胞、「組換え」細胞、「形質転換された」細胞、または「トランスジェニック」細胞という。
Ｃ１代謝微生物またはメタン資化性細菌内での異種核酸の発現に有用な発現系および発現ベクターは公知である。
Ｃ１代謝細菌のエレクトロポレーションは、Ｔｏｙａｍａら，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６６：１，１９９８；Ｋｉｍ ａｎｄ Ｗｏｏｄ，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４８：１０５，１９９７；Ｙｏｓｈｉｄａら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２３：７８７，２００１、および米国特許出願公開第２００８／００２６００５号に以前に記載されている。
ドナー細胞とレシピエント細胞との直接的接触を含む特定の形質転換型をいう細菌接合は、Ｃ１代謝細菌への核酸の移入のためにより頻繁に使用されている。細菌接合は、相互に密接して接触させた「ドナー」細胞および「レシピエント」細胞の混合を含む。接合は、新規に合成されたドナー核酸分子がレシピエント細胞に一方向性に導入されるドナー細菌とレシピエント細菌との間の細胞質連結の形成によって生じる。接合反応におけるレシピエントは、ドナー細菌からの水平伝播によって核酸を受容することができる任意の細胞である。接合反応におけるドナーは、接合性プラスミド、接合性トランスポゾン、または可動性プラスミドを含む細菌である。ドナープラスミドの物理的移入は、自己伝染性プラスミドによるか、「ヘルパー」プラスミドの補助によって行うことができる。Ｃ１代謝細菌に関する接合は、Ｓｔｏｌｙａｒら，Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌｏｇｉｙａ ６４：６８６，１９９５；Ｍｏｔｏｙａｍａら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．４２：６７，１９９４；Ｌｌｏｙｄら，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７１：３６４，１９９９；およびＯｄｏｍら，国際公開第０２／１８６１７号；Ａｌｉら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２：２９３１，２００６に以前に記載されている。
Ｃ１代謝細菌中での異種核酸の発現は、当該分野で公知である（例えば、米国特許第６，８１８，４２４号；米国特許出願公開第２００３／０００３５２８号を参照のこと）。メチロトローフ性細菌のＭｕトランスポゾンベースの形質転換が記載されている（Ａｋｈｖｅｒｄｙａｎら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９１：８５７，２０１１）。Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ内の宿主遺伝子を挿入不活化しない異種遺伝子の単一コピーまたは多コピーの発現のためのｍｉｎｉ−Ｔｎ７トランスポゾン系が記載されている（米国特許出願公開第２００８／００２６００５号）。
Ｃ１代謝細菌において内因性遺伝子機能を不活化、ノックアウト、または欠失するための種々の方法を使用することができる。低成長Ｃ１代謝細菌中に欠失／挿入変異体を構築するための自殺ベクターを使用した対立遺伝子交換はまた、Ｔｏｙａｍａ ａｎｄ Ｌｉｄｓｔｒｏｍ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４４：１８３，１９９８；Ｓｔｏｌｙａｒら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４５：１２３５，１９９９；Ａｌｉら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２：２９３１，２００６；Ｖａｎ Ｄｉｅｎら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４９：６０１，２００３に記載されている。
外因性核酸の高発現に適切な相同プロモーターまたは異種プロモーターを利用することができる。例えば、米国特許第７，０９８，００５号は、Ｃ１代謝細菌における異種遺伝子発現のためのメタンまたはメタノールの存在下で高度に発現するプロモーターの使用を記載している。使用することができるさらなるプロモーターには、デオキシ−キシルロースリン酸シンターゼメタノールデヒドロゲナーゼオペロンプロモーター（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１６０：１１９，１９９８）；ＰＨＡ合成用プロモーター（Ｆｏｅｌｌｎｅｒら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４０：２８４，１９９３）；またはメチロトローフ菌における未変性プラスミドから同定したプロモーター（欧州特許第２９６４８４号）が含まれる。外来プロモーターには、ｌａｃオペロンＰｌａｃプロモーター（Ｔｏｙａｍａら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３：５９５，１９９７）またはハイブリッドプロモーター（Ｐｔｒｃなど）（Ｂｒｏｓｉｕｓら，Ｇｅｎｅ ２７：１６１，１９８４）が含まれる。一定の実施形態では、プロモーターまたはコドン最適化を、宿主メタン資化性細菌においてグリセロール利用経路酵素をコードする外因性核酸の高構成的発現のために使用する。宿主メタン資化性細菌における外因性核酸の発現制御も利用することができる。特に、グリセロール利用酵素をコードする外因性核酸の発現制御により、天然に存在しないメタン資化性細菌の成長速度を最適化することが望ましいかも知れない。グリセロール利用経路を逆に進行させるためのグリセロールの非存在（例えば、炭素源としてのメタンに対する成長中）により、細菌からグリセロールが分泌され、それにより、成長速度を遅延させることが可能である。グリセロールの存在に応答したグリセロール利用経路酵素をコードする核酸の発現制御により、種々の炭素源条件下での細菌成長を最適にすることができる。例えば、メチロトローフ性細菌およびメタン資化性細菌における組換えタンパク質発現の誘導性／調節性の系を、米国特許出願公開第２０１０／０２２１８１３号に記載のように使用することができる。細菌におけるグリセロール利用遺伝子の制御は十分に確立されている（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ ａｎｄ Ｐｏ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：５２１５，１９９６；Ａｂｒａｍら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７４：５９４，２００８；Ｄａｒｂｏｎら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４３：１０３９，２００２；Ｗｅｉｓｓｅｎｂｏｒｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：６１２２，１９９２）。グリセロール利用経路酵素をコードする外因性核酸分子を所望の発現レベルにするために、グリセロール利用調節エレメントを、宿主メタン資化性細菌に導入するか宿主メタン資化性細菌中で不活化することもできる。
スクリーニング方法は、Ｂｒｏｃｋ，前出に開示されている。対立遺伝子交換変異体の同定のために選択方法は、当該分野で公知である（例えば、米国特許出願公開第２００６／００５７７２６号，Ｓｔｏｌｙａｒら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４５：１２３５，１９９９；およびＡｌｉら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５２：２９３１，２００６を参照のこと）。
培養方法
種々の培養方法を、本明細書中に記載の組換えメタン資化性細菌のために使用することができる。例えば、メタン資化性細菌を、バッチ培養または連続培養法によって成長させることができる。一定の実施形態では、培養物を、制御培養ユニット（発酵槽、バイオリアクター、または中空繊維膜バイオリアクターなど）で成長させる。
古典的なバッチ培養法は、培養開始時に培養液の組成を設定し、培養プロセス中に外部変更に供さない閉鎖系である。したがって、培養プロセス開始時に培養液に所望のＣ１代謝微生物（例えば、メタン資化性菌）を接種し、いかなる物質も系に添加することなく成長または代謝させる。しかし、典型的には、「バッチ」培養は炭素源の添加に関してバッチであり、しばしばｐＨおよび酸素濃度などの因子の制御を試みる。バッチ系では、系の代謝産物およびバイオマス組成物は、培養終了時まで絶えず変化する。バッチ培養物内で、細胞は、静的な遅滞期から高成長の対数増殖期に移行し、最終的に成長速度が低下または停止する静止期に移行する。未処置の場合、静止期の細胞は最終的に死滅するであろう。対数成長期の細胞は、しばしば、いくつかの系において最終生成物または中間体の大量産生を担う。他の系では、静止期または対数期後に産生することができる。
フェドバッチ系は、標準的なバッチ系の異形である。フェッドバッチ培養プロセスは、培養が進行するにつれて漸増量の基質を添加するという修正を加えた典型的なバッチ系を含む。フェッドバッチ系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向がある時および培養物中の基質の量が制限されることが望ましい場合に有用である。フェドバッチ系内の実際の基質濃度を測定することが困難であるので、ｐＨ、溶存酸素、および排ガス（ＣＯ２など）の部分圧などの測定可能な因子の変化に基づいて推定する。バッチ培養法およびフェドバッチ培養法は、当該分野で一般的であり、且つ公知である（例えば、Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ；Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３６：２２７，１９９２を参照のこと）。
連続培養は、特定培養培地をバイオリアクターに連続的に添加し、処理のために同量の馴化培地を同時に除去する場合に「開放」系である。連続培養は、一般的に、細胞が主に対数増殖期にあるように細胞の液相密度を高度に一定に維持する。あるいは、連続培養を、固定化細胞を使用して実施することができ、この培養は、炭素および栄養素を連続的に添加し、価値のある生成物、副生成物、および廃棄物を細胞集団から連続的に取り出す。細胞固定化を、天然材料および／または合成材料から構成される広範な固体支持体を使用して行うことができる。
連続培養または半連続培養により、細胞成長または最終生成物の濃度に影響を及ぼす１つの因子または多数の因子を調整可能である。例えば、１つの方法は、限定された栄養素（炭素源など）または窒素レベルを固定された比率で維持し、他の全てのパラメーターを調整することが可能である。他の系では、成長に影響を及ぼすいくつかの因子を連続的に変化させることができる一方で、培地混濁度によって測定される細胞濃度を一定に保つ。連続培養系は成長条件を定常状態に維持することに務めるので、培養液除去に起因する細胞喪失と培養における細胞成長速度との平衡を保たなければならない。連続培養プロセスのための栄養素および成長因子の調整方法ならびに生成物の形成速度を最大にするための技術は、当該分野で周知であり、種々の方法がＢｒｏｃｋ，前出に詳述されている。
脂肪酸誘導体組成物
背景として、安定同位体測定および物質収支アプローチは、メタンの全体的な供給源および吸収源を評価するために広く使用されている（Ｗｈｉｔｉｃａｒ ａｎｄ Ｆａｂｅｒ，Ｏｒｇ．Ｇｅｏｃｈｅｍ．１０：７５９，１９８６；Ｗｈｉｔｉｃａｒ，Ｏｒｇ．Ｇｅｏｃｈｅｍ．１６：５３１，１９９０を参照のこと）。酸化量を決定するために残存メタンのδ１３Ｃ値を使用するために、メタンの微生物酸化に原因する同位体分留度を知ることが必要である。例えば、好気性メタン資化性菌は、特異的酵素であるメタンモノオキシゲナーゼ（ｍｏｎｏｘｙｇｅｎａｓｅ）（ＭＭＯ）によってメタンを代謝することができる。メタン資化性菌は、メタンをメタノールに変換し、その後にホルムアルデヒドに変換する。ホルムアルデヒドをＣＯ２にさらに酸化して還元等価物（ＮＡＤＨ）の形態で細胞にエネルギーを供給するか、光合成生物における炭素同化経路に直接類似するＲｕＭＰサイクルまたはセリンサイクルのいずれかによってバイオマスに組み込むことができる（Ｈａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｎｓｏｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６０：４３９，１９９６）。
より具体的には、Ｉ型メタン資化性菌は、バイオマス合成のためにＲｕＭＰ経路を使用して専らＣＨ４からバイオマスを生成するのに対して、ＩＩ型メタン資化性菌は５０〜７０％のＣＨ４由来の細胞炭素および３０〜５０％のＣＯ２由来の細胞炭素を同化するセリン経路を使用する（Ｈａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｈａｎｓｏｎ，１９９６）。炭素同位体組成の測定方法は、例えば、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら（Ｇｅｏｃｈｉｍ．Ｃｏｓｍｏｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７０：１７３９，２００６）（その方法全体が本明細書中で参考として援用される）に提供されている。バイオマス由来の油組成物の１３Ｃ／１２Ｃ安定炭素比（「δ」値‰（δ１３Ｃ）として提供する）は、使用されるＣ１基質の供給源および純度に応じて変化し得る（例えば、図７を参照のこと）。
本明細書中に記載のＣ１代謝非光合成微生物および方法を使用して産生した脂肪酸誘導体組成物を、炭素フィンガープリント法によって石油化学製品または光合成微生物もしくは光合成植物から産生した脂肪酸と区別することができる。一定の実施形態では、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、またはその任意の組み合わせのδ１３Ｃ組成は、−３０‰未満、−３１‰未満、−３２‰未満、−３３‰未満、−３４‰未満、−３５‰未満、−３６‰未満、−３７‰未満、−３８‰未満、−３９‰未満、−４０‰未満、−４１‰未満、−４２‰未満、−４３‰未満、−４４‰未満、−４５‰未満、−４６‰未満、−４７‰未満、−４８‰未満、−４９‰未満、−５０‰未満、−５１‰未満、−５２‰未満、−５３‰未満、−５４‰未満、−５５‰未満、−５６‰未満、−５７‰未満、−５８‰未満、−５９‰未満、−６０‰未満、−６１‰未満、−６２‰未満、−６３‰未満、−６４‰未満、−６５‰未満、−６６‰未満、−６７‰未満、−６８‰未満、−６９‰未満、または−７０‰未満である。
いくつかの実施形態では、Ｃ１代謝微生物バイオマスは本明細書中に記載の脂肪酸誘導体組成物を含み、ここで、脂肪酸誘導体含有バイオマスまたは脂肪酸誘導体組成物のδ１３Ｃは、約−３５‰〜約−５０‰、−４５‰〜約−３５‰、または約−５０‰〜約−４０‰、または約−４５‰〜約−６５‰、または約−６０‰〜約−７０‰、または約−３０‰〜約−７０‰である。一定の実施形態では、脂肪酸誘導体組成物は、少なくとも５０％の脂肪酸を含むか、少なくとも５０％脂肪酸誘導体を含む。さらなる実施形態では、脂肪酸誘導体組成物は、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、またはその任意の組み合わせを含む。なおさらなる実施形態では、脂肪酸誘導体組成物は、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪アルコール、Ｃ８〜Ｃ２４分枝鎖脂肪アルコール、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪アルデヒド、Ｃ８〜Ｃ２４ω−ヒドロキシ脂肪酸、またはＣ８〜Ｃ２４ジカルボン酸アルコールを含む。なおさらなる実施形態では、脂肪酸誘導体組成物は、脂肪酸の大部分（５０％ｗ／ｗ超）がＣ８〜Ｃ１４、Ｃ１０〜Ｃ１６、またはＣ１４〜Ｃ２４の範囲の炭素鎖長を有する脂肪酸、脂肪酸誘導体の大部分がＣ１８未満の炭素鎖長を有する脂肪酸誘導体、または総脂肪アルコールの少なくとも７０％がＣ１０〜Ｃ１８脂肪アルコールを含む脂肪アルコール含有組成物を含む。
さらなる実施形態では、Ｃ１代謝非光合成微生物の脂肪酸誘導体含有バイオマスまたは脂肪酸誘導体組成物のδ１３Ｃは、約−３０‰未満であるか、約−４０‰〜約−６０‰の範囲である。一定の実施形態では、脂肪酸誘導体含有バイオマスは使用済み培地と共に組換えＣ１代謝非光合成微生物を含むか、脂肪酸誘導体含有バイオマスは組換えＣ１代謝非光合成微生物の培養物由来の使用済み培地上清組成物を含み、ここで、脂肪酸誘導体含有バイオマスまたはこれから得られた脂肪酸誘導体組成物のδ１３Ｃは約−３０‰未満である。一定の他の実施形態では、脂肪酸誘導体組成物を脂肪酸誘導体含有バイオマスから単離、抽出、または濃縮し、このバイオマスは、培養物由来の使用済み培地（すなわち、組換えＣ１代謝非光合成微生物の培養物由来の使用済み培養液上清組成物）と共に組換えＣ１代謝非光合成微生物を含み得る。
一定の実施形態では、組換えＣ１代謝非光合成微生物の脂肪酸誘導体含有バイオマスまたは脂肪酸誘導体組成物は、脂肪酸変換酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。さらなる実施形態では、かかる異種ポリヌクレオチドは、脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼ、カルボン酸レダクターゼ、チオエステラーゼ、アシル−ＣｏＡシンセターゼ、Ｐ４５０、モノオキシゲナーゼ（ｍｏｎｏｘｙｇｅｎａｓｅ）、またはその任意の組み合わせをコードする。さらなる実施形態では、組換えＣ１代謝非光合成微生物の脂肪酸誘導体含有バイオマスまたは脂肪酸誘導体組成物は、Ｃ１代謝非光合成微生物中の効率的発現のためにコドン最適化された本明細書中に記載の異種核酸配列を含む。
本開示の組換えＣ１代謝非光合成微生物の脂肪酸誘導体含有バイオマスまたは脂肪酸誘導体組成物の生成で用いる例示的な生物には、細菌または酵母が含まれる。一定の実施形態では、脂肪酸誘導体含有バイオマスまたは脂肪酸誘導体組成物は、メタン資化性菌またはメチロトローフ菌（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．１６ａ（ＡＴＣＣ ＰＴＡ ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｙ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｂａｔｈ（ＮＣＩＭＢ １１１３２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｕｌａｎｓ、またはその任意の組み合わせなど）由来のＣ１代謝細菌に由来する。
さらなる実施形態では、脂肪酸誘導体含有バイオマスまたは脂肪酸誘導体組成物は、シンガス代謝細菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎ、またはその組み合わせなど）である本開示の組換えＣ１代謝細菌由来のＣ１代謝細菌に由来する。
実施例１
Ｃ１代謝微生物からの脂質抽出
収集した細菌バイオマス内に含まれる脂肪酸油組成物を、２０℃（すなわち、室温）で１体積のメタノールを含む２体積のクロロホルムから構成される抽出溶液（ＣＭ溶液）中にて実施したＦｏｌｃｈ抽出プロトコール（Ｆｏｌｃｈら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２６：４９７，１９５７）の修正バージョンを使用して抽出した。約５ｇの細胞湿重量（ＷＣＷ）のいずれかの新鮮な細菌バイオマス（または−８０℃で保存し、その後に解凍した細菌バイオマス）を抽出のために使用した。１００ｍＬのＣＭ溶液を細胞材料に添加し、混合物を分液漏斗中で強く抽出した。少なくとも１０分後、３相に分離された。抽出脂質を含む有機相が分液漏斗の底部に沈殿し、これを清潔なガラスボトルに排出させた。中間層は主に溶解した細胞材料を含み、塩および他の可溶性細胞成分を含む軽質の水相から分離することができた。
任意選択的に、水相中の固体を、遠心機または他の機械的濃縮装置を使用して濃縮することができる。固体から除去した水を再利用することができる一方で、いくらか水が残存する固体を固体処理ユニットに供給することができる。
脂質抽出効率を向上させるために、残存溶解細胞集団および残留水を含む分液漏斗にさらなる１００ｍＬの新鮮なＣＭ溶液を直接添加することによって第２の抽出工程を行った。混合物を再度完全に混合し、相を分離させ、２種の抽出物由来の底部の有機相をプールした。次いで、プールした有機相を、分液漏斗中で１００ｍＬ脱イオン水を使用して洗浄して任意の残存する水溶性材料を除去した。分離された有機画分を分液漏斗の底部から再度単離し、酸素の非存在下が好ましい加熱回転蒸発によるか窒素流下での５５℃の蒸発によって溶媒を除去した。
Figure 2015534831
Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ＯＢ３ｂ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｂａｔｈ、およびＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．１６ａの収集培養物から抽出した固化脂肪酸組成物をそれぞれ秤量し、元の乾燥細胞重量（ＤＣＷ）の重量画分として表１に示す。これらのデータは、これらのＣ１代謝微生物由来のＤＣＷの有意な画分が脂質から構成されることを示す。
Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．１６ａバイオマス由来の脂肪酸組成物も、Ｈａｒａ ａｎｄ Ｒａｄｉｎのヘキサン：イソプロパノール（ＨＩＰ）抽出法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９０：４２０，１９７８）を使用して抽出した。ＨＩＰ法を使用して抽出した脂肪酸組成物の分析は、脂肪酸組成物が修正Ｆｏｌｃｈ法を使用して抽出した脂肪酸組成物と本質的に同一である（データ示さず）ことを示していた。
実施例２
Ｃ１代謝微生物由来の脂質の脂肪酸メチルエステル変換
乾燥固体の形態のＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｂａｔｈ、Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ＯＢ３ｂ、およびＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．１６ａ培養バイオマスから抽出した脂質画分を、単一工程で個別に水酸化カリウム（ＫＯＨ）を使用して加水分解し、メタノールとの反応によって脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）に変換した。１０ｍＬガラスボトル中の約５ｇの抽出固体脂質を、５ｍＬのトルエン：メタノール（１：１ ｖ／ｖ）の０．２Ｍ ＫＯＨ溶液を使用して溶解した。ボトルを強く振盪し、次いで、２５０ｒｐｍにて４２℃で６０分間混合後、溶液を周囲温度に冷却し、分液漏斗に移した。およそ５ｍＬの蒸留水および５ｍＬのＣＭ溶液を分液漏斗に添加し、混合し、次いで、相を重力または５分間の遠心分離（３，０００ｒｐｍ、２５℃）によって分離させた。溶解したグリセロールリン酸エステルを含む上部の水層を除去し、重い油相（底部）を回収し、回転蒸発または一定の窒素流によって濃縮乾固した。
各メタン資化性菌培養物由来の脂質中に見出されたＦＦＡおよびＦＡＭＥを、ガスクロマトグラフ／質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）を使用して分析した。加水分解／エステル交換工程の前後に回収した固体を、ＧＣ／ＭＳ分析の内部標準としてウンデカン酸を含む３００μＬ酢酸ブチルに溶解した。得られた溶液を、１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して不溶性残渣を除去した。同体積のＮ，Ｏ−ビス（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドを遠心分離工程由来の上清に添加し、短時間ボルテックスした。サンプルを、質量分析計検出器（ＨＰ ５７９２）を備えたＧＣにロードし、Ａｇｉｌｅｎｔ ＨＰ−５ＭＳ ＧＣ／ＭＳカラム（３０．０ｍ×２５０μｍ×０．２５μｍ膜厚）を使用してＦＦＡおよびＦＡＭＥを分離した。ＦＦＡおよびＦＡＭＥの同一性を、その標準の保持時間および質量スペクトルの電子イオン化を使用して確認した。ＧＣ／ＭＳ法は、キャリアガスとして流速１．２ｍＬ／分のヘリウムを利用した。注入ポートを２０：１のスプリット比で２５０℃に保持した。オーブン温度を６０℃に１分間保持し、その後に３００℃まで８℃増加／分を含む温度勾配で上昇させた。ＦＦＡおよびＦＡＭＥのそれぞれの面積比を、質量検出器の応答由来の総イオンに基づいて計算した。
加水分解／エステル交換の前後に回収された固体残渣を、ＧＣ／ＭＳによってＦＦＡおよびＦＡＭＥについて分析した（表２を参照のこと）。
Figure 2015534831
表２から明らかなように，加水分解／エステル交換前の抽出脂質組成物は、遊離脂肪酸およびさらなる脂肪酸が豊富であるが、ＦＦＡは加水分解／エステル交換後に種々の長さの脂肪酸メチルエステルに変換される。これらのデータは、本開示のＣ１代謝微生物由来の油組成物を精製し、これを使用して価値の高い分子を作製することができることを示す。
実施例３
Ｃ１代謝微生物由来の脂質中の安定炭素同位体分布
Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍのバイオマスおよび脂質画分の乾燥サンプルを、ＩｓｏＰｒｉｍｅ１００ ＩＲＭＳ（Ｉｓｏｐｒｉｍｅ，Ｃｈｅａｄｌｅ，ＵＫ）を取り付けたＣＨＮＯＳ元素分析器（ｖａｒｉｏ ＩＳＯＴＯＰＥ ｃｕｂｅ，Ｅｌｅｍｅｎｔａｒ，Ｈａｎａｕ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した元素分析器／連続フロー型同位体比質量分析によって、炭素および窒素含有量（％乾燥重量）、ならびに炭素（１３Ｃ）および窒素（１５Ｎ）安定同位体比について分析した。発酵槽または血清瓶で培養したメタン資化性バイオマスのサンプルを遠心分離し、脱イオン水に再懸濁し、０．２〜２ｍｇの炭素（約０．５〜５ｍｇ乾燥細胞重量）に対応する体積を５×９ｍｍスズカプセル（Ｃｏｓｔｅｃｈ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に移し、８０℃で２４時間乾燥させた。同様に、事前に抽出した脂質画分をクロロホルムに懸濁し、０．１〜１．５ｍｇの炭素を含む体積をスズカプセルに移し、８０℃で２４時間蒸発乾固させた。０．１ｍｇの炭素を含む標準によって信頼性の有るδ１３Ｃ値を得た。
同位体比を「δ」表記（‰）で示し、これは、千分率（ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ）偏差に基づいた標準の同位体組成に対する材料の同位体組成がδ１３Ｃ（またはδ１５Ｎ）＝（Ｒサンプル／Ｒ標準−１）×１，０００（式中、Ｒは重い同位体の軽い同位体に対する分子比である）で与えられる。炭素標準はウィーンピーディーベレムナイト（Ｖ−ＰＤＢ）であり、窒素については大気である。ＮＩＳＴ（国立標準技術研究所）は、ＳＲＭ（標準物質）番号１５４７（モモの葉）を較正標準として使用することを推奨していた。全同位体分析を、カリフォルニア大学バークレー校の安定同位体生物地質化学センターで行った。Ｃ同位体およびＮ同位体分析の長期外部精度は、それぞれ０．１０‰および０．１５‰である。
Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＯＢ３ｂを３つの異なる発酵バッチ内でメタンに対して成長させ、Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｂａｔｈを２つの異なる発酵バッチ内でメタンに対して成長させ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．１６ａを単一の発酵バッチ内でメタンに対して成長させた。これらの各培養物由来のバイオマスを、安定炭素同位体分布（δ１３Ｃ値；表３を参照のこと）について分析した。
Figure 2015534831
Figure 2015534831
さらに、安定炭素同位体分析を、バイオリアクター中でメタンに対して成長させたＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ＯＢ３ｂ株（Ｍｔ ＯＢ３ｂ）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｂａｔｈ株（Ｍｃ Ｂａｔｈ）、およびＭｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．１６ａ株（Ｍｍｓ １６ａ）由来のバイオマスおよび対応する脂質画分（表４を参照のこと）について行った。
Figure 2015534831
Ｍｔ ＯＢ３ｂ株、Ｍｃ Ｂａｔｈ株、およびＭｍｓ １６ａ株由来のバイオマスを、それぞれ９４時間（３．１４ｇのＤＣＷ／Ｌ）、２６時間（２．２ｇのＤＣＷ／Ｌ）、および３９時間（１．１４ｇのＤＣＷ／Ｌ）で収集した。表４中の脂質についてのδ１３Ｃ値は、２連の測定値の平均を示す。
実施例４
脂質における安定炭素同位体分布に及ぼすメタン供給源および純度の影響
天然ガス成分を含むメタンに対するメタン資化性菌成長を試験するために、１００ｍＬ特定培地ＭＭＳ１．０を含む一連の０．５リットル血清瓶に、メタンおよび空気の１：１（ｖ／ｖ）混合物を供給した同一培地中で成長させた血清瓶バッチ培養（５％ｖ／ｖ）由来のＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ＯＢ３ｂまたはＭｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｂａｔｈを播種した。ＭＭＳ１．０培地の組成は以下であった：０．８ｍＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３０ｍＭのＮａＮＯ３、０．１４ｍＭのＣａＣｌ２、１．２ｍＭのＮａＨＣＯ３、２．３５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、３．４ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、２０．７μＭのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、６μＭのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１０μＭのＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡ、および１ｍＬ／リットルの微量元素溶液（Ｌあたり以下を含む：５００ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４００ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２０ｍｇのＭｎＣｌ２・７Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０ｍｇのＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１５ｍｇのＨ３ＢＯ３、２５０ｍｇのＥＤＴＡ）。培地をオートクレーブし、冷却した後に、リン酸塩、重炭酸塩、およびＦｅＩＩＩ−Ｎａ−ＥＤＴＡを添加した。培地の最終ｐＨは７．０±０．１であった。
播種したボトルをゴムスリーブストッパーで密封し、滅菌０．４５μｍフィルターおよび滅菌２７Ｇ針によってシリンジを介して６０ｍＬメタンガスを注入した。二連の培養物に６０ｍＬの（Ａ）純度９９％のメタン（グレード２．０，Ｐｒａｘａｉｒ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｌｌｉａｎｃｅ Ｇａｓ，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ）、（Ｂ）天然ガス標準を示す純度７０％のメタン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ；９％エタン、６％プロパン、３％メチルプロパン、３％ブタン、および他の微量炭化水素成分も含む）、（Ｃ）メタン供給源ＡおよびＢの１：１混合物として送達させた純度８５％のメタン；および（Ｄ）９３％超のメタン（グレード１．３，Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ；インハウス分析ではメタン組成９９％超を示した）をそれぞれ注入した。培養物を、２５０ｒｐｍでの回転振盪を使用して３０℃（Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＯＢ３ｂ）または４２℃（Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｂａｔｈ）でインキュベートし、１ｍＬのサンプルを取り出すことによっておよそ１２時間間隔で成長を測定してＯＤ６００を決定した。この時ボトルを通気し、上部空間を６０ｍＬの各メタン供給源（Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤ）および６０ｍＬの濃縮酸素（少なくとも純度８５％）と置換した。約２４時間間隔で、５ｍＬのサンプルを取り出し、遠心分離（８，０００ｒｐｍ、１０分間）によって細胞を回収し、次いで、分析するまで−８０℃で保存した。
Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｔｒａｉｎ ＯＢ３ｂおよびＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｂａｔｈ由来のメタン資化性バイオマスについての炭素含有量および窒素含有量（％乾燥重量）ならびに炭素（１３Ｃ）および窒素（１５Ｎ）安定同位体比の分析を実施例３に記載のように行った。表５は、異なるレベルの純度を有するメタンに対してボトル培養の種々のバッチで成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｂａｔｈ由来のバイオマスサンプルについての安定炭素同位体分析の結果を示す。
Figure 2015534831
１つのメタン供給源（Ａ、９９％）に対して成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｂａｔｈの平均δ１３Ｃは−４１．２±１．２であった一方で、異なるメタン供給源（Ｂ、７０％）に対して成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｂａｔｈの平均δ１３Ｃは−４４．２±１．２であった。メタン供給源ＡおよびＢを混合した場合、中間のδ１３Ｃ平均−４３．８±２．４が認められた。これらのデータは、メタン供給源ＡおよびＢに対して成長させた細胞材料のδ１３Ｃが投入メタンのδ１３Ｃの相違に起因して相互に有意に異なることを示す。しかし、２つのガスの混合物に対して成長させた細胞は１２Ｃを優先的に利用し、したがって、より負のδ１３Ｃ値となる傾向を示す。
異なるメタン供給源およびボトル培養の種々のバッチにおいて成長させた２つの異なるメタン資化性菌（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ ＢａｔｈおよびＭｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ＯＢ３ｂ）がδ１３Ｃ分布の相違を示すかどうかを試験するために、類似の実験を行った（表６を参照のこと）。
Figure 2015534831
第１のメタン供給源（Ａ）に対して成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの平均δ１３Ｃは−４４．５±８．８であった一方で、同一メタン供給源に対して成長させたＭ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍの平均δ１３Ｃは−４７．８±２．０であった。第２のメタン供給源（Ｂ）に対して成長させたＭ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓの平均δ１３Ｃが−３７．９±０．４であった一方で、Ｍ．ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍの平均δ１３Ｃは−３９．８±４．５であった。これらのデータは、メタン供給源に対して成長させた細胞材料のδ１３Ｃが同一のメタン供給源に対して成長させた異なる株由来の細胞材料のδ１３Ｃと高度に類似することを示す。したがって、細胞材料のδ１３Ｃの実測値は、研究された特定の細菌株の性質よりもむしろ投入ガスの組成に主に依存するようである。
上記の種々の実施形態を組み合わせてさらなる実施形態を得ることができる。本明細書中で言及されており、そして／または出願データシートに列挙されている米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物（２０１２年１１月９日提出の米国仮特許出願第６１／７２４，７３３号が含まれる）の全ては、その全体が本明細書中で参考として援用される。必要に応じて種々の特許、出願、および刊行物の概念を使用するために実施形態の態様を修正して、なおさらなる実施形態を得ることができる。
上記の詳細な説明を考慮して実施形態のこれらおよび他の変更形態を得ることができる。一般に、以下の特許請求の範囲では、使用した用語は、明細書中に開示した特定の実施形態に特許請求の範囲を制限すると解釈すべきでないが、特許請求の範囲は、かかる特許請求の範囲が権利を付与される均等物の全範囲と共に全ての可能な実施形態を含むと解釈すべきである。したがって、特許請求の範囲は、開示に制限されない。

Claims (76)

  1. 脂肪酸誘導体の作製方法であって、非天然Ｃ１代謝非光合成微生物をＣ１基質供給原料と共に培養し、該脂肪酸誘導体を回収する工程を含み、
    該Ｃ１代謝非光合成微生物が脂肪酸変換酵素をコードする組換え核酸分子を含み、
    該Ｃ１代謝非光合成微生物が該Ｃ１基質を脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、またはその組み合わせを含むＣ８〜Ｃ２４脂肪酸誘導体に変換する、方法。
  2. 前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｈｙｐｈｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ、Ｎｏｃａｒｄｉａ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｙａｒｒｏｗｉａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、およびＲｈｏｄｏｔｏｒｕｌａからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  4. 前記Ｃ１代謝非光合成微生物が細菌である、請求項１に記載の方法。
  5. 前記Ｃ１代謝細菌がメタン資化性菌またはメチロトローフ菌である、請求項４に記載の方法。
  6. 前記Ｃ１代謝細菌がメタン資化性菌である、請求項４に記載の方法。
  7. 前記メタン資化性菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈａｎｏｍｏｎａｓ、またはその組み合わせである、請求項６に記載の方法。
  8. 前記メタン資化性菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．１６ａ（ＡＴＣＣ ＰＴＡ ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、またはその組み合わせである、請求項６に記載の方法。
  9. 前記メタン資化性菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ＯＢ３ｂ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｂａｔｈ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ．１６ａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、またはその高成長バリアントである、請求項６に記載の方法。
  10. 前記培養物が異種細菌をさらに含む、請求項６〜９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記Ｃ１代謝細菌がメチロトローフ菌である、請求項４に記載の方法。
  12. 前記メチロトローフ菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｘｔｏｒｑｕｅｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｐｕｌｉ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｉｃｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｏｄｕｌａｎｓ、またはその組み合わせである、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記Ｃ１代謝細菌が、天然ガス細菌、非在来型天然ガス細菌、またはシンガス代謝細菌である、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記シンガス代謝細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、ｃａｒｂｏｘｙｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｅｔｅｒｉｕｍ、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、またはその組み合わせである、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記シンガス代謝細菌が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｒａｇｓｄａｌｅｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃａｒｂｏｘｙｄｉｖｏｒａｎｓ、Ｂｕｔｙｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｗｏｏｄｉｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｅｏｐｒｏｐａｎｏｌｏｇｅｎ、またはその組み合わせである、請求項１３に記載の方法。
  16. 前記Ｃ１代謝非光合成微生物が偏性Ｃ１代謝非光合成微生物である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記脂肪酸変換酵素が、脂肪アルコールを形成することができる脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 脂肪アルコールを形成することができる前記脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼが、ＦＡＲ、ＣＥＲ４、またはＭａｑｕ＿２２２０である、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記脂肪酸変換酵素が、脂肪アルデヒドを形成することができる脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  20. 脂肪アルデヒドを形成することができる前記脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼがａｃｒ１である、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記脂肪酸変換酵素がカルボン酸レダクターゼである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  22. チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記チオエステラーゼが、シグナルペプチド、ＵｃＦａｔＢ、またはＢＴＥを欠くｔｅｓＡである、請求項２２に記載の方法。
  24. 内因性チオエステラーゼ活性が、不変の内因性チオエステラーゼ活性と比較して減少するか、最小であるか、消失する、請求項２２または請求項２３に記載の方法。
  25. アシル−ＣｏＡシンセターゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記アシル−ＣｏＡシンセターゼが、ＦａｄＤ、ｙｎｇ１、またはＦＡＡ２である、請求項２５に記載の方法。
  27. 内因性アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性が、不変の内因性アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性と比較して減少するか、最小であるか、消失する、請求項２５または２６に記載の方法。
  28. ω−ヒドロキシ脂肪酸を産生するためのＰ４５０酵素またはモノオキシゲナーゼ酵素をコードする組換え核酸分子をさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  29. 内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性が、不変の内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性と比較して減少するか、最小であるか、消失する、請求項２８に記載の方法。
  30. 内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性が、ジカルボン酸を産生するための不変の内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性と比較して増加または上昇している、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、Ｃ８〜Ｃ１４、またはＣ１０〜Ｃ１６、またはＣ１４〜Ｃ２４脂肪アルコールの１つまたは複数を含む脂肪アルコールを産生する、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、Ｃ８〜Ｃ１４、またはＣ１２〜Ｃ１４、またはＣ１４〜Ｃ１８脂肪アルコールを含む脂肪アルコールを産生する、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  33. 前記Ｃ１代謝非光合成微生物がＣ１０〜Ｃ１８脂肪アルコールを含む脂肪アルコールを産生し、該Ｃ１０〜Ｃ１８脂肪アルコールが総脂肪アルコールの少なくとも７０％を構成する、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
  34. 前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、メタンを含む天然ガス、非在来型天然ガス、またはシンガスをＣ８〜Ｃ１４脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、またはその組み合わせに変換することができる、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  35. 前記Ｃ１代謝非光合成微生物が、分枝鎖脂肪アルコールを含む脂肪アルコールを産生する、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  36. 脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、またはその任意の組み合わせの産生量が、約１ｍｇ／Ｌ〜約５００ｇ／Ｌの範囲である、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  37. 前記Ｃ１基質が、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸またはその塩、一酸化炭素、二酸化炭素、メチルアミン、メチルチオール、あるいはメチルハロゲンである、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  38. 前記Ｃ１基質が、メタン、天然ガス、非在来型天然ガス、またはシンガスである、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記Ｃ１代謝非光合成微生物がメタン資化細菌であり、前記Ｃ１基質がメタンであり、前記細菌を好気性条件下で培養する、請求項１に記載の方法。
  40. 制御培養ユニット中でＣ１代謝非光合成微生物を培養する工程をさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の方法。
  41. 前記Ｃ１基質が、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸またはその塩、一酸化炭素、二酸化炭素、天然ガス、非在来型天然ガス、シンガス、メチルアミン、メチルチオール、またはメチルハロゲンである、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記制御培養ユニットが発酵槽またはバイオリアクターである、請求項４０に記載の方法。
  43. 脂肪酸変換酵素をコードする組換え核酸分子を含む非天然メタン資化性菌であって、該メタン資化性菌が、Ｃ１基質をＣ８〜Ｃ２４脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪エステルワックス、ヒドロキシ脂肪酸、ジカルボン酸、またはその組み合わせに変換することができる、非天然メタン資化性菌。
  44. 前記脂肪酸変換酵素が、脂肪アルコールを形成することができる脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼである、請求項４３に記載の非天然メタン資化性菌。
  45. 脂肪アルコールを形成することができる前記脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼが、ＦＡＲ、ＣＥＲ４、またはＭａｑｕ＿２２２０である、請求項４４に記載の非天然メタン資化性菌。
  46. 前記脂肪酸変換酵素が、脂肪アルデヒドを形成することができる脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼである、請求項４３に記載の非天然メタン資化性菌。
  47. 脂肪アルデヒドを形成することができる前記脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼがａｃｒ１である、請求項４６に記載の非天然メタン資化性菌。
  48. 前記脂肪酸変換酵素がカルボン酸レダクターゼである、請求項４３に記載の非天然メタン資化性菌。
  49. チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の非天然メタン資化性菌。
  50. 前記チオエステラーゼが、リーダー配列、ＵｃＦａｔＢ、またはＢＴＥを欠くｔｅｓＡである、請求項４９に記載の非天然メタン資化性菌。
  51. 内因性チオエステラーゼ活性が、不変の内因性チオエステラーゼ活性と比較して減少するか、最小であるか、消失する、請求項４９または５０に記載の非天然メタン資化性菌。
  52. アシル−ＣｏＡシンセターゼをコードする組換え核酸分子をさらに含む、前記請求項のいずれか１項に記載の非天然メタン資化性菌。
  53. 前記アシル−ＣｏＡシンセターゼが、ＦａｄＤ、ｙｎｇ１、またはＦＡＡ２である、請求項５２に記載の非天然メタン資化性菌。
  54. 内因性アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性が、不変の内因性アシル−ＣｏＡシンセターゼ活性と比較して減少するか、最小であるか、消失する、請求項５２または５３に記載の非天然メタン資化性菌。
  55. ω−ヒドロキシ脂肪酸を産生するためのＰ４５０酵素またはモノオキシゲナーゼ）酵素をコードする組換え核酸分子をさらに含む、請求項４３〜５４のいずれか１項に記載の非天然メタン資化性菌。
  56. 内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性が、不変の内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性と比較して阻害される、請求項５５に記載の非天然メタン資化性菌。
  57. 内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性が、ジカルボン酸を産生するための不変の内因性アルコールデヒドロゲナーゼ活性と比較して増加または上昇している、請求項４３〜５４のいずれか１項に記載の非天然メタン資化性菌。
  58. 前記メタン資化性菌が、Ｃ８〜Ｃ１４、またはＣ１０〜Ｃ１６、またはＣ１４〜Ｃ２４脂肪アルコールの１つまたは複数を含む脂肪アルコールを産生する、請求項４３〜５４のいずれか１項に記載の非天然メタン資化性菌。
  59. 前記メタン資化性菌が、Ｃ８〜Ｃ１４、またはＣ１２〜Ｃ１４、またはＣ１４〜Ｃ１８脂肪アルコールを含む脂肪アルコールを産生する、請求項４３〜５４のいずれか１項に記載の非天然メタン資化性菌。
  60. 前記メタン資化性菌がＣ１０〜Ｃ１８脂肪アルコールを含む脂肪アルコールを産生し、Ｃ１０〜Ｃ１８脂肪アルコールが総脂肪アルコールの少なくとも７０％を構成する、請求項４３〜５４のいずれか１項に記載の非天然メタン資化性菌。
  61. 前記メタン資化性菌が、分枝鎖脂肪アルコールを含む脂肪アルコールを産生する、請求項４３〜５４のいずれか１項に記載の非天然メタン資化性菌。
  62. 前記脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸、またはジカルボン酸の産生量が約１ｍｇ／Ｌ〜約５００ｇ／Ｌの範囲である、請求項４３〜６１のいずれか１項に記載の非天然メタン資化性菌。
  63. 前記Ｃ１基質が、メタン、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸またはその塩、一酸化炭素、二酸化炭素、メチルアミン、メチルチオール、あるいはメチルハロゲンである、請求項４３〜６２のいずれか１項に記載の非天然メタン資化性菌。
  64. 前記Ｃ１基質が、メタン、天然ガス、または非在来型天然ガスである、請求項４３〜６２のいずれか１項に記載の非天然メタン資化性菌。
  65. 前記メタン資化性菌が、メタンを含む天然ガス、非在来型天然ガス、またはシンガスをＣ８〜Ｃ１８脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、ヒドロキシ脂肪酸、またはジカルボン酸に変換することができる、請求項６４に記載の非天然メタン資化性菌。
  66. 前記宿主メタン資化性菌が、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ Ｂａｔｈ株、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ １６ａ（ＡＴＣＣ ＰＴＡ ２４０２）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ ＯＢ３ｂ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｓｐｏｒｉｕｍ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９７）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｐａｒｖｕｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９８）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｍｅｔｈａｎｉｃａ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，１９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ａｌｂｕｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，２００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ（ＮＲＲＬ Ｂ−１１，２０１）、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｒｇａｎｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＴＣＣ ２７，８８６）、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ ＡＪ−３６７０（ＦＥＲＭ Ｐ−２４００）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ（ＡＴＣＣ ７００７９９）、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｅｌｌａ ｔｕｎｄｒａｅ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｄａｌｔｏｎａ ＳＢ２株、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｂｒｙｏｐｈｉｌａ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃａｐｓａ ａｕｒｅａ ＫＹＧ、Ｍｅｔｈｙｌａｃｉｄｉｐｈｉｌｕｍ ｉｎｆｅｒｎｏｒｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｉｂｉｕｍ ｐｅｔｒｏｌｅｉｐｈｉｌｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ａｌｃａｌｉｐｈｉｌｕｍ、またはその組み合わせである、請求項４３〜６５のいずれか１項に記載の非天然メタン資化性菌。
  67. 異種アシル−ＣｏＡ依存性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子、異種チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子、および異種アシル−ＣｏＡシンセターゼをコードする組換え核酸分子を含む非天然メタン資化性菌であって、
    該メタン資化性菌がＣ１基質をＣ８〜Ｃ２４脂肪アルコールに変換することができる、非天然メタン資化性菌。
  68. 前記脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼが、未変性の脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼの発現レベルと比較して過剰発現される、請求項６７に記載の非天然メタン資化性菌。
  69. 脂肪アルデヒドおよび脂肪アルコールを形成することができる前記アシル−ＣｏＡ依存性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼがａｃｒ１である、請求項６７または６８に記載の非天然メタン資化性菌。
  70. 脂肪アルコールを形成することができる前記アシル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼが、ＦＡＲ、ＣＥＲ４、またはＭａｑｕ＿２２２０である、請求項６７〜６９のいずれか１項に記載の非天然メタン資化性菌。
  71. 前記アシル−ＣｏＡシンセターゼが、ＦａｄＤ、ｙｎｇ１、またはＦＡＡ２である、請求項６７〜７０のいずれか１項に記載の非天然メタン資化性菌。
  72. 異種アシル−ＣｏＡ非依存性脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子および異種チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子を含む非天然メタン資化性菌であって、
    該メタン資化性菌が、Ｃ１基質をＣ８〜Ｃ２４脂肪アルコールに変換することができる、非天然メタン資化性菌。
  73. 前記脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼが、未変性の脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼの発現レベルと比較して過剰発現される、請求項７２に記載の非天然メタン資化性菌。
  74. カルボン酸レダクターゼをコードする組換え核酸分子、ホスホパンテテイニルトランスフェラーゼをコードする組換え核酸分子、およびアルコールデヒドロゲナーゼをコードする組換え核酸分子を含む非天然メタン資化性菌であって、
    該メタン資化性菌が、Ｃ１基質をＣ８〜Ｃ２４脂肪アルコールに変換することができる、非天然メタン資化性菌。
  75. 異種脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子、異種チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子、および異種Ｐ４５０または異種モノオキシゲナーゼをコードする組換え核酸分子を含む非天然メタン資化性菌であって、
    該未変性アルコールデヒドロゲナーゼが阻害されており、
    該メタン資化性菌が、Ｃ１基質をＣ８〜Ｃ２４ω−ヒドロキシ脂肪酸に変換することができる、非天然メタン資化性菌。
  76. 異種脂肪酸アシル−ＣｏＡレダクターゼをコードする組換え核酸分子および異種チオエステラーゼをコードする組換え核酸分子を含む非天然メタン資化性菌であって、
    該メタン資化性菌が、未変性アルコールデヒドロゲナーゼの通常の発現レベルと比較して未変性アルコールデヒドロゲナーゼを過剰発現するか、異種アルコールデヒドロゲナーゼをコードする組換え核酸分子で形質転換されているか、またはその両方であり、
    該メタン資化性菌が、Ｃ１基質をＣ８〜Ｃ２４ジカルボン酸アルコールに変換することができる、非天然メタン資化性菌。
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