CN101490241A - 脂肪酸及其衍生物的制备 - Google Patents

Abstract

本发明提供遗传工程化的微生物以及它们的使用方法，所述微生物产生来自脂肪酸生物合成途径的产物(脂肪酸衍生物)。

Description

脂肪酸及其衍生物的制备

相关申请的交叉引用

本申请要求享有2006年5月19日提交的美国临时申请第60/802,016号，2006年5月19日提交的美国临时申请第60/801,995号，2007年3月28日提交的美国临时申请第60/908,547号和2007年2月13日提交的PCT申请第PCT/US2007/003736号的优先权，这些申请均通过引用并入本文。

技术领域

本发明提供遗传工程化的微生物以及它们的使用方法，所述微生物产生来自脂肪酸生物合成途径的产物(脂肪酸衍生物)。

背景技术

技术的发展伴随着对燃料来源依赖的增加，这类燃料来源正变得日益有限和难以获得。随着化石燃料的燃烧正以空前的速度发生，很有可能不久以后世界上的燃料需求就将超过现在的燃料供给。

因此，现在的发展集中于利用再生能源，诸如日光、水、风和生物质(biomass)。利用生物质产生新的燃料来源(即生物燃料)是一种可供选择的方案，该燃料不是来自于石油。生物燃料(生物柴油)是一种由长链烷烃和酯构成的可生物降解的、清洁燃烧的燃料。在大部分内燃柴油发动机中，生物柴油的使用可以采用纯的形式(被称为“纯”生物柴油)，或者按照任何浓度与常规的石化柴油混合。制备生物柴油的通用方法涉及三酰甘油(主要是植物油)的酯交换，这产生脂肪酸酯和不需要的副产品甘油的混合物，从而提供异质性的产物和造成经济效益低下的废产物。

简述

本文公开的重组微生物能够从脂肪酸生物合成途径合成产物(脂肪酸衍生物)，并且可选的将这种产物释放到发酵肉汤。这种脂肪酸衍生物还可用作生物燃料和专用化学品。这些生物燃料和专用化学品可用于制备其他产物，诸如营养补剂、聚合物、石蜡替代物和个人护理用品。

本文公开的重组微生物可以被工程化产生各种脂肪酸衍生物，包括但不限于，短链醇诸如乙醇、丙醇异丙醇和丁醇，脂肪醇，脂肪酸酯，烃和蜡酯。

在一个实例中，本文提供修饰微生物的方法，使其产生和可选的释放，从可再生碳源产生的脂肪酸衍生物。这种微生物可以被遗传工程化，例如，通过引入外源DNA序列，所述序列编码一种或者多种蛋白，所述蛋白能够代谢可再生碳源以产生脂肪酸衍生物，以及在一些实例中分泌脂肪酸衍生物。因此可以在产生有用脂肪酸衍生物的发酵过程中使用所述修饰的微生物，该过程利用可再生碳源(生物质)作为起始材料。在一些实例中，使用现有的遗传易控制的微生物，这是因为简化对其途径的工程化，所述途径控制生长、产生以及减少或者消除降低生物合成途径效率的副反应。此外，这种修饰的微生物可用于消耗可再生碳源以便产生可以直接用作生物燃料的燃料，不需要专门的储存或者运输方法。在其他实例中，通过表达增加脂肪酸产生的外源核酸序列，天然产烃的微生物被工程化以过量产生烃。

本文提供的微生物产生脂肪酸衍生物，所述衍生物具有确定的碳链长度、分枝和饱和水平。在特定实例中，均质产物的产生减少了与发酵和分离有关的总成本。在一些实例中，提供包括一种或者多种外源核酸序列的微生物，所述序列编码至少一种硫酯酶(EC 3.1.2.14)和至少一种蜡合酶(EC 2.3.1.75)。在其他实例中提供包括一种或者多种外源核酸序列的微生物，所述序列编码至少一种硫酯酶(EC 3.1.2.14)和至少一种醇乙酰基转移酶(2.3.1.84)。仍在其他实例中，提供包括一种或者多种外源核酸序列的微生物，所述序列编码至少一种硫酯酶(EC3.1.2.14)、至少一种酰基辅酶A还原酶(EC 1.2.1.50)和至少一种醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)。还提供表达一种或者多种外源核酸序列的微生物，所述序列编码至少一种硫酯酶(EC 3.1.2.14)和至少一种脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(1.1.1.^*)。可以选择外源核酸序列编码的硫酯酶肽来提供均质产物。

在一些实例中，被工程化产生脂肪酸衍生物的微生物是大肠杆菌(E.coli)，运动发酵单胞菌(Z.mobilis)，浑浊红球菌(Rhodococcusopacus)，真氧产碱杆菌(Ralstonia eutropha)，弗尼斯弧菌(Vibriofurnissii)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，链霉菌(Streptomycetes)，嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophila)，假单胞菌(Pseudomonas)或者藤黄微球菌(Micrococus leuteus)以及它们的亲缘菌。

在其他实例中，按照本文描述通过优化脂肪酸的生物合成途径，内源性产烃的微生物被工程化以过量产生烃。已知产生烃并且利用本文提供的教导可以被工程化过量产生烃的示例性微生物包括节杆菌(Arthrobacter sp.)，芽孢杆菌(Bacillus sp.)，布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)，着色菌(Chromatium sp.)，树脂枝孢霉(Cladosporium resina)(ATCC22711)，巴斯德梭状芽胞杆菌VKM(Clostridium pasteurianumVKM)，破伤风形梭菌(Clostridium tenanomorphum)，尿酸棱菌(Clostridium acidiurici)，棒状杆菌(Corynebacterium species)，蓝藻(cyanobacterial species)(灰色念珠藻(Nostoc muscorum)，组囊藻(Anacystis(Synechococcus)nidulans)，丝状蓝藻(Phormidium luridum)，佛氏绿胶蓝细菌(Chlorogloea fritschii)，红海束毛藻(Trichodesmiumerythaeum)，Oscillatoria williamsii，微鞘藻(Microcoleus chthonoplaseis)，Coccochloris elabens，Agmenellum quadruplicatum，Plectonematerebrans，具鞘微鞘藻(M vaginatus)，和岩生眉藻(C.scopulorum))，脱硫脱硫弧菌(Desulfovibrio desulfuricans)(ATCC29577)，Kineococcusradiotolerans(BAA-149)，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)(FD533，ATCC 272，381，382，ISU，540，4698，7468，27141)，小球菌(Micrococcus sp.)(ATCC 146，398，401，533)，玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(ATCC 412，416，516)，溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)，分支杆菌(Mycobacterium species)，青霉(Penicillium sp.)，曲霉(Aspergillus sp.)，绿色木霉(Trichoderma virida)，出芽短梗霉(Pullularia pullulans)，Jeotgalicoccus sp.(M.candicans)(ATCC 8456)，红假单胞菌球状绿菌(Rhodopseudomonas spheroids Chlorobium sp.)，深红红螺菌(Rhodospirillium rubrum)(ATCC11170)，万尼氏红微菌(Rhodomicrobium vannielii)，嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)(ATCC 13637，17444，17445，17666，17668，17673，17674，17679，17677)，路德类酵母(Saccharomycodes ludwigii)(ATCC 22711)，类酵母(Saccharomyces sp.)(oviformus，ludwiggi，tropicalis)，弗尼斯弧菌M1(Vibrio furnissii M1)，海产弧菌MP-1(Vibrio marinus MP-1)，Vibrio ponticus，海红沙雷氏菌(Serratia marinorubra)，玉米黑粉菌(Ustilago maydis)，麦散黑粉菌(Ustilago nuda)，小麦条黑粉菌(Urocystis agropyri)，高粱丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)和腥黑粉菌(Tilletia sp.)(foetida，caries，controversa)。

除了被工程化表达外源核酸序列(其允许脂肪酸衍生物的产生)外，所述微生物还可以具有被功能性去除或者弱化的一种或多种内源性基因。例如，ackA(EC 2.7.2.1)，ackB(EC 2.7.2.1)，adhE(EC 1.1.1.1，1.2.1.10)，fabF(EC 2.3.1.179)，fabR(登录号NP_418398)，fadE(EC1.3.99.3，1.3.99.-)，GST(EC 6.3.2.3)，gpsA(EC 1.1.1.94)，ldhA(EC1.1.1.28)，pflB(EC 2.3.1.54)，plsB(EC 2.3.1.15)，poxB(EC 1.2.2.2)，pta(EC 2.3.1.8)，谷胱甘肽合酶(EC 6.3.2.3)及其组合可以被弱化。

除了被工程化表达外源核酸序列(其允许脂肪酸衍生物的产生)外，所述微生物还可以具有一种或多种过表达的其他基因。例如，pdh，panK，aceEF(编码丙酮酸盐和2-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1p脱氢酶组分和E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶组分，登录号：NP_414656，NP_414657，EC：1.2.4.1. 2.3.1.61，2.3.1.12)，accABCD/fabH/fabD/fabG/acpP/fabF(编码FAS，登录号：CAD85557，CAD85558，NP_842277，NP_841683，NP_415613，EC：2.3.1.180，2.3.1.39，1.1.1.100，1.6.5.3，2.3.1.179)，编码脂乙酰辅酶A还原酶的基因(登录号：AAC45217，EC 1.2.1.-)，UdhA或者类似基因(编码嘧啶核苷酸转氢酶，登录号：CAA46822，EC：1.6.1.1)和编码脂乙酰辅酶A还原酶的基因(登录号：AAC45217，EC 1.2.1.-)。

在一些实例中，本文描述的微生物每升发酵肉汤产生至少1mg脂肪酸衍生物。在其他实例中，所述微生物每升发酵肉汤产生至少100mg/L，500mg/L，1g/L，5g/L，10g/L，20g/L，25g/L，30g/L，35g/L，40g/L，50g/L，100g/L或者120g/L脂肪酸衍生物。在一些实例中，从所述微生物产生并释放脂肪酸衍生物，而在其他实例中，在分离产物前裂解所述微生物。

在一些实例中，所述脂肪酸衍生物包括至少长8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32或者34碳的碳链。在一些实例中，至少50％，60％，70％，80％，85％，90％或者95％的产生的脂肪酸衍生产物包含长8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32或者34碳的碳链。在其他实例中，至少60％，70％，80％，85％，90％或者95％的脂肪酸衍生产物包含1，2，3，4或者5的不饱和点。

本发明还提供产生脂肪酸衍生物的方法。这些方法包括培养本文描述的微生物以及从发酵肉汤分离产物。

这些以及其他实例在下面的详细说明中被进一步描述。

附图简述

图1显示FAS生物合成途径。

图2显示产生蜡的生物合成途径。可以在宿主细胞中利用宿主细胞内产生的醇产生蜡，或者可以向培养基中添加外源醇来产生蜡。被设计产生蜡的微生物将利用外源核酸序列以及硫酯酶(EC 3.1.2.14)序列产生蜡合酶(EC 2.3.1.75)。其他可以被调控增加蜡生成的酶包括参与脂肪酸合成的酶(FAS酶EC 2.3.1.85)，酰基辅酶A合酶(EC 2.3.1.86)，脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(EC 1.1.1.^*)，酰基辅酶A还原酶(1.2.1.50)和醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)。

图3显示产生脂肪醇的生物合成途径。通过表达编码硫酯酶(EC3.1.2.14)的以及酰基辅酶A还原酶(EC 1.2.1.50)、醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)和脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(FAR，EC 1.1.1^*)的组合的外源核酸序列可以产生具有确定碳链长度的脂肪醇。其他能够被调控增加脂肪醇生成的酶包括参与脂肪酸合成的酶(FAS酶EC 2.3.1.85)和酰基辅酶A合酶(EC 2.3.1.86)。

图4显示产生脂肪酸酯的生物合成途径。通过外源表达各种硫酯酶(EC 3.1.2.14)，以及酰基辅酶A还原酶(1.2.1.50)、醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)和脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(FAR，EC 1.1.1^*)的组合，和乙酰转移酶(EC 2.3.1.84)，可以产生具有确定碳链长度的脂肪酸酯。其他能够被调控增加脂肪酸酯生成的酶包括参与脂肪酸合成的酶(FAS酶EC2.3.1.85)和酰基辅酶A合酶(EC 2.3.1.86)。

图5显示按照实施例4的描述，用pCDFDuet-1-fadD-acr1和包含各种硫酯酶基因的质粒共转化菌株的脂肪醇生成。在25℃的摇瓶中，所述菌株在包含0.4％葡萄糖的M9矿物培养基中好氧生长。鉴定出饱和的C10、C12、C14、C16和C18脂肪醇。在一些样品中还检测出少量的C16:1和C18:1脂肪醇。利用乙酸乙酯从细胞沉淀提取脂肪醇，并利用N-三甲基硅烷基(TMS)咪唑将其衍生化以增强检测。

图6显示从制备菌株释放脂肪醇。当细胞在37℃生长时，大约50％的生成的脂肪醇从细胞释放。

图7A-图7D显示表达醇乙酰转移酶(AATs，EC 2.3.1.84)的制备宿主和表达蜡合酶(EC 2.3.1.75)的制备宿主产生的辛酸辛酯(C8C8)的GS-MS谱。图7A显示菌株C41(DE3，ΔfadE/pHZ1.43)/pRSETB+pAS004.114B)的乙酰乙酸酯提取，其中pHZ1.43质粒表达ADP1(蜡合酶)。图7B显示菌株C41(DE3，ΔfadE/pHZ1.43)/pRSETB+pAS004.114B)的乙酰乙酸酯提取，其中pHZ1.43质粒表达SAAT。图7C显示菌株C41(DE3，ΔfadE/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B)的乙酰乙酸酯提取，其中pHZ1.43质粒不包含ADP1(蜡合酶)或者SAAT。图7D显示C41(DE3，ΔfadE/pHZ1.43)/pRSET B+pAS004.114B)生成的C8C8的质谱和裂解谱，其中pHZ1.43质粒表达SAAT。

图8显示当来自不动杆菌(A.baylyi)ADP1(WSadp1)的蜡合酶与来自萼距花(Cuphea hookeriana)的硫酯酶基因在制备宿主中共表达时，制备的乙酯的分布。

图9A和图9B显示GC/MS分析的色谱。图9A显示乙基提取物的色谱，所述乙基提取物来自于用质粒pCDFDuet-1-fadD-WSadp1、pETDuet-1-′tesA转化的大肠杆菌LS9001菌株的培养物。乙醇被添加到发酵物中。图9B显示用作参照的棕榈酸乙酯和油酸乙酯的色谱。

图10是标明各种基因的表格，所述基因可以被过量表达或者弱化以增加脂肪酸衍生物的生成。所述表格还标明能够被调控以改变脂肪酸衍生产物结构的各种基因。本领域普通技术人员能够理解一些用于改变脂肪酸衍生物结构的基因还会增加脂肪酸衍生物的生成。

缩写和术语

提供下列关于术语和方法的解释以便更好的描述本发明，并指导本领域普通技术人员实施本发明。本文使用的“包括(comprising)”表示“包含(including)”，单数形式的“一个(a)”或者“一个(an)”或者“the”包括复数含义，除非上下文明确的另外指出。例如，“包括一个细胞”指包含一个或者多个这类细胞，“包括硫酯酶”指包含一种或者多种硫酯酶肽以及本领域普通技术人员已知的其同等物，等等。术语“或者”是指陈述的可选择要素或者两个或更多个要素组合中的单个要素，除非上下文明确的另外指出。例如短语“硫酯酶活性或者脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶活性”是指硫酯酶活性、脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶活性或者脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶活性和硫酯酶活性两者的组合。

除非另外解释，所有本文使用的技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常的理解具有相同的含义。尽管与本文描述的类似或者等同的方法和材料可用于本发明的实施或者试验，但下文描述了适合的方法和材料。所述材料、方法和实施例只是说明性的，而不是用于限制。根据下面的详细说明和权利要求，本发明的其他特征将是明显。

登录号：贯穿本说明书的登录号来源于美国国立卫生研究院维护的NCBI数据库(国立生物技术信息中心)。所述登录号是2007年3月27日由该数据库提供的。

酶分类号(EC)：贯穿本说明书提供的EC编号来自京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomics)维护的KEGGLigand数据库，这由东京大学部分资助。所述EC编号是2007年3月27日由该数据库提供的。

弱化：为了降低某物的影响、活性或者强度。在一个实例中，特定的酶对组合物(不是产物或者反应物)造成的反馈抑制或者抑制(非途径特异性反馈)的灵敏度被降低，这样的话所述酶活性不受化合物存在的影响。例如，fabH基因和其对应的氨基酸序列是温度敏感的，可以将其改变以降低对温度变化的敏感性。当需要支链氨基酸时，可以使用fabH基因的弱化作用。在另一个实例中，被改变成活性更低的酶可以被称作弱化的。

可以使用酶的功能性缺失来弱化酶。功能性缺失是对基因序列或者控制基因序列转录的序列进行的突变、部分或者全部缺失、插入或者其他变化，这减少或者抑制基因产物的产生，或者导致基因产物没有功能(即本文描述的对plsB基因的突变)。例如，大肠杆菌中fabR的功能性缺失减轻了脂肪酸生物合成途径的抑制，允许大肠杆菌产生更多的不饱和脂肪酸(UFAs)。在一些情况下功能性缺失被描述成敲除突变。

本领域普通技术人员将理解存在许多弱化酶活性的方法。例如，弱化作用可以通过以下技术实现：通过改变核酸序列引入氨基酸序列的变化，将基因置于活性较低的启动子控制之下，表达针对目的基因的干扰RNA、核酶或者反义序列，或者通过本领域已知的任意其他技术。

碳源：通常指适合作为原核生物或者简单真核细胞生长的碳源的底物或者化合物。碳源可以是各种形式，包括但不限于聚合物，糖，酸，醇，醛，酮，氨基酸，肽，等等。这些包括，例如，各种单糖诸如葡萄糖，低聚糖，多糖，纤维素质，木糖，和阿拉伯糖，二糖，诸如蔗糖，饱和或者不饱和的脂肪酸，琥珀酸盐，乳酸盐，乙酸盐，乙醇，等等，或者其混合物。此外，碳源还可以是光合作用产物，包括但不限于葡萄糖。

cDNA(互补DNA)：一段缺少内部、非编码片段(内含子)和决定转录的调控序列的DNA。可以通过从细胞提取的信使RNA逆转录合成cDNA。

缺失：从核酸分子去除一个或者多个核苷酸，或者从蛋白去除一个或多个氨基酸，再将两边的区域连接到一起。

可检测的：能够确定出现或者存在。例如，使用根据下面实施例11提供的方法，从反应物产生的产物(诸如C18脂肪酸的生成)是可检测的。

DNA：脱氧核糖核酸。DNA是长链聚合物，其包括大部分活的有机体(一些病毒具有包括核糖核酸RNA的基因)的遗传物质。DNA聚合物中的重复单位是4种不同的核苷酸，其包括4种碱基，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶中的一种，所述碱基上结合有脱氧核糖，而磷酸基与所述脱氧核糖连接。DNA分子中被称为密码子的核苷酸三联体编码肽的氨基酸。术语密码子还指mRNA中3核苷酸的对应(和互补)序列，所述DNA序列被转录成所述mRNA。

内源的：当在本文中对核酸分子和特定的细胞或者微生物使用时，是指位于细胞内的核酸序列或者肽，其不是利用重组工程技术导入细胞的。例如，当细胞最初从自然界分离时，已经存在于所述细胞中的基因。即使调控序列诸如激活转录或者翻译的启动子或者增强子序列已经通过重组技术被改变，基因仍被认为是内源的。

外源的：本文中对核酸分子和特定的细胞使用时，是指不是来源于自然界发现的特定细胞的任意核酸分子。因此，一旦非天然存在的核酸分子被引入细胞，则其被认为是外源的。对特定细胞来说，天然存在的核酸分子也可以是外源的。例如，一旦从细胞X分离的完整编码序列被引入细胞Y，则该编码序列对细胞Y来说是外源核酸，即使X和Y是相同的细胞类型。

表达：基因的编码信息被转变为细胞的结构与功能诸如蛋白、转移RNA或者核糖体RNA的过程。表达的基因包括那些被转录为mRNA然后被翻译为蛋白的基因，以及那些被转录为RNA但不被翻译为蛋白的基因(例如，转移和核醣体RNAs)。

脂肪酯：包括由脂肪酸制备的任意酯。脂肪酸的碳链可以包含本文描述的修饰的任意组合。例如，碳链可以包含一个或多个不饱和点，一个或多个分枝点(包括环状分枝)，以及可以被工程化变得短或者长。任何醇都可以用于形成脂肪酸酯，例如来自脂肪酸生物合成途径的醇，由制备宿主通过非脂肪酸生物合成途径产生的醇，和发酵肉汤中提供的醇。

脂肪酸衍生物：包括部分由宿主生物体的脂肪酸生物合成途径制备的产物。脂肪酸生物合成途径包括脂肪酸合酶，其可以按照本文的描述被工程化产生脂肪酸衍生物，以及在一些实例中其可以与其他酶一起表达以产生具有所需碳链特性的脂肪酸衍生物。示例性的脂肪酸衍生物包括诸如短链和长链醇、烃和脂肪酸酯，包括蜡。

发酵肉汤：包括任意支持微生物生命(即主动代谢碳的微生物)的培养基。发酵培养基通常包含碳源。碳源是可以被微生物用作(利用或者不利用其他的酶)能量的任何物。

烃：包括那些包含元素碳(C)和氢(H)的化合物。所有烃都由碳骨架以及与该骨架连接的氢原子构成。有时，该术语被用作术语“脂肪烃”的简称。基本上存在3种类型的烃：(1)芳香族烃，其具有至少一个芳香环；(2)饱和烃，亦称为烷，其缺少双键、三键或者芳香键；和(3)不饱和烃，其在碳原子之间具有一个或者多个双键或者三键，被分成：烯烃、炔和二烯。液体的地质提取的烃被称作石油(字面理解是“岩石油”)或者矿物油，而气态的地质烃被称作天然气。所有这些均是作为制备有机化学品的原料的燃料和原材料的主要来源，它们通常是利用石油地质工具在地球表面下发现的。沉积岩中的石油储备是用于能源和化学工业的烃的主要来源。烃在经济上非常重要，因为它们包括了主要化石燃料(煤，石油，天然气，等等)和生物燃料以及塑料、蜡、溶剂和油类的成分。

分离的：“分离的”生物学组分(诸如核酸分子、蛋白或者细胞)已经基本上从该组分天然存在的其他生物学组分中分离或者纯化，诸如其他染色体的和染色体外的DNA和RNA，以及蛋白。已经被“分离的”核酸分子和蛋白包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白。该术语还包含在宿主细胞中利用重组表达制备的核酸分子和蛋白，以及化学合成的核酸分子和蛋白。

在一个实例中，分离的是指天然存在的核酸分子与两个序列不是直接邻接的，而在作为其来源的天然存在的生物体基因组中其与所述两个序列是直接邻接的(一个在5′端，一个在3′端)。

微生物：包括来自古细菌域、真细菌域和真核生物域的原核和真核微生物种，后者包括酵母和丝状真菌、原生动物、藻类或者更高等的原生生物。术语“微生物细胞”和“微生物(microbes)”可以与术语微生物(microorganism)互换使用。

核酸分子：包括RNA和DNA分子，其包括但不限于，cDNA、基因组DNA和mRNA。包括合成的核酸分子，例如那些化学合成或者重组产生的核酸分子。核酸分子可以是双链或者单链的。单链时，核酸分子可以是正义链或者反义链。此外，核酸分子可以是环状或者线性的。

可操作的连接：当第一核酸序列与第二核酸序列具有功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作的连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或者表达，则所述启动子与所述编码序列可操作的连接。通常，可操作连接的DNA序列是连接的，并且必要时在相同阅读框内连接两个蛋白编码区域。作为单个信使RNA串联转录的分离基因的结构被称为操纵子。因此将基因紧密相邻置于单个启动子的转录调节下，例如在质粒载体中，则构成合成操纵子。

ORF(开放阅读框)：不含任何终止密码子的一系列编码氨基酸的核苷酸三联体(密码子)。这些序列通常可以被翻译为肽。

过表达：当基因的转录速率与其内源转录速率相比提高的时候。在一些实例中，过表达还包括基因的翻译速率高于该基因的内源翻译速率。检测过表达的方法是本领域公知的。例如可以利用rtPCR评价转录的RNA水平，以及利用SDS page凝胶分析评价蛋白水平。

纯化的：术语“纯化的”并不需要绝对的纯度；它只是一个相对术语。因此，例如，纯化的脂肪酸衍生物制品(诸如蜡或者脂肪酸酯制品)是指比位于其细胞环境内的产物浓度更高的产物。例如，纯化的蜡是指与和其相伴的细胞组分(核酸、脂、糖和其他肽)基本上分离的蜡。在另一个实例中，纯化的蜡制品是指基本上不含污染物(诸如那些发酵后可能存在的污染物)的蜡。

在一个实例中，当按重量计至少大约50％的样品由脂肪酸酯组成时，例如当至少大约60％，70％，80％，85％，90％，92％，95％，98％或者99％或者更高比例的样品由脂肪酸酯组成时，脂肪酸酯是纯化的。可用于纯化蜡、脂肪醇和脂肪酸酯的方法的实例包括下面实施例11描述的方法。

重组：重组核酸分子或者蛋白，其具有非天然存在的序列，具有由人工组合序列的两个另外分离的序列片段制备的序列，或者以上两者。例如可以通过化学合成或者人工操作核酸分子或者蛋白的分离片段，诸如遗传工程技术，实现这种人工组合。重组还用于描述以下核酸分子，它们已经被人工处理，但包含的调控序列和编码区与分离所述核酸的生物体中发现的相同。重组细胞或者微生物是包含外源核酸分子诸如重组核酸分子的细胞或者微生物。

释放：化合物从细胞内部(胞内)向细胞外部(胞外)的运动。该运动可以是主动或者被动的。当释放是主动的时候，它可以被一种或者多种转运蛋白肽推动，在一些实例中，它可以消耗能量。当释放是被动的时候，它能够通过扩散穿过膜，可以通过连续收集来自胞外环境的所需化合物来推动，从而促进进一步的扩散。化合物的释放还可以通过裂解细胞来实现。

表面活性剂：能够降低液体表面张力的物质，其中该物质溶于所述液体中。它们通常由水溶性的头和烃链或者尾组成。水溶性基团是亲水性的，可以是离子的或者非离子的，而烃链是疏水性的。表面活性剂被用于各种产品，包括去污剂和清洁剂，还可用作纺织品、皮革和纸的辅助剂，用于化工工艺、化妆品和药物、食品工业以及农业。此外，它们还可以用于辅助提取和分离处于难以接近环境的原油或者作为水乳胶。

根据不同的用途划分存在4类表面活性剂。阴离子表面活性剂具有去污剂样活性，通常适用于清洁用途。阳离子表面活性剂包含长链烃，通常被用于处理蛋白和合成聚合物或者作为织物柔软剂和护发素的成分。两性表面活性剂也包含长链烃，通常在洗发剂中使用。非离子型表面活性剂通常被用于清洁产品。

转化或者重组细胞：例如通过分子生物学技术，已经被引入核酸分子(诸如编码酰基辅酶A合酶的核酸分子)的细胞。转化包括能够将核酸分子引入这类细胞的所有技术，包括但不限于，利用病毒载体转染，接合作用，利用质粒载体转化，和通过电穿孔的裸DNA引入，脂质体转染，和颗粒枪加速。

在允许产物生成的条件下：任何允许微生物产生所需产物(诸如脂肪酸，烃，脂肪醇，蜡或者脂肪酸酯)的发酵条件。发酵条件通常包括温度范围，通气水平，和培养基选择，将上述条件组合时允许微生物生长。示例性的培养基包括肉汤或者凝胶。通常，培养基包括碳源诸如葡萄糖，果糖，纤维素，或者可以被微生物直接代谢的类似物，或者可以在培养基中使用促进代谢碳源的酶。为了确定培养条件是否允许产物生成，将微生物培养24、36或者48小时，收集并分析样品。例如，可以检测样品或者培养基(细胞在其中生长)的细胞中所需产物的存在。当分析产物的存在时，可以使用下面实例提供的那些方法。

载体：作为引入细胞从而产生转化细胞的核酸分子。载体可以包括允许其在细胞中复制的核酸序列，诸如复制原点。载体还可以包括一种或者多种选择性标志物基因和本领域已知的其他遗传成分。

蜡：在指定物理条件下形成固体或者柔软物质的各种脂肪酸酯。被称为蜡的脂肪酸酯通常比不是蜡的脂肪酸酯具有更长的碳链。例如，室温下蜡通常形成柔软的物质。

详细说明

I.脂肪酸衍生物的制备

被外源DNA序列转化的宿主生物体可以是修饰的宿主生物体，例如生物体被修饰以增加酰基ACP或者酰基辅酶A的产生，减少脂肪酸衍生物和中间物的分解代谢，或者降低生物合成途径特定点的反馈抑制。除了修饰本文描述的基因外，其他细胞资源也可以被转向过量产生脂肪酸，例如乳酸盐、琥珀酸盐和/或乙酸盐途径可以被弱化，而乙酰辅酶A羧化酶(ACC)被过表达。本文描述的制备宿主的修饰可以通过基因组改变、染色体外表达系统或者其组合来实现。图1和图2提供所述途径的概述。

A.乙酰辅酶A-丙二酰辅酶A到酰基-ACP

脂肪酸合酶(FAS)是一组催化酰基链起始和延伸的肽(Marrakchi etal.，Biochemical Society，30：1050-1055，2002)。酰基载体蛋白(ACP)以及FAS途径的酶控制产生的脂肪酸的长度、饱和度和分枝。被归入FAS的酶包括AccABCD，FabD，FabH，FabG，FabA，FabZ，FabI，FabK，FabL，FabM，FabB和FabF。根据期望的产物，这些基因的一种或者多种可以被弱化或者过表达。

例如，制备宿主的脂肪酸生物合成途径中使用前体乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A(图2)。被工程化过量产生这些组分的大肠杆菌或者其他宿主生物体可以作为后续遗传工程步骤的起点，以提供特异性输出产物(诸如脂肪酸酯，烃，脂肪醇)。可以对宿主菌株进行数种不同的修饰，其联合或者单独进行，以获得增加的乙酰辅酶A/丙二酰辅酶A/脂肪酸和脂肪酸衍生产物。例如，为了增加乙酰辅酶A生成，可以构建以下质粒，所述质粒包含pdh，panK，aceEF，(编码丙酮酸盐和2-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1p脱氢酶组分和E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶组分)，fabHbbcpbF，以及在一些实例中编码脂酰辅酶A还原酶和醛去羰基化酶的其他DNA，它们均位于组成性或者另外的可控启动子的控制下。这些基因的示例性的Genbank登录号是：pdh(BAB34380，AAC73227，AAC73226)，panK(也称为coaA，AAC76952)，aceEF(AAC73227，AAC73226)，fabH(AAC74175)，fabD(AAC74176)，fabG(AAC74177)，acpP(AAC74178)，fabF(AAC74179)。

此外，通过用不包含相应基因或者包含其缺失突变的条件复制型或者非复制型质粒转化，或者通过替代启动子或者增强子序列，在工程化微生物中fadE，gpsA，ldhA，pflb，adhE，pta，poxB，ackA，和/或ackB可以被敲除，或者它们的表达水平可以被降低。这些基因示例性的Genbank登录号是：fadE(AAC73325)，gspA(AAC76632)，ldhA(AAC74462)，pflb(AAC73989)，adhE(AAC74323)，pta(AAC75357)，poxB(AAC73958)，ackA(AAC75356)和ackB(BAB81430)。

获得的工程化微生物可以在希望的环境中生长，例如包含有限甘油的环境(培养基中低于1％ w/v)。这样的话，这些微生物产生乙酰辅酶A的水平将增加。利用重头合成质粒中包含的编码accABCD(乙酰辅酶A羧化酶，例如登录号AAC73296，EC 6.4.1.2)的DNA，按照上文所述工程化微生物可以影响丙二酰辅酶A的过量产生。还可以在重头合成质粒中包含编码脂肪酶(例如登录号CAA89087，CAA98876)的DNA来实现脂肪酸的过量产生。

在一些实例中，乙酰辅酶A羧化酶(ACC)被过表达以增加其胞内浓度，例如是天然表达水平的至少2倍，诸如至少5倍，或者至少10倍。

此外，plsB(例如登录号AAC77011)D311E突变可用于去除酰基辅酶A库的限制。

此外，在制备宿主中可以包含sfa基因(FabA的抑制基因，例如登录号AAN79592)的过表达以增加单不饱和脂肪酸的生成(Rock et al.，J.Bacteriology 178：5382-5387，1996)。

B.酰基ACP到脂肪酸

为了工程化制备宿主以产生脂肪酸衍生物的均质群，一种或者多种内源基因可以被弱化或者功能性去除，并且一种或者多种硫酯酶可以被表达。例如，通过弱化硫酯酶C18(例如登录号AAC73596和P0ADA1)(其使用C18:1-ACP)并表达硫酯酶C10(例如登录号Q39513)(其使用C10-ACP)来产生C10脂肪酸衍生物。因此，产生碳链长度为10的脂肪酸衍生物的相对均质群。在另一个实例中，通过弱化内源硫酯酶(其产生非C14脂肪酸)并表达硫酯酶登录号Q39473(其使用C14-ACP)来产生C14脂肪酸衍生物。在另一实例中，通过表达使用C12-ACP的硫酯酶(例如登录号Q41635)并弱化产生非C12脂肪酸的硫酯酶来产生C12脂肪酸衍生物。利用本领域已知的方法，例如在细胞裂解后利用放射性前体、HPLC和GC-MS，可以验证乙酰辅酶A、丙二酰辅酶A和脂肪酸的过量产生。

表1

硫酯酶

 

登录号	生物体来源	基因	产生的优先产物
				AAC73596	大肠杆菌	tesA，不含前导序列	C18:1
Q41635	加利福尼亚桂树(Umbellularia	fatB	C12:0

 

	California)
				Q39513；	萼距花(Cupheahookeriana)	fatB2	C8:0-C10:0
AAC49269	萼距花	fatB3	C14:0-C16:0
				Q39473	樟树(Cinnamonumcamphorum)	fatB	C14:0
CAA85388	拟南芥(Arabidopsisthaliana)	fatB[M141T]*	C16:1
				NP 189147；NP 193041	拟南芥	fatA	C18:1
CAC39106	慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhiizobiumjaponicum)	fatA	C18:1
				AAC72883	萼距花	fatA	C18:1

^*Mayer et al.，BMC Plant Biology 7：1-11，2007.

C.脂肪酸到酰基辅酶A

可以利用已知的肽工程化制备宿主以产生各种长度的脂肪酸。一种制备脂肪酸的方法涉及增加一种或者多种酰基辅酶A合酶肽(EC2.3.1.86)的表达或者表达它们更具活性的形式。

本文使用的酰基辅酶A合酶包括属于酶分类号EC 2.3.1.86的肽，以及能够催化脂肪酸转化为酰基辅酶A的任意其他肽。此外，本领域普通技术人员将理解一些酰基辅酶A合酶肽同样也能催化其他反应，例如一些酰基辅酶A合酶肽将接受脂肪酸以外的其他底物。因此还包括这类非特异性酰基辅酶A合酶肽。酰基辅酶A合酶肽的序列是公开提供的。图10提供示例性的GenBank登录号。

D.酰基辅酶A到脂肪醇

可以利用已知的多肽工程化制备宿主以便从酰基辅酶A产生脂肪醇。一种制备脂肪醇的方法涉及增加脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(FAR，EC 1.1.1.^*)或者酰基辅酶A还原酶(EC 1.2.1.50)和乙醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)的表达或者表达它们更具活性的形式。在下文中脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(FAR，EC 1.1.1.^*)、酰基辅酶A还原酶(EC 1.2.1.50)和醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)被总称为脂肪醇形成肽。在一些实例中，所有这3种脂肪醇形成基因都能在制备宿主中过表达，而在其他实例中，一种或者多种脂肪醇形成基因可以被过表达。

本文使用的脂肪醇形成肽包括属于酶分类号EC 1.1.1.^*、1.2.1.50和1.1.1.1的肽，以及能够催化酰基辅酶A转化为脂肪醇的任意其他肽。此外，本领域普通技术人员将理解一些脂肪醇形成肽同样也能催化其他反应，例如一些酰基辅酶A还原酶将接受脂肪酸以外的其他底物。因此还包括这类非特异性肽。脂肪醇形成肽的序列是公开提供的。图10提供示例性的GenBank登录号。

脂肪醇还被描述为基于烃的表面活性剂。为了制备表面活性剂，微生物被修饰以便从可再生碳源产生表面活性剂。这类微生物包括第一外源DNA序列和第二外源DNA序列，所述第一外源DNA序列编码能够将脂肪酸转化为脂肪醛的蛋白，所述第二外源DNA序列编码能够将脂肪醛转化为醇的蛋白。在一些实例中，第一外源DNA序列编码脂肪酸还原酶。在一个实施方式中，第二外源DNA序列编码哺乳动物微粒体的醛还原酶或者长链醛脱氢酶。在另一个实例中，第一和第二外源DNA序列来自于节杆菌AK19(Arthrobacter AK 19)、粘红酵母(Rhodotorula glutinins)、不动杆菌M-1菌株(Acinobacter sp strain M-1)或者解脂假丝酵母(Candidalipolytica)的多酶复合物。在一个实施方式中，第一和第二异源DNA序列来自于不动杆菌M-1株或者解脂假丝酵母的多酶复合物。

可用于表面活性剂制备的异源DNA序列(其编码将脂肪酸转化为长链醇的蛋白)的其他来源包括，但不限于，高山被孢霉(Mortierella alpina)(ATCC 32222)，弯曲隐球菌(Crytococcus curvatus)(也称为Apiotricumcurvatum)，Alcanivorax jadensis(T9T＝DSM 12718＝ATCC 700854)，不动杆菌HO1-N(Acinetobacter sp.HO1-N)，(ATCC 14987)和混浊红球菌(Rhodococcus opacus)(PD630 DSMZ 44193)。

在一个实例中，脂肪酸衍生物是饱和的或者不饱和的表面活性剂产物，其具有限于6-36个碳原子的碳原子含量。在另一个实例中，表面活性剂产物具有限于24-32个碳原子的碳原子含量。

用于产生表面活性剂的合适宿主可以是真核或者原核微生物。示例性的宿主包括节杆菌AK19，粘红酵母，不动杆菌M-1菌株，拟南芥(Arabidopsis thalania)或者解脂假丝酵母，酿酒酵母，和大肠杆菌，其被工程化表达乙酰辅酶A羧化酶。先天具有合成高水平的脂和油形式的表面活性剂前体的宿主，诸如混浊红球菌，节杆菌AK19，粘红酵母和大肠杆菌，其被工程化表达乙酰辅酶A羧化酶，以及其他油质细菌、酵母和真菌也可以被使用。

E.脂肪醇到脂肪酯

可以利用已知的多肽工程化制备宿主以产生各种长度的脂肪酯。一种制备脂肪酯的方法包括增加一种或者多种醇O-乙酰基转移酶肽(EC 2.3.1.84)的表达或者表达其更具活性的形式。这些肽催化乙酰辅酶A和醇的反应，从而形成辅酶A和乙酸酯。在一些实例中，醇O-乙酰基转移酶肽可以与挑选的硫酯酶肽、FAS肽和脂肪醇形成肽联合表达，从而允许控制碳链长度、饱和和分枝度。在一些情况下，可以共表达bkd操纵子以便产生支链脂肪酸前体。

本文使用的醇O-乙酰基转移酶肽包括属于酶分类号EC 2.3.1.84的肽，以及能够催化乙酰辅酶A和醇转化形成辅酶A和乙酸酯的任意其他肽。此外，本领域普通技术人员将理解醇O-乙酰基转移酶肽将同样催化其他反应，例如一些醇O-乙酰基转移酶肽将接受脂肪醇或者乙酰辅酶A硫酯之外的其他底物，即诸如其他醇和其他酰基辅酶A硫酯。因此还包括这类非特异性或者各种特异性的醇O-乙酰基转移酶肽。醇O-乙酰基转移酶肽的序列是公开提供的。图10提供示例性的GenBank登录号。用于表征特定醇O-乙酰基转移酶肽活性的分析是本领域公知的。还可以产生工程化的O-乙酰基转移酶和O-酰基转移酶，它们对供体酰基或者受体醇部分具有新的活性和特异性。可以通过本领域记载的合理的进化方法产生工程化酶。

F.酰基辅酶A到脂肪酯(生物柴油和蜡)

可以利用已知的肽工程化制备宿主以便从酰基辅酶A和醇产生脂肪酸酯。在一些实例中，在发酵培养基中提供醇，而在其他实例中，如本文所述制备宿主可以提供醇。本领域普通技术人员将理解，在结构上脂肪酸酯具有A侧和B侧。在本文中描述时，酯的A侧用于描述醇提供的碳链，而酯的B侧用于描述酰基辅酶A提供的碳链。链可以是饱和或者不饱和的，分枝或者不分枝的。制备宿主可以被工程化产生脂肪醇或者短链的醇。制备宿主还可以被工程化产生特异性酰基辅酶A分子。本文使用的脂肪酸酯是来自脂酰基硫酯和醇的酯，其中所述酯的A侧和B侧的长度可以独立的不同。通常，酯的A侧的长度至少为1，2，3，4，5，6，7或者8个碳，而酯的B侧的长度是8，10，12，14，16，18，20，22，24或者26个碳。A侧和B侧可以是直链或者支链的，饱和或者不饱和的。

可以利用已知的多肽工程化脂肪酯的制备，其包括来自酰基辅酶A和醇的蜡。本文使用的蜡是长链脂肪酸酯，其中所述酯的A侧和B侧的长度可以独立的不同。通常，酯的A侧的长度至少是8，10，12，14，16，18，20，22，24或者26个碳。类似地，酯的B侧的长度至少是8，10，12，14，16，18，20，22，24或者26个碳。A侧和B侧可以是单、双或者三不饱和的。可以利用已知的多肽工程化脂肪酯的制备，其包括来自酰基辅酶A和醇的蜡。一种制备脂肪酯的方法包括增加一种或者多种蜡合酶(EC 2.3.1.75)的表达或者表达其更具活性的形式。

本文使用的蜡合酶包括属于酶分类号EC 2.3.1.75的肽，以及能够催化酰基硫酯转化为脂肪酯的任意其他肽。此外，本领域普通技术人员将理解一些蜡合酶肽同样也能催化其他反应，例如一些蜡合酶肽将接受短链酰基辅酶A和短链醇以产生脂肪酯。因此还包括这类非特异性蜡合酶。蜡合酶肽的序列是公开提供的。图10提供示例性的GenBank登录号。鉴定蜡合酶活性的方法提供于美国专利第7,118,896号，其通过引用并入本文。

在特定实例中，如果所需产物是基于脂肪酯的生物燃料，则微生物被修饰以便从可再生能源产生脂肪酯。这类微生物包括编码蜡酯合酶的外源DNA序列，其被表达以便给予所述微生物从可再生能源合成饱和的、不饱和的或者支链脂肪酯的能力。在一些实施方式中，蜡酯合成蛋白包括，但不限于：脂肪酸延长酶(elongases)，酰基辅酶A还原酶，酰基转移酶或者蜡合酶，脂酰基转移酶，二酰甘油酰基转移酶，酰基辅酶A蜡醇酰基转移酶，双功能蜡酯合酶/酰基辅酶A：二酰甘油酰基转移酶，其选自希蒙得木(Simmondsia chinensis)、不动杆菌ADP1菌株(Acinetobactersp.strain ADP1)(更为正式地乙酸钙不动杆菌ADP1(Acinetobactercalcoaceticus ADP1))、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、Fundibacterjadensis、拟南芥或者真养产碱杆菌(Alkaligenes eutrophus)的多酶复合物。在一个实施方式中，脂肪酸延长酶、酰基辅酶A还原酶或者蜡合酶来自于真养产碱杆菌以及文献中已知产生蜡和脂肪酸酯的其他生物体的多酶复合物。

编码蜡合成蛋白(其可用于脂肪酯制备)的异源DNA的其他来源包括但不限于，高山被孢霉(例如ATCC 32222)，弯曲隐球菌(也称为Apiotricum curvatum)，Alcanivoraxjadensis(例如T9T＝DSM 12718＝ATCC 700854)，不动杆菌HO1-N(例如ATCC 14987)和混浊红球菌(例如PD630，DSMZ 44193)。

本文描述的方法允许制备不同长度的脂肪酯。在一个实例中，脂肪酸酯产物是饱和的或者不饱和的脂肪酯产物，其具有24-46个碳原子的碳原子含量。在一个实施方式中，脂肪酯产物具有24-32个碳原子的碳原子含量。在另一个实施方式中，脂肪酯产物具有14和20个碳的碳含量。在另一个实施方式中，脂肪酯是C18:1的甲酯。在另一个实施方式中，脂肪酯是C16:1的乙酯。在另一个实施方式中，脂肪酯是C16:1的甲酯。在另一个实施方式中，脂肪酸酯是辛醇的十八烷酯。

用于产生脂肪酯的有用宿主可以是真核或者原核微生物。在一些实施方式中，这类宿主包括但不限于，酿酒酵母，解脂假丝酵母，大肠杆菌，节杆菌AK 19，粘红酵母，不动杆菌M-1菌株，解脂假丝酵母和其他油脂性微生物。

在一个实例中，使用来自不动杆菌ADP1基因座AAO17391的蜡酯合酶(描述于Kalscheuer和Steinbuchel，J.Biol.Chem.278：8075-8082，2003，通过引用并入本文)。在另一个实例中，使用来自希蒙得木基因座AAD38041的蜡酯合酶。

任选的使用蜡酯输出者(exporter)诸如FATP家族的成员以促进蜡或者酯释放入胞外环境。可以使用的蜡酯输出者实例是脂肪酸(长链)转运蛋白CG7400-PA同种型A，这是来自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)基因座NP_524723的同种型。

G.酰基ACP、酰基辅酶A到烃

已知多种微生物产生烃，诸如烷、烯烃和类异戊二烯。这些烃中的许多来源于脂肪酸生物合成。通过控制天然宿主中与脂肪酸生物合成有关的基因，可以控制这些烃的产生。例如，布朗葡萄藻(Botryococcusbraunii)的烃生物合成经由脂肪醛的脱羰作用实现。通过脂酰辅酶A还原酶还原脂酰硫酯产生脂肪醛。因此，通过工程化布朗葡萄藻(B.braunii)表达特定基因诸如硫酯酶(其控制被导入烷生物合成途径的脂肪酸的链长)，可以控制烷终产物的结构。在布朗葡萄藻中表达产生支链脂肪酸生物合成的酶将产生支链烷。引入影响脂肪酸去饱和产生的基因将产生烯烃。这些基因的组合还可以提供对生成的烃的最终结构的进一步控制。为了产生更高水平的天然或者工程化的烃，参与脂肪酸及其前体生物合成或者其他产物降解的基因可以被表达、过表达或者减弱。这些方法中的每一种都可用于在弗尼斯弧菌M1及其功能同系物中产生烷，所述弗尼斯弧菌M1通过还原脂肪醇产生烷(参见上文关于脂肪醇生成的生物合成和工程化)。这些方法中的每一种还可用于藤黄微球菌、嗜麦芽窄食单胞菌、Jeogalicoccus sp.(ATCC8456)和相关微生物的许多菌株产生烯烃。这些微生物产生长链内烯烃，其来自于脂肪酸前体的头对头缩合。利用本文描述的方法控制脂肪酸前体的结构和水平将形成不同链长、分枝和饱和水平的烯烃。

还可以利用还原伯醇的进化氧化/还原酶产生烃。已知脂肪伯醇可用于在微生物诸如弗尼斯弧菌M1中产生烷(Myong-Ok，J.Bacteriol.，187：1426-1429，2005)。NAD(P)H依赖的氧化/还原酶是有效的催化剂。合成的NAD(P)H依赖性氧化还原酶可以利用进化工程化产生，并在制备宿主中表达以产生脂肪酸衍生物。本领域普通技术人员都清楚，“进化”脂肪醇还原酶使其具有所需活性的方法是公知的(Kolkman和Stemmer NatBiotechnol.19：423-8，2001，Ness etal.，Adv Protein Chem.55：261-92，2000，Minshull和Stemmer Curr Opin Chem Biol.3：284-90，1999，Huisman和Gray Curr Opin Biotechnol.Aug；13：352-8，2002，以及参见美国专利申请2006/0195947)。通过标准方法产生NAD(P)H依赖性氧化还原酶文库，所述标准方法诸如差错倾向PCR、位点特异性随机诱变、位点特异性饱和诱变或者定点特异性诱变。此外，还可以通过“改组”天然存在的NAD(P)H依赖性氧化还原酶编码序列产生文库。文库在合适的宿主诸如大肠杆菌中表达。然后分析表达氧化/还原酶文库不同成员的各个集落的氧化/还原酶的表达，所述氧化/还原酶能够催化脂肪醇的还原。例如，可以通过针对全细胞生物转化、细胞提取物、透化的细胞或者纯化的酶来分析每个细胞。通过分光光度或者荧光监测NAD(P)H的脂肪醇依赖性氧化鉴定脂肪醇还原酶。通过GC/MS、TLC或者其他方法监测烷的生成。采用这种方式鉴定的氧化/还原酶被用于产生烷、烯烃和相关支链径。这可以在体外或者体内实现。后者通过在诸如本文描述的那些产生脂肪醇的生物体中表达进化的脂肪醇还原酶基因来实现。脂肪醇作为醇还原酶的底物，所述醇还原酶产生烷。其他氧化还原酶也可以被工程化催化该反应，诸如那些使用分子氢、谷胱甘肽、FADH或者其他还原辅酶的氧化还原酶。

II.基因工程化制备菌株以增加脂肪酸衍生物的产生

利用本领域公知的技术，诸如电穿孔，磷酸钙沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转染，脂质体介导的转染，结合作用，转导等等，可以将异源DNA序列稳定的或者瞬时引入宿主细胞，所述异源DNA序列参与产生脂肪酸衍生物的生物合成途径。对于稳定转化，DNA序列还包括选择性标志物，诸如，抗生素抗性，例如对新霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素的抗性，弥补营养缺陷型的基因，等等。

本文的各种实施方式利用包括异源DNA序列的表达载体，所述异源DNA序列编码参与代谢或者生物合成途径的蛋白。合适的表达载体包括，但不限于，病毒载体，诸如杆状病毒载体，噬菌体(phage)载体，诸如噬菌体(bacteriophage)载体，质粒，噬菌粒，粘粒，fosmids，细菌人工染色体，病毒载体(例如，基于以下病毒的病毒载体：牛痘病毒，脊髓灰质炎病毒，腺病毒，腺相关病毒，SV40，单纯疱疹病毒，等等)，基于P1的人工染色体，酵母质粒，酵母人工染色体，和任意对目的特定宿主具有特异性的其他载体(诸如大肠杆菌、Pseudomonas pisum和酿酒酵母)。

有用的表达载体可以包括一种或者多种选择性标志基因，以提供用于选择转化宿主细胞的表型性状。所述选择性标志基因编码在选择性培养基中生长的转化宿主细胞存活或者生长必需的蛋白。没有转化包含选择性标志基因的载体的宿主细胞将不会在培养基中存活。通常的选择基因编码以下蛋白：(a)提供对抗生素或者其他毒素的抗性，例如，氨苄青霉素，新霉素，甲氨蝶呤或者四环素，(b)弥补营养缺陷型缺陷，或者(c)提供复合培养基没有的重要营养物，例如，编码杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。在可选的实施方式中，选择性标志基因是编码二氢叶酸还原酶或者提供新霉素抗性(用于真核细胞培养)的基因，或者提供四环素或者氨苄青霉素抗性(用于原核宿主细胞，诸如大肠杆菌)的基因。

表达载体中编码生物合成途径基因产物的DNA序列被可操作的连接到合适的表达调控序列(启动子，增强子，等等)，以指导所编码基因产物的合成。这类启动子可以来源于微生物或者病毒，包括CMV和SV40。根据使用的宿主/载体系统，表达载体可以使用大量合适的转录和翻译控制元件中的任意一种，包括组成型和诱导型启动子，转录增强子元件，转录终止子，等等(参见例如，Bitter et al.，Methods in Enzymology，153：516-544，1987)。

用于原核宿主细胞的合适启动子包括，但不限于，能够识别T4、T3、Sp6和T7聚合酶的启动子，噬菌体λ的P_R和P_L启动子，大肠杆菌的trp、recA、热休克和lacZ启动子，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的α-淀粉酶和∑特异性启动子，杆菌噬菌体的启动子，链霉菌启动子，噬菌体λ的int启动子，pBR322 β-内酰胺酶基因的bla启动子，和氯霉素乙酰转移酶基因的CAT启动子。原核启动子的综述可参见Glick，J.Ind.Microbiol.1：277，1987；Watson et al.，MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE(基因的分子生物学)，4th Ed.，Benjamin Cummins(1987)；和Sambrook et al.，上文。

用于真核宿主内使用的合适真核启动子的非限制性实例来源于病毒，包括小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer et al.，J.Mol.Appl.Gen.1：273，1982)；疱疹病毒的TK启动子(McKnight，Cell 31：355，1982)；SV40早期启动子(Benoist et al.，Nature(London)290：304，1981)；Rous肉瘤病毒启动子；巨细胞病毒启动子(Foecking et al.，Gene 45：101，1980)；酵母gal4基因启动子(Johnston，et al.，PNAS(USA)79：6971，1982；Silver，etal.，PNAS(USA)81：5951，1984)；和IgG启动子(Orlandi et al.，PNAS(USA)86：3833，1989)。

微生物宿主细胞可以用编码生物合成途径基因产物的异源DNA序列进行遗传修饰，所述异源DNA序列被可操作的连接到诱导型启动子。诱导型启动子是本领域公知的。合适的诱导型启动子包括但不限于，受蛋白、代谢物或者化学制品影响的启动子。这些包括：牛白血病病毒启动子，金属硫蛋白启动子，地塞米松诱导型MMTV启动子，SV40启动子，MRP polIII启动子，四环素诱导型CMV启动子(诸如人即刻早期CMV启动子)以及那些来自trp和lac操纵子的启动子。

在一些实例中，遗传修饰的宿主细胞用编码生物合成途径基因产物的异源DNA序列进行遗传修饰，所述异源DNA序列被可操作的连接到组成型启动子。合适的组成型启动子是本领域已知的，包括组成型腺病毒主要晚期启动子，组成型MPSV启动子和组成型CMV启动子。

在一些实例中，被修饰的宿主细胞是用外源DNA序列进行遗传修饰的细胞，所述外源DNA序列编码参与生物合成途径的单个蛋白。在其他实施方式中，被修饰的宿主细胞是用外源DNA序列进行遗传修饰的细胞，所述外源DNA序列编码两种或更多种参与生物合成途径的蛋白-例如，生物合成途径的第一和第二种酶。

当宿主细胞被遗传修饰而表达两种或更多种参与生物合成途径的蛋白时，所述DNA序列可以被包含在单个或者不同的表达载体中。当所述DNA序列被包含在单个表达载体时，在一些实施方式中，核苷酸序列被可操作的连接到常见控制元件(例如，启动子)，例如，所述常见控制元件控制单个表达载体中所有编码生物合成途径蛋白的DNA序列的表达。

当被修饰的宿主细胞用编码两种或更多种参与生物合成途径的蛋白的异源DNA序列进行遗传修饰时，所述DNA序列之一被可操作的连接到诱导型启动子，而所述DNA序列的一个或者多个被可操作的连接到组成型启动子。

在一些实施方式中，可以增加生物合成途径中间物的胞内浓度(例如，遗传修饰的宿主细胞的中间物浓度)以进一步提高终产物的产量。有许多方式可以增加中间物的胞内浓度，包括但不限于，增加培养基中生物合成途径底物的浓度；增强在生物合成途径中起作用的酶的催化活性；增加底物(例如，初始底物)的胞内量，所述底物是在生物合成途径中起作用的酶的底物；等等。

在一些实例中，脂肪酸衍生物或者中间物在细胞的细胞质中生成。有许多方式可以增加细胞质浓度，包括但不限于，将脂肪酸结合辅酶A形成酰基辅酶A硫酯。此外，通过增加细胞中辅酶A的生物合成可以增加酰基辅酶A的浓度，诸如通过过表达与泛酸盐生物合成有关的基因(panD)或者敲除与谷胱甘肽生物合成有关的基因(谷胱甘肽合酶)。

III.碳链特性

利用本文提供的教导可以制备大量产物。这些产物包括烃、脂肪醇、脂肪酸酯和蜡。其中一些产物可以用作生物燃料和专用化学品。可以设计并在微生物中产生这些产物。可以制备产物，以致它们包含分枝点、饱和水平和碳链长度，从而使这些产物成为许多应用所需的起始材料(图10提供可以单独或者联合使用制备各种脂肪酸衍生物的各种酶的说明)。

在其他实例中，可以将来源于不同物种的外源FAS基因的表达或者工程化的变异体引入宿主细胞，引起在结构上(长度，分枝，不饱和度，等等)与天然宿主不同的脂肪酸代谢物的生物合成。也可以选择或者工程化这些异源基因产物以便它们不受宿主细胞中复杂的天然调节机制的影响，从而以更为可控的方式产生需要的商品。例如可以在制备宿主中表达来自枯草芽孢杆菌，酿酒酵母，链霉菌(Streptomycesspp)，雷尔氏菌(Ralstonia)，红球菌(Rhodococcus)，棒状杆菌(Corynebacteria)，短杆菌(Brevibacteria)，分支杆菌(Mycobacteria)，油脂性酵母等等的FAS酶。

本领域普通技术人员将理解，当制备宿主被工程化为从脂肪酸生物合成途径产生脂肪酸(其包含特定水平的不饱和、分枝或者碳链长度)时，获得的工程化脂肪酸可用于脂肪酸衍生物的制备。因此，从制备宿主产生的脂肪酸衍生物可以显示工程化脂肪酸的特性。例如，制备宿主可以被工程化为产生支链短链脂肪酸，然后利用本文提供的关于脂肪醇制备的教导(即包括醇形成酶诸如FAR)，制备宿主产生支链短链脂肪醇。类似地，通过工程化制备宿主产生具有确定水平的分枝、不饱和和/或碳链长度的脂肪酸，可以产生烃，从而制备同质烃群。此外，当需要不饱和醇、脂肪酸酯或者烃时，可以工程化脂肪酸生物合成途径，产生低水平的饱和脂肪酸，还可以表达其他去饱和酶以减少饱和产物的生成。

A.饱和

通过工程化制备宿主过表达fabB，或者通过在低温(例如低于37℃)下增殖制备宿主，可以将制备宿主工程化为产生不饱和脂肪酸。FabB偏好顺式-δ³癸烯酰ACP，并导致在大肠杆菌中产生显著百分数的不饱和脂肪酸。FabB的过表达导致主要产生不饱和脂肪酸(de Mendoza etal.，J.Biol.Chem.，258：2098-101，1983)。然后这些不饱和脂肪酸被用作制备宿主的中间物，所述制备宿主被工程化产生脂肪酸衍生物，诸如脂肪醇，酯，蜡，烯烃，烷，等等。本领域普通技术人员将理解，通过减弱fabA或者过表达FabB和表达特定硫酯酶(如下所述)，可以产生具有所需碳链长度的不饱和脂肪酸衍生物。可选择地，可以去除脂肪酸生物合成的抑制物FabR(Genbank登录号NP_418398)，这也导致大肠杆菌中不饱和脂肪酸生成的增加(Zhang et al.，J.Biol.Chem.277：pp.15558，2002.)。通过FabM(反式-2，顺式-3-癸烯酰基-ACP异构酶，Genbank登录号DAA05501)的过表达和肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)FabK(反式-2-烯酰基-ACP还原酶II，Genbank登录号NP_357969)的受控表达(Marrakchi et al.，J.Biol.Chem.277：44809，2002)，并去除大肠杆菌Fab I((反式-2-烯酰基-ACP还原酶，Genbank登录号NP_415804)，可以实现不饱和脂肪酸的进一步增加。此外，为了增加不饱和脂肪酸酯的百分比，微生物还可以过表达fabB(编码β-酮酰基-ACP合酶I，登录号：BAA16180，EC：2.3.1.41)，Sfa(编码fabA的抑制物，登录号：AAC44390)以及gnsA和gnsB(两者均编码secG缺失突变抑制物，又称冷休克蛋白，登录号：ABD18647.1，AAC74076.1)。

在一些实例中，可以减弱内源fabF基因，从而增加生成的棕榈酸酯(palmitoleate)(C16:1)的百分比。

B.包括环状部分的分枝

利用本文提供的教导，可以产生脂肪酸衍生物，其包含分枝点、环状部分及其组合。

通过表达一种或者多种外源核酸序列，可以将天然产生直链脂肪酸(sFAs)的微生物工程化为产生支链脂肪酸(brFAs)。例如，大肠杆菌天然产生直链脂肪酸(sFAs)。为了工程化大肠杆菌产生brFAs，可以引入并表达数种基因，所述基因提供支化前体(bkd操纵子)并能够从支化前体(fabH)起始脂肪酸生物合成。此外，生物体可以表达用于延伸brFAs(诸如ACP，FabF)的基因和/或去除通常产生sFAs以及会与被引入的基因(诸如FabH，FabF)竞争的相应大肠杆菌基因。

支化酰基辅酶A2-甲基-丁基-辅酶A、异戊酰-辅酶A和异丁基-辅酶A是brFA的前体。在大部分包含brFA的微生物中，它们从支化氨基酸(异亮氨酸，亮氨酸和缬氨酸)分两个步骤被合成(在下文中详细描述)(Kadena，Microbiol.Rev.55：pp.288，1991)。为了工程化微生物产生brFAs或者过量产生brFAs，这两个步骤中一种或者多种酶的表达或者过表达可以被工程化。例如，在一些情况下制备宿主可以具有可以实现一个步骤的内源性酶，这样的话只需要重组表达参与第二个步骤的酶。

形成支化脂肪酸的第一步是通过支链氨基酸转氨酶产生相应的α-酮酸。大肠杆菌具有这种酶，IlvE(EC 2.6.1.42；Genbank登录号YP_026247)。在一些实例中，异源支链氨基酸转氨酶可能不被表达。但是，大肠杆菌IlvE或者任意其他支链氨基酸转氨酶，诸如乳酸乳球菌的ilvE(Genbank登录号AAF34406)，恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)的ilvE(Genbank登录号NP_745648)或者天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)(Genbank登录号NP_629657)的ilvE可以在宿主微生物中过表达，如果转氨酶反应是被挑选用于脂肪酸衍生物生成的宿主生物中brFA生物合成速率的限制性因素。

第二步，α-酮酸向相应支链酰基辅酶A的氧化脱羧，被支链α-酮酸脱氢酶复合物(bkd；EC 1.2.4.4.)催化(Denoya et al.J.Bacteriol.177：pp.3504，1995)，所述复合物由E1α/β(脱羧酶)、E2(二氢硫辛酰转酰酶)和E3(二氢硫辛酰脱氢酶)亚基构成，类似于丙酮酸盐和α-酮戊二酸脱氢酶复合物。表2显示来自数种微生物的潜在bkd基因，它们可以在制备宿主中表达以提供支链酰基辅酶A前体。基本上，每个具有brFAs和/或依赖支链氨基酸生长的微生物都可以用作分离bkd基因的来源，所述bkd基因用于在制备宿主诸如大肠杆菌中表达。此外，大肠杆菌具有E3组分(作为其丙酮酸脱氢酶复合物的一部分；lpd，EC1.8.1.4，Genbank登录号NP_414658)，因此它足以只表达E1α/β.和E2 bkd基因。

表2

来自挑选的微生物的Bkd基因

 

生物	基因	Genbank登录号
			天蓝色链霉菌	bkdA1(E1α)	NP_628006

 

	bkdB1(E1β)bkdC1(E2)	NP_628005NP_638004
			天蓝色链霉菌	bkdA2(E1α)bkdB2(E1β)bkdC2(E2)	NP_733618NP_628019NP_628018
阿维链霉菌(Streptomycesavermitilis)	bkdA(E1a)bkdB(E1b)bkdC(E2)	BAC72074BAC72075BAC72076
			阿维链霉菌	bkdF(E1α)bkdG(E1β)bkdH(E2)	BAC72088BAC72089BAC72090
枯草芽孢杆菌	bkdAA(E1α)bkdAB(E1β)bkdB(E2)	NP_390288NP_390288NP_390288
			恶臭假单胞菌	bkdA1(E1α)bkdA2(E1β)bkdC(E2)	AAA65614AAA65615AAA65617

在另一个实例中，通过共表达巴豆酰辅酶A还原酶(Ccr，EC 1.1.1.9)和异丁基-辅酶A变位酶(大亚基IcmA，EC 5.4.99.2；小亚基IcmB，EC5.4.99.13)(Han和Reynolds J.Bacteriol.179：pp.5157，1997)，在制备宿主诸如大肠杆菌中产生异丁基-辅酶A。巴豆酰辅酶A是大肠杆菌和其他微生物中脂肪酸生物合成的中间物。来自于所选微生物的ccr和icm基因的实例列于表3。

表3

来自所选微生物的Ccr和icm基因

 

生物	基因	Genbank登录号
			天蓝色链霉菌	ccricmAicmB	NP_630556NP_629554NP_630904
肉桂地链霉菌(Streptomycescinnamonensis)	ccricmA	AAD53915AAC08713

 

icmB

AJ246005

除了bkd基因的表达外(参见上文)，brFA生物合成的起始利用对支链酰基辅酶A特异的β-酮酰-酰基-载体-蛋白合酶III(FabH，EC2.3.1.41)(Li etal.J.Bacteriol.187：pp.3795，2005)。这类FabHs的实例列于表4。可以在制备宿主中表达fabH基因，所述fabH基因参与任意包含brFA的微生物的脂肪酸生物合成。来自于天然不产生brFA的制备宿主的Bkd和FabH酶可以不支持brFA的生成，因此可以重组表达Bkd和FabH。类似地，Bkd和FabH生成的内源性水平可能不足以产生brFA，因此，它们可以被过表达。此外，可以表达脂肪酸生物合成机器的其他组分，诸如酰基载体蛋白(ACPs)和β-酮酰-酰基-载体-蛋白合酶II，候选物是酰基载体蛋白(ACPs)和β-酮酰-酰基-载体-蛋白合酶II(fabF，EC 2.3.1.41)(候选物列于表4)。除了表达这些基因外，可以将制备宿主内源性脂肪酸生物合成途径中的一些基因弱化。例如，在大肠杆菌中干扰brFA生物合成的最可能的候选物是fabH(Genbank登录号NP_415609)和/或fabF基因(Genbank登录号NP_415613)。

如上所述，通过联合表达支持brFA合成和醇合成的基因，可以产生支链醇。例如，当醇还原酶诸如来自不动杆菌(Acinetobacter baylyi)ADP1的Acr1与bkd操纵子共表达时，大肠杆菌可以合成异戊醇、异丁醇或者2-甲基丁醇。类似地，当Acr1与ccr/icm基因共表达时，大肠杆菌可以合成异丁醇。

为了将制备宿主诸如大肠杆菌转变为能够合成ω-环状脂肪酸(cyFAs)的生物，需要引入和表达数种基因，所述基因提供环状前体环己基羰基辅酶A(Cropp et al.Nature Biotech.18：pp.980，2000)。然后可以表达表4所列的基因(fabH，ACP和fabF)以起始和延伸ω-环状脂肪酸。可选择地，同源基因可以从产生cyFAs的微生物中分离，并在大肠杆菌中表达。

表4

来自具有brFAs的所选微生物的FabH，ACP和fabF基因

 

生物	基因	Genbank登录号
			天蓝色链霉菌	fabH1	NP_626634

 

	ACPfabF	NP_626635NP_626636
			阿维链霉菌	fabH3fabC3(ACP)fabF	NP_823466NP_823467NP_823468
枯草芽孢杆菌	fabH_AfabH_BACPfabF	NP_389015NP_388898NP_389474NP_389016
			嗜麦芽窄食单胞菌	SmalDRAFT_0818(FabH)SmalDRAFT_0821(ACP)SmalDRAFT_0822(FabF)	ZP_01643059ZP_01643063ZP_01643064
嗜肺军团菌(Legionellapneumophila)	FabHACPfabF	YP_123672YP_123675YP_123676

下列基因的表达足以在大肠杆菌中提供环己基羰基辅酶A：来自山丘链霉菌(Streptomyces collinus)安三烯菌(ansatrienin)基因簇的ansJ，ansK，ansL，chcA和ansM(Chenetal.，Eur.J.Biochem.261：pp.1999，1999)或者来自链霉菌HK803磷内酯霉素(phoslactomycin)B基因簇的plmJ，plmK，plmL，chcA和plmM(Palaniappan et al.，J.Biol.Chem.278：pp.35552，2003)以及山丘链霉菌(S.collinnus)，阿维链霉菌(S.avermitilis)或者天蓝色链霉菌(S.coelicolor)的chcB基因(Patton et al.Biochem.，39：pp.7595，2000)(参见表5的Genbank登录号)。

表5

用于环己基羰基辅酶A合成的基因

 

生物	基因	Genbank登录号
			山丘链霉菌	ansJKansL	U72144*

 

	chcAansLchcB	AF268489
			链霉菌HK803	pmlJKpmlLchcApmlM	AAQ84158AAQ84159AAQ84160AAQ84161
天蓝色链霉菌	chcB/caiD	NP_629292
			阿维链霉菌	chcB/caiD	NP_629292

只有chcA在Genbank登录号U72144下有注释，ansJKLM参见Chen etal.(Eur.J.Biochem.261：pp.1999，1999)

表4所列的基因(fabH，ACP和fabF)足以起始和延伸ω-环状脂肪酸，因为它们具有广泛的底物特异性。如果这些基因中的任意一种与表5的ansJKLM/chcAB或者pmlJKLM/chcAB基因的共表达而不产生cyFAs，可以从产生cyFAs的微生物分离fabH、ACP和/或fabF同系物(例如通过利用简并PCR引物或者异源DNA探针)，并共表达这些同系物。表6列出挑选的包含ω-环状脂肪酸的微生物。

表6

包含ω-环状脂肪酸的微生物的实例

 

生物	参考
		Curtobacterium pusillum	ATCC19096
酸土脂环芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)	ATCC49025
		酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)	ATCC27009
Alicyclobacilluscycloheptanicum*	Moore，J.Org.Chem.62：pp.2173，1997.

^*利用环庚基羰基辅酶A和不利用环己基羰基辅酶A作为cyFA生物合成的前体

C.酯特征

本领域普通技术人员将理解，酯包括A侧和B侧。如本文所述，B侧由宿主生物中从头合成的脂肪酸提供。在宿主被另外工程化产生醇包括脂肪醇的情况下，A侧也由宿主生物产生。在其他实例中，A侧也可以在培养基中提供。如本文所述，通过选择所需硫酯酶基因和当脂肪醇被制备时，B侧和A侧可以被设计成具有某些碳链特征。这些特征包括不饱和点、分枝和需要的碳链长度。下文的实施例6提供制备长链脂肪酸酯的示例性方法，其中A侧和B侧由制备宿主产生。类似地，实施例5提供制备中链脂肪酸酯的方法。当A侧和B侧都由制备宿主提供，并且它们都利用脂肪酸生物合成途径中间物产生时，它们将具有类似的碳链特征。例如，至少50％、60％、70％或者80％的生成的脂肪酸酯将具有长度相差6、4或者2个碳的A侧和B侧。A侧和B侧还显示类似的分枝和饱和水平。

除了产生提供A侧的脂肪醇外，宿主还可以产生其他短链醇诸如乙醇、丙醇、异丙醇、异丁醇和丁醇，所述短链醇可以利用本领域公知的技术并入A侧。例如，由宿主生物产生丁醇。为了制备产生丁醇的细胞，LS9001株(在下面的实施例1中描述)被进一步工程化，在pBAD24表达载体中于prpBCDE启动子系统下表达大肠杆菌K12的atoB(乙酰辅酶A乙酰基转移酶)，溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)的β-羟丁酰辅酶A脱氢酶，拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)的巴豆酸酶，拜氏梭菌的丁酰辅酶A脱氢酶，黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)的辅酶A酰化醛脱氢酶(ALDH)，和丙酮丁醇棱菌(Clostridium acetobutylicum)的adhE编码醛-醇脱氢酶。类似地，可以利用Kalscheuer等教导的方法(Microbiology152：2529-2536，2006，通过引用并入本文)，在制备宿主中产生乙醇。

IV.发酵

通过使用特定的发酵技术可以增强脂肪酸衍生物的生成和分离。一种将产生最大化并降低成本的方法是增加碳源百分比，所述碳源被转变为烃类产物。在正常的细胞生命周期中，碳被用于细胞功能包括产生脂、糖、蛋白、有机酸和核酸。降低生长相关活性必需的碳的量可以增加碳源转变为输出物的功效。这可以通过首先增殖微生物到所需密度来实现，诸如在对数生长期的顶峰实现的密度。在这个时间点，复制检查点基因可用于终止细胞生长。具体来说，群感机制(综述于Camilli和Bassler Science 311：1113，2006；Venturi FEMS Microbio Rev30：274-291，2006；和Reading和Sperandio FEMS Microbiol Lett254：1-11，2006)可用于激活基因诸如p53、p21或者其他检查点基因。在大肠杆菌中可以被激活以停止细胞复制和生长的基因包括umuDC基因，其过表达停止了静止期到指数生长期的进展(Murli et al.，J.ofBact.182：1127，2000)。UmuC是DNA聚合酶，其可以进行对非编码损伤的跨损伤合成-大部分UV和化学诱变作用的机制基础。umuDC基因产物用于跨损伤合成过程，并且还作为DNA损伤检查点。UmuDC基因产物包括UmuC，UmuD，umuD’，UmuD’₂C，UmuD’₂和UmuD₂。同时，产物生成基因将被激活，因此复制和维持途径使用的需求被最小化，而脂肪酸衍生物被制备。

输入的碳转变为烃类产物的百分比是成本动因。效率越高(即百分比更高)，则方法越低廉。对于含氧碳源(即基于葡萄糖和其他糖的来源)，氧必须以二氧化碳的形式释放。每释放2个氧原子，还释放1个碳原子，导致约34％(w/w)的最大理论代谢效率(对脂肪酸衍生的产物)。但是对于其他烃类产物和碳源来说，该数字是变化的。文献中通常的效率是约小于5％。生成烃类产物的工程化微生物可以具有大于1％、3％、5％、10％、15％、20％、25％和30％的效率。在一个实例中，微生物显示大约10％至大约25％的效率。在其他实例中，这类微生物显示大约25％至大约30％的效率，以及在其他实例中，这类微生物显示大于30％的效率。

在一些实例中，当终产物从细胞被释放时，可以使用连续过程。在这种方法中，可以将具有产生脂肪酸衍生物的生物的反应器组装成多通路。在一个实例中，去除一部分培养基，并保留一部分培养基。从水层分离脂肪酸衍生物，然后依次将其返回到发酵室。

在一个实例中，发酵室包括经历连续还原的发酵作用。在这种情况下，将产生稳定的还原环境。通过二氧化碳的释放(气态形式)保持电子平衡。增加NAD/H和NADP/H平衡的努力也有利于稳定电子平衡。

通过工程化制备宿主表达NADH:NADPH转氢酶，也可以增强胞内NADPH的提供。一种或者多种NADH:NADPH转氢酶的表达将糖酵解中产生的NADH转化为NADPH，其增强脂肪酸衍生物的生成。

本文公开的是通过转运蛋白从重组宿主微生物连续产生和输出脂肪酸衍生物的系统。许多转运和外排蛋白用于分泌大量化合物，它们可以被进化为对特定类型的脂肪酸衍生物具有选择性。因此，在一些实施方式中，重组宿主微生物功能性表达编码ABC转运蛋白的外源DNA序列，这样的话微生物将脂肪酸衍生物输出到培养基。在一个实例中，ABC转运蛋白是秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、拟南芥、真养产碱杆菌或者红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)(基因座AAN73268)的ABC转运蛋白。在另一个实例中，ABC转运蛋白是选自CER5(基因座At1g51500或者AY734542)、AtMRP5、AmiS2和AtPGP1的ABC转运蛋白。在一些实例中，ABC转运蛋白是CER5。在另一个实例中，CER5基因来自于拟南芥(基因座At1g51500、AY734542、At3g21090和Atlg51460)。

转运蛋白，例如，还可以是选自以下蛋白的外排蛋白：大肠杆菌的AcrAB、TolC和AcrEF，或者嗜热蓝细菌聚球藻BP-1(Thermo-synechococcus elongatus BP-1)的t111618、t111619和t110139。

此外，转运蛋白可以是，例如，选自黑腹果蝇、秀丽隐杆线虫、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)或者酿酒酵母或者哺乳动物FATP’s中任意一种的脂肪酸转运蛋白(FATP)。利用膜质区反转还可以再合成FATPs，以便反转底物流的方向。具体来说，组成蛋白亲水性结构域(或者膜结构域)的氨基酸序列可以被反转，但对各个特定氨基酸保持相同的密码子。这些区域的鉴定是本领域公知的。

还可以根据释放脂肪酸衍生物的内在能力挑选制备宿主。可以用胞内产物对胞外产物的比例表示产物生成和释放入发酵肉汤的效率。在一些实例中，该比例可以是5:1，4:1，3:1，2:1，1:1，1:2，1:3，1:4或者1:5。

此外可以将制备宿主工程化为表达重组纤维素小体(cellulosomes)，诸如在PCT申请第PCT/US2007/003736号中描述的那些，其允许制备宿主使用纤维素质作为碳源。例如，还可以将制备宿主工程化为表达转化酶(EC 3.2.1.26)，这样的话蔗糖就可以被用作碳源。

类似地，利用Ingram等人在美国专利第5,000,000号，第5,028,539号，第5,424,202号，第5,482,846号和第5,602,030号中描述的教导，制备宿主可以被工程化，这样的话制备宿主可以有效吸收碳并使用纤维素质作为碳源。

IV.生成后加工

可以从发酵培养基中分离发酵期间生成的脂肪酸衍生物。可以使用任何已知的从水介质分离脂肪酸衍生物的技术。本文提供的一个示例性分离法是两相(双相)分离法。该方法涉及在足以产生脂肪酸衍生物的条件下发酵遗传工程化的制备宿主，允许在有机相中收集衍生物并从水性发酵肉汤分离有机相。该方法可以在分批以及连续发酵环境下实施。

双相分离利用脂肪酸衍生物的相对不混溶性促进分离。不混溶是指化合物相对不能溶于水，由化合物的分配系数定义。分配系数P被定义为化合物在有机相(在双相系统中，有机相通常是生成过程中由脂肪酸衍生物形成的相，但是，在一些实例中可以提供有机相(诸如辛烷层以促进产物分离))中的平衡浓度除以水相(即发酵肉汤)中处于平衡状态的浓度。当描述两相系统时，通常采用logP来描述P。logP为10的化合物将为有机相分配10:1，而logP为0.1的化合物将为水相分配10:1。本领域普通技术人员将理解，通过选择发酵肉汤和有机相使生成的脂肪酸衍生物具有高logP值，即使发酵容器中的浓度非常低，脂肪酸衍生物也将进入有机相。

通过本文所述方法产生的脂肪酸衍生物在发酵肉汤以及细胞质中是相对不混溶的。因此，脂肪酸衍生物会在胞内或者胞外于有机相中聚集。产物在有机相中的聚集将削弱脂肪酸衍生物对细胞功能的影响，这将允许制备宿主产生更多的产物。换言之，脂肪酸衍生物的浓度不会对宿主细胞有显著的影响。

按照本文所述产生的脂肪醇、脂肪酸酯、蜡和烃允许均质化合物的制备，其中至少60％、70％、80％、90％或者95％的生成的脂肪醇、脂肪酸酯和蜡将具有相差小于4个碳或者小于2个碳的碳链长度。这些化合物还可以被制备为具有相对一致的饱和度，例如至少60％、70％、80％、90％或者95％的脂肪醇、脂肪酸酯、烃和蜡是单不饱和、双不饱和或者三不饱和的。这些化合物可以被直接用作燃料、个人护理添加剂、营养补剂。这些化合物还可以被用作后续反应的原料以制备其他产物，所述后续反应诸如酯交换，氢化，通过氢化、热裂解(pyrolisis)或者这两者的催化裂化，或者环氧化反应。

V.燃料成分

本文描述的脂肪酸衍生物可以被用作燃料。本领域普通技术人员将理解，根据燃料的预定目的，可以制备和使用不同的脂肪酸衍生物。例如，对于预期在寒冷气候中使用的汽车燃料，可能希望支化脂肪酸衍生物，因此利用本文提供的教导，可以制备支化烃、脂肪酸酯和醇。利用本文描述的方法，可以制备包括相对均质的脂肪酸衍生物的燃料，其具有需要的燃料质量。这类燃料可以用碳指纹法(carbonfingerprinting)进行表征，与石油衍生的燃料或者源自甘油三酯的生物柴油相比，它们不含杂质，此外，基于脂肪酸衍生物的燃料可以与其他燃料或者燃料添加剂组合以产生具有所需性质的燃料。

A.碳指纹法

生物制备的脂肪酸衍生物代表了用于燃料(诸如醇、柴油和汽油)的新原料。一些利用脂肪酸衍生物制备的生物燃料不是从可再生来源生成，这样的话，所述生物燃料是物质的新组合物。根据双碳同位素指纹法，可以将这些新的燃料与来自石化碳的燃料进行区分。此外，通过双碳同位素指纹法(参见，美国专利第7,169,588号，通过引用并入本文)，可以确定生物源碳(例如葡萄糖对甘油)的特定来源。

该方法有效的区别化学上相同的材料，并根据生物圈(植物)成分生长的来源(以及可能的年份)区分产物中的碳。同位素¹⁴C和¹³C为该问题提供补充信息。放射碳定年同位素(¹⁴C)，其核半衰期为5730年，可以清楚的区分碳样品是化石(“死的”)还是生物圈(“活的”)原料[Currie，L.A.＂Source Apportionment of Atmospheric Particles(大气颗粒来源区分)，＂Characterization of Environmental Particles(环境颗粒表征)，J.Buffle and H.P.van Leeuwen，Eds.，1 of Vol.I of the IUPACEnvironmental Analytical Chemistry Series(IUPAC环境分析化学系列I卷1版)(Lewis Publishers，Inc)(1992)374]。放射碳定年的基本假设是大气中¹⁴C浓度的恒定性导致活生物体中¹⁴C的恒定性。当处理分离的样品时，该样品的年代可以根据关系式t＝(-5730/0.693)ln(A/A.sub.O)(等式5)大致推断，其中t＝年代，5730年是放射性碳的半衰期，A和A.sub.O分别是样品和现代标准品的特定¹⁴C活性[Hsieh，Y.，Soil Sci..Soc.Am J.，56，460，(1992)]。但是，因为1950年以来的大气层核试验和1850年以来化石燃料的燃烧，¹⁴C获得第二种、地球化学时间特征。它在大气CO₂中的浓度--由此在活生物圈中的浓度--在60年代中期的核试验顶峰时大概加倍。此后其逐渐回归到大约1.2×10¹²的稳态宇生(大气)基本的同位素率(¹⁴C/¹²C)，具有7-10年的近似弛豫“半衰期”。(这后一半衰期不能从字面上理解；必须使用详细的大气核输入/衰变功能来追踪核时代开始后大气和生物圈¹⁴C的变化。)它是后一生物圈¹⁴C的时间特征，这保留了每年测定新近生物圈碳的年代的许诺。通过加速器质谱法(AMS)测量¹⁴C，结果用“现代碳分数”(f_M)的单位表示。f_M由国家标准技术研究院(National Institute of Standards andTechnology(NIST))标准参考物质(Standard Reference Materials(SRMs))4990B和4990C确定，它们分别被称为草酸标准品HOxI和HOxII。基本定义涉及0.95倍¹⁴C/¹²C同位素比HOxI(参照AD 1950)。这大致相当于衰变-校正的工业革命前的木材。对于当今的活生物圈(植物体)而言，f_M大约是1.1。

稳定的碳同位素比例(¹³C/¹²C)为鉴别和区分来源提供了互补途径。指定生物来源材料中的¹³C/¹²C比例是二氧化碳被固定时大气二氧化碳中¹³C/¹²C比例的结果，其也反映了准确的代谢途径。还存在区域性变化。石油，C3植物(阔叶)，C亚4植物(草)和海相碳酸盐的¹³C/¹²C以及对应的δ¹³C值都显示显著差异。此外，因为代谢途径，C3和C4植物的脂质分析不同于源于相同植物的糖组分的材料。在测量精度内，由于同位素分馏作用，¹³C显示大的变化，对于本发明来说最明显的就是光合机制。植物中碳同位素比差异的主要原因与植物中光合碳代谢途径的差异密切相关，尤其是初始羧化作用期间发生的反应，即大气CO₂的初步固定。植物的两大类是并入“C3”(或者Calvin-Benson)光合循环的植物和并入“C4”(或者Hatch-Slack)光合循环的植物。C3植物诸如硬木和针叶树，主要是在温带气候带。在C3植物中，初始CO₂固定或者羧化反应涉及核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶，第一稳定产物是3-碳化合物。另一方面，C4植物包括这类植物诸如热带草、玉米和甘蔗。在C4植物中，涉及另一种酶磷酸烯醇-丙酮酸羧化酶的其他羧化反应是初始羧化反应。第一稳定的碳化合物是4-碳酸，其随后被脱去羧基。如此释放的CO₂然后被C3循环再固定。

C4和C3植物均显示一定范围的¹³C/¹²C同位素比，但通常值是千分之约-10到-14(C4)和千分之约-21到-26(C3)[Weber et al.，J.Agric.Food Chem.，45，2942(1997)]。煤和石油通常落于后一范围。开始用白垩系皮狄组中美洲拟箭石化石(pee dee belemnite)(PDB)石灰石对¹³C测量尺度调零，其中以该材料的千分之偏差给出值。“Δ¹³C”，采用千分之(per mil)单位的值，缩写为％，按如下公式计算：

(等式6)

因为PDB参考物质(RM)已经被耗尽，通过与IAEA、USGS、NIST和其他挑选的国际同位素实验室的合作已经发展出一系列替代的RMs。与PDB千分偏差的标记是Δ¹³C。通过对44、45和46分子离子质量的高精度稳定比例质谱法(IRMS)测量CO₂。

根据¹⁴C(f_M)和双碳同位素指纹法，可以将脂肪酸衍生物以及相关生物燃料、化学制品和混合物与它们石化来源的对应物完全区分，指示物质的新组合物。

本文描述的脂肪酸衍生物可用于制备生物燃料和化学制品。根据双碳同位素指纹法，还可以区分本发明提供的基于新脂肪酸衍生物的产物组合物和只来自于石化来源的材料。区分这些产物的能力有益于在商业中追踪这些材料。例如，可以将包括“新”和“老”碳同位素图谱的燃料或者化学制品与只由“老”材料制备的燃料和化学制品进行区分。因此，当前材料可以在商业上进行跟踪，根据它们的独特的图谱，用于定义竞争和确定保存限期的目的。

在一些实例中，制备的生物燃料组合物包括具有大约-10.9到大约-15.4的δ¹³C的脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸衍生物占组合物中生物来源材料(源自可再生资源诸如纤维素质和糖)的至少大约85％。在其他实例中，生物燃料组合物包括具有以下化学式的脂肪酸衍生物

X——(CH(R))_nCH₃

其中X代表CH_3，-CH₂OR¹；-C(O)OR²；或者-C(O)NR³R⁴；

对于每个n，R独立的是不存在的、H或者低级脂肪族；

N是从8到34的整数，诸如从10到24；和

R¹，R²，R³和R⁴独立的选自H和低级烷基。通常，当R是低级脂肪族时，R代表分枝的、不分枝的或者环状的低级烷基或者低级烯基部分。示例性的R基团包括，但不限于，甲基，异丙基，异丁基，仲-丁基，环戊烯基等等。脂肪酸衍生物的特征还在于具有从大约-10.9到大约-15.4的δ¹³C；并且脂肪酸衍生物占组合物中生物来源材料的至少大约85％。在一些实例中，生物燃料组合物中脂肪酸衍生物的特征在于具有至少大约1.003、1.010或者1.5的现代碳分数(f_M ¹⁴C)。

B.脂肪酸衍生物

各种脂肪酸酯的十六烷值(CN)、粘性、熔点和燃烧热已经在例如Knothe，Fuel Processing Technology(燃料加工技术)86：1059-1070，2005中被表征，其通过引用并入本文。利用本文提供的教导，可以将制备宿主工程化为产生Knothe(Fuel Processing Technology 86：1059-1070，2005)描述的任意一种脂肪酸酯。

通过本文描述的制备宿主可以产生醇(短链，长链，支链或者不饱和的)。这类醇可以被直接用作燃料，或者它们可用于产生酯，即上文描述酯的A侧。这类酯可以单独的或者与本文描述的其他脂肪酸衍生物组合用作燃料。

类似地，从本文描述的微生物产生的烃也可以被用作生物燃料。可以将基于这类烃的燃料设计为包含分枝点，确定的饱和度以及特定的碳长度。当被单独或者与其他脂肪酸衍生物组合用作生物燃料时，烃还可以与添加剂或者其他传统燃料(醇，源自甘油三酯的柴油，和基于石油的燃料)组合。

C.杂质

本文描述的脂肪酸衍生物可用于制备生物燃料。这些脂肪酸衍生物从脂肪酸直接制备，而不是通过甘油三酯的化学加工制备。因此，包括所述脂肪酸衍生物的燃料包含的杂质少于一般衍生自甘油三酯的生物燃料，诸如衍生自植物油和脂肪的燃料。

本文描述的脂肪酸衍生物生物燃料(在将脂肪酸衍生物与其他燃料诸如传统燃料混合前)包含的转酯催化剂少于石化柴油或者生物柴油。例如，脂肪酸衍生物可以包含低于大约2％，1.5％，1.0％，0.5％，0.3％，0.1％，0.05％或者0％的转酯催化剂或者源自转酯催化剂的杂质。转酯催化剂包括例如，氢氧化物催化剂诸如NaOH、KOH、LiOH，和酸性催化剂，诸如无机酸催化剂和路易斯酸催化剂。催化剂和源自转酯催化剂的杂质包括，但不限于，锡，铅，汞，镉，锌，钛，锆，铪，硼，铝，磷，砷，锑，铋，钙，镁，锶，铀，钾，钠，锂，及其组合。

类似地，本文描述的粗脂肪酸衍生物生物燃料(在将脂肪酸衍生物与其他燃料诸如石化柴油或生物柴油混合前)包含的甘油(或者丙三醇)少于由甘油三酯制备的生物燃料。例如，脂肪酸衍生物可以包含低于大约2％，1.5％，1.0％，.5％，.3％，.1％，.05％或者0％的甘油。

源自脂肪酸衍生物的粗生物燃料包含的游离醇(即用于产生酯的醇)也少于由甘油三酯制备的生物柴油。这部分归因于制备宿主利用醇的效率。例如，脂肪酸衍生物包含低于大约2％，1.5％，1.0％，.5％，.3％，.1％，.05％或者0％的游离醇。

源自所述脂肪酸衍生物的生物燃料的特征还可以在于，其硫浓度低于石油衍生的柴油。例如，源自脂肪酸衍生物的生物燃料具有低于大约2％，1.5％，1.0％，.5％，.3％，.1％，.05％或者0％的硫。

D.添加剂

燃料添加剂用于增强燃料或者发动机的性能。例如，燃料添加剂可用于改变冰点/胶凝点，浊点，润滑性，粘性，抗氧化性，发火性，辛烷值和闪点。在美国，所有的燃料添加剂必须在环境保护局(Environmental Protection Agency)登记，通过代理商的网站以及联系代理商可以公开获得出售燃料添加剂的公司和燃料添加剂的名称。本领域普通技术人员将理解，本文描述的脂肪酸衍生物可以与一种或者多种这类添加剂混合以提供需要的质量。

本领域普通技术人员还将理解，本文描述的脂肪酸衍生物可以与其他燃料混合，诸如源自甘油三酯的生物柴油，各种醇诸如乙醇和丁醇，以及石油衍生的产物诸如汽油。在一些实例中，制备具有低胶凝点的脂肪酸衍生物，诸如C16:1乙酯或者C18:1乙酯。将这种低胶凝点的脂肪酸衍生物与由甘油三酯制备的生物柴油混合以降低燃料的总胶凝点。类似地，可以将脂肪酸衍生物诸如C16:1乙酯或者C18:1乙酯与石油衍生的柴油混合以提供至少5％和经常大于5％的生物柴油的混合物。在一些实例中，混合物包括至少20％或者更多的脂肪酸衍生物。

例如，可以将生物燃料组合物制备成包括至少大约20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％或者95％的脂肪酸衍生物，所述脂肪酸衍生物包括8:0，10:0，12:0，14:0，14:1，16:0，16:1，18:0，18:1，18:2，18:3，20:0，20:1，20:2，20:3，22:0，22:1或者22:3的碳链。这类生物燃料组合物还可以包括至少一种选自以下物质的添加物：可以将浊点降低到低于约5℃或者约0℃的浊点降低添加剂，表面活性剂，或者微乳剂，至少大约5％，10％，15％，20％，30％，40％，50％，60％，70％或者80％，85％，90％，或者95％的来自甘油三酯的柴油燃料，石油衍生的汽油或者来自石油的柴油燃料。

实施例

图1是FAS途径示意图，显示直接参与酰基-ACP合成的酶。为了增加蜡/脂肪酸酯和脂肪醇的产生，可以过表达或者突变一种或者多种酶以减少反馈抑制。此外，代谢中间物产生基于非脂肪酸的产物(副反应)的酶可以被功能性缺失或者弱化以增加通过脂肪酸生物合成途径的碳通量。下面的实施例1、2和8提供示例性的制备宿主，所述制备宿主已经被工程化以增加脂肪酸产生。

图2、图3和图4分别显示可以被工程化以产生脂肪醇和蜡/脂肪酸酯的生物合成途径。如图2所示，可以利用数种不同的多肽实现各种底物(乙酰辅酶A，丙二酰辅酶A，酰基-ACP，脂肪酸，和酰基辅酶A)向各种产物(乙酰辅酶A，丙二酰辅酶A，酰基-ACP，脂肪酸，和酰基辅酶A)的转变。下面的实施例描述了已经被工程化或者可以被工程化产生特定脂肪醇和蜡/脂肪酸酯和烃的微生物。

实施例1，制备宿主构建

一个示例性的制备宿主是LS9001。通过修饰Overexpress.com(Saint Beausine，France)的C41(DE3)以功能性缺失fadE基因(酰基辅酶A脱氢酶)，制备LS9001。

简单来说，利用引物YafV_NotI和Ivry_O1扩增大约830bp的fadE上游，以及利用引物Lpcaf_ol和LpcaR_Bam扩增大约960bp的fadE下游，制备大肠杆菌的fadE敲除菌株。使用重叠PCR产生读框内缺失完整fadE基因的构建体。将fadE缺失构建体克隆入温度敏感质粒pKOV3，其包含用于反选择的SacB基因，并按照Link等人(J.Bact.179：6228-6237，1997)的方法实现fadE的染色体缺失。所获菌株无法降解脂肪酸和脂酰辅酶A(该功能缺失在本文中被称为ΔfadE)。

制备宿主可以包括的其他修饰包括，引入载有4种负责大肠杆菌中乙酰辅酶A羧化酶活性的基因(accA，B，C，和D，登录号：NP_414727，NP_417721，NP_417722，NP_416819，EC 6.4.1.2)的质粒。分两步将accABCD基因作为双顺反子(bicistronic)操纵子克隆入pACYCDuet-1(Novagen，Madison，WI)的NcoI/HindIII和NdeI/AvrII位点，所获质粒被称为pAS004.126。

制备宿主可以包括的其他修饰包括以下：aceEF(编码丙酮酸盐和2-酮戊二酸脱氢酶复合物的E1p脱氢酶组分和E2p二氢硫辛酰胺酰基转移酶组分)的过表达；和来自本领域已知编码这类蛋白的任意生物的fabH/fabD/fabG/acpP/fabF(编码FAS)等等可以在制备宿主中被表达，所述生物包括例如大肠杆菌，欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonaseuropaea)(ATCC 19718)，枯草芽孢杆菌，酿酒酵母，链霉菌，雷尔氏菌，红球菌，棒状杆菌，短杆菌，分支杆菌，油脂性酵母。类似地，可以将制备宿主工程化为表达豌豆(Pisum savitum)的accABCD(编码乙酰辅酶A羧化酶)以取代大肠杆菌同系物，或者除了大肠杆菌同系物之外再表达。但是，当制备宿主也产生丁醇时，较不希望表达豌豆同系物。

在一些示例性的制备宿主中，可以利用Link等人(J.Bacteriol.179：6228-6237，1997)的方法敲除或者弱化基因。例如，可以被敲除或者弱化的基因包括gpsA(编码生物合成sn-甘油3-磷酸脱氢酶，登录号NP_418065，EC：1.1.1.94)；ldhA(编码乳酸脱氢酶，登录号NP_415898，EC：1.1.1.28)；pflb(编码甲酸盐乙酰基转移酶1，登录号：P09373，EC：2.3.1.54)；adhE(编码醇脱氢酶，登录号：CAA47743，EC：1.1.1.1，1.2.1.10)；pta(编码磷酸转乙酰酶，登录号：NP_416800，EC：2.3.1.8)；poxB(编码丙酮酸氧化酶，登录号：NP_415392，EC：1.2.2.2)；ackA(编码醋酸盐激酶，登录号：NP_416799，EC：2.7.2.1)及其组合。

类似地，利用上述用于fadE缺失的方法，可以将PlsB[D311E]突变引入LS9001以弱化PlsB。一旦被引入，该突变将减少碳向磷脂产生转向的量(参见，图1)。简单来说，通过用谷氨酸的GAA密码子取代天冬氨酸311的GAC密码子，制备编码PlsB[D311E]的等位基因。通过基因合成制备被改变的等位基因，利用Link等人的方法(参见上文)将染色体plsB野生型等位基因替换为突变的plsB[D311E]等位基因。

实施例2，制备宿主修饰

构建下列质粒用于表达各种蛋白，所述蛋白被用于合成脂肪酸衍生物。利用标准分子生物学方法制备构建体，所有被克隆的基因均在IPTG-诱导型启动子(T7，tac或者lac启动子)的控制下。

将大肠杆菌的‘tesA基因(硫酯酶A基因，登录号NP_415027，不含前导序列(Cho and Cronan，The J.ofBiol.Chem.，270：4216-9，1995，EC：3.1.1.5，3.1.2.-)克隆入NdeI/AvrII消化的pETDuet-1(本文描述的pETDuet-1购自Novagen，Madison，WI)。将编码加利福尼亚桂树(Umbellularia California)、萼距花(Cuphea hookeriana)和樟树(Cinnamonum camphorum)的FatB型植物硫酯酶(TEs)的基因(登录号：UcFatB1＝AAA34215，ChFatB2＝AAC49269，ChFatB3＝AAC72881，CcFatB＝AAC49151)分别克隆入3种不同的载体：(i)NdeI/AvrII消化的pETDuet-1，(ii)XhoI/HindIII消化的pBluescript KS+(Stratagene，LaJolla，CA)(用于产生N端lacZ::TE融合蛋白)和(iii)XbaI/HindIII消化的pMAL-c2X(New England Lab，Ipswich，MA)(用于产生n端MalE::TE融合)。将大肠杆菌的fadD基因(编码酰基辅酶A合成酶)克隆入NcoI/HindIII消化的pCDFDuet-1衍生物，所述衍生物在其NdeI/AvrII位点内包含不动杆菌ADP1的acr1基因(酰基辅酶A还原酶)。表7提供用于制备数个示例性制备菌株的质粒的概述，本领域普通技术人员将理解可以使用不同的质粒和基因组修饰获得类似的菌株。

表7

制备宿主中使用的质粒概述

 

质粒	生物来源基因产物	登录号，EC号
			pETDuet-1-tesA	大肠杆菌TesA	登录号：NP_415027，EC：3.1.1.5，3.1.2.-
pETDuet-1-TEucpBluescript-TEucpMAL-c2X-TEuc	加利福尼亚桂树UcFatB1	Q41635AAA34215
			pETDuet-1-TEchpBluescript-TEchpMAL-c2X-TEch	萼距花ChFatB2ChFatB3	ABB71581AAC49269AAC72881
pETDuet-1-TEccpBluescript-TEccTEci	樟树CcFatB	AAC49151
			pCDFDuet-1-fadD-acr1	大肠杆菌	fadD：登录号NP_416319，EC 6.2.1.3acr1：登录号YP_047869

挑选的表达质粒包含相容的复制子和抗生素抗性标志物，这样的话可以建立4质粒表达系统。因此，可以用(i)任意TE表达质粒，(ii)FadD表达质粒，其也表达acr1和(iii)蜡合酶表达质粒共转化LS9001。当用IPTG诱导时，所获菌株从碳源诸如葡萄糖产生脂肪醇的浓度将增加。生成的脂肪醇的碳链长度和饱和度取决于表达的硫酯酶基因。

实施例3，脂肪醇在重组大肠杆菌菌株中的产生

通过在制备宿主中外源表达硫酯酶基因和酰基辅酶A还原酶基因(FAR)，产生脂肪醇。更具体的，将质粒pCDFDuet-1-fadD-acr1(酰基辅酶A还原酶)和pETDuet-1-′tesA(硫酯酶)转化入大肠杆菌菌株LS9001(实施例1中描述)，在添加100mg/L壮观霉素和50mg/L羧苄青霉素的LB板中挑选对应的转化体。将LS9001/pCDFDuet-1-fadD-acr1的4个转化体分别接种3mL添加50mg/L羧苄青霉素和100mg/L壮观霉素的M9培养基。包含所述转化体的样品在25℃的振荡器(250rpm)上生长，直到它们达到0.5OD₆₀₀。每种样品取1.5mL转移入包含30mL上述培养基的250mL烧瓶中。所获培养物在25℃的振荡器上生长，直到培养物达到0.5-1.0OD₆₀₀。然后添加IPTG到1mM的终浓度，继续生长40小时。

然后在4000rpm离心细胞，并将细胞沉淀悬浮于1.0mL甲醇中。然后将3mL乙酸乙酯与悬浮细胞混合。然后向混合物中添加3mLH₂O，并用超声处理所述混合物20分钟。在4000rpm离心所获样品5分钟，将包含脂肪醇的有机相(上层相)进行GC/MS分析。全部醇(包括十四醇、十六醇、十六碳烯醇和十八碳烯醇)的产量大约是1-10mg/L。当以相同方式培养只载有空载体的大肠杆菌菌株时，在乙酸乙酯提取物中只发现了0.2-0.5mg/L的脂肪醇。

实施例4，脂肪醇在制备宿主的产生和释放

在大肠杆菌中表达Acr1(酰基辅酶A还原酶)，所述大肠杆菌仅依靠葡萄糖作为唯一的碳源和能源生长。大肠杆菌产生少量的脂肪醇诸如十二醇(C12:0-OH)，十四醇(C14:0-OH)和十六醇(C16:0-OH)。在其他样品中，FadD(酰基辅酶A合成酶)与acr1在大肠杆菌中一起表达，观察到脂肪醇生成增加5倍。

在其他样品中，在野生型大肠杆菌C41(DE3)和大肠杆菌C41(DE3 ΔfadE)(缺失酰基辅酶A脱氢酶的菌株)中表达acr1、fadD、accABCD(乙酰辅酶A羧化酶)(如实施例1所述构建的载有accABCD的质粒)以及各种不同的硫酯酶(TEs)。这导致脂肪醇生成的额外增加并调节脂肪醇模式(参见图5)。例如，大肠杆菌′tesA(pETDuet-1-′tesA)在该系统的过表达实现C12:0-OH、C14:0-OH和C16:0-OH的大约60倍增加，其中C14:0-OH是主要的脂肪醇。当表达ChFatB3酶(pMAL-c2X-TEcu中来自萼距花的FatB3)，获得非常类似的结果。当表达UcFatB1酶(pMAL-c2X-TEuc中来自加利福尼亚桂树的FatB1)时，脂肪醇生成增加大约20倍，并且C12:0-OH是主要的脂肪醇。

ChFatB3和UcFatB1表达还分别导致显著量不饱和脂肪醇C16:1-OH和C14:1-OH的生成。在利用tesA表达产生的样品上清中也发现了脂肪醇的存在(图6)。在37℃发现上清和细胞沉淀中脂肪醇的量近似相等，而在25℃发现大约25％的脂肪醇在上清中。

实施例5，中链脂肪酸酯

醇乙酰转移酶(AATs，EC 2.3.1.84)，其负责各种植物中的酰基乙酸酯制备，可用于产生中等链长度的蜡，诸如辛酸辛酯，辛酸癸酯，癸酸癸酯，等等。从中链醇(诸如C6、C8)合成的脂肪酯和中链酰基辅酶A(或者脂肪酸，诸如C6或者C8)具有相对低的熔点。例如，己酸己酯具有-55℃的熔点，而辛酸辛酯具有-18℃到-17℃的熔点。这些化合物的低熔点使它们成为生物燃料的良好候选物。

在该实施例中，SAAT基因与大肠杆菌的fadD和acr1(不动杆菌ADP1的醇还原酶)在制备宿主C41(DE3，ΔfadE)中共表达，并向发酵肉汤中提供辛酸。这导致辛酸辛酯的生成。类似地，当在制备宿主中表达不动杆菌ADP1的蜡合酶基因以替代SAAT基因时，产生辛酸辛酯。

利用DNA 2.0(Menlo Park，CA 94025)合成重组SAAT基因。合成的DNA基于公开的基因序列(登录号AF193789)，并被修饰以去除NcoI位点。将合成的SAAT基因(作为BamHI-HindIII片段)克隆入用BamHI和HindIII线性化的pRSET B(Invitrogen，Calsbad，California)。将所获质粒pHZ1.63A与pAS004.114B共转化大肠杆菌制备宿主，其载有大肠杆菌的fadD基因和不动杆菌ADP1的acr1基因。所述转化体在3mL含有2％葡萄糖的M9培养基中生长。在IPTG诱导和添加0.02％辛酸后，在25℃继续培养40小时。然后，向全培养物中添加3mL乙酰乙酸酯，并用混合器混合若干次。利用GC/MS分析乙酰乙酸酯相。

令人惊讶的是，在乙酰乙酸酯提取物中没有发现酰基乙酸酯。但是，发现新化合物，该化合物是辛酸辛酯。而不含SAAT基因的对照菌株[C41(DE3，ΔfadE)/pRSET B+pAS004.114B]不产生辛酸辛酯。菌株[C41(DE3，ΔfadE)/pHZ1.43B+pAS004.114B]也产生辛酸辛酯，其中pHZ1.43载有不动杆菌ADP1的蜡合酶基因(参见图7B)。

以前没有关于SAAT活性产生辛酸辛酯的报道，该发现使制备中链蜡诸如辛酸辛酯、辛基癸酸成为可能，它们具有低熔点，是取代基于甘油三酯的生物柴油的生物燃料的良好候选物。

实施例6，蜡酯在大肠杆菌菌株LS9001中的产生

通过工程化大肠杆菌制备宿主表达脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶、硫酯酶和蜡合酶，产生蜡酯。因此，制备宿主产生酯的A侧和B侧两者，而两侧的结构均受硫酯酶基因表达的影响。

更具体地，利用不动杆菌ADP1的基因组DNA作为模板，通过下列引物扩增不动杆菌ADP1的蜡合酶(称为WSadp1，登录号AA017391，EC：2.3.175)。所述引物是(1)WSadp1_NdeI，5’-TCATATGCGCCCA TTACATCCG-3’和(2)WSadp1_Avr，5’-TCCTAGGAGGGCTAATTT AGCCCTTTAGTT-3’。PCR产物用NdeI和AvrII消化，并被克隆入pCOALDeut-1得到pHZ1.43。将载有WSadp1的质粒与pETDuet-1′tesA和pCDFDuet-1-fadD-acr1共转化大肠杆菌菌株LS9001，在添加50mg/L卡那霉素、50mg/L羧苄青霉素和100mg/L壮观霉素的LB板中挑选转化体。将3个转化体接种于3mL LBKCS(添加50mg/L卡那霉素、50mg/L羧苄青霉素、100mg/L壮观霉素和10g/L葡萄糖的LB肉汤)，在37℃振荡器(250rpm)上培养。当培养物达到0.5OD₆₀₀时，将1.5mL各种培养物转移到250mL包含50mL LBKCS的烧瓶中，让烧瓶在37℃的振荡器(250rpm)上生长，直至培养物达到0.5-1.0OD₆₀₀。然后添加IPTG到1mM的终浓度。所述被诱导的培养物在37℃振荡器上再生长40-48小时。

然后将培养物放入50mL锥形管中，将细胞以3500×g离心10分钟。然后将细胞沉淀与5mL乙酸乙酯混合。利用GC/MS分析乙酸乙酯提取物。蜡(包括C16C16，C14:1C16，C18:1C18:1，C2C14，C2C16，C2C16:1，C16C16:1和C2C18:1)的胞内产量大约是10mg/L。当以相同方式培养只载有空载体的大肠杆菌菌株时，在乙酸乙酯提取物中只发现了0.2mg/L的蜡。

实施例7，脂肪-乙酯在制备宿主中的产生和释放

通过用载有不动杆菌的蜡合酶基因(质粒pHZ1.43)、萼距花的硫酯酶基因(质粒pMAL-c2X-TEcu)和大肠杆菌的fadD基因(质粒pCDFDuet-1-fadD)的质粒转化LS9001菌株，实现对该菌株的修饰。该重组菌株在25℃ 3mL含有50mg/L卡那霉素、100mg/L羧苄青霉素和100mg/L壮观霉素的M9培养基中生长。在IPTG诱导后，将培养基调节到1％乙醇和2％葡萄糖的终浓度。IPTG诱导后让培养物生长40小时。通过在3500×g离心10分钟，从消耗的培养基分离细胞。用3mL M9培养基重悬细胞沉淀。然后用1个体积的乙酸乙酯提取细胞悬液和消耗的培养基。对来自细胞悬液和上清的所获乙酸乙酯相进行GC-MS分析。结果显示C16乙酯是最主要的酯(与对这种硫酯酶的预期一致，参见表1)，并且生成脂肪酸酯的20％从细胞释放(参见图8)。包含pCOLADuet-1(蜡合酶基因的空载体)、pMAL-c2X-TEuc(包含加利福尼亚桂树的fatB)和pCDFDuet-1-fadD(大肠杆菌的fadD基因)的对照大肠杆菌菌株C41(DE3，ΔfadE)未能产生可检测量的脂肪乙酯。利用商品化的棕榈酸乙酯作为参照定量脂肪酸酯。除了向发酵肉汤中添加甲醇或者异丙醇以外，还利用本文描述的的方法制备脂肪酸酯，产生预期的脂肪酸酯。

实施例8，各种硫酯酶对重组大肠杆菌菌株产生的脂肪乙酯组合物的影响。

硫酯酶FatB3(萼距花)、TesA(大肠杆菌)和FatB(加利福尼亚桂树)与蜡合酶(不动杆菌)同时被表达。通过用pHZ1.43的NotI-AvrII片段替换NotI-AvrII片段(载有acr1基因)，构建称为pHZ1.61的质粒，这样的话fadD和ADP1蜡合酶位于同一质粒中，并且两条编码序列均处于分离的T7启动子控制下。pHZ1.61的构建使利用两质粒系统替代实施例6描述的三质粒系统成为可能。然后将pHZ1.61与载有上述不同硫酯酶基因的各种质粒中的一种共转化大肠杆菌C41(DE3，ΔfadE)。

利用本文描述的技术测定这些转化体产生的总脂肪酸乙酯(上清和胞内的脂肪酸乙酯)。脂肪酸乙酯的产量和组合物概述于表8。

表8

重组大肠杆菌C41(DE3，ΔfadE)/pHZ1.61和载有各种硫酯酶基因的质粒产生的脂肪酸乙酯的产量(mg/L)和组合物。

 

硫酯酶	C2C10	C2C12:1	C2C12	C2C14:1	C2C14	C2C16:1	C2C16	C2C18:1	总
										‘TesA	0.0	0.0	6.5	0.0	17.5	6.9	21.6	18.1	70.5
ChFatB3	0.0	0.0	0.0	0.0	10.8	12.5	11.7	13.8	48.8
										ucFatB	6.4	8.5	25.3	14.7	0.0	4.5	3.7	6.7	69.8
pMAL	0.0	0.0	0.0	0.0	5.6	0.0	12.8	7.6	26.0

注释：‘TesA，pETDuet-1-‘tesA；chFatB3，pMAL-c2X-TEcu；ucFatB，pMAL-c2X-TEuc；pMAL，pMAL-c2X，用于本研究所用硫酯酶的空载体。

实施例9，制备宿主构建

控制脂肪酸产生的基因在微生物之间是保守的。例如，表9鉴定了本文描述的许多基因的同系物，已知它们在产生烃的微生物中表达。为了增加诸如表9所示的那些微生物中脂肪酸的产生，从而增加烃的产生，可以表达异源基因，诸如那些来自大肠杆菌的基因。本领域普通技术人员还将理解，也可以利用本文描述的方法过表达或者弱化表9所示微生物的内源性基因。此外，可以在内源性产生烃的微生物中表达或者弱化图10描述的基因，以产生具有确定碳链长度、饱和点和分枝点的特定烃。

例如，将编码乙酰辅酶A羧化酶的外源核酸序列引入K.radiotolerans。下列基因包括K.radiotolerans的乙酰辅酶A羧化酶蛋白产物，乙酰辅酶A羧化酶，α亚基(accA/ZP_00618306)，乙酰辅酶A羧化酶，生物素羧基载体蛋白(accB/ZP_00618387)，乙酰辅酶A羧化酶，生物素羧化酶亚基(accC/ZP_00618040)，和乙酰辅酶A羧化酶，β(羧基转移酶)亚基(accD/ZP_00618306)。将这些基因克隆入质粒，这样的话制备出受Kradiotolerans表达系统控制的合成乙酰辅酶A羧化酶操纵子(accABCD)，所述表达系统诸如Ruyter等人(Appl EnvironMicrobiol.62：3662-3667，1996)公开的表达系统。将所述质粒转化K.radiotolerans将增强脂肪酸产生。还可以利用本文公开的方法，将K.radiotolerans的烃产生菌株工程化为产生具有特定碳链长度的支化不饱和烃。

表9

烃制备宿主

生物                      基因名    登录号/Seq ID/基因座       EC号

脱硫脱硫弧菌 G20           accA     YP_388034                  6.4.1.2

                                                               6.3.4.14，

脱硫脱硫弧菌 G22           accC     YP_388573/YP_388033        6.4.1.2

脱硫脱硫弧菌 G23           accD     YP_388034                  6.4.1.2

脱硫脱硫弧菌 G28           fabH     YP_388920                  2.3.1.180

脱硫脱硫弧菌 G29           fabD     YP_388786                  2.3.1.39

脱硫脱硫弧菌 G30           fabG     YP_388921                  1.1.1.100

                                                               3.1.26.3，

脱硫脱硫弧菌 G31           acpP     YP_388922/YP_389150        1.6.5.3，

                                                               1.6.99.3

脱硫脱硫弧菌 G32           fabF     YP_388923                  2.3.1.179

脱硫脱硫弧菌 G33           gpsA     YP_389667                  1.1.1.94

                                                               1.1.1.27，

脱硫脱硫弧菌 G34           ldhA     YP_388173/YP_390177        1.1.1.28

梨火疫病菌(微球菌)(Erwinia accA     942060-943016              6.4.1.2

(micrococcus)amylovora)

梨火疫病菌(微球菌)           accB           3440869-3441336       6.4.1.2

梨火疫病菌(微球菌)           accC           3441351-3442697       6.3.4.14，

                                                                  6.4.1.2

梨火疫病菌(微球菌)           accD           2517571-2516696       6.4.1.2

梨火疫病菌(微球菌)           fadE           1003232-1000791       1.3.99.-

梨火疫病菌(微球菌)           plsB(D311E)    333843-331423         2.3.1.15

梨火疫病菌(微球菌)           aceE           840558-843218         1.2.4.1

梨火疫病菌(微球菌)           aceF           843248-844828         2.3.1.12

梨火疫病菌(微球菌)           fabH           1579839-1580789       2.3.1.180

梨火疫病菌(微球菌)           fabD           1580826-1581749       2.3.1.39

梨火疫病菌(微球菌)           fabG           CAA74944              1.1.1.100

                                                                  3.1.26.3，

梨火疫病菌(微球菌)           acpP           1582658-1582891       1.6.5.3，

                                                                  1.6.99.3

梨火疫病菌(微球菌)           fabF           1582983-1584221       2.3.1.179

梨火疫病菌(微球菌)           gpsA           124800-125810         1.1.1.94

                                                                  1.1.1.27，

梨火疫病菌(微球菌)           ldhA           1956806-1957789       1.1.1.28

Kineococcus   radiotolerans

SRS30216                     accA           ZP_00618306           6.4.1.2

Kineococcus   radiotolerans

SRS30216                     accB           ZP_00618387           6.4.1.2

Kineococcus   radiotolerans                 ZP_00618040            6.3.4.14，

SRS30216                     accC           /ZP_00618387           6.4.1.2

Kineococcus   radiotolerans

SRS30216                     accD           ZP_00618306            6.4.1.2

Kineococcus   radiotolerans

SRS30216                     fadE           ZP_00617773            1.3.99.-

Kineococcus   radiotolerans

SRS30216                     plsB(D311E)    ZP_00617279            2.3.1.15

Kineococcus   radiotolerans

SRS30216                     aceE           ZP_00617600            1.2.4.1

Kineococcus   radiotolerans

SRS30216                     aceF           ZP_00619307            2.3.1.12

Kineococcus   radiotolerans

SRS30216                     fabH           ZP_00618003            2.3.1.180

Kineococcus   radiotolerans

SRS30216                     fabD           ZP_00617602            2.3.1.39

Kineococcus   radiotolerans

SRS30216                     fabG           ZP_00615651            1.1.1.100

Kineococcus   radiotolerans  acpP           ZP_00617604            3.1.26.3，

SRS30216                                                1.6.5.3，

                                                        1.6.99.3

Kineococcus  radiotolerans

SRS30216               fabF       ZP_00617605           2.3.1.179

Kineococcus  radiotolerans

SRS30216               gpsA       ZP_00618825           1.1.1.94

Kineococcus  radiotolerans                              1.1.1.27，

SRS30216               ldhA       ZP_00618879           1.1.1.28

深红红螺菌(Rhodospirillum

rubrum)                accA       YP_425310             6.4.1.2

深红红螺菌             accB       YP_427521             6.4.1.2

                                  YP_427522/YP_425144/

                                  YP_427028/YP_426209/  6.3.4.14，

深红红螺菌             accC       YP_427404             6.4.1.2

深红红螺菌             accD       YP_428511             6.4.1.2

深红红螺菌             fadE       YP_427035             1.3.99.-

深红红螺菌             aceE       YP_427492             1.2.4.1

深红红螺菌             aceF       YP_426966             2.3.1.12

深红红螺菌             fabH       YP_426754             2.3.1.180

深红红螺菌             fabD       YP_425507             2.3.1.39

深红红螺菌             fabG       YP_425508/YP_425365   1.1.1.100

                                                        3.1.26.3，

                                                        1.6.5.3，

深红红螺菌             acpP       YP_425509             1.6.99.3

                                  YP_425510/YP_425510

深红红螺菌             fabF       /YP_425285            2.3.1.179

深红红螺菌             gpsA       YP_428652             1.1.1.94

                                                        1.1.1.27，

深红红螺菌             ldhA       YP_426902/YP_428871   1.1.1.28

弗尼斯弧菌             accA       1，16                 6.4.1.2

弗尼斯弧菌             accB       2，17                 6.4.1.2

                                                        6.3.4.14，

弗尼斯弧菌             accC       3，18                 6.4.1.2

弗尼斯弧菌             accD       4，19                 6.4.1.2

弗尼斯弧菌             fadE       5，20                 1.3.99.-

弗尼斯弧菌             plsB(D311E)6，21                 2.3.1.15

弗尼斯弧菌             aceE       7，22                 1.2.4.1

弗尼斯弧菌             aceF       8，23                 2.3.1.12

弗尼斯弧菌             fabH       9，24                 2.3.1.180

弗尼斯弧菌             fabD       10，25                2.3.1.39

弗尼斯弧菌             fabG       11，26                1.1.1.100

弗尼斯弧菌             acpP       12，27                3.1.26.3，

                                                              1.6.5.3，

                                                              1.6.99.3

弗尼斯弧菌               fabF          13，28                 2.3.1.179

弗尼斯弧菌               gpsA          14，29                 1.1.1.94

                                                              1.1.1.27，

弗尼斯弧菌               ldhA          15，30                 1.1.1.28

嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3  accA          ZP_01643799            6.4.1.2

嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3  accB          ZP_01644036            6.4.1.2

                                                              6.3.4.14，

嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3  accC          ZP_01644037            6.4.1.2

嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3  accD          ZP_01644801            6.4.1.2

嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3  fadE          ZP_01645823            1.3.99.-

嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3  plsB(D311E)   ZP_01644152            2.3.1.15

嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3  aceE          ZP_01644724            1.2.4.1

嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3  aceF          ZP_01645795            2.3.1.12

嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3  fabH          ZP_01643247            2.3.1.180

嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3  fabD          ZP_01643535            2.3.1.39

嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3  fabG          ZP_01643062            1.1.1.100

                                                              3.1.26.3，

                                                              1.6.5.3，

嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3  acpP          ZP_01643063            1.6.99.3

嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3  fabF          ZP_01643064            2.3.1.179

嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3  gpsA          ZP_01643216            1.1.1.94

                                                              1.1.1.27，

嗜麦芽窄食单胞菌 R551-3  ldhA          ZP_01645395            1.1.1.28

对于表9，登录号来自于GenBank，2007年4月15号Release 159.0，

EC编号来自于KEGG，2007年4月Release 42.0(加上每日更新直至并包括05/09/07)，梨火疫病菌菌株Ea273的结果来自于Sanger测序中心，5/9/07的完整鸟枪序列，欧文氏菌(Erwinia)的位置代表Sanger假染色体上的位置，弗尼斯弧菌M1的序列来自于LS9 VFM1假染色体，v2完成，9/28/06，并且包括完整的基因，还可能包括侧翼序列。

实施例10，其他示例性制备菌株

下面的表10提供其他的示例性制备菌株。描述了两种产生脂肪酸、脂肪醇和蜡酯的示例性生物合成途径。通过将大肠杆菌的accABCD基因、大肠杆菌的′tesA基因和大肠杆菌的fadD基因的表达克隆入宿主细胞，可以产生遗传工程化的宿主。宿主细胞可以选自大肠杆菌、酵母，将它们添加到该表中。还可以将这些基因转化宿主细胞，所述宿主细胞被修饰以包含上面实施例1和2描述的一个或者多个遗传操作。如表10所示，可以利用指定的外源基因产生其他的制备宿主。

表10

用于制备遗传工程化制备菌株的基因组合

实施例11，发酵

可以将宿主微生物工程化为表达在pBAD24中prpBCDE启动子系统下来自大肠杆菌的umuC和umuD，其通过该基因与合适终产物制备基因的从头合成。对于小规模的烃产物制备，将载有pBAD24(具有氨苄青霉素抗性和终产物合成途径)以及pUMVC1(具有卡那霉素抗性和乙酰辅酶A/丙二酰辅酶A过表达系统)的大肠杆菌BL21(DE3)细胞在2L烧瓶的500ml LB培养基中37℃振荡>200rpm孵育过夜，所述LB培养基添加有75μg/mL氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素，直到培养物达到OD₆₀₀>0.8。当实现OD₆₀₀>0.8时，向细胞中添加25mM丙酸钠(pH 8.0)，以激活用于制备的工程化基因系统并且停止细胞增殖(通过umuC和umuD蛋白的激活)。诱导在30℃进行6小时。孵育后，利用GC-MS(如下所述)检查培养基中的产物。

对于大规模产物制备，工程化的微生物在10L、100L或者更大的批次中生长，发酵，并酌情根据质粒中编码的特定基因而诱导表达所需产物。将载有pBAD24(具有氨苄青霉素抗性和终产物合成途径)以及pUMVC1(具有卡那霉素抗性和乙酰辅酶A/丙二酰辅酶A过表达系统)的大肠杆菌BL21(DE3)细胞，在LB培养基(无甘油)中37℃振荡>200rpm孵育，500mL种子培养物用于10L发酵(5L用于100L发酵)，直到与75μg/mL氨苄青霉素和50μg/ml卡那霉素孵育的培养物达到OD₆₀₀>0.8(通常16小时)。通过连续添加维持培养基中25mM丙酸钠(pH 8.0)，以激活用于制备的工程化基因系统并且停止细胞增殖(通过umuC和umuD蛋白的激活)。向培养基中连续添加葡萄糖以维持90g/100mL的浓度。诱导1小时后，每小时取出不超过总细胞体积10％的等份式样，并保持不搅动，以便烃产物上升到表面并经历自发的相分离。然后收集烃组分，并将水相返回反应室。反应室连续运作。当OD₆₀₀降低到0.6以下时，用来源于种子培养物的新批次替换细胞。

对于蜡酯制备，分离后，用1M HCl简单洗涤蜡酯以打开酯键，然后用蒸馏水彻底洗涤恢复到pH 7。

实施例12，产物表征

为了表征和定量脂肪醇和脂肪酸酯，使用电子碰撞质谱(MS)与气相色谱法(GC)联合的检测法。首先用过量的的N-三甲基硅烷(TMS)咪唑衍生化脂肪醇样品以增加检测灵敏度。脂肪酸酯不需要衍生化。将脂肪醇-TMS衍生物和脂肪酸酯溶于合适的挥发性溶剂，诸如乙酸乙酯。利用下列方法在30m DP-5毛细管柱上分析样品。无分流注射1μL到GC/MS柱后，将烘箱维持在100℃ 3分钟。按照20℃/分钟的速率将温度升至320℃。烘箱在320℃再维持5分钟。载气氦的流速是1.3mL/分钟。MS四极式扫描50-550m/z。将产物峰的保留时间和裂解谱与可靠参照进行比较以证实峰的同一性。

例如，十六烷酸乙酯在10.18分钟洗脱(图9A和图9B)。非常容易的观察到284质量单位的母离子。更多的是质谱裂解期间产生的子离子。这包括最普遍的80质量单位的子离子。衍生化脂肪醇十六醇-TMS在10.29分钟洗脱，可以观察到313的母离子。最普遍的离子是299质量单位的M-14离子。

利用如上所述的GC/MS方法，通过注射各种浓度的合适可靠参照进行定量。该信息用于绘制应答(总积分的离子计数)相对浓度的标准曲线。

等同

当本发明的具体实例在本文中明确公开时，上述说明书和本文的实例只是说明性的，而非限制性的。在浏览了本说明书包括实例后，本发明的许多变化对本领域技术人员来说是显而易见的。本发明的全部范围应该参考实例和等同物的全部范围以及说明书和这种变化来确定。

序列表

<110>LS9公司

<120>脂肪酸及其衍生物的制备

<130>7771-77376-02

<160>30

<170>PatentIn version 3.3

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<223>xaa可以是任何天然存在的氨基酸

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Claims (59)

1.微生物，包括一种或者多种编码至少一种肽的外源核酸序列，所述肽选自accA(EC 6.4.1.2)，accB(EC 6.4.1.2)，accC(EC 6.4.1.2)，accD(EC 6.4.1.2)，aceE(EC 1.2.4.1，2.3.1.61，2.3.1.12)，aceF(EC1.2.4.1，2.3.4.16，2.3.1.12)，acpP(AAC74178)，fadD(EC 2.3.1.86)，cerl(EC 4.1.99.5)，fabA(EC4.2.1.60)，fabB(EC 2.3.1.41)，fabD(EC 2.3.1.39)，fabG(EC 1.1.1.100)，fabH(EC 2.3.1.180)，fabI(EC 1.3.1.9)，fabZ(EC4.2.1.-)，脂肪酶(EC 3.1.1.3)，丙二酰辅酶A脱羧酶(EC 4.1.1.9，4.1.1.41)，panD(EC 4.1.1.11)，panK(EC 2.7.1.33)，pdh(EC 1.2.4.1)，udhA(EC 1.6.1.1)及其组合，和包括蜡合酶(EC 2.3.1.75)的肽。

2.微生物，包括一种或者多种编码至少一种肽的外源核酸序列，所述肽选自accA(EC 6.4.1.2)，accB(EC 6.4.1.2)，accC(EC 6.4.1.2)，accD(EC 6.4.1.2)，aceE(EC 1.2.4.1，2.3.1.61，2.3.1.12)，aceF(EC1.2.4.1，2.3.4.16，2.3.1.12)，acpP(AAC74178)，fadD(EC 2.3.1.86)，cerl(EC 4.1.99.5)，fabA(EC4.2.1.60)，fabB(EC 2.3.1.41)，fabD(EC 2.3.1.39)，fabG(EC 1.1.1.100)，fabH(EC 2.3.1.180)，fabI(EC 1.3.1.9)，fabZ(EC4.2.1.-)，脂肪酶(EC 3.1.1.3)，丙二酰辅酶A脱羧酶(EC 4.1.1.9，4.1.1.41)，panD(EC 4.1.1.11)，panK(EC 2.7.1.33)，pdh(EC 1.2.4.1)，udhA(EC 1.6.1.1)及其组合，和包括醇乙酰转移酶(2.3.1.84)的肽。

3.微生物，包括一种或者多种编码至少一种肽的外源核酸序列，所述肽选自accA(EC 6.4.1.2)，accB(EC 6.4.1.2)，accC(EC 6.4.1.2)，accD(EC 6.4.1.2)，aceE(EC 1.2.4.1，2.3.1.61，2.3.1.12)，aceF(EC1.2.4.1，2.3.4.16，2.3.1.12)，acpP(AAC74178)，fadD(EC 2.3.1.86)，cerl(EC 4.1.99.5)，fabA(EC4.2.1.60)，fabB(EC 2.3.1.41)，fabD(EC 2.3.1.39)，fabG(EC 1.1.1.100)，fabH(EC 2.3.1.180)，fabI(EC 1.3.1.9)，fabZ(EC4.2.1.-)，脂肪酶(EC 3.1.1.3)，丙二酰辅酶A脱羧酶(EC 4.1.1.9，4.1.1.41)，panD(EC 4.1.1.11)，panK(EC 2.7.1.33)，pdh(EC 1.2.4.1)，udhA(EC 1.6.1.1)及其组合，和包括醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)的肽。

4.微生物，包括一种或者多种编码至少一种肽的外源核酸序列，所述肽选自accA(EC 6.4.1.2)，accB(EC 6.4.1.2)，accC(EC 6.4.1.2)，accD(EC 6.4.1.2)，aceE(EC 1.2.4.1，2.3.1.61，2.3.1.12)，aceF(EC1.2.4.1，2.3.4.16，2.3.1.12)，acpP(AAC74178)，fadD(EC 2.3.1.86)，cerl(EC 4.1.99.5)，fabA(EC4.2.1.60)，fabB(EC 2.3.1.41)，fabD(EC 2.3.1.39)，fabG(EC 1.1.1.100)，fabH(EC 2.3.1.180)，fabI(EC 1.3.1.9)，fabZ(EC4.2.1.-)，脂肪酶(EC 3.1.1.3)，丙二酰辅酶A脱羧酶(EC 4.1.1.9，4.1.1.41)，panD(EC 4.1.1.11)，panK(EC 2.7.1.33)，pdh(EC 1.2.4.1)，udhA(EC 1.6.1.1)及其组合，和包括脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(1.1.1.^*)的肽。

5.微生物，包括一种或者多种弱化的内源核酸序列，所述序列选自ackA(EC 2.7.2.1)，ackB(EC 2.7.2.1)，adhE(EC 1.1.1.1，1.2.1.10)，fabF(EC 2.3.1.179)，fabR(登录号NP_418398)，fadE(EC 1.3.99.3，1.3.99.-)，GST(EC 6.3.2.3)，gpsA(EC 1.1.1.94)，ldhA(EC 1.1.1.28)，pflB(EC 2.3.1.54)，plsB(EC 2.3.1.15)，poxB(EC 1.2.2.2)，pta(EC2.3.1.8)，谷胱甘肽合酶(EC 6.3.2.3)及其组合，和一种或者多种编码包括蜡合酶(EC 2.3.1.75)或者酰基转移酶(EC2.3.1.84)的第二肽的外源核酸序列。

6.微生物，包括一种或者多种弱化的内源核酸序列，所述序列选自ackA(EC 2.7.2.1)，ackB(EC 2.7.2.1)，adhE(EC 1.1.1.1，1.2.1.10)，fabF(EC 2.3.1.179)，fabR(登录号NP_418398)，fadE(EC 1.3.99.3，1.3.99.-)，GST(EC 6.3.2.3)，gpsA(EC 1.1.1.94)，ldhA(EC 1.1.1.28)，pflB(EC 2.3.1.54)，plsB(EC 2.3.1.15)，poxB(EC 1.2.2.2)，pta(EC2.3.1.8)，谷胱甘肽合酶(EC 6.3.2.3)及其组合，和一种或者多种编码包括醇乙酰转移酶(EC 2.3.1.84)的肽的外源核酸序列。

7.微生物，包括一种或者多种弱化的内源核酸序列，所述序列选自ackA(EC 2.7.2.1)，ackB(EC 2.7.2.1)，adhE(EC 1.1.1.1，1.2.1.10)，fabF(EC 2.3.1.179)，fabR(登录号NP_418398)，fadE(EC 1.3.99.3，1.3.99.-)，GST(EC 6.3.2.3)，gpsA(EC 1.1.1.94)，ldhA(EC 1.1.1.28)，pflB(EC 2.3.1.54)，plsB(EC 2.3.1.15)，poxB(EC 1.2.2.2)，pta(EC2.3.1.8)，谷胱甘肽合酶(EC 6.3.2.3)及其组合，和一种或者多种编码包括醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)的肽的外源核酸序列。

8.微生物，包括一种或者多种弱化的内源核酸序列，所述序列选自ackA(EC 2.7.2.1)，ackB(EC 2.7.2.1)，adhE(EC 1.1.1.1，1.2.1.10)，fabF(EC 2.3.1.179)，fabR(登录号NP_418398)，fadE(EC 1.3.99.3，1.3.99.-)，GST(EC 6.3.2.3)，gpsA(EC 1.1.1.94)，ldhA(EC 1.1.1.28)，pflB(EC 2.3.1.54)，plsB(EC 2.3.1.15)，poxB(EC 1.2.2.2)，pta(EC2.3.1.8)，谷胱甘肽合酶(EC 6.3.2.3)及其组合，和一种或者多种编码包括脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(1.2.1.^*)的肽的外源核酸序列。

9.如权利要求1-8中任一项所述的微生物，其中所述微生物是大肠杆菌(E.coli)。

10.如权利要求1-8中任一项所述的微生物，其中所述微生物还包括脂肪酸衍生物。

11.如权利要求10所述的微生物，其中所述微生物还包括编码ACP、Sfa或者其组合的外源核酸序列。

12.如权利要求10所述的微生物，其中所述微生物表达一种或者多种编码酶的外源核酸序列，所述酶选自支链酮酸脱氢酶复合物(EC1.2.4.4)的一种或者多种组分，llve(EC 2.6.1.42)，lpd(EC 1.8.1.4)，Ccr(EC1.1.19)，IcmA(EC5.4.99.2)，IcmB(5.4.99.13)，fabH(EC 2.3.1.180)，fabF(EC 2.3.1.179)，fabH3(EC 2.3.1.180)，fabC3(NP_823468)，β-酮酰-ACP合酶II(EC 2.3.1.180)，烯酰辅酶A还原酶(EC 1.3.1.34)，烯酰辅酶A异构酶(EC 4.2.1.-)及其组合，其中所述脂肪酸衍生物是分枝的。

13.如权利要求10所述的微生物，其中所述微生物表达一种或者多种编码硫酯酶(3.1.2.-，3.1.1.-)的外源核酸序列。

14.如权利要求10所述的微生物，其中所述微生物表达一种或者多种编码酶的外源核酸序列，所述酶选自fabB(EC2.3.1.41)，fabK(EC 1.2.1.9)，fabL(EC 1.2.1.9)，fabM(5.3.3.14)，fadE(EC 1.3.99.3，1.3.99.-)及其组合，并且其中所述脂肪酸衍生物是不饱和的。

15.如权利要求1-8中任一项所述的微生物，其中fadE被弱化。

16.如权利要求1-8中任一项所述的微生物，其中accABCE、fadD被过表达。

17.如权利要求1-8中任一项所述的微生物，其中所述微生物位于包括发酵肉汤的容器中，所述发酵肉汤包括至少10mg/L脂肪酸酯，10mg/L脂肪醇，10mg/L烃或者至少10mg/L蜡。

18.如权利要求10所述的微生物，其中所述脂肪酸衍生物包括大约1个到大约5个双键。

19.如权利要求10所述的微生物，其中所述脂肪酸衍生物包括大约8到大约30的碳链长度。

20.如权利要求10所述的微生物，其中所述脂肪酸衍生物包括大约1个到大约5个分枝点。

21.如权利要求1-8中任一项所述的微生物，其中所述微生物还包括具有A侧和B侧的脂肪酸酯或者蜡。

22.如权利要求21所述的微生物，其中所述A侧和B侧由所述微生物产生。

23.如权利要求21所述的微生物，其中所述A侧、B侧或者A侧和B侧两者包括大约1个到大约5个双键。

24.如权利要求21所述的微生物，其中所述A侧、B侧或者A侧和B侧两者包括大约1到大约26的碳链长度。

25.如权利要求21所述的微生物，其中所述A侧、B侧或者A侧和B侧两者包括大约1个到大约5个碳分枝点。

26.如权利要求21所述的微生物，其中所述A侧、B侧或者A侧和B侧两者包括1到5个环丙基部分。

27.如权利要求1-8中任一项所述的微生物，其中所述微生物是节杆菌(Arthrobacter sp.)，芽孢杆菌(Bacillus sp.)，布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)，着色菌(Chromatium sp.)，树脂枝孢霉(Cladosporium resina)(ATCC22711)，巴斯德梭状芽胞杆菌VKM(Clostridium pasteurianum VKM)，破伤风形梭菌(Clostridiumtenanomorphum)，尿酸棱菌(Clostridium acidiurici)，棒状杆菌(Corynebacterium species)，蓝藻(cyanobacterial species)(灰色念珠藻(Nostoc muscorum)，组囊藻(Anacystis(Synechococcus)nidulans)，丝状蓝藻(Phormidium luridum)，佛氏绿胶蓝细菌(Chlorogloea fritschii)，红海束毛藻(Trichodesmium erythaeum)，Oscillatoria williamsii，微鞘藻(Microcoleus chthonoplaseis)，Coccochloris elabens，Agmenellumquadruplicatum，Plectonema terebrans，具鞘微鞘藻(M vaginatus)和岩生眉藻(C.scopulorum))，脱硫脱硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)(ATCC29577)，Kineococcus radiotolerans(BAA-149)，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)(FD533，ATCC 272，381，382，ISU，540，4698，7468，27141)，小球菌(Micrococcus sp.)(ATCC 146，398，401，533)，玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(ATCC 412，416，516)，溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)，分支杆菌(Mycobacterium species)，青霉(Penicillium sp.)，曲霉(Aspergillus sp.)，绿色木霉(Trichodermavirida)，出芽短梗霉(Pullularia pullulans)，Jeotgalicoccus sp.(M.candicans)(ATCC 8456)，红假单胞菌球状绿菌(Rhodopseudomonasspheroids Chlorobium sp.)，深红红螺菌(Rhodospirillium rubrum)(ATCC11170)，万尼氏红微菌(Rhodomicrobium vannielii)，嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC 13637，17444，17445，17666，17668，17673，17674，17679，17677)，路德类酵母(Saccharomycodes ludwigii)(ATCC 22711)，类酵母(Saccharomyces sp.)(oviformus，ludwiggi，tropicalis)，弗尼斯弧菌M1(Vibrio furnissii M1)，海产弧菌MP-1(Vibrio marinus MP-1)，Vibrio ponticus，海红沙雷氏菌(Serratia marinorubra)，玉米黑粉菌(Ustilago maydis)，麦散黑粉菌(Ustilago nuda)，小麦条黑粉菌(Urocystis agropyri)，高粱丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)，或者腥黑粉菌(Tilletia sp.)(foetida，caries，controversa)。

28.产生脂肪醇的方法，包括在足以产生脂肪醇的条件下培养权利要求3、4、7或者8中任一项所述的微生物；并分离所述脂肪醇。

29.产生脂肪酸酯的方法，包括在足以产生脂肪酸酯的条件下培养权利要求1、2、6、7或者21-25中任一项所述的微生物；并分离所述脂肪酸酯。

30.产生蜡的方法，包括在足以产生蜡的条件下培养权利要求1、2、6、7或者21-25中任一项所述的微生物；并分离所述蜡。

31.微生物，选自节杆菌(Arthrobacter sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、着色菌(Chromatium sp.)、树脂枝孢霉(Cladosporium resina)(ATCC22711)、巴斯德梭状芽胞杆菌VKM(Clostridium pasteurianum VKM)、破伤风形梭菌(Clostridiumtenanomorphum)、尿酸棱菌(Clostridium acidiurici)、棒状杆菌(Corynebacterium species)、蓝藻(cyanobacterial species)(灰色念珠藻(Nostoc muscorum)、组囊藻(Anacystis(Synechococcus)nidulans)、丝状蓝藻(Phormidium luridum)、佛氏绿胶蓝细菌(Chlorogloea fritschii)、红海束毛藻(Trichodesmium erythaeum)、Oscillatoria williamsii、微鞘藻(Microcoleus chthonoplaseis)、Coccochloris elabens、Agmenellumquadruplicatum、Plectonema terebrans、具鞘微鞘藻(M vaginatus)和岩生眉藻(C.scopulorum))、脱硫脱硫弧菌(ATCC29577)(Desulfovibriodesulfuricans)，Kineococcus radiotolerans(BAA-149)，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)(FD533，ATCC 272，381，382，ISU，540，4698，7468，27141)，小球菌(Micrococcus sp.)(ATCC 146，398，401，533)，玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(ATCC 412，416，516)，溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、分支杆菌(Mycobacterium species)、青霉(Penicillium sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、绿色木霉(Trichoderma virida)、出芽短梗霉(Pullularia pullulans)、Jeotgalicoccus sp.(M.candicans)(ATCC 8456)、红假单胞菌球状绿菌(Rhodopseudomonasspheroids Chlorobium sp.)、深红红螺菌(Rhodospirillium rubrum)(ATCC11170)、万尼氏红微菌(Rhodomicrobium vannielii)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC 13637，17444，17445，17666，17668，17673，17674，17679，17677)、路德类酵母(Saccharomycodes ludwigii)(ATCC 22711)、类酵母(Saccharomycessp.)(oviformus，ludwiggi，tropicalis)、弗尼斯弧菌M1(Vibrio furnissii M1)、海产弧菌MP-1(Vibrio marinus MP-1)、Vibrio ponticus，海红沙雷氏菌(Serratia marinorubra)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、麦散黑粉菌(Ustilago nuda)、小麦条黑粉菌(Urocystis agropyri)、高粱丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)或者腥黑粉菌(Tilletia sp.)(foetida，caries，controversa)，其包括一种或者多种编码第一多肽的外源核酸序列，所述第一多肽选自accA(EC 6.4.1.2)，accB(EC 6.4.1.2)，accC(EC 6.4.1.2)，accD(EC 6.4.1.2)，aceE(EC 1.2.4.1，2.3.1.61，2.3.1.12)，aceF(EC1.2.4.1，2.3.4.16，2.3.1.12)，acpP(AAC74178)，fadD(EC 2.3.1.86)，cerl(EC 4.1.99.5)，fabA(EC4.2.1.60)，fabB(EC 2.3.1.41)，fabD(EC 2.3.1.39)，fabG(EC 1.1.1.100)，fabH(EC 2.3.1.180)，fabI(EC 1.3.1.9)，fabZ(EC4.2.1.-，脂肪酶(EC 3.1.1.3)，丙二酰辅酶A脱羧酶(EC 4.1.1.9，4.1.1.41)，panD(EC 4.1.1.11)，panK(EC 2.7.1.33)，pdh(EC 1.2.4.1)，udhA(EC 1.6.1.1)及其组合，其中与野生型微生物相比，所述微生物产生烃的量增加。

32.微生物，选自节杆菌(Arthrobacter sp.)、芽孢杆菌(Bacillussp.)、布朗葡萄藻(Botryococcus braunii)、着色菌(Chromatium sp.)、树脂枝孢霉(Cladosporium resina)(ATCC22711)、巴斯德梭状芽胞杆菌VKM(Clostridium pasteurianum VKM)、破伤风形梭菌(Clostridiumtenanomorphum)、尿酸棱菌(Clostridium acidiurici)、棒状杆菌(Corynebacterium species)、蓝藻(cyanobacterial species)(灰色念珠藻(Nostoc muscorum)、组囊藻(Anacystis(Synechococcus)nidulans)、丝状蓝藻(Phormidium luridum)、佛氏绿胶蓝细菌(Chlorogloea fritschii)、红海束毛藻(Trichodesmium erythaeum)、Oscillatoria williamsii、微鞘藻(Microcoleus chthonoplaseis)、Coccochloris elabens、Agmenellumquadruplicatum、Plectonema terebrans、具鞘微鞘藻(M vaginatus)和岩生眉藻(C.scopulorum))、脱硫脱硫弧菌(ATCC29577)(Desulfovibriodesulfuricans)，Kineococcus radiotolerans(BAA-149)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)(FD533，ATCC 272，381，382，ISU，540，4698，7468，27141)、小球菌(Micrococcu sp.)(ATCC 146，398，401，533)、玫瑰色微球菌(Micrococcus roseus)(ATCC 412，416，516)、溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、分支杆菌(Mycobacterium species)、青霉(Penicillium sp.)、曲霉(Aspergillus sp.)、绿色木霉(Trichoderma virida)、出芽短梗霉(Pullularia pullulans)、Jeotgalicoccus sp.(M.candicans)(ATCC 8456)、红假单胞菌球状绿菌(Rhodopseudomonasspheroids Chlorobium sp.)、深红红螺菌(Rhodospirillium rubrum)(ATCC11170)、万尼氏红微菌(Rhodomicrobium vannielii)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)(ATCC 13637，17444，17445，17666，17668，17673，17674，17679，17677)、路德类酵母(Saccharomycodes ludwigii)(ATCC 22711)、类酵母(Saccharomycessp.)(oviformus，ludwiggi，tropicalis)、弗尼斯弧菌M1(Vibrio furnissii M1)、海产弧菌MP-1(Vibrio marinus MP-1)、Vibrio ponticus、海红沙雷氏菌(Serratia marinorubra)、玉米黑粉菌(Ustilago maydis)、麦散黑粉菌(Ustilago nuda)、小麦条黑粉菌(Urocystis agropyri)、高粱丝黑穗病菌(Sphacelotheca reiliana)和腥黑粉菌(Tilletia sp.)(foetida，caries，controversa)，其包括一种或者多种弱化的内源核酸序列，所述核酸序列选自ackA(EC 2.7.2.1)，ackB(EC 2.7.2.1)，adhE(EC 1.1.1.1，1.2.1.10)，fabF(EC 2.3.1.179)，fabR(登录号NP_418398)，fadE(EC 1.3.99.3，1.3.99.-)，GST(EC 6.3.2.3)，gpsA(EC 1.1.1.94)，ldhA(EC 1.1.1.28)，pflB(EC 2.3.1.54)，plsB(EC 2.3.1.15)，poxB(EC 1.2.2.2)，pta(EC2.3.1.8)，谷胱甘肽合酶(EC 6.3.2.3)及其组合，其中与野生型微生物相比，所述微生物产生烃的量增加。

33.如权利要求31或者32中任一项所述的微生物，其中所述微生物还表达酶，所述酶选自蜡合酶(EC 2.3.1.75)，醇乙酰转移酶(2.3.1.84)，醇脱氢酶(EC 1.1.1.1)和脂肪醇形成酰基辅酶A还原酶(1.1.1.^*)。

34.如权利要求31和32中任一项所述的微生物，其中所述微生物表达一种或者多种编码酶的核酸序列，所述酶选自支链酮酸脱氢酶复合物(EC 1.2.4.4)的一种或者多种组分，llve(EC 2.6.1.42)，lpd(EC1.8.1.4)，Ccr(EC 1.1.19)，IcmA(EC5.4.99.2)，IcmB(5.4.99.13)，fabH(EC2.3.1.180)，ACP(登录号NP_626635)，fabF(EC 2.3.1.179)，fabH3(EC2.3.1.180)，fabC3(NP_823468)，β-酮酰-ACP合酶II(EC 2.3.1.180)，烯酰辅酶A还原酶(EC 1.3.1.34)，烯酰辅酶A异构酶(EC 4.2.1.-)及其组合，其中所述脂肪酸衍生物是分枝的。

35.如权利要求31和32中任一项所述的微生物，其中所述微生物表达一种或者多种编码硫酯酶(3.1.2.-，3.1.1.-)的外源核酸序列。

36.如权利要求31和32中任一项所述的微生物，其中所述微生物表达一种或者多种编码酶的外源核酸序列，所述酶选自FadA(EC2.3.1.16)，FadI(EC 2.3.1.16)，FadB(EC 2.3.1.41)，FadJ(EC 4.2.1.17，EC 5.1.2.3，EC 5.3.3.8，EC 1.1.1.35)，FabK(EC 1.2.1.9)，FabL(EC1.2.1.9)，FabM(5.3.3.14)及其组合。

37.获得纯化的脂肪酸衍生物的方法，包括，

在足以产生脂肪酸衍生物的条件下，培养权利要求1-28和31-36中任一项所述的微生物；

使所述脂肪酸衍生物分离进入有机相；和

从所述有机相纯化所述脂肪酸衍生物。

38.生物燃料组合物，包括：

至少大约85％的脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸衍生物包括选自8:0，10:0，12:0，14:0，14:1，16:0，16:1，18:0，18:1，18:2，18:3，20:0，20:1，20:2，20:3，22:0，22:1或者22:3的碳链；和

至少一种足以将所述生物燃料组合物的浊点降低到低于大约0℃的添加剂。

39.生物燃料组合物，包括：

至少大约17％的脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸衍生物包括选自8:0，10:0，12:0，14:0，14:1，16:0，16:1，18:0，18:1，18:2，18:3，20:0，20:1，20:2，20:3，22:0，22:1或者22:3的碳链；和

至少大约80％的常规柴油。

40.生物燃料组合物或者原料，包括具有大约-10.9到大约-15.4的δ¹³C的脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸衍生物占所述组合物中生物来源材料的至少大约85％。

41.生物燃料组合物或者原料，包括具有以下化学式的脂肪酸衍生物

X——(CH(R))_nCH₃

其中X代表CH₃，-CH₂OR¹；-C(O)OR²；或者-C(O)NR³R⁴；

对于每个n，R独立地是不存在的、H或者低级脂肪族；

n是从8到34的整数；和

R¹，R²，R³和R⁴独立地选自H和低级烷基；

其中所述脂肪酸衍生物具有大约-10.9到大约-15.4的δ¹³C；并且所述脂肪酸衍生物占所述组合物中生物来源材料的至少大约85％。

42.如权利要求40所述的生物燃料组合物，其中所述脂肪酸衍生物占所述组合物中生物来源的脂肪酸衍生材料的至少大约85％。

43.如权利要求41所述的生物燃料组合物或者原料，其中所述脂肪酸衍生物具有至少大约1.003的现代碳分数(f_M ¹⁴C)。

44.如权利要求41所述的生物燃料组合物或者原料，其中对于每个n来说，R独立地选自H，甲基，乙基，异丙基，异丁基，仲丁基和环戊烯基。

45.如权利要求41所述的生物燃料组合物或者原料，其中所述式

(CH(R))_n

包括至少一个烯基部分。

46.如权利要求41所述的生物燃料组合物或者原料，其中所述脂肪酸衍生物包括选自8:0，10:0，12:0，14:0，14:1，16:0，16:1，18:0，18:1，18:2，18:3，20:0，20:1，20:2，20:3，22:0，22:1或者22:3的碳链。

47.如权利要求41所述的生物燃料组合物或者原料，在所述生物燃料组合物中还包括低级醇。

48.如权利要求47所述的生物燃料组合物，其中所述低级醇选自乙醇、丁醇、己醇或者其组合。

49.如权利要求47所述的生物燃料组合物，还包括表面活性剂。

50.如权利要求47所述的生物燃料组合物，其中所述生物燃料组合物包括微乳剂。

51.生物燃料组合物，包括：

至少大约55％的脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸衍生物包括选自8:0，10:0，12:0，14:0，14:1，16:0，16:1，18:0，18:1，18:2，18:3，20:0，20:1，20:2，20:3，22:0，22:1或者22:3的碳链；和

至少一种足以将所述生物燃料组合物的浊点降低到低于大约0℃的添加剂。

52.如权利要求51所述的生物燃料组合物，其中所述脂肪酸衍生物具有大约-10.9到大约-15.4的δ¹³C。

53.如权利要求51所述的生物燃料组合物，还包括低级醇。

54.生物燃料组合物，包括：

至少大约11％的脂肪酸衍生物，其中所述脂肪酸衍生物包括选自8:0，10:0，12:0，14:0，14:1，16:0，16:1，18:0，18:1，18:2，18:3，20:0，20:1，20:2，20:3，22:0，22:1或者22:3的碳链；和

至少大约80％的常规柴油。

55.生物燃料组合物或者原料，包括具有以下化学式的脂肪酸衍生物

X——(CH(R))_nCH₃

其中X代表CH₃，-CH₂OR¹；-C(O)OR²；或者-C(O)NR³R⁴；

对于每个n，R独立地是不存在的、H或者低级烷基，并且至少一个R是低级烷基；

n是从8到34的整数；

R¹，R²，R³和R⁴独立地选自H和低级烷基；和

其中所述脂肪酸衍生物具有大约-10.9到大约-15.4的δ¹³C。

56.如权利要求55所述的生物燃料组合物，其中所述脂肪酸衍生物是所述生物燃料组合物的至少大约10％。

57.生物燃料组合物，基本上由具有以下化学式的脂肪酸衍生物组成

X——(CH(R))_nCH₃

其中X代表CH₃，-CH₂OR¹；-C(O)OR²；或者-C(O)NR³R⁴；

对于每个n，R独立地是不存在的、H或者低级烷基；

n是从8到34的整数；和

R¹，R²，R³和R⁴独立地选自H和低级烷基；

其中所述脂肪酸衍生物具有大约-10.9到大约-15.4的δ¹³C。

58.如权利要求38-57中任一项所述的生物燃料，其中所述生物燃料包括低于.1％的甘油。

59.如权利要求38-58中任一项所述的生物燃料，其中所述生物燃料包括低于0.1％的转酯催化剂。

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