CN103080305A - 酵母由木质纤维素和甘油生产生物柴油 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于细胞外产生游离脂肪酸及其酯的经遗传修饰微生物，其中所述微生物的特征在于改进的脂质生物合成代谢途径：例如脂酰-CoA合成酶活性降低，使得微生物能够利用葡萄糖、淀粉、木质纤维素和甘油基底物中的一种或更多种作为碳源过量产生和分泌脂肪酸酯(生物柴油)进入周围培养基。本发明还提供了用于细胞外产生游离脂肪酸及其酯的方法，包括使用所述经遗传修饰微生物和适于所述方法的生长培养基。
Description
技术领域
本发明涉及通过基因工程改变酵母中的脂质生物合成代谢途径，以利用葡萄糖、淀粉、木质纤维素和甘油基底物中的一种或更多种作为碳源过量产生和分泌脂肪酸酯(生物柴油)进入周围培养基。
背景技术
生物柴油是指包含来源于植物油或动物脂肪的长链脂肪酸的单烷基酯的燃料，称作B100，并且满足了ASTM D6571的需要。当前，产生生物柴油的最常用方法是可食用和不可食用的植物油或有时动物脂肪的转酯基反应。转酯基反应在醇如甲醇或乙醇和催化剂如碱或酸的存在下将甘油三酯转化成脂肪酸烷基酯，其副产物是甘油。生物柴油具有与石油柴油相当的十六烷值和能值(energy content)，因此被认为是石油柴油的极好替代品。其可以以纯的形式(100％)或以各种比例与石油柴油共混使用。大豆和油菜籽是用于产生生物柴油的植物油的通常来源。这些植物油为甘油三酯形式，之后需要将其降解成游离脂肪酸和甘油，之后脂肪酸通过已知为“转酯基”的方法化学或酶促酯化。这需要可用于粮食作物和燃料作物生产的可利用耕地上的无数植株，因此对于食品价格造成了不期望的压力。此外，因为油料种子是季节性作物，一旦收获并利用，就必须等待到下次收获。因此，需要克服食物或燃料的两难选择，并且需要持续将全球能量消耗从化石燃料向环保的生物燃料转移。另一个目的是开发能源，例如作为现有生物柴油工业副产物的便宜碳源(甘油)和最丰富的天然的不可食用糖源(即木质纤维素)。非淀粉碳源如纤维素、半纤维素、木糖和木质素的利用不仅将有利于经济地大量产生生物柴油，还将减少满足社会食物需求的农业资源植株。
尽管已经尝试利用微生物有机体产生生物柴油，但是成功的主要障碍是开发稳定高产的微生物及产生其的方法。
发明内容
本发明涉及用于细胞外产生游离脂肪酸及其酯的经遗传修饰微生物，其中所述微生物的特征在于：脂酰-CoA合成酶的活性降低，其通过以下一个或更多个方法实现：FAA2基因缺失；FAA1基因、FAA3基因和FAA4基因中任一个缺失；重组内源FAA1基因、FAA3基因或FAA4基因，其中所述基因与异源启动子有效连接；和/或乙酰CoA羧化酶的表达增强，其通过以下方法实现：重组内源基因ACC1基因，其中所述基因与异源启动子有效连接。例如所述微生物选自物种：曲霉属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、镰刀菌属(Fusarium)、Lindnera、油脂酵母属(Lipomyces)、红曲霉属(Monascus)、毛霉属(Mucor)、管囊酵母属(Pachysolen)、毕赤酵母属(Pichia)，根霉属(Rhizopus)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosacchromyces)、丝孢酵母属(Trichosporon)、耶氏酵母属(Yarrowia)、和接合酵母属(Zygosacchromyces)。优选地，所述经遗传修饰生物是酵母属物种，特别是酿酒酵母。
在一个实施方案中，所述经遗传修饰微生物的特征在于与来自酵母的TEF1启动子[SEQ ID NO：113]有效连接的重组内源ACC1基因。
在一个实施方案中，所述经遗传修饰微生物的特征在于包含转基因，所述转基因编码包括PflA和PflB的丙酮酸甲酸裂合酶。
所述经遗传修饰微生物包括FAA2缺失(或FAA1、FAA3或FAA4缺失)或者与异源启动子有效连接的重组内源ACC1基因，其特征可在于还包括转基因，所述转基因编码包括PflA和PflB的丙酮酸甲酸裂合酶。
所述经遗传修饰微生物的特征还可在于还包括转基因，所述转基因编码酰基CoA-ACP硫酯酶，其中所述硫酯酶选自：大豆(Soyabean)(Glycinemax)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)(Protein ID-A8HY17)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Protein ID-Q9SJE2)、蓖麻(Ricinuscommunis)(Protein ID-B9RAC3)、小麦(Triticum aestivum)、油菜(Brassica napus)CtFatA(Protein ID-Q43745)、红花(C.tinctorius)CtFatA(Protein ID-Q42715)、山竹(G.mangostana)GmFatA1(ProteinID-O04792)、萼距花(C.hookeriana)CwFatB1(Protein ID-Q39513)、赖特萼距花(C.wrightii)CwFatB1(蛋白质ID-Q39662)、山竹(G.Mangostana)GmFatB1(蛋白质ID-O04794)。
所述经遗传修饰微生物的特征还可在于还包括酰基辅酶A：乙醇O-酰基转移酶的表达增强，其通过重组内源乙酰辅酶A：乙醇O-酰基转移酶(EEB1)基因实现，其中所述基因与异源启动子有效连接。
所述经遗传修饰微生物的特征还可在于还包括编码异源胞浆酰基CoA硫酯酶(CTE-1)的转基因，其中所述CTE-1选自小鼠(Mus muscilis)(Protein ID-O55137)、拟南芥(Protein ID-Q5FYU1)或大鼠(Rattusnorvegicus)(Protein ID-Q6AZ44)。
所述经遗传修饰微生物的特征还可在于还包括编码异源甘油激酶或木糖异构酶或编码二者的一个或更多个的转基因；其中所述甘油激酶选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甘油激酶(Protein ID-P32190)，而所述木糖异构酶选自植物发酵梭菌(Clostridium phytofermentas)木糖异构酶(Protein ID-A9KN98)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)木糖异构酶(Protein ID-Q8Z9Z1)。
所述经遗传修饰微生物的特征还可在于还包括内源甲酸脱氢酶FDH基因的缺失，其中所述FDH基因选自：GeneID：854570、GeneID：8300341和GeneID：2907923。
所述经遗传修饰微生物的特征还可在于还包括编码异源甲酸氢裂合酶的转基因，其中所述裂合酶为大肠杆菌(E.coli)甲酸氢裂合酶(ProteinID-C8UET5)。
所述经遗传修饰微生物的特征还可在于还包括内源醇脱氢酶(ADH)基因的缺失，其中所述ADH基因选自：GeneID：854068、GeneID：2538902、GeneID：2868277和GeneID：852442。
本发明还涉及酵母或真菌菌株用于细胞外产生游离脂肪酸及其酯的用途，其中所述酵母或真菌菌株选自：热带假丝酵母(Candida tropicalis)、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)、酵母FAA2缺失菌株和任一上述经遗传修饰微生物的酵母或真菌菌株。
本发明还涉及用于细胞外产生游离脂肪酸及其酯的方法，包括步骤：a)向生长培养基中引入微生物酵母或真菌菌株以产生培养物；b)孵育所述培养物，其中向所述培养物中的所述生长培养基通氧；c)在步骤b)后在不供应氧的情况下进一步孵育所述培养物；d)从所述培养物中回收包含游离脂肪酸和酯的胞外相；其中所述微生物为酵母或真菌菌株。
所述方法还可使用选自热带假丝酵母、嗜鞣管囊酵母或任何上述经遗传修饰微生物的微生物。
在一个实施方案中，所述方法的生长培养基包含选自葡萄糖、甘油、木糖、水解纤维素和半纤维素、淀粉、糖醇和木聚糖中至少之一的碳源，优选地，所述生长培养基包含下文所述成分或由其组成。
本发明还提供了适于上述方法使用的生长培养基，其中所述培养基的组成包含以下成分。
| 组分 | 组成(克/升) |
| 碳源 | |
| 碳源 | ≥50g |
| 氮源 | |
| 硫酸铵 | 5g |
| 维生素* | |
| 生物素 | 20μg |
| 叶酸 | 2μg |
| 肌醇 | 10mg |
| 烟酸 | 400μg |
| 核黄素 | 200μg |
| 盐酸吡哆醇 | 400μg |
| 盐酸硫胺 | 400μg |
| 提供微量元素的化合物 |
其中所述碳源选自葡萄糖、甘油、木糖、水解纤维素和半纤维素、淀粉、糖醇和木聚糖。
附图说明
图1a：作为发酵生长温度(X轴)之函数的两种酵母菌株的可皂化脂肪酸含量(Y轴)。注意在整个试验中对照值以Y坐标为0时在X轴上读取。
图1b：作为葡萄糖浓度(X轴)之函数的两种酵母菌株的可皂化脂肪酸含量(Y轴)。相互关系为通过原点的线性，但由于实践的困难，该趋势在X＝20之后停止。
图1c：作为pH值(X轴)之函数的两种酵母菌株的发酵培养基的可皂化脂肪酸含量(Y轴)。趋势大致为钟形曲线。
图2：酵母菌株酿酒酵母(野生型)分泌进培养基的脂肪酸甲酯的气相色谱图。
图3：酵母中的脂质代谢循环，a)FAA2是酿酒酵母系统(repertoire)中催化脂肪酸代谢第一步的酶之一；b)酵母中脂质代谢的操作。
图4：FAA2缺失部分。基因上游145bp和下游60bp缺失且被URA3代替。
图5：利用来源于WT基因的FAA2的PCR扩增产物进行的SDS凝胶电泳。泳道1：DNA大小标记：100-10000核苷酸碱基对；泳道2：利用引物对3扩增WT酵母基因组DNA的PCR产物(表4)。
图6a、b：转化酵母菌落gDNA中FAA2(Δura3)缺失的检测。孔3-9、11-17包含转化酵母菌落基因组DNA，用FAA2引物组3扩增。孔18、20-27、30-33包含转化酵母菌落基因组DNA，用URA3引物组2扩增。孔1、10、19、28、29、40包含DNA大小梯状标准品。孔编号2和39分别包含用引物组3和引物组2扩增的WT-DNA。孔38包含用引物组2扩增的URA3质粒，作为正对照。
图7：由生长在葡萄糖培养基上的WT-菌株(酿酒酵母)分泌的细胞外脂肪酸的GC-MS图。
图8：由生长在葡萄糖培养基上的WT-菌株(酿酒酵母)分泌的胞内脂肪酸的GC-MS图。
图9：生长在葡萄糖培养基上的WT-菌株的FAA2(Δura3)缺失突变株(酿酒酵母FAA2Δura3)的细胞外脂肪酸的GC-MS图。
图10：生长在葡萄糖培养基上的WT-菌株的FAA2(Δura3)缺失突变株(酿酒酵母FAA2Δura3)的胞内脂肪酸的GC-MS图。
图11：由生长在甘油培养基上的WT-菌株(酿酒酵母)分泌的细胞外脂肪酸的GC-MS图。
图12：生长在甘油培养基上的WT-菌株的FAA2(Δura3)缺失突变株(酿酒酵母FAA2Δura3)的细胞外脂肪酸的GC-MS图。
图13：生长在葡萄糖培养基上的热带假丝酵母的细胞外脂肪酸的GC-MS图(上图)；脂肪酸标准品(下图)。
图14：生长在甘油培养基上的热带假丝酵母的细胞外脂肪酸的GC-MS图(上图)；脂肪酸标准品(下图)。
图15：针对染色体基因座的二分基因靶向底物(bipartitegene-targeting substrate)上游序列和下游序列的同源重组，导致ACC1启动子与TEFl启动子的交换以及侧翼为正向重复(DR)的KI URA3的插入。随后通过将菌株涂板到包含5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基上除去KI URA3。
图16：来自转化SC-ACC1酵母菌落的gDNA中FAA2(Δura3)缺失的PCR检测。凝胶中泳道1-4包含转化酵母菌落的基因组DNA，分别用FAA2引物组3和URA3引物扩增，表明在泳道1、2和4的突变株gDNA中存在URA3而不存在FAA2。泳道5包含DNA大小梯状标准品。
图17：用pflA和pflB特异性引物扩增的扩增自大肠杆菌基因组的大肠杆菌丙酮酸甲酸裂合酶A基因(泳道1和4)与丙酮酸甲酸裂合酶B基因(泳道2和3)的PCR检测。泳道M包含DNA大小梯状标准品。
图18：示出了质粒(泳道2和3)与连接的质粒(泳道1和4)的凝胶图像。泳道1是穿梭载体PCM182中的PflA基因。泳道4是穿梭载体PCM183中的PFLB基因。泳道M包含DNA大小梯状标准品。
图19：当以20％葡萄糖作为碳源生长时本发明的酵母菌株的脂肪酸产率对比。
图20：当以5％纯甘油作为碳源生长时本发明的酵母菌株的脂肪酸产率对比。
图21：当以5％粗甘油作为碳源生长时本发明的酵母菌株的脂肪酸产率对比。
图22：当以15％木糖作为碳源生长时本发明的酵母菌株的脂肪酸产率对比。
图23：当以10ml/L水解小麦木质纤维素作为碳源生长时本发明的酵母菌株的脂肪酸产率对比。
发明目的：
本发明提供了依赖于经修饰酵母菌株的生物柴油替代性来源，所述酵母菌株的脂质生物合成的代谢途径被特别改造为当提供一种或更多种底物如葡萄糖、淀粉、甘油和木质纤维素时过量产生和分泌酯化脂肪酸。尽管酵母菌株分泌的脂肪酸及其酯的链长通常多种多样，其中所产生的脂肪酸大部分为长链脂肪酸(C：16、C：18甚至更长)，但是期望产生链长稍短的脂肪酸及其酯，因为这些被认为是高质量的生物柴油来源。
定义：
ACC1：编码乙酰CoA羧化酶的基因。
FAA2：编码长链脂肪酰-CoA合成酶(Faa2p；EC No：6.2.1.3)的基因，所述酶接受比Faa1p范围更大的酰基链长，优选C9∶0-C13∶0；并且参与内源脂肪酸库的活化；
MCFA：中链脂肪酸
PflA：编码丙酮酸甲酸裂合酶A(PflA)的基因
pflB：编码丙酮酸甲酸裂合酶B(PflB)的基因
SCFA：短链脂肪酸
VLCFA：极长链脂肪酸
1.0本发明微生物的选择
本发明的微生物为酵母或真菌物种，因为酵母和真菌在一些培养条件下可以积累油脂，并且一些酵母和真菌物种在以特定碳源生长时会向培养基中分泌脂肪酸。因此，本发明的酵母或真菌物种能够在培养基中细胞外分泌脂肪酸，并且能够产生大的细胞生物量和高的细胞外脂质产率。根据本发明的优选酵母或真菌物种为能够分泌脂肪酸及其酯的酵母或真菌物种，所述酵母或真菌物种属于：曲霉属(例如，构巢曲霉(A.nidulans))、假丝酵母属(例如热带假丝酵母(C.tropicalis)、木兰假丝酵母(C.magnolia))、隐球酵母属(例如，浅白隐球酵母(C.albidus))、德巴利酵母属(例如，汉逊德巴利酵母(D.hansenii))、镰刀菌属(例如，尖孢镰刀菌(F.oxysporum))、Lindnera(e.g.L.jadinii)、油脂酵母属(例如，产油油脂酵母(L.lipofera)或斯达油脂酵母(L.starkeyi))、红曲霉属(例如，紫红曲霉(M.purpureus))、毛霉属(例如，卷枝毛霉(M.circinelloides)、冻土毛霉(M.hiemalis)、米黑根毛霉(M.miehei)、总状毛霉(M.racemosus))、管囊酵母属(例如，嗜鞣管囊酵母(P.tannophilus))、毕赤酵母属(例如，巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、树干毕赤酵母(P.stipitis)、安格斯毕赤酵母(P.angusta))、根霉属(例如，米根霉(R.oryzae))、红冬孢酵母属(圆红冬孢酵母(R.toruloides))、红酵母属(例如，黏红酵母(R.glutinis))、酵母属(例如，酿酒酵母)、裂殖酵母(例如，粟酒裂殖酵母(S.pombe))、丝孢酵母属(例如，出芽丝孢酵母(T.pullulan))、耶氏酵母属(例如，解脂耶氏酵母(Y.lipolytica))，接合酵母属(例如，鲁氏接合酵母(Z.rouxii))或其任何菌株。优选地，微生物为酵母属，特别为酿酒酵母。
在本发明的一个实施方案中，微生物属于酵母菌假丝酵母属，特别是热带假丝酵母物种，所述酵母的特征在于分泌十六烷酸。
2.0本发明的适于合成和分泌MCFA的经遗传修饰酵母或真菌物种
本发明的经遗传修饰酵母或真菌物种/菌株优选来源于选自上文第1节中所示组的微生物。将所选酵母或真菌物种/菌株中的一个或更多个控制代谢途径的基因遗传修饰为使所选物种/菌株能够由各种便宜碳源如淀粉、甘油和木质纤维素产生和分泌脂肪酸酯。
2.1.0脂肪酸分解代谢降低的经遗传修饰酵母或真菌菌株
2.1.1内源脂酰-CoA合成酶基因FAA2的缺失
在一个实施方案中，本发明的酵母或真菌物种/菌株的编码Faa2p的FAA2基因缺失(FAA2Δ菌株)，Faa2p催化中链脂肪酸的活化，是这些脂肪酸β氧化中的第一个关键步骤。酵母或真菌物种中FAA2基因的缺失降低了通过脂肪酸分解代谢的代谢流(metabolic flux)。另外，本发明的FAA2Δ酵母或真菌物种的特征不仅在于相比于野生型酵母出乎意料高比例的MCFA的合成，还在于能够将在细胞内合成的MCFA分泌到细胞外。当酵母菌株为酿酒酵母时，缺失的FAA2基因为Gene ID：856734(SEQID No：1)，其编码FAA2(EC 6.2.1.3)Protein ID：P39518(SEQ ID No：2)。
2.1.2内源脂酰CoA合成酶基因表达的沉默
在另一实施方案中，通过基因缺失方式或通过启动子改造方式沉默或敲减(knocked-down)本发明的酵母或真菌物种中一个或更多个内源脂酰-CoA合成酶(FAA)基因。例如，用驱动较低表达水平的启动子代替天然FAA基因启动子，从而显著降低基因FAA基因的表达水平及其编码的位于过氧化物酶体和线粒体中的酶。
因此，可用驱动较低表达水平的启动子代替酿酒酵母FAA1、FAA3、FAA4的各启动子。相应策略可应用于沉默或敲减其他酵母物种中FAA的表达。在一个实施例中，待通过基因缺失来沉默或通过启动子改造来敲减的FAA基因为以下一种或更多种：酿酒酵母的Faa1基因(GeneID：854495(SEQ ID No：3)，其编码Protein ID-P30624：(SEQ ID No：4))，Faa3基因(GeneID：854808(SEQ ID No：5)，其编码Protein ID-P39002(SEQ ID No：6))，和Faa4(GeneID：855288(SEQ ID No：7)，其编码Protein ID-P47912(SEQ ID No：8))；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)FAA基因(GeneID：2541350(SEQ ID No：9)，其编码ProteinID-Q9P7D7(SEQ ID No：10))；新型隐球酵母(Crytococcus neoformans)FAA基因(GeneID：3257561(SEQ ID No：11)，其编码ProteinID-Q5KH65(SEQ ID No：12))；热带假丝酵母FAA基因(GeneID：8300178(SEQ ID No：13)，其编码Protein ID-C5MID6(SEQ ID No：14))；构巢曲霉FAA基因(GeneID：2876383(SEQ ID No：15)，其编码ProteinID-Q5BFS3(SEQ ID No：16))；和解酯耶氏酵母FAA基因(GeneID：2911089(SEQ ID No：17)，其编码Protein ID-Q6C8Q3(SEQ ID No：18))。
2.1.3脂酰-CoA合成酶活性的抑制
在另一实施方案中，可通过抑制剂抑制本发明酵母或真菌物种中内源脂酰CoA合成酶(FAA)的酶活性，例如利用三氮菌素C(triacsin C)(Pubchem.ID-CID：9576787)或腺苷5′-十六烷基磷酸盐。可以将三氮菌素C加入到生长培养基中抑制FAA活性，从而增加培养基中分泌的脂肪酸的水平。这种方式可用于各酵母或真菌物种中的FAA基因不能被遗传修饰的情况。
2.1.4破坏和抑制FATp1
在另一实施方案中，本发明的酵母或真菌物种中编码脂肪酸转运蛋白的基因FATp1被破坏或抑制。在酿酒酵母中脂质代谢是区室化的，其中生物合成酶位于细胞的胞浆中，而分解代谢酶位于过氧化物酶体和线粒体中。为了氧化脂肪酸，必须通过转运蛋白如位于过氧化物酶体膜上的“脂肪酸转运蛋白”(FAT1)将它们运输到这些分开的细胞器中。Fat1本身是中链脂肪酸-CoA活化酶。因此，对该酶的抑制和/破坏阻止了脂肪酸进入过氧化物酶体，从而降低了流向脂质分解代谢途径的代谢流。在一个实施例中，FAA基因被破坏或抑制的FATp1基因是：酿酒酵母的脂肪酸转运蛋白基因(GeneID：852329(SEQ ID No：19)，其编码Protein ID-P38225(SEQ ID No：20))、解酯耶氏酵母的脂肪酸转运蛋白基因(GeneID：2911572(SEQ ID No：21)，其编码Protein ID-Q6C5Q8(SEQ ID No：22))、巴斯德毕赤酵母的脂肪酸转运蛋白基因(GeneID：8197297(SEQ IDNo：23)，其编码Protein ID-C4QXD6(SEQ ID No：24))和热带假丝酵母的脂肪酸转运蛋白基因(GeneID：8302036(SEQ ID No：25)，其编码Protein ID-C5MBJ9(SEQ ID No：26))。
2.2.0脂肪酸合成代谢提高的经遗传修饰酵母或真菌物种/菌株
2.2.1胞浆乙酰CoA产生提高的经遗传修饰酵母或真菌菌株
通过转化和表达编码丙酮酸甲酸裂合酶(pfl)的基因对本发明的酵母或真菌菌株进行遗传修饰，所述酶能够在胞浆中将丙酮酸转化成乙酰-CoA和甲酸。酵母中PFL发挥功能需要表达编码PFL同型二聚体的结构基因(pflB)及其活化酶的结构基因(pflA)，并且需要单电子供体作为辅因子。在无氧条件下，通过稳定其活性部位的甘氨酰自由基(由PflA介导的过程)无活性的PFL被转化成其活化形式。酿酒酵母含有能够活化PFL的胞浆单电子供体。在一个实施例中，来源于大肠杆菌的PflA和PflA基因被转化到了酵母或真菌菌株中。因为可利用的乙酰-CoA一般可作为不仅脂肪醇而且脂质生物合成过程的一个重要限制，这种遗传修饰促进发酵有机体产生脂肪酸。
酵母和真菌为真核生物，其中很多细胞过程是区室化的，使得大部分的脂质生物合成位于胞浆，而分解代谢位于线粒体和过氧化物酶体中。导致产生丙酮酸的糖酵解位于酵母和真菌的胞浆中，而丙酮酸向乙酰-CoA的转化由丙酮酸脱氢酶复合物催化发生在线粒体中。因此，乙酰CoA的浓度相对而言在胞浆中比在线粒体中低。丙酮酸-甲酸裂合酶是丙酮酸线粒体氧化的“旁路(Bypass)”，其将丙酮酸(通过胞浆中的糖酵解形成)转化成甲酸和乙酰CoA。因为该酶位于胞浆中，其可被用于增加胞浆中的乙酰CoA浓度，并且使更多乙酰CoA可用于通过ACC1转化成丙二酰CoA，如以下2.2.4所述。
在以上2.1.1、2.1.2、2.1.3和2.2.1以及以下点2.2.4的遗传修饰的目的是使被发酵生物体摄取强制进入脂质合成代谢途径的碳的摩尔数最大化。
2.2.2通过甲酸脱氢酶(FDH)基因缺失改善氧化还原平衡的经遗传修饰酵母或真菌物种/菌株
被遗传修饰成表达丙酮酸甲酸裂合酶(PFLA&B)(见以上2.2.1)的本发明的酵母或真菌菌株将在胞浆中产生甲酸盐或甲酸。酵母和真菌基因组包含编码甲酸脱氢酶的基因，所述酶将甲酸降解成二氧化碳和水并产生NADH分子。但是，当以甘油生长时，在磷酸甘油向磷酸甘油醛的前糖酵解氧化中已经产生了一分子NADH。脂肪酸的生物合成反应消耗2分子NADPH，而以甘油生长产生两分子NADH。加上丙酮酸甲酸裂合酶和甲酸脱氢酶的活化，每分子甘油将产生4分子DNAH。为了避免这种氧化还原失衡，需要缺失FDH基因，以此维持代谢系统的氧化还原平衡。在一个实施例中，待缺失的FDH基因是酿酒酵母的FDH基因(Gene ID：854570(SEQ ID No：44)，其编码Protein ID-Q08911(SEQ ID No：45))、热带假丝酵母的FDH基因(GeneID：8300341(SEQ ID No：46)，其编码Protein ID-C5M8W6(SEQ ID No：47))和解酯耶氏酵母的FDH基因(GeneID：2907923(SEQ ID No：48)，其编码Protein ID-Q6BZU8(SEQID No：49))。
2.2.3与氧化还原平衡偶联的氢产生提高的经遗传修饰酵母或真菌物种/菌株
本发明被遗传修饰成表达丙酮酸甲酸裂合酶(PFL A&B)(见以上2.2.1)且缺失FDH基因(见以上2.2.2)的酵母或真菌菌株将在胞浆中产生甲酸盐或甲酸。尽管通过FDH基因缺失(见以上2.2.2)避免了FDH活性造成的氧化还原失衡，但是依然有PFI活性产生的额外NADH的问题。此外，在较高浓度，甲酸对于发酵的酵母细胞具有毒害。因此，细菌甲酸氢裂合酶基因在以上2.2.1和2.2.2所述遗传修饰酵母中的异源表达(例如通过转化来自大肠杆菌的甲酸氢裂合酶(GeneID：8486957(SEQID No：50)，其编码Protein ID-C8UET5(SEQ ID No：51))将确保细胞中偶联的氢产生与氧化还原平衡。甲酸氢裂合酶在无氧条件下将甲酸分子降解成氢气和二氧化碳。在此过程中，酶利用一分子NADH作为还原当量。因此，通过这种酶解决了氧化还原失衡和甲酸毒害二者问题。此外，因为酶的活性与胞浆在无氧条件下最佳，所以与pfl和ACC1一样，这种酶的活性在用于根据本发明产生和分泌脂肪酸的两阶段发酵方法中最佳。
2.2.4丙二酰CoA的产生提高的经遗传修饰真菌菌株
丙二酰-CoA的功能是使合成代谢和分解代谢两者的多种代谢途径相互连接的代谢“交汇点”。乙酰CoA羧化酶(ACC)催化将乙酰CoA羧化形成3碳化合物“丙二酰CoA”的反应，后者随后进入脂质生物合成的代谢途径。因此，发酵酵母中丙二酰CoA胞浆浓度的提高将导致更多流向脂质生物合成并且产生更多脂肪酸。可通过过表达编码乙酰CoA羧化酶(将乙酰CoA转化成丙二酰CoA)的ACC1基因增加经修饰酵母菌株中的丙酰胺CoA的浓度。在一个实施例中，乙酰CoA羧化酶的表达/合成的增加可通过控制天然ACC编码基因在其宿主细胞中的表达水平实现，例如，用驱动更高表达水平的同类ACC基因的可替代启动子代替天然ACC基因启动子。酵母中ACC1基因的过表达可通过例如将天然ACC1基因的内源启动子用酿酒酵母的TEF1启动子[SEQ ID NO：113]代替来实现。待过表达的合适ACC1基因包括酿酒酵母的ACC1基因(GeneID：855750(SEQ ID No：27)，其编码Protein ID-Q00955(SEQ ID No：28))、粟酒裂殖酵母的ACC基因(GeneID：2543344(SEQ ID No：29)，其编码Protein ID-P78820(SEQ ID No：30))、巴斯德毕赤酵母的ACC基因(GeneID：8196923(SEQ ID No：31)，其编码Protein ID-C4QXW1(SEQID No：32))、热带假丝酵母的ACC基因(GeneID：8301221(SEQ ID No：33)，其编码Protein ID-C5M4L7(SEQ ID No：34))、解酯耶氏酵母的ACC基因(GeneID：2909424(SEQ ID No：35)，其编码ProteinID-Q6CC91(SEQ ID No：36))和构巢曲霉的ACC基因(GeneID：2871016(SEQ ID No：37)，其编码Protein ID-C8V2U7(SEQ ID No：38))。
2.3.0短链脂肪酸如十二烷酸产生增加的经遗传修饰酵母或真菌物种/菌株
由本发明的细菌或真菌物种/菌株分泌的脂肪酸优选地短于16个碳长，优选长度为14或12个碳长。脂肪酸链的长度通过胞浆酶--硫酯酶(酰基CoA-ACP硫酯酶)来确定，所述酶使得脂肪酸合成酶复合物(Fatty acidSynthase Complex，FAS)上生长中的脂肪酸链之间的键断裂并将脂肪酸释放到胞浆中。通常在酵母中，天然酰基CoA-ACP硫酯酶在脂肪酸链的长度达到16个碳时断裂脂酰-CoA与酰基载体蛋白(Acyl-Carrier Protein，ACP)之间的硫酯键。但是，另外某些油料植物如棕榈和肉桂自身的硫酯酶能够在生长中的脂肪酸链的长度达到12个碳时就断裂其硫酯键。用编码赖特萼距花(Cuphea wrightii)、Umbrelia californica、Cinnamomumcamphorum、大豆的酰基CoA-ACP硫酯酶的基因转化本发明的酵母或真菌物种/菌株将增加中链脂肪酸的比例，从而提高可来源于其的燃料混合物的质量。在一个事实方案中，本发明的酵母或真菌菌株被遗传修饰为转化有来源于以下任意的酰基CoA-ACP硫酯酶基因：大豆(Glycine max)GeneID：100170693、莱茵衣藻(GeneID：5722109(SEQ ID No：52)，其编码Protein ID-A8HY17(SEQ ID No：53))、拟南芥(GeneID：837372，其编码Protein ID-Q9SJE2(SEQ ID No：54))、蓖麻(GeneID：8269197(SEQ ID No：55)，其编码Protein ID-B9RAC3(SEQ ID No：56))、小麦(GeneID：543005)、油菜CtFatA(Genbank登录号：X73849(SEQ IDNo：57)，其编码Protein ID-Q43745(SEQ ID No：58))、红花CtFatA(Genbank登录号：M96569(SEQ ID No：59)，其编码Protein ID-Q42715(SEQ ID No：60))、山竹GmFatA1(Genbank登录号：U92876(SEQ IDNo：61)，其编码Protein ID-O04792(SEQ ID No：62))、萼距花CwFatB1(Genbank登录号：U17076(SEQ ID No：63)编码Protein ID-Q39513(SEQ ID No：64))、赖特萼距花CwFatB1(Genbank登录号：U56103(SEQ ID No：65)，其编码Protein ID-Q39662(SEQ ID No：66))、山竹GmFatB1(Genbank登录号：U92878(SEQ ID No：67)，其编码ProteinID-O04794(SEQ ID No：68))。
本发明的转化酵母或真菌菌株中硫酯酶的表达还增加了所释放脂肪酸酯化成乙酯。
2.4.0脂肪酸酯的分泌增加的遗传修饰酵母或真菌
酵母(如酿酒酵母)本身具有分泌酯化脂肪酸的天然能力，这种酯是优选的，因为其化学性质类似于“生物柴油”。酰基辅酶A：乙醇O酰基转移酶将脂肪酸转化成脂肪酸乙酯，因此酰基辅酶A：乙醇O酰基转移酶的过表达将增强脂肪酸酯的分泌。本发明酵母菌株中天然酰基辅酶A：乙醇O酰基转移酶基因(例如，酿酒酵母(GeneID：856010(SEQ ID No：71)，其编码Protein ID-Q02891(SEQ ID No：72))、巴斯德毕赤酵母(GeneID：8196549(SEQ ID No：69)，其编码Protein ID-C4QX24(SEQ ID No：70))的表达水平可通过将这些基因本身的启动子替换成较强启动子来实现。
2.5.0游离脂肪酸库(pool)增加的经遗传修饰酵母或真菌物种/菌株
在脂肪酸的合成终止且通过酰基CoA-ACP硫酯酶的活性将脂肪酸链从脂肪酸合酶复合物(FAS)断裂开时，脂酰-CoA链释放到胞浆中。通过切除CoA基团将脂酰-CoA链转化成游离脂肪酸的酶酰基-CoA硫酯酶位于酵母的过氧化物酶体中。通过异源表达哺乳动物胞浆酰基CoA硫酯酶(CTE)，本发明的经遗传修饰酵母或真菌物种胞浆中游离脂肪酸的释放和辅酶A的再循环提高。本发明遗传修饰的酵母或真菌菌株转化有以下来源的CTE基因：小鼠(GeneID：26897(SEQ ID No：73)，其编码Protein ID-O55137(SEQ ID No：74))、拟南芥(GeneID：827955(SEQ IDNo：75)，其编码Protein ID-Q5FYU1(SEQ ID No：76))或大鼠(GeneID：170588(SEQ ID No：77)，其编码Protein ID-Q6AZ44(SEQ ID No：78))。
2.6.0乙醇生物合成降低的经遗传修饰酵母或真菌物种
通过天然醇脱氢酶基因ADH1和/或ADH5的缺失，本发明的经遗传修饰酵母或真菌菌株中进入乙醇合成的碳流(Carbon flux)减少。本发明经遗传修饰酵母或真菌菌株中天然醇脱氢酶基因的表达通过以下基因的缺失降低：酿酒酵母的ADH1(GeneID：854068(SEQ ID No：79)，其编码Protein ID P00330(SEQ ID No：80))、粟酒裂殖酵母的ADH1(GeneID：2538902(SEQ ID No：81)，其编码Protein ID P00332(SEQ IDNo：82))、构巢曲霉的ADH1(GeneID：2868277(SEQ ID No：83)，其编码Protein ID C8VL73(SEQ ID No：84))、酿酒酵母的ADH5(GeneID：852442(SEQ ID No：85)，其编码Protein ID-P38113(SEQ ID No：86))。
2.7.0能够以戊糖和/或己糖作为碳源生长的经遗传修饰酵母或真菌物种/菌株
本发明的遗传修饰酵母或真菌菌株表达异源细菌甘油激酶和/或木糖异构酶基因，从而使得菌株能够以木质纤维素源底物(例如，戊糖和己糖)和/或甘油作为碳源生长产生生物柴油。这些异源表达的酶的功能是使得碳流流向脂肪酸脂质生物合成途径。本发明的遗传修饰酵母或真菌菌株转化有选自以下的一种或更多种基因：植物发酵梭菌木糖异构酶(GeneID：5743318(SEQ ID No：87)，其编码Protein ID-A9KN98(SEQ ID No：88))、鼠疫耶尔森菌木糖异构酶(GeneID：1176874(SEQ ID No：89)，其编码Protein ID-Q8Z9Z1(SEQ ID No：90))和酿酒酵母甘油激酶(GeneID：856353(SEQ ID No：91)，其编码Protein ID-P32190(SEQ IDNo：92))。
3.0提高本发明的酵母菌株的脂肪酸及其酯的产生和细胞外分泌的方法
在第一个实施方案中，本发明的酵母菌株的生长以及酵母菌株脂肪酸及其酯的细胞外分泌通过两阶段发酵法实现。根据该方法，首先用本发明的酵母菌株接种所选择的生长培养基。然后将接种的培养物孵育选自1小时至多至200小时的总时间，例如孵育至少3、5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70，80、100、120、140、160或180小时。优选地，总孵育时间为约84小时，这对于获得最大产量分泌脂肪酸是最佳的，而较长的孵育时间将伴随着产率的下降，这主要是因为所分泌的脂肪酸被发酵生物自身消耗。在孵育期间的第一阶段，最初给生长培养基通气(定义为：通气/通氧至100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、5、1、0.1％的氧饱和生长培养基)足以使得酵母菌株有氧生长的时间。可通过以1.20mmol/g/h的摄入率提供氧流且以100-120rpm的速率振摇培养物来实现饱和氧条件。有氧生长维持选自至少1小时至20小时的时间段，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18或20小时。在所选有氧生长的时期末通过部分或完全停止氧气供应减少生长培养基的通气。结果，随着氧气水平的下降，最初氧饱和的生长培养基逐渐变为无氧，造成酵母菌株的细胞进入第二无氧生长阶段。在有氧生长时期末，培养物通常达到4至5的光密度，提供足够数量的细胞进入无氧呼吸阶段，此时细胞开始在培养基中分泌和释放脂肪酸。依赖于其特定的生长速率，不同酵母菌株的OD趋于不同。
作为上述两阶段发酵法的另一实施方案，孵育本发明的酵母菌株的温度维持在15℃至45℃之间的恒定温度，例如18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40或45°C，或上述值之间的任何温度值。优选地，温度维持在25°C至35°C之间。
作为上述两阶段发酵法的另一实施方案，培养酵母菌株的生长培养基的pH维持在2.5至4.5的恒定pH，例如2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2或4.5，或上述值之间的任何pH值。优选地，pH维持在3.0至4.5之间。可以通过HCl/NaOH调节维持pH，此时定期检测培养物的pH，然后通过加入合适量的NaOH或HCl将pH调节到3.5。当使用柠檬酸钠缓冲液维持pH时，脂肪酸产量下降，这是因为柠檬酸对脂肪酸合成的抑制作用。
作为上述两阶段发酵法的另一实施方案，培养酵母菌株的生长培养基为合成培养基，其被设计成通过提供高糖(例如，200g/l右旋糖(dextrose))浓度使渗透压最大，并且具有氮源(例如，硫酸铵)和必需的B类维生素。在一个优选实施方案中，培养基基于Wickerham合成培养基(1951，参考文献)，其被改进成使具有渗透压。优选地，培养基添加碳源如甘油、葡萄糖、戊糖，优选具有以下浓度：甘油，1％至5％；葡萄糖浓度15％至20％；和戊糖浓度15％至20％。
作为上述两阶段发酵法的另一实施方案，发酵在提供有用于向培养基提供氧气以有利于有氧和无氧生长阶段二者的可控装置的生物反应器中进行。另外，所述生物反应器是提供有搅拌培养物之装置的生物反应器，并且优选允许持续引入营养物。优选地，生物反应器提供有用于将细胞外培养基与酵母细胞分离的装置。
4.0.0通过脂肪酸脱羧由游离脂肪酸产生烷烃
可通过以下多种化学步骤将本发明经遗传修饰酵母或真菌物种/菌株分泌的游离脂肪酸转化成烷烃：
4.0.1Barton脱羧
可通过Barton脱羧
(http://www.organic-chemistry.org/namedreactions/barton-decarboxylation.shtm)
或Hunsdeicker反应
(http://www.organic-chemistry.org/namedreactions/hunsdiecker-reaction.shtm)将游离脂肪酸催化脱羧转化成烷烃。
4.0.2 Kolbe电解
可通过Kolbe电解
(http://www.organic-chemistry.org/namedreactions/kolbe-electrolysis.shtm)将游离脂肪酸电解脱羧转化成烷烃。
4.03钯/铂(PD/C)催化剂
可以通过在300℃、12bar的压强下用PD/C催化剂处理4小时将游离脂肪酸转化成烷烃。
4.0.4酶促脱羧
可通过固定化酶脱羧将游离脂肪酸转化成烷烃，所述酶可由包含合适酶的细胞提取物制备，所述细胞例如含有用于使链长超过20个碳的脂肪酸脱羧的长链脂肪酸脱羧酶的昆虫细胞：意大利蜜蜂(Apis mellifera)、家蝇(Musa domestica)、湿木白蚁(Zootermopsis angusticollis)、骚扰锥蝽(Triatoma infestans)。更合适的酶可从藻类提取物获得，Crocosphaeraspp、等鞭金藻(Isochrysis)、定鞭金藻属(Prymnesium spp)、水云属(Ectocarpus spp)、昆布属(Laminaria spp)、Streblonema spp。已知当本发明的经遗传修饰酵母细胞生长在本发明的改进生长培养基上时，分泌链长超过20个碳原子的脂肪酸。长链脂肪酸(LCFA)的存在由于增加其密度、提高燃料混合物的凝固点、增加其在寒冷天气下冰冻的趋势而降低了生物柴油的质量。为了避免这一点并增加燃料的生热值，利用存在于各种昆虫如“蜜蜂”(意大利蜜蜂)、木材白蚁(湿木白蚁)、蝽等的提取物中的LCFA脱羧酶将LCFA酶促脱羧。用存在于这些昆虫的固定化提取物中的酶处理由本发明酵母分泌的脂肪酸混合物，并且处理培养基中的NADPH溶液。培养基中链长为20、22、24个碳原子的LCFA部分将被脱羧产生碳比亲本链长短一个碳的相应烷烃。因此，所得燃料混合物具有较高燃烧值。
实施例1针对酵母产生脂肪酸的关于温度、pH、培养基组成和右旋糖浓度的最佳生长条件
进行了使酵母的脂肪酸产生最大化的生长条件的实验，目的是确定调节生物量增长的条件和提高脂肪酸合成和积累和/或分泌的条件。
平行测试了两种酿酒酵母菌株：
1)国家工业微生物中心(National centre for industrialmicroorganisms，NCIM)菌株3090，
(http://www.ncl-india.org/ncim/cataloguedetails.jsp？mid＝29&category＝yeast&ncimno＝3090)
2)普通面包酵母菌株
将菌株培养在Wickerham合成培养基(Wickerham L J.1951.Taxonomy of yeast.US Department of Agriculture，Technical BulletinNo.1029.)上，其组成在表1给出，但是碳源如所示进行了改变。
表1
发酵条件：
i)接种有这两种菌株任一种的生长培养基的两阶段发酵在1升生物反应器中进行84小时的时期。初始在接种后的最初10小时，生长培养基是氧饱和的。之后停止向反应器提供氧，以使得酵母细胞逐渐进入无氧生长阶段，随着氧气水平的下降，生物反应器中建立了无氧条件。平行进行作为对照的未接种发酵，用于与接种培养物进行比较。
ii)如图1a所示，通过将生长培养基的温度调整为15至45℃分析生长温度的影响。在全部其他所测试发酵条件下，生物反应器中生长培养基维持在30℃的温度。
iii)如图1b所示，通过向发酵培养基提供终浓度为5至20g/升的葡萄糖(glucose)代替右旋糖(dextrose)作为碳源，来分析葡萄糖浓度的影响。
iv)如图1b所示，通过加入HCl或NaOH调节发酵培养基的pH以得到2.0至5.0的pH，来分析pH的影响。
脂肪酸产生分析：
发酵84小时后，通过离心将各发酵的酵母细胞与发酵液分离。通过Cocito，C和Delphini，C.1994，in Food Chemistry，50(3)，297-305.所述方法从细胞中提取脂肪酸。将生长培养基中或提取自细胞的脂肪酸用水或醇KOH皂化，通过离心回收皂化的脂肪酸，随后用浓HCl进行酸处理以产生游离脂肪酸。然后利用乙醚或氯仿的溶剂萃取法将脂肪酸与水相分离。将萃取的脂肪酸进行气相色谱分析，以鉴定脂肪酸组成及其链长度。气相色谱(GC)条件：
制备脂肪酸甲酯样品并且注入(体积：1.0ml)到GC装置中：[ChemitoGC 8610，装配有10％FFAP 3m柱(O.D：1/8，筛目-80/100)和FID检测器：FID]，用氯仿作为溶剂。温度程序：起始温度1：100℃，持续1：2分，速率1：10℃，温度2：250℃，持续2：25分钟，注射/检测器温度：250℃/250℃；载剂流速：30ml/分钟；范围：×10；衰减：×1
表2用GC测量的样品脂肪酸含量，可以将色谱图(图2)中的峰与表中的值进行比较。对应于峰的值表示存在特定链长的脂肪酸(在表的最后列给出)
结论：当生长在Wickerham合成培养基中时，最有利于两种酿酒酵母菌株产生和细胞外分泌中链脂肪酸(MCFA)的条件如下：
表3：酵母菌产生MCFA的最佳生长条件
| 参数 | 值 |
| 温度 | 25℃ |
| pH | 3.5 |
| 葡萄糖浓度 | 18g/升 |
| 发酵条件 | 起始有氧，随后无氧 |
MCFA被细胞外分泌进入生长培养基，在此MCFA及其乙酯二者是用作生物柴油的候选。
尽管没有理论支持，但是认为微生物(包括酵母)中的脂肪酸合成适合于膜脂肪酸特征谱(特别是磷脂含量)以维持其流动性，以响应生长温度的变化。较高温度刺激具有较高沸点的较长链FA合成，而较低温度刺激具有较低密度和沸点的链长较短的FA合成。
似乎发酵培养基中糖浓度的增加活化脂质生物合成机制，认为通过糖酵解产生过量的乙酰CoA转为产生丙二酰CoA，其反过来导致FA的生物合成。高葡萄糖浓度也对酵母细胞质膜有渗透压力，所述膜调整为更有弹性。这通过膜内MCFA和不饱和FA[UFA]含量的增加实现，因此不饱和链中的扭结(kink)造成分子连锁(interlock)，从而增加其弹性。
在pH3.5附近FA的产生和分泌最大，以及由于其酸性FA的分泌造成pH降低。但是，随着时间pH又开始增加，这被认为是由于产生的游离脂肪酸的酯化。这样，可以知道MCFA及其酯二者在生长培养基中积累。
实施例2.FAA2基因缺失增强酿酒酵母脂肪酸产生
2.0.0方法
将从CSM菌株库获得的酿酒酵母菌株CEN-PK2(MATa/MATa；ura3-52/ura3-52；trpl-289/trp1-289；leu2-3，112/leu2-3，112；his3D1/his3D1；MAL2-8C/MAL2-8C；SUC2/SUC2)中的FAA2基因缺失，并且用1.1kbp URA3标记基因(来源于马克斯克鲁维酵母)替换以使其能够合成尿嘧啶。URA3编码乳清苷5-磷酸脱羧酶(ODCase)，一种参与嘧啶核苷酸合成的酶。
引物组1被设计来使亲本CEN-PK2菌株(以下称WT菌株)中沿着FAA2基因上游侧翼的150碱基对和FAA2基因下游侧翼的60碱基对缺失FAA2基因。引物组3(结合在FAA2基因序列的中心附近)被用于扩增FAA2基因的～1300bp片段，以便检测来源于WT菌株的基因组DNA中的FAA2基因。使用可在www.yeastgenome.org得到的引物设计工具(引物-Design Tool)来设计引物。
表4用于基因缺失目的的引物列表
引物组1：上游：SEQ ID NO：93；下游SEQ ID NO：94，
引物组2：URA3上游侧翼fw：SEQ ID NO：95；Rv：SEQ ID NO：96，
引物组3：FAA2Fw：SEQ ID NO：97；FAA2Rv：SEQ ID NO：98。
提取WT菌株基因组DNA并且进行融合PCR，其中插入URA3基因以替换缺失的FAA2基因。按照Gietz(Gietz，Jean等1992)所述方案用URA3转化酵母细胞。将转化的菌落培养在SD-URA基本培养基平板上。利用引物组2进行菌落PCR(Colony PCR)，其清楚表明在突变菌落中存在插入的URA3基因而缺少FAA2基因。将稳定的突变菌落在基本培养基平板上培养。
将转化的酵母菌株在YPD培养基上培养2天至O.D为2，然后在改进的Wickerham合成培养基上进行生长实验，如表5所示，进行6天。
表5
＊替代碳源：甘油、木糖、消化的纤维素和半纤维素、淀粉、甘露醇以及其他糖醇、木聚糖。
发酵条件为多阶段，包括：初始48小时有氧生长，之后4天无氧条件以促进脂肪酸释放进培养基中。将培养瓶在30℃的水浴中孵育，并且以80rpm的速度振摇以有效混合。发酵6天后，测量培养物的OD，并且通过在5000rpm离心6分钟来从液相中除去细胞。根据Cocito和Delfini，1994 supra提取和定量细胞和上清中细胞内和细胞外脂肪酸。唯一与所述方案不同的是将细胞外脂肪酸提取进溶剂乙醚中而不是氯仿中。
用于分析脂肪酸的GC条件：使用DBI毛细管柱，(30m长，0.25mmi.d，膜厚0.25μm)；温度梯度为40℃至200℃6℃/分钟，200℃15分钟，200℃至260℃6℃/分钟，260℃至290℃2℃/分钟，注射器温度280℃，检测器温度300℃，分离率(split rate)1∶20；所使用载气为氮气；线性流速1.5ml/分钟；压力15.7psig；注射器体积1-2μl。
计算脂肪酸产量：特定组分的峰下面积确定了其在给定混合物中的百分比。每50ml提取液中脂肪酸的总百分比基于最大量组分(产率大于4％的那些)的百分比的和。随后，通过简单交叉相乘计算每升中这些脂肪酸的比例。
2.1.0酿酒酵母WT-菌株中缺失FAA2菌株(FAA2Δura3)的产生
通过使用引物组3的PCR证明WY菌株基因组中FAA2基因的存在，其中将所扩增的FAA2基因片段分离并通过凝胶电泳(图5)进行检测。在转化WT菌株使FAA2基因缺失后，将转化细胞培养在选择培养基平板(SD-URA)上。SD-URA平板上16个菌落的生长表明成功转化产生了Δura3酵母菌株。将由缺失突变体提取的基因组DNA利用FAA2引物和WRA3引物进行PCR扩增，以确认Δura3缺失事件，图6a，b。
在用引物组3扩增的转化菌落中未检测到FAA2基因，证实了突变体酵母基因组中FAA2基因的缺失(图6a、6b中孔3-9、11-17)。在若干用引物组2扩增的突变体菌落中清楚检测到了URA3基因(图6a、6b中孔25、26、8、30-33)，证明了Δura3缺失事件。酿酒酵母(AGPH-01)FAA2缺失菌株(FAA2Δura3)遵照Budapest Treaty条例9.1和11.4(g)以菌株名CBS126804保存在Centraalbureau voor Schimmelcultures，P.O Box85167，3508AD Utrecht，NL on 26.04.2010。
2.2.0对照酿酒酵母WT菌株的FAA2缺失菌株(FAA2Δura3)的脂肪酸合成与分泌谱
将FAA2菌株和WT菌株培养在具有特定碳源的改进型Wickerham合成培养基上，如2.0.0所述分别提取生长培养基和细胞中的脂肪酸。
2.2.1以20％葡萄糖生长的Wt菌株的细胞外脂肪酸特征谱
收获时WT菌株培养物的光密度为11。在培养基有机萃取结束时脂肪酸的产量为每50mL取样培养基5ml。通过气相色谱分离由培养基提取的细胞外分泌脂肪酸粗样品，并且用质谱(GC-MS)确定其组成。图7的GC-MS曲线示出了驻留时间(RT)对应于测试样品中的组分(主要是脂肪酸)的多个峰。对应于多于4％的分泌脂质的全部峰列在表6中。
表6：以20％葡萄糖生长的WT菌株分泌的主要细胞外脂肪酸
WT菌株分泌的纯脂肪酸的产量为约67ml/升培养物
2.2.2以20％葡萄糖生长的WT菌株的胞内脂肪酸特征谱
收获时WT菌株培养物的光密度为11。由来源于50ml样品的细胞提取的胞内脂肪酸的产量为0.5ml。通过GC-MS分析所提取的胞内脂肪酸样品。图8的GC-MS曲线示出了驻留时间(RT)对应于测试样品中的组分(主要是脂肪酸)的多个峰。对应于多于4％的分泌脂质的全部峰列在表7中。
表7：以20％葡萄糖生长的WT菌株的主要胞内脂肪酸
| 驻留时间 | 组分名称 | 组分百分比 |
| 28.84 | 十六烷酸(C：16) | 5％ |
| 30.81 | 硬脂酸(C：18) | 10％ |
| 32.48 | 油酸(C：18，9) | 22％ |
2.2.3以20％葡萄糖生长的FAA2Δura3菌株的细胞外脂肪酸特征谱
收获时培养物的光密度为7。在培养基有机萃取结束时可皂化脂肪酸的产量为每50mL取样培养基10ml。通过GC-MS分析所提取的细胞外脂肪酸样品。图9的GC-MS曲线示出了驻留时间(RT)对应于测试样品中的组分(主要是脂肪酸)的多个峰。对应于多于4％的分泌脂质的全部峰列在表8中。
表8：以20％葡萄糖生长的FAA2Δ菌株分泌的主要细胞外脂肪酸
| 驻留时间 | 组分名称 | 组分百分比 |
| 27.34 | 十五烷酸(C：15) | 5％ |
| 28.80 | 十六烷酸(C：16) | 13％ |
| 29.42 | 环二十烷(C：20) | 9.5％ |
| 30.76 | 硬脂酸(C：18) | 42％ |
| 31.30 | ？ | 7.6％ |
FAA2Δ菌株分泌的纯脂肪酸的产量为约134ml/升培养物。与酿酒酵母WT菌株相反，FAA2Δ菌株中未分泌极长链脂肪酸(Very Long ChainFatty Acids，VLCFA)。
2.2.4以20％葡萄糖生长的FAA2Δura3菌株的胞内脂肪酸特征谱
收获时FAA2Δ菌株培养物的光密度为7。由来源于50ml样品的细胞提取的胞内脂肪酸的产量为0.4ml。通过GC-MS分析所提取的胞内脂肪酸样品。图10的GC-MS曲线示出了驻留时间(RT)对应于测试样品中的组分(主要是脂肪酸)的多个峰。对应于多于4％的分泌脂质的全部峰列在表9中。
表9：以20％葡萄糖生长的FAA2Δ菌株分泌的主要胞内脂肪酸
| 驻留时间 | 组分名称 | 组分百分比 |
| 28.81 | 十六烷酸(C：16) | 20％ |
| 30.75 | 硬脂酸(C：18) | 23％ |
| 32.36 | 油酸(C：18，9) | 31％ |
以葡萄糖生长的FAA2Δ菌株与WT菌株相比胞内C18脂肪酸相对的量提高。
2.2.5以5％甘油生长的WT菌株的细胞外脂肪酸特征谱
为了评估生长培养基中的可替代碳源，将葡萄糖用5％甘油代替，而保持生长培养基的其余组分不变。收获时WT菌株培养物的光密度为7。在培养基有机萃取结束时脂肪酸的产量为4ml/50mL取样培养基。通过GC-MS分析所提取的细胞外脂肪酸样品。图11的GC-MS曲线示出了驻留时间(RT)对应于测试样品中的组分(主要是脂肪酸)的多个峰。对应于多于4％的分泌脂质的全部峰列在表10中。
表10：以5％甘油生长的WT菌株分泌的主要细胞外脂肪酸
WT菌株分泌的纯脂肪酸的产量为约60ml/升培养物。
2.2.6以5％甘油生长的FAA2Δura3菌株的细胞外脂肪酸特征谱
收获时WT菌株培养物的光密度为4。在培养基有机萃取结束时脂肪酸的产量为每50mL取样培养基2.5ml。通过GC-MS分析所提取的细胞外脂肪酸样品。图12的GC-MS曲线示出了驻留时间(RT)对应于测试样品中的组分(主要是脂肪酸)的多个峰。对应于多于4％的分泌脂质的全部峰列在表11中。
表11：以5％甘油生长的FAA2Δ菌株分泌的主要胞外脂肪酸
FAA2Δ菌株分泌的纯脂肪酸(包括硅氧烷)的产量为约32ml/升培养物(表12)
表12WT菌株和FAA2Δ菌株分泌的脂肪酸的产量
| 酵母菌株 | 脂肪酸产率 | 碳源和浓度 |
| WT-菌株 | 67ml/升 | 20％葡萄糖 |
| WT-菌株 | 60ml/升 | 5％甘油 |
| FAA2Δ菌株 | 134ml/升 | 20％葡萄糖 |
| FAA2Δ菌株 | 32ml/升 | 5％甘油 |
2.2.7与酿酒酵母WT对比的FAA2缺失菌株(FAA2Δura3)的脂肪酸合成和分泌特征谱总结
当以葡萄糖作为碳源生长时，FAA2Δ菌株分泌的纯脂肪酸比WT菌株提高了7％-8％。当以甘油生长时，与在该碳源上缓慢的生长速率相对应的是，FAA2Δ菌株和WT菌株二者的脂肪酸产量都下降。如果不算WT菌株产生的VLCFA(四十四烷)，FAA2Δ菌株分泌到培养基中的纯MCFA的比例还比WT菌株提高16％。FAA2Δ菌株分泌的主要MCFA是十六烷酸(C：16∶0)和硬脂酸(C18∶0)和油酸(C：18∶1)。由于样品中的脂肪酸酯与色谱柱的固定相反应，所以应当将硅氧烷的脂肪酸衍生物作为原样品中各脂肪酸的信号。
与WT菌株相反，突变体没有产生任何痕量的极长链脂肪酸(VLCFA)。VLCFA是固体脂肪并且基本不适于作为生物柴油。酿酒酵母中的脂肪酸延长酶系统(ELO1、ELO2、ELO3)用于使链长16的脂肪酸(MCFA)向20至26延长。WT菌株产生的高比例VLCFA表明在FAA2基因的存在下延长酶系统的活性提高。出人意料的是，FAA2基因的缺失停止了通过脂肪酸延长酶系统进入VLCFA的碳损失。更确切地说，FAA2缺失使得碳流通道远离VLCFA而流向MCFA，表明具有决定酵母中脂肪酸链长的作用。获自FAA2Δ菌株的直接适于合成生物柴油的脂肪酸的最大产率在葡萄糖中高达18-20％。每分子甘油的脂肪酸产率相当于(稍高)葡萄糖。无氧呼吸相关的生长条件导致了脂肪酸的分泌。
总之，酵母中FAA2基因的缺失能够抑制MCFA分解代谢并且使得碳流向MCFA，增加该中链脂肪酸的分泌(主要为十六烷酸(C：16∶0)、硬脂酸(C：18∶0)和油酸(C：18∶1))，为本发明提供了适于产生生物柴油的改进的酵母菌株。
实施例3.用于产生适于产生柴油的脂肪酸的热带假丝酵母的用途
将热带假丝酵母(DTU菌株库)培养在以具有特定碳源的改进型Wickerham合成培养基上，按照2.0.0所述分别提取生长培养基和细胞中的脂肪酸。
3.0.0当热带假丝酵母生长在补充有葡萄糖的合成培养基上并且通过GC-MS提取和分析所分泌的脂肪酸时，检测到总计21个峰(图13)。对应于35％总提取脂肪酸的最突出的峰具有28.84分钟的驻留时间，鉴定为十六烷酸。有机萃取后可皂化脂肪酸的产量为7.5ml/50培养基。十六烷酸的产量为50ml/升培养基。
3.0.1当热带假丝酵母生长在补充有5％甘油的合成培养(表5)基上并且通过GC-MS提取和分析所分泌的脂肪酸时，检测到总计19个峰(图14)。对应于85.4％总提取脂肪酸的最突出的峰具有28.92分钟的驻留时间。尽管RT对应于杀虫剂2-(2，2二氯乙烯基)-3，3-二甲基环丙烷羧酸2-丁氧乙酯，但根据其各分子量，该峰被归于十六烷酸。有机萃取后可皂化脂肪酸的产量为7ml/50培养基。十六烷酸的产量为120ml/升培养基。
3.02热带假丝酵母的脂肪酸合成和分泌谱总结
培养在补充有葡萄糖或甘油的培养基上的热带假丝酵母在无氧发酵阶段分泌MCFA十六烷酸。所分泌的十六烷酸的产量很高，对应于120ml/升生长培养基。因此，根据本发明的热带假丝酵母是特别适于产生生物柴油的酵母菌株。
实施例4过表达乙酰CoA羧化酶以增加丙二酰CoA浓度
酵母中ACC1基因的过表达通过用来源于酿酒酵母的TEF1启动子[SEQ ID NO：113]替换天然ACC1基因的内源启动子实现，以便得到经遗传修饰酵母中的ACC1过表达。用于启动子替换的系统基于二分(bipartite)DNA分子，其中两个DNA片段的每一个都携带目标序列(待插入序列)和所选择的标记基因，所述标记基因无功能但是与第二片段中的相同标记的一些部分同源(图15)。第一片段含有ACC1上游序列、正向重复和上游2/3乳酸克鲁维酵母(KI)URA3。使用野生型酿酒酵母的基因组作为模板，利用引物ACC1(SWA3和SWA4)扩增对应于ACC1启动子之前序列的上游。以pWJ1042作为模板利用引物SWA5和SWA6(表13)扩增具有上游2/3Kl URA3的正向重复。然后用引物SWA3和SWA6将两种PCR产物融合到一起。为了获得第二片段，产生3种PCR产物。利用引物SWA7和SWA8(表13)由pWJ1042扩增与第一片段中的1/3Kl URA3同源的下游2/3Kl URA3。分别利用引物SWA 9/10和SWA11/12(表13)由酵母基因组DNA扩增TEF1启动子和与ACC1的前一部分同源的下游序列。然后通过使用引物SWA7和SWA12的另一RCR反应将三种PCR产物融合。然后将上述两种片段转化到酿酒酵母中并通过同源重组整合进酵母染色体。建立系统以使得URA3标记能够回收。为了通过重组使URA3标记缺失，将转化体接种在含有5-氟乳清酸(5-FOA)的培养基中。因为Ura3使5-FOA代谢成毒性化合物，所以会杀死保留URA3的酵母，这样缺少URA3的酵母就能耐受5-FOA并且存活。将由此产生的菌株称作SC-ACC1菌株。
表13
引物SWA3-SEQ ID NO：99；引物SWA4-SEQ ID NO：100；引物SWA5-SEQ ID NO：101；引物SWA6-SEQ ID NO：102；引物SWA7-SEQ IDNO：103；引物SWA8-SEQ ID NO：104；引物SWA9-SEQ ID NO：105；引物SWA10-SEQ ID NO：106；引物SWA11-SEQ ID NO：107；引物SWA12-SEQ ID NO：108。
4.0.2通过过表达ACC1得到的较高代谢流与FAA2缺失形式的脂肪酸分解代谢抑制相偶联，以净增加脂肪酸的产生。如实施例2所述，将SC-ACC1菌株作为模板链，用于通过用URA3基因代替FAA2引入FAA2的缺失。通过提取自突变株的gDNA的PCR分析证明双突变株(称作SC-FAA2-ACC1)的改造(图16)。
实施例5用于增加丙酮酸流的丙酮酸甲酸裂合酶pfl(A&B)的表达
通过异源胞质表达编码将丙酮酸(EMP途径产物)转化成甲酸和乙酰CoA的被称为pflA或pflB酶的丙酮酸甲酸裂合酶的细菌基因来增加改造酵母中乙酰CoA的浓度。
首先将丙酮酸甲酸裂合酶基因(来源于大肠杆菌K12的丙酮酸甲酸裂合酶A(PflA)(GeneID：4491405(SEQ ID No：39)，其编码ProteinID-A1A9E2(SEQ ID No：41))或丙酮酸甲酸裂合酶B(PflB)(GeneID：4494334(SEQ ID No：42)，其编码Protein ID-A1A9I0(SEQ ID No：43)))克隆到载体(质粒)中。利用其各自的5′和3′正向引物和反向引物(表14)扩增pflB、pflA基因(图17)。通过使用限制酶EcoRI、Xbal、Spel和Pstl的前置和后置插入的“生物砖块(biobrick)”组装策略来克隆基因。最终构建体由pGal1-基因-Adh1-终止子组成，并且转移到酵母Tet-off基穿梭载体PCM182和PCM183(图18)中。然后将组装体用于任何产生脂肪酸的酵母系统。
表14
PflA正向引物-SEQ ID NO：109；反向引物-SEQ ID NO：110
PflB正向引物-SEQ ID NO：111；反向引物-SEQ ID NO：112
用质粒PCM182(PflA)和PCM183(PflB)两者转化四种酿酒酵母菌株(野生型和3种经遗传修饰菌株)，通过在SC-TRP琼脂平板上培养来挑选包含了插入的PflA基因和PflB基因两者的转化菌株[称为PFL系统]。将所产生的四种突变菌株称作以下：
酿酒酵母-PFL系统
酿酒酵母-ΔFAA2+PFL系统
酿酒酵母-TEF1ΔACC1+PFL系统
酿酒酵母-ΔFAA2+TEF1ΔACC1+PFL系统
实施例6使用本发明的酵母菌株由不同碳源产生适于生物柴油的脂肪酸
6.0.1本发明的亲本和突变酵母的命名
| 菌株号 | 酿酒酵母菌株 | 基因型 |
| 1 | 亲本菌株-CENPK2 | WT |
| 2 | WT的FAA2缺失 | ΔFAA2 |
| 3 | WT的TEF1/ACC1启动子转换 | TEF1ΔACC1 |
| 4 | 插入WT的PFL系统(PflA&B基因) | PFL |
| 5 | WT的ΔFAA2/PFL双突变体 | ΔFAA2/PFL |
| 6 | WT的TEF1ΔFAA/PFL双突变体 | TEF1ΔACC1/PFL |
| 7 | WT的ΔFAA2/TEF1ΔACC1双突变体 | ΔFAA2/TEF1ΔACC1 |
| 8 | WT的ΔFAA2/TEF1ΔACC1/PFL三突变体 | ΔFAA2/TEF1ΔACC1/PFL |
| 9 | 热带假丝酵母-野生型 | CT-WT |
| 10 | 嗜鞣管囊酵母-野生型 | PT-WT |
6.02提供有20％葡萄糖作为碳源的本发明酵母菌株产生的脂肪酸的特征谱
将酵母菌株培养在表5给出限定生长培养基(改进型Wickerham合成培养基)上，其中所选择的唯一碳源是20％葡萄糖。酵母菌株在发酵生长条件的生长以及随后所产生的细胞外脂质(脂肪酸生产)的提取和分析按实施例2.0.0定义。将所提取的脂肪酸浓缩至体积2ml并且送去进行GC-MS分析。2ml体积脂肪酸的谱在表15和图19给出。
表15：20％葡萄糖上酵母菌株产生的脂肪酸的特征谱
| 菌株 | C：6 | C：8 | C：11 | C：12 | C：14 | C：14,1 | C：15 | C：16 | C：17,1 | C：18 | C：20 | C＞20 | 总计 |
| 1 | - | -- | -- | - | - | - | - | 14％ | - | 11％ | 0 | 52％ | 77％ |
| 2 | - | -- | -- | - | - | - | 5％ | 13％ | 42％ | 9.5％ | 0 | 69.5％ | |
| 4 | 1.4％ | 1.9％ | 2.9％ | 2％ | 14.8％ | - | 34.1％ | - | 30％ | 2.1％ | - | 89.2％ | |
| 5 | - | - | - | - | - | 14％ | - | 49.5％ | - | 30％ | 2.5％ | - | 96％ |
| 6 | - | - | - | - | 2.1％ | - | - | 52％ | - | 26.5％ | - | 2.8％ | 83.4％ |
| 7 | 2.4％ | - | - | 2.9％ | 14.7％ | - | 41％ | 13.3％ | 14.6％ | 3.2％ | -- | 92.1％ | |
| 8 | 3.6％ | 5％ | - | - | 4.1％ | 21.1％ | - | 30％ | 16.2％ | 12.6％ | - | - | 92.6％ |
| 9 | - | - | - | - | - | - | - | 35％ | - | 22％ | - | - | 57％ |
图19表明当菌株以20％葡萄糖作为底物培养时，菌株4、5(包含PFL系统，其提高乙酰CoA的胞浆水平)增强了由葡萄糖产生脂肪酸的产率。进一步的三重突变(菌株8)表明改造脂肪酸生物合成方法的途径对于脂肪酸总产量具有积极作用。
表15显示了突变对于所产生的脂肪酸特征谱的影响。WT酵母菌株1产生的大部分脂肪酸是极长链脂肪酸(VLCFA)类型，不适于产生生物柴油。当以葡萄糖培养时，所有突变对于降低脂肪酸长度具有巨大且出乎意料的作用。突变株分泌的大部分脂肪酸为中链脂肪酸，对于其作为生物柴油具有重要商业意义。单独的FAA2缺失对脂肪酸链长的作用是出人意料的。
此外，菌株4、5、6和7的双重突变体产生了短链脂肪酸比例增加的脂肪酸。
三重突变体(图8)表现为较低比例的较长硬脂酸和较高比例的较短链长脂肪酸。这些较短脂肪酸的存在使得生物柴油的质量更好，因为较短的脂肪酸燃烧更充分且在较低温度不冰冻。
6.0.3提供有5％纯甘油作为碳源的本发明酵母菌株产生的脂肪酸的特征谱
将酵母菌株培养在表5给出限定生长培养基(改进型Wickerham合成培养基)上，其中所选择的唯一碳源是5％纯甘油。酵母菌株在发酵生长条件的生长以及随后所产生的细胞外脂质(脂肪酸产物)的提取和分析如实施例2.0.0中所定义。将所提取的脂肪酸浓缩至体积2ml并且进行GC-MS分析。2ml体积脂肪酸的特征谱在表16和图20给出。
表16：5％纯甘油上酵母菌株产生的脂肪酸的特征谱
| 菌株 | C：6 | C：8 | C：14 | C：14,1 | C：16 | C：18 | C：20 | C＞20 | C：18-1 | C：18-2,6 | 总计 |
| 1 | 0 | 74％ | 74％ | ||||||||
| 2 | 4％ | 18％ | 30.5％ | 0 | 52.5％ | ||||||
| 3. | 1％ | 1％ | 7％ | 2％ | 11％ | ||||||
| 5 | 2％ | 20％ | 43％ | 32％ | 2.6％ | 99.6％ | |||||
| 6 | 23.4％ | 45％ | 31.4％ | 99.8％ | |||||||
| 7 | 5.8％ | 1％ | 20％ | 11.5％ | 38.3％ | ||||||
| 8 | 10％ | 5.1％ | 7.8％ | 7.2％ | 30.2％ | ||||||
| 9 | 0 | 2,25％ | 2.25％ | ||||||||
| 10 | 4％ | 0％ | 15％ | 0 | 19％ |
图16显示当以5％纯甘油培养菌株时，单一突变的菌株(菌株2和3)比WT菌株1产生更低水平的脂肪酸。但是，包含PFL系统的双重突变体显示脂肪酸的产量提高。其可能原因是在甘油进入糖酵解途径(甘油＞＞磷酸甘油醛-3-磷酸)时产生的额外NADH保持为未使用，从而造成NAD+失衡，其妨碍单突变体菌株的生长。但是，引入PLF系统消除了细胞系统的这种NADH失衡，因此，发现具有PFL系统的双重突变体菌株具有较高性能。
表16显示了突变对于所产生的脂肪酸特征谱的影响。包含PLF系统的双突变体(菌株5和6)表现出由MCFA构成的类似脂肪酸特征谱。缺少PFL系统的双突变体菌株(菌株7)不能具有类似于菌株5和6的高脂肪酸产率，证实了PFL系统在能够发酵甘油产生脂肪酸中的重要作用。尽管三重突变株产生的脂肪酸总量低于WT或双重突变株，但是再次出乎意料地表现为有利于产生较高比例的较短链长脂肪酸。
6.0.4提供5％粗甘油作为碳源的本发明酵母菌株产生的脂肪酸的谱
将酵母菌株培养在表5给出限定生长培养基(改进型Wickerham合成培养基)上，其中所选择的唯一碳源是5％粗甘油。酵母菌株在发酵生长条件的生长以及随后所产生的细胞外脂质(脂肪酸产物)的提取和分析如实施例2.0.0中定义。将所提取的脂肪酸浓缩至体积2ml并且进行GC-MS分析。2ml体积脂肪酸的谱在表17和图21给出。
表17：5％粗甘油上酵母菌株产生的脂肪酸的特征谱
粗甘油包含其他可能促进或抑制酵母菌株的生长和发酵的成分。单突变体菌株2和3以及三重突变体8表现出以粗甘油生长和产生比WT菌株更多的MCFA的能力。菌株10也出乎意料地表现出以粗甘油生长并将其发酵成脂肪酸的强健能力。菌株2、3和8的表现也证实了FAA2基因缺失以及ACC1基因的活化对于通过发酵产生脂肪酸之活性的重要性。
6.0.5提供15％木糖作为碳源的本发明酵母菌株产生的脂肪酸特征谱
将酵母菌株培养在表5给出限定生长培养基(改进型Wickerham合成培养基)上，其中所选择的唯一碳源是15％木糖。酵母菌株在发酵生长条件的生长以及随后所产生的细胞外脂质(脂肪酸产物)的提取和分析如实施例2.0.0中所定义。将所提取的脂肪酸浓缩至体积2ml并且进行GC-MS分析。2ml体积脂肪酸的谱在表18和图22给出。
表18：15％木糖上酵母菌株产生的脂肪酸的特征谱
出乎意料的是，菌株3、4、5和8在利用木糖和产生脂肪酸上胜过了WT。同样，PFL系统有利于增强单突变体、双突变体和三突变体菌株产生脂肪酸。
6.0.6提供水解小麦木质纤维素作为碳源的本发明酵母菌株产生的脂肪酸特征谱
将酵母菌株培养在表5给出限定生长培养基(改进型Wickerham合成培养基)上，其中所选择的唯一碳源是水解小麦木质纤维素。酵母菌株在发酵生长条件的生长以及随后所产生的细胞外脂质(脂肪酸产物)的提取和分析如实施例2.0.0中所定义。将所提取的脂肪酸浓缩至体积2ml并且进行GC-MS分析。2ml体积脂肪酸的谱在表19和图23给出。
表19：水解小麦木质纤维素上酵母菌株产生的脂肪酸特征谱
改造的酵母菌株在小麦秸秆水解产物形式的消化木质纤维素上的生长表现为三突变体菌株(菌株8)比其他改造菌株产生更多的脂肪酸，而单突变体FAA2也是有效的。但是菌株8相比于菌株2在中链脂肪酸的产生及其分布范围上具有额外的优点，这对于生物柴油的最佳质量很重要。此外，菌株8分泌的脂肪酸全部为脂肪族饱和脂肪酸，而在菌株2的脂肪酸特征谱中明显存在不饱和脂肪酸。
| 申请人或代理机构案号P81000119PCT | 国际申请号PCT/EP2011/060237 |
有关保藏的微生物或其他生物材料的说明（PCT Rule 13bis）
表格PCT/RO/134（1998年7月；2004年1月重新印刷）
Claims (17)
1.一种用于细胞外产生游离脂肪酸及其酯的经遗传修饰微生物，其中所述微生物的特征在于：
a.脂酰-CoA合成酶的活性降低，其通过FAA2基因缺失实现，和
b.乙酰CoA羧化酶的表达增强，其通过重组内源ACC1基因实现，其中所述基因与异源启动子有效连接，或
c.编码包括PflA和PflB的丙酮酸甲酸裂合酶的转基因，
其中所述微生物选自物种：曲霉属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)、隐球酵母属(Cryptococcus)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、镰刀菌属(Fusarium)、Lindnera、油脂酵母属(Lipomyces)、红曲霉属(Monascus)、毛霉属(Mucor)、管囊酵母属(Pachysolen)、毕赤酵母属(Pichia)，根霉属(Rhizopus)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)，红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyces)，裂殖酵母属(Schizosacchromyces)，丝孢酵母属(Trichosporon)、耶氏酵母属(Yarrowia)、和接合酵母属(Zygosacchromyces)。
2.根据权利要求1所述的经遗传修饰微生物，其特征在于：(a)的FAA2基因缺失，与异源启动子有效连接的重组内源ACC1基因(b)，和编码包括PflA和PflB的丙酮酸甲酸裂合酶的转基因。
3.根据权利要求1或2所述的经遗传修饰微生物，其特征还在于编码酰基CoA-ACP硫酯酶的转基因，其中所述硫酯酶选自：大豆(Soyabean)(Glycine max)、莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)(Protein ID-A8HY17；SEQ ID NO：53)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)(Protein ID-Q9SJE2；SEQ ID NO：54)、蓖麻(Ricinus communis)(Protein ID-B9RAC3；SEQ ID NO：56)、小麦(Triticum aestivum)(GeneID：543005)、油菜(Brassica napus)的CtFatA(Protein ID-Q43745；SEQID NO：58)、红花(C.tinctorius)的CtFatA(Protein ID-Q42715；SEQ IDNO：60)、山竹(G.mangostana)的GmFatA1(Protein ID-O04792；SEQID NO：62)、萼距花(C.hookeriana)的CwFatB1(Protein ID-Q39513；SEQID NO：64)、赖特萼距花(C.wrightii)的CwFatB1(蛋白质ID-Q39662；SEQ ID NO：66)、山竹(G.Mangostana)的GmFatB1(蛋白质ID-O04794；SEQ ID NO：68)。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的经遗传修饰微生物，其特征还在于酰基辅酶A：乙醇O-酰基转移酶的表达增强，其通过如下实现：
a.重组内源酰基辅酶A：乙醇O-酰基转移酶(EEB1)基因，其中所述基因与异源启动子有效连接。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的经遗传修饰微生物，其特征还在于编码异源胞浆酰基CoA硫酯酶(CTE-1)的转基因，其中所述CTE-1选自小鼠(Mus muscilis)(Protein ID-O55137；SEQ ID NO：74)、拟南芥(Protein ID-Q5FYU1；SEQ ID NO：76)或大鼠(Rattus norvegicus)(Protein ID-Q6AZ44；SEQ ID NO：78)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的经遗传修饰微生物，其特征还在于编码异源甘油激酶或木糖异构酶或编码二者的一个或更多个转基因，其中所述甘油激酶选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)甘油激酶(Protein ID-P32190；SEQ ID NO：92)，而所述木糖异构酶选自植物发酵梭菌(Clostridium phytofermentas)木糖异构酶(Protein ID-A9KN98；SEQ ID NO：88)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)木糖异构酶(Protein ID-Q8Z9Z1；SEQ ID NO：90)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的经遗传修饰微生物，其特征还在于内源甲酸脱氢酶FDH基因的缺失，其中所述FDH基因选自：GeneID：854570(SEQ ID NO：44)、GeneID：8300341(SEQ ID NO：46)和GeneID：2907923(SEQ ID NO：48)。
8.根据权利要求7所述的经遗传修饰微生物，其特征还在于编码异源甲酸氢裂合酶的转基因，其中所述裂合酶为大肠杆菌(E.coli)甲酸氢裂合酶(Protein ID-C8UET5；SEQ ID NO：51)。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的经遗传修饰微生物，其特征还在于内源醇脱氢酶(ADH)基因的缺失，其中所述ADH基因选自：GeneID：854068(SEQ ID NO：79)、GeneID：2538902(SEQ ID NO：81)、GeneID：2868277(SEQ ID NO：83)和GeneID：852442(SEQ ID NO：85)。
10.一种包含以下成分的生长培养基：
并且其中所述碳源选自葡萄糖、甘油、木糖、水解纤维素和半纤维素、淀粉、糖醇和木聚糖中至少之一。
11.一种细胞外产生游离脂肪酸及其酯的方法，其包括步骤：
a.将酵母或真菌菌株引入到生长培养基中以产生培养物；
b.孵育所述培养物，其中对所述培养物中所述生长培养基通氧；
c.在步骤(b)后不供应氧的情况下进一步孵育所述培养物；
d.从所述培养物中回收包含游离脂肪酸及其酯的胞外相；
其中所述微生物为酵母或真菌菌株。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述微生物为具有以下一个或更多个特征的经遗传修饰微生物：
a.脂酰-CoA合成酶的活性降低，其通过FAA2基因缺失实现，
b.乙酰CoA羧化酶的表达增强，其通过重组内源ACC1基因实现，其中所述基因与异源启动子有效连接，和
c.编码包括PflA和PflB的丙酮酸甲酸裂合酶的转基因，
其中所述微生物选自物种：曲霉属、假丝酵母属、隐球酵母属、德巴利酵母属、镰刀菌属、Lindnera、油脂酵母属、红曲霉属、毛霉属、管囊酵母属、毕赤酵母属，根霉属、红冬孢酵母属，红酵母属、酵母属，裂殖酵母属，丝孢酵母属、耶氏酵母属和接合酵母属。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述微生物选自(Candidatropicalis)、嗜鞣管囊酵母(Pachysolen tannophilus)或根据权利要求1至9中任一项所述的微生物。
14.根据权利要求11至13中任一项所述方法，其中所述生长培养基包含选自葡萄糖、甘油、木糖、水解纤维素和半纤维素、淀粉、糖醇和木聚糖中至少之一的碳源。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述生长培养基包含权利要求11给出的成分或由其组成。
16.酵母或真菌菌株用于细胞外产生游离脂肪酸及其酯的用途，其中所述微生物为具有以下一个或更多个特征的经遗传修饰微生物：
a.脂酰-CoA合成酶的活性降低，其通过FAA2基因缺失实现，
b.乙酰CoA羧化酶的表达增强，其通过重组内源ACC1基因实现，其中所述基因与异源启动子有效连接，和
c.编码包括PflA和PflB的丙酮酸甲酸裂合酶的转基因，
其中所述微生物选自物种：曲霉属、假丝酵母属、隐球酵母属、德巴利酵母属、镰刀菌属、Lindnera、油脂酵母属、红曲霉属、毛霉属、管囊酵母属、毕赤酵母属，根霉属、红冬孢酵母属，红酵母属、酵母属，裂殖酵母属，丝孢酵母属、耶氏酵母属和接合酵母属。
17.根据权利要求16所述的用途，其中所述微生物选自热带假丝酵母、嗜鞣管囊酵母或根据权利要求1至9中任一项所述的微生物。
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