CN104024419A - 使用了重组酵母的乙醇的制造方法 - Google Patents

使用了重组酵母的乙醇的制造方法 Download PDF

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Abstract

在具有木糖代谢能力的酵母中的木糖同化和乙醇发酵时，代谢培养基中的乙酸而降低乙酸浓度。将具有木糖代谢能力、且导入了乙醛脱氢酶基因的重组酵母，用含有纤维素、纤维素酶和木糖的培养基培养，从而进行乙醇发酵。

Description

使用了重组酵母的乙醇的制造方法
技术领域
本发明涉及使用了具有木糖代谢能力的重组酵母的乙醇的制造方法。
背景技术
纤维素系生物质作为乙醇等有用醇和/或有机酸的原料而被有效利用。为了在利用了纤维素系生物质的乙醇制造中提高乙醇生产量，开发了作为底物能够利用5碳单糖木糖的酵母。例如，专利文献1公开了染色体中插入了来源于树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因以及来源于酿酒酵母(S.cerevisiae)的木酮糖激酶基因的酵母。
另外，已知乙酸在纤维素系生物质的水解物中大量含有，抑制酵母的乙醇发酵。特别地，已知在导入了木糖的同化基因的酵母中，显著地抑制以木糖为糖源的乙醇发酵(非专利文献1和2)
另一方面，将用纤维素酶糖化纤维素系生物质而得的物质进行发酵后的醪中，主要包含未发酵残渣、难发酵残渣、酶和发酵用微生物。通过将包含醪的反应液在接着进行的发酵中利用，可以实现发酵用微生物的再利用，降低发酵用微生物的新加入量，实现低成本化。但是，此时，醪所含的乙酸也同时被带入，其结果是有时发酵培养基所含的乙酸的浓度上升，抑制乙醇发酵。另外，即使在将发酵槽内的醪送入保持减压的闪蒸罐，在闪蒸罐内除去乙醇后，将醪送回发酵槽这样的连续发酵法中，也难以从醪中去除乙酸，因而由乙酸产生的发酵抑制成为重要的问题。
为了避免由乙酸产生的发酵抑制，有通过乙醇发酵中一般使用的菌株酿酒酵母的LPP1基因和/或ENA1基因的过表达(非专利文献3)、FPS1基因的破坏(非专利文献4)来改善在乙酸存在下乙醇的发酵能力的报告。然而，这些报告是以葡萄糖作为底物时的乙醇发酵的结果，对由于乙酸而发酵被显著抑制的以木糖作为底物时的乙醇发酵的效果不明。另外，即使使用这些报告的突变酵母，也不能实现减少在如上所述的发酵菌体再利用和/或连续发酵时成为问题的乙酸的带入量。
作为避免由乙酸产生的发酵抑制的其他方法，考虑使培养基中的乙酸在乙醇发酵的同时代谢。但是，乙酸的代谢是需氧的反应，与乙醇的代谢途径重复。因此，虽然如果在需氧条件下进行发酵则可能使乙酸代谢，但同时目的物质乙醇也被代谢。
为了在乙醇不被代谢的厌氧条件下使乙酸代谢，有通过在破坏了酿酒酵母的甘油生产途径的GPD1·GPD2基因的株中导入编码乙醛脱氢酶(EC1.2.1.10)的mhpF基因，从而同化乙酸的报告(非专利文献5、专利文献2)。此外，乙醛脱氢酶催化以下的可逆反应。
乙醛+NAD＋+辅酶A乙酰辅酶A+NADH+H+
此外，利用GPD1·GPD2基因的甘油生产途径如下述式所示，是将代谢中产生的剩余的辅酶NADH氧化成NAD＋的途径。
0.5葡萄糖+NADH+H++ATP→甘油+NAD++ADP+Pi
于是通过破坏GPD1·GPD2基因来破坏该反应途径，通过导入mhpF来供给剩余的辅酶NADH，进行下述的反应。
乙酰辅酶A+NADH+H+→乙醛+NAD＋+辅酶A
另外，乙酰辅酶A由乙酸通过乙酰辅酶A合成酶而合成，乙醛被转换成乙醇，因而最终形成下述反应式，在剩余的辅酶NADH被氧化的同时，乙酸也被代谢。
乙酸+2NADH+2H++ATP→乙醇+NAD＋+AMP+Pi
如上所述，对酵母赋予乙酸代谢能力的机理，需要破坏甘油途径。然而，已知GPD1基因和GPD2基因的重复破坏株发酵能力大幅降低，产业水平上的实用性低。另外，非专利文献5和专利文献2不是关于木糖同化酵母的报告，在木糖同化时是否有效果是不明的。
此外，还有对GPD1基因和GPD2基因的非破坏株导入mhpF基因的报告(非专利文献6)。然而，非专利文献6中虽然通过mhpF基因的导入而乙酸的生产量减少，但没有培养基中的乙酸减少这样的报告。进而，该非专利文献6也还不是关于木糖同化酵母的报告。
此外，有对导入了木糖还原酶(XYL1)基因、木糖醇脱氢酶(XYL2)基因(均来源于树干毕赤酵母(Pichia stipitis))和木酮糖激酶(XKS1)基因(来源于酿酒酵母)的木糖同化酵母，导入乙醛脱氢酶基因(来源于溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica))的报告(非专利文献7和专利文献3)。然而，这些文献中在木糖同化时不发生乙酸同化，与乙醛脱氢酶非导入株相比培养基中的乙酸浓度无差异。
如上，现有技术中并未报告在同化木糖的同时进行乙醇发酵的条件下，使乙酸效率良好地代谢·分解的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2009-195220号公报
专利文献2：WO2011/010923
专利文献3：WO2003/078643
非专利文献
非专利文献1：FEMS Yeast Research,vol.9,2009,358-364
非专利文献2：Enzyme and Microbial Technology33,2003,786-792
非专利文献3：Biotechnol.Bioeng.2009103(3):500-512
非专利文献4：Biotechnol.Lett.201133:277-284
非专利文献5：Appl.Environ.Microbiol.201076:190-195
非专利文献6：Biotechnol.Lett.201133:1375-1380
非专利文献7：Appl.Environ.Microbiol.200470:2892-2897
发明内容
发明要解决的课题
因此，本发明鉴于上述事实，特别地提供乙醇的制造方法，其中，使用了具有木糖代谢能力的酵母中的在木糖同化和乙醇发酵时能够代谢培养基中的乙酸而降低乙酸浓度的重组酵母。
用于解决课题的方法
为了实现上述目的，本发明者们进行了深入研究，结果发现，对具有木糖代谢能力的酵母导入了特定的乙醛脱氢酶基因的重组酵母，在包含纤维素和木糖的培养基中，在一边糖化纤维素一边进行乙醇发酵时，能够代谢培养基中的乙酸，从而完成了本发明。
本发明包含以下内容。
(1)乙醇的制造方法，具有以下工序：将具有木糖代谢能力、且导入了乙醛脱氢酶基因的重组酵母，用含有纤维素、纤维素酶和木糖的培养基进行培养，从而进行乙醇发酵。
(2)根据(1)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述酵母是导入了木糖代谢相关基因的重组酵母。
(3)根据(1)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述乙醛脱氢酶基因编码来源于大肠杆菌的乙醛脱氢酶mhpF。
(4)根据(3)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述来源于大肠杆菌的乙醛脱氢酶mhpF是以下的(a)或(b)的蛋白质，
(a)具有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质，
(b)具有相对于序列号2所示的氨基酸序列有70%以上的同一性的氨基酸序列、且具有乙醛脱氢酶活性的蛋白质。
(5)根据(2)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述木糖代谢相关基因是木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因和木酮糖激酶基因。
(6)根据(1)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，在上述乙醇发酵中，至少同时进行上述纤维素的糖化。
(7)根据(1)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述重组酵母高表达具有将乙醛转换为乙醇的活性的醇脱氢酶基因。
(8)根据(1)所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述重组酵母是具有将乙醇转换为乙醛的活性的醇脱氢酶基因的表达量下降了的重组酵母。
本说明书包含作为本申请的优先权基础的日本专利申请2011-233300号的说明书和/或附图所记载的内容。
发明的效果
在本发明的乙醇的制造方法中，可以降低培养基中的乙酸浓度，从而可以有效地避免由乙酸引起的发酵抑制。其结果是，本发明的乙醇的制造方法可以较高地维持以木糖作为糖源的乙醇发酵的效率，可以实现优异的乙醇收率。因此，本发明的乙醇的制造方法，例如，在再利用重组酵母时和/或在连续培养中使用时可以降低乙酸的带入量，维持优异的乙醇收率。
附图说明
图1是用于说明mhpF基因过表达株的制作步骤的模式图。
图2是显示培养基中的乙酸浓度的变化的特性图。
图3是显示培养基中的乙醇浓度的变化的特性图。
图4是显示培养基中的木糖浓度的变化的特性图。
具体实施方式
以下，使用附图和实施例更详细地说明本发明。
本发明的乙醇的制造方法是，使用具有木糖代谢能力、且导入了乙醛脱氢酶基因的重组酵母，由培养基所含的糖源合成乙醇的方法。在本发明的乙醇的制造方法中，具有能够通过上述重组酵母来代谢培养基所含的乙酸，随着乙醇发酵而培养基中的乙酸浓度降低这样的特征。
＜重组酵母＞
本发明的乙醇的制造方法中使用的重组酵母，是具有木糖代谢能力、且至少导入了乙醛脱氢酶基因的酵母。这里，具有木糖代谢能力，是包含通过导入木糖代谢相关基因而被赋予木糖代谢能力的情况、本来具有木糖代谢相关基因而本来具有木糖代谢能力的情况的任一种的含义。即，称为具有木糖代谢能力的酵母的情况下，是包含导入了木糖代谢相关基因的重组酵母和本来具有木糖代谢相关基因的酵母的任一种的含义。
具有木糖代谢能力的酵母可以同化培养基中所含的木糖而生产乙醇。此外，培养基中所含的木糖，既可以是通过将以木糖作为构成糖的木聚糖和/或半纤维素等进行糖化的工艺而得的，也可以是培养基所含的木聚糖和/或半纤维素等被糖化酶糖化而供给至培养基中的。后者的情况下，是指所谓同时糖化发酵的体系。
木糖代谢相关基因，是包含编码将木糖转换为木糖醇的木糖还原酶的木糖还原酶基因、编码将木糖醇转换为木酮糖的木糖醇脱氢酶的木糖醇脱氢酶基因和编码将木酮糖磷酸化而生成木酮糖5-磷酸的木酮糖激酶的木酮糖激酶基因的含义。此外，由木酮糖激酶而生成的木酮糖5-磷酸进入戊糖磷酸途径而被代谢。
作为木糖代谢相关基因，不特别限定，可列举来源于树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的木糖还原酶基因和木糖醇脱氢酶基因、来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的木酮糖激酶基因(Eliasson A.et al.,Appl.Environ.Microbiol,66:3381-3386和Toivari MN et al.,Metab.Eng.3:236-249参照)。此外，作为木糖还原酶基因，可利用来源于热带假丝酵母(Candida tropicalis)和/或近平滑假丝酵母(Candida prapsilosis)的木糖还原酶基因。作为木糖醇脱氢酶基因，可利用来源于热带假丝酵母(Candidatropicalis)和/或近平滑假丝酵母(Candida prapsilosis)的木糖醇脱氢酶基因。作为木酮糖激酶基因，可利用来源于树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的木酮糖激酶基因。此外，还可以利用来源于作为厌氧性的霉的Piromyces sp.E2种(特表2005-514951号公报)、来源于作为厌氧性的霉的Cyllamycesaberensi、来源于作为细菌的多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、来源于作为细菌的Clostridium phytofermentans、来源于鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)簇的木糖异构酶基因(XI基因)等。
另外，作为本来具有木糖代谢能力的酵母，不特别限定，可列举树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)和近平滑假丝酵母(Candida prapsilosis)等。
另一方面，作为导入具有木糖代谢能力的酵母中的乙醛脱氢酶基因，不特别限定，可以使用来源于任何生物的基因。另外，在乙醛脱氢酶基因使用来源于除了酵母等真菌以外的生物，例如，细菌和/或动物、植物、昆虫、藻类的基因的情况下，优选使用根据导入的酵母中的密码子使用频率而改变了碱基序列的基因。
更具体地，作为乙醛脱氢酶基因，可以使用大肠杆菌中的mhpF基因、和/或如Applied and Environmental Microbiology,May2004,p.2892-2897,Vol.70,No.5中公开的那样使用溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)中的ALDH1基因。这里，大肠杆菌中的mhpF基因的碱基序列和由mhpF基因所编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号1和2。
但是，作为乙醛脱氢酶基因，不限于序列号1和2所特定的，也可以是碱基序列和/或氨基酸序列不同但处于旁系同源物(paralog)的关系或狭义的同源物的关系的基因。
另外，乙醛脱氢酶基因不限于这些序列号1和2所特定的，也可以是例如，编码具有与序列号2的氨基酸序列有70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上、最优选为95％以上的序列类似性或同一性的氨基酸序列、且具有乙醛脱氢酶活性的蛋白质的基因。序列类似性和同一性的值，可以通过安装了BLAST算法的BLASTN和/或BLASTX程序来算出(默认的设定)。此外，序列类似性的值，可以算出在将一对氨基酸序列两两比对分析时完全一致的氨基酸残基、和物理化学上功能类似的氨基酸残基的合计，作为比较的全氨基酸残基中的上述合计数的比例而算出。此外，同一性的值，可以算出在将一对氨基酸序列两两比对分析时完全一致的氨基酸残基，作为比较的全氨基酸残基中的上述氨基酸残基数的比例算出。
进而，乙醛脱氢酶基因不限于这些序列号1和2所特定的，还可以是例如，编码具有对序列号2的氨基酸序列置换、缺失、插入或添加了1或数个氨基酸的氨基酸序列、且具有乙醛脱氢酶活性的蛋白质的基因。这里，数个例如为2～30个，优选为2～20个，更优选为2～10个，最优选为2～5个。
进而另外，乙醛脱氢酶基因不限于这些序列号1和2所特定的，也可以是例如，与包含序列号1的碱基序列的DNA的互补链的全部或一部分在严格条件下杂交、且编码具有乙醛脱氢酶活性的蛋白质的基因。这里所说的“严格条件”是指形成所谓特异性杂种、不形成非特异性杂种的条件，可以参照例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Third Edition)来适宜确定。具体地，可以根据DNA杂交(southern hybridization)时的温度和/或溶液所含的盐浓度、和DNA杂交(southern hybridization)的洗涤工序时的温度和/或溶液所含的盐浓度来设定严格度。更详细地，作为严格条件，例如钠浓度为25～500mM、优选为25～300mM，温度为42～68℃、优选为42～65℃。更具体地为5×SSC(83mM NaCl、83mM柠檬酸钠)、温度42℃。
如上所述，关于包含与序列号1不同的碱基序列的基因、或编码与序列号2不同的氨基酸序列的基因是否作为乙醛脱氢酶基因发挥功能，只要制作将该基因插入适当的启动子和终止子等之间而得的表达载体，使用该表达载体转化例如大肠杆菌等宿主，测定表达的蛋白质的乙醛脱氢酶活性即可。乙醛脱氢酶活性可以如下测定：作为底物准备包含乙醛、辅酶A和NAD+的溶液，在适当的温度下与检查对象蛋白质作用，将生成的乙酰磷酸通过磷酸乙酰转移酶的作用而转换为乙酰磷酸，从而测定；或者将生成的NADH进行分光学测量而测定。
此外，本发明的乙醇的制造方法中使用的重组酵母也可以是具有木糖代谢能力、且至少导入了乙醛脱氢酶基因、进而导入了其他基因的酵母。作为其他基因不特别限定，例如，可以是导入了与葡萄糖等的糖代谢相关的基因的酵母。作为一例，重组酵母可以通过导入β-葡糖苷酶基因而制成具有β-葡糖苷酶活性的酵母。
这里β-葡糖苷酶活性是指催化糖的β-糖苷键水解的反应的活性。即，β-葡糖苷酶可以将纤维二糖等纤维寡糖分解为葡萄糖。β-葡糖苷酶基因也可以作为细胞表层呈递型基因而导入。这里，细胞表层呈递型基因，是指进行了改变而使得由该基因所编码的蛋白质以在细胞的表层展示的方式表达的基因。例如，细胞表层呈递型β葡糖苷酶基因，是将β葡糖苷酶基因与细胞表层定位蛋白质基因融合而得的基因。细胞表层定位蛋白质是指固定于酵母的细胞表层、存在于细胞表层的蛋白质。可列举例如作为凝集性蛋白质的α-或a-凝集素、FLO蛋白质等。通常细胞表层定位蛋白质在N-末端侧具有分泌信序列号并在C-末端侧具有GPI锚附着识别信号。虽然在具有分泌信号方面与分泌性蛋白质相同，但细胞表层定位蛋白质在介由GPI锚被固定输送到细胞膜上这方面与分泌性蛋白质不同。细胞表层定位蛋白质在通过细胞膜时GPI锚附着识别序列信号被选择性地切断，在新突出的C末端部分与GPI锚结合从而被固定在细胞膜上。之后GPI锚的根部被磷脂酰肌醇依赖性磷脂酶C(PI-PLC)切断。接着，从细胞膜被切下的蛋白质插入细胞壁并被固定在细胞表层，从而定位于细胞表层(例如，参照日本特开2006-174767号公报)。
作为β-葡糖苷酶基因，不特别限定，可列举例如来自棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)的β-葡糖苷酶基因(Murai et al.,Appl.Environ.Microbiol.64:4857-4861)。此外，作为β-葡糖苷酶基因，还可利用来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的β-葡糖苷酶基因、来自噬纤维梭菌(Clostridiumcellulovorans)的β-葡糖苷酶基因和来自扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibligera)的β-葡糖苷酶基因等。
另外，本发明的乙醇的制造方法中使用的重组酵母，还可以是在β葡糖苷酶基因的基础之上，或者除了β葡糖苷酶基因以外，还导入了编码构成纤维素酶的其他酶的基因的重组酵母。作为除了β葡糖苷酶以外的构成纤维素酶的酶，可以列举从结晶纤维素的末端使纤维二糖游离的外切型的纤维二糖水解酶(CBH1和CBH2)、不能分解结晶纤维素但随机切断非结晶纤维素(无定形纤维素)链的内切型的内切葡聚糖酶(EG)。
另外，作为导入重组酵母的其他基因，可列举具有将乙醛转换为乙醇的活性的醇脱氢酶基因(ADH1基因)、具有将乙酸转换为乙酰-辅酶A的活性的乙酰-辅酶A合成酶基因(ACS1基因)、具有将乙醛转换为乙酸的活性的基因(ALD4基因、ALD5基因和ALD6基因)。此外，还可以破坏具有将乙醇转换为乙醛的活性醇脱氢酶基因(ADH2基因)。
进而，在本发明的乙醇的制造方法中使用的重组酵母，优选为具有以下特征的重组酵母，所述特征是高表达具有将乙醛转换为乙醇的活性的醇脱氢酶基因(ADH1基因)。为了高表达该基因，可列举将内在的该基因的启动子置换为高表达用启动子、将能表达地具有该基因的表达载体导入酵母这样的方法。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的ADH1基因的碱基序列和由该基因所编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号70和71。但是，作为高表达对象的醇脱氢酶基因，不限于由序列号70和71所特定的基因，也可以是碱基序列和/或氨基酸序列不同但处于旁系同源物(paralog)的关系或狭义的同源物的关系的基因。
另外，醇脱氢酶基因不限于由这些序列号70和71所特定的基因，也可以是例如，编码具有与序列号71的氨基酸序列有70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上、最优选为95％以上的序列类似性或同一性的氨基酸序列、且具有醇脱氢酶活性的蛋白质的基因。序列类似性和同一性的值，可以通过安装了BLAST算法的BLASTN和/或BLASTX程序来算出(默认的设定)。此外，序列类似性的值，可以算出在将一对氨基酸序列两两比对分析时完全一致的氨基酸残基、和物理化学上功能类似的氨基酸残基的合计，作为比较的全氨基酸残基中的上述合计数的比例而算出。此外，同一性的值，可以算出在将一对氨基酸序列两两比对分析时完全一致的氨基酸残基，作为比较的全氨基酸残基中的上述氨基酸残基数的比例算出。
进而，醇脱氢酶基因不限于由这些序列号70和71所特定的基因，也还可以是例如，编码具有对序列号71的氨基酸序列置换、缺失、插入或添加了1或数个氨基酸的氨基酸序列、且具有乙醛脱氢酶活性的蛋白质的基因。这里，数个例如为2～30个，优选为2～20个，更优选为2～10个，最优选为2～5个。
进而另外，醇脱氢酶基因不限于由这些序列号70和71所特定的基因，也可以是例如，与包含序列号70的碱基序列的DNA的互补链的全部或一部分在严格条件下杂交、且编码具有乙酰乙醛脱氢酶活性的蛋白质的基因。这里所说的“严格条件”是指形成所谓特异性杂种、不形成非特异性杂种的条件，可以参照例如Molecular Cloning:A Laboratory Manual(ThirdEdition)来适宜确定。具体地，可以根据DNA杂交(southern hybridization)时的温度和/或溶液所含的盐浓度、和DNA杂交(southern hybridization)的洗涤工序时的温度和/或溶液所含的盐浓度来设定严格度。更详细地，作为严格条件，例如钠浓度为25～500mM、优选为25～300mM，温度为42～68℃、优选为42～65℃。更具体地为5×SSC(83mM NaCl、83mM柠檬酸钠)、温度42℃。
如上所述，关于包含与序列号70不同的碱基序列的基因、或编码与序列号71不同的氨基酸序列的基因是否作为醇脱氢酶基因发挥功能，只要制作将该基因插入适当的启动子和终止子等之间而得的表达载体，使用该表达载体转化例如酵母等宿主，测定表达的蛋白质的醇脱氢酶活性即可。醇脱氢酶活性可以如下测定：作为底物准备包含醇和NAD+或NADP+的溶液，在适当的温度下与检查对象蛋白质作用，测量生成的醛；或者将NADH或NADPH进行分光学测量从而测定。
进而，本发明的乙醇的制造方法中使用的重组酵母优选具有如下特征，所述特征是具有将乙醇转换为醛的活性的醇脱氢酶基因(ADH2基因)的表达量下降了。为了使该基因的表达量下降，可列举改变内在的该基因的启动子、使该基因缺失这样的方法。作为抑制基因的表达的手法，可列举所谓转座子法、转基因法、转录后基因沉默法、RNAi法、无义介导的衰减(Nonsense mediated decay,NMD)法、核酶法、反义法、miRNA(micro-RNA，微RNA)法、siRNA(small interfering RNA，小干扰RNA)法等。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的ADH2基因的碱基序列和由该基因所编码的蛋白质的氨基酸序列分别示于序列号72和73。但是，作为对象的醇脱氢酶基因，不限于序列号72和73所特定的基因，也可以是碱基序列和/或氨基酸序列不同但处于旁系同源物(paralog)的关系或狭义的同源物的关系的基因。
另外，醇脱氢酶基因不限于由这些序列号72和73所特定的基因，也可以是例如，编码具有与序列号73的氨基酸序列有70％以上、优选为80％以上、更优选为90％以上、最优选为95％以上的序列类似性或同一性的氨基酸序列、且具有醇脱氢酶活性的蛋白质的基因。序列类似性和同一性的值，可以通过安装了BLAST算法的BLASTN和/或BLASTX程序来算出(默认的设定)。此外，序列类似性的值，可以算出在将一对氨基酸序列两两比对分析时完全一致的氨基酸残基、和物理化学上功能类似的氨基酸残基的合计，作为比较的全氨基酸残基中的上述合计数的比例而算出。此外，同一性的值，可以算出在将一对氨基酸序列两两比对分析时完全一致的氨基酸残基，作为比较的全氨基酸残基中的上述氨基酸残基数的比例算出。
进而，醇脱氢酶基因不限于由这些序列号72和73所特定的基因，也还可以是例如，编码具有对序列号73的氨基酸序列置换、缺失、插入或添加了1或数个氨基酸的氨基酸序列、且具有乙酰乙醛脱氢酶活性的蛋白质的基因。这里，数个例如为2～30个，优选为2～20个，更优选为2～10个，最优选为2～5个。
进一步另外，醇脱氢酶基因不限于由这些序列号72和73所特定的基因，也可以是例如，与包含序列号72的碱基序列的DNA的互补链的全部或一部分在严格条件下杂交、且编码具有乙酰乙醛脱氢酶活性的蛋白质的基因。这里所说的“严格条件”是指形成所谓特异性杂种、不形成非特异性杂种的条件，可以参照例如Molecular Cloning:A LaboratoryManual(Third Edition)来适宜确定。具体地，可以根据DNA杂交(southernhybridization)时的温度和/或溶液所含的盐浓度、和DNA杂交(southernhybridization)的洗涤工序时的温度和/或溶液所含的盐浓度来设定严格度。更详细地，作为严格条件，例如钠浓度为25～500mM、优选为25～300mM，温度为42～68℃、优选为42～65℃。更具体地为5×SSC(83mM NaCl、83mM柠檬酸钠)、温度42℃。
如上所述，关于包含与序列号72不同的碱基序列的基因、或编码与序列号73不同的氨基酸序列的基因是否作为醇脱氢酶基因发挥功能，只要制作将该基因插入适当的启动子和终止子等之间而得的表达载体，使用该表达载体转化例如酵母等宿主，测定表达的蛋白质的醇脱氢酶活性即可。醇脱氢酶活性可以如下测定：作为底物准备包含醛和NADH或NADPH的溶液，在适当的温度下与检查对象蛋白质作用，测量生成的醇；或将NADP+进行分光学测量而测定。
进而，作为导入重组酵母的其他基因，可列举参与构成生物质的半纤维素所含的5碳糖L-阿拉伯糖的代谢途径的基因。作为这样的基因，可列举例如，来源于原核生物的L-阿拉伯糖异构酶基因、L-核酮糖激酶基因、L-核酮糖-5-磷酸-4-差向异构酶基因、和/或来源于真核生物的L-阿糖醇-4-脱氢酶基因、L-木糖还原酶基因。
＜重组酵母的制作＞
可以通过将上述的乙醛脱氢酶基因导入成为宿主的酵母基因组中，来制作能够在本发明中使用的重组酵母。这里，乙醛脱氢酶基因可以导入对不具有木糖代谢能力的酵母导入了木糖代谢相关基因而得的重组酵母中，也可以导入本来具有木糖代谢能力的酵母中，还可以对不具有木糖代谢能力的酵母与木糖代谢相关基因一起导入。另外，可以将乙醛脱氢酶基因导入不具有木糖代谢能力的酵母而制作重组酵母，然后，将木糖代谢相关基因导入该重组酵母，从而赋予木糖代谢能力。
作为能用作宿主的酵母，不特别限定，可列举休哈塔假丝酵母(CandidaShehatae)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、嗜鞣管囊酵母(Pachysolentannophilus)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)与粟酒裂殖酵母(Schizosaccaromyces pombe)等酵母，特别优选为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。此外，作为酵母，可以是为了实验方面的方便性而使用的实验株，也可以是为了实用方面的有用性而使用的工业株(实用株)。作为工业株，可列举例如用于葡萄酒、清酒和/或烧酎制作的酵母株。
此外，作为成为宿主的酵母，优选使用具有同宗配合性的酵母。根据日本特开2009-34036号公报所公开的方法，通过使用具有同宗配合性的酵母，可以简便地向基因组中导入多拷贝基因。具有同宗配合性的酵母与同宗配合酵母为同义。作为具有同宗配合性的酵母，不特别限定，任何酵母株都可以实用。作为具有同宗配合性的酵母，可列举酿酒酵母OC-2株(NBRC2260)，但不限于此。此外，作为具有同宗配合性的酵母，可列举醇酵母(台研396号、NBRC0216)(出处：“アルコール酵母的諸特性(醇酵母的诸特性)”酒研会报、No37、p18-22(1998.8))、在巴西和冲绳分离出的乙醇生产酵母(出处：“ブラジルと沖縄で分離したSaccharomycescerevisiae野生株的遺伝学的性質(在巴西和冲绳分离的酿酒酵母野生株的遗传学性质)”日本农艺化学会志、Vol.65、No.4、p759-762(1991.4))和180(出处：“アルコール発酵力の強い酵母的スクリーニング(醇发酵能力强的酵母的筛选)”日本酿造协会志、Vol.82、No.6、p439-443(1987.6))等。另外，即使是显示异宗配合的表型的酵母，也可通过以可表达的方式导入HO基因而制成具有同宗配合性的酵母来使用。因此，在本发明中，具有同宗配合性的酵母是也包含以可表达的方式导入了HO基因的酵母的含义。
其中，酿酒酵母OC-2株是一直以来在葡萄酒酿酒的现场被利用的被确认了安全性的菌株，因而优选。此外酿酒酵母OC-2株如后述实施例所述的那样，是在高糖浓度的条件下启动子活性优异的菌株，因而优选。特别是酿酒酵母OC-2株在高糖浓度条件下丙酮酸脱羧酶基因(PDC1)的启动子活性优异，因而优选。
另外，作为导入的基因的启动子，不特别限定，可利用例如，甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGK1)的启动子、高渗透压应答7基因(HOR7)的启动子等。其中，丙酮酸脱羧酶基因(PDC1)的启动子高表达下游的目的基因的能力高，因而优选。
即，上述基因可以与调控表达的启动子和/或其他表达调控区一起导入酵母的基因组中。或者，上述基因也可以以通过成为宿主的酵母的基因组中本来存在基因的启动子和/或其他表达调控区而进行表达调控的方式导入。
作为导入上述基因的方法，可以应用已知作为酵母的转化方法的现有公知的任何方法。具体来说，例如，可以以例如电穿孔法“Meth.Enzym.,194,p182(1990)”、原生质球法“Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75p1929(1978)”、乙酸锂法“J.Bacteriology,153,p163(1983)”、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75p1929(1978)、Methods in yeast genetics,2000Edition:A Cold SpringHarbor Laboratory Course Manual等记载的方法实施，但不限于此。
＜乙醇制造＞
在使用以上所说明的重组酵母制造乙醇时，用含有纤维素、纤维素酶和木糖的培养基进行乙醇发酵培养。即，进行乙醇发酵的培养基，作为碳源至少含有木糖和纤维素酶作用于纤维素而生成的葡萄糖。此外，培养基中也可以预先含有葡萄糖等其他碳源。
另外，在乙醇发酵中利用的培养基所含的纤维素和木糖的一者或两者可以来源于生物质。换句话说，在乙醇发酵中利用的培养基也可以是包含纤维素系生物质、能糖化纤维素系生物质所含的纤维素酶的纤维素酶、糖化纤维素系生物质所含的半纤维素而生成木糖的半纤维素酶的组成。这里，作为纤维素系生物质，可以是实施了现有公知的前处理的物质。作为前处理，不特别限定，可列举例如，将木质素用微生物分解的处理、和/或纤维素系生物质的粉碎处理等。另外，作为前处理，也可以应用例如，将粉碎了的纤维素系生物质浸渍于稀硫酸溶液和/或碱溶液、离子液体中的处理、水热处理、微粉碎处理这样的处理。通过这些前处理，可以提高生物质的糖化率。
另外，在乙醇发酵中利用的培养基，还可以添加将纤维素系生物质糖化处理后的糖化液。此时，糖化液包含残存的纤维素和/或纤维素酶、以及来源于纤维素系生物质所含的半纤维素的木糖。
如上，本发明的乙醇的制造方法，成为将培养基所含的纤维素用纤维素酶进行糖化的工序、与以木糖和糖化所生成的葡萄糖作为糖源的乙醇发酵的工序同时进行的所谓同时糖化发酵处理。这里，同时糖化发酵处理是指将糖化纤维素系生物质的工序与乙醇发酵工序不区分地同时实施的处理。
在使用任一培养基的情况下，该重组酵母都能够同化培养基中所含的木糖而生成乙醇。此外，作为糖化方法没有特别限制，可列举利用纤维素酶和/或半纤维素酶等纤维素酶制剂的酶法等。纤维素酶制剂含有与纤维素链和半纤维素链的分解相关的多种酶，显示内切葡聚糖酶活性、内切木聚糖酶活性、纤维二糖水解酶活性、葡糖苷酶活性和木糖苷酶活性等多种活性。作为纤维素酶制剂，没有特别限制，可列举例如，由里氏木霉(Trichoderma reesei)、和/或解纤维顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)等所生产的纤维素酶。作为纤维素酶制剂，也可以使用市售品。
在同时糖化发酵处理中，向含有纤维素系生物质(也可以在前处理后)的培养基中加入纤维素酶制剂和上述重组微生物，在规定的温度范围内培养该重组酵母。作为培养温度没有特别限制，考虑乙醇发酵的效率可以为25～45℃，优选为30～40℃。此外培养液的pH值优选为4～6。此外，培养时也可以进行搅拌和/或振荡。进而，也可以是先在酶的最适温度(40～70℃)下进行糖化，然后，使温度下降至规定的温度(30～40℃)再添加酵母这样的不规则的同时糖化发酵。
在本发明的利用重组酵母的乙醇的制造方法中，在乙醇发酵之后从培养基中回收乙醇。对乙醇的回收方法没有特别限制，可采用现有公知的任意方法。例如，在上述乙醇发酵结束后，通过固液分离操作将含有乙醇的液层、与含有重组酵母和/或固体成分的固层分离。然后将液层中含有的乙醇用蒸馏法进行分离·纯化，从而可以回收纯度高的乙醇。此外，乙醇的纯化度可以根据乙醇的使用目的而适宜调整。
一般地，在利用来源于生物质的糖来制造乙醇的情况下，在上述的前处理和/或糖化处理中有时产生乙酸和/或糠醛这样的发酵抑制物质。特别地关于乙酸，已知其抑制酵母的生长·增殖，使以木糖作为糖源的乙醇发酵的效率下降。
然而，在本发明中，由于使用导入了乙醛脱氢酶基因的重组酵母，因而可以代谢培养基所含的乙酸，从而可以将培养基所含的乙酸浓度抑制得较低。因此，本发明的乙醇的制造方法，与使用了未导入乙醛脱氢酶基因的酵母时相比，可以实现优异的乙醇收率。
另外，根据本发明的乙醇的制造方法，由于即使在将重组酵母培养规定时间之后培养基中的乙酸浓度也低，因而，即使在利用培养规定时间之后的培养基的一部分重新开始培养的连续培养体系中使用，也能够降低乙酸的带入量。另外，根据本发明的乙醇的制造方法，即使在乙醇发酵工序结束之后回收菌体而再利用的情况下，也由于同样的理由而可以降低乙酸的带入量。
实施例
以下使用实施例更详细地说明本发明，但本发明的技术范围并不限制于以下实施例。
〔实施例1〕
在本实施例中，制作对木糖同化酵母导入了大肠杆菌的乙醛脱氢酶基因(mhpF基因)的重组酵母，评价该重组酵母的乙酸代谢能力。
＜mhpF基因过表达用DNA片段的构建＞
以详细如后述的参考例1所制作的质粒pCR-T_HIS3-P_TDH3-AUR1-C-P_TDH2-IDP2m-T_IDP2-PDC1part作为模板，通过PCR扩增除了TDH2基因的启动子区域和IDP2基因以外的DNA片段。该PCR中，作为引物，使用TB2158(5’-ACCCGTGGCTGCGAGCGACCAGCTAACTTGGTCGAC-3’：序列号3)与TB2797(5’-CCTCATTGCTGGATAGAGCCTCATCG-3’：序列号4)。
另一方面，以酵母OC2株(NBRC2260)的基因组作为模板，扩增包含ERO1基因终止子区域的DNA片段和包含HOR7基因的启动子区域的DNA片段。这些PCR中使用的引物以酵母属基因组数据库(SaccharomycesGenome Database)(http://www.yeastgenome.org/)的DNA序列数据作为参考，以扩增所得的DNA片段为约15bp重复的方式设计。在扩增包含ERO1基因终止子区域的DNA片段的PCR中，作为引物使用TB2796(5’-TCTATCCAGCAATGAGGAGTGATTTTACAC-3’：序列号5)与TB2462(5’-GAGCAACACAGTTTATCTTATATGTATTCAATG-3’：序列号6)。另外，在扩增包含HOR7基因的启动子区域的DNA片段的PCR中，作为引物使用TB2168(5’-TTTTATTATTAGTCTTTTTTTTTTTTGACAATATCTG-3’：序列号7)与TB2654(5’-TCGCTCGCAGCCACGGGT-3’：序列号8)。
mhpF基因，以全长全合成了根据酵母的密码子使用频率而改变密码子而得的序列的基因(从GenScript社购入)为模板通过PCR进行扩增。该PCR中，作为引物，使用TB2463(5’-TAAACTGTGTTGCTCTTATGCGGCCTCTCCTGC-3’：序列号9)与TB2464(5’-AGACTAATAATAAAAATGTCAAAGAGAAAAGTTGCTATTATCG-3’：序列号10)。将各个DNA片段使用In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit(Clontech)克隆化到质粒中。将所得的质粒命名为pCR-T_HIS3-P_TDH3-AUR1-C-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-PDC1part。
＜XYL1、XYL2、XKS1基因过表达·GRE3基因同宗破坏株的制作＞
用孢子形成培养基(1%磷酸钾、0.1%酵母提取物、0.05%葡萄糖、2%琼脂)，使对同宗配合的2倍体酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)OC2-T株(Saitoh,S.等、J.Ferment.Bioeng.1996年、81卷、98-103页)异宗地导入了XYL1、XYL2、XKS1基因过表达·GRE3基因而得的株(后述的参考例2参照)形成孢子，利用同宗配合性而进行2倍化。获得了在作为2倍体的染色体的两个GRE3基因座区域插入了XYL1、XYL2、XKS1基因、且GRE3基因被破坏的株。将该株作为Uz326株。
＜mhpF基因过表达株的制作(图1)＞
为了将mhpF过表达用DNA片段导入Uz326株的基因组，需要作为同源重组区域的DNA片段的5’、3’两末端的序列位于各自的染色体上的附近的位置。因此，以包含用于将含有mhpF过表达用DNA片段的5’末端部分的HIS3基因的终止子区域和TDH3基因的启动子区域的DNA片段、和含有3’末端部分的PDC1基因的一部分的DNA片段的序列导入PDC6基因上游的DNA片段(过表达基座用DNA片段)的质粒pCR-5U_PDC6-T_HIS3-P_TDH3-Ble-T_URA3-PDC1part-5U_PDC6(后述的参考例1参照)作为模板，通过PCR来扩增除载体部分的pCR-Blunt IITOPO以外的DNA片段。该PCR中作为引物使用TB0948(5’-GTTGAAGTCGCCTGGTAGCC-3’：序列号11)与TB0735(5’-CGGTGATCCCCTTGAAAAAG-3’：序列号12)。使用Frozen-EZ YeastTransformation II试剂盒(ZYMO RESEARCH)，按照试剂盒所附带的方案，对Uz326株转化所扩增的DNA片段。转化后，接种于包含玉米素(300μg/ml)的YPD的板上，在30℃培养5天，得到转化体，命名为Uz327株。
接着，以上述所得的pCR-T_HIS3-P_TDH3-AUR1-C-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-PDC1part作为模板，通过PCR来扩增除了载体部分的pCR-Blunt II TOPO以外的DNA片段。该PCR中作为引物使用TB1932(5’-TCCCTCCACCAAAGGTGTTC-3’：序列号13)与TB0115(5’-TTGCAAAGAACCGTCACCAATG-3’：序列号14)。使用Frozen-EZYeast Transformation II试剂盒，将扩增的DNA片段转化Uz327株，得到转化体，命名为Uz370株。
＜发酵试验＞
将如上所述得到的Uz370株和Uz327株接种于YPD培养基(酵母提取物10g/L、胨20g/L、葡萄糖20g/L)，以150转/分钟(振幅35mm)在30℃培养24小时。对于培养的菌，将CX培养基(纤维素100g/L、木糖70g/L、酵母提取物10g/L、乙酸2.75g/L、Cellic CTec2[ノボザイム社制的纤维素酶]40FPU/g纤维素；调整至pH值6.0)、DX培养基(葡萄糖100g/L、木糖70g/L、酵母提取物10g/L、乙酸2.75g/L；调整至pH值6.0)、X培养基(木糖70g/L、酵母提取物10g/L、乙酸2.75g/L；调整至pH值6.0)各28ml和直径10mM的尼龙覆膜铁球加入30ml体积的烧瓶中，将上述菌体以OD＝7.3进行接种，以80转/分钟(振幅35mm)·32℃进行发酵，研究乙醇的生产量和乙酸的消耗量。此外，各自的浓度用HPLC(LC-10A;岛津制作所、柱：Aminex HPX-87H(Bio-Rad制)、移动相：0.01N H2SO4、流量：0.6ml/分钟、温度：30℃、检出器：差示折射率检出器RID-10A)进行测定。
作为发酵试验的结果，将培养基中的乙酸浓度的变化示于图2，将培养基中的乙醇浓度的变化示于图3，将培养基中的木糖浓度的变化示于图4。如图2所示，过表达mhpF基因的Uz370株，仅在使用作为同时糖化发酵用的培养基的CX培养基时能够代谢培养基中的乙酸。另一方面，Uz370株在作为糖源包含葡萄糖和木糖的培养基和/或仅包含木糖的培养基中不代谢乙酸。此外，如图2所示，在使用包含葡萄糖和木糖的培养基(DX培养基)的情况下，过表达mhpF基因的Uz370株虽然可以评价为与Uz327株相比乙酸生产量降低，但随着发酵时间的经过的乙酸生产却被评价为与Uz327株基本同等。另外，过表达mhpF基因的Uz370株如图3和4所示，关于乙醇收率和/或木糖代谢能力，可以评价为与Uz327株相比为同等。
〔参考例1〕
本参考例中关于实施例所使用的pCR-5U_PDC6-T_HIS3-P_TDH3-Ble-T_URA3-PDC1part-5U_PDC6的制作步骤进行说明。首先，以酵母OC2株的基因组作为模板，扩增包含PDC6基因5’上游非翻译区域和一部分PDC6基因区域的DNA片段，使用Zero Blunt TOPO PCRCloning Kit进行克隆化，命名为pCR-5U_PDC6。PCR中作为引物使用TB0948(5’-GTTGAAGTCGCCTGGTAGCC-3’：序列号15)与TB0735(5’-CGGTGATCCCCTTGAAAAAG-3’：序列号16)。
另外，以酵母OC2株的基因组作为模板，通过PCR来扩增包含HIS3基因的终止子区域的DNA片段、包含TDH3基因的启动子区域的DNA片段、包含URA3基因的终止子区域的DNA片段、包含PDC1基因的一部分的DNA片段。
在扩增包含HIS3基因的终止子区域的DNA片段的PCR中，作为引物使用TB1401(5’-TGCGGCCGGCCGCAGC-3’：序列号17)与TB1433(5’-CGCTAACATTCAACGCTAAGAGCGCGCCTCGTTC-3’：序列号18)。在扩增包含TDH3基因的启动子区域的DNA片段的PCR中，作为引物使用TB2717(5’-TAGCGTTGAATGTTAGCGTCAACAAC-3’：序列号19)与TB1928(5’-TTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCGAAAC-3’：序列号20)。在扩增包含URA3基因的终止子区域的DNA片段的PCR中，作为引物使用TB2121(5’-TGCATGTCTACTAAACTCACAAATTAGAGCTTCAATT-3’：序列号21)与TB1672(5’-GTCGACCAAGTTAGCTGGGGGTAATAACTGATATAATTAAA-3’：序列号22)。在扩增包含PDC1基因的一部分的DNA片段的PCR中，作为引物使用TB2814(5’-CCAGCTAACTTGGTCGACTTG-3’：序列号23)与TB0115(5’-TTGCAAAGAACCGTCACCAATG-3’：序列号24)。
进而，以pBBLE-LDHKCB(Applied and Environmental Microbiology,71,2789-2792)作为模板，通过PCR来扩增腐草霉素耐性基因。该PCR中作为引物使用TB2100(5’-ACATAAACAAACAAAATGACCGACCAAGCGACG-3’：序列号25)与TB0897(5’-AGTTTAGTAGACATGCATCATGAGATGCCTGCAAG-3’：序列号26)。
进一步另外，以pCR-5U_PDC6作为模板，通过PCR来扩增在PDC6基因5’上游约700bp的部分切断而形成直链状的DNA片段。该PCR中作为引物使用TB2105(5’-CTGCGGCCGGCCGCACTTCCAAGCATCTCATAAACC-3’：序列号27)与TB4031(5’-ACATAAACAAACAAAGATGTACGATCGCCTGCAC-3’：序列号28)。将通过该PCR得到的DNA片段、上述的包含HIS3基因的终止子区域的DNA片段、和上述的包含TDH3基因的启动子区域的DNA片段使用In-FusionTM Advantage PCRCloning Kit进行克隆化，将所得的质粒命名为pCR-5U_PDC6-T_HIS3-P_TDH3-3U_PDC6。
接着，以所得的pCR-5U_PDC6-T_HIS3-P_TDH3-5U_PDC6作为模板，通过PCR来扩增在TDH3基因的启动子区域与PDC6基因5’上游非翻译区域的序列之间切断而形成直链状的DNA片段。该PCR中作为引物使用TB1928(5’-TTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCGAAAC-3’：序列号29)与TB2118(5’-GACGGTTCTTTGCAAGATGTACGATCGCCTGCAC-3’：序列号30)。将通过该PCR得到的本DNA片段、上述的包含URA3基因的终止子区域的DNA片段、上述的腐草霉素耐性基因、和上述的包含PDC1基因的一部分的DNA片段使用In-FusionTM AdvantagePCR Cloning Kit进行克隆化，将所得的质粒命名为pCR-5U_PDC6-T_HIS3-P_TDH3-Ble-T_URA3-PDC1part-5U_PDC6。
另外，在本参考例中，使用如上所述制作的pCR-5U_PDC6-T_HIS3-P_TDH3-Ble-T_URA3-PDC1part-5U_PDC6，制作实施例中使用的pCR-T_HIS3-P_TDH3-AUR1-C-P_TDH2-IDP2m-T_IDP2-PDC1part。首先，以pCR-5U_PDC6-T_HIS3-P_TDH3-Ble-T_URA3-PDC1part-5U_PDC6作为模板，通过PCR来扩增包含HIS3基因的终止子区域和TDH3基因的启动子区域的DNA片段。该PCR中作为引物，使用TB3345(5’-TGCGGCCGGCCGCAGCTTTGCAGAG-3’：序列号31)与TB1928。
另一方面，以酵母OC2株(NBRC2260)的基因组作为模板，通过PCR来扩增包含TDH2基因的启动子区域的DNA片段、包含COX4基因的线粒体转运信号的DNA片段、包含IDP2基因的ORF和终止子区域的DNA片段、以及包含PDC1基因的一部分的DNA片段。在这些PCR中使用的引物，以酵母属基因组数据库(Saccharomyces Genome Database)(http://www.yeastgenome.org/)的DNA序列数据为参考，以扩增而得的DNA片段为约15bp重复的方式设计。在扩增包含TDH2基因的启动子区域的DNA片段的PCR中，作为引物使用TB2704(5’-CTTGACGGGTATTCTGAGCATCTTAC-3’：序列号32)与TB2595(5’-TTTGTTTTGTTTGTTTGTGTGATGAATTTAATTTG-3’：序列号33)。在扩增包含COX4基因的线粒体转运信号的DNA片段的PCR中，作为引物使用TB2448(5’-AACAAACAAAACAAAATGCTTTCACTACGTCAATC-3’：序列号34)与TB2449(5’-CTTAATCTTTGTCATAAGAGCATATCTAGAGCTACACAAAG-3’：序列号35)。在扩增包含IDP2基因的ORF和终止子区域的DNA片段的PCR中，作为引物使用TB2452(5’-ATGACAAAGATTAAGGTAGCTAACCCC-3’：序列号36)与TB2092(5’-GACCAAGTTAGCTGGTATATCGGTCCTCTGTGTAG-3’：序列号37)。在扩增包含PDC1基因的一部分的DNA片段的PCR中，作为引物使用TB2814和TB0115。
此外，COX4基因的线粒体转运信号序列使用以O.Emanuelsson等(以J.Mol.Biol.300,1005-1016的算法为基础的预测程序“TargetP”(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)，推定为ORF5’末端的25个氨基酸。
另外，以pAUR101(タカラ生物)作为模板通过PCR来扩增包含AUR1-C(短梗霉素(Aureobasidin)耐性)基因ORF和终止子区域的DNA片段。该PCR中作为引物使用TB1972(5’-ACATAAACAAACAAAATGGCAAACCCTTTTTCGAGATG-3’：序列号38)与TB1973(5’-AGAATACCCGTCAAGCTGGATAGAGCCTCATCGTTAC-3’：序列号39)。
接着，将PCR扩增而得的包含AUR1-C基因的DNA片段和包含TDH2基因的启动子区域的DNA片段使用In-FusionTM Advantage PCR CloningKit(Clontech社制)进行结合，使用引物TB1972和TB2595通过PCR来扩增。将包含COX4基因的线粒体转运信号的DNA片段、包含IDP2基因ORF和终止子区域的DNA片段和包含PDC1基因的一部分的DNA片段使用引物TB2448和TB0115进行结合，通过PCR来扩增。2种结合DNA片段使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(インビトロジェン社制)克隆化到质粒中。将以克隆化的各质粒作为模板通过PCR而扩增的2种DNA片段、和包含HIS3基因的终止子区域和TDH3基因的启动子区域的DNA片段使用In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit进行结合，使用引物TB1932和TB0115通过PCR来扩增结合DNA片段。PCR扩增而得的结合DNA片段使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit克隆化到质粒中。将所得的质粒命名为pCR-T_HIS3-P_TDH3-AUR1-C-P_TDH2-IDP2m-T_IDP2-PDC1part。
〔参考例2〕
在本参考例中，对于对同宗配合的2倍体酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)OC2-T株(Saitoh,S.等、J.Ferment.Bioeng.1996年、81卷、98-103页)异宗地导入了XYL1、XYL2、XKS1基因过表达·GRE3基因的株的制作步骤进行说明。
＜XYL1、XYL2、XKS1基因过表达·GRE3基因破坏用DNA片段的制作＞
以酵母BY4742株(Open Biosystems)的基因组DNA为模板，用PCR扩增包含GRE3基因及其5’上游和3’下游非翻译区的DNA片段。PCR用的引物分别使用TB2358(5’-TGGGAATATTACCGCTCGAAG-3’：序列号40)与TB2359(5’-AAGGGGGAAGGTGTGGAATC-3’：序列号41)。此外，用于酵母BY4742株的DNA序列扩增的PCR引物的设计参考了Saccharomyces Genome Database(酵母基因组数据库)的DNA序列数据。以质粒pUC19为模板，通过PCR来扩增包含在pUC19的多克隆位点切断那样的pUC19全长的直链状DNA片段。PCR用的引物分别使用TB2373(5’-CACACCTTCCCCCTTGATCCTCTAGAGTCGACC-3’：序列号42)与TB2374(5’-GCGGTAATATTCCCAGATCCCCGGGTACCGAGCTC-3’：序列号43)。将上述两种DNA片段使用In-FusionTM Advantage PCRCloning Kit(タカラバイオ)进行克隆化，命名为pUC19-5U_GRE3-GRE3-3U_GRE3。
以pUC19-5U_GRE3-GRE3-3U_GRE3作为模板，用PCR扩增包含GRE3基因的5’上游及3’下游非翻译区和pUC19的区域的DNA片段，以酵母BY4742株的基因组DNA为模板，用PCR扩增包含TEF1启动子区的DNA片段、XKS1基因、包含HIS3终止子区的DNA片段。PCR用引物分别使用TB3018(5’-AACGAGGCGCGCTCTTCCAGCCAGTAAAATCCA-3’：序列号44)与TB3017(5’-GCTATGGTGTGTGGGCTTTAAAAAATTTCCAATTTTCCTTTACG-3’：序列号45)、TB2210(5’-CCCACACACCATAGCTTCAAAATG-3’：序列号46)与TB2269(5’-TCTTTAGATTAGATTGCTATGCTTTCTTTCTAATGAGCAAG-3’：序列号47)、TB2345(5’-AATCTAATCTAAAGAATGTTGTGTTCAGTAATTCAGAGAC-3’：序列号48)与TB2346(5’-CTGCGGCCGGCCGCATTAGATGAGAGTCTTTTCCAGTTC-3’：序列号49)、TB1401(5’-TGCGGCCGGCCGCAGC-3’：序列号50)与TB2683(5’-GCGCCTCGTTCAGAATGA-3’：序列号51)。将上述四种DNA片段使用In-FusionTM Advantage PCRCloning Kit进行克隆化，命名为pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-3U_GRE3。
以pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-3U_GRE3为模板，用PCR扩增包含在HIS3终止子区与GRE3基因的3’下游非翻译区之间切断那样的质粒全长的直链状DNA片段，以酵母BY4742株的基因组DNA为模板，用PCR扩增包含TDH2启动子区的DNA片段、包含ILV3终止子区的DNA片段，以树干毕赤酵母(Pichia stipitis)的基因组DNA为模板，用PCR扩增XYL1基因。PCR用引物分别使用TB9020(5’-TCCAGCCAGTAAAATCCATAC-3’：序列号52)与TB2457(5’-CCGTCAAGAGAGCGCGCCTCGTTCAG-3’：序列号53)、TB2844(5’-GCGCTCTCTTGACGGGTATTCTGAGCATCTTAC-3’：序列号54)与TB2595(5’-TTTGTTTTGTTTGTTTGTGTGATGAATTTAATTTG-3’：序列号55)、TB2314(5’-AACAAACAAAACAAAATGCCTTCTATTAAGTTGAAC-3’：序列号56)与TB2455(5’-GGGGCCTATAATGCATTAGACGAAGATAGGAATCTTG-3’：序列号57)、TB2456(5’-AACAAACAAAACAAAATGCCTTCTATTAAGTTGAAC-3’：序列号58)与TB3019(5’-ATTTTACTGGCTGGAATTTCGTAGATTATAATTAAGGCGAC-3’：序列号59)。此外，用于XYL1基因序列扩增的PCR引物设计参考了在GeneBank中登录的树干毕赤酵母XYL1基因(登录号XM_001385144)。将上述四种DNA片段使用In-FusionTM Advantage PCRCloning Kit进行克隆化，命名为pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-3U_GRE3。
以pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-3U_GRE3为模板，用PCR扩增包含在ILV3终止子区与GRE3基因的3’下游非翻译区之间切断那样的质粒全长的直链状DNA片段，以酵母BY4742株的基因组DNA为模板，用PCR扩增包含PDC1启动子区的DNA片段和包含ILV6终止子区的DNA片段，以树干毕赤酵母的基因组DNA作为模板，用PCR扩增XYL2基因。PCR用引物分别使用TB2375(5’-AGTTGCTTGACACGGTGGAAGAAGGTCCAGCCAGTAAAATCCATA-3’：序列号60)与TB3021(5’-ATTTCGTAGATTATAATTAAGGCGAC-3’：序列号61)、TB2010(5’-TTTGATTGATTTGACTGTGTTATTTTGC-3’：序列号62)与TB2261(5’-CCGTGTCAAGCAACTATGGG-3’：序列号63)、TB3022(5’-TATAATCTACGAAATTAATAAGAAAGGTGACCGTG-3’：序列号64)与TB2347(5’-GTTAGTCTCTCGGCCTTGCG-3’：序列号65)、TB2351(5’-GGCCGAGAGACTAACTTACTCAGGGCCGTCAAT-3’：序列号66)与TB2352(5’-GTCAAATCAATCAAAATGACTGCTAACCCTTCC-3’：序列号67)。此外，用于XYL2基因序列扩增的PCR引物设计参考了在GeneBank中登录的树干毕赤酵母XYL2基因(登录号AF127801或X55392)。将上述四种DNA片段使用In-FusionTM Advantage PCR Cloning Kit进行克隆化，命名为pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-ILV6_T-XYL2-PDC1_P-3U_GRE3。
以pUC19-5U_GRE3-P_TEF1-XKS1-T_HIS3-P_TDH2-XYL1-T_ILV3-ILV6_T-XYL2-PDC1_P-3U_GRE3为模板，用PCR扩增GRE3基因的从5’上游非翻译区至3’下游非翻译区的DNA片段。将本片段用于制成XYL1、XYL2、XKS1基因过表达·GRE3基因破坏株。
＜XYL1、XYL2、XKS1基因过表达·GRE3基因异宗破坏株制作＞
使用XYL1、XYL2、XKS1基因过表达·GRE3基因破坏用DNA片段，将OC2-T株用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒(ZYMORESEARCH)按照试剂盒附带的方案进行转化。转化后，接种在以木糖为单独碳源的板中，在30℃下培养7天，获得转化体。由转化体制备基因组DNA，通过PCR法，使用作为插入DNA片段的外侧和载体内侧的引物的TB2356(5’-TGGGGCTAAACGAGATTTGG-3’：序列号68)与TB592(5’-GAAATTTAGTATGCTGTGCTTGGG-3’：序列号69)，确认了在染色体正常地单拷贝插入。
〔实施例2〕
在本实施例中，制作对木糖同化酵母导入了大肠杆菌的乙醛脱氢酶基因(mhpF基因)与醇脱氢酶基因(ADH1基因)、并破坏了醇脱氢酶基因(ADH2基因)的重组酵母，评价该重组酵母的乙酸代谢能力。此外，导入的醇脱氢酶基因(ADH1基因)编码具有将乙醛转换为乙醇的活性的蛋白质。另外，破坏的醇脱氢酶基因(ADH1基因)编码具有将乙醇转换为乙醛的活性的蛋白质。
＜供试株＞
在本实施例中，构建：实施例1中制作的Uz326株、对Uz326株赋予组氨酸要求性而得的Uz644株、将Uz644株筛选在添加了5-氟乳清酸的培养基中生长的株(Boeke,J.D.,et al.1987Methods Enzymol.;154:164-75.)而成为了尿嘧啶要求性的Uz659株、对Uz659株导入mhpF基因而得的Uz670株、对Uz659株导入mhpF基因和ADH1基因而得的Uz672株、对Uz659株导入ADH1基因而得的Uz822株、破坏Uz659株的ADH2基因而得的Uz674株、破坏Uz659株的ADH2基因并导入mhpF基因而得的Uz669株、破坏Uz659株的ADH2基因并导入mhpF基因和ADH1基因而得的Uz737株(表1)。
表1
＜HIS3基因破坏用DNA片段的制作＞
以酵母OC2株的基因组DNA作为模板，通过PCR来扩增包含HIS3基因及其5’上游及3’下游非翻译区域的DNA片段。使用的PCR用引物分别使用TB3164与TB3165(以下，将本实施例中使用的引物归纳于表2显示)。扩增的DNA片段使用Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit(ライフテクノロジーズ社制)克隆化到质粒中，命名为pCR-5U_HIS3-HIS3-3U_HIS3。
以pCR-5U_HIS3-HIS3-3U_HIS3作为模板，通过PCR来扩增包含HIS3基因的5’上游及3’下游非翻译区域和pCR-BluntII-TOPO的区域的DNA片段，并以pAUR101(タカラ生物社制)作为模板，通过PCR来扩增包含AUR1-C基因及其启动子和终止子区域的DNA片段。PCR用引物分别使用以扩增而得的DNA片段为约15bp重复的方式设计的TB3458与TB3459的对、TB2885与TB2859的对。将上述DNA片段使用In-Fusion HDCloning Kit(タカラ生物社制)进行克隆化，命名为pCR-5U_HIS3-AUR1-C-3U_HIS3。
＜HIS3基因破坏株的制作＞
以pCR-5U_HIS3-AUR1-C-3U_HIS3作为模板，通过PCR来扩增除了载体部分pCR-Blunt II TOPO以外的DNA片段，制作HIS3基因破坏用DNA片段。PCR用引物分别使用TB3164与TB3165。使用本DNA片段，将使2倍体的同宗配合酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)OC2株过表达木糖同化基因(XYL1、XYL2、XKS1)而得的Uz326株(实施例1)，使用Frozen-EZ Yeast Transformation II试剂盒(ZYMO RESEARCH社制)，按照试剂盒所附带的方案进行转化。转化后，接种于包含短梗霉素(Aureobasidin)的YPD板，在30℃培养7天，得到转化体。用孢子形成培养基(1%磷酸钾、0.1%酵母提取物、0.05%葡萄糖、2%琼脂)使本株形成孢子，利用同宗配合性进行2倍化。获得了在作为2倍体的染色体的两个HIS3基因座区域插入了AUR1-C基因、且HIS3基因被破坏的株。将此作为Uz644株。
＜ADH2基因破坏用DNA片段(HIS3标志物)的制作＞
以酵母BY4742株的基因组DNA作为模板，通过PCR来扩增包含ADH2基因及其5’上游及3’下游非翻译区域的DNA片段。作为PCR用引物使用TB2939与TB2940。扩增的DNA片段使用Zero Blunt TOPO PCRCloning Kit克隆化到质粒中，命名为pCR-5U_ADH2-ADH2-3U_ADH2。
以上述pCR-5U_ADH2-ADH2-3U_ADH2作为模板，通过PCR来扩增包含ADH2基因的5’上游及3’下游非翻译区域和pCR-BluntII-TOPO的区域的DNA片段，并以上述pCR-5U_HIS3-HIS3-3U_HIS3作为模板，通过PCR来扩增包含HIS3基因及其启动子和终止子区域的DNA片段。PCR用引物使用以分别扩增而得的DNA片段为约15bp重复的方式设计的TB3100与TB3102的对、TB3101与TB3089的对。将上述DNA片段使用In-Fusion HD Cloning Kit(タカラ生物社制)进行克隆化，命名为pCR-5U_ADH2-HIS3-3U_ADH2。
＜ADH2基因破坏株的制作＞
以pCR-5U_ADH2-HIS3-3U_ADH2作为模板，通过PCR来扩增除了载体部分的pCR-Blunt II TOPO以外的DNA片段，制作ADH2基因破坏用DNA片段。作为PCR用引物使用TB2939与TB2940。使用本DNA片段转化Uz644株。转化后，接种于不含组氨酸的SC培养基(Mthods in YeastGenetics,Cold Spring Harbor Laboratory Press)板，在30℃培养5天，得到转化体。使本株形成孢子，进行2倍化。获得了在作为2倍体的染色体的两个ADH2基因座区域插入了HIS3基因、且ADH2基因被破坏的株。将此作为Uz674株。
＜mhpF基因过表达用DNA片段的制作＞
以pCR-T_HIS3-P_TDH3-AUR1-C-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-PDC1part(参照实施例1)作为模板，通过PCR来扩增包含ERO1基因的终止子区域、mhpF基因和HOR7基因的启动子区域的DNA片段。作为PCR用引物使用TB3598与TB2654。以BY4742株的基因组DNA作为模板，通过PCR来扩增包含CYC1基因的终止子区域的DNA片段。作为PCR用引物使用TB2236与TB3597。以pCR-5U_HIS3-HIS3-3U_HIS3作为模板，通过PCR来扩增包含HIS3基因及其启动子和终止子区域的DNA片段。作为PCR用引物使用TB3099与TB3089。以pCR-5U_ADH2-ADH2-3U_ADH2作为模板，通过PCR来扩增在ADH2基因与3’下游非翻译区域之间切断而变成直链状的DNA片段。作为使用的PCR用引物，使用TB3172与TB3100。此外，PCR用引物以分别扩增而得的DNA片段为约15bp重复的方式设计。将上述4种DNA片段使用In-Fusion HD Cloning Kit进行克隆化，命名为pCR-5U_ADH2-ADH2-T_CYC1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2。
＜mhpF基因过表达株的制作＞
以上述pCR-5U_ADH2-ADH2-T_CYC1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2作为模板，通过PCR来扩增除了载体部分的pCR-BluntII TOPO以外的DNA片段，制作mhpF基因过表达用DNA片段。作为PCR用引物使用TB3326与TB2940。使用本DNA片段转化Uz644株。转化后，接种于不含组氨酸的SC培养基板，在30℃培养5天，得到转化体。使本株形成孢子，进行2倍化。获得在作为2倍体的染色体的两个ADH2基因座附近区域插入了mhpF基因的株。将此作为Uz670株。
＜mhpF·ADH1基因过表达用DNA片段的制作＞
以上述pCR-5U_ADH2-ADH2-T_CYC1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2作为模板，通过PCR来扩增在CYC1基因终止子区域与ERO1基因终止子区域的之间切断而成为直链状的DNA片段。作为PCR用引物使用TB3173与TB2429。以BY4742株的基因组DNA作为模板，通过PCR来扩增包含TDH3基因的启动子区域的DNA片段和包含ADH1基因和ADH1基因的终止子区域的部分的DNA片段。PCR用引物分别使用TB2717与TB1938的对、TB2997与TB2998的对。此外，PCR用引物以分别扩增而得的DNA片段为约15bp重复的方式设计。将上述3种DNA片段使用In-Fusion HD Cloning Kit进行克隆化，命名为pCR-5U_ADH2-ADH2-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2。
＜mhpF·ADH1基因过表达株的制作＞
以上述pCR-5U_ADH2-ADH2-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2作为模板，通过PCR来扩增除了载体部分的pCR-Blunt II TOPO以外的DNA片段，制作mhpF·ADH1基因过表达用DNA片段。作为PCR用引物使用TB3326与TB2940。使用本DNA片段转化Uz644株。转化后，接种于不含组氨酸的SC培养基板，在30℃培养5天，得到了转化体。使本株形成孢子，进行了2倍化。获得了在作为2倍体的染色体的两个ADH2基因座附近区域插入了mhpF和ADH1基因的株。将此作为Uz672株。
＜mhpF·ADH1基因过表达·ADH2破坏用DNA片段的制作＞
以上述pCR-5U_ADH2-ADH2-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH2-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2作为模板，通过PCR来扩增除了ADH2基因以外的DNA片段。作为PCR用引物使用TB2717与TB2943。此外，PCR用引物以扩增而得的DNA片段在两末端约15bp重复的方式设计。将本片段转化大肠杆菌，得到DNA片段环状化了的质粒，命名为pCR-5U_ADH2-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2。
＜mhpF·ADH1基因过表达·ADH2破坏株的制作＞
以上述pCR-5U_ADH2-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2作为模板，通过PCR来扩增除了载体部分的pCR-Blunt II TOPO以外的DNA片段，制作mhpF·ADH1基因过表达·ADH2破坏用DNA片段。作为PCR用引物使用TB2939与TB2940。使用本DNA片段转化Uz644株。转化后，接种于不含组氨酸的SC培养基板，在30℃培养5天，得到了转化体。使本株形成孢子，进行了2倍化。获得了在作为2倍体的染色体的两个ADH2基因座插入了mhpF和ADH1基因、且ADH2被破坏的株。将此命名为Uz737株。
＜mhpF基因过表达·ADH2破坏用DNA片段的制作＞
以上述pCR-5U_ADH2-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2作为模板，通过PCR来扩增除了ADH1基因以外的DNA片段。作为PCR用引物使用TB3217与TB1928。此外，PCR用引物以扩增而得的DNA片段在两末端约15bp重复的方式设计。将本片段转化大肠杆菌，得到DNA片段环状化了的质粒，命名为pCR-5U_ADH2-T_CYC1-P_TDH3-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2。
＜mhpF基因过表达·ADH2破坏株的制作＞
以上述pCR-5U_ADH2-T_CYC1-P_TDH3-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2作为模板，通过PCR来扩增除了载体部分的pCR-Blunt II TOPO以外的DNA片段，制作mhpF基因过表达·ADH2破坏用DNA片段。作为PCR用引物使用TB2939与TB2940。使用本DNA片段转化Uz644株。转化后，接种于不含组氨酸的SC培养基板，在30℃培养5天，得到了转化体。使本株形成孢子，进行了2倍化。获得了在作为2倍体的染色体的两个ADH2基因座插入了mhpF基因、且ADH2被破坏的株。将此作为Uz669株。
＜ADH1基因过表达用DNA片段的制作＞
以pCR-5U_ADH2-ADH2-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-ERO1_T-mhpF-HOR7_P-HIS3-3U_ADH2作为模板，通过PCR来扩增除了mhpF基因表达盒以外的DNA片段。作为PCR用引物使用TB3090与TB3086。此外，PCR用引物以扩增而得的DNA片段在两末端约15bp重复的方式设计。将本片段转化大肠杆菌，得到DNA片段环状化了的质粒，命名为pCR-5U_ADH2-ADH2-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-HIS3-3U_ADH2。
＜ADH1基因过表达株的制作＞
以上述pCR-5U_ADH2-ADH2-T_CYC1-P_TDH3-ADH1-T_ADH1-HIS3-3U_ADH2作为模板，通过PCR来扩增除了载体部分的pCR-Blunt II TOPO以外的DNA片段，制作ADH1基因过表达用DNA片段。作为PCR用引物使用TB3326与TB2940。使用本DNA片段转化Uz644株。转化后，接种于不含组氨酸的SC培养基板，在30℃培养5天，得到了转化体。使本株形成孢子，进行了2倍化。获得了在作为2倍体的染色体的两个ADH2基因座附近区域插入了ADH1基因的株。将此作为Uz822株。
＜ADH2破坏用DNA片段(TRP1标志物)的制作＞
以上述pCR-5U_ADH2-HIS3-3U_ADH2作为模板，通过PCR来扩增除了HIS3基因以外的DNA片段。作为PCR用引物使用TB4481与TB3435。以酵母BY4742株的基因组DNA作为模板，通过PCR来扩增包含TRP1基因及其5’上游及3’下游非翻译区域的DNA片段。作为PCR用引物使用TB2799与TB2800。此外，PCR用引物以分别扩增而得的DNA片段为约15bp重复的方式设计。将上述2种DNA片段使用In-Fusion HDCloning Kit进行克隆化，命名为pCR-5U_ADH2-TRP1-3U_ADH2。
＜ADH2基因株的制作＞
以上述pCR-5U_ADH2-TRP1-3U_ADH2作为模板，通过PCR来扩增除了载体部分的pCR-Blunt II TOPO以外的DNA片段，制作ADH2破坏用DNA片段。作为PCR用引物使用TB2939与TB2940。使用本DNA片段转化TPP1被破坏了的酵母OC2株OC2-T株(Saitoh,S.等、J.Ferment.Bioeng.1996、81、98-103)。转化后，接种于不含色氨酸的SC培养基板，在30℃培养5天，得到了转化体。使本株形成孢子，进行了2倍化。获得了在作为2倍体的染色体的两个ADH2基因座区域插入了TRP1基因、且ADH2基因被破坏的株。将此作为Uz996株。
表2
＜烧瓶发酵试验＞
使用如上制作的菌株如下实施烧瓶发酵试验。首先，在分注了20ml葡萄糖浓度20g/L的YPD液体培养基的100ml体积的带挡板的烧瓶中接菌供试株，以30℃120转/分钟进行24小时培养。收集菌体后，接菌于分注了10ml下述发酵培养基的20ml体积烧瓶中，以振荡培养(80转/分钟、振幅35mm、30℃、n=1)进行发酵试验。此外，盖于烧瓶的栓是穿过了内径1.5mm的针的橡胶制，通过在针顶部安装逆止阀而将烧瓶保持厌氧。
表3
发酵液中的葡萄糖、木糖、纤维二糖、乙酸、甘油、木糖醇、乙醇使用HPLC(LC-10A；岛津制作所)在下述条件下测定。
柱：AminexHPX-87H
移动相：0.01N H2SO4
流量：0.6ml/分钟
温度：30℃
检出器：差示折射率率检出器RID-10A
＜发酵试验结果＞
将ADH2破坏株Uz966(木糖同化基因非导入株)与OC2株在Cm200Y10Ac1515FPU的培养基条件下进行发酵试验，将乙醇为最高浓度时的葡萄糖和乙酸的浓度示于表4。
表4
乙醇g/L 葡萄糖g/L 乙酸g/L
Uz966株(⊿adh2) 46.0 0.89 15.5
OC2株 46.4 0.70 15.3
发酵时间:89小时接菌量：PCV0.12%
由表4可判断，在破坏了ADH2基因的株中，在发酵底物仅为葡萄糖的情况下，与非破坏株发酵能力无特别差异。
接着，对导入了木糖同化基因的酵母，用含木糖的培养基(表3的Cm150X60Y10Ac525FPU)实施发酵试验。此外，接菌量为PCV:0.12％，发酵时间为113小时。结果示于表5。
表5
由表5可判断，与乙醛脱氢酶基因mhpF过表达株相比，在过表达mhpF基因和ADH1基因并且破坏了ADH2基因的Uz737株中，乙醇转换·葡萄糖代谢的效率改善效果协同地发挥。另外，明确了在Uz737株中，培养基中的乙酸的浓度有意义地减少，乙酸同化能力也提高。另外，判断在包含木糖的培养基条件下，导入了木糖同化基因的酵母的ADH2破坏株(Uz674株)发酵被显著抑制。然而，判定了通过过表达mhpF基因，可以恢复由ADH2基因的破坏产生的发酵抑制。
将本说明书中引用的全部的出版物、专利和专利申请直接作为参考纳入本说明书。

Claims (8)

1.乙醇的制造方法，具有以下工序：将具有木糖代谢能力、且导入了乙醛脱氢酶基因的重组酵母，用含有纤维素、纤维素酶和木糖的培养基进行培养，从而进行乙醇发酵。
2.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述酵母是导入了木糖代谢相关基因的重组酵母。
3.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述乙醛脱氢酶基因编码来源于大肠杆菌的乙醛脱氢酶mhpF。
4.根据权利要求3所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述来源于大肠杆菌的乙醛脱氢酶mhpF是以下的(a)或(b)的蛋白质，
(a)具有序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质，
(b)具有相对于序列号2所示的氨基酸序列有70%以上的同一性的氨基酸序列、且具有乙醛脱氢酶活性的蛋白质。
5.根据权利要求2所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述木糖代谢相关基因是木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因和木酮糖激酶基因。
6.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，在上述乙醇发酵中，至少同时进行上述纤维素的糖化。
7.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述重组酵母高表达具有将乙醛转换为乙醇的活性的醇脱氢酶基因。
8.根据权利要求1所述的乙醇的制造方法，其特征在于，上述重组酵母是具有将乙醇转换为乙醛的活性的醇脱氢酶基因的表达量下降了的重组酵母。
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