FI122520B - Noroviruksen kapsidi ja rotaviruksen VP6-proteiini käytettäväksi yhdistelmärokotteena - Google Patents

Noroviruksen kapsidi ja rotaviruksen VP6-proteiini käytettäväksi yhdistelmärokotteena Download PDF

Info

Publication number
FI122520B
FI122520B FI20106067A FI20106067A FI122520B FI 122520 B FI122520 B FI 122520B FI 20106067 A FI20106067 A FI 20106067A FI 20106067 A FI20106067 A FI 20106067A FI 122520 B FI122520 B FI 122520B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
rotavirus
norovirus
antigen
vaccine
vlp
Prior art date
Application number
FI20106067A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI20106067A0 (fi
Inventor
Vesna Blazevic
Timo Vesikari
Kirsi Nurminen
Leena Huhti
Suvi Lappalainen
Eeva Jokela
Original Assignee
Vesna Blazevic
Timo Vesikari
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vesna Blazevic, Timo Vesikari filed Critical Vesna Blazevic
Publication of FI20106067A0 publication Critical patent/FI20106067A0/fi
Priority to FI20106067A priority Critical patent/FI122520B/fi
Priority to US13/269,326 priority patent/US8895015B2/en
Priority to RU2013121815/10A priority patent/RU2013121815A/ru
Priority to PCT/FI2011/050880 priority patent/WO2012049366A1/en
Priority to BR112013009164A priority patent/BR112013009164A2/pt
Priority to AU2011315405A priority patent/AU2011315405B2/en
Priority to SG2013027974A priority patent/SG189398A1/en
Priority to KR1020137012218A priority patent/KR101847472B1/ko
Priority to CN201180049612.4A priority patent/CN103260645B/zh
Priority to MX2013004159A priority patent/MX352478B/es
Priority to JP2013533249A priority patent/JP5902181B2/ja
Priority to EP11832191.8A priority patent/EP2627353B1/en
Priority to CA2814175A priority patent/CA2814175C/en
Priority to TW100137092A priority patent/TWI479022B/zh
Application granted granted Critical
Publication of FI122520B publication Critical patent/FI122520B/fi

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/15—Reoviridae, e.g. calf diarrhea virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/295—Polyvalent viral antigens; Mixtures of viral and bacterial antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/08—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for nausea, cinetosis or vertigo; Antiemetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/12—Antidiarrhoeals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12323—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
    • C12N2720/00011—Details
    • C12N2720/12011—Reoviridae
    • C12N2720/12311—Rotavirus, e.g. rotavirus A
    • C12N2720/12334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/16011—Caliciviridae
    • C12N2770/16023—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/16011—Caliciviridae
    • C12N2770/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/026—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from a baculovirus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Keksintö koskee norovirus-rotavirus-yhdistelmärokotetta, joka on tarkoitettu norovirus- ja rotavirusinfektioiden ja/tai virusten aiheuttamien ripuli- ja oksennustautien estämiseen ihmisillä. Tarkemmin ilmaistuna keksintö käsittää menetelmän sellaisen yhdistelmärokotteen valmistamiseksi, joka käsittää norovirus- ja rotavirusantigeenejä, erityisesti noroviruksen VLP:iden ja rotaviruksen rekombinantti-VP6-proteiinin tai kaksikerroksisten VP2/VP6-VLP:iden seoksia. Lisäksi keksintö koskee menetelmiä immuunivasteen indusoimiseksi.

Description

NOROVIRUKSEN KAPSIDI JA ROTAVIRUKSEN VP6-PROTEIINI KÄYTETTÄVÄKSI YHDISTELMÄROKOTTEENA
Keksinnön ala
Esillä oleva keksintö koskee rokoteformulaatioita gastroenteriitin 5 ennaltaehkäisemiseksi erityisesti pienillä lapsilla. Täsmällisemmin esillä oleva keksintö koskee yhdistelmärokoteformulaatioita, jotka käsittävät ainakin yhtä noroviruksen antigeeniä ja ainakin yhtä rotaviruksen antigeeniä.
Keksinnön tausta
Rotaviruksen aiheuttama gastroenteriitti aiheuttaa vuosittain yli 500 10 000 pikkulasten kuolemantapausta maailmanlaajuisesti. Rotavirukset (RV), jot ka kuuluvat Reoviridae-heimoon, ovat merkittävin yksittäinen pikkulasten vakavaa ripulia aiheuttava tekijä myös kehittyneissä maissa, joissa tauti aiheuttaa vähemmän kuolemantapauksia kuin kehittyvissä maissa, mutta vaatii usein kallista sairaalahoitoa. Eläviä, suun kautta otettavia rotavirusrokotteita on ollut 15 saatavilla vuodesta 2006 lähtien. Nykyään sekä WHO että monet yksittäiset maat suosittelevat terveiden lasten rokottamista rotavirusta vastaan.
Elävän, suun kautta otettavan rotavirusrokotteen kehittämisessä Tampereen yliopiston professori Timo Vesikarilla on ollut keskeinen rooli. Rotavirusrokotteen ensimmäiset kliiniset kokeet suoritettiin Tampereella vuonna 20 1982. Professori Vesikari ryhmineen suoritti ratkaisevat kokeet, joissa todettiin kahden nykyisin lisensoidun elävän, suun kautta otettavan rotavirusrokotteen, bovine-human reassortantti pentavalentti -rokotteen RotaTeq® (Merck) ja hu-maani-rotavirusrokotteen Rotarix® (GSK), tehokkuus ja turvallisuus (Vesikari et ai. Safety and efficacy of a pentavalent human-bovine (WC3) reassortant ro-^ 25 tavirus vaccine. N Engl J Med 2006;354:23-33; Vesikari et ai. Efficacy of hu- ^ man rotavirus vaccine against rotavirus gastroenteritis during the first 2 years ^ of life in European infants: randomised, double-blind controlled study. Lancet JRj 2007;370:1757-63).
^ Vaikka nykyisin saatavilla olevat elävät, heikennetyt suun kautta 30 otettavat rotavirusrokotteet ovat tehokkaita ja niitä käytetään menestyksek-§ käästi monissa maissa, niihin liittyy mahdollisia turvallisuusongelmia, jotka voi-
CD
o vat rajoittaa näiden rokotteiden käyttöä ajan mittaan. Eräs aikaisempi elävä, S suun kautta otettava rotavirusrokote, joka perustui reesus-rotavirukseen (Ro- taShield®, Wyeth), vedettiin pois markkinoilta USA:ssa vuonna 1999, koska se 35 saattoi olla osatekijänä intestinaalisessa intussusseptiossa, jota esiintyi noin 2 1:llä 10 000:stä ensimmäisen rokoteannoksen saajasta. Nykyiseen lisensoituun rotavirusrokotteeseen ei liity tällaista suurta riskiä, mutta yhteyttä ei voida kokonaan sulkea pois.
Lisäksi vuonna 2010 havaittiin, että molemmat lisensoidut elävät ro-5 tavirusrokotteet sisälsivät sian circoviruksen (PCV) DNA:ta. Vaikka tämän löydöksen merkitys on epäselvä, se aiheutti väliaikaisen kiellon toiselle rokotteelle ja rotavirusrokottamisen vähenemisen kaiken kaikkiaan. Nämä molemmat ongelmat liittyvät oleellisesti ainoastaan eläviin rokotteisiin, ja yhdessä ne korostavat tarvetta kehittää ei-eläviä vaihtoehtoja rotavirusrokotteille.
10 Rotaviruksen genomi muodostuu 11 kaksinauhaisesta RNA-seg- mentistä, jotka sijaitsevat kolmikerroksellisen viruksen sisemmässä ytimessä. Nämä kolme kerrosta muodostuvat dsRNA:han sitoutuneesta ydinproteiinista VP2, sisemmästä kapsidiproteiinista VP6 ja ulommasta kapsidiglykoproteiinista VP7 yhdessä hemagglutiniini-piikkiproteiini VP4:n kanssa. Merkittävin kapsidi-15 proteiini VP6 määrittää viruksen ryhmäspesifisyyden, ja se on konservoitunein, immunogeenisin ja määrältään suurin rotavirusproteiini. Ulommat kapsidiprote-iinit VP7 ja VP4 sisältävät neutraloivia epitooppeja ja indusoivat suojaavaa immuniteettia neutraloivien vasta-aineiden pohjalta.
Elävien, suun kautta otettavien rotavirusrokotteiden indusoiman ak-20 tiivisen suojan mekanismia ei täysin tunneta. Pintaproteiinien VP7 ja VP4 tiedetään indusoivan serotyyppispesifisiä neutraloivia vasta-aineita. Serotyyppien välillä on kuitenkin merkittävää ristiinsuojausta, jota ei voi selittää serotyyppis-pesifisellä immuniteetilla. VP6 on immunodominantti proteiini rotavirusinfekti-ossa ja rokotuksen jälkeen. Vaikka VP6 ei indusoi neutraloivia vasta-aineita, se 25 indusoi heterologista rotavirusspesifistä immuniteettia.
Ensimmäinen rotaviruksen rekombinanttiproteiini VP6 (rVP6) tuotet-5 tiin rBV-ekspressiojärjestelmästä yli 20 vuotta sitten (Estes M. et ai.1987). VP6
C\J
^ yksinään muodostaa in vitro oligomeerisiä rakenteita, jotka voivat olla putki- "7 maisia, pallomaisia tai levymäisiä ja jotka muodostuvat eri määristä trimeerejä w 30 (Lepaualt J, Embo J, 20, 2001). VP2:n ja VP6:n ekspressoiminen samanaikai- | sesti rBVs:ssä johtaa kaksikerroksisten virusmaisten partikkeleiden (dl-VLP) iv_ muodostumiseen. VP2:n, VP6:n ja VP7:n (VP4:n kanssa tai sitä ilman) eks-
CD
§ pressoiminen samanaikaisesti johtaa kolmikerroksisiin VLP-partikkeleihin, jotka ^ muistuttavat natiiveja infektoivia rotaviruspartikkeleita. Suurin osa rokotteen ^ 35 immunogeenisuuden ja tehokkuuden tutkimuksista eläinmalleissa on suoritettu käyttämällä eri rotavirus-VLP-partikkeleita tai ei-ihmisperäistä VP6-rekombi- 3 nanttiproteiinia adjuvantin kanssa. Ihmisillä ei toistaiseksi ole suoritettu kliinisiä kokeita sellaisilla ei-eläviä rotavirusproteiinialayksiköitä sisältävillä rokotteilla, joissa olisi käytetty joko VLP-partikkeleita tai VP6-rekombinanttiproteiinia.
Kun rotavirus on saatu eliminoitua kokonaan tai osittain monilla alu-5 eilla, noroviruksen suhteellinen merkitys tautia aiheuttavana tekijänä kasvaa. Norovirukset (NV) kuuluvat Caliciviridae-heimoon, ja ne aiheuttavat sporadista akuuttia nonbakteriaalista gastroenteriittiä kaiken ikäisillä ihmisillä ja ovat osatekijöinä paikallisissa gastroenteriittiepidemioissa kaikkialla maailmassa. Noro-virukset aiheuttavat vuosittain noin miljoona sairaalahoitoa vaativaa sairausta-10 pausta ja yli 200 000 kuolemantapausta maailmanlaajuisesti alle viisivuotiailla lapsilla. Rotaviruksen jälkeen norovirus on toiseksi merkittävin virusperäisen akuutin gastroenteriitin aiheuttaja pienillä lapsilla.
Noroviruksen genomi koostuu noin 7,6 kb pitkästä yksinauhaisesta RNA:sta, joka on järjestäytynyt kolmeen avoimeen lukukehykseen (ORF 1-3). 15 ORF1 koodaa RNA-riippuvaista RNA-polymeraasia, joka on samankaltainen kuin muilla ssRNA-viruksilla; ORF2 koodaa merkittävintä kapsidiproteiinia VP1 ja ORF3 koodaa pientä rakenneproteiinia VP2. Suurin osa ihmisiin vaikuttavista noroviruksista kuuluu kahteen genoryhmään (Gl ja Gil) ja nämä kaksi geno-ryhmää jakautuvat ainakin 8 Gl- ja 17 Gll-genotyyppiin. Viime vuosina geno-20 tyyppi GII-4 on ollut pääasiallisena syynä suurimmassa osassa sporadisista gastroenteriittitapauksista ja epidemioista.
VP1 -kapsidiproteiinin uniikki ominaisuus on sen kyky itserakentua tyhjiksi viruksen kaltaisiksi partikkeleiksi (VLP). Genoryhmään I kuuluvan Nor-walk-viruksen kapsidigeenin kloonaaminen rekombinantti-bakulovirukseen 25 (rBV) on johtanut ensimmäisten noroviruksen VLP:iden tuottamiseen 20 vuotta sitten (Jiang et ai., 1992). Nämä VLP:t ovat morfologisesti ja antigeenisesti 5 samankaltaisia natiivin noroviruksen kanssa. Noroviruksen VLP:iden kolmiulot-
C\J
^ teinen rakenne elektronikryomikroskopialla ja tietokoneavusteisilla kuvankäsit- ^ telytekniikoilla katsottuna osoittaa, että noroviruksen kapsidi muodostaa T=3 w 30 ikosahedraalisen symmetrisen rakenteen, joka sisältää 180 VP1-kapsidipro- | teiinimolekyyliä järjestäytyneenä 90 dimeeriksi halkaisijan ollessa 38 nm. No- iv_ roviruksen VLP:itä käytetään yleisesti antigeenilähteenä diagnostisissa serolo-
CD
§ gisissa määrityksissä sekä noroviruksia vastaan suunnattujen kandidaattirokot- ^ teiden kehittämisessä. Vaikka noroviruksen sitoutumiseen ja sisäänpääsyyn ^ 35 tarvittava(t) reseptori(t) ei(vät) ole täysin selvillä, on hiljattain havaittu, että no rovirus tunnistaa reseptoreina ihmisen histoveriryhmäantigeeneja (HBGA).
4
Yleisimmin vastaan tulevia veriryhmiä HBGA:iden joukosta ovat ABO (ABH) ja Lewis. Näitä kompleksisia hiilihydraatteja löytyy punasolujen ja limakalvon epiteelisolujen pinnalta sekä vapaina antigeeneinä biologisista nesteistä. Lisäksi hiljattain on havaittu, että norovirukset tunnistavat HBGA-antigeeneja kantas-5 pesifisesti, ja useita erilaisia reseptorisitoutumiskuvioita on tunnistettu.
Norovirusta vastaan suunnattu elävä rokote ei ole vaihtoehto, koska noroviruksia ei voida kasvattaa soluviljelmässä. Siksi norovirusta vastaan suunnatut kandidaattirokotteet ovat olleet ja tulevat todennäköisesti olemaan joko VLP-rokotteita tai liukoista antigeeniä sisältäviä rokotteita.
10 Ei-monistuvia alayksikköjä sisältävien rokotteiden ja sub-viraalisten partikkeleiden käyttö nykyaikaisessa rokotesuunnittelussa alkoi 80-luvun puolivälissä siitä havainnosta, että hepatiitti B:n pinta-antigeenipartikkeleita (HBsAg-partikkeleita) löytyi HB-tartunnan saaneiden potilaiden verestä. Tällaiset rokotteet ovat yleisesti turvallisia, koska niissä ei ole lainkaan eläviä hei-15 kennettyjä tai inaktivoituja viruksia tai niiden geneettistä materiaalia, ja niitä voidaan tuottaa suhteellisen helposti ja kustannustehokkaasti suuria määriä. Esimerkki proteiinialayksikkörokotteesta ovat viruksen kaltaiset partikkelit (VLP:t), jotka jäljittelevät elävien virusten tyhjiä kuoria ja joilla on siksi samankaltaisia antigeenisiä ja immunogeenisiä ominaisuuksia kuin elävillä viruksilla. 20 Rokotteen indusoimat neutraloivat seerumivasta-aineet ovat tärkeitä suojautumisessa virusinfektioita vastaan. VLP:iden oleellisiin ominaisuuksiin kuuluu se, että ne muistuttavat luonnollista virusta ja säilyttävät siksi neutraloivat epi-tooppinsa, jotka ovat konformaatio-riippuvaisia.
Norovirusten VLP:illä ja rotavirusten VP6-proteiineilla on useita kieh- 25 tovia piirteitä ja tärkeitä ominaisuuksia, jotka tekevät niistä lupaavia rokotekan- didaatteja. Johtuen niiden itseään toistavista, multivalenttisista rakenteista 5 VLP:t ovat erittäin immunogeenisiä. Antigeenin esittäminen hyvin organisoitu en ^ neena, tiheänä, toistuvana ryhmittymänä VLP:iden pinnalla saa aikaan voi- T makkaita vasta-ainevasteita hyvin alhaisilla annoksilla, kun taas sana antigeeni w 30 monomeerina esitettynä on tavallisesti ei-immunogeeninen. B-solut aktivoituvat | tehokkaasti näillä toistuvilla rakenteilla (kuten VLP:illä tai heksagoneiksi järjes- is_ täytyneillä ja korkea-asteisiin rakenteisiin, esim. putkimaisiin rakenteisiin, paka-
CD
§ tuilla rVP6-trimeereillä), mikä johtaa B-solureseptorien ristisilloittumiseen solun £ pinnalla. VLP:iden partikkelimainen luonne, erityisesti kokoalueella noin 40 nM, 011 35 on ihanteellinen makropinosytoosin ja endosytoosin kautta tapahtuvalle nano- partikkeleiden sisäänotolle erikoistuneissa antigeeniä esittelevissä soluissa 5 (APC), nimittäin dendriittisoluissa (DC) (Fifis T., J Immunol, 2004, 173). Sen vuoksi VLP:t samoin kuin elävät virukset aktivoivat ja kypsyttävät dendriittisolu-ja suoraan ilman muita soluja. Dendriittisoluilla on keskeinen tehtävä synnynnäisten ja hankittujen immuunivasteiden aktivoimisessa ja ne osallistuvat pit-5 käikäiseen muisti-IgG-tuotantoon ja ovat ainoita APC-soluja, jotka kykenevät aktivoimaan naiiveja T-soluja. VLP:t pohjustavat tehokkaasti CTL:iä intrasellu-laarisen replikaation puuttuessa (Keller SA et ai, Intro, J Immunol, 2010). Siitä syystä VLP:t stimuloivat tehokkaasti sekä soluvälitteistä immuniteettia (CMI) että humoraalista immuunivastetta.
10 Kuten edellä on jo mainittu, VP6 on rotaviruksen runsaslukuisin ja immunogeenisin alaryhmäspesifinen antigeeni. VP6:n kyky muodostaa multi-meerisia rakenteita ja sen nostattama voimakas immuunivaste tekevät siitä erinomaisen rotavirusrokotekandidaatin. VP6 ei indusoi neutral isaatiovasta-aineita rotavirukselle, mutta sen sijaan se indusoi heterotyyppisen ristisuojaa-15 vaan immuniteetin nostattamalla voimakkaita auttaja-T-soluvasteita (Th-soluvasteita), jotka edistävät ristireaktiivista immuniteettia (Burns JW et ai., 1996 Science; Parez N et ai., 2004, J Virol). VP6-spesifiset CD4+ -Th-solut auttavat samalla VP7-ja/tai VP4-molekyylien pinnalla oleville neutraloiville epi-toopeille spesifisiä B-soluja (Esquirel FR, Arch. Virol 2000, 145, 813). Lisäksi 20 VP6-spesifisten CD4+ -Th-solujen osoitettiin suojaavan rottaeläinten rotavi-rusinfektioilta joko suoran sytotoksisen mekanismin kautta limakalvoilla tai an-tiviraalisten sytokiinien tuotannon kautta.
Ottaen huomioon rotavirus-ja norovirusinfektioiden vakavuuden sekä tällä hetkellä saatavilla olevien rokkoteiden puutteet on sekä ei-eläville no-25 rovirus- että rotavirusrokotteille tarvetta erityisesti lapsuusaikaisen akuutin gastroenteriitin estämiseksi. Immuunivasteet noroviruksille ja rotaviruksille ovat 5 monimutkaisia eikä suojan korrelaatteja ole täysin selvitetty. Edellä kuvattujen
C\J
^ VLP:iden, mukaan lukien norovirus-VLP:iden, ja rotaviruksen VP6-proteiinin ^ uniikit ominaisuudet viittaavat yhteisesti siihen, että näistä kahdesta kom- w 30 ponentista muodostuva rokote olisi toteuttamiskelpoinen strategia immunisoi- £ miseksi norovirus- ja rotavirusinfektioita vastaan.
I·'- § Keksinnön lyhyt selostus
CD
° Keksintö perustuu siihen yllättävään havaintoon, että yhdistelmäro-
O
™ kotteen sisältämät norovirus- ja rotavirusantigeenit eivät haittaa toisiaan vaan 35 saavat aikaan synergistisen immuniteetin rokotteen sisältämää kumpaakin antigeeniä vastaan.
6
Esillä oleva keksintö tarjoaa siten käyttöön rokotekoostumuksen, joka sisältää vähintään yhtä noroviruksen VLP-antigeeniä ja vähintään yhtä rota-viruksen VP6-antigeeniä.
Joissakin suoritusmuodoissa rokoteformulaatio sisältää lisäksi noro-5 virusantigeeniä, joka on valittu joukosta, joka koostuu antigeenisistä kapsidi-peptideistä, ja antigeenisistä kapsidiproteiineista. Antigeeni voi olla peräisin mistä tahansa noroviruskannasta kuten Gl- ja Gll-genoryhmiin tai niiden mihin tahansa genotyyppiin kuuluvista kannoista. Joissakin suoritusmuodoissa noro-virusantigeeni on GII-4-VLP, edullisesti monovalentissa muodossa. Joissakin 10 muissa suoritusmuodoissa norovirusantigeeni sisältää useampaa kuin yhtä VLP-tyyppiä.
Joissakin suoritusmuodoissa rotaviruksen VP6-antigeeni on valittu ryhmästä, joka koostuu rVP6-proteiinista, kaksikerroksisesta VP2/VP6-VLP:stä ja VP6-proteiinia sisältävistä VLP:istä. rVP6 voi olla multimeerisessa putkimai-15 sessa, pallomaisessa tai levymäisessä muodossa.
Esillä oleva keksintö mahdollistaa lisäksi kuvattujen rokotteiden käytön gastroenteriitin ehkäisemisessä erityisesti pienillä lapsilla.
Lisäksi tämä keksintö tarjoaa käyttöön menetelmän valmistaa tässä kuvattuja rokotekoostumuksia. Menetelmä käsittää i) vähintään yhden norovi-20 ruksen VLP-antigeenin ja vähintään yhden rotaviruksen VP6-antigeenin samanaikaisen ilmentämisen yhdessä isännässä tai ii) vaiheet, joissa: a) tuotetaan eristetään ja puhdistetaan vähintään yhtä noroviruksen VLP-antigeeniä; b) tuotetaan, eristetään ja puhdistetaan vähintään yhtä rotaviruksen VP6-antigeeniä ja c) sekoitetaan mainitut norovirus- ja rotavirusantigeenit. Edulli-25 sesti antigeenit on tuotettu rekombinantti-bakuloviruksella infektoidussa hyön-teissoluisännässä.
5 Keksinnön muut kohteet, näkökannat, yksityiskohdat ja edut käyvät
C\J
^ ilmi jäljempänä olevista kuvioista, yksityiskohtaisesta selostuksesta ja esimer- ^ keistä.
o
CM
^ 30 Kuvioiden lyhyt selostus
CL
^ Keksintöä selostetaan nyt tarkemmin edullisten suoritusmuotojen o avulla viitaten oheisiin piirroksiin, joista: ° Kuvio 1 A on valokuva page blue -värjätystä 12-prosenttisesta SDS-
O
™ PAGE-geelistä, jossa osoitetaan bakuloviruksessa ekspressoitujen noroviruk- 35 sen GII-4-VLP:iden (kaista A), rotaviruksen rVP6:n (kaista B), kaksikerroksis ten VP2A/P6-VLP:iden (kaista C), rokote-cocktailin (norovirus-GII-VLP:t + 7 rVP6; kaista D) ja kimeerisen rokotteen (samanaikaisesti infektoitu norovirus-GII-4-kapsidi ja rotaviruksen VP6; kaista E) puhtaus. Eri proteiinit osoitetaan nuolilla geelin oikealla puolella. Jokaista proteiinia vastaava molekyylipaino (kDa) osoitetaan geelin vasemmalla puolella.
5 Kuvio 1 B esittää elektronimikrovalokuvia rekombinanttiproteiinien muodostamista morfologisista rakenteista. Proteiinit puhdistettiin ja rakenteita tutkittiin elektronimikroskopialla, mitä seurasi värjäys 3-prosenttisella uranyyli-asetaatilla. VLP-rakenteita havaittiin noroviruksen (NV) GII-4-kapsidilla ja rotaviruksen (RV) VP2/VP6:lla (paneelit A ja C), ja putkimaisia rakenteita havaittiin 10 VP6-proteiinilla (paneeli B). Sekä GII-4-VLP:itä että VP6-putkia havaittiin paneelissa D (rokote-cocktailformulaatio) ja paneelissa E (kimeerinen rokotefor-mulaatio).
Kuvio 2 havainnollistaa norovirus-spesifisestä (NV-spesifisestä) IgG-vasteesta saatuja ELISA-määritystuloksia GII-4-VLP:iden eri annoksilla ja 15 antoreiteillä (intramuskulaarinen, IM ja intradermaalinen, ID) tehtyjen BALB/c-hiirten immunisointien jälkeen.
Kuvio 3 havainnollistaa NV-spesifisen IgG-seerumin loppupistetit-raatiomäärityksestä saatuja tuloksia GII-4-VLP:iden eri annoksilla ID-reittiä pitkin tehtyjen immunisaatioiden jälkeen.
20 Kuvio 4 esittää NV-spesifisen IgG-immuunivasteen kehittymisen ki netiikkaa GII-4-VLP:iden eri annoksilla immunisoitujen hiirten seerumissa ELI-SA-testillä mitattuna. Ylempi paneeli esittää ID-immunisaatioista ja alempi paneeli IM-immunisaatioista saatuja tuloksia.
Kuvio 5 havainnollistaa NV-spesifisen IgG-vasteen kestoa GII-4-25 VLP:illä tehtyjen IM-immunisointien jälkeen ELISA-testillä testattuna.
Kuvio 6 esittää IgG-loppupistetitraatiomäärityksestä saatuja ELISA- 5 tuloksia seerumeissa, jotka on saatu intradermaalisesti (ylempi paneeli) tai in-
C\J
^ tramuskulaarisesti (alempi paneeli) joko pelkästään GII-4-VLP:illä tai yhdessä T rVP6:n kanssa cocktail-formulaationa tai kimeerisenä formulaationa immunisoi- o w 30 tujen hiirten koeryhmistä.
£ Kuvio 7 havainnollistaa IgG-loppupistetitraatiomäärityksestä saatuja is. ELISA-tuloksia seerumeissa, jotka on saatu intradermaalisesti (ylempi paneeli)
CD
§ tai intramuskulaarisesti (alempi paneeli) joko pelkästään rVP6:llä tai yhdessä ^ GII-4VLP:iden kanssa cocktail-formulaationa tai kimeerisenä formulaationa 35 immunisoitujen hiirten koeryhmistä.
8
Kuvio 8 havainnollistaa NV-spesifisestä, fekaalisesta IgG-loppu-pistetitraatiomäärityksestä saatuja tuloksia joko pelkästään GII-4-VLP:illä tai yhdessä rVP6:n kanssa cocktail-formulaationa tai kimeerisenä formulaationa tehtyjen hiirten immunisointien jälkeen.
5 Kuvio 9 kuvaa pelkästään GII-4-VLP:illä, cocktail-formulaatiolla tai kimeerisellä formulaatiolla joko intradermaalisesti (vasemmanpuoleiset paneelit) tai intramuskulaarisesti (oikeanpuoleiset paneelit) immunisoitujen hiirten NV-spesifisten lgG1- ja lgG2a-alatyypin vasta-ainevasteiden loppupistetitraa-tiomäärityksiä.
10 Kuvio 10 esittää pelkästään rVP6:lla, cocktail-formulaatiolla tai ki meerisellä formulaatiolla intradermaalisesti (vasemmanpuoleiset paneelit) tai intramuskulaarisesti (oikeanpuoleiset paneelit) immunisoitujen hiirten RV-spe-sifisten lgG1- ja lgG2a-alatyypin vasta-ainevasteiden loppupistetitraatiomääri-tyksiä.
15 Kuvio 11 havainnollistaa GII-4- (ylempi paneeli) tai rVP6-spesifisten (alempi paneeli) IgG-vasta-aineiden keskimääräisiä aviditeetti-indeksejä (%) pelkällä, cocktail-formulaatiolla tai kimeerisellä formulaatiolla tehtyjen immunisaatioiden jälkeen. Aviditeetti-indeksiä > 50 % pidetään korkeana aviditeettinä.
Kuvion 12 ylempi paneeli edustaa GII-4-VLP-indusoitujen IgG-vas-20 ta-aineiden ristireaktiivisuutta eri NV-genotyyppejä (GII-12 ja GI-3) vastaan. Alempi paneeli havainnollistaa rVP6-indusoitujen vasta-aineiden ristireaktiivisuutta useita ihmisen (G1P8, G2P6, G4P6, G8P10ja G12P4), naudan (BRV) ja reesuksen (RRV) rotaviruskantoja vastaan ELISA-testillä mitattuna.
Kuvio 13 havainnollistaa NV-GII-4-spesifisten seerumivasta-ainei-25 den kykyä estää homologisten GII-4-VLP:iden (paneeli A) tai heterologisten GI-3-VLP:iden (paneeli B) sitoutumista ihmisen histoveriryhmäantigeeniin 5 (HBGA) H-tyyppi-3 (putatiivinen NV-GII-4-reseptori). Paneeli C esittää loppu-
C\J
^ pistetiitterin sellaisista seerumeista, joita tarvitaan estämään GII-4-VLP:iden si- ^ toutuminen H-tyyppiin 3 maksimaalisesti. Estoindeksi laskettiin seuraavasti: w 30 100 % - (OD[seerumin kanssa]/OD[ilman seerumia] x 100 %).
| Kuvio 14 esittää eri rokoteformulaatioilla immunisoiduista hiiristä ke- rv. rättyjen splenosyyttien ELISPOT-määritystuloksia. Ylempi paneeli havainnollis-
CD
§ taa GII-4-VLP-spesifisiä IgG-vasta-aineita erittäviä soluja (ASC-soluja) solujen ^ keräämispäivänä, kun taas alempi paneeli esittää GII-4-VLP-spesifisten ASC- ^ 35 solujen määrää neljä päivää GII-4-VLP:iden kanssa tehdyn viljelemisen jäi- 9 keen. Ylemmän ja alemman paneelin välinen ero ASC-solujen määrässä osoittaa B-muistisoluvastetta.
Keksinnön yksityiskohtainen selostus
Esillä oleva keksintö koskee yhdistelmärokoteformulaatioita, jotka 5 käsittävät ainakin yhtä noroviruksen (NV) VLP-antigeeniä ja ainakin yhtä rota-viruksen (RV) VP6-antigeeniä.
Yllättäen on havaittu, että norovirus- ja rotavirusantigeenit eivät estä toistensa immunogeenisuutta toisin kuin monissa muissa yhdistelmärokotteissa on käynyt. Esillä olevissa rokotteissa olevien yksittäisten antigeenien välillä 10 ei ole häirintää yhdistelmässä, jolloin esillä olevan keksinnön mukainen yhdistelmärokote kykenee nostamaan immuunivasteen rokotteessa olevaa kumpaakin antigeeniä vastaan. Immuunivaste yhdistelmän yhtä komponenttia vastaan on soveltuvasti vähintään 50 %, edullisesti 100 % tai olennaisesti 100 %, saman komponentin immuunivasteesta erikseen mitattuna. Immuunivaste voi-15 daan soveltuvasti mitata esimerkiksi vasta-ainevasteiden avulla, kuten tässä tekstissä esimerkein havainnollistetaan. Esillä olevilta rokoteformulaatioilta ei pelkästään puutu yksittäisten antigeenien välinen negatiivinen häirintä, vaan ne saavat aikaan myös synergistisen vaikutuksen.
Rokoteformulaatiot voivat lisäksi sisältää muita käyttökelpoisia no-20 rovirusantigeenejä kuten, niihin kuitenkaan rajoittumatta, antigeenisiä kapsidi-proteiineja, peptidejä, monomeerejä, dimeerejä tai niiden mitä tahansa yhdistelmiä. Norovirusantigeenit voivat olla peräisin joko Gl- tai Gll-genoryhmään kuuluvasta noroviruksesta tai sillä voi olla haluttu genotyyppi. Joissakin suoritusmuodoissa norovirusantigeeni on valittu ryhmästä, joka koostuu GII-4-, Gll-25 12- ja GI-3-VLP:istä. Koska genotyyppi GII-4 on maailmanlaajuisesti merkittä- ς vin noroviruksesta johtuvan akuutin gastroenteriitin aiheuttaja, esillä olevissa ^ rokotteissa käytettävä norovirusantigeeni on edullisesti GII-4-VLP. Edullisesti T VLP:t ovat monovalentteja.
S Rotaviruksen VP6 on alaryhmäspesifinen antigeeni, joka on runsas- | 30 lukuisin ja immunogeenisin rotavirusproteiini mukaan lukien ristireaktiiviset an- N ti-rotavirusvasteet. Esillä olevilla rokoteformulaatioilla immunisoitujen hiirten ro- o tavirusspesifiset seerumivasta-aineet olivat ristireaktiivisia alaryhmiin 1 ja 2 ° kuuluville ihmisen, naudan ja apinaeläinten eri rotaviruskannoille aivan kuten o w suurimmassa osassa ihmisiä infektoivien rotavirusserotyyppien tapauksista 35 (kuvio 12).
10
Rotaviruksen VP6:tta, rekombinantti-VP6:tta (rVP6:tta), multimeeri-sessa tai missä tahansa muussa muodossa, tai mitä tahansa rotaviruksen VLP:tä, joka käsittää VP6:tta, voidaan käyttää rotavirusantigeeninä esillä olevissa rokoteformulaatioissa. VP2:n ja VP6:n samanaikainen ekspressoiminen 5 rekombinantti-bakuloviruksissa saa aikaan kaksikerroksisten viruksen kaltaisten partikkeleiden (dl-VP2/VP6-VLP:iden) muodostumisen. Tällaiset VLP:t lukeutuvat mukaan esillä olevissa rokoteformulaatioissa käytettäväksi soveltuviin ro-tavirusantigeeneihin. Rotavirusantigeenit voivat olla peräisin mistä tahansa ro-taviruskannasta, mutta ne ovat edullisesti humaaniantigeenejä ihmisen rotavi-10 ruksesta.
Edellä kuvattuja norovirus- ja rotavirusantigeenejä voidaan käyttää esillä olevissa rokoteformulaatioissa millaisena haluttuna yhdistelmänä tahansa. Joissakin suoritusmuodoissa rokoteformulaatio sisältää monovalentteja GII-4-noroviruksen VLP:itä ja rotaviruksen rVP6-proteiinia, edullisesti multi-15 meerisessa muodossa. Joissakin muissa suoritusmuodoissa rokoteformulaatio sisältää monovalentteja GII-4-noroviruksen VLP:itä ja rotaviruksen kaksikerroksisia VP2/VP6-VLP:itä.
Norovirus- ja rotavirusantigeenejä voidaan eristää ja puhdistaa luonnollisista lähteistä. Joissakin muissa suoritusmuodoissa mainittuja anti-20 geenejä voidaan tuottaa rekombinanttitekniikoilla sopivissa ekspressioisännis-sä mukaan lukien, niihin kuitenkaan rajoittumatta, hiivasolut (esim. S. cere-visiae, S. pombe tai Pichia pastori), bakteerisolut (esim. E. coli), hyönteissolut (esim. Sf9-solut) ja nisäkässolut (esim. CHO-solut). Alan ammattilainen tuntee hyvin kuhunkin ekspressiosysteemiin soveltuvia ekspressiovektoreita.
25 Esillä olevat rokotteet voivat käsittää yksittäisten norovirus- ja rotavi- rusrokotteiden yhdistelmää missä tahansa suhteessa, edullisesti yhtä suurina 5 määrinä (1:1). Yhdistelmärokote voidaan formuloida ainakin kahdella tapaa.
C\J
^ Ensimmäisen tavan mukaan norovirus- ja rotavirusrokotteita tuotetaan rekom- T binanttiproteiineina erikseen (joko VLP:iden, monomeerien, dimeerien, trimee- ^ 30 rien, pallojen, putkien tai levyjen muodossa tai niiden minä tahansa yhdistel- | mänä) ja sekoitetaan in vitro tietyssä suhteessa ”cocktail”-rokotteeksi kutsutun r*. nestemäisen formulaation aikaansaamiseksi. Toisen tavan mukaan norovirus-
CD
§ kapsidin ja rotaviruksen VP6:n kimeerisiä proteiineja aikaansaadaan infektoi- ? maila samanaikaisesti haluttu isäntä (esim. Sf9-hyönteissolut) sopivalla eks- ^ 35 pressiosysteemillä (esim. rekombinatti-bakuloviruksilla, jotka ekspressoivat no- 11 roviruksen kapsidigeeniä ja rotaviruksen VP6-geeniä). Tällaisia rokoteformu-laatioita kutsutaan tässä tekstissä ’’kimeerisiksi” rokotteiksi.
Tyyppispesifisten (homotyyppisten) immuunivasteiden lisäksi ristire-aktiivisten (heterotyyppisten) immuunivasteiden indusoituminen on hyvin tär-5 keää sellaisten virusten kuin norovirus ja rotavirus ollessa kyseessä. Näillä viruksilla on suuria määriä erilaisia genotyyppejä/serotyyppejä ja kantoja kiertämässä. Ihanteellinen rokote indusoi vasteen rokotteessa olevan viruksen erilaisille homologisille ja heterologisille kannoille. Joissakin suoritusmuodoissa GI-3- (kuuluu norovirusten genoryhmään I) ja GII-12- (kuuluu norovirusten ge-10 noryhmään II) VLP:iden tunnistettiin olevan heterologisia antigeenejä rokote-formulaatioissa oleville GII-4-VLP:ille. GII-4-spesifisillä yksittäis- tai yhdistelmä-rokotteilla immunisoidut hiiret tuottivat molemmille heterologisille antigeeneille reaktiivisia vasta-aineita sekä genoryhmien välillä että niiden sisällä. Noin 50 %:n lisäys ristireaktiivisessa immuunivasteessa Gl-3:a vastaan yhdistelmäro-15 kotteella immunisoitujen hiirten seerumissa rotaviruksen VP6-yksittäisrokot-teeseen verrattuna viittaa esillä olevassa rokoteformulaatiossa olevan rotaviruksen VP6-proteiinin adjuvanttivaikutukseen. Toisin sanoen esillä olevien yhdistelmärokotteiden antigeeniset komponentit saavat aikaan synergistisen vaikutuksen. Esimerkeissä osoitetaan, että rotaviruksen VP6-proteiinilla on kyky 20 toimia adjuvanttina rokoteantigeenillä indusoidun immuunivasteen laajentamisen ja seerumin estoaktiivisuuden lisääntymisen suhteen.
Ristireaktiivisten vasteiden lisäksi esillä olevat yhdistelmärokotte-formulaatiot indusoivat noroviruksille ja rotaviruksille spesifisiä voimakkaita, systeemisiä, pitkäkestoisia (muisti) ja estäviä IgG-vasta-ainevasteita ja soluvä-25 litteisiä immuniteetteja kaikilla immunisaatioreiteillä (edullisesti ID- ja IM-reiteillä). Nämä reaktiot ovat vastakkaisia infektion jälkeen syntyville lyhytikäi-5 sille ja tyyppispesifisille luonnollisille vasteille. Näin ollen systeeminen immuu-
C\J
^ nivaste, joka on vastakkainen paikalliselle mukosaaliselle vasteelle, saattaa ol- ^ la tarpeen suojan pidemmälle kestolle.
w 30 Seerumin IgG-vasta-aineiden siirtyminen suolen onteloon aikaansaa £ todennäköisesti tärkeän suolistoinfektiolta suojaavan mekanismin. Voidaan n olettaa, että mitä suurempi on parenteraalisesti (ID/IM) annetun rokotteen, ku-
CO
§ ten tässä tekstissä kuvatun rokotteen, nostama systeeminen immuunivaste, εις tä korkeampi siirtyneiden vasta-aineiden taso ja parempi suoja on.
011 35 Lisäksi esillä olevat rokoteformulaatiot indusoivat sekatyyppispainot- teisen (mixed balanced type) immuunivasteen, nimittäin T-auttajasolujen (Th) 12 tyypin 1 ja Th2-tyypin vasteet. Tämä on tärkeä havainto ottaen huomioon, että molemmat immuunivastetyypit todennäköisesti välittävät suojaa norovirus-ja/tai rotavirusinfektiota vastaan.
Lisäksi esillä olevat rokoteformulaatiot ovat potentteja korkea-5 aviditeettisten vasta-aineiden indusoijia, kuten esimerkeissä osoitetaan. Kor-kea-aviditeettisten vasta-aineiden osoitettiin korreloivan merkittävästi rokotteiden suojatehokkuuden kanssa.
Lisäksi keksinnössä osoitetaan, että genoryhmien välinen ristisuoja voidaan saada aikaan tässä käytetyillä rokoteformulaatioilla. Immunisointi nolo roviruksen tietyistä kannoista/genotyypeistä saaduilla VLP:illä, kuten tässä tekstissä kuvatulla GII-4-VLP:llä (ns. monovalentti rokote), ei ainoastaan indusoi ristireaktiivista tai heterotyyppistä immuunivastetta muita kuin rokoteformu-laatiossa käytettyjä genotyyppejä vastaan (tässä tekstissä GI-3 ja GII-12), vaan myös estää heterologista virusta sitoutumasta ja neutraloi viruksen kuten 15 tässä tekstissä kuvataan.
Immuunistimulaatiota nostavien aktiivisten ainesosien eli norovirus-ja rotavirusantigeenien lisäksi esillä olevan formulaatiot voivat sisältää steriilejä, myrkyttömiä, farmaseuttisesti hyväksyttäviä fysiologisia kantajia. Joissakin suoritusmuodoissa rokoteformulaatio voi lisäksi sisältää säilöntäaineita kuten 20 fenolia, 2-fenoksietanolia tai tiomersaalia bakteeri- tai sienikontaminaatioiden estämiseksi ja/tai stabilointiaineita kuten sakkaroosia, laktoosia, aminohappoja, tai gelatiinia rokotteen stabiloimiseksi haitallisia olosuhteita vastaan ja immu-nogeenien tarttumisen estämiseksi lääkepullon reunaan.
Joissakin suoritusmuodoissa esillä olevat rokoteformulaatiot voivat 25 sisältää tehokkaan määrän yhtä tai useampaa adjuvanttia. Yleisesti ottaen ad-juvanttiaineiden yksi pääominaisuuksista on laajentaa rokotevasta-aineiden in-5 dusoimaa immuunivastetta. Termiin ’’adjuvantin tehokas määrä” sisältyy sellai-
C\J
^ nen määrä adjuvanttia, joka kykenee stimuloimaan immuunivasteen annettua t antigeeniä vastaan eli määrä, joka lisää annetun antigeenikoostumuksen im- w 30 muunivastetta mitattuna esimerkiksi ristireaktiivisuuden tai vasta-aineen esto- | aktiivisuuden suhteen seerumissa, kuten tämä tekstin esimerkeissä havainnol- r^. listetaan. Sopiviin tehokkaisiin lisäyksiin lukeutuvat yli 5 %:n, edullisesti yli
CO
g 25 %:n ja erityisesti yli 50 %:n lisäykset verrattuna samaan antigeenikoostu- ^ mukseen ilman adjuvanttia. Alan ammattialiset tuntevat hyvin rokoteformulaa- ^ 35 tioihin soveltuvia adjuvantteja.
13
Esillä olevia rokoteformulaatioita voidaan tarjota käyttöön erilaisissa muodoissa mukaan lukien, niihin kuitenkaan rajoittumatta, vesipitoiset liuokset ja kuivat jauheet (lyofilisoidut formulaatiot). Vesipitoisia liuoksia voidaan tarjota käyttöön esimerkiksi muodossa, joka soveltuu annettavaksi injektiolla, nenän 5 kautta (esim. suihkeina tai nenätippoina) tai suun kautta.
Rokoteformulaatioita voidaan antaa eri reittejä pitkin, kuten alalla yleisesti tiedetään. Esillä olevan keksinnön mukaisia rokoteformulaatioita voidaan edullisesti antaa parenteraalisin injektioin mukaan lukien, niihin kuitenkaan rajoittumatta, intramuskulaarisilla (IM), intradermaalisilla (ID) tai subku-10 taanisilla (SC) injektioilla.
Monenlaisia anto-ohjelmia voidaan soveltaa esillä oleviin rokotefor-mulaatioihin. Koska vakavalla akuutilla rotavirus-gastroenteriitillä ja norovirus-gastroenteriitillä on samankaltainen insidenssipiikki 6 kuukauden ja 3 ikävuoden välillä, yhdistetty norovirus- ja rotavirusrokote voitaisiin kohdentaa tämän 15 ikäryhmän lapsiin seuraavalla kahdella ei-rajoittavalla tavalla: a) Injektoitava norovirus+rotavirus-rokote voisi olla osa rutiininomaista pikkuvauvojen rokoteohjelmaa. Oletettavasti kaksi rokoteannosta olisi riittävä vauvoille, mitä voisi mahdollisesti myöhemmin seurata tehosteannos. Suomessa rutiininomaista rokoteohjelmaa toteutetaan 3, 5 ja 12 kuukauden 20 iässä. Esillä oleva norovirus+rotavirus-rokote sopisi tällaiseen ohjelmaan. Kun muissa maissa on hieman toisenlaiset ohjelmat, ehdotettua rokotetta voitaisiin helposti soveltaa erilaisiin ohjelmiin annettavaksi 2, 4, ja 12 kuukauden iässä, 4, 6 ja 12 kuukauden iässä ja niin edelleen; b) Injektoitavaa norovirus+rotavirus-rokotetta voitaisiin käyttää te-25 hosterokotteena rotavirukselle ja primaarirokotteena norovirukselle 12-15 kuukauden iässä. Annettaisiin kaksi annosta. Tätä vaihtoehtoa voitaisiin käytit tää, mikäli elävää suun kautta annettavaa rotavirusrokotetta käytetään jatkos-
C\J
^ sakin primaari-immunisointina rotavirusta vastaan 2 - 6 kuukauden iässä. Ro- t tavirusimmuniteetin tiedetään heikkenevän toisena ja kolmantena elinvuotena o w 30 ja tehosterokotteen olevan monessa tapauksessa suotavaa. Eläviä suunkautta | annettavia rokotteita ei kuitenkaan voida käyttää tehosterokotteina kohonneen i-v. suolentuppeumariskin vuoksi myöhemmällä iällä eli tavallisten tehOSterOkOttei-
CD
§ den aikaan.
g Injektoitava norovirus+rotavirus-rokote kahtena annoksena 12-15 011 35 kuukauden iässä annettuna toimisi tehosterokotteena rotavirukselle ja primaa rirokotteena norovirukselle. Vaikka (pieni) osa noroviruksen aiheuttamista gast- 14 roenteriiteistä esiintyy alle 12 kuukauden ikäisillä vauvoilla ja suurin osa tautitapauksista esiintyy tämän iän jälkeen, rokotteella olisi silti potentiaalia estää suurin osa pikkulasten noroviruksen aiheuttamista gastroenteriittitapauksista.
Esillä olevia rokotteita voidaan käyttää norovirus- ja rotavirusinfekti-5 oiden, norovirus- ja rotavirusindusoitujen ripuli- ja oksennustautien sekä gast-roenteriitin estämiseen ja vähentämiseen sekä immuunivasteen indusoimiseen norovirusta ja rotavirusta vastaan sitä tarvitsevilla kohteilla rokottamalla kohde farmaseuttisesti tehokkaalla määrällä esillä olevaa rokoteformulaatiota. "Farmaseuttisesti tehokas määrä” rokotetta on se määrä, joka kykenee nostamaan 10 sellaisen immuunivasteen, joka suojaa rokotteen saajaa norovirukselta ja rata-virukselta.
Esimerkit
Alan ammattilaiselle on ilmeistä, että tekniikan kehittyessä keksinnön perusajatus voidaan toteuttaa monin eri tavoin. Keksintö ja sen suoritus-15 muodot eivät siten rajoitu yllä kuvattuihin esimerkkeihin vaan ne voivat vaihdella patenttivaatimusten puitteissa.
Esimerkki 1. Noroviruksen VLP:iden tuottaminen ja puhdistaminen GII-4-Noroviruksen kapsidigeenin eristäminen ja kloonaaminen GII-4-norovirus eristettiin potilaan ulosteesta Suomessa 1999. Ulos-20 teen RNA eristettiin käyttäen QiaAmp RNA viral mini kit -pakkausta (Qiagen, Saksa). Noroviruksen koko VP1-kapsidigeenin (1620 bp) sisältävä DNA-fragmentti monistettiin käänteistranskriptaasipolymeraasiketjureaktiolla (RT-PCR) käyttäen seuraavia alukkeita: JV24-forward (5- GTGAATGAAGATGGCGTCGA-3') (Buesa et ai., 2002) ja reverse (5'- 0 25 TTATAATGCACGTCTACGCCC-3'). VP1-kapsidisekvenssin täysimittainen ctj DNA-kopio saatiin sekvensoimalla laitteella ABI PRISM™ 310 Genetic Analy- q zer (Applied Biosystems, USA). Kyseessä oleva noroviruskanta luokiteltiin ge- w neettiseen klusteriin instanssien EMBL/Genebank ja European Food-borne Vi-
X
ί ruses in network (FBVE) mukaisesti (GenBank-sekvenssitietokannan talletus- 30 numero AF080551). Koko VP1-kapsidigeeni monistettiin käyttäen seuraavia § alukkeita: GII-4-fwd (5’CACAGGATCCATGAAGATGGCGTCGAATGAC-3') ja 1 GII-4-rev (5’CTCTGAATTCTTATAATGCACGTCTACGCCCCGCTCCA-3 ) lait- C\] teella PTC-200 DNA Engine (MJ Research). Monistettu fragmentti kloonattiin pCR2.1-TOPO-vektoriin (Invitrogen, USA) ja lisäksi subkloonattiin pFastBad- 15 bakulovirussiirtovektoriin (Invitrogen). Transformaation jälkeen kemiallisesti kompetentteihin E. colin TOPIO-soluihin, VP1 verifioitiin sekvensoimalla käyttäen laitetta ABI PRISM™ 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
GII-12- ja GI-3-noroviruksen kapsidigeenien eristäminen ja kloonaaminen 5 Ulostenäytteet kerättiin noroviruksen infektoimilta potilailta Suomes sa. RNA:t eristettiin (Qlagen) kuten edellä esitetään. Noroviruksen GII-12-VP1-kapsidigeeni ja GI-3-VP1-kapsidigeeni monistettiin RT-PCR:llä käyttäen seu-raavia alukkeita: GII-12-fwd (5’-GTGAATGAAGATGGCGTCGA-3'), 10 GII-12-rev (5’TTACTGTACTCTTCTGCGCCC-3') ja GI-3-fwd (5’-GTAAATGATGATGGCGTCTAA-3’) ja GI-3-rev (5’-TGGGCCATTATGATCTCCTAAT-3').
Amplikonit (1,6 Kb) sekvensointiin ja kannat luokiteltiin instanssien EMBL/Genebank ja FBVE mukaisesti (GeneBank-sekvenssitietokannan talle-15 tusnumero GII-12 AJ277618 ja GI-3 AF414403). Noroviruksen VP1-kapsi-digeenit (GII-12 ja GI-3) kodonioptimoitiin. GII-12 kloonattiin pFastBacDual-siirtovektoriin (Invitrogen) ja GI-3 kloonattiin pFastBad-siirtovektoreihin (Invitrogen).
Noroviruskapsidin rekombinantti-bakulovirusstokin (BV-stokin) tuotta-20 minen
Rekombinantti-bakmidin tuottamiseksi pFastBac-konstrukti transformoitiin kompetentteihin DHIOBacTM E.coli -soluihin Bac-to-Bac-bakulo-virusekspressiosysteemin (Invitrogen) avulla valmistajan ohjeiden mukaisesti. Bakmidi-DNA puhdistettiin 2 ml:sta yliyön LB-kasvatusta käyttäen PureLink 25 HiPure Plasmid DNA Miniprep Kit -pakkausta (Invitrogen). Rekombinatti-
O
^ bakmidi-DNA analysoitiin PCR:llä geenin läsnäolon verifioimiseksi bakmidissa.
^ pUC/M13:n analysoimiseksi käytettiin forward- ja reverse-alukkeita (Invitro- ° gen). VLP:itä tuotettiin sellaisissa Spodoptera frugiperda (Sf9) -hyönteisiä soluissa, jotka oli infektoitu rekombinantti-bakuloviruksella Bac-to-Bac-ekspres- 30 siosysteemin mukaisesti. Tarkemmin sanottuna, Sf9-soluja kylvettiin Multidish § 6-well -levyille (Nunc, Thermo Fisher, Tanska) tiheyteen 1x10® solua/ml see-
CD
o rumitonta kasvatusliuosta (SF 900 SFM III, Invitrogen) ja transfektoitiin bakmi- ° di-DNA:lla (1 pg) käyttämällä ainetta Cellfectin (Invitrogen). Soluja kasvatettiin 26 °C:ssa ja kerättiin 72 h transfektion jälkeen. Solususpensiota sentrifugoitiin 35 nopeudella 500 x g 5 min ajan ja supernatantti (P1-bakulovirusstokki) jaettiin 16 eriin ja säilytettiin 4 °C:ssa. Sf9-solut infektoitiin P1-bakulovirusstokilla ja kuuden päivän kuluttua infektiosta (dpi) solususpensiota sentrifugoitiin nopeudella 500 x g 5 min ajan ja eriin jaettua supernatanttia (P2-bakulovirusstokki) säilytettiin 4 °C:ssa. Bakulovirustiitterit (pesäkkeitä muodostavat yksiköt; pfu) P2-5 stokin MOI-arvona (multiplicity of infektion) ilmaistuna määritettiin käyttämällä BacPak Rapid Titer kit -pakkausta (Clontech laboratories, USA).
Rekombinantin (r) noroviruskapsidin ekspressoiminen sekä VLP:n tuottaminen ja puhdistaminen
Noroviruksen VLP:iden tuottamiseksi luotiin 200 ml:n Sf9-soluvil-10 jelmiä, joiden tiheys oli 1 x 106 solua/ml, ja solut infektoitiin P2-stokilla, jonka MOI-arvo oli 1. Infektoitu soluviljelmä kirkastettiin päivänä kuusi sentrifugoimal-la nopeudella 3000 x g 30 min ajan 4 °C:ssa. Supernatantissa olevia VLP:itä konsentroitiin ultrasentrifugoimalla (L8-60M-ultrasentrifuugi, Beckman SW-32.1 Ti-roottori) nopeudella 100000 x g 2 h ajan 4 °C:ssa ja pelletit suspensoitiin 15 uudestaan 3 ml:aan liuosta: 0,2 M Tris-HCI (pH7,3). VLP:t ladattiin 10 - 60-prosenttisen epäyhtenäisen sakkaroosigradientin päälle ja ultrasentrifugoitiin nopeudella 100000 x g 1 h ajan 4°C:ssa. Fraktiot kerättiin talteen pohjaan puhkaistun reiän kautta. Talteen kerättiin suunnilleen 25 fraktiota ja jokainen fraktio analysoitiin SDS-PAGE-geelillä kapsidiproteiinien ekspressoitumisen 20 suhteen. Ensimmäisen sakkaroosigradienttifraktion osoitettujen fraktioiden analysoiminen osoitti, että ilmeinen kapsidiproteiinipiikki kulkeutui 35-pro-senttiseen sakkaroosiin, ja nämä fraktiot poolattiin. Lisäksi GII-4-VLP:t puhdistettiin uudella epäyhtenäisellä sakkaroosigradientilla (35 % - 60 %). VLP:itä sisältävät fraktiot kerättiin talteen ja yhdistettiin. Sakkaroosi poistettiin dialysoi-25 maila yli yön 1 I fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS) vastaan. VLP:itä kon-^ sentroitiin ultrasentrifugoimalla. Lyhyesti sanottuna enimmillään 15 ml dialyysi- ^ tuotetta konsentroitiin käyttäen Amicon Ultra 30 kDa -sentrifugifiltterilaitetta T (Millipore Corporation, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. VLP:itä säily- ° tettiin 4 °C:ssa PBS-liuoksessa. Kokonaisproteiinipitoisuus määritettiin käyttä- | 30 mällä Pierce® BCA-proteiinimääritystä (Thermo Scientific, USA). Puhtaus ja N integriteetti varmistettiin 12 % SDS-PAGE:n avulla, mitä seurasi densitometri- o nen analyysi ja EM.
o δ
CM
17
Esimerkki 2. Rotavirusantigeenit A. Rotaviruksen rVP6:n tuottaminen ja puhdistaminen
Rotaviruksen VP6:n eristäminen ja kloonaaminen VP6-geenisegmentin täydellisen nukleotidisekvenssin saamiseksi 5 voimakkaasti G1[P8] RT-PCR -positiiviselta akuuttia gastroenteriittiä sairastavalta potilaalta peräisin olevan 10-prosenttisen ulostesuspension RNA eristettiin QIAmp RNA viral mini kit -pakkauksen (Qiagen) avulla valmistajan ohjeiden mukaisesti. Eristetty dsRNA alistettiin RT-PCR-reaktioille käyttämällä VP6:lle spesifistä alukeparia, joka tuottaa 1362 bp -mittaisen amplikonin (Matthijns-10 sens et ai., 2006). Amplikoni puhdistettiin QIAquick-geeliekstraktiokitillä (Qiagen) ja sekvensoitiin ABI PRISM TM 310 Genetic Analyzer -laitteella (Applied Biosystems). VP6-amplikonin sekvenssi kodonioptimoitiin ja kloonattiin pFast-Bac1-vektoriin (Invitrogen).
Rotaviruksen VP6-rekombinantti-bakulovirusstokin (BV-stokin) tuottami-15 nen
Tuotanto suoritettiin olennaisesti, kuten edellä on kuvattu noroviruk-sen yhteydessä.
Rotaviruksen rVP6:n tuottaminen ja puhdistaminen
Rekombinantti-VP6:n tuottamiseksi 200 ml Sf9-hyönteissoluja infek-20 toitiin VP6-geeniä sisältävillä rekombinantti-bakuloviruksilla MOI-arvolla 5 pfu/-solu solukonsentraatiossa 1 x 106 solua/ml. Viljelmäsupernatantti kerättiin päivänä 6 dpi ja kirkastettiin sentrifugoimalla nopeudella 1000 rpm 20 min ajan 4 °C:ssa. Rekombinanttiproteiini konsentroitiin ultrasentrifugoimalla 100000 x 5 g 1,5 h ajan 4 °C:ssa ja pelletit suspensoitiin uudestaan liuokseen: 0,2 M Tris- ^ 25 HCI (pH 7,3) ja puhdistettiin yhtenäisellä sakkanoosigradientilla (10 % - 60 %) v nopeudella 100000 x g 16 h ajan 4 °C:ssa. Myös uusi sakkaroosigradientti- ° puhdistus oltaisi voitu suorittaa. VP6-proteiinia sisältävät sakkaroosifraktiot | poolattiin, dialysoitiin yli yön PBS-liuosta vastaan ja konsentroitiin käyttäen ^ Amicon Ultra 50 -sentrifugifiltteriyksikköjä (Millipore Corporation). Kokonaispro- o 30 teiinipitoisuus määritettiin käyttämällä Pierce® BCA-proteiinimääritystä. Puhtain us ja integriteetti varmistettiin 12 % SDS-PAGE:n avulla, mitä seurasi densito-
O
metrinen analyysi ja EM.
18 B. Rotaviruksen kaksikerroksisten (dl) VP2/VP6-VLP:iden tuottaminen ja puhdistaminen
Rotaviruksen VP2-proteiinin eristäminen ja kloonaaminen VP2-geenisegmentin täydellisen nukleotidisekvenssin saamiseksi 5 saman G1[P8] RT-PCR -positiivisen, akuuttia gastroenteriittiä sairastavan potilaan RNA eristettiin QIAmp RNA viral mini kit -pakkauksen (Qiagen) avulla samalla tavalla kuin on kuvattu rotaviruksen rVP6:n tuottamisen ja puhdistamisen yhteydessä. RT-PCR-reaktio suoritettiin käyttämällä VP2:lle spesifistä alu-keparia (Matthijnssens et ai., 2006) 2662 bp -mittaisen amplikonin tuottami-10 seksi. Amplikoni puhdistettiin ja sekvensoitiin samalla tavalla kuin VP6:n yhteydessä. VP2-amplikonin sekvenssi kodonioptimoitiin ja kloonattiin pFast-Bac1-vektoriin (Invitrogen).
Rotaviruksen VP2-rekombinantti-bakulovirusstokin (BV-stokin) tuottaminen 15 Tuotanto suoritettiin olennaisesti, kuten edellä on kuvattu noroviruk- sen yhteydessä.
Rotaviruksen dl-VP2/VP6-VLP:iden tuottaminen ja puhdistaminen
Rotaviruksen kaksikerroksisten (dl) VP2/VP6-VLP:iden tuottamiseksi Sf9-hyönteissoluja infektoitiin samanaikaisesti VP2- ja VP6-geenejä sisältä-20 villa rekombinantti-bakuloviruksilla samalla MOI-arvolla/solu solukonsentraati-ossa 1 x 106 solua/ml. Viljelmäsupernatantit kerättiin päivänä 7 dpi ja kirkastettiin sentrifugoimalla nopeudella 1000 rpm 20 min ajan 4 °C:ssa. Rekombinant-ti-VP2/6-VLP:itä konsentroitiin ja puhdistettiin yhtenäisellä sakkaroosigradientil-la samalla tavoin kuin rekombinantti-norovirus-VLP:t. VP2:ta ja VP6:tta sisältä-^ 25 vät sakkaroosifraktiot poolattiin, dialysoitiin yli yön PBS-liuosta vastaan ja kon- cv sentroitiin käyttäen Amicon Ultra-100 -sentrifugifiltteriyksikköjä (Millipore Cor- ό poration). VLP:itä säilytettiin 4 °C:ssa PBS-liuoksessa. Kokonaisproteiinipitoi- C\l x suus määritettiin käyttämällä Pierce® BCA-proteiinimääritystä (Thermo Scienti- ^ fic, USA). VP2/6:n puhtaus ja integriteetti varmistettiin 12 % SDS-PAGE:n ja ^ 30 EM:n avulla. VP6:n osuus VP2A/P6-näytteessä määritettiin densitometrisellä g analyysillä, δ
CM
19
Esimerkki 3. Kimeerisen proteiinin (GII-4-kapsidi + VP6) tuottaminen ja puhdistaminen
Kimeeriset proteiinivalmisteet tuotettiin infektoimalla Sf9-hyönteis-soluja samanaikaisesti noroviruksen GII-4-rBV:lla MOI-arvolla 5 ja rotaviruksen 5 VP6-rBV:llä MOI-arvolla 5. Samanaikaisesti infektoitujen hyönteissolujen su-pernatantit kerättiin päivänä 6 dpi. Soluviljelmä kirkastettiin sentrifugoimalla nopeudella 3000 x g 30 min ajan 4 °C:ssa ja supernatantti ultrasentrifugoitiin nopeudella 100000 x g 2 h ajan 4°C:ssa. Pelletit uudelleensuspensoitiin liuokseen 0,2 M Tris-HCI (pH 7,3) ja kimeeriset proteiinit puhdistettiin samanai-10 kaisesti yhtenäisellä sakkaroosigradientilla (10 % - 60 %) nopeudella 100000 x g 3 h ajan 4 °C:ssa. Molempia rekombinanttiproteiineja (NV-kapsidia ja vastaavasti RV-VP6:tta) sisältävät fraktiot kerättiin talteen pohjaan puhkaistun reiän kautta ja analysoitiin SDS-PAGE:n avulla. 40-Prosenttisesta sakkaroosista otetut kimeeristä proteiinia sisältävät fraktioit poolattiin ja sakkaroosi poistettiin 15 dialysoimalla PBS-liuosta vastaan. Dialysoitu tuote konsentroitiin käyttäen Amicon Ultra 30 kDa -sentrif ug if il tteril a itetta. Tuotteita säilytettiin 4 °C:ssa PBS-liuoksessa. Kokonaisproteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä Pierce® BCA-proteiinimääritystä (Thermo Scientific, USA). Kummankin proteiinin puhtaus ja integriteetti varmistettiin 12 % SDS-PAGE:n avulla, mitä seurasi densi-20 tometrinen analyysi ja EM.
Esimerkki 4. Noroviruksen ja rotaviruksen VLP:iden karakterisoiminen SDS-PAGE ja densitometrinen kvantitatiivinen analyysi Näytteet ajettiin SDS-PAGE-geelillä (natriumdodekyylisulfaattipoly-akryyliamidigeelielektroforeesilla) käyttäen polyakryyliamidigeelejä, joissa oli ^ 25 12 % akryyliamidia erottelevassa geeliosassa ja 5 % kokoojageeliosassa (Bio- oj rad Laboratories, USA). Näytteitä keitettiin 5 min ajan Laemmli-näytepusku- ^ rissa, joka sisälsi: 2 % SDS, 5 % β-merkaptoetanoli, 62 mM Tris-HCI (pH 6,8), i 0 25 % glyseroli ja 0,01 % bromofenolisininen (Biorad). Geelit värjättiin Page- 1 Blue™-proteiinivärjäysliuoksella (Fermentas, Liettua).
30 SDS-PAGE-geelillä ajettujen proteiinien määrä määritettiin g AlphaEase® FC Software -ohjelmistolla (Alpha Innotech, USA) valmistajan oh- o jeiden mukaisesti.
Kuvio 1A esittää PageBlue-värjättyjen geelien valokuvia, joissa odotetun molekyylipainon omaavat havaitut proteiinit on merkitty nuolella. Kimeeri-35 set GII-4-kapsidi- ja rotavirus-VP6-proteiinit havaittiin sakkaroosigradientin sa- 20 moissa fraktioissa. Kuvio 1A esittää puhdistettuja proteiineja SDS-PAGE-geelillä.
Elektronimikroskopia (EM)
Preparaatit negatiivivärjättiin 3-prosenttisella uranyyliasetaatilla (UA) 5 (pH 4,6). 3 pl proteiininäytettä laitettiin hiilipinnoitetulle hilalle (carbon coated grid) 30 s ajaksi. Hila kuivattiin ja 3 μΙ UA:ta laitettiin hilalle taas 30 s ajaksi. Ylimääräinen neste poistettiin ja hilaa tutkittiin FEI Tecnai F12 -elektronimikroskoopilla (Philips Electron Optics, Hollanti), joka toimii jännitteellä 120 kV.
Jokaisen proteiinin morfologiaa tutkittiin EM:llä (Kuvio 1B) ja korkea-10 asteisten rakenteiden, mukaan lukien GII-4-VLP:iden, rVP6-tubuleiden and dl-VP2/VP6-VLP:iden, muodostuminen vahvistettiin. Tässä näytetään rVP6:n putkimaisia rakenteita, mutta rVP6:n mitä tahansa muotoja voi muodostua mukaan lukien, niihin kuitenkaan rajoittumatta, trimeerit ja korkea-asteiset multi-meeriset rakenteet mukaan lukien pallot ja levyt. GII-4-VLP:iden ja rVP6:n seis koittaminen cocktailiksi suhteessa 1:1 ei haitannut proteiinien integriteettiä tai kummankaan osan morfologiaa cocktailissa. Samanlaisia morfologisia piirteitä havaittiin cocktail-rokotteessa ja kimeerisessä rokotteessa tunnistaen rVP6-tubuleita GII-4-VLP:illä täytettyinä. NV-kapsidien ja RV-VP6:n muita rakenteita voi myös muodostua.
20 Esimerkki 5. Hiirten immunisoinnit Iältään 7 - 9 -viikkoisia BALB/c-naarashiiriä (4-5 hiirtä/ryhmä) immunisoitiin intradermaalisesti (ID) tai intramuskulaarisesti (IM) eri rokotteilla kaksi kertaa, viikolla 0 ja viikolla 3. Joissakin tapauksissa hiiret saivat ainoastaan yhden immunisoinnin rokotteella. Immunisointeihin käytetyt rokotteet oli- 25 vat seuraavanlaisia: GII-4-VLP:t, rVP6-proteiini, dl-VP2/VP6-VLP:t, cocktail o ^ (GII-4-VLP:iden ja rVP6:n seos), kimeerinen rokote, ja cocktail-VLP (GII-4- ^ VLP:iden ja dl-VP2/VP6-VLP:iden seos). Käytetyt rokoteannokset olivat: 50 pg, ° 10 pg, 1 pg ja 0,1 pg. Suurimmassa osassa tapauksista hiiret immunisoitiin 10 ^ pl:lla yksittäisrokoteformulaatiota tai 20 pl:lla yhdistelmärokotetta (cocktail tai ^ 30 kimeerinen). Cocktail-rokote sisältää 10 pl kumpaakin yksittäisrokotekompo- l''- § nenttia. Cocktail-rokotteen saamiseksi sekoitettiin esimerkiksi 10 pl Gilles VLP:itä PBS:ssä ja 10 pg rVP6:ta PBS:ssä in vitro ja säilytettiin 4 °C:ssa. Veri-
Si näytteet (seeruminäytteet) ja ulosteet kerättiin viikoilla 0 (esivuodatettu, ei- immunisoitu seerumi), 2, 3 ja 4. Hiirille tehtiin eutanasia 2 viikkoa viimeisen 21 immunisoinnin jälkeen ja ulosteet, kokoveri ja imukudos kerättiin. Naiiveja hiiriä, jotka eivät saaneet rokoteformulaatiota, käytettiin kontrolleina.
Esimerkki 6. Rokoteindusoidun immuunivasteen annosvaste, kinetiikka ja kesto 5 Hiiriryhmiä (5 hiirtä/ryhmä) immunisoitiin 10, 1 tai 0,1 pg:lla GII-4- VLP:itä päivänä Oja 21 käyttäen IM-ja ID-reittejä. Seerumia kerättiin viikoilla 0, 2, 3 ja 4 ja hiiret lopetettiin viikolla 5. Jokainen lopetusseerumi testattiin laimennoksella 1:200 NV-spesifisen lgG:n suhteen. Samantasoinen vaste indusoitui annoksilla 10 ja 1 pg, mutta jonkin verran alhaisempi vaste havaittiin an-10 noksella 0,1 pg (kuvio 2). Lisäksi poolattujen seerumeiden loppupistetiitteri oli samankaltainen edellä mainituissa ryhmissä (kuvio 3). Naiiveilla kontrollihiirillä ei ollut vastetta NV:lle. Kuvio 4 esittää immuunivasteen kinetiikkaa viikoittain kerätyistä seerumeista mitattuna. Immunisaatiopisteet esitetään nuolella. Tulokset osoittavat, että immunisointi yhdellä annoksella indusoi erittäin voimak-15 kaan immuunivasteen, erityisesti annoksilla 10 pg ja 1 pg. 50 pg:n annos indusoi samankaltaisen vasteen kuin 10 pg:n annos määrittäen vasteen saturaati-on annoksella 10 pg. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset identifioivat annokset 10 pg ja 1 pg optimaalisiksi, vaikka rokoteformulaatioissa voidaankin käyttää muita annoksia. Lisäksi 10 pg:n annos indusoi pitkäkestoisen immuunivasteen, jo-20 ka ei heikentynyt viikkoon 25 mennessä (kuvio 5).
Esimerkki 7. Ulosteanalyysi lgG:n siirtyminen seerumista suolen onteloon liittyy suojautumiseen enteerisiltä patogeeneiltä kuten NV ja RV. Suolistossa olevan lgG:n kyky välittää suojautumista RV-infektiota vastaan tai lievittää tautia on osoitettu passiivini 25 silla immunoglobuliinihoidoilla lapsilla.
O
™ Yksittäisrokoteformulaatioiden tai yhdistelmärokotteiden lgG:n mah- -7 dolliseen siirtymiseen kohdistuvan vaikutuksen testaamiseksi hiirten tuoreita
° ulosteita suspensoitiin 10 mM Tris-puskuriin, jossa oli 100 mM NaCI:a, 1 mM
jg CaC^ita 0,05 % Tvveeniä, 1 % aprotiniinia ja 10 pM leupeptiinia (kaikki Sigma- 30 Aldrichilta), 10-prosenttisen ulostesuspension saamiseksi, mitä homogenisoi-
N
§ tiin vorteksoimalla. Homogenisoituja suspensioita pidettiin jäähauteessa 20
CD
o min ajan ja sentrifugoitiin 15 minuuttia nopeudella 18000 x g +4 °C:ssa. Su- w pernatantit erotettiin ja säilytettiin -80 °C:ssa.
Ulostenäytteet testattiin GII-4-norovirukselle ja rotaviruksen VP6:lle 35 spesifisen lgG:n suhteen ELISA-testillä, kuten on kuvattu seerumivasta-aine- 22 ELISA-testin yhteydessä pienin muutoksin. Päällystämisen ja blokkaamisen jälkeen ulostenäytteitä (10-prosenttinen ulostesuspensio) laimennettiin kaksinkertaisella saijalaimennuksella arvosta 1:2 arvoon 1:32 ja lisättiin levylle. Vuohen anti-hiiri lgG-HRP:tä (Sigma-AIdrich) laimennettiin 1:3000 ja levy kehitettiin 5 ja absorbanssi mitattiin kuten yllä kuvataan.
Kuvio 8 osoittaa, että merkittävä määrä NV-spesifistä lgG:tä havaittiin immunisoitujen hiirten ulosteissa, mutta ei kontrollihiirten ulosteissa.
Esimerkki 8. Seerumianalyysit
Hiiriryhmiä immunisoitiin, kuten edellä kuvataan, kummallakin yksit-10 täisrokoteformulaatiolla tai yhdistelmärokotteella. lgG:n alatyyppejä lgG1 ja lgG2a mitattiin immunisoitujen hiirten seerumista rokoteformulaatioilla indusoitujen immuunivasteiden tyypin määrittämisen mahdollistamiseksi. T-auttaja (Th) 1-ja Th2-dikotomian ja vallitsevan immunoglobuliinin isotyypin välinen yhteys selvitettiin: lgG1 luokitellaan Th2-tyypin vasteeksi ja lgG2a Th1 -tyypin 15 vasteeksi. Th1-tyyppi edistää soluvälitteistä immuniteettia ja Th2-tyyppi humo-raalista immuniteettia.
Seerumin norovirus-lgG:n ja IgG-alatyypin ELISA-testi
Immunisoitujen ja kontrollihiirten seerumeita testattiin immunoglobu-liini G:n (IgG), lgG1:n ja lgG2a:n suhteen entsyymivälitteisellä immunosorbent-20 timäärityksellä (ELISA). Noroviruksen GII-4-, GII-12-ja GI-3-VLP:itä käytettiin 96-kuoppaisten mikrotiitterilevyjen (Nunc Immuno Maxisorp, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) päällystämiseen (4 °C yliyön) konsentraati-oilla 0,2 pg/ml, 0,4 pg/ml ja vastaavasti 1 pg/ml (100 pl/kuoppa) 10 mM PBS:ssä. Kolme kertaa 0,05 % Tween 20:tä sisältävällä PBS:llä (PBS-T) teh-^ 25 dyn pesun jälkeen levyjä blokattiin huoneenlämmössä (RT) 1 h ajan PBS:llä, ^ joka sisälsi 5 % rasvatonta maitoa (Sigma-AIdrich). Tämän jälkeen kuoppia
C\J
-7 pestiin kolme kertaa PBS-T:llä ja inkuboitiin 1 h ajan 37 °C:ssa käyttämällä 100 ° pl seerumilaimennosta 1:200 tai kaksinkertaista sarjalaimennosta PBS-T:tä, g joka sisälsi 1 % rasvatonta maitoa. Kaikki seeruminäytteet testattiin kahdessa
CL
30 kuopassa. Kuuden pesukerran jälkeen piparjuuriperoksidaasiin (HRP:hen) o konjugoitua anti-hiiri lgG:tä (Sigma-AIdrich), jota oli laimennettu 1:4000 liuok-
CO
o sella 1 % maito PBS-T:ssä, lisättiin kuoppiin.
^ Anti-GII-4-lgG-alatyypin vasteet määritettiin käyttämällä vuohen an ti-hiiri lgG1- tai lgG2a-HRP-konjugaattia (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia), jota 35 oli laimennettu 1:6000 liuoksella 1 % maito PBS-T:ssä. Inkubaation (1 h, 23 37 °C) jälkeen levyt pestiin ja o-fenyleenidiamiinidihydrokloridisubstrraattia (SIGMAF/ASTOPD, Sigma-AIdrich) lisättiin konsentraatiossa 0,4 mg/ml. Levyjä inkuboitiin huoneen lämmössä pimeässä 30 min ajan ja reaktio pysäytettiin 2 M rikkihapolla (H2S04). Absorbanssi (optinen tiheys, OD) aallonpituudella 490 5 nm mitattiin mikrolevylukijalla (Victor2 1420, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA). Yksi tunnettu positiivinen ja yksi negatiivinen näyte naiivi-hiirestä lisättiin kaikille levyille kontrolleiksi. Tyhjistä kuopista (kuopat ilman seerumia) saatu taustasignaali vähennettiin levyn kaikista OD-lukemista. Näytettä pidettiin positiivisena, jos nettoabsorbanssi oli cut-off-arvon yläpuolella seuraavalla tavalla 10 laskettuna: keskimääräinen OD (naiivit hiiret) + 3 x SD ja vähintään 0,100 OD.
Seerumin rotavirus-lgG:n ja IgG-alatyypin ELISA-testi VP6-proteiinia käytettiin 96-kuoppaisten mikrotiitterilevyjen päällystämiseen bikarbobaatti/karbonaattipuskurissa (0,1 mM Na2C03, 0,8 mM NaH-C03, pH 9,55) konsentraatiolla 1 pg/ml (100 μΙ/kuoppa). Edellä olevan vaiheen 15 jälkeen ELISA-testi suoritettiin samalla tavalla kuin ELISA-testi noroviruksen osalta. Ristireagoivien rota-spesifisten seerumivasta-aineiden havaitsemiseksi polyklonaalista kanin anti-rotavirusta (humaani) (DAKO) laimennettiin 1:200 bi-karbonaatti/karbonaattipuskurilla ja sitä käytettiin 100 μΙ/kuoppa mikrotiitterilevyjen päällystämiseksi (+4 °C yliyön). PBS-T:llä neljä kertaa tehdyn pesun jäl-20 keen levyt päällystettiin käyttämällä edellä kuvatulla tavalla valmistettua rotavi-rusantigeeniä 100 μΙ/kuoppa (+4 °C yliyön). PBS-T:llä neljä kertaa tehdyn pesun jälkeen levyjä blokattiin + 37 °C:ssa 1 h PBS:llä, joka sisälsi 5 % rasvatonta aitoa. Tämän vaiheen jälkeen ELISA-testi suoritettiin samalla tavalla kuin seerumin ELISA-testi noroviruksen osalta.
^ 25 Seerumi-lgG:n voimakkuus ja alatyypit o ^ Kuviot 6 ja 7 esittävät norovirus- ja rotavirus-spesifisiä seerumin -7 IgG-titraatioita vastaavasti. Loppupistetiitterit olivat huomattavan korkeita (resi- ° prookkinen tiitteri >4-5 Iog10) jokaisen immunisoidun hiiriryhmän osalta kontit rollihiiriä lukuun ottamatta. Nämä tulokset osoittavat, että yhdistelmärokotteen
CL
30 komponenteilla ei ole keskinäistä inhibitiota tai spesifisten immuunivasteiden § supressiota.
CD
o Kuviot 9 ja 10 osoittavat, että kaikki esillä olevan keksinnön mukaili set rokoteformulaatiot indusoivat sekatyyppispainotteisen immuunivasteen, nimittäin Th1-tyypin ja Th2-tyypin immuunivasteen. Tämä on tärkeä havainto 35 ottaen huomioon, että todennäköisesti molemmat immuunivasteen tyypit välit- 24 tävät suojautumista NV- ja/tai RV-infektioita vastaan. Th-solut auttavat B-soluja (joko solu-solu-kontaktien tai liukoisten sytokiinien avulla) erityisesti erilaistumisessa B-muistisoluiksi, joita tarvitaan pitkäkestoiseen muistivasteeseen, minkä indusoitumiseen rokotteilla yleisesti tähdätään. RV-VP6-spesifiset Th-5 solut indusoivat suojan rottaeläinten rotavirus-infektioita vastaan ja aikaansaavat siihen liittyvää apua B-soluille, jotka spesifisesti neutraloivat RV:n hetero-tyyppisten VP4- tai VP7-molekyylien epitooppeja (Esuivel FR, Arch. Virology 2000; Peralta et ai., Virology Journal, 2009). Tästä syystä Th-solut ovat tärkeitä heterotyyppisen immuunivasteen indusoitumiselle.
10 Esimerkki 9. Immuunivasteen aviditeetti
Vasta-aineen aviditeetti on funktionaalisen vasta-ainematuraation tai affiniteettimaturaation mitta. Korkea-aviditeettisten vasta-aineiden on osoitettu korreloivan merkittävästi rokotteiden suojaustehokkuuden kanssa (Makidon et ai., 2008). Olemme aikaisemmin osoittaneet (Nurminen et ai., 2010), että van-15 hemmilla lapsilla, joiden veressä oli korkea-aviditeettisia NV-spesifisiä IgG-vasta-aineita, oli vähemmän NV-infektioita kuin alle kahden vuoden ikäisillä lapsilla, joilla oli matala-aviditeettisia vasta-aineita.
NV- ja RV-vasta-aineiden aviditeetin määrittämiseksi käytettiin urea-eluutiota matala-aviditeettisten vasta-aineiden poistamiseksi [Kanno ja Kazu-20 yama, 2002], ELISA-määritys toteutettiin kuten edellä kuvataan lukuun ottamatta ylimääräistä urea-inkubaatio vaihetta. Sen jälkeen kun seerumeita oli in-kuboitu antigeenillä (norovirus-GII-4-VLP tai rotavirus-VP6-proteiini) päällystetyillä levyillä, seerumit imettiin levyiltä ja niihin lisättiin liuosta: 8 M urea (Sigma-Aldrich) PBS-T:ssä. Viiden minuutin inkubaation jälkeen käsittely toistettiin. Le-25 vyjä pestiin neljä kertaa ennen HRP-konjugoidun anti-hiiri-lgG:n lisäämistä ja 5 levyjen kehittämistä kuten edellä kuvataan. Aviditeetti-indeksi laskettiin seu- ^ raavasti: [OD urean kanssa / OD ilman ureaa] x 100 %; indeksiarvoa > 50 %
CM
v pidettiin korkeana aviditeettinä.
o cm Yksittäis- tai yhdistelmärokotteella tehdyt immunisoinnit indusoivat | 30 korkea-aviditeettisia NV- ja RV-spesifisiä IgG-vasta-aineita (aviditeetti-indeksi N >50 % vastaavasti). Tulokset osoittavat, että esillä olevat rokoteformulaatiot o ovat suojaavia ominaisuuksia omaavien korkea-aviditeettisten vasta-aineiden ° potentteja indusoijia (kuvio 11).
O
CM
25
Esimerkki 10. Ristireaktiiviset immuunivasteet
Eri serotyyppien rotaviruksia (G1P8, G2P6, G4P6, G8P10, G12P4, BRV ja RRV) kasvatettiin reesusapinan sikiön munuaissoluissa (MA104) ja valmistettiin käytettäväksi antigeeneinä ELISA-testissä ristireaktiotutkimuksia 5 varten.
Immunisoitujen ja kontrollihiirten seerumeita testattiin norovirus- ja rotavirus-vasta-aineiden suhteen ELISA-testillä kuten esimerkissä 8 esitetään. Norovirus-GII-4-indusoidut seerumivasta-aineet olivat ristireaktiivisia heterolo-gisia GI-3- ja GII-12-antigeeneja vastaan (kuvio 12, ylempi paneeli). Lisäksi ro-10 koteformulaatioilla immunisoitujen hiirten rotavirus-spesifiset seerumivasta-aineet olivat ristireaktiivisia alaryhmiin 1 ja 2 kuuluvia ihmisen, nautaeläinten ja apinaeläinten eri rotaviruskantoja vastaan (kuvio 12, alempi paneeli).
Rotaviruksen VP6-antigeeni aiheutti yllättäen noin 50 % nousun ris-tireaktiivisessa immuunivasteessa Gl-3:a kohti yhdistelmärokotteella immuni-15 soitujen hiirten seerumissa rotavirus-VP6-yksittäisrokotteeseen verrattuna (kuvio 12, ylempi paneeli). Tämä tulos osoittaa, että esillä olevien yhdistelmärokotteiden antigeeniset komponentit aikaansaavat synergistisen vaikutuksen.
Esimerkki 11. Blokkausmääritys
Blokkausmääritys on surrogaatin neutralisaatiomääritys noroviruk-20 sen osalta. Norovirusta ei pystytä kasvattamaan soluviljelmissä in vitro ja siksi neutralisaatiomääritys perinteisessä mielessä käyttämällä vasta-aineita, jotka estävät virusta sitoutumasta ja infektoimasta permissiivisiä soluja, on mahdotonta suorittaa. Ihmisen histoveriryhmäantigeenien (HBGA) on hiljattain havaittu toimivan norovirusreseptoreina, joita ekspressoituu mm. mukosaalisilla pin-25 noilla olevien solujen (esim. enterosyyttien) pinnalla. Esimerkiksi H-tyypin 3 hii-5 lihydraatti on tunnistettu NV-GII-4:n mahdolliseksi reseptoriksi ja siksi GII-4-
C\J
^ VLP:t sitoutuvat edellä mainittuun hiilihydraattiin (L Huhti et ai, 2010). NV- ^ VLP:iden sitoutumisen reseptoriin odotetaan estyvän neutraloivia ominaisuuk- siä omaavilla vasta-aineilla. Itse asiassa GII-4-VLP:iden sitoutuminen H-tyyp-| 30 piin 3 voitiin blokata sellaisilta lapsilta saaduilla seerumeilla, jotka eivät olleet r*. infektoituneet noroviruksella vesitse levinneen akuutin gastroenteriittiepidemi-
(O
g an aikana (K Nurminen et ai, 2010). Suoja NV-infektiota vastaan korreloi see- t- rumien voimakkaan blokkausaktiivisuuden kanssa. Tämän vuoksi vasta-ainei-
O
w den blokkausaktiivisuus voi olla oleellinen NV-suojan surrogaattimarkkeri, kun 35 pohditaan erilaisia rokotelähestymistapoja.
26
Blokkausmääritys NV-VLP:iden sitoutumisesta HBGA H-tyyppiin 3 suoritettiin immunisoitujen ja kontrolliin iirien seerumeilla. Mikrotiitterilevyt päällystettiin GII-4- tai GI-3-VLP:illä PBS:ssä (pH 7,2) konsentraatiolla 2 pg/ml ja inkuboitiin 4 h huoneenlämmössä. Pesun jälkeen levyjä inkuboitiin 5 % mai-5 dossa PBS:ssä yli yön 4 °C:ssa. Vaihteluvälillä 1:200 - 1:6400 sarjalaimennet-tuja seerumeita lisättiin kuoppiin ja levyjä inkuboitiin 1 h 37 °C:ssa. Seerumien imemisen jälkeen lisättiin 100 pl biotinyloitua H-tyyppi-3:a tai Lewis B:tä (Leub) (Lectinity Holdings, Inc., Moskova, Venäjä) kontrollina konsentraatiossa 20 pg/ml tai 40 pg/ml PBS-T:ssä, jossa oli 1 % maitoa. Neljän tunnin jälkeen 10 37 °C:ssa kuopat pestiin ja 1:2000-laimennosta streptavidiinikonjugoitua HRP:tä (Thermo Fisher Scientific Inc.) lisättiin ja inkuboitiin 1 h 37 °C:ssa. Väri-reaktion kehittyminen ja absorbanssin mittaaminen aallonpituudella 490 nm tehtiin, kuten edellä kuvataan. Ilman seerumia inkuboiduista kuopista saatuja OD-lukemia pidettiin maksimisignaaleina H-tyypin 3 sitoutumiselle GII-4-15 VLP:hen. Blokkausindeksi mitattiin seuraavasti: 100 % - (OD[seerumin kanssa] / OD[ilman seerumia] x 100 %). VLP:iden sitoutumista negatiiviseen kontrolliin Leub-HBGA ei havaittu. Taustasignaali tyhjistä kuopista (kuopista ilman HBGA:ta) vähennettiin kaikkien testattujen näytteiden OD-arvoista.
Kuviot 13A ja 13B esittävät Gll-4:n ja vastaavasti Gl-3:n sitoutumi-20 sen blokkaamista oletettuun reseptoriinsa H-tyyppi 3. Kaksi kertaa suurempi tiitteri tarvittiin blokkaamaan maksimaalisesti GII-4-VLP:iden sitoutuminen yk-s i ttä i s ro kotteel I a immunisoitujen hiirten H-tyyppiin 3 yhdistelmärokotteeseen verrattuna (kuvio 13C). Tämä tulos osoittaa, että rVP6-proteiini yhdistelmärokotteessa ei suppressoi tai inhiboi GII-4-spesifisten seerumeiden blokkausak-25 tiivisuutta. Päinvastoin, yhdistelmärokoteformulaatiolla immunisoitujen hiirten seerumeiden huomattava blokkausaktiivisuus viittaa samankaltaiseen rVP6-5 proteiinin adjuvanttivaikutukseen kuin edellisessä kokeessa havaittiin. Lisäksi
C\J
^ tuloksemme osoittavat, että genoryhmien välinen ristisuoja on helposti havait- ^ tavissa tutkimuksessamme käytetyillä rokoteformulaatioilla. Tällainen havainto w 30 on suhteellisen uniikki norovirusrokotetutkimuksen alalla. Tulokset osoittavat | myös, että immunisointi viruksen yksittäisellä kannalla/genotyypillä (niin kutsutin tu monovalenttirokote) ei ainoastaan indusoi ristireaktiivista tai hetorotyyppistä
CD
§ immuunivastetta rokoteformulaatioista puuttuvia toisia kantoja vastaan kuten ^ edellä on kuvattu, vaan myös estää heterologista virusta sitoutumasta ja neut- ^ 35 raloi sen.
27
Esimerkki 12. Vasta-ainetta erittävien solujen (ASC) ELISPOT-testi
Vasta-ainetta erittävät solut (ASC) jaetaan B-solulinjan plasmasolui-hin ja B-muistisoluihin, jotka ovat vastuussa pitkäkestoisesta suojasta patogeeniä vastaan (muistivaste) ja jotka reagoivat patogeeniin nopeasti uudel-5 leenaltistuksessa, mikä on minkä tahansa rokotuksen tarkoituksena olevan muistivasteen tunnusmerkki. ELISPOT-määritystä käytettiin IgG-vasta-aineita erittävien plasmasolujen ja B-muistisolujen frekvenssin havaitsemiseen immunisoitujen hiirten pernassa.
Lopetettujen hiirten pernat kerättiin Hanksin suolaliuokseen (HBBS) 10 (Sigma-AIdrich). Pernojen rakenne hajotettiin skalpellilla ja dissosioitiin yk-sisolususpensioksi käyttämällä 70 pm:n solusuodatinta (Becton, Dickinson and Company, USA). Suspensioita sentrifugoitiin 300 x g 10 min ajan ja solut uu-delleensuspensoitiin HBSS:ään. Punasolut hajotettiin HBSS:llä, jota oli laimennettu 1:10, minkä jälkeen suspension molaarisuus palautettiin 2 x 15 HBSS:llä. Splenosyyttisuspensioita pestiin kolme kertaa, pakastettiin pakastus-liuoksessa (RPMI, jota oli täydennetty 40 % FBS:llä ja 10 % DMSOIIa, Sigma-AIdrich), ja säilytettiin nestetypessä myöhempää käyttöä varten.
96-Kuoppaisia PVDF-levyjä (Millipore) päällystettiin yli yön + 4 °C:ssa noroviruksen GII-4-VLP:illä tai rotaviruksen VP6-proteeineilla kon-20 sentraatiossa 40 pg/ml tilavuudessa 100 μΙ/kuoppa. Splenosyyttejä sulatettiin nestetypestä, pestiin ja suspensoitiin soluviljelyliuokseen (RPMI-1640 täydennettynä 10 % FBS:llä, 100 U/ml penisilliinillä, 100 pg/ml streptomysiinillä, 50 pM 2-merkaptoetanolilla ja 2 mM L-glutamiinilla). Levyjen pesemisen ja blok-kaamisen jälkeen splenosyyttejä lisättiin konsentraatiossa 4 x 105 solua/kuop-25 pa ja inkuboitiin yli yön + 37 °C:ssa, 5 % CC^ssa. Levyjä pestiin 6 kertaa PBS-T:llä ja vuohen anti-hiiri-lgG-HRP:tä (Sigma-AIdrich) lisättiin kuoppiin laimen-o noksella 1:1000. Kolmen tunnin inkuboimisen jälkeen huoneenlämmössä levyt ^ pestiin intensiivisesti ja kehitettiin DAB-substraatin avulla (SigmaFAST DAB, q Sigma-AIdrich), ja spotit laskettiin. Naiiveista kontrollieläimistä peräisin olevissa 1X1 30 kuopissa esiintyvät spotit vähennettiin koeryhmästä. Tulokset on ilmaistu GII-4- £ VLP- tai VP6-spesifisinä vasta-aineita tuottavina soluina (ACS) ja on normality soitu per 1 x 106 solua.
S Joissakin tapauksissa soluja inkuboitiin in vitro neljän päivän ajan 5 GII-4-VLP:iden tai rVP6:n kanssa, pestiin ja laitettiin levyille, kuten B-muisti-
CM
35 solujen kvantitatiivisen analyysin yhteydessä on kuvattu. Niiden solujen, joille ei tehty in vitro -stimulaatiota, ELISPOT-määrityksestä saatujen spottien oletet- 28 tiin olevan aktiivisesti erittäviä plasmasoluja. Neljä päivää kasvatetuista soluista saadut spotit, plasmasolujen tuottamien spottien vähentämisen jälkeen, edustavat B-muistisolua ktiivisuutta.
Kuvio 14 osoittaa, että esillä olevat rokoteformulaatiot indusoivat B-5 solulinjan plasmasoluja tuottamaan NV- ja RV-spesifisiä IgG-vasta-aineita. Lisäksi samanlaisilla määrillä yksittäis- ja yhdistelmärokotteita indusoituu suuria määriä B-muistisoluja, jotka erittävät spesifisiä IgG-vasta-aineita, mikä osoittaa, että indusoitu vaste on muistivaste.
o
C\J
i
C\J
o
CVJ
X
a:
CL
h-
CD
O
CD
O
O
OJ
Patenttivaatimukset 29 1. Rokotekoostumus, joka käsittää ainakin yhden noroviruksen VLP-antigeenin ja ainakin yhden rotaviruksen VP6-antigeenin.
5 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rokotekoostumus, joka käsittää lisäksi norovirusantigeenin, joka on valittu joukosta: antigeeniset kapsidipeptidit ja antigeeniset kapsidiproteiinit.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rokotekoostumus, jossa mainittu norovirusantigeeni on peräisin joukosta: genoryhmien Gl ja Gil norovirukset ja 10 niiden genotyypit.
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 3 mukainen rokotekoostumus, jossa mainittu norovirusantigeeni on GII-4 VLP.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen rokotekoostumus, jossa mainittu GII-4 VLP on monovalentti.
15 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rokotekoostumus, jossa mainittu norovirusantigeeni käsittää useamman kuin yhden VLP-tyypin.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen rokotekoostumus, jossa mainittu rotaviruksen VP6-antigeeni on valittu joukosta: rVP6-proteiini, kaksikerroksinen VP2/VP6-VLP-rakenne, VP6-proteiinia sisältävät VLP-rakenteet ja niiden yh- 20 distelmät.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen rokotekoostumus, jossa mainittu rVP6 on multimeerisessä muodossa, joka on putkimainen, pallomainen, levymäinen tai niiden yhdistelmä.
9. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 8 mukainen rokotekoostumus, jo- 25 ka käsittää lisäksi steriilin, myrkyttömän ja farmaseuttiseen käyttöön hyväksy- ^ tyn fysiologisen kantaja-aineen.
^ 10. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 9 mukainen rokotekoostumus
(M
T käytettäväksi ennaltaehkäisemään sairautta, joka on valittu ryhmästä: noro- ja S rotavirusinfektio, viruksen aiheuttama ripuli, oksennustauti ja gastroenteriitti.
£ 30 11. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksen 1 - 8 mukaisen rokote- koostumuksen valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää vaiheen, jossa ilmen- o netään samanaikaisesti samassa isännässä ainakin yhtä noroviruksen VLP-
CD
° antigeeniä ja ainakin yhtä rotaviruksen VP6-antigeeniä, tai vaiheet, joissa o a) tuotetaan, eristetään ja puhdistetaan ainakin yksi noroviruksen 35 VLP-antigeeni; 30 b) tuotetaan, eristetään ja puhdistetaan ainakin yksi rotaviruksen VP6-antigeeni; ja c) sekoitetaan mainitut noro- ja rotavirusantigeenit.
12. Patenttivaatimuksen 12 mukainen menetelmä, jossa mainitut 5 antigeenit on valmistettu rekombinantti-bakuloviruksella infektoidussa hyön-teissoluisännässä.
o
C\J
Cd 0 cg 1 CC Q.
N
co o
CO
o δ
Cd
FI20106067A 2010-10-14 2010-10-15 Noroviruksen kapsidi ja rotaviruksen VP6-proteiini käytettäväksi yhdistelmärokotteena FI122520B (fi)

Priority Applications (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20106067A FI122520B (fi) 2010-10-15 2010-10-15 Noroviruksen kapsidi ja rotaviruksen VP6-proteiini käytettäväksi yhdistelmärokotteena
US13/269,326 US8895015B2 (en) 2010-10-14 2011-10-07 Norovirus capsid and rotavirus VP6 protein for use as combined vaccine
SG2013027974A SG189398A1 (en) 2010-10-14 2011-10-12 Norovirus capsid and rotavirus vp6 protein for use as combined vaccine
MX2013004159A MX352478B (es) 2010-10-14 2011-10-12 Proteina vp6 de la capside de norovirus y rotavirus para el uso como vacuna combinada.
BR112013009164A BR112013009164A2 (pt) 2010-10-14 2011-10-12 capsídeo de norovírus e proteína vp6 de rotavírus para uso como vacina combinada.
AU2011315405A AU2011315405B2 (en) 2010-10-14 2011-10-12 Norovirus capsid and rotavirus VP6 protein for use as combined vaccine
RU2013121815/10A RU2013121815A (ru) 2010-10-14 2011-10-12 Капсид норовируса и белок vp6 ротавируса для использования в качестве комбинированной вакцины
KR1020137012218A KR101847472B1 (ko) 2010-10-14 2011-10-12 혼합 백신으로 사용하기 위한 노로바이러스 캡시드 및 로타바이러스 ｖｐ6 단백질
CN201180049612.4A CN103260645B (zh) 2010-10-14 2011-10-12 用作联合疫苗的诺罗病毒壳体和轮状病毒vp6蛋白
PCT/FI2011/050880 WO2012049366A1 (en) 2010-10-14 2011-10-12 Norovirus capsid and rotavirus vp6 protein for use as combined vaccine
JP2013533249A JP5902181B2 (ja) 2010-10-14 2011-10-12 混合ワクチンとして使用するためのノロウイルスカプシド及びロタウイルスｖｐ６タンパク質
EP11832191.8A EP2627353B1 (en) 2010-10-14 2011-10-12 Norovirus capsid and rotavirus vp6 protein for use as combined vaccine
CA2814175A CA2814175C (en) 2010-10-14 2011-10-12 Norovirus capsid and rotavirus vp6 protein for use as combined vaccine
TW100137092A TWI479022B (zh) 2010-10-14 2011-10-13 諾羅病毒衣殼與輪狀病毒ｖｐ６蛋白質做為組合疫苗的用途

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI20106067A FI122520B (fi) 2010-10-15 2010-10-15 Noroviruksen kapsidi ja rotaviruksen VP6-proteiini käytettäväksi yhdistelmärokotteena
FI20106067 2010-10-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI20106067A0 FI20106067A0 (fi) 2010-10-15
FI122520B true FI122520B (fi) 2012-03-15

Family

ID=43064225

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI20106067A FI122520B (fi) 2010-10-14 2010-10-15 Noroviruksen kapsidi ja rotaviruksen VP6-proteiini käytettäväksi yhdistelmärokotteena

Country Status (14)

Country Link
US (1) US8895015B2 (fi)
EP (1) EP2627353B1 (fi)
JP (1) JP5902181B2 (fi)
KR (1) KR101847472B1 (fi)
CN (1) CN103260645B (fi)
AU (1) AU2011315405B2 (fi)
BR (1) BR112013009164A2 (fi)
CA (1) CA2814175C (fi)
FI (1) FI122520B (fi)
MX (1) MX352478B (fi)
RU (1) RU2013121815A (fi)
SG (1) SG189398A1 (fi)
TW (1) TWI479022B (fi)
WO (1) WO2012049366A1 (fi)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8481693B2 (en) 2007-03-14 2013-07-09 Takeda Vaccines (Montana), Inc. Virus like particle purification
WO2013061941A1 (ja) 2011-10-24 2013-05-02 トヨタ自動車株式会社 組換え酵母を用いたエタノールの製造方法
JOP20130186B1 (ar) 2012-06-22 2021-08-17 Takeda Vaccines Montana Inc تنقية الجزيئات الشبيهة بالفيروسات
CN103667199B (zh) * 2012-09-20 2019-01-22 厦门大学 体外制备轮状病毒双层类病毒颗粒的方法
CA2902560A1 (en) * 2013-03-14 2014-09-25 President And Fellows Of Harvard College Nanoparticle-based compositions
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
JP2015015931A (ja) * 2013-07-12 2015-01-29 株式会社Ｕｍｎファーマ ウイルス様粒子を含む培養物の製造方法
US20160194368A1 (en) 2013-09-03 2016-07-07 Moderna Therapeutics, Inc. Circular polynucleotides
AU2014315287A1 (en) 2013-09-03 2015-03-12 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
US10323076B2 (en) 2013-10-03 2019-06-18 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
JP2018078806A (ja) * 2016-11-14 2018-05-24 東ソー株式会社 ノロウイルスｒｎａの検出方法
CA3053522A1 (en) 2017-03-28 2018-10-04 Children's Hospital Medical Center Norovirus s particle based vaccines and methods of making and using same
CA3063723A1 (en) 2017-05-18 2018-11-22 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding tethered interleukin-12 (il12) polypeptides and uses thereof
JP6879111B2 (ja) 2017-08-02 2021-06-02 トヨタ自動車株式会社 組換え酵母及びこれを用いたエタノールの製造方法
KR102038364B1 (ko) 2018-03-15 2019-10-30 전남대학교 산학협력단 소 로타바이러스 감염증 예방용 약독화 혼합생백신 조성물
WO2021140524A1 (en) 2020-01-08 2021-07-15 Bharat Biotech International Limited Viral vaccine compositions and methods of preparations thereof
CN111265660B (zh) * 2020-01-19 2022-11-15 青岛明勤生物科技有限公司 一种通用型疫苗免疫增强剂
CN114316009B (zh) * 2020-09-29 2023-04-25 上海交通大学 一种能够结合多种病毒的蛋白及其应用

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5298244A (en) * 1990-10-25 1994-03-29 University Of Saskatchewan Assembled viral particles and their use in a vaccine to rotaviral disease
PT100090A (pt) 1991-02-04 1993-07-30 Univ Saskatchewan Metodo de preparacao de uma composicao capz de libertar um agente biologicamente activo para um alvo, e de encapsulacao do referido agente em esferas da proteina vp6
US6673355B1 (en) 1995-06-14 2004-01-06 Baylor College Of Medicine Rotavirus enterotoxin NSP4 and methods of using same
JP2000139473A (ja) * 1998-11-16 2000-05-23 Hokkaido Green Bio Kenkyusho:Kk ロタウイルス遺伝子を導入した遺伝子組換え植物、この遺伝子組換え植物に由来するロタウイルスのタンパク質及びこのロタウイルスのタンパク質に対する抗体
US20030166139A1 (en) 2001-07-20 2003-09-04 Choi Anthony H. Rotavirus VP6 subunit
US8277819B2 (en) * 2005-06-16 2012-10-02 Children's Hospital Medical Center Norovirus particle for use as an antiviral or vaccine
WO2007009081A2 (en) * 2005-07-07 2007-01-18 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services A hexavalent bovine rotavirus reassortant composition designed for use in developing countries
WO2007081447A2 (en) * 2005-11-22 2007-07-19 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Norovirus and sapovirus antigens
US8481693B2 (en) * 2007-03-14 2013-07-09 Takeda Vaccines (Montana), Inc. Virus like particle purification
KR20100083150A (ko) * 2007-09-18 2010-07-21 리고사이트 파머슈티컬즈 인코퍼레이티드 노로바이러스에 대한 보호면역반응을 제공하는 방법
EP2265639A1 (en) * 2008-04-18 2010-12-29 Unilever N.V. Compositions comprising antibodies or antibody fragments
WO2010006326A2 (en) * 2008-07-11 2010-01-14 Tufts University Methods and compositions for spore-based vaccines
CN107043408B (zh) 2009-06-09 2021-02-09 儿童医院医疗中心 抗原-诺罗病毒p-结构域单体和二聚体，抗原-诺罗病毒p-粒子分子，及其制备和应用方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2814175C (en) 2019-11-05
JP2013540773A (ja) 2013-11-07
US8895015B2 (en) 2014-11-25
TWI479022B (zh) 2015-04-01
KR20140030100A (ko) 2014-03-11
AU2011315405B2 (en) 2016-09-22
EP2627353A1 (en) 2013-08-21
EP2627353B1 (en) 2017-11-29
CA2814175A1 (en) 2012-04-19
CN103260645B (zh) 2016-03-16
JP5902181B2 (ja) 2016-04-13
KR101847472B1 (ko) 2018-04-11
AU2011315405A1 (en) 2013-05-23
CN103260645A (zh) 2013-08-21
RU2013121815A (ru) 2014-11-20
SG189398A1 (en) 2013-05-31
TW201217530A (en) 2012-05-01
MX352478B (es) 2017-11-27
US20120093884A1 (en) 2012-04-19
WO2012049366A1 (en) 2012-04-19
FI20106067A0 (fi) 2010-10-15
BR112013009164A2 (pt) 2019-09-24
MX2013004159A (es) 2013-11-04
EP2627353A4 (en) 2014-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI122520B (fi) Noroviruksen kapsidi ja rotaviruksen VP6-proteiini käytettäväksi yhdistelmärokotteena
RU2744193C2 (ru) Иммуногенные композиции для иммунизации свиней против цирковируса типа 3 и способы их получения и применения
Li et al. Virus-like particles for enterovirus 71 produced from Saccharomyces cerevisiae potently elicits protective immune responses in mice
Perrin et al. Recombinant capripoxviruses expressing proteins of bluetongue virus: evaluation of immune responses and protection in small ruminants
AU2020277165B2 (en) Feline calicivirus vaccine
Zhang et al. High-yield production of recombinant virus-like particles of enterovirus 71 in Pichia pastoris and their protective efficacy against oral viral challenge in mice
Xu et al. Superior protection conferred by inactivated whole virus vaccine over subunit and DNA vaccines against salmonid alphavirus infection in Atlantic salmon (Salmo salar L.)
EP1925318A1 (en) Recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA)-based vaccine for the avian flu
TW201920663A (zh) 免疫原性屈公病毒
CA2673355A1 (en) Antigenicity of infectious pancreatic necrosis virus vp2 sub-viral particles expressed in yeast
CA2948181A1 (en) Virus like vesicles (vlvs) based vaccines to prevent or treat chronic hepatitis b virus (hbv) infection
Crisci et al. Chimeric calicivirus-like particles elicit protective anti-viral cytotoxic responses without adjuvant
Farnós et al. High-level expression and immunogenic properties of the recombinant rabbit hemorrhagic disease virus VP60 capsid protein obtained in Pichia pastoris
JP2008528504A (ja) ネコカリシウイルスに対する改良ワクチン
CN108431214B (zh) 人轮状病毒g9p[6]毒株和作为疫苗的用途
EP3583948A1 (en) Vaccines for the prevention of rabbit haemorrhagic disease
Farnós et al. Biochemical and structural characterization of RHDV capsid protein variants produced in Pichia pastoris: advantages for immunization strategies and vaccine implementation
WO2013030608A1 (en) Nanoparticle-based veterinary vaccine
RU2803427C1 (ru) Иммуногенные композиции для иммунизации свиней против цирковируса типа 3 и способы их получения и применения
WO2022076977A1 (en) Fusion protein comprising circoviridae capsid protein, and chimeric virus-like particles composed thereof
Pourasgari et al. Intranasal immunization of mice with VP2 DNA of human rotavirus a induces cellular and humoral immunity
Khaled Calicivirus antigen engineering for possible vaccine development

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 122520

Country of ref document: FI

Kind code of ref document: B