KR20100083150A

KR20100083150A - 노로바이러스에 대한 보호면역반응을 제공하는 방법

Info

Publication number: KR20100083150A
Application number: KR1020107008312A
Authority: KR
Inventors: 찰스 리차드슨; 토마스 에스 베드빅; 토마스 알 포버트
Original assignee: 리고사이트 파머슈티컬즈 인코퍼레이티드
Priority date: 2007-09-18
Filing date: 2008-09-18
Publication date: 2010-07-21
Also published as: JP2014141528A; AU2008302276B2; KR20150129042A; US11040097B2; JP2019163328A; CN101918028B; US20110182975A1; US20190381164A1; JP2016196502A; WO2009039229A3; SG184733A1; SG10201601660YA; CA2698397A1; JP6296885B2; US20240316175A1; CA2698397C; JP2010539192A; CN101918028A; WO2009039229A2; EP2190471A2

Abstract

본 발명은 백신 분야, 특히 노로바이러스에 대한 백신 분야이다. 또한, 본 발명은 백신 조성물의 제조 방법 및 보호면역반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.

Description

노로바이러스에 대한 보호면역반응을 제공하는 방법{Method of Conferring a Protective Immune Response to Norovirus}

노로바이러스는 비박테리아성 위장염의 유행성 발생의 한 중요한 원인으로 출현한 배양할 수 없는 인간 칼리시바이러스이다(Glass et al, 2000; Hardy et at, 1999). 노로바이러스의 임상적 중요성은 민감한 분자 진단법의 개발 이전에는 저평가되었다. 유전자형 유전자군 I 놀워크 바이러스(NV) 게놈의 복제 및 재조합 바큘로바이러스 발현 시스템으로부터 바이러스-유사 입자들(VLPs)의 생산은 널리 퍼진 노로바이러스 감염을 밝혀낸 분석법의 개발을 유도하였다(Jiang et al 1990; 1992)노로바이러스는 절단되지 않은 RNA 게놈을 함유하는 단일가닥의 양성 센스 RNA 바이러스이다. 바이러스 게놈은 3개의 오픈 리딩 프레임을 암호화하고, 이중 후자 둘은 각각 중요한 캡시드 단백질과 중요하지 않은 구조 단백질의 생산을 특징으로 한다(Glass et al 2000). 진핵세포 발현 시스템에서 높은 수준으로 발현될 때, NV의 캡시드 단백질 및 특정 다른 노로바이러스들은 천연 노로바이러스 비리온들과 구조적으로 유사한 VLPs 속에서 자가결합된다. 투과전자현미경으로 관찰할 때, VLPs는 인간 대변 샘플로부터 분리한 감염성 비리온들과 형태적으로 분간할 수 없다.

노로바이러스들에 대한 면역 반응은 복잡하고 보호의 상관관계의 한쪽은 이제 설명되고 있다. 천연 바이러스로 수행된 인간 지원자 연구들은 점막-유도 기억 면역 반응들이 감염으로부터 단기간의 보호를 제공한다는 것을 증명하고 백신-매개 보호가 실현 가능하다는 것을 나타내었다(Lindesmith et al. 2003; Parrino et al.1997; Wyatt et al., 1974))

비록 노로바이러스는, VLPs의 이용가능성과 대량으로 생산되는 이들의 능력 때문에 인비트로 배양될 수 없으나, 노로바이러스 캡시드의 항원 및 구조 정밀사진을 뚜렷이 보이게 하는데 상당한 진전이 이루어졌다. VLPs는 감염성 유전자 물질이 없으면서 바이러스 캡시드 단백질의 확실한 증거를 보유한다. 결과적으로, VLPs는 바이러스의 세포 수용체와의 기능적 상호작용을 모방하여, 감염을 재생하거나 일으키는 능력이 없으면서 적절한 숙주 면역반응을 유도한다. NIH와 공동으로, 베일러 의대는 학문적, 투자자-지원 I 단계 임상 시험에서 인간 지원자들에서 NV VLPs에 대한 체액, 점막 및 세포 면역 반응들을 연구하였다. 경구 투여된 VLPs는 건강한 어른들에서 안전하고 면역원성이 있다(Ball et al. 1999; Tacket et al. 2003). 다른 연구 센터에서, 동물 모델에서의 임상전 실험들은 박테리아 엑소토신 항원보강제로 비강으로 투여될 때 VLPs에 대한 면역반응의 증가를 증명하였다(Guerrero et al. 2001; Nicollier-Jamot et al. 2004; Periwal et al. 2003; Souza et al.(2007) Vaccine, doi:10.1016/j.vaccine.2007.09.040). 그러나, 연구들은 임의의 노로바이러스 백신을 사용하여 노로바이러스에 대한 보호면역반응을 얻을 수 있다는 것을 보고하지 못했다.

본 발명은 적어도 하나의 노로바이러스 항원을 포함하는 백신을 투여하는 단계를 포함하여, 피험자, 특히 인간 피험자에서 노로바이러스 감염에 대한 보호면역성을 유도하는 방법들을 제공한다. 한 실시예에서, 항원은 노로바이러스 바이러스 유사 입자(VLP)이다. 본 발명의 방법들에서 사용된 백신들은 하나 이상의 항원보강제를 더 포함한다. 노로바이러스 VLPs는 유전자군 I 또는 유전자군 II 바이러스 또는 이의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 한 실시예에서, 백신은 약 0.1중량% 내지 약 80중량%의 농도로 VLPs를 포함한다. 다른 실시예에서, 백신은 복용 당 약 1㎍ 내지 약 100mg의 노로바이러스 VLPs의 복용량을 포함한다.

일부 실시예들에서, 백신은 전달 물질을 더 포함하고, 이 전달 물질은 저장소 효과를 제공함으로써 항원 흡수를 향상시키는 역할을 하고, 전달 부위에서 항원 잔류 시간을 증가시키고 또는 전달 부위에서 세포 밀착 결합의 완화를 통해 면역 반응을 향상시킨다. 전달 물질은 생체접착제일 수 있는데, 바람직하게는 더마탄 셀페이트, 콘드로이틴, 펙틴, 뮤신, 알지네이트, 폴리(아크릴산)의 가교 유도체, 폴리바이닐 알콜, 폴리바이닐 파이롤리돈, 폴리사카라이드, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 렉틴, 섬모 단백질 및 카복시메틸셀룰로오스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 점막접착제일 수 있다. 바람직하게는, 점막접착제는 폴리사카라이드이다. 더욱 바람직하게는, 점막접착제는 키토산 또는 키토산 염 또는 키토산 염기와 같은 키토산을 함유하는 혼합물이다.

다른 실시예에서, 백신은 항원보강제를 포함한다. 항원보강제는 톨-라이크 리셉터(TLR) 효현제, 모노포스포릴 지질 A(MPL^®), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, 알루미늄 염, 사이토카인, 사포닌, 무라밀 다이펩타이드(MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람-음성 박테리아의 리포폴리사카라이드(LPS), 폴리포스파젠, 에멀젼, 비로솜, 코크리트, 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLG) 미세입자, 폴록사머 입자, 미세입자, 박테리아 내독소와 같은 내독소 및 리포솜으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 항원보강제는 톨-라이크 리셉터(TLR) 효현제이다. 더욱 바람직하게는, 항원보강제는 MPL^®이다.

본 발명의 방법들은 액체 제제 또는 건조 분말로 제제화된 노로바이러스 백신을 투여하는 단계를 포함한다. 건조 분말 제제는 지름 약 10 내지 약 500 마이크로미터의 평균 입자 크기를 가질 수 있다. 백신을 투여하기 위한 적절한 경로는 점막, 근육내, 정맥, 피하(subcutaneous), 피내, 피하(subdermal) 또는 경피를 포함한다. 특히, 투여 경로는 근육내 또는 점막일 수 있고, 점막 투여의 바람직한 경로는 비강, 경구 또는 질 투여 경로를 포함한다. 다른 실시예에서, 백신은 코 스프레이, 비액, 또는 건조 분말로 제제화되며, 백신은 비강에 밀접하게 고정되거나 삽입된 백신을 함유하는 장치로부터 비강 내에서 빠른 침적에 의해 투여된다. 다른 실시예에서, 백신은 하나 또는 두 콧구멍으로 투여된다.

본 발명은 피험자에서 노로바이러스 감염에 대한 보호 면역반응을 유도하는 방법들에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 노로바이러스 VLPs 및 적어도 하나의 항원보강제를 포함하는 조성물을 인간에게 투여하는 방법들을 제공하며, 백신은 노로바이러스 감염의 적어도 하나의 증상으로부터 보호한다. 부가적으로 또는 선택적으로, 백신은 적어도 하나의 전달 물질을 더 포함할 수 있다.

노로바이러스 항원

본 발명은 하나 이상의 노로바이러스 항원을 포함하는 조성물을 제공한다. "노로바이러스"는 칼리시바이러스과의 노로바이러스속의 일원을 의미한다. 일부 실시예에서, 노로바이러스는 인간 또는 비인간 포유류 종들에 감염성인 관련된, 양성-센스 단일-가닥 RNA, 외피가 없는 바이러스의 그룹을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 노로바이러스는 인간에게 급성 위장염을 일으킬 수 있다. 또한 노로바이러스는 전자현미경으로 관찰할 때 경계가 정해진 구조 또는 가장자리를 가진 소형 원형 구조 바이러스(SRSVs)로 부를 수 있다. 노로바이러스 내에 포함되는 것은 핵산 및 아미노산 서열로 정의된 적어도 4개 유전자군이고, 15개 유전자 집단을 포함한다. 주요 유전자군은 GI 및 GII이다. GIII 및 GIV이 제안되었으나 일반적으로 허용된다. GIII의 대표적인 것은 소, 제나 균주(Jena strain)이다. GIV는 하나의 바이러스, 알파트론을 함유한다. 노로바이러스의 추가 설명을 위해서는 Vinje et al. J. Clin. Micro. 41:1423-1433 (2003) 참조. "노로바이러스"는 재조합 노로바이러스 바이러스-유사 입자들(rNOR VLPs)을 의미한다. 일부 실시예들에서, 예를 들어, Sf9 세포들에서 바큘로바이러스 벡터로부터, 세포들의 ORF2에 의해 암호화된 노로바이러스 캡시드 단백질의 재조합 발현은 캡시드 단백질의 VLPs 속으로의 자발적인 자가결합을 유도할 수 있다. 일부 실시예들에서, 예를 들어, Sf9 세포들에서 바큘로바이러스 벡터로부터, ORF1 및 ORF2에 의해 암호화된 적어도 하나의 노로바이러스 단백질들의 재조합 발현은 캡시드 단백질의 VLPs 속으로의 자발적인 자가결합을 유도할 수 있다. VLPs는 노로바이러스와 구조적으로 유사하나 바이러스 RNA 게놈이 없어서 감염성이 없다. 따라서, "노로바이러스"는 결핍 입자들을 포함하는 감염성 또는 비감염성 입자들일 수 있는 비리온을 포함한다.

노로바이러스의 비제한적인 예들은 놀워크 바이러스(NV, GenBank M87661, NP₀₅₆₈₂₁), 사우스앰톤 바이러스(SHV, GenBank L07418), 사막방패바이러스(DSV, U04469), 헤세 바이러스(HSV), 치바 바이러스(CHV, GenBank AB042808), 하와이 바이이러스(HV, GenBank U07611), 설산 바이러스(SMV, GenBank U70059), 토론토 바이러스(TV, Leite et al, Arch. Virol. 141 :865-875), 브리스톨 바이러스(BV), 제나 바이러스(JV, AJ01099), 메릴랜드 바이러스(MV, AY032605), 세토 바이러스(SV, GenBank AB031013), 켑버웰 바이러스(CV, AF145896), 로드스달 바이러스(LV, GenBank X86557), 그림스비 바이러스(GrV, AJ004864), 멕시코 바이러스(MXV, GenBank U22498), 박서(AF538679), C59(AF435807), VA115(AY038598), BUDS (AY660568), 휴스턴 바이러스(HoV), MOH(AF397156), 패리스 아일랜드(PiV; AY652979), VA387(AY038600), VA207(AY038599), 및 오퍼레이션 이라키 프리덤(OIF, AY675554)을 포함한다. 핵산 및 이의 상응하는 아미노산 서열은 전체가 참조로 포함된다. 일부 실시예들에서, 암호문이 동정 목적을 위해 사용될 수 있고 구성된다: 바이러스가 분리된 숙주 종들/속 약어/종 약어/균주 이름/발생 연도/기원 국가((Green et al., Human Caliciviruses, in Fields Virology Vol. 1 841- 874 (Knipe and Howley, editors-in-chief, 4th ed., Lippincott Williams & Wilkins 2001)). 놀워크 바이러스, 설산 바이러스 및 휴스톤 바이러스가 일부 실시예에서 바람직하다.

노로바이러스 항원은 펩타이드, 단백질 또는 바이러스-유사 입자들(VLPs)의 형태일 수 있다. 한 바람직한 실시예에서, 노로바이러스 항원은 VLPs를 포함한다. 본 발명에서 사용된 대로, "바이러스-유사 입자(들) 또는 VLPs"는 바이러스-유사 입자(들), 단편(들), 응집체 또는 노로바이러스의 서열을 암호화하고 감염성 노로바이러스 입자들의 항원 특성(들)과 유사한 항원 특성(들)을 포함하는 캡시드 단백질로부터 생산된 이의 부분(들)을 의미한다. 노로바이러스 항원들은 캡시드 모노머, 캡시드 멀티머, 단백질 또는 VLPs의 펩타이드 단편 또는 응집체 또는 이의 혼합물 형태일 수 있다. 노로바이러스 항원 단백질 또는 펩타이드는 당업계에 공지된 방법들을 사용하여 생산된 변형 형태일 수 있다.

본 발명의 VLPs는 VP1 및/또는 VP2와 같은 전장 노로바이러스 캡시드 단백질 또는 단백질 또는 당업계의 표준 방법을 사용하는 특정 VP1 또는 VP2 유도체로 형성될 수 있다. 선택적으로, VLP를 형성하는데 사용된 캡시드 단백질은 절단된 캡시드 단백질이다. 일부 실시예들에서, 예를 들어, VLPs의 적어도 하나는 절단된 VP1 단백질을 포함한다. 다른 실시예들에서, 모든 VLPs는 절단된 VP1 캡시드를 포함한다. 절단은 N-또는 C-말단 절단일 수 있다. 절단된 캡시드 단백질들은 적절한 기능성 캡시드 단백질 유도체들이다. 기능성 캡시드 단백질 유도체들은 면역반응이 전장 캡시드 단백질로 이루어진 VLP에 의해 일어나는 것과 동일한 방식으로 면역반응(필요한 경우, 적절하게 도움이 될 때)을 일으킬 수 있다.

VLPs는 중요한 VP1 단백질 및/또는 중요하지 않은 VP2 단백질을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 각 VLP는 단가 VLP를 생산하는 단지 하나의 노로바이러스 유전자군으로부터의 VP1 및/또는 VP2 단백질을 함유한다. 본 발명에서 사용된 대로, "단가"라는 용어는 항원 단백질들이 단일 노로바이러스 유전자군으로부터 유도된다는 것을 의미한다. 예를 들어, VLPs는 유전자군 I(예를 들어, 놀워크 바이러스로부터의 VP1 및 VP2)의 바이러스 균주로부터의 VP1 및/또는 VP2를 함유한다. 바람직하게는, VLP는 주로 VP1 단백질로 구성된다. 본 발명의 한 실시예에서, 항원은 1가 VLPs의 혼합물이고 여기서 조성물은 여러 바이러스 균주(예를 들어, 놀워크 바이러스 및 휴스톤 바이러스)로부터 얻은 다른 노로바이러스 유전자군으로부터의 VP1 및/또는 VP2로 구성된 VLPs와 혼합된 단일 노로바이러스 유전자군으로부터의 VP1 및 VP2로 구성된 VLPs를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 노로바이러스 유전자군 II의 하나 이상의 균주로부터의 단가 VLPs와 함께 노로바이러스 유전자군 I의 하나 이상의 균주로부터의 단가 VLPs를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 노로바이러스 VLP 혼합물은 놀워크 및 휴스톤 노로바이러스의 균주들로 구성된다.

그러나, 본 발명의 다른 실시예에서, VLPs는, 예를 들어, 제 2 노로바이러스 유전자군으로부터의 VP1 및/또는 VP2와 상호혼합된 하나의 노로바이러스 유전자군으로부터의 VP1 및/또는 VP2 단백질을 포함하는 다가 VLPs일 수 있고, 여기서 다른 VP1 및 VP2 단백질은 키메릭 VP1 및 VP2 단백질이 아니나, 동일한 캡시드 구조 내에 함께 결합되어 면역성 VLPs를 형성한다. 본 발명에서 사용된 대로, "다가"라는 용어는 항원 단백질들이 노로바이러스 둘 이상의 유전자군으로부터 유도된다는 것을 의미한다. 다가 VLPs는 둘 이상의 바이러스 균주로부터 얻은 VLP 항원을 함유할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 노로바이러스 유전자군 II(예를 들어, 휴스톤 바이러스)의 하나 이상의 균주로부터의 캡시드 모노머 또는 멀티머와 함께 노로바이러스 유전자군 I(예를 들어, 놀워크 바이러스)의 하나 이상의 균주로부터의 캡시드 모노머 또는 멀티머로 구성된 다가 VLPs를 함유할 수 있다. 바람직하게는, 다가 VLPs는 놀워크 및 휴스톤 노로바이러스의 균주들로부터의 캡시드 단백질들을 함유한다.

조성물 내에서 단가 또는 다가 VLPs의 조합은 각각의 VLP 형태의 면역원성을 차단하지 않은 것이 바람직하다. 특히 본 발명의 조합에서 노로바이러스 VLPs 사이에 간섭이 없는 것이 바람직하며, 본 발명의 결합된 VLP 조성물은 백신에서 나타낸 각 노로바이러스 유전자형에 의해 감염에 대해 면역성을 유발할 수 있다. 적합하게는 조합에서 소정의 VLP 형태에 대한 면역 반응은 개별적으로 측정될 때 동일한 VLP 형태의 면역 반응의 적어도 50%, 바람직하게는 100% 또는 실질적으로 100%이다. 면역 반응은 실시예들에서 기술된 대로 항체 반응에 의해 적절하게 측정될 수 있다.

다가 VLPs는 개별 캡시드 단백질의 개별 발현에 의해 생산될 수 있고 조합에 의해 VLPs를 형성한다. 선택적으로 다가 캡시드 단백질들은 하나 이상의 DNA 구조물로부터 동일한 세포 내에 발현될 수 있다. 예를 들어, 다가 DNA 구조물들은 숙주 세포들 속으로 트랜스폼 또는 트랜스펙트될 수 있고, 각 벡터는 다른 캡시드 단백질을 암호화한다. 선택적으로 공유된 프로모터 또는 다가 개별 프로모터에 의해 제어될 수 있는 다가 캡시드 유전자를 가진 단일 벡터가 사용될 수 있다. 적절한 경우, IRES 요소들은 벡터 속에 혼합될 수 있다. 이런 발현 전략들을 사용하여, 공동 발현된 캡시드 단백질들은 뒤이은 VLP 형성을 위해 공동 정제될 수 있거나 자연적으로 다가 VLPs를 형성할 수 있고 이후 정제될 수 있다.

다가 VLP 생산을 위한 바람직한 방법은 다른 노로바이러스 유전자형으로부터 VLP 캡시드 단백질 또는 VP1 및/또는 VP2 단백질과 같은 유도체를 제조하는 단계, 단백질들을 혼합하는 단계 및 단백질을 결합하여 다가 VLPs를 생산하는 단계를 포함한다. 캡시드 단백질들은 미정제 추출물의 형태일 수 있고, 혼합 이전에 부분적으로 정제되거나 정제될 수 있다. 다른 유전자군의 결합된 단가 VLPs는 분해될 수 있고, 함께 혼합되어 다가 VLPs 속에 재결합될 수 있다. 바람직하게는, 단백질 또는 VLPs는 결합하기 전에 적어도 부분적으로 정제된다. 선택적으로, 다가 VLPs의 추가 정제는 결합 후 수행될 수 있다.

적합하게는 본 발명의 VLPs는 VLPs의 분해 및 재결합에 의해 제조되어, 균질 및 순수 VLPs를 제공한다. 한 실시예에서 다가 VLPs는 둘 이상의 VLPs의 분해, 뒤이어 재결합하기 이전에 임의의 적절한 시점에서 분해된 VLP의 조합에 의해 제조될 수 있다. 이런 방법은, 예를 들어, 일부 효모 균주에서 발생하는 것과 같이, VLPs가 발현된 VP1 단백질로부터 자연적으로 형성될 때 적합하다. VP1 단백질의 발현이 자연적인 VLP 형성으로 유도되지 않는 경우, VP1 단백질 또는 캡소머의 제제들은 VLPs 속에 모이기 전에 결합될 수 있다.

다가 VLPs가 사용되는 경우, 바람직하게는 VLPs의 성분들은 이들이 최종 혼합된 VLP에 있는 것이 바람직한 비율로 혼합된다. 예를 들어, 놀워크 및 휴스톤 바이러스(또는 다른 노로바이러스 균주)로부터의 부분적으로 정제된 VP1 단백질의 동일한 양의 혼합물은 다가 VLP에 대략 동일한 양의 각 단백질을 제공한다.

다가 VLPs를 포함하는 조성물들은 본 발명에 참조로 포함된 WO 98/44944, WO0045841의 용액들과 같이 당업계에 공지된 용액들에 의해 안정화될 수 있다.

본 발명의 조성물들은 VP1 및 VP2 단백질 또는 유도체 이외에 다른 단백질 또는 단백질 단편을 포함할 수 있다. 다른 단백질 또는 펩타이드는 본 발명의 조성물과 공동 투여될 수 있다. 선택적으로 조성물은 비-노로바이러스 항원으로 제제화될 수 있거나 공동 투여될 수 있다. 이런 항원들은 다른 질환들에 대한 보호를 제공하는 것이 적절하다.

VP1 단백질 또는 기능성 단백질 유도체는 VLP를 형성할 수 있고, VLP 형성은 전자현미경 및 동적 레이저광 산란과 같은 표준 기술들로 분석될 수 있다.

항원 제조

본 발명의 항원 분자들은 유기체들로부터의 분리 및 정제에 의해 제조되며 여기서 항원 분자들은 자연적으로 발생하거나 재조합 기술들에 의해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 비록 대장균 또는 S. cerevisiae , S. pombe , Pichia pastori와 같은 효모 세포들 또는 다른 피키아 발현 시스템, CHO 또는 HEK 시스템과 같은 포유류 세포 발현과 같은 임의의 적절한 세포들이 사용될 수 있지만, 노로바이러스 VLP 항원들은 Sf9 또는 H5 세포들과 같은 곤충 세포들로 제조된다. 재조합 방법 또는 합성에 의해 제조될 때, 펩타이드를 구성하는 아미노산의 하나 이상의 삽입, 결실, 역위 또는 치환이 이루어질 수 있다. 상기 항원들의 각각은 실질적으로 순수한 상태로 사용되는 것이 바람직하다.

곤충 세포 배양액에 노로바이러스 VLPs의 생산 방법은 전문이 참조로 포함된 미국특허 제 6,942,865호에 이미 개시되어 있다. 간단히, 바이러스 캡시드 유전자(OFR2) 및 중요하지 않은 구조 유전자(ORF3)를 함유하는 게놈의 3' 말단으로부터의 cDNA가 복제되었다. 바이러스 캡시드 유전자들을 운반하는 재조합 바큘로바이러스들은 복제된 cDNAs로부터 제조되었다. 노로바이러스 VLPs는 Sf9 또는 H5 곤충 세포 배양액에서 생산되었다.

항원보강제

본 발명은 노로바이러스 항원과 사용하기 위한 항원보강제를 포함하는 조성물을 제공한다. 대부분의 항원보강제는 빠른 이화작용으로부터 항원을 보호하도록 설계된 물질, 예를 들어, 수산화알루미늄 또는 미네랄 오일 및 단백질로부터 유도된 백일해(Bordatella pertussis) 또는 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)과 같은 면역반응의 자극제를 함유한다. 적절한 항원보강제들은 구입할 수 있고, 예를 들어, 프레운드 불완전 항원보강제 및 완전 항원보강제(Pifco Laboratories, Detroit, Mich.); 머크 항원보강제 65(Merck and Company, Inc., Rahway, NJ.); 수산화알루미늄 겔(알룸)과 같은 알루미늄 염 또는 인산알루미늄; 칼슘, 철 또는 아연염; 아실화 티로신의 불용성 현탁액; 아실화 당; 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도된 폴리사카라이드; 폴리포스파젠; 생분해성 미세구; 및 퀼 A이다.

또한 적절한 항원보강제는 톨-라이크 리셉터(TLR) 효현제, 모노포스포릴 지질 A(MPL), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, 알루미늄 염, 사이토카인, 사포닌, 무라밀 다이펩타이드(MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람-음성 박테리아의 리포폴리사카라이드(LPS), 폴리포스파젠, 에멀젼, 비로솜, 코크리트, 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLG) 미세입자, 폴록사머 입자, 미세입자, 박테리아 내독소와 같은 내독소 및 리포솜을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 항원보강제는 박테리아로 유도되지 않은 엑소톡신이다. 바람직한 항원보강제는 3DMPL 또는 QS21과 같은 Th1 형태 반응을 자극하는 것들이다.

살모넬라로부터의 지질 A의 비독성 유도체인 모노포스포릴 지질 A(MPL)는 백신 항원보강제로 개발된 강력한 TLR-4 효현제이다(Evans et al. 2003). 임상전 설치류 연구에서, 비강 MPL은 전신, 체액 반응뿐만 아니라 분비 반응을 향상시키는 것으로 나타났다(Baldridge et al. 2000; Yang et al. 2002). 120,000 이상의 환자들의 임상 연구에서 백신 항원보강제로서 안정하고 효과적인 것으로 증명되었다(Baldrick et al, 2002; 2004). MPL은 TLR-4 수용체를 통해 선천성 면역성의 유도를 자극하고 따라서 그람 음성 및 그람 양성 박테리아, 바이러스, 및 기생충을 포함하는 매우 넓은 범위의 감염성 병원균에 대해 비특이적 면역 반응을 일으킬 수 있다(Baldrick et al. 2004; Persing et al. 2002). 비강 제제에 MPL을 포함하면 선천성 반응을 빠르게 유도하여, 바이러스 공격으로부터 비특이적 면역반응을 유발하는 반면 백신의 항원 성분들에 의해 발생한 특이적 반응을 향상시킨다.

따라서, 한 실시예에서, 본 발명은 후천성 및 선천성 면역성의 인핸서로서 모노포스포릴 지질(MPL^®) 또는 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL^®)를 포함하는 조성물을 제공한다. 화학적으로 3D-MPL^®은 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A와 4, 5 또는 6개 아실화 사슬의 혼합물이다. 3 De-O-아실화 모노포스포릴 지질 A의 바람직한 형태는 유럽특허 0 689 454 B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)에 개시되며, 참조로 본 발명에 포함된다. 다른 실시예에서, 본 발명은 BioMira's PET 지질 A 또는 TLR-4 효현제와 같이 작용하도록 설계된 합성 유도체와 같은 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체를 포함하는 조성물을 제공한다.

"유효량의 항원보강제"는 당업자가 잘 이해할 것이고, 투여된 항원에 대한 면역 반응을 자극할 수 있는 하나 이상의 항원보강제의 양, 즉, 비강 세척에서 IgA 수준, 혈청 IgG 또는 IgM 수준 또는 B 및 T-세포 증식의 면에서 측정된 대로, 투여된 항원 조성물의 면역 반응을 증가시키는 양을 포함한다. 면역글로불린 수준의 적절하게 효과적인 증가는 임의의 항원보강제 없는 동일한 항원 조성물과 비교해서 5%이상, 바람직하게는 25%이상 및 특히 50%이상을 포함한다.

전달 물질

또한 본 발명은 항원 흡수를 향상시키고, 저장소 효과를 제공하거나 전달 부위에서 항원 잔류 시간을 증가시키는 전달 물질을 포함하는 조성물을 제공한다. 이런 전달 물질은 생체접착성 물질일 수 있다. 특히, 생체접착제는 키토산, 키토산 염 또는 키토산 염기(예를 들어, 키토산 글루타메이트)와 같은 점막접착제이다.

갑각류의 껍질에 있는 키틴으로부터 유도된 양전하 직선형 폴리사카라이드인 키토산은 상피 세포들 및 이들의 덮개 점막층에 대한 생체접착제이다. 키토산에 의한 항원 제제는 비강 점막과의 접촉 시간을 증가시켜, 저장소 효과에 의해 흡수를 증가시킨다(Ilium et al. 2001; 2003; Davis et al. 1999; Bacon et al. 2000; van der Lubben et al. 2001; 2001; Lim et al. 2001). 키토산은 동물 모델과 인간에서 독감, 백일해 및 디프테리아를 포함하는 여러 백신들에 대한 비강 전달 시스템으로 검사하였다(Ilium et al. 2001; 2003; Bacon et al. 2000; Jabbal-Gill et al. 1998; Mills et al. 2003; McNeela et al. 2004). 이런 검사들에서, 키토산은 비경구 백신접종과 동일한 수준으로 전신 면역반응을 향상시키는 것으로 나타났다. 또한, 현저한 항원-특이적 IgA 수준이 점막 분비액에서 측정되었다. 따라서, 키토산은 비강 백신 효과를 크게 향상시킬 수 있다. 또한, 이의 물리적 특성들 때문에, 키토산은 분말로 제제화된 비강 백신으로 특히 적합하다(van der Lubben et al. 2001; Mikszta et al. 2005 ; Huang et al. 2004).

따라서, 한 실시예에서, 본 발명은 비강 투여에 적합한 항원 또는 백신 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 항원 및 선택적으로 유효량의 항원보강제를 포함한다. 바람직한 실시예들에서, 본 발명은 키토산과 같은 적어도 하나의 전달 물질 및 MPL^®, CPGs, 이미퀴모드(imiquimod), 가디퀴모드(gardiquimod), 또는 합성 지질 A 또는 지질 A 모방체 또는 유사체와 같은 적어도 하나의 항원보강제와 함께 노로바이러스 VLP와 같은 노로바이러스 항원을 포함하는 항원 또는 백신 조성물을 제공한다.

키토산의 분자량은 10kDa 내지 800kDa, 바람직하게는 100kDa 내지 700kDa 및 더욱 바람직하게는 200kDa 내지 600kDa이다. 조성물에서 키토산의 농도는 통상적으로 약 80%(w/w)까지, 예를 들어, 5%, 10%, 30%, 50%, 70% 또는 80%일 것이다. 키토산은 적어도 75% 탈아세틸화, 예를 들어, 80-90%, 더욱 바람직하게는 82-88% 탈아세틸화, 특히 83%, 84%, 85%, 86% 및 87% 탈아세틸화된 것이다.

백신 및 항원 제제

본 발명의 조성물들은 백신 또는 항원 제제로서 투여하기 위해 제제화될 수 있다. 본 발명에서 사용된 "백신"이란 용어는 상기한 대로 본 발명의 노로바이러스 VLPs 또는 다른 노로바이러스 항원을 함유하는 제제를 의미하고, 척추동물에게 투여될 수 있는 형태이고 감염을 완화 및/또는 VLPs 또는 감염의 적어도 하나의 증상을 감소 및/또는 항원의 다른 복용량의 효과를 향상시키기에 충분한 면역 반응을 유도하기 위해 치료 면역성을 유도하기에 충분한 면역반응을 유도한다. 본 발명에서 사용된 "항원 제제" 또는 "항원 조성물"이란 용어는 척추동물, 예를 들어, 포유류에게 투여될 때, 면역반응을 유도할 제제를 의미한다. 본 발명에서 사용된 "면역반응"이란 용어는 체액 면역반응 및 세포-매개 면역반응 모두를 의미한다. 체액 면역반응은, 예를 들어, 감염성 물질을 중성화하고, 감염성 물질이 세포에 들어가는 것을 막고, 상기 감염성 물질의 복제를 막고 및/또는 숙주 세포가 감염되고 파괴되는 것을 보호하는 B 림프구에 의한 항체들의 생산의 자극을 포함한다. 세포-매개 면역반응은 감염을 예방하거나 완화하거나 이의 적어도 하나의 증상을 완화시키는 척추동물(예를 들어, 인간)에 의해 나타나는 감염성 물질에 대한 T-림프구 및/또는 매크로파아지와 같은 다른 세포에 의해 매개되는 면역반응을 의미한다. 특히, "보호 면역성" 또는 "보호면역반응"은 감염을 예방 또는 완화하거나 감염의 적어도 하나의 증상을 완화시키는 척추동물(예를 들어, 인간)에 의해 나타나는 감염 물질에 대한 면역성 또는 면역반응을 유도하는 것을 의미한다. 구체적으로, 백신의 투여에 의한 보호면역반응의 유도는 위장염의 하나 이상의 증상의 존재를 제거 또는 완화 또는 이런 증상들의 지속 또는 심각성의 완화에 의해 명백하다. 노로바이러스에 의한 위장염의 임상적 증상들은 구역질, 설사, 묽은 변, 구토, 열 및 전신권태를 포함한다. 질환 증상들을 완화 또는 제거하는 보호면역반응은 사람들에서 노로바이러스 발생의 속도를 줄이거나 멈추게 할 것이다. 백신 제제는 일반적으로 백신 설계에서 개시된다(("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York). 본 발명의 조성물은, 예를 들어, 경구, 위장관 및 호흡기(예를 들어, 코) 점막의 하나 이상에 전달하기 위해 제제화될 수 있다.

조성물이 호흡기(예를 들어, 코) 점막에 전달하기 위한 것인 경우, 통상적으로 에어로졸 또는 비액과 같은 투여용 수용액 또는 선택적으로, 비강 내에서 빠른 침적을 위한 건조 분말로 제제화된다.

비액으로 투여하기 위한 조성물은 방부제, 점도 조절제, 긴장 조절제, 완충제 등과 같이 이런 조성물에 주로 포함되는 형태의 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 점도 조절제는 미세결정 셀룰로오스, 키토산, 전분, 폴리사카라이드 등일 수 있다. 건조 분말로 투여하기 위한 조성물은 점막 접착제, 증량제 및 적절한 분말 흐름 및 크기 특성을 전달하기 위한 물질과 같이 이런 조성물에 주로 포함되는 하나 이상의 부형제를 함유할 수 있다. 증량제 및 분말 흐름 및 크기 물질은 만니톨, 수크로오스, 트레할로스 및 자일리톨을 함유할 수 있다.

한 실시예에서, 본 발명의 노로바이러스 백신 또는 항원 제제는 면역원으로 하나 이상의 노로바이러스 유전자군 항원(들), MPL^®과 같은 항원보강제, 점막표면에 대한 접착력을 향상시키는 키토산과 같은 생고분자 및 만니톨과 수크로오스와 같은 증량제를 포함한다. 예를 들어, 노로바이러스 백신은 하나 이상의 노로바이러스 유전자군 항원(들)(예를 들어, 놀워크 바이러스, 휴스톤 바이러스, 설산 바이러스), MPL^®항원보강제, 키토산 점막접착제 및 적절한 흐름 특성을 제공하는 증량제로서 만니톨과 수크로오스를 함유하는 10mg의 건조 분말로서 제제화될 수 있다. 상기 제제는 약 7.0mg(25 내지 90% w/w 범위) 키토산, 약 1.5mg 만니톨(0 내지 50% w/w 범위), 약 1.5mg 수크로오스(0 내지 50% w/w 범위), 약 25㎍ MPL^®(0.1 내지 5% w/w 범위), 및 약 100㎍ 노로바이러스 항원(0.05 내지 5% w/w 범위)을 포함할 수 있다.

노로바이러스 항원은 약 0.01%(w/w) 내지 약 80%(w/w)의 농도로 존재할 수 있다. 한 실시예에서, 노로바이러스 항원은 양쪽 콧구멍 속에 투여하기 위해 10mg 건조 분말 제제 당 약 5㎍, 약 15㎍, 약 25㎍, 약 50㎍, 약 100㎍, 약 200㎍, 약 500㎍ 및 약 1mg(0.05, 0.015, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 5.0 및 10.0% w/w) 또는 한쪽 콧구멍 속에 투여하기 위해 20mg 건조 분말 제제 당 약 10㎍, 약 30㎍, 약 50㎍, 약 100㎍, 약 200㎍, 약 400㎍, 약 1mg 및 약 2mg(0.1, 0.3, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 10.0 및 20.0% w/w)의 복용량으로 제제화될 수 있다. 상기 제제는 각 투여하는 동안 콧구멍 하나 또는 콧구멍 두 개에 제공될 수 있다. 첫 번째 투여 1 내지 12 주 후 면역반응을 향상시키기 위해 추가 투여(booster administration)가 있을 수 있다. 백신과 항원 제제에서 노로바이러스 항원의 함량은 1㎍ 내지 100mg, 바람직하게는 1-1000㎍, 더욱 바람직하게는 5-500㎍, 가장 통상적으로 10-200㎍의 범위일 수 있다. 각 복용시 투여된 전체 노로바이러스 항원은 약 10㎍, 약 30㎍, 약 200㎍, 약 250㎍, 약 400㎍, 약 500㎍ 또는 약 100㎍일 수 있다. 전체 백신 복용량은 한 콧구멍에 투여될 수 있고 두 콧구멍에 투여하기 위해 반으로 나뉠 수 있다. 건조 분말 특성들은 입자들의 10% 미만이 지름이 10㎛ 미만이게 된다. 평균 입자 크기는 지름이 10 내지 500㎛이다.

다른 실시예에서, 항원 및 백신 조성물은 피험자에게 연속적으로 투여하기 위한 액체로 제제화될 수 있다. 비강 투여를 위한 액체 제제는 노로바이러스 유전자군 항원(들), 항원보강제, 및 키토산과 같은 전달 물질을 포함할 수 있다. 근육내(i.m.) 투여용 액체 제제는 전달 물질(예를 들어, 키토산) 없이 노로바이러스 유전자군 항원(들), 항원보강제 및 버퍼를 포함할 수 있다.

바람직하게는 항원 및 백신 조성물은 동결건조되어 사용될 때까지 무수 상태로 저장되며, 액체 제제에서 사용되는 경우 사용시점에 희석제로 재구성된다. 선택적으로, 본 발명의 다른 성분들은 키트 또는 장치(어떤 성분 또는 모든 성분이 동결건조됨)에 개별적으로 저장될 수 있다. 성분들은 건조 제제를 위해 동결건조 형태로 존재하거나 액체 제제를 위해 재구성될 수 있고 사용하기 이전에 혼합되거나 환자에게 개별적으로 투여될 수 있다. 건조 분말 투여의 경우, 백신 또는 항원 제제는 비강 전달 장치 속에 미리 채워 사용시까지 저장될 수 있다. 바람직하게는, 이런 비강 전달 장치는 이의 내용물을 보호하고 안정성을 확보할 것이다.

항원 제제 및 백신의 동결건조는 당업계에 주지되어 있다. 통상적으로 액체 항원은 동결건조되는 동안 항원을 보호하고 원하는 특성들을 가진 분말을 생산하기 위해 물질들의 존재하에서 동결건조된다. 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 락토오스(10-200mg/mL의 초기 농도로 존재)와 같은 당들이 단백질 항원을 냉동 보호 및 동결 보호하고 원하는 특성들을 가진 동결건조 덩어리 또는 분말을 생산하기 위해 통상적으로 사용된다. 동결건조된 조성물은 이론적으로 더 안정하다. 분사 건조 또는 분사 동결 건조와 같은 다른 건조 기술들이 사용될 수 있다. 대부분의 제제화 방법의 목표는 단백질 응집과 분해를 최소화하는 것이지만, 본 발명자들은 응집된 항원들이 존재하면 노로바이러스 VLPs에 대한 면역반응을 향상시키는 것을 증명하였다(실시예 3 및 4의 동물 모델 참조). 따라서, 본 발명자들은 항원의 응집률이 동물 모델들에서 최대 면역 반응을 유도하기 위해 응집된 항원 대 응집되지 않은 항원의 최적 비율을 만드는 동결건조 과정 동안 제어될 수 있는 방법을 개발하였다.

따라서, 본 발명은 (a) 노로바이러스 항원, 수크로오스 및 키토산을 포함하는 선-동결건조 용액을 제조하는 단계, 여기서 수크로오스 대 키토산의 질량비는 약 0:1 내지 약 10:1이다; (b) 용액을 동결하는 단계; 및 (c) 48-72시간 동안 동결된 용액을 동결건조하는 단계를 포함하며, 여기서 최종 동결건조된 생성물은 응집된 형태의 상기 노로바이러스 항원의 비율을 함유한다. 한 실시예에서, 선-동결건조 용액은 증량제를 더 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 증량제는 만니톨이다.

바람직한 비율의 응집을 얻기 위한 수크로오스 및 키토산의 적절한 비율은 다음 안내를 따라 측정될 수 있다. 약 2.5:1 내지 약 10:1의 범위로 수크로오스 대 키토산 선-동결건조 혼합물은 선-동결건조 용액 농도(실시예 13 참조)에 따라 약 95% 이상의 응집되지 않은 노로바이러스 항원(즉, 5% 미만의 응집된 항원; 실시예 13 참조) 후-동결건조의 범위를 나타낼 것이다. 약 1:1 내지 약 2.1:1의 수크로오스 대 키토산의 질량 비율은 약 50% 내지 약 90%의 응집되지 않은 노로바이러스 항원을 생산할 것이다(즉, 약 10% 내지 약 50% 응집된 항원). 0:1 수크로오스 대 키토산의 중량비는 30% 미만의 응집되지 않은 노로바이러스 항원을 생산할 것이다. 수크로오스와 키토산을 생략하면 5% 미만의 응집되지 않은 항원을 생산할 것이다(즉, 95% 이상의 응집된 항원). 이런 지침들을 사용하여, 당업자는 최적의 면역반응을 생산하는데 필요한 응집의 원하는 양을 얻기 위해서 선-동결건조 혼합물에서 수크로오스 대 키토산 중량비를 조절할 수 있다.

또한, 선-동결건조 용액에 수크로오스 및 만니톨을 포함하면 시간에 걸쳐 응집되지 않은 노로바이러스 항원의 안정성을 향상시킨다. 제제에서 응집된 항원/응집되지 않은 항원의 비율은 약 12달 이상의 기간 동안 건조 분말로 저장될 때 증가하지 않는다(실시예 10 참조). 따라서, 이 동결건조 방법은 응집된 노로바이러스 항원 대 응집되지 않은 노로바이러스 항원의 예상가능하고 제어가능한 비율로 안정한 제제를 얻게 한다.

면역반응 자극 방법

각 항원 또는 백신 제제에서 항원의 양은 현저한 부작용 없이 강한 면역반응을 유도하는 양으로 선택된다. 이런 양은 특이적 항원(들)이 사용되고, 투여 경로 및 사용된 항원보강제에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 본 발명의 내용에서 환자에게 투여된 복용량은 시간이 지남에 따라 환자에서 유익한 치료 반응을 일으키거나 항원-특이적 항체들의 생산을 유도하는데 충분해야 한다. 따라서, 조성물은 특이적 항원에 대한 면역반응을 유발 및/또는 질환 또는 감염으로부터의 증상 및/또는 합병증을 예방, 완화, 감소 또는 치료하는데 충분한 양으로 환자에게 투여되어 사람들에게 노로바이러스 발생의 속도를 줄이거나 멈추게 한다. 이것을 이루지는데 적합한 양은 "치료적으로 유효한 복용량"으로 정의된다.

실질적으로 순수한 형태의 노로바이러스 항원의 경우, 각 복용량은 제제에서 각 노로바이러스 항원의 경우 약 1㎍ 내지 10mg, 바람직하게는 약 15-500㎍을 포함할 것이다. 본 발명의 항원 제제를 사용하는 전형적인 면역 방법에서, 제제들은 여러 번(예를 들어 1-4) 투여될 수 있고, 각 복용량은 1-1000㎍의 각 항원을 함유한다. 복용량은 생산된 조성물의 면역 활성 및 환자의 상태뿐만 아니라 치료할 환자의 체중 또는 표면적에 의해 결정될 것이다. 복용량의 크기는 특정 환자에서 특정 조성물의 투여와 동반할 수 있는 부작용들의 존재, 특성 및 정도에 의해 결정될 것이다.

본 발명의 항원 및 백신 제제는 비-점막 또는 점막 경로를 통해 투여될 수 있다. 이런 투여는 비경구 주사(예를 들어, 정맥, 피하 및 근육내) 또는 볼/설하, 직장, 경구, 비강, 국부(경피 및 눈), 질, 폐, 동맥내, 복강, 안구내 또는 비강 경로 또는 특정 조직에 직접과 같은 다른 전통적인 직접 경로를 통한 인비보 투여를 포함한다. 선택적으로, 본 발명의 백신은 경구, 국부, 피하, 점막, 정맥, 근육내, 비강, 설하, 경피, 피하, 피내, 및 좌약과 같은 여러 경로 중 임의의 것에 의해 투여될 수 있다. 투여는 패치, 바늘, 카테테르 또는 관련 장치를 사용하여, 1회 또는 수회 직접 투여함으로써 간단하게 이루어질 수 있다.

한 바람직한 실시예에서, 본 발명의 항원 및 백신 제제들은 점막 표면에 투여된다. 점막 표면을 통한 면역화는 면역화의 다른 경로들을 통해 여러 가능한 장점들을 제공한다. 가장 뚜렷한 이점들은 1) 점막 면역화는 투여를 위해 바늘 또는 숙련자를 필요로 하지 않으며 2) 면역반응이 병원균 침투 부위(들) 뿐만 아니라 전신에서 일어난다(Isaka et al 1999; Kozlowski et al. 1997; Mestecky et al. 1997; Wu et al. 1997)는 것이다.

다른 태양에서, 본 발명은 환자의 점막 표면에 하나 이상의 노로바이러스 항원, 적어도 하나의 유효 항원보강제 및/또는 적어도 하나의 전달 물질을 포함하는 항원 또는 백신 조성물을 (바람직하게는 비강으로) 투여하여 IgA 점막 면역반응 및 IgG 전신 면역반응을 유발하는 방법을 제공한다.

본 발명은 본 발명에서 정의된 노로바이러스 항원들 및 적어도 하나의 항원보강제 또는 본 발명에서 정의된 적어도 하나의 전달 물질의 비강 제제를 분산하기 위한 수단을 제공하는 것을 고려한다. 예를 들어, 분산 장치는 에어로졸 전달 시스템 형태를 가지며 단지 1회 복용량 또는 다수 복용량을 분산하도록 준비될 수 있다. 이런 장치는 백신 또는 항원 제제의 계량된 복용량을 비강으로 전달할 것이다. 적절한 장치들의 다른 예는 드롭퍼, 면봉, 에어로졸화기, 취입기(예를 들어, Valois Monopowder Nasal Administration Device, Bespak UniDose DP), 연무기 및 흡입기를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 장치들은 피험자가 제제를 비강 속으로 흡입하는 것을 필요로 하는 수동적 수단에 의해 항원 또는 백신 제제를 전달할 수 있다. 선택적으로, 장치는 복용량을 비강으로 투입하거나 분사함으로써 제제를 능동적으로 전달할 수 있다. 투여는 피험자 당(콧구멍 당 한 장치) 두 개의 장치를 포함한다. 활성 성분(노로바이러스 항원)의 실제 복용량은 약 5-1000㎍일 수 있다. 한 바람직한 실시예에서, 항원 또는 백신 제제는 비강 속에 가깝게 유지되거나 삽입된 제제를 함유하는 장치로부터 비강 내로 빠른 침적에 의해 비강 점막으로 투여된다.

또한 본 발명은 하나 이상의 노로바이러스 항원에 대해 항체들을 발생하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 상기한 대로 본 발명의 백신 또는 항원 제제를 피험자에게 투여하는 단계를 포함한다. 이런 항체들은 당업계에서 통상의 방법에 의해 분리될 수 있고 정제될 수 있다. 노로바이러스 항원들에 대해 특이적인 분리된 항체들은 진단 면역분석법의 개발에서 사용될 수 있다. 이런 분석법은 임상적 샘플에서 노로바이러스를 탐지하고 감염을 일으키는 특정 바이러스(예를 들어, 놀워크, 휴스톤, 설산 등)를 동정하는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 분리된 항체들은 수동 또는 단기 면역성을 제공하는 노로바이러스 감염에 약한 피험자들에게 투여될 수 있다.

본 발명은 피험자에게 본 발명의 백신 제제를 투여함으로써 노로바이러스 감염을 앓고 있는 피험자의 보호면역반응을 유도하는 방법을 제공하며, 상기 백신은 노로바이러스 VLPs와 적어도 하나의 항원보강제를 포함한다. 한 실시예에서, 피험자는 인간이며 백신은 노로바이러스 감염의 하나 이상의 증상으로부터 보호한다. 비록 다른 사람들이 노로바이러스 항원에 의한 면역반응을 유도하는 방법들을 보고하였으나(미국특허 출원공개공보 US 2007/0207526), 아무도 인간들에서 보호면역반응의 유도를 입증하지 못했다. 백신의 유효성이 혈청 항체들과 관련이 있는 미국에서 현재 허가된 여러 백신들과 달리, 연구들은 놀워크 바이러스에 대한 혈청 항체들의 증가된 역가와 같은 면역반응의 마커들은 인간들에서 보호면역반응과 관련이 없다는 것을 보여주었다(Johnson et al. (1990) J. Infectious Diseases 161 : 18-21). 또한, 인간들에서 놀워크 바이러스 공격을 실험하는 다른 연구는 놀워크 감염에 대한 민감함은 다인자성이었고 분비상태와 메모리 점막 면역반응과 같은 인자들을 포함하였다는 것을 나타내었다(Lindesmith et al (2003) Nature Medicine 9: 548-553). 노로바이러스는 인비트로 배양되지 않을 수 있기 때문에, 바이러스 중성화 분석법은 현재 이용할 수 없다. 중성화 분석법을 대체하는 기능성 분석법은 혈구응집억제(HAI) 분석법이다. HAI는 노로바이러스 VLPs는 적혈구 세포 항원들과 결합하기 때문에 노로바이러스에 의한 항원-코팅 적혈구 세포들의 응집을 억제하는 노로바이러스 백신 유도 항체들의 능력을 측정한다. 이런 분석법에서, 노로바이러스 VLPs의 고정된 양은 면역된 피험자들의 적혈구 세포와 혈청의 고정된 양과 혼합된다. 만일 혈청 샘플이 기능성 항체들을 포함하는 경우, 항체들은 적혈구 세포들과 결합하는 VLPs와 경쟁할 것이어서, 적혈구 세포들의 응집을 억제한다.

유사한 발견들이 로타바이러스와 같은 다른 바이러스들에 대한 백신들로 관찰되었다. 로타바이러스 백신들의 경우, 혈청 항체들이 보호에 직접 관여하는지 또는 최근 감염을 단순히 나타내는지에 대한 논란이 있다(Jiang, 2002; Franco, 2006). 보호의 이런 상관관계를 정의하는 것은 특히 로타바이러스 또는 노로바이러스와 같은 설사 질환들의 내용에서 특히 어렵고, 보호를 다루는 임상전 연구들은 점막 면역성(장 IgA), 사이토카인 동화 및 세포 매개 면역성의 기여들과 여러 면에서 관련될 수 있다. 임상 개발 동안 이런 면역 반응들을 측정하는 데 어려움 및 혈청 항체 측정값들 대한 상관관계의 부족은 이런 형태의 바이러스들에 대한 백신의 효과는 인간 임상 면역성 검사 실험을 통해서만 입증될 수 있다는 것을 요한다.

상기한 대로, 본 발명의 백신 제제들의 투여는 노로바이러스 감염의 적어도 하나의 증상을 예방 및/또는 치료한다. 노로바이러스 감염의 증상들은 당업계에 주지되어 있고 구역질, 구토, 설사 및 위 경련을 포함한다. 또한, 노로바이러스 감염된 환자는 낮은 등급 열, 두통, 한기, 근육통 및 피로를 가질 수 있다. 본 발명은 피험자에게 본 발명의 백신 제제를 투여함으로써 노로바이러스 감염을 앓고 있는 피험자의 보호면역반응을 유도하는 방법을 포함하며 노로바이러스 감염과 관련된 적어도 하나의 증상은 완화 및/또는 감소된다. 증상의 감소는, 예를 들어, 피험자에 의한 자가평가, 의사의 평가 또는 삶의 질 평가, 노로바이러스 감염 또는 다른 증상들의 느린 진행, 노로바이러스 증상의 심각성 감소를 포함하는 적절한 분석 또는 측정(예를 들어, 체온) 또는 적절한 분석(예를 들어, 항체 역가 및/또는 B-세포 또는 T-세포 활성화 분석)을 수행함으로써 주관적으로 또는 객관적으로 측정될 수 있다. 유효 반응은 장으로부터 나온 바이러스의 양을 나타내는 대변 샘플들에서 바이러스 양을 직접 측정(예를 들어, RT-PCR)함으로써 측정될 수 있다. 객관적 평가는 동물 및 인간 평가를 모두 포함한다.

본 발명에 개시된 백신 및 항원 제제들의 동물 모델에서 안정성과 효과는 전문이 참조로 본 발명에 포함된 국제출원 PCT/US07/79929에 보고된다.

본 발명의 내용 중에 포함되어 있음

도 1은 놀워크 바이러스(NV)-특이적 IgG가 마른 분발 VPs로 면역화된 토끼들에서 유도되는 것을 도시한다. 토끼들에게 50㎍ NV-VLP + 50㎍ MPL로 1, 22 및 43일(화살표)에, 비강 투여로 3회 복용하였다. 각 토끼의 혈청을 지정한 날에 ELISA에 의해 NV-VLP 특이적 IgG에 대해 검사하였다. VLP 백신된 토끼들만 NV-VLP 특이적 IgG를 가졌고, 치료되지 않은 그룹과 위약 치료 그룹은 탐지가능한 항원-특이적 항체들(데이터 도시되지 않음)을 갖지 않았다. 반응들의 산술적 평균이 도시되며 U/mL(1U ~ 1㎍)으로 표현된다. 막대는 평균의 표준 에러를 나타낸다.
도 2는 대조군(항원보강제/부형제) 또는 놀워크 바이러스 VLPs(5, 15 또는 50㎍)의 3회 복용 중 하나를 포함하는 백신 제제로 면역화된 인간 지원자들로부터 혈청 IgA(패널 A) 및 IgG(패널 B) 수준을 측정하는 ELISA 분석법의 결과들을 도시한다. 안티-VLP에서 기하 평균 4배 증가는 제 2 면역화(56일) 이후 35일에 복용량 수준의 각각에 대해 도시된다. 지원자들은 0일과 21일에 면역화되었다.
도 3은 놀워크 바이러스 VLPs 또는 대조군(항원보강제/부형제)의 50㎍ 복용량으로 백신 제제를 투여받은 인간 지원자들에서 세포들을 분비하는 IgA(패널 A) 및 IgB(패널 B) 항체의 수준을 도시한다. 10⁶ 말초 혈액 단핵구 세포(PBMCs) 당 ASCs의 기하 평균(GMN)은 연구일(7일 또는 28일), 구체적으로 면역화 후 7일에 대해 도표로 나타낸다. 지원자들은 0일과 21일에 면역화되었다.

본 발명은 다음 실시예들에서 개시된 특정 실시예들을 참조하여 더욱 상세하게 설명될 것이다. 실시예들은 본 발명의 순수하게 설명하기 위한 것이고 어떤 경우에도 이의 범위를 제한하려는 것이 아니다.

실시예 1. 토끼들에서 노로바이러스 백신 제제들의 GLP 독성 연구

본 발명의 목적은 토끼들에서 3회 비강 복용 후 놀워크 바이러스-바이러스 유사 입자(NV-VLP)의 잠재 독성을 평가하는 것이다. NV-VLP 백신은 유전자 군 I VLP의 25㎍(10mg 건조 분말 당), 25㎍ MPL, 7mg 키토산 글루타메이트, 1.475mg 만니톨 및 1.475mg 수크로오스를 포함하였다. 연구는 8주 동안 실시되었다. 임의의 효과들의 지속, 가역 또는 지연된 개시는 치료 없는 회복 기간인 4주 후 분석하였다. 60마리 뉴질랜드 흰 토끼들(30/성별)을 3 그룹(10마리 토끼/성별/그룹)으로 무작위로 분류하였다. 그룹 1 동물들은 복용되지 않았다(투약되지 않음). 그룹 2 동물들은 10mg/콧구멍(전체 20mg)의 플라시보(즉 항원보강제/부형제: MPL, 키토산, 수크로오스 및 만니톨)을 투여받았다. 그룹 3 동물들은 콧구멍 당 25㎍(전체 50㎍)의 항원에 해당하는 10mg/콧구멍(전체 20mg)의 NV-VLP 백신을 투여받았다. 그룹 2 및 3의 동물들은 베스파크 유니도스 비강 건조 분말 장치를 사용하여 비강 투여함으로써 연구일(SD) 1, 22 및 43에 복용되었다. 동물들(5/그룹/성별)에게 SD 46 및 74에 전체 육안 검시(full gross necropsy)를 하였다. 연구 동안 측정된 변수들은 사망률, 임상적 및 케이지사이드 관찰(cageside observation), 체중, 체중 변화, 음식 소비, 체온, 안과 검사, 임상 병리학(임상 화학, 혈액학 및 소변 분석), 육안 병리학, 장기 무게 데이터 및 조직 병리학을 포함하였다. 연구 개요는 표 1에 요약된다. 연구의 결론은 표 2에 요약된다.

놀워크 백신 제제의 GLP 독성에 대한 연구 변수들

종류	귀 태그 IDs를 가진 SPF 뉴질랜드 흰 토끼들
No. 동물/성별/복용 그룹	10마리 수컷 및 10마리 암컷/그룹
연구 동물의 전체 숫자	60
그룹 1	치료되지 않은 대조군
그룹 2	항원보강제/부형제
그룹 3	항원보강제/부형제로 1x 최대 인간 복용량

놀워크 백신 제제에 대한 안정성 및 독성 결과

관찰	사망률, 임상 또는 케이지사이드 관찰에 대한 치료 관련 효과 없음.
체중 및 체중 변화	체중 또는 체중 변화에 대한 부작용 없음.
음식 소비	음식 소비에 대한 치료 관련 부작용 없음.
체온	체온에 대한 치료 관련 부작용 없음.
안과학	눈 상처가 연구 동안 어떠한 동물에서도 발견되지 않았다.
임상 병리학	NV-VLP 백신 또는 항원보강제/부형제를 투여받은 토끼들의 B 림프구 수의 다클론 활성화가 3-76일 관찰되었다. 절대 단핵구 값들은 3-46일에 NV-VLP 백신 또는 항원보강제/부형제를 투여받은 토끼들에서 상승하였다. 선택된 소변 분석 변수들에 대한 치료 효과들이 없었다.
육안 병리학	치료 관련 관찰이 없음
장기 무게	절대 또는 상대 장기 무게에 대한 부작용 없음
조직 병리학	NV-VLP 백신 또는 항원보강제/부형제를 투여받은 토끼들의 비갑개(nasal turbinate)의 점막 내에서 또는 비강 내 아무 곳에서 변하는 양의 염증 침윤물 및/또는 비강 통로 내 출혈. 관찰된 상처는 면역 반응에서 예상되는 것들이다. 두 그룹에서 상처는 실제로 제한되며 SD74에 의해 완전히 없어졌다.

케이지 사이드 관찰은 중요한 결과들을 발견하지 못했다. 혈액학적 치수(글로불린 및 전체 단백질의 증가)는 B 림프구 다클론 활성화의 전형이었고 항원보강제 효과에 영향을 줄 수 있다. 조직 병리학적 발견들은 두 그룹에서 토끼들의 비갑개의 점막 내에서 또는 비강 내 아무 곳에서 변하는 양의 염증 침윤물 및/또는 비강 통로 내 출혈로 이루어졌다. 관찰된 상처는 실제로 제한되며 연구일 74에 의해 완전히 없어졌다.

NV-VLP 특이적 IgG에 대한 ELISA에 의해 분석된 혈청 샘플들은 1회 복용 이후 10일에 면역화된 동물들의 30%에서 측정가능한 안티-NV-VLP 역가를 나타내었다. 22일 및 43일에 추가 치료들은 혈청전환된 동물들의 수 및 생성물-특이적 항체들의 레벨 모두 증가하였고 73일에 면역화된 동물들의 90%가 혈청전환되었다. 투약되지 않거나 기질 치료된 대조군들 중 아무것도 정량가능한 레벨의 NV-VLP 특이적 항체들(데이터 도시되지 않음)를 갖지 않았다.

면역반응은 1일, 15일 및 29일에 동일한 제제로 비강으로 면역화된 토끼들의 다른 세트에서 메모리 B-세포 반응들에 의해 추가로 특징화하였다. 메모리 B-세포 반응들은 전문이 참조로 본 발명에 포함된 국제출원 PCT/US07/79929에 개시된 대로 측정하였다. 나중 상승 이후 156일에 수집된 조직들은 말초 혈액, 비장에서, 가장 눈에 띄게는, 장간막 림프절들에서 NV-VLP 특이적 메모리 B-세포의 존재를 나타내었다. 장간막 림프젤에서 항원 특이적 메모리 B-세포들은 IgA 양성이었다. 추가로, NV-VLP-특이적 항체-분비 장 수명 혈장 세포들은 골수에 존재하였다.

실시예 2. 인간들에서 놀워크 백신 제제의 복용량 증가 안정성 연구

노로바이러스 유전자군 1 백신의 안정성 및 면역원성의 더블 블라인드(double-blind), 제어된, 복용량 증가 단계 1 연구를 수행하였다. 백신은 비강 투여를 위해 설계된 건조 분말 기질의 동결건조된 놀워크 바이러스-유사 입자들(VLPs)로 구성되었다. 백신들은 H형 1 항원 분비자들인 건강한 성인 지원자들을 포함하였다. H형 1 항원 분비자들의 등록의 논리적 근거는 H형 1 항원 분비자들이 놀워크 바이러스에 감염되기 쉬운 반면 비 분비자들은 저항력이 있다는 것이다. 대조군으로서, 각 복용 레벨에서 2명의 추가 지원자들에게 기질을 단독으로 투여하였다. 건조 분말 기질(dry powder matrix)은 25㎍ MPL^® 항원보강제, 7mg 키토산, 1.5mg 만니톨 및 1.5mg 수크로오스를 포함하였다. 지원자들에게 0일 및 21일에 복용시켰고 각 복용 이후 증상들의 7일 일기를 쓰도록 하였다. 혈청학을 위한 혈액, 항체 분비 세포들(ASC) 및 점막 항체 평가를 위한 대변 및 혈액 샘플을 수집하였다.

놀워크 VLP 백신의 성분들은 표 3에 나열된다. 백신은 비강 전달 장치에 포장된다. 놀워크 VLP 백신의 1회 투여는 1회 복용 베스파크(영국, 밀토케인) 유니도스 DP 건조 분말 비강 전달 장치에 포장되었다. 각 장치는 10mg의 건조 분말 백신 제제를 전달하였다. 백신의 각 복용량은 각 콧구멍에 하나씩, 두 개의 전달 장치로 이루어졌다. 전체 백신 복용량은 20mg의 건조 분말이었다. 항원보강제/부형제의 제제는 놀워크 VLP 항원이 제제에 포함되지 않는 것을 제외하고 놀워크 VLP 백신과 동일하다. 항원보강제/부형제의 제제는(건조 분말 기질로도 불림) 표 4에 요약된다.

놀워크 VLP 백신 조성물

성분	분자 종류	10mg 건조 분말당 양	최종 제제의 %
놀워크 VLP	재조합 단백질	2.5, 7.5, 25 또는50㎍	0.025, 0.075, 0.25 또는 0.50%
모노포스포릴 지질 A	인지질	25㎍	0.25%
키토산	폴리사카라이드	7.0mg	70%
만니톨	당	1.5mg	15%*
수크로오스	당	1.5mg	15%

항원보강제/부형제(건조 분말 기질)

성분	분자 종류	10mg 건조 분말당 양	최종 제제의 %
모노포스포릴 지질 A	인지질	25㎍	0.25%
키토산	폴리사카라이드	7.0mg	70%
만니톨	당	1.5mg	15%
수크로오스	당	1.5mg	15%

구체적으로, 백신의 복용량 증가는 다음과 같이 수행되었다: 건강한 사람을 적절하게 선별한 후, 3명의 지원자의 한 그룹에게 비강 경로로 5㎍ 놀워크 VLP 백신과 건조 분말 기질(n=2) 또는 건조 분말 기질 단독(n=1)을 무작위로 투여하였다. 3명의 지원자는 21일 동안 안전을 추적하였고 이들의 안전 데이터를 독립된 안전 모니터(ISM)에 의해 관찰하였다. ISM의 승인 후, 개인들에게 비강 경로로 5㎍ VLP 단백질과 건조 분말 기질(n=3) 또는 기질 단독(n=1)을 무작위로 투여하였다. ISM은 이 제 2 그룹으로부터 안정성 데이터를 받았고 ISM의 승인 후, 1 차 복용 후 21일에 2차 비강 복용하였다. 지원자들은 각 복용 이후 증상들의 7일 일기를 썼다. ISM이 다음 높은 복용량에 대한 증가가 허용가능하였다고 결정한 후, 7명 지원자의 다른 그룹에게 0일 및 21일에 비강 경로로 15㎍ VLP 단백질(n=5)을 함유하는 놀워크 VLP 백신 또는 건조 분말 기질 단독(n=2)을 무작위로 투여하였다. 다시, 7일 증상 일기를 기록하고 21일에 2차 복용 전에 ISM으로 검토하였다. 마지막으로, 1차 2개의 그룹으로부터의 안정 데이터를 검토한 후, ISM은 복용량 증가가 허용가능하였다고 결정한 후, 7명 지원자의 마지막 그룹에게 0일 및 21일에 비강 경로로 15㎍ VLP 단백질(n=5)을 함유하는 놀워크 VLP 백신 또는 건조 분말 기질 단독(n=2)을 무작위로 투여하였다. 7일 증상 일기와 다른 안전 데이터를 21일에 2차 복용 전 ISM에 의해 검토하였다.

지원자들에게 놀워크 VLP 백신 또는 건조 분말 기질 단독을 투여한 후 7일 동안 증상들(콧물, 코 통증/불편, 코 막힘, 콧물 나옴, 코 가려움, 코피, 두통과 같은 국소 증상 및 일일 구강 온도, 근통, 구역질, 구토, 복부 통증, 설사 및 식욕부진과 같은 전신 증상)의 일일 일기를 쓰게 하였다. 중간 의료 기록들은 각각의 다음 방문 때(7±1, 21±2, 28±2, 56±2 및 180±14일) 얻었고; 지원자들은 일시적 질환, 약 복용 및 의사 방문에 대해 질문받았다. 지원자들은 다음 방문 동안 듣지 못했던 사건들을 포함하는 모든 심각한 또는 심한 부작용을 보고하도록 요구받았다. 지원자들은 7일 및 28일(각 면역화 후 7일)에 CBC와 혈청 크레아틴, 글루코스, AST 및 ALT를 분석 받았고 이상이 있는 경우, 검사가 정상이거나 안전하다고 나올때 까지 이상 실험실 검사를 하였다.

블라인드 데이터는 소량(n=5) 또는 기질(n=2)을 투여받은 지원자들의 7명 중 4명은 백신 접종 후 처음 24시간 이후 콧물, 코 통증, 막힘, 가려움, 재채기, 두통, 및/또는 목 아픔의 일부 또는 전부를 보고하였다는 것을 나타내었다. 한 지원자는 1일 및 6일의 각각에 약한 코피를 보고하였다. 중간 복용량(n=5) 또는 기질(n=2)을 받은 지원자들의 7명 중 5명은 처음 24시간 이후 약한 콧물, 막힘, 가려움, 재채기 및/또는 두통을 보고하였다. 증상들은 일반적으로 처음 72시간 이후 사라졌으나 한 지원자에서 코 막힘이 7일 동인 지속되었다. 블라인드되지 않은 데이터에 대한 결과들의 요약은 아래 표 5에 제공되며, 높은 복용량에서 보고된 부작용들을 포함한다. 이런 결과들은 비강 노로바이러스 VLP 백신은 VLP 농도과 무관하게 나타난 국소의, 주로 온화한 짧게 지속되는 증상들과 관련이 있다는 것을 나타낸다. 부작용, 혈액학, 혈액 화학 및/또는 물리적 실험 결과들에 대한 항원보강제/부형제(또는 기질) 대조군 그룹과 놀워크 VLP 백신 그룹들 사이에 차이가 보이지 않았다.

놀워크 VLP 백신 또는 항원보강제/부형제에 대해 부작용들을 가진 지원자들의 수

보고된 부작용	항원보강제 /부형제(N=6)	적은 복용량 (N=5)	중간 복용량 (N=5)	높은 복용량 (N=5)*
코 및 목
코 막힘	4	2	3	1
코 가려움	3	3	2	2
콧물	3	3	4	3
코 통증	-	2	1	2
재채기	3	2	1	3
코피	-	1	1	-
아픈 목/URI	-	1	-	1
가렵고 아픈 목	-	1	-	-
코/목 화끈거림	-	1	-	1
가슴
기침	2	-	-	-
가슴 불편	-	-	-	1
전신
두통	2	2	1	1
불안	3	2	-	1
구역질	-	1	-	1
복부 통증	1	-	-	1
실험실
ALT/AST	-	1	-	-
AST	1	-	-	-
ALT	-	-	-	1
Alk Phos	-	-	-	1
위장관
설사	-	1		1
식욕 부진	1	-	1	-
부작용 보고되지 않음
	-	-	1	2

* 그룹 3에 있는 한 피험자는 2차 복용되지 않았다.

면역화 이전 및 7±1, 21±2, 28±2, 56±2 및 180±14일에 혈액을 수집하여 효소-연결 면역흡수 분석법(ELISA)에 의해 놀워크 VLP 백신에 대한 혈청 항체들을 측정하였다. 백신 또는 건조 분말 기질의 각 복용량의 투여 이전 및 이후 7일에, 말초 혈액 림프구들을 수집하여 ELISPOT 분석법에 의해 항체 분비 세포들을 탐지하였다. 백신접종 이전 및 이후 21±2, 56±2 및 180±14일에, 혈액 샘플을 얻어서 세포들을 분리하고 놀워크 VLP 항원에 반응한 사이토카인 생산 및 림프구 증식을 포함하는 세포 매개 면역성의 이후 연구들을 위해 동결건조하였다. 전체 대변 샘플을 면역화 이전 및 안티-놀워크 VLP sIgA 스크리닝을 위해 7±1, 21±2, 28±2, 56±2 및 180±14일에 수집하였다. 타액을 면역화 이전 및 7±1, 21±2, 28±2, 56±2일에 구입할 수 있는 장치(NC, 뉴턴, 사르스테트, 살리베트)로 수집하였고 점막 항체들에 양성인 경우 56일, 180±14일에 샘플을 수집하고 안티-놀워크 VLP sIgA에 대해 스크리닝하였다. 마지막으로 높은 복용량의 놀워크 VLPs(50㎍, 상기한 세 번째 그룹)를 투여받은 지원자들의 혈액을 0, 21, 56 및 180일에 메모리 B-세포에 대해 스크리닝하였다.

다음 방법들은 면역화된 개인들 또는 건조 분말 기질 단독을 투여받은 개인들로부터 수집한 혈액, 대변 및 타액 샘플을 분석하는데 사용하였다.

A. ELISA에 의한 혈청 항체 측정

20mLdml 혈액을 코드화된 표본들을 스크리닝하기 위해 표적 항원으로서 정제된 재조합 놀워크 VLPs를 사용하는 ELISA에 의해 놀워크 바이러스에 대한 항체들의 측정을 위해 백신접종 이전 및 이후 여러 시점에서 수집하였다. 간단하게, 탄산염 코팅 버퍼 pH 9.6에 있는 놀워크 VLPs는 미세적정 판을 코팅하기 위해 사용하였다. 코팅된 판들을 세척하고, 차단하고 검사 혈청의 연속된 두 배 희석으로 배양하였고 뒤이어 세척하고 인간 IgG, IgM 및 IgA에 대해 특이적인 효소-접합 2차 항체 시약들로 배양하였다. 적절한 기질 용액들을 처가하고, 색을 현상하고, 판들을 읽고 IgG, IgM 및 IgA 종점 역가를 각 항체 종류에 대한 기준 표준 곡선과 비교하여 측정하였다. 양성 반응은 백신접종 이후 역가의 4배 상승으로 나타났다. 백신 복용의 각각에 대한 56일(2차 면역화 이후 35일)에서 혈청 역가들은 도 2에 도시된다. 결과들은 IgG 및 IgA에 대한 혈청 역가들에서 복용량-의존성 증가를 보여준다. IgG 및 IgA 모두에 대한 상당한 혈청 역가는 50㎍의 노로바이러스 항원을 함유하는 백신을 투여받은 지원자들에서 관찰되었다.

B. 항체 분비 세포 분석법

ASC 분석법이 놀워크 VLPs에 대한 항체들을 분비하는 세포들을 탐지하기 위해 헤파린 처리된 혈액(heparinized blood)으로부터 PBMCs를 수집하였다. 이런 분석법들은 놀워크 VLP 백신 또는 건조 분말 단독의 투여 이후 0, 7±1, 21±2 및 28±2일에 수행하였다. 반응 속도 및 각 복용량에 대한 각각의 시점에서 10⁶ PBMC 당 ASC의 평균 숫자를 기술하였다. 양성 반응은 모든 피험자들(긴 거리에서)에 대한 평균 백신접종 이전 카운트 이상의 적어도 3배 표준 편차(SD)이고 유사한 분석법으로 측정한 대로 매질 자극 음성 대조군 웰(2 지점(spots) 더하기 3 SD의 평균에 해당하는 적어도 8 ASC 지점인 10⁶ PBMC 당 백신접종 이후 ASC 카운트로 나타났다.

50㎍ 복용량의 놀워크 VLPs에 대한 ASC 분석법의 결과들은 도 3에 도시된다. 순환하는 IgG 및 IgA 항체 분비 세포들을 최초 및 추가 백신접종 이후 7일 관찰하였고, 백신은 면역원성이라는 것을 나타낸다.

C. 기능성 항체 반응의 측정

단락 B에서 개시한 대로 수집한 혈청을 추가로 분석하여 안티-놀워크 바이러스 항체들의 기능성 특성들을 측정하였다. 연속된 두 배 희석된 검사 혈청을 놀워크 VLPs에 의해 적혈구 세포들의 혈구응집을 억제하는 이들의 능력에 대해 분석하였다(보호면역반응을 나타내는 기능성 분석). 양성 반응은 백신접종 이후 역가에서 4배 상승으로 나타났다. 50㎍ 복용량의 놀워크 VLPs 백신을 투여받은 5명 피험자들에 대한 56일(부스트(boost) 이후 35일)에서 혈청 역가 및 혈구응집 억제 역가는 도 6에 도시된다. 결과들은 혈청 IgG 역가에 의해 측정된 혈청전환 반응을 나타낸 개인들의 75 퍼센트(75%)는 혈구응집 억제에 의해 측정된 대로 인간 적혈구 세포들에 대한 결합 수용체를 봉쇄할 수 있는 기능성 항체 반응을 일으켰다는 것을 보여준다.

5명 인간 지원자들에 대한 0일 및 부스트 이후 35일(35PB)에 대한 혈청 IgG 및 혈구응집 억제(HAI)(기능성)

혈청 IgG 역가
피험자 표시	0일	35PB일
A	2,444.6	37,185.9
B	4,462.1	23,508.4
C	7,735.7	13,357.8
D	884.5	4,577.5
E	12,719.0	91,710.8
혈구응집 억제( HAI ) 역가
피험자 표시	0일	35PB일
A B C D E	8 8 512 <8 128	256 256 512 8 1024

D. 놀워크 바이러스-특이적 메모리 B-세포들의 측정

헤파린 처리된 혈액은 그룹 3으로부터 수집하였고(0 및 21일 30mL, 56 및 180일 50mL) 인비트로 항원 자극보다 먼저 일어난 ELISpot 분석법을 사용하여 백신접종 이후 0, 21, 56 및 180일에 메모리 B 세포들을 측정하였다. 토끼들에서 놀워크 VLP 제제에 의해 일어난 메모리 B 세포들의 주기를 측정하는데 유사한 분석법을 사용하였다(참조로 본 발명에 포함된 국제출원 PCT/US07/79929 참조). 항원 특이적 메모리 B 세포들의 클론 증식과 항체 분비 세포들로의 분화를 허용하도록 말초 혈액 단핵 세포들(24웰 플레이트에서 5 x 10⁶ cells/mL, 1mL/well)을 놀워크 VLP 항원(2-10㎍/mL)로 4일 동안 배양하였다. 대조군들은 항원 및/또는 관련되지 않은 항원으로 배양된 세포들의 부존재하에서 동일 조건들에서 배양된 세포들을 포함한다. 자극 이후, 세포들을 세척하고, 계수하고 놀워크 바이러스 VLP로 코팅된 ELISpot 플레이트로 옮긴다. 전체 Ig-분비 B 림프구 당 바이러스 특이적 메모리 B 세포들의 주기를 측정하기 위해서, 증식된 B 세포들을 안티-인간 IgG 및 안티-인간 IgA 항체들로 코팅된 웰들에 첨가한다. 결합된 항체들을 HRP-표지화된 안티-인간 IgG 또는 안티-인간 IgA에 의해 뒤이어 트루 블루 기질에 의해 드러나 보이게 한다. IgA 및 IgG 서브클래스(IgA1, IgA2 및 IgG1-4)에 대한 접합체를 구별된 작동체 매커니즘과 관련이 있을 수 있는 항원 특이적 서브클래스 반응들과 면역 시초(immune priming)를 측정하는데 사용될 수 있다. 지점들은 ELISpot 리더로 계수한다. 각 지원자에 대한 증식된 세포 개체군은 이들의 메모리 B 세포 표현형, 즉, CD19+, CD27+, IgG+, IgM+, CD38+, IgD-을 확인하기 위해 유세포 분석기로 검사한다.

E. 세포 면역 반응들

헤파리처리된 혈액(50mL 그룹 1 및 2, 25mL 그룹 3)을 코드화된 표본으로서 수집하였고 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 분리하고 놀워크 VLP 항원에 대한 CMI 반응들의 가능한 이후 평가를 위해 액체 질소에 냉동보관하였다. 수행될 수 있는 분석법은 놀워크 VLP 항원에 대한 PBMC 증식 및 사이토카인 반응을 포함하고 확립된 기술들에 따라 인터페론(IFN)-γ 및 인터루킨(IL)-4 레벨을 측정함으로써 결정될 수 있다.

F. 안티-놀워크 VLP sIgA를 위한 대변 및 타액의 수집

안티-재조합 놀워크 바이러스 IgA는 대변과 타액 샘플들에서 측정한다. 타액 표본들을 프로테아제 억제제(즉, AEBSF, 루펩틴, 베스타틴 및 아프로티닌)(MO, 세이트 루이스, 시그마)로 처리하고, -70℃에서 저장하고 상기한 분석법(Mills et al. (2003) Infect. Immun. 71: 726-732)의 변형을 사용하여 분석하였다. 대변은 백신접종 이후 여러 일 동안 수집하고 분석할 때까지 -70℃에서 저장한다. 표본들을 해동하고 프로테아제 억제제 버퍼를 첨가하여 10% w/v 대변 현탁액을 제조한다. 대변 상청액을 하기한 대로, ELISA에 의해 재조합 놀워크 바이러스(rNV)-특이적 점막 IgA에 대해 분석한다.

대략 2-3mL의 전체 타액을 백신 접종 이전 및 이후 여러 시점에 수집하였다. 타액을 구입할 수 있는 장치(NC, 뉴턴, 사르스테트, 살리베트)로 수집하였고, 이 장치에서 살리베트 면봉은 타액이 충분히 배일 때까지 씹거나 30-45초 동안 혀 밑에 놓인다. 타액을 원심분리에 의해 면봉으로부터 수집한다.

G. 대변 및 타액에서 안티-놀워크 VLP의 측정

안티-인간 IgA 항체 시약 또는 표적 rNV VLP 항원 코팅으로 코팅된 플레이트를 사용하는 ELISAs를 수행하여 각 표본에 대한 전체 IgA를 측정하고 및 특이적 안티 VLP IgA 반응들에 역가를 측정하였다. 전체 또는 특이적 IgA는 상기한 대로 HRP-표지화된 안티-인간 IgA로 드러나 보이게 된다. 내부 전체 IgA 표준 곡선은 IgA 함량을 정량하는 것을 포함한다. 반응은 특이적 항체에서 4배 상승으로 나타난다.

실시예 3. 인간에서 비강 놀워크 VLP 백신의 2회 복용의 안전성과 면역원성 연구 연구

건강한 성인들에서 무작위, 더블 블라인드 연구를 수행하여 놀워크 바이러스 유사 입자(VLP) 백신의 2회 복용 레벨의 안전성과 면역원성을 항원보강제/부형제 및 플라시보 대조군(빈 장치)와 비교하였다. 백신은 실시예 2에 개시한 대로 비강 투여를 위해 설계된 건조 분말 기질의 동결건조된 놀워크 바이러스-유사 입자들(VLPs)로 구성되었다. 백신들은 H형 1 항원 분비자들인 건강한 성인 지원자들을 포함하였다. 인간 지원자들을 4 그룹 중 하나에 무작위로 배정하고 각 그룹에 다음 처리 중 하나를 받게 한다: 50㎍ 복용량의 놀워크 VLP 백신, 100㎍ 복용량의 놀워크 VLP 백신, 항원보강제/부형제 또는 플라시보. 지원자들에게 0일 및 21일에 복용시켰고 각 복용 이후 증상들의 7일 일기를 쓰도록 하였다. 혈청학을 위한 혈액, 항체 분비 세포들(ASC) 및 점막 항체 평가를 위한 대변 및 혈액 샘플을 수집하였다.

놀워크 VLP 백신의 성분들은 실시예 2에 있는 표 3에 나열된다. 백신은 비강 전달 장치에 포장된다. 놀워크 VLP 백신의 1회 투여는 1회 복용 베스파크(영국, 밀토케인) 유니도스 DP 건조 분말 비강 전달 장치에 포장되었다. 각 장치는 10mg의 건조 분말 백신 제제를 전달하였다. 백신의 각 복용량은 각 콧구멍에 하나씩, 두 개의 전달 장치로 이루어졌다. 전체 백신 복용량은 20mg의 건조 분말이었다. 따라서, 50㎍ 백신 복용량은 각각 10mg의 건조 분말 제제를 전달하는 두 장치로 구성되며, 각각의 10mg의 건조 분말 제제는 25㎍의 놀워크 VLP, 25㎍ MPL^® 항원보강제, 7mg 키토산, 1.5mg 만니톨 및 1.5mg 수크로스로 이루어진다. 유사하게, 100㎍ 백신 복용량은 10mg의 건조 분말 제제를 전달하는 두 장치로 구성되며, 각각의 10mg의 건조 분말 제제는 50㎍의 놀워크 VLP, 25㎍ MPL^® 항원보강제, 7mg 키토산, 1.5mg 만니톨 및 1.5mg 수크로스로 이루어진다. 항원보강제/부형제의 제제는 놀워크 VLP 항원이 제제에 포함되지 않는 것을 제외하고 놀워크 VLP 백신과 동일하다. 항원보강제/부형제의 제제는(건조 분말 기질로도 불림) 표 4에 요약된다. 플라시보 그룹은 2회 빈 장치가 투여된다.

지원자들에게 놀워크 VLP 백신, 건조 분말 기질 단독 또는 플라시보를 투여한 후 7일 동안 증상들(콧물, 코 통증/불편, 코 막힘, 콧물 나옴, 코 가려움, 코피, 두통과 같은 국소 증상 및 일일 구강 온도, 근통, 구역질, 구토, 복부 통증, 설사 및 식욕부진과 같은 전신 증상)의 일일 일기를 쓰게 하였다. 중간 의료 기록들은 각각의 다음 방문 때(7+1, 21+2, 28+2, 56+2 및 180+14일) 얻었고; 지원자들은 일시적 질환, 약 복용 및 의사 방문에 대해 질문받았다. 지원자들은 다음 방문 동안 듣지 못했던 사건들을 포함하는 모든 심각한 또는 심한 부작용을 보고하도록 요구받았다. 지원자들은 7일 및 28일(각 면역화 후 7일)에 CBC와 혈청 크레아틴, 글루코스, AST 및 ALT를 분석 받았고 이상이 있는 경우, 검사가 정상이거나 안전하다고 나올때 까지 이상 실험실 검사를 하였다.

면역화 이전 및 7+1, 21+2, 28+2, 56+2 및 180+14일에 혈액을 수집하여 효소-연결 면역흡수 분석법(ELISA)에 의해 놀워크 VLP 백신에 대한 혈청 항체들을 측정하였다. 백신 또는 건조 분말 기질의 각 복용량의 투여 이전 및 이후 7일에, 말초 혈액 림프구들을 수집하여 ELISPOT 분석법에 의해 항체 분비 세포들을 탐지하였다. 백신접종 이전 및 이후 21+2, 56+2 및 180+14일에, 혈액 샘플을 얻어서 세포들을 분리하고 놀워크 VLP 항원에 반응한 사이토카인 생산 및 림프구 증식을 포함하는 세포 매개 면역성의 이후 연구들을 위해 동결건조하였다. 전체 대변 샘플을 면역화 이전 및 안티-놀워크 VLP sIgA 스크리닝을 위해 7+1, 21+2, 28+2, 56+2 및 180+14일에 수집하였다. 타액을 면역화 이전 및 7+1, 21+2, 28+2, 56+2일에 구입할 수 있는 장치(NC, 뉴턴, 사르스테트, 살리베트)로 수집하였고 점막 항체들에 양성인 경우 56일, 180+14일에 샘플을 수집하고 안티-놀워크 VLP sIgA에 대해 스크리닝하였다. 마지막으로 높은 복용량의 놀워크 VLPs(50㎍, 상기한 세 번째 그룹)를 투여받은 지원자들의 혈액을 0, 21, 56 및 180일에 메모리 B-세포에 대해 스크리닝하였다.

면역화된 개인들 또는 건조 분말 기질 단독 또는 플라시보를 투여받은 개인들로부터 수집한 혈액, 대변 및 타액 샘플을 분석하는데 사용된 방법들은 실시예 2에 상세하게 기술된다.

실시예 4. 놀워크 바이러스 VLP 백신 제제에 의해 면역화된 인간에서 놀워크 바이러스 공격 연구

여러 부위, 무작위, 더블 블라인드, 플라시보 제어 단계 1-2 변화 연구는 상기 실시예 2에 개시된 놀워크 VLP 백신으로 면역화된 80명 인간 지원자들에서 수행한다. 적절한 피험자들은 H형 -1 올리고사카라이드(양성 타액 분비 상태로 측정)를 나타내고 B 혈액형 또는 AB 혈액형 이외인 18-50세의 건강한 사람들이 포함된다. H형-1 분비자가 아니거나 B 혈액형 또는 AB 혈액형인 피험자들은 놀워크 바이러스에 대한 감염에 더욱 저항력이 있다고 보고되며 연구로부터 배제된다. 적어도 80%의 지원자들은 이런 두 기준에 따라 적절하다고 예상된다.

스크리닝 이후, 모든 허용 기준을 충족하는 적절한 지원자들을 각 그룹에 대략 40명을 가진 두 개의 동일한 크기의 그룹 중 하나로 무작위로 추출한다(1:1). 그룹 1은 놀워크 VLP로 면역화하고 그룹 2는 플라시보를 투여한다. 지원자들을 각 콧구멍에 10mg 놀워크 VLP 백신(20mg 전체 건조 분말) 또는 플라시보로 면역화한다. 각 10mg의 놀워크 VLP 백신은 50㎍의 놀워크 VLP, 7mg 키토산, 25㎍ MPL®, 1.5mg의 수크로오스 및 대략 1.5mg의 만니톨을 포함한다. 따라서, 그룹 1의 각 지원자는 각 면역화에서 100㎍의 놀워크 VLP 항원의 전체 복용량을 투여받는다. 지원자들은 0 및 21 연구일에 백신 또는 플라시보를 투여받는다.

플라시보와 비교된 놀워크 바이러스 VLP 백신의 안정성을 분석한다. 지원자들은 백신 또는 플라시보로 면역화된 후 7일 동안 일기를 써서 부작용의 심각성과 지속을 문서화한다. 심각한 부작용(SAEs) 및 임의의 현저한 새로운 의학적 증상의 발생은 백신 또는 플라시보의 최종 복용 후 6개월 동안 및 감염성 바이러스에 의한 공격 후 4개월 동안 이어진다.

모든 지원자들을 백신 또는 플라시보의 2차 복용 후 21일 내지 42일(42 내지 56 연구일)에 감염성 놀워크 바이러스로 공격한다. 각 지원자는 50% 인간 감염성 복용량(HID 50), 즉, 플라시보 그룹에서 적어도 50%의 지원자에서 질환을 일으키는 것으로 예상되는 감염성 바이러스의 양 또는 그 이상으로 투여된다. HID 50은 놀워크 바이러스의 약 48 및 약 480 바이러스 당량 사이이다. 놀워크 바이러스는 살균수와 혼합되고 구강으로 제공된다. 접종 이후 50mg 중탄산나트륨 용액이 주입되어, 위 산과 펩신에 의한 바이러스의 파괴를 예방한다. 중탄산 나트륨 용액(물속 500mg 중탄산나트륨)의 2차 주입은 감염성 바이러스의 구강 접종 후 5분 소요된다. 지원자들은 급성 위장염(구토, 설사, 묽은 변, 복부 통증, 구역질 및 열)의 증상/신호가 사라진 후 적어도 4일 및 적어도 18일 동안 시설에 있는다.

여러 측정기준을 관찰하여 바이러스 공격에 의해 유도된 위장염의 증상/신호를 예방하거나 감소시키는데 놀워크 VLP 백신의 효과를 측정한다. 모든 지원자들은 자신들의 급성 위장염의 임상적 증상들을 기록하고 이런 증상들은 연구 장소에서 연구원들에 의해 문서화된다. 백신을 투여받은 그룹 1의 질환 증상/신호는 그룹 2 플라시보 투여자와 비교된다.

타액 및 대변 샘플들을 백신 또는 플라시보 이전 및 공격 이후 모든 지원자들로부터 정기적으로 수집한다. 혈청 샘플들은 IgA 및 IgG에 대해 ELISA로 분석하고 놀워크 VLPs에 대해 역가를 측정한다. 놀워크 항원 및 놀워크 RNA는 바이러스의 존재, 장으로부터 유출된 바이러스의 양 및 바이러스 유출 기간을 나타내는 각각 ELISA 및 PCR에 의해 대변 샘플에서 검사한다. 공격 후 병이 든 피험자들은 증상/신호가 사라질 때까지 혈청 화학, BUN, 크라아티닌 및 간 기능 검사를 포함하는 다른 실험실 연구를 받는다.

백신 그룹(그룹 1) 및 플라시보 그룹(그룹 2)으로부터의 결과는 비교되어 노로바이러스 질환 전체(1차 종점)에 대한 백신의 보호 효과 및/또는 증상/신호의 완화에 대한 백신의 효과(병의 심각성 및 병의 기일의 #) 및/또는 존재의 감소, 바이러스 유출 양 및/또는 유출 기간(2차 종점)을 분석한다.

본 발명은 본 발명의 개별 태양의 한 설명인 특정 실시예들에 의해 범위가 제한되지 않으며 기능적으로 균등한 방법 및 구성요소는 본 발명의 범위 내에 있다. 또한, 본 발명에서 도시되고 개시된 것들 이외에 본 발명의 다양한 변형은 일상적인 실험들을 사용하여 상기 설명과 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이런 변형과 균등물은 첨부된 청구항의 범위 내에 해당할 것이다.

본 명세서에서 언급한 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 공보, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타낸 것과 같이 어느 정도 본 명세서에 참조로 포함된다.

본 발명에서 참조문헌의 인용 또는 언급은 이런 문헌이 본 발명에 대한 종래기술이라는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

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Claims

인간에게 노로바이러스 유사 입자들(VLPs) 및 적어도 하나의 항원보강제를 포함하는 백신을 투여하는 단계를 포함하여 인간에서 노로바이러스 감염에 대한 보호면역반응을 일으키는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 노로바이러스 VLPs는 노로바이러스 유전자군 I 및 유전자군 II 바이러스 균주들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 노로바이러스 VLPs는 단가 VLPs인 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 노로바이러스 VLPs는 단가 VLPs인 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 핵산 서열은 캡시드 단백질을 암호화하는 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 백신은 제 2 형태의 노로바이러스 VLPs를 포함하는 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 노로바이러스 VLPs는 놀워크 바이러스 VLPs이고 상기 제 2 노로바이러스 VLPs는 휴스턴 바이러스 VLPs인 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 백신은 전달 물질을 더 포함하는 방법.
제 8 항에 있어서,
전달 물질은 생체접착제인 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 생체접착제는 점막접착제인 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 점막접착제는 더마탄 셀페이트, 콘드로이틴, 펙틴, 뮤신, 알지네이트, 폴리(아크릴산)의 가교 유도체, 폴리바이닐 알콜, 폴리바이닐 파이롤리돈, 폴리사카라이드, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 렉틴, 섬모 단백질 및 카복시메틸셀룰로오스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제 11 항에 있어서,
상기 점막접착제는 폴리사카라이드인 방법.
제 12 항에 있어서,
상기 폴리사카라이드는 키토산 또는 키토산 염 또는 키토산 염기인 방법.
제 1 항에 있어서,
항원보강제는 톨-라이크 리셉터(TLR) 효현제, 모노포스포릴 지질 A(MPL^®), 합성 지질 A, 지질 A 모방체 또는 유사체, 알루미늄 염, 사이토카인, 사포닌, 무라밀 다이펩타이드(MDP) 유도체, CpG 올리고, 그람-음성 박테리아의 리포폴리사카라이드(LPS), 폴리포스파젠, 에멀젼, 비로솜, 코크리트, 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLG) 미세입자, 폴록사머 입자, 미세입자, 박테리아 내독소와 같은 내독소 및 리포솜으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제 14 항에 있어서,
항원보강제는 톨-라이크 리셉터(TLR) 효현제인 방법.
제 14 항에 있어서,
항원보강제는 MPL인 방법.
제 1 항에 있어서,
항원보강제는 독소 항원보강제가 아닌 방법.
제 1 항에 있어서,
백신은 분말 제제인 방법.
제 1 항에 있어서,
백신은 액체 제제인 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 백신은 점막, 비강, 근육내, 정맥, 피하(subcutaneous), 피내, 피하(subdermal) 및 경피 투여 경로로 이루어진 그룹으로부터 선택된 경로에 의해 인간에게 투여되는 방법.
제 20 항에 있어서,
상기 백신은 비강으로 투여되는 방법.
제 21 항에 있어서,
상기 백신은 비강에 밀접하게 고정된 백신을 포함하는 하나 이상의 장치로부터 비강 내에 빠른 증착에 의해 코 점막에 투여되는 방법.
제 22 항에 있어서,
상기 백신은 콧구멍 하나 또는 모두에 투여되는 제제.
제 1 항에 있어서,
상기 노로바이러스 VLPs는 약 0.01%(w/w) 내지 약 80%(w/w)의 농도로 존재하는 방법.
제 1 항에 있어서,
노로바이러스 VLPs는 복용량 당 약 1㎍ 내지 약 100mg의 양으로 존재하는 방법.
제 25 항에 있어서,
노로바이러스 VLPs는 복용량 당 약 1㎍ 내지 약 100㎍인 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 백신은 노로바이러스 감염의 하나 이상의 증상을 보호하는 방법.