ES2216280T3 - Formulaciones estabilizadas de papilomavirus humano. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a formulaciones de antígeno del virus del papiloma humano (HPV) que impiden la agregación de las proteínas y presentan una estabilidad prolongada en forma de soluciones acuosas. Dichas formulaciones comprenden una sal (por ejemplo, cloruro de sodio) y un tensioactivo no iónico (polisorbato 80 por ejemplo Tween 80) en concentraciones fisiológicamente aceptable.

Description

Formulaciones estabilizadas de papilomavirus humano.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a formulaciones de antígeno de papilomavirus humanos que muestran una estabilidad de antígeno aumentada y una agregación y precipitación de antígeno reducidas. La presente invención se refiere también a procedimientos de preparación de vacunas de HPV coadyuvadas utilizando las formulaciones de antígeno de papilomavirus humano descritas en la presente memoria. La presente invención se refiere también a vacunas de papilomavirus humano coadyuvadas generadas a partir de estas formulaciones de antígeno de papilomavirus.

Antecedentes de la invención

Las infecciones por papilomavirus (PV) ocurren en una variedad de animales, incluyendo seres humanos, ovejas, perros, gatos, conejos, monos, serpientes y vacas. Los papilomavirus infectan células epiteliales, induciendo generalmente tumores epiteliales o fibroepiteliales benignos en el sitio de infección. Los papilomavirus son agentes infecciosos específicos de especie.

Los papilomavirus se clasifican en distintos grupos basándose en el hospedador al que infectan. Los papilomavirus humanos (HPV) se clasifican además en más de 70 tipos basándose en estudios de hibridación de ADN. Los tipos de PV parecen ser inmunógenos específicos de tipo en que una inmunidad neutralizante ante la infección por un tipo de papilomavirus no confiere inmunidad frente a otro tipo de papilomavirus.

En los seres humanos, diferentes tipos de HPV causan distintas enfermedades. Los HPV de tipos 1, 2, 3, 4, 7, 10 y 26-29 causan verrugas benignas en individuos tanto normales como inmunocomprometidos. Los HPV de tipos 5, 8, 9, 12, 14, 15, 17, 19-25, 36 y 46-50 causan lesiones planas en individuos inmunocomprometidos. Los HPV de tipos 6, 11, 34, 39, 41-44 y 51-55 causan condilomas no malignos de la mucosa genital o respiratoria. Los HPV de tipos 16, 18, 31, 33, 35, 45 y 58 causan displasia epitelial de la mucosa genital y están asociados a la mayoría de los carcinomas in situ e invasivos del cuello de la matriz, vagina, vulva y canal anal.

Los papilomavirus son virus de ADN icosaédricos sin cubierta pequeños (50-60 nm) que codifican hasta 8 genes tempranos y 2 tardíos. Los marcos de lectura abiertos (ORF) de los genomas virales se designan E1 a E8 y L1 a L2, en los que "E" designa temprano y "L" designa tardío. L1 y L2 codifican proteínas de cápsida viral. Los genes tempranos (E) están asociados a funciones tales como replicación viral, regulación transcripcional y transformación celular.

La proteína L1 es la proteína de cápsida mayoritaria y tiene un peso molecular de 55-60 kDa. La proteína L2 es una proteína de cápsida minoritaria que tiene un peso molecular predicho de 55-60 kDa y un peso molecular aparente de 75-100 kDa como se determina mediante electroforesis en gel de poliacrilamida. Los datos inmunológicos sugieren que la mayoría de la proteína L2 es interna de la proteína L1 dentro del capsómero viral. El ORF de L1 está altamente conservado entre diferentes papilomavirus. Las proteínas L2 están menos conservadas entre diferentes papilomavirus.

Los genes L1 y L2 se han identificado como buenas dianas para inmunoprofilaxis. Algunos de los genes tempranos se ha demostrado también que son dianas potenciales del desarrollo de vacunas. Los estudios en sistemas de papilomavirus de conejo de cola de algodón (CRPV) y papilomavirus bovinos (BPV) han mostrado que las inmunizaciones con proteínas L1 y/o L2 recombinantes (producidas en bacterias o utilizando vectores Vaccinia) protegían a animales de la infección viral. La expresión de genes L1 de papilomavirus en sistemas de expresión de baculovirus o utilizando vectores Vaccinia dio como resultado el ensamblaje de partículas viroides (VLP), que se han utilizado para inducir respuestas de anticuerpo neutralizante de virus de alta titulación que se correlacionan con la protección de la exposición viral. Además, los genes L1 y L2 se han utilizado para generar vacunas para la prevención y tratamiento de infecciones por papilomavirus en animales.

Se han expresado partículas viroides que contienen proteína L1 de HPV11 tanto en sistemas de célula de insecto como de mamífero. La expresión de VLP en células de levadura ofrece las ventajas de ser rentable y adaptarse fácilmente al crecimiento a gran escala en fermentadores. Sin embargo, la proteína L1 de HPV11 se expresa a bajos niveles en células de levadura. Se observó que esto era un resultado del truncamiento del ARNm de L1 de HPV11. En contraposición, el gen L1 de HPV6 se transcribe en forma de un ARNm completo y se expresa a altos niveles. Modificando el ADN de L1 de HPV6 para codificar la proteína L1 de HPV11, es posible facilitar la transcripción de ARNm completo, dando como resultado una expresión de proteína L1 de HPV11 aumentada.

Los genes L1 y L2 se han utilizado para generar vacunas para la prevención y el tratamiento de infecciones por papilomavirus en animales. Los genes L1 y L2 de HPV de tipo 16 se han clonado en un vector viral de Vaccinia y se han infectado células de mamífero CV-1 con el vector recombinante para producir partículas viroides (VLP).

Se han generado L1 y L2 de papilomavirus bovino recombinante derivado de bacterias. Los sueros neutralizantes ante las proteínas bacterianas recombinantes reaccionan de forma cruzada con virus nativos a bajos niveles, presumiblemente debido a diferencias en las conformaciones de las proteínas nativa y derivada de bacteria.

Se han utilizado baculovirus recombinantes que expresan los ORF de L1 de HPV16 y L2 de HPV 16 para infectar células de insecto SF9 y producir proteínas L1 y L2. Los análisis por transferencia Western mostraron que las proteínas L1 y L2 derivadas de baculovirus reaccionaban con anticuerpos contra HPV16. L1 derivada de baculovirus forma VLP.

Jansen et al., (1995, Vaccine 13(16): 1509-1514) utiliza un tampón de procesamiento que comprende cloruro de sodio y Tween 80® durante la purificación de VLP de L1 y L1+L2 de papilomavirus de conejo de cola de algodón.

El documento WO 95/31476A se refiere a proteína L1 de papilomavirus recombinante y a su uso para detectar y tratar infecciones por papilomavirus.

Powell et al., "Compendium of Vaccine Adjuvants and Excipients" (1995, Plenum Press, Nueva York, página 205) afirma que el polisorbato 80 puede utilizarse en formulaciones de vacuna en emulsión.

Actualmente, las formulaciones de VLP de HPV recombinante purificadas deben almacenarse a altas concentraciones de NaCl para evitar la agregación en solución. A bajas fuerzas iónicas, las VLP de HPV agregan hasta el punto de precipitar de la solución. Basándose en éstas y otras observaciones relacionadas, se han almacenado soluciones madre de HPV congeladas en presencia de altas concentraciones de NaCl (1,25-2,5 M). Las muestras altamente agregadas de VLP de HPV 11 manifiestan una baja antigenicidad in vitro medida por ensayos de núcleo RIA, EIA o BIA. Por lo tanto, existe la necesidad de preparar una formulación de VLP de HPV que sea estable en condiciones salinas fisiológicas así como en condiciones de almacenamiento a largo plazo aceptables. La presente invención se dirige a y satisface esta necesidad.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a una formulación de vacuna de antígeno de papilomavirus humano (HPV) que está exenta de coadyuvantes que contienen alúmina y que se estabiliza frente a la agregación de antígeno a temperaturas por encima de 0ºC, que comprende:

(a) un componente de vacuna que comprende partículas viroides de papilomavirus humano que comprenden proteína L1 o proteína L1 y L2;

(b) una sal seleccionada de cloruro de sodio, sulfato de sodio, sulfato de amonio, acetato de sodio, citrato de sodio y fosfato de sodio, que está presente a una concentración fisiológica aceptable; y

(c) un tensioactivo no iónico presente a una concentración fisiológicamente aceptable.

La presente invención se refiere también a la generación de una vacuna de HPV coadyuvada sin alúmina que se forma mezclando una formulación de antígeno de HPV de la presente invención con una cantidad biológicamente eficaz de un coadyuvante sin alúmina para formar una vacuna de HPV coadyuvada sin alúmina.

Las formulaciones de antígeno de HPV y vacunas coadyuvadas sin alúmina de la presente invención incluyen, pero no están sólo limitadas como componente antígeno, partículas viroides generadas en forma de una vacuna de subunidades de HPV recombinante que comprende las proteínas L1 o una combinación de L1 y L2 de HPV de tipos 6a, 6b, 11, 16 y 18. Está dentro del alcance de esta invención estabilizar formas monovalentes de esta vacuna recombinante así como formas divalentes (tales como, pero sin limitación alguna, L1 de HPV 11, L1 de HPV 16 y L1 de HPV 6a recombinantes), y formas multivalentes (tales como, pero sin limitación alguna, L1 de HPV11, L1 de HPV 6a, L1 de HPV16 y L1 de HPV18 recombinantes).

La presente invención se refiere también a formulaciones de antígeno de HPV que comprenden una concentración de sal fisiológica y un tensioactivo para proporcionar una estabilización aumentada del componente de vacuna de la formulación a temperaturas superiores a 0ºC. Las formulaciones de HPV de la presente invención deberían ser capaces de un prolongado almacenamiento durante periodos de hasta al menos un mes hasta aproximadamente 2 años a aproximadamente 2ºC a aproximadamente 8ºC.

Una realización de la presente invención se refiere a formulaciones de antígeno de HPV en las que la formulación comprende una sal fisiológicamente aceptable, incluyendo pero no necesariamente con limitación, cloruro de sodio, sulfato de sodio y sulfato de amonio. El fin de la inclusión de una sal en la formulación es obtener la fuerza iónica deseada. Las contribuciones a la fuerza iónica pueden proceder de iones producidos por el compuesto tamponante, incluyendo pero sin limitación fosfato, citrato, acetato, succinato, Tris-HCl, MOPS, etc., así como de iones de sales no tamponantes.

Otra realización de la presente invención se refiere a formulaciones de antígeno de HPV en las que la formulación comprende un tensioactivo no iónico, incluyendo pero no necesariamente con limitación, ésteres de ácido graso de polioxietilensorbitán (polisorbatos) tales como polisorbato 80 (por ejemplo Tween 80®), polisorbato 60 (por ejemplo Tween 60®) y polisorbato 20 (por ejemplo Tween 20®), polioxietilenalquiléteres (por ejemplo, Brij 58®, Brij-35®), así como otros que incluyen, pero sin limitación, Triton X-100®, Triton X-114®, NP40®, Span 85 y la serie de tensioactivos no iónicos de Pluronics (por ejemplo Pluronics 121).

Una realización adicional de la presente invención se refiere a una formulación de antígeno de HPV en la que la formulación comprende un tensioactivo no iónico como se describe anteriormente y presente en un intervalo de hasta aproximadamente 0,2% p/v, siendo la sal fisiológicamente aceptable cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM, en presencia de un tampón fisiológicamente aceptable.

Otra realización de la presente invención se refiere a una formulación de antígeno de HPV en la que la formulación comprende un tensioactivo no iónico como se describe anteriormente y presente en un intervalo de hasta aproximadamente 0,2% p/v, siendo la sal fisiológicamente aceptable cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 400 mM, en presencia de un tampón fisiológicamente aceptable.

Aún otra realización de la presente invención se refiere a una formulación de antígeno de HPV en la que la formulación comprende un tensioactivo no iónico como se describe anteriormente y presente en un intervalo de hasta aproximadamente 0,2% p/v, siendo la sal fisiológicamente aceptable cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 300 mM, en presencia de un tampón fisiológicamente aceptable.

Otra realización de la presente invención se refiere a una formulación de antígeno de HPV en la que la sal fisiológicamente aceptable es cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM, y el tensioactivo no iónico, polisorbato 80 (incluyendo pero sin limitación Tween 80®), está presente en un intervalo hasta aproximadamente 0,2% p/v, en presencia de un tampón fisiológicamente aceptable

Una realización específica de la presente invención se refiere a una formulación de antígeno de HPV en la que la sal fisiológicamente aceptable es cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM, y el tensioactivo no iónico, polisorbato 80 (incluyendo pero sin limitación Tween 80®), está presente en un intervalo de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,1% p/v, en presencia de un tampón fisiológicamente aceptable.

Una realización preferida de la presente invención se refiere a una formulación de antígeno de HPV en la que el cloruro de sodio está presente en una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 400 mM, el polisorbato 80 (incluyendo pero sin limitación Tween 80®), está presente en un intervalo porcentual en cantidades de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,1% p/v, en presencia de un tampón fisiológicamente aceptable.

Una realización especialmente preferida de la presente invención se refiere a una formulación de antígeno de HPV en la que el cloruro de sodio está presente en una concentración de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 300 mM, el polisorbato 80 (incluyendo pero sin limitación Tween 80®), está presente en un intervalo porcentual en cantidades de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,1% p/v, en presencia de un tampón fisiológicamente aceptable.

Será conocido por un experto en la técnica proporcionar las formulaciones de antígeno de HPV de la presente invención en un tampón fisiológicamente aceptable, preferible pero no necesariamente con limitación, una formulación tamponada con fosfato, citrato, acetato, succinato, Tris-HCl o MOPS, preferiblemente pero sin limitación a un intervalo de pH de aproximadamente 5,0 a 9,0, y especialmente en un intervalo de pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0.

La presente invención se refiere también a procedimientos de generación de formulaciones de vacuna de HPV que implican utilizar la formulación de antígeno de HPV de la presente invención. Estos procedimientos mejorados de generar vacuna de HPV no basada en alúmina se describen en la presente memoria.

La presente invención se refiere también a vacunas de HPV coadyuvadas en las que se combina una cantidad biológicamente eficaz de un coadyuvante con una cantidad biológicamente eficaz de una formulación que contiene antígeno como se describe en la presente memoria.

El término "PV", como se utiliza en la presente memoria, es la abreviatura de "papilomavirus".

El término "HPV", como se utiliza en la presente memoria, es la abreviatura de "papilomavirus humano".

El término "VLP", como se utiliza en la presente memoria, es la abreviatura de "partícula viroide".

La expresión "fisiológicamente aceptable", como se utiliza en la presente memoria, significa un tampón, un excipiente o una sal en la que la concentración o la fuerza iónica es tal que la formulación es biológicamente compatible con el hospedador diana inmunizado, tal como un ser humano.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra el efecto de la dilución de proteína sobre el tamaño hidrodinámico frente al tiempo para VLP de L1 de HPV11 (MOPS 50 mM, pH 7,0, NaCl 1,25 M) durante un periodo de 2 meses a 4ºC. (\Box) 470 \mug/ml, (\sqbullet)18 \mug/ml.

La Figura 2 muestra el efecto de la concentración de sal sobre el tamaño hidrodinámico de VLP de L1 de HPV16 durante el almacenamiento a temperatura ambiente. Las muestras se diluyeron en un tampón, se almacenaron durante 1 hora y después se analizaron. En el caso de HPV11, las muestras se dializaron después también durante una noche frente al mismo tampón. La VLP de L1 de HPV11 se formuló en tampón MOPS 50 mM (pH 7,0) que contenía diferentes concentraciones de NaCl, (\circ) sin diálisis, (\Box) con diálisis. La VLP de L1 de HPV16 se formuló en tampón MOPS 50 mM (pH 7,0) que contenía diferentes concentraciones de NaCl, (\bullet) sin diálisis.

La Figura 3 muestra el efecto de la adsorción de proteína a una membrana de diálisis sobre el tamaño hidrodinámico (\bullet) y la concentración de proteína (\sqbullet) [como porcentaje de la L1 de HPV12 restante] de 50 \mug/ml de VLP de L1 de HPV11 en MOPS 50 mM, pH 7,0 a NaCl 180 mM en un tubo de polipropileno a temperatura ambiente durante 96 horas.

La Figura 4 muestra el efecto del poliestireno (\circ), polipropileno (\bullet) y vidrio (\lozenge) sobre la adsorción de VLP de L1 de HPV11 en MOPS 50 mM, pH 7,0 a NaCl 1,25 M a temperatura ambiente durante 24 horas.

La Figura 5 muestra el efecto de aumentar la relación superficie/volumen sobre la adsorción de VLP de L1 de HPV11 (18 \mug/ml) a polipropileno en MOPS 50 mM, pH 7,0, NaCl 0,25 M. (\Box) superficie/volumen= 4 cm^{-1}; (\bullet) superficie/volumen= 6 cm^{-1}.

La Figura 6A y la Figura 6B muestran el efecto de diversos tensioactivos (a 0,01%) sobre la estabilidad de la VLP de L1 de HPV11 (18 \mug/ml) en MOPS 50 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM a temperatura ambiente durante 20 horas (panel A) y en MOPS 50 mM, pH 7,0, NaCl 40 mM a 50ºC durante 30 minutos, y después a temperatura ambiente durante 48 horas (panel B) antes de someterse a dispersión dinámica de luz (DLS).

Las Figuras 7A y 7B muestran el efecto del polisorbato 80 (por ejemplo Tween 80®) sobre la adsorción superficial (panel A) y la agregación (panel B) de VLP de L1 de HPV11 (16 \mug/ml) frente a una superficie de polipropileno a temperatura ambiente en MOPS 50 mM, pH 7,0 a diversas fuerzas iónicas: (\bullet) (NH_{2})_{2}SO_{4} 0,4 M + 0,01% de Tween 80®; (\circ) (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,1 M; (\lozenge) (NH_{4})_{2}SO_{4} 0,5 M; (x) Na_{2}SO_{4} 0,1 M; (|) Na_{2}SO_{4} 0,5 M; (\Delta) NaCl 0,1 M y (\sqbullet) NaCl 0,5 M.

La Figura 8 muestra el efecto del polisorbato 80 (por ejemplo Tween 80®) sobre el diámetro hidrodinámico y la concentración de VLP de L1 de HPV 11 de VLP de L1 de HPV11 (18 \mug/ml) frente a una superficie de polipropileno en MOPS 50 mM, pH 7,0, NaCl 250 mM a temperatura ambiente frente al tiempo. La concentración de proteína se mide como un porcentaje de la concentración de proteína inicial. La reducción de la concentración de proteína está inversamente relacionada con la adsorción superficial, (\sqbullet) con 0,01% de Tween 80®, diámetro hidrodinámico; y (\blacklozenge) sin Tween 80®, diámetro hidrodinámico.

La Figura 9 muestra el efecto combinado de la concentración de NaCl y de polisorbato 80 (por ejemplo Tween 80®) sobre el tamaño hidrodinámico para VLP de L1 de HPV11 (18 \mug/ml) en MOPS 50 mM, pH 7,0, con (\bullet) NaCl 40 mM y 0,01% de Tween 80®; (\lozenge) NaCl 100 mM y 0,01% de Tween 80®; y (\circ) NaCl 40 mM, ausente Tween 80®.

La Figura 10A y la Figura 10B muestran el efecto de la concentración de polisorbato 80 (por ejemplo Tween 80®) [(\bullet) 0,000% p/v; (\circ) 0,001% p/v; (\sqbullet) 0,005% p/v; (\Box) 0,010% p/v] sobre el tamaño hidrodinámico (Dh (nm)) para VLP de L1 de HPV11 (18 \mug/ml) en MOPS 50 mM; pH 7,0, NaCl 150 mM a 4ºC (panel A) y a temperatura ambiente (panel B) frente al tiempo.

La Figura 11 muestra el efecto de diversos tensioactivos (a 0,01%) sobre la estabilidad de VLP de L1 de HPV16 (20 \mug/ml) almacenadas en MOPS 50 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM a temperatura ambiente durante 50 días antes de someterse a dispersión dinámica de luz (DLS).

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a formulaciones de antígeno de papilomavirus humano (HPV) que previenen la agregación de antígeno y aumentan la estabilidad de antígeno a concentraciones fisiológicas de sal en presencia de un tensioactivo.

La presente invención se refiere también a la generación de una vacuna de HPV coadyuvada sin alúmina que se forma mezclando una formulación de antígeno de HPV de la presente invención con una cantidad biológicamente eficaz de un coadyuvante sin alúmina para formar una vacuna de HPV coadyuvada sin alúmina.

Las formulaciones de antígeno de HPV y vacunas coadyuvadas sin alúmina de la presente invención incluyen, pero no están solamente limitadas como componente antígeno a, partículas viroides generadas en forma de una vacuna de subunidades de HPV recombinante que comprende proteínas L1 o una combinación de L1 y L2 de HPV de tipos 6a, 6b, 11, 16 y 18. Está dentro del alcance de esta invención estabilizar formar monovalentes de esta vacuna recombinante, así como formas divalentes (tales como, pero sin limitación alguna, L1 de HPV11, L1 de HPV16 y L1 de HPV6a), y formas multivalentes (tales como, pero sin limitación alguna, L1 de HPV11, L1 de HPV6a, L1 de HPV16 y L1 de HPV18). Con este fin, aunque se utilizan VLP de L1 de HPV11 en la ejemplificación de la invención, esto no limita en modo alguno los tipos de HPV que pueden generarse para estabilización en las formulaciones de antígeno de esta invención. De hecho, resulta evidente tras la revisión de esta descripción que las formulaciones de vacuna descritas en la presente memoria pueden utilizarse para estabilizar otras formulaciones de vacuna, incluyendo pero no solamente limitadas a otras VLP basadas en HPV. Por ejemplo, las formulaciones de vacuna de HPV de la presente invención incluyen, pero no están solamente limitadas a, partículas viroides generadas en forma de una vacuna de subunidades de HPV recombinante que comprende proteínas L1 o una combinación de L1 y L2 de HPV de tipos 6a, 6b, 11, 16 y 18. Por lo tanto, como se observó anteriormente, resulta también evidente que las formulaciones de la presente invención serán útiles para estabilizar diversas formulaciones divalentes y multivalentes, incluyendo pero sin limitación formulaciones de HPV divalentes (tales como L1 de HPV11 y L1 de HPV6a) y multivalentes (tales como L1 de HPV11, L1 de HPV6a, L1 de HPV16 y L1 de HPV18 recombinantes).

Por lo tanto, la presente invención se refiere a formulaciones de antígeno que comprenden un tensioactivo no iónico que estabiliza VLP de HPV en condiciones de sal y tampón fisiológicamente activas a lo largo de un intervalo de concentraciones de proteína útiles y a temperaturas de almacenamiento preferidas. Las formulaciones de HPV de la presente invención deben ser susceptibles de almacenamiento prolongado durante periodos de hasta al menos un mes a aproximadamente dos años aproximadamente a 2ºC a aproximadamente 8ºC. Estas formulaciones pueden mezclarse con coadyuvantes sin alúmina, especialmente coadyuvantes sin alúmina que se afectan negativamente por formulaciones de alta fuerza iónica conocidas por utilizarse para VLP de HPV.

A baja fuerza iónica, la VLP de L1 de HPV11 es conocida por agregar hasta el punto de precipitar de la solución. Las muestras altamente agregadas de VLP de L1 de HPV11 son conocidas por manifestar una baja antigenicidad in vitro (tal como en ensayos de núcleo RIA, EIA o BIA). Los datos en la sección de ejemplo 3 muestran que se descongeló una VLP de L1 de HPV11 (470 \mug/ml en MOPS 50 mM/NaCl 1,25 M) y se diluyó una porción de la solución a 18 \mug/ml en el mismo tampón. La solución de concentración menor de proteína agregó con el tiempo incluso si la concentración de NaCl se mantenía a NaCl 1,25 M. Por lo tanto, las altas concentraciones de sal no previenen por sí solas la agregación de VLP de HPV. Los datos presentados en la sección de ejemplo 4 que ensaya diversos intervalos de concentración de NaCl (mediante almacenamiento o diálisis la solución bruta durante un corto periodo de tiempo) muestran que una reducción en la concentración de NaCl a un nivel bajo (aproximadamente NaCl 150 mM e inferior) da como resultado la agregación de proteína (seguida de precipitación). Para evitar este problema, las soluciones que contienen VLP de L1 de HPV11 pueden almacenarse congeladas en presencia de altas concentraciones de NaCl (de aproximadamente 1,2 M-2,5 M). Una parte de la invención como se describe en la presente memoria se refiere a diversas formulaciones que comprenden VLP de HPV que resisten la agregación a concentraciones salinas fisiológicas en intervalos de temperatura útiles. Las formulaciones de la presente invención facilitan el almacenamiento a largo plazo de soluciones de VLP de HPV estables a 4ºC, y permiten útiles estudios de inmunogenicidad de HPV solo o en presencia de coadyuvantes de sal de aluminio o coadyuvantes sin aluminio.

Además, se describe en la sección de ejemplo 5 que poner en contacto VLP de HPV con diversas superficies afectará también a la agregación. Se muestra en la presente memoria que aumentar el área superficial para contacto con una VLP de HPV (por ejemplo membrana de diálisis o tubo de almacenamiento) aumenta el tamaño hidrodinámico de la VLP. Este aumento de la agregación conduce a una reducción concomitante de la concentración de proteína en la solución de VLP de HPV, indicando la adsorción de las VLP de HPV sobre la superficie de membrana y sugiriendo una correlación entre la adsorción a la superficie y la agregación. Por lo tanto, está también dentro del alcance de la invención poner en contacto la vacuna con una superficie contenedora preferida. Los datos indican que las VLP de L1 de HPV11 (MOPS 50 mM/NaCl 1,25 M, pH 7,0) incubadas a temperatura ambiente durante 24 horas muestran una adsorción significativa a vidrio de borosilicato, mientras que no se observa una adsorción significativa a poliestireno.

La sección de ejemplo 6 contiene datos que indican los excipientes y sales preferidos para inclusión en las formulaciones de la presente invención.

Por lo tanto, la esencia de la presente invención se refiere a formulaciones de antígeno de HPV que comprenden concentraciones salinas fisiológicas a las que se ha añadido un tensioactivo no iónico de tal modo que el componente antígeno de la formulación posea una estabilidad prolongada a temperaturas de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 40ºC, así como la resistencia a la agregación observada a menudo con formulaciones de HPV conocidas. Con este fin, la presente invención se refiere a formulaciones de vacuna de HPV que comprenden una sal, incluyendo pero no necesariamente con limitación, cloruro de sodio, sulfato de sodio y sulfato de amonio, presentes a una fuerza iónica que es fisiológicamente aceptable para el hospedador. El fin de la inclusión de una sal en la formulación es obtener la fuerza iónica deseada. Las contribuciones a la fuerza iónica pueden provenir de los iones producidos por el compuesto tamponante así como de los iones de sales no tamponantes.

Un aspecto especialmente preferido de la presente invención se refiere a formulaciones de antígeno de HPV que comprenden una sal a un nivel fisiológicamente aceptable a la que se añade una cantidad mínima de un tensioactivo no iónico para proporcionar una estabilización aumentada del componente de vacuna de la formulación. Los tensioactivos no iónicos para uso en las formulaciones de antígeno de la presente invención incluyen, pero sin limitación, ésteres de ácidos grasos de polioxietilensorbitán, incluyendo pero sin limitación, polisorbato 80 (Tween 80®), polisorbato 60 (Tween 60®) y polisorbato 20 (Tween 20®), polioxietilenalquiléteres, incluyendo pero sin limitación Brij 58®, Brij 35®, así como otros tales como Triton X-100®, Triton X-114®, NP40®, Span 85 y la serie de tensioactivos no iónicos de Pluronics (por ejemplo Pluronics 121).

Una realización adicional de la presente invención se refiere a una formulación de antígeno de HPV en la que la formulación comprende un tensioactivo no iónico como se describe anteriormente y presente en un intervalo de hasta aproximadamente 0,2% p/v, siendo la sal fisiológicamente aceptable cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM, en presencia de un tampón fisiológicamente aceptable.

Otra realización de la presente invención se refiere a una formulación de antígeno de HPV en la que la formulación comprende un tensioactivo no iónico como se describe anteriormente y presente en un intervalo de hasta aproximadamente 0,2% p/v, siendo la sal fisiológicamente aceptable cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 400 mM, en presencia de un tampón fisiológicamente aceptable.

Aún otra realización de la presente invención se refiere a una formulación de antígeno de HPV en la que la formulación comprende un tensioactivo no iónico como se describe anteriormente y presente en un intervalo de hasta aproximadamente 0,2% p/v, siendo la sal fisiológicamente aceptable cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 300 mM, en presencia de un tampón fisiológicamente aceptable.

Otra realización de la presente invención se refiere a una formulación de antígeno de HPV en la que la sal fisiológicamente aceptable es cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM, y el tensioactivo no iónico, polisorbato 80 (incluyendo, pero sin limitación, Tween 80®), está presente en un intervalo de hasta aproximadamente 0,2% p/v en presencia de un tampón fisiológicamente aceptable.

Una realización específica de la presente invención se refiere a una formulación de antígeno de HPV en la que la sal fisiológicamente aceptable es cloruro de sodio a una concentración de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 500 mM, y el tensioactivo no iónico, polisorbato 80 (incluyendo pero sin limitación, Tween 80®), está presente en un intervalo de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,1% p/v en presencia de un tampón fisiológicamente aceptable.

Una realización preferida de la presente invención se refiere a una formulación de antígeno de HPV en la que el cloruro de sodio está presente en una concentración de aproximadamente 50 mM a aproximadamente 400 mM y el polisorbato 80 (incluyendo pero sin limitación Tween 80®) está presente en un intervalo porcentual en cantidades de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,1% p/v, en presencia de un tampón fisiológicamente aceptable.

Una realización especialmente preferida de la presente invención se refiere a una formulación de antígeno de HPV en la que el cloruro de sodio está presente a una concentración de aproximadamente 150 mM a aproximadamente 300 mM y el polisorbato 80 (incluyendo pero sin limitación Tween 80®) está presente en un intervalo porcentual en cantidades de aproximadamente 0,01% a aproximadamente 0,1% p/v, en presencia de un tampón fisiológicamente aceptable.

Será conocido por un experto en la técnica proporcionar las formulaciones de antígeno de HPV de la presente invención en un tampón fisiológicamente aceptable, preferible pero no necesariamente con limitación, una formulación tamponada con fosfato, citrato, succinato, acetato, Tris-HCl o MOPS, en un intervalo de pH que incluye, pero sin limitación, aproximadamente 5,0 a aproximadamente 9,0, preferiblemente un intervalo de pH de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 8,0.

La formulación descrita en la presente invención permite el almacenamiento de soluciones de HPV a concentraciones salinas casi fisiológicas en estado no congelado. Por lo tanto, dará como resultado la eliminación de las etapas de congelación y descongelación y permitirá la formulación directa de soluciones de VLP de HPV con coadyuvantes sin aluminio en las condiciones de fuerza iónica fisiológica apropiadas.

El procedimiento de la presente invención debería permitir un almacenamiento prolongado de la formulación de antígeno original a temperaturas en el intervalo de aproximadamente 2ºC a aproximadamente 8ºC durante un periodo de hasta al menos 2 años.

Resulta evidente tras la revisión de esta descripción que es una ventaja de las formulaciones de antígeno de HPV de la presente invención la capacidad de combinarse directamente con un coadyuvante sin alúmina a concentraciones fisiológicamente aceptables. Resulta también evidente tras la revisión de esta descripción que es otra ventaja la estabilidad aumentada a temperaturas por encima de la de congelación, de aproximadamente 0ºC a aproximadamente 40ºC, y especialmente de entre 2ºC y 8ºC, de tal modo que estas formulaciones pueden añadirse directamente a un coadyuvante que no contiene alúmina apropiado. En otras palabras, las formulaciones descritas en la presente memoria son también susceptibles de formulación directa en soluciones de HPV con coadyuvantes sin alúmina a concentraciones salinas fisiológicas.

El régimen de dosificación que utiliza las formulaciones de vacuna de HPV de la presente invención puede seleccionarse según una variedad de factores, incluyendo el tipo, especie, edad, peso, sexo y estado médico del paciente; la gravedad de la afección a tratar; la vía de administración; la función renal y hepática del paciente; y el compuesto particular de la misma empleado. Un médico experto puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz de vacuna de HPV necesaria para prevenir, contrarrestar o detener la progresión de la afección.

Los siguientes ejemplos se proporcionan como ilustrativos de la presente invención sin limitar, sin embargo, la misma a estos.

Ejemplo 1 Sobreexpresión de VLP de L1 de HPV11 recombinante

Construcción del gen sintético de L1 - La sobreexpresión y purificación de L1 de VLP de HPV11 se describen en las solicitudes de EE.UU. nº de serie 08/413.571 y 08/413.572, ambas presentadas el 30 de marzo de 1995, y se presenta también en esta sección de ejemplo sólo para ejemplificar, pero en modo alguno para limitar, los procedimientos que pueden utilizarse para generar VLP de HPV recombinante. Esta memoria describe el uso de L1 de HPV11 y L1 de HPV16 para ejemplificar las formulaciones de la presente invención. Será conocido por un experto en la técnica que puede utilizarse metodología de ADN recombinante conocida para generar las VLP de HPV recombinante citadas en la presente memoria. Será también conocido que pueden utilizarse hospedadores diferentes de levadura para sobreexpresar VLP de HPV que se utilizarán en las formulaciones de antígeno de la presente invención.

El marco abierto de lectura de L1 de HPV11 de 1,5 kpb se construyó utilizando oligómeros de ADN sintéticos adquiridos en Midland Reagent Company. Estos oligómeros se suministraron conteniendo fosfatos 5' terminales. Se requirieron un total de 24 oligómeros, que se enumeran a continuación:

1

2

3

4

5

Los oligómeros que forman los pares complementarios (nº 241-1 y nº 241-24, nº 241-2 y nº 241-23, nº 241-3 y nº 241-22, nº 241-4 y nº 241-21, nº 241-5 y nº 241-20, nº 241-6 y nº 241-19, nº 241-7 y nº 241-18, nº 241-8 y nº 241-17, nº 241-9 y nº 241-16, nº 241-10 y nº 241-15, nº 241-11 y nº 241-14, nº 241-12 y nº 241-13) se asociaron en tubos separados que contenían Tris 2,5 mM, pH 7,5, EDTA 0,25 mM. Los tubos se calentaron a 98ºC durante 4 min y después se dispusieron en 200 ml de agua a 98ºC en un vaso de precipitados de 250 ml para enfriar lentamente. Cuando el agua se enfrió a temperatura ambiente, los pares asociados se añadieron a tubos como se indica: fragmento A (pares oligoméricos nº 241-1 y 24, y 2 y 23); fragmento B (nº 241-3 y 22, 4 y 21, 5 y 20 y 6 y 19), fragmento C (nº 241-7 y 18, 8 y 17, 9 y 16 y 10 y 15) y fragmento D (nº 241-11 y 14 y 12 y 13). Estas mezclas de pares oligoméricos se calentaron a 62ºC durante 2 min y después se enfriaron lentamente como antes. Los contenidos de cada tubo se ligaron durante una noche a 23ºC utilizando ADN ligasa de T4 (Boehringer Mannheim Inc) y los reactivos suministrados por el fabricante.

Después del ligamiento, el fragmento B requirió amplificación por PCR para aumentar la cantidad de producto completo. Esto requirió diez ciclos de 94ºC, 1 min; 48ºC, 1 min; 72ºC, 1 min, seguido de 10 min a 72ºC en un termociclador de Applied Biosystems utilizando Taq polimerasa de Boehringer Mannheim y los cebadores oligoméricos:

5'-GGAATTCACATGCATGCACAGGCCTAG-3' (SEC Nº ID 25) y

5'-GGAATTCGGGGTACCAGCCCTGTTAA-3' (SEC Nº ID 26).

Los productos ligados y el producto PCR del fragmento B se digirieron con enzimas de restricción (Boehringer Mannheim, Inc.) como sigue: el fragmento A se digirió con Bgl II y Sph I; el fragmento B con Sph I y Kpn I; el fragmento C con Kpn I y Xho I; y el fragmento D con Xho I y Bgl II. Los fragmentos digeridos se separaron en geles de agarosa de bajo punto de fusión (FMC BioProducts) y se aislaron los fragmentos de tamaño correcto mediante escisión de la banda y digestión de la agarosa utilizando Agarase™ (Boehringer Mannheim, Inc.) como recomienda el proveedor. Los fragmentos A, B y D se recuperaron mediante precipitación con etanol y después se ligaron separadamente al vector pSP72 (Promega Inc.) que se había digerido similarmente con enzimas de restricción para acoplar cada fragmento que se está ligando.

El fragmento C digerido con Kpn I y Xho I se ligó en primer lugar a los oligómeros asociados.

5'-TCGAAGACTGGAACTTTGGGTTATCGCCTCCCCCAAATGGTACA-C-3' (SEC Nº ID 27) y

5'-TCGAGTGTACCATTTGGGGGAGGCGATAACCCAAAGTTCCAGTC-T-3' (SEC Nº ID 28).

El fragmento C se volvió a escindir después con Xho I y el fragmento KpnI-Xho I de 450 pb se ligó con el vector pSP72 digerido con Kpn I, Xho I Las mezclas de ligamiento se utilizaron para transformar células de Escherichia coli competentes cepa DH5 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). En los transformantes se analizaron los clones que contienen inserto mediante hibridación de colonias (J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Se aisló ADN de plásmido de los clones positivos utilizando un kit miniprep Wizard (Promega Corp.) y después se secuenció utilizando un secuenciador de ADN de Applied Biosystems 373A. Se digirieron los clones que contenían la secuencia de ADN correcta para cada uno de los 4 fragmentos como anteriormente para liberar los fragmentos del vector pSP72. Se ligó el fragmento C digerido con KpnI y Xho I con el fragmento D digerido con Xho I y Bgl II y pSP72 cortado con Kpn I y Bgl II en un ligamiento de tres vías. Los productos de ligamiento se utilizaron después para transformar E. coli. Los transformantes resultantes se secuenciaron y se obtuvo un clon de secuencia correcta (designado CD). El inserto Bgl II-Kpn I de 750 pb de CD se volvió a escindir del vector pSP72 y se ligó con el fragmento A digerido con Bgl II y Sph I y el fragmento B digerido con SphI y Kpn I en un ligamiento de tres vías como anteriormente, excepto porque se añadió Bgl II para reducir los productos de ligamiento indeseados. Los productos de ligamiento se separaron en geles de agarosa, se aisló el fragmento de 1,5 kpb y se designó como D361-1.

Construcción de vectores de expresión en levadura de L1 de HPV6/11, L1 de HPV11 y L1 de HPV6 - Se construyó el vector de expresión de levadura pGAL-10 aislando un fragmento Sph I de 1,4 kpb de un plásmido pUC18/promotor GAL bidireccional que contiene los promotores GAL1-GAL10 divergentes de Saccharomyces cerevisiae del plásmido pBM272 (proporcionado por Mark Johnston, Washington University, St. Louis, MO). Los promotores divergentes están flanqueados en cada lado por una copia del terminador transcripcional ADH1 de levadura (Bennetzen y Hall, 1982, J. Biol. Chem. 257: 3018-3025), un sitio de clonación de BamHI localizado entre el promotor GAL1 y la primera copia del terminador transcripcional ADH1 y un sitio de clonación Sma I localizado entre el promotor GAL10 y la segunda copia del terminador transcripcional ADH1. Se digirió un vector lanzadera de levadura constituido por pBR322, el gen LEUd2 de levadura (Erhart y Hollenberg, 1983, J. Bacteriol. 156: 625-635) y el plásmido 2u de levadura (proporcionado por Benjamin Hall, University of Washington, Seattle, WA) (Broach y Volkert, 1991, Circular DNA Plasmids of Yeasts, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) con Sph I, y se ligó con el fragmento promotor GAL divergente Sph I de 1,4 kpb, dando como resultado pGAL1-10.

El ADN de L1 híbrido HPV6/11 que codifica la proteína L1 de HPV11 (muestra D361-1 del ejemplo 1) contiene una secuencia líder de levadura no traducida (Kniskern et al., 1986, Gene 46: 135-141) inmediatamente cadena arriba del codón de metionina iniciador de L1 de HPV6/11. El plásmido pGAL1-10 se linealizó con BamHI, que corta entre el promotor GAL1 y el terminador de la transcripción ADH1, y se ligó con el fragmento génico de L1 de HPV6/11 de 1,5 kpb (muestra D361-1). Se analizaron transformantes de DH5 de E. coli (Gibco BRL, Inc.) y se aisló un plásmido pGAL1-10 que contenía el gen L1 de HPV6/11, que se designó como D362-1.

Se clonó ADN de HPV11 de tipo salvaje (wt-HPV11) a partir de una lesión de condiloma acuminado (proporcionada amablemente por el Dr. Darron Brown). Se extrajo el ADN genómico humano total y se digirió con endonucleasas de restricción. La fracción que contenía ADN de wt-HPV11 se ligó con un vector de clonación de E. coli para utilizar como molde para PCR. El gen L1 de wt-HPV11 se amplificó por PCR utilizando polimerasa Vent (New England Biolabs, Inc.), 10 ciclos de amplificación (94ºC, 1 min; 48ºC, 1 min; 72ºC, 1 min 45 s) y los siguientes cebadores oligonucleotídicos que contienen sitios Bgl II flanqueantes (subrayados):

Cebador con sentido:	5'-CTC AGA TCT CAC AAA ACA AAA TGT GGC GGC CTA GCG ACA GCA
	CAG-3' (SEC Nº ID 29)
Cebador sin sentido:	5'-GAG AGA TCT TAC TTT TTG GTT TTG GTA CGT TTT CG-3' (SEC Nº ID 30)

El cebador con sentido introduce una secuencia líder de levadura no traducida (Kniskern et al., Gene 46:
135-141) inmediatamente cadena arriba del codón de metionina iniciador de L1 de wt-HPV11 (marcado con negrita). El producto PCR de L1 de wt-HPV11 de 1,5 kpb se digirió con Bgl II, se purificó en gel y se ligó con el plásmido pGAL1-10 digerido con BamHI, proporcionando el plásmido p329-1.

Se extrajo el ADN genómico total de una lesión de condiloma acuminado positivo de HPV6a (amablemente proporcionado por el Dr. Darron Brown). El gen L1 de HPV6a se amplificó por PCR utilizando ADN de la muestra de biopsia como molde, polimerasa Vent (New England Biolabs, Inc.), 35 ciclos de amplificación (94ºC, 1 min; 48ºC, 1 min; 72ºC, 1 min 45 s), el cebador con sentido enumerado anteriormente para la PCR de L1 de wt-HPV11 y un cebador sin sentido de secuencia

5'-GAG AGA TCT TAC CTT TTA GTT TTG GCG CGC TTA C-3' (SEC Nº D 31)

El producto de PCR de L1 de HPV6a de 1,5 kpb se digirió con Bgl II, se purificó en gel y se ligó con el plásmido pGAL-10 digerido con BamHI, proporcionando el plásmido D128.

Preparación de la cepa 1558

a. Preparación de la cepa de levadura U9 - Se obtuvo la cepa 2150-2-3 de Saccharomyces cerevisiae (MATalfa, leu2-04, ade1, cirº) del Dr. Leland Hartwell (University of Washington, Seattle, WA). Se propagaron células de la cepa 2150-2-3 durante una noche a 30ºC en 5 ml de medio YEHD (Carty et al., 1987, J. Ind. Micro. 2: 117-121). Las células se lavaron 3 veces con agua estéril destilada, se resuspendieron en 2 ml de agua estéril destilada y se sembraron 0,1 ml de suspensión celular en cada una de seis placas de cultivo de ácido 5-fluoroorótico (FOA) para seleccionar los mutantes ura3 (Cold Spring Harbor Laboratory Manual for Yeast Genetics). Las placas de cultivo se incubaron a 30ºC. El medio contenía por cada 250 ml de agua destilada: 3,5 g de base nitrogenada de levadura Difco sin aminoácidos y sulfato de amonio; 0,5 g de ácido 5-fluoroorótico, 25 mg de uracilo y 10,0 g de dextrosa.

El medio se esterilizó mediante filtración a través de membranas de 0,2 \mum y después se mezcló con 250 ml de 4% de bacto-agar (Difco) mantenidos a 50ºC, 10 ml de una solución 1,2 mg/ml de adenina y 5 ml de solución de L-leucina (180 mg/50 ml). El medio resultante se dispensó a 20 ml por placa Petri.

Después de 5 días de incubación, habían aparecido numerosas colonias. Las colonias individuales se aislaron mediante un nuevo cultivo en estrías de colonias de las placas de cultivo FOA iniciales a placas de cultivo FOA recientes, que se incubaron después a 30ºC. Se ensayó en una serie de colonias del segundo conjunto de placas de cultivo FOA la presencia de la mutación ura3 mediante sembrado duplicado tanto en placas de cultivo YEHD como uracilo menos. El resultado deseado era un buen crecimiento en YEHD y ningún crecimiento en medio uracilo menos. Se obtuvo un aislamiento (U9) que mostró estas propiedades. Se almacenó en forma de una solución madre de glicerol congelada (cepa nº 325) a -70ºC para uso posterior.

b. Preparación de un vector para la desestabilización del gen MNN9 de levadura - Para preparar un vector para la desestabilización del gen MNN9, fue necesario clonar en primer lugar el gen MNN9 del ADN genómico de S. cerevisiae. Esto se realizó mediante tecnología estándar de reacción en cadena con polimerasa (PCR). Se diseñaron un cebador con sentido 5' y un cebador sin sentido 3' para PCR de la secuencia de codificación de MNN9 completa basándose en la secuencia publicada para el gen MNN9 de levadura (Zymogenetics: solicitud de patente OEP nº 88117834.7, publicación nº 0-314-096-A2). Se utilizaron los siguientes cebadores de oligodesoxinucleótidos que contienen sitios Hind III flanqueantes (subrayados):

Cebador con sentido:	5'-CTT AAA GCT T AT GTC ACT TTC TCT TGT ATC G-3' (SEC Nº ID 32)
Cebador sin sentido:	5'-TGA TAA GCT TGC TCA ATG GTT CTC TTC CTC-3' (SEC Nº ID 33).

El codón de metionina iniciador para el gen MNN9 se marca en negrita. Se realizó la PCR utilizando ADN genómico de la cepa JRY188 de S. cerevisiae como molde, ADN polimerasa Taq (Perkin Elmer) y 25 ciclos de amplificación (94ºC, 1 min; 37ºC, 2 min; 72ºC, 3 min). El fragmento PCR resultante de 1,2 kpb se digirió con Hind III, se purificó en gel y se ligó con pUC13 digerido con Hind III y tratado con fosfatasa alcalina (Pharmacia). El plásmido resultante se designó como p1183.

Para desestabilizar el gen MNN9 con el gen URA3 de levadura, se digirió el plásmido pBR322-URA3 (que contiene el fragmento Hind III de 1,1 kpb que codifica el gen URA3 de S. cerevisiae subclonado en el sitio Hind III de pBR322) con Hind III y el fragmento de ADN de 1,1 kpb que porta el gen URA3 funcional se purificó en gel, se hicieron sus extremos romos con ADN polimerasa T4 y después se ligó con plásmido p1183 digerido con Pml I (PmI I corta en la secuencia de codificación de MNN9). El plásmido p1199 resultante contiene una desestabilización del gen MNN9 por el gen funcional URA3.

c. Construcción de la cepa 1372 derivada de U9 que contiene una desestabilización del gen MNN9 - Para la desestabilización del gen MNN9 en la cepa U9 (nº 325), se digirieron 30 \mug del plásmido p1199 con Hind III para crear un módulo de desestabilización mnn9::URA3 lineal. Se transformaron células de la cepa 325 con el ADN de p1199 digerido con Hind III mediante el procedimiento de esferoplastos (Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929-1933) y se seleccionaron los transformantes en un medio de agar sintético que carecía de uracilo y contenía sorbitol 1,0 M. El medio sintético contenía, por litro de agua destilada: agar, 20 g; base nitrogenada de levadura sin aminoácidos, 6,7 g; adenina, 0,04 g; L-tirosina, 0,05 g; sorbitol, 182 g; glucosa, 20 g y solución de leucina menos nº 2, 10 ml. La solución de leucina menos nº 2 contiene, por litro de agua destilada: L-arginina, 2 g; L-histidina, 1 g;
L-leucina, 6 g; L-isoleucina, 6 g; L-lisina, 4 g; L-metionina, 1 g; L-fenilalanina, 6 g; L-treonina, 6 g; L-triptófano, 4 g.

Las placas de cultivo se incubaron a 30ºC durante 5 días, en cuyo momento habían aparecido numerosas colonias. Se hicieron preparaciones de ADN cromosómico a partir de 10 colonias y se digirieron después con Eco RI más Hind III. Las digestiones de ADN se evaluaron después por transferencia Southern (Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press) utilizando el fragmento Hind III de 1,2 kpb que porta el gen MNN9 (aislado del plásmido p1199) como sonda. Se identificó un aislamiento (cepa nº 1372) que mostró los desplazamientos de banda de ADN esperados en la transferencia Southern así como la extrema grumosidad mostrada típicamente por los mutantes mnn9.

d. Construcción de un vector para la desestabilización del gen HIS3 de levadura - Para construir un módulo de desestabilización en el que el gen HIS3 de S. cerevisiae se desestabiliza por el gen URA3, se digirió el plásmido YEp6 (Struhl et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1035) con BamHI y el fragmento BamHI que porta el gen HIS3 se purificó en gel, se hicieron los extremos romos con ADN polimerasa T4 y se ligó con pUC18, que
se había digerido previamente con BamHI y tratado con ADN polimerasa T4. El plásmido resultante (designado p1501 o pUC18-HIS3) se digirió con Nhe I (que corta en la secuencia codificante de HIS3), y el fragmento de vector se purificó en gel, se hicieron los extremos romos con ADN polimerasa T4 y se trató después con fosfatasa alcalina intestinal de ternero. El gen URA3 se aisló del plásmido pBR322-URA3 mediante digestión con Hind III, y el fragmento de 1,1 kpb que porta el gen URA3 se purificó en gel, se hicieron los extremos romos con ADN polimerasa de T4 y se ligó con el fragmento Nhe I pUC18-HIS3 anterior. El plásmido resultante (designado como pUC18-his3::URA3 o p1505) contiene un módulo de desestabilización en el que el gen HIS3 de levadura se desestabiliza por el gen URA3 funcional.

e. Construcción del vector para la desestabilización del gen PRB1 de levadura por el gen HIS3 - El plásmido FP8\DeltaH que porta el gen PRB1 de S. cerevisiae se proporcionó por el Dr. E. Jones de Carnegie-Mellon Univ. (Moehle et al., 1987, Genetics 115: 225-263). Se digirió con Hind III más Xho I, y el fragmento de ADN de 3,2 kpb que porta el gen PRB1 se purificó en gel y se hicieron los extremos romos mediante tratamiento con ADN polimerasa T4. EL plásmido pUC18 se digirió con BamHI, se purificó en gel y se hicieron los extremos romos con ADN polimerasa T4. El fragmento de vector resultante se ligó con el fragmento del gen PRB1 anterior, proporcionando el plásmido pUC18-PRB1. El plásmido YEp6, que contiene el gen HIS3, se digirió con BamHI. El fragmento BamHI de 1,7 kpb resultante que porta el gen HIS3 funcional se purificó en gel y después se hicieron los extremos romos mediante tratamiento con ADN polimerasa T4. El plásmido pUC18-PRB1 se digirió con Eco RV más Nco I que cortan en la secuencia de codificación de PRB1 y eliminan el sitio activo de proteasa B y la secuencia flanqueante. El fragmento Eco
RV-Nco I de 5,7 kpb que porta las porciones 5' y 3' residuales de la secuencia de codificación de PRB1 en pUC18 se purificó en gel, se hicieron los extremos romos mediante tratamiento con ADN polimerasa T4, se desfosforilaron con fosfatasa alcalina intestinal de ternero y se ligó con el fragmento de HIS3 de extremos romos descrito anteriormente. El plásmido resultante (designado como pUC18-prb1::HIS3, nº depósito: 1245) contiene el gen HIS3 funcional en lugar de la porción del gen PRB1 que se había eliminado anteriormente.

f. Construcción de una cepa de levadura relacionada con U9 que contiene desestabilizaciones tanto del gen MNN9 como PRB1 - Se construyó la cepa 1372 relacionada con U9 que contiene una desestabilización del gen MNN9 en la presente memoria. Se pasaron aislamientos clonales de la cepa 1372 por placas de cultivo FOA para seleccionar los mutantes ura3. Se obtuvieron una serie de aislamientos ura3 de la cepa 1372 y se seleccionó un aislamiento particular (la cepa 12930-190-S1-1) para la posterior desestabilización del gen HIS3. Se digirió el vector de desestabilización pUC18-his3::URA3 (p1505) con Xba I más Eco RI para generar un módulo de desestabilización his3::URA3 lineal y se utilizó para la transformación de la cepa 12930-190-S1-1 mediante el procedimiento de acetato de litio (Methods in Enzymology, 1992, 194: 290). Se seleccionaron transformantes ura+ en medio de agar sintético que carece de uracilo, se volvieron a cultivar en estrías los aislamientos clonales en el mismo medio y después se sembraron por duplicado en medio que carece de uracilo o histidina para analizar aquellos aislamientos que fueran tanto Ura+ como His-. Se seleccionó un aislamiento (cepa 12930-230-1) para la posterior desestabilización del gen PRB1. El vector de desestabilización del gen PRB1 (pUC18-prb1::HIS3, nº de depósito 1245) se digirió con Sac I más Xba I para generar un módulo de desestabilización prb1::HIS3 lineal y se utilizó para la transformación de la cepa 12930-230-1 mediante el procedimiento de acetato de litio. Los transformantes His+ se seleccionaron en medio de agar que carece de histidina y se volvieron a cultivar en estrías en el mismo medio los aislamientos clonales. Se preparó ADN genómico a partir de una serie de los aislamientos His+ resultantes, se digirió con Eco RI y después se sometió a electroforesis en geles de agarosa al 0,8%. Se realizaron después análisis de transferencia Southern utilizando una sonda de 617 pb radiomarcada del gen PRB1 que se había preparado mediante PCR utilizando los siguientes cebadores oligodesoxinucleotídicos.

5'-TGG TCA TCC CAA ATC TTG AAA-3' (SEC Nº ID 34); y

5'-CAC CGT AGT GTT TGG AAG CGA-3' (SEC Nº ID 35)

Se obtuvieron 11 aislamientos que mostraron la hibridación esperada de la sonda con un fragmento de ADN prb1::HIS3 de 2,44 kpb. Esto estaba en contraposición con la hibridación de la sonda con el fragmento de 1,59 kpb para el gen PRB1 de tipo salvaje. Se seleccionó uno de estos aislamientos que contiene la desestabilización prb1::HIS3 deseada para uso posterior, y se designó cepa nº 1558.

Ejemplo 2 Expresión de L1 de HPV11 y L1 de HPV6 en levadura

Se utilizaron los plásmidos D362-1 (pGAL1-10 + L1 de HPV6/11), p329-1 (pGAL1-10 + L1 de wt-HPV11), D128 (pGAL1-10 + L1 de HPV6) y pGAL1-10 para transformar la cepa nº 1558 de S. cerevisiae (MAT\alpha, leu2-04, prb1::HIS3, mnn9::URA3, ade1, cirº) mediante el procedimiento de esferoplastos (Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1929-1933). La cepa de levadura nº 1558 transformada con el plásmido D362-1 se designó como cepa nº 1782. Para los estudios de ARN, se hicieron crecer aislamientos clonales de levadura a 30ºC en medio complejo YEH (Carty et al., 1987, J. Ind. Micro., 2, 117-121) que contenía sorbitol 0,1 M y 2% de glucosa o galactosa durante 26 horas. Después de recoger las células, se extrajo el ARN de levadura utilizando el procedimiento de fenol ácido caliente como se ha descrito (Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Current Protocols, 1993). Para análisis de proteínas, se hicieron crecer aislamientos idénticos a 30ºC en medio complejo YEH que contiene sorbitol 0,1 M, 2% de glucosa y 2% de galactosa durante 70 horas. Después de recoger las células, se degradaron los sedimentos celulares con perlas de vidrio y se analizó en los lisados celulares la expresión de L1 de HPV11 o L1 de HPV6 mediante análisis por inmunotransferencia.

Fermentación de L1 de HPV6/11 (cepa nº 1782)

Se transfirió asépticamente el crecimiento de superficie de un cultivo en placa de la cepa 1782 a un medio líquido exento de leucina que contenía (por l): 8,5 g de base nitrogenada de levadura Difco sin aminoácidos y sulfato de amonio; 0,2 g de adenina, 0,2 g de uracilo, 10 g de ácido succínico, 5 g de sulfato de amonio y 0,25 g de L-tirosina; este medio se ajustó a pH 5,0-5,3 con NaOH antes de la esterilización. Después de crecer durante 25 h a 28ºC, a 250 rpm en un agitador giratorio, se prepararon viales de cultivo congelados añadiendo glicerol estéril a una concentración final de 17% (p/v) antes del almacenamiento a -70ºC (1 ml por criovial). Se desarrolló el inóculo para la fermentación de la cepa 1782 en el mismo medio (750 ml por matraz de 2 l) y se inició mediante la transferencia de los contenidos descongelados de dos viales de cultivo congelados a los matraces de 2 l e incubación a 28ºC a 250 rpm en un agitador giratorio durante 25h. La fermentación de la cepa 1782 utilizó un fermentador Chemap 23 L con un volumen de trabajo de 18 l después de la inoculación. El medio de producción utilizado contenía (por l): 20 g de extracto de levadura Difco; 10 g de peptona Sheffield HySoy, 20 g de glucosa y 20 g de galactosa; el medio se ajustó a pH 5,3 antes de la esterilización. Se transfirieron los contenidos completos (500 ml) del matraz de inóculo de 2 l al fermentador, que se incubó a 28ºC, con 9 l de aire por min, 500 rpm, 24 kPa de presión. La agitación se aumentó a la necesaria para mantener niveles de oxígeno disuelto mayores de 40% de saturación. Se controló la progresión de la fermentación mediante medidas de glucosa fuera de línea (analizador Beckman Glucose 2) y espectrometría de masas en línea (Perkin-Elmer 1200). Después de 66 h de incubación, se alcanzó una densidad celular de 9,32 g de peso de célula seca por l. Se combinaron los contenidos de dos de dichos fermentadores (total 17,5 l de caldo) antes de la recuperación celular. El cultivo se concentró mediante filtración de fibra hueca (cartucho Amicon H5MP01-43 en un sistema de filtración Amicon DC-10) hasta aproximadamente 2 l, se diafiltró con 2 l de solución salina tamponada con fosfato y se concentró adicionalmente (hasta aproximadamente 1 l) antes de dispensar a frascos de centrífuga de 500 ml. Se recogieron los sedimentos celulares mediante centrifugación a 8000 rpm (rotor Sorval GS3) durante 20 min a 4ºC. Después de decantar el sobrenadante, se almacenaron los sedimentos (358 g de células húmedas totales) a -70ºC hasta su uso.

Purificación de proteínas de cápsida de L1 de HPV recombinante de tipo 11

Todas las etapas se realizaron a 4ºC a menos que se indique otra cosa. Las células se almacenaron congeladas a -70ºC. Las células congeladas (peso húmedo: 180 g) se descongelaron a 20-23ºC y se resuspendieron en 900 ml de "tampón de ruptura" (MOPS 50 mM, pH 7,2, NaCl 500 mM, CaCl_{2} 1 mM). Los inhibidores de proteasa AEBSF y pepstatina A se añadieron a concentraciones finales de 1 mM y 1,7 mM, respectivamente. La suspensión celular densa se degradó a una presión de aproximadamente 110,4 MPa mediante 4 pasadas en un microfluidizador M110-Y (Microfluidice Corp., Newton, MA). Se añadió un volumen suficiente de detergente Triton X100® al 10% (Pierce, Rockford, IL) a la suspensión celular densa degradada para llevar la concentración de TX100 a 0,5%. La suspensión densa se agitó durante 20 horas. El lisado tratado con Triton X100 se centrifugó a 12.000 x g durante 40 minutos para eliminar los desechos celulares. Se recuperó el líquido sobrenadante que contiene proteína L1.

El líquido sobrenadante se diafiltró frente a cinco volúmenes de fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2, NaCl 0,5 M utilizando un módulo de membrana de flujo tangencial de 300 K (Filtron, Northborough, MA). El material retenido por la membrana se mostró mediante radioinmunoensayo y transferencia Western que contenía la proteína L1.

Se aplicó el retenido a una columna de afinidad de alta resolución (11,0 cm de DI x 5,3 cm) de resina SP Spherodex (M)® (IBF, Villeneuve-la-Garenne, Francia) equilibrada en fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2, NaCl 0,5 M. Después de un lavado con tampón de equilibrado y una etapa de lavado con fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2, NaCl 1,0 M, se eluyó la proteína L1 con una etapa de lavado con fosfato de sodio 20 mM, pH 7,2, NaCl 2,5 M. Se recogieron las fracciones durante los lavados y la elución. Se ensayó en las fracciones de columna la proteína total mediante el procedimiento Bradford. Se analizaron después las fracciones por transferencia Western y SDS-PAGE con detección de Coomasie coloidal. Se analizaron también las fracciones por radioinmunoensayo.

Se agruparon las fracciones de SP Spherodex que mostraron una pureza y enriquecimiento en proteína L1 comparables. Se analizó el producto final mediante transferencia Western y SDS-PAGE con detección de Coomasie coloidal. Se estimó que la proteína L1 era >90% homogénea. La identidad de la proteína L1 se confirmó por transferencia Western. El producto final se filtró asépticamente a través de una membrana de 0,22 mm y se almacenó a -70ºC en MOPS 50 mM y NaCl 1,25 M.

Se realiza un análisis de microscopía electrónica con Structure Probe (West Chester, PA). Se dispone una alícuota de muestra en una rejilla de cobre recubierta de carbono de malla 200. Se dispone una gota de ácido fosfotungsténico al 2%, pH 7,0 sobre la rejilla durante 20 segundos. Se deja secar la rejilla con aire seco antes del examen por TEM. Toda la microscopía se realiza utilizando un microscopio electrónico de transmisión JEOL 100 CX (JEOL USA, Inc.) a un voltaje de aceleración de 100 kV. Las microfotografías generadas tienen un número de aumentos final de

\hbox{100.000
x.}

Ensayo de Bradford para proteína total

Se ensayó la proteína total utilizando un kit Coomassie Plus® comercialmente disponible (Pierce, Rockford, IL). Se diluyeron muestras a los niveles apropiados en H_{2}O Milli-Q. Los volúmenes requeridos fueron 0,1 ml y 1,0 ml para los protocolos estándar y de microensayo, respectivamente. Para ambos protocolos, se utilizó BSA (Pierce, Rockford, IL) para generar la curva patrón. El ensayo se realizó según las recomendaciones del fabricante. Las curvas patrón se trazaron utilizando software CricketGraph® en un ordenador Macintosh IIci.

Ensayos SDS-PAGE y transferencia Western

Todos los geles, tampones y aparatos electroforéticos se obtuvieron de Novex (San Diego, CA) y se procesaron según las recomendaciones del fabricante. Brevemente, se diluyeron las muestras a concentraciones iguales de proteína en H_{2}O Milli-Q y se mezclaron 1:1 con tampón de incubación de muestra que contenía DTT 200 mM. Las muestras se incubaron 15 min a 100ºC y se cargaron en geles de Tris-glicina al 12% premoldeados. Las muestras se sometieron a electroforesis a 125 V durante 1 h 45 min. Los geles se desarrollaron por tinción de Coomasie coloidal utilizando un kit obtenido comercialmente (Integrated Separation Systems, Natick, MA).

Para transferencias Western, las proteínas se transfirieron a membranas PVDF a 25 V durante 40 min. Las membranas se lavaron con H_{2}O Milli-Q y se secaron al aire. El anticuerpo primario fue antisuero de conejo policlonal producido frente a la proteína de fusión TrpE-HPV11L1 (proporcionada por el Dr. D. Brown). La solución de anticuerpo se preparó mediante dilución del antisuero en tampón de transferencia (5% de leche desnatada en fosfato de sodio 6,25 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM, 0,02% de NaN_{3}). La incubación fue durante al menos 1 hora a 20-23ºC. La transferencia se lavó durante 1 minuto cada vez con tres cambios de PBS (fosfato de sodio 6,25 mM, pH 7,2, NaCl 150 mM). La solución de anticuerpo secundario se preparó diluyendo antisuero conjugado ligado a fosfatasa alcalina de IgG de cabra anti-conejo (Pierce, Rockford, IL) en tampón de transferencia. La incubación procedió en las mismas condiciones durante al menos 1 hora. Las transferencias se lavaron como antes, y se detectaron utilizando un sustrato NBT/BCIP de 1 etapa (Pierce, Rockford, IL).

Ejemplo 3 Dependencia de la concentración de proteina de la agregación

Se preparó un lote de VLP de HPV11 como se describe anteriormente y se almacenó a 0,47 mg/ml en MOPS 50 mM que contenía NaCl 1,25 M. Se descongeló este lote y se diluyó una porción de esta solución a 18 \mug/ml en el mismo tampón. Aunque la solución madre a mayor concentración de proteína mantuvo el mismo diámetro hidrodinámico (Dh), en el intervalo de 107-115 nm (medido por dispersión dinámica de luz), durante 2 meses a 4ºC, la solución de concentración menor de proteína agregó con el tiempo aunque la concentración de sal se mantuviera a NaCl 1,25 M (Figura 1). La Figura 1 muestra que a una concentración de proteína HPV menor, incluso altas concentraciones de sal no protegen a HPV de la agregación durante el almacenamiento a 4ºC.

Ejemplo 4 Dependencia de la concentración de sal de la agregación

Se preparó un lote de VLP de HPV11 y HPV16 y se ensayó la dependencia de la sal del tamaño hidrodinámico durante el almacenamiento. Se diluyeron VLP de HPV 11 y 16 recombinantes de la solución madre (en MOPS 50 mM, NaCl 1,25 M, pH 7,0) en tampón MOPS 50 mM de tal modo que la concentración de proteína final permaneciera constante aproximadamente a 20 \mug/ml, pero la concentración de NaCl variara como se indica en la Figura 2. Las diluciones se realizaron en tubos Eppendorf de polipropileno y se almacenaron a temperatura ambiente. Se realizaron medidas al cabo de 1 hora de preparación de las diluciones porque, como se indica en el ejemplo previo (Figura 1), ocurre una lenta agregación a esta concentración de proteína incluso en una solución que contiene una alta concentración de sal. El valor de Dh fue casi invariable a NaCl 0,15 M (HPV11) y NaCl 0,5 M (HPV16), pero aumentó a concentraciones menores de sal (Figura 2). Por otro lado, las muestras dializadas de HPV11 manifestaron mayores tamaños hidrodinámicos a todas las concentraciones de sal y el efecto fue especialmente pronunciado a concentraciones de sal por debajo de NaCl 0,5 M.

Un experimento separado con un lote diferente de HPV11 (datos no mostrados en forma de figura) muestra que las VLP de L1 de HPV11 recombinante (dializadas en tampón fosfato de sodio 20 mM (pH 7,2) que contienen diferentes concentraciones de NaCl) manifestaban un aumento del Dh de aproximadamente 113 nm en NaCl 0,5 M a 133 nm en NaCl 0,15 M. Las muestras dializadas en NaCl 1,0, 2,0 y 3,0 M manifestaron valores de Dhde 114, 113 y 108 nm en una comparación bilateral, mientras que una muestra dializada en una concentración de NaCl 0,025 M formaba un precipitado visible. Las concentraciones de proteína de estas muestras estuvieron en el intervalo de 130-179 \mug/ml (medidas por el ensayo de proteína de Lowry) excepto para la muestra en NaCl 0,025 M que tenía sólo 16 \mug/ml de proteína restante en solución. Una muestra control, que se almacenó en tampón fosfato de sodio 20 mM (pH 7,2) que contenía NaCl 2,5 M pero no dializada, proporcionó un valor de Dh de 82 nm.

Los datos de este ejemplo muestran que aunque bajas concentraciones de sal o bajas fuerzas iónicas conducen a la agregación interpartículas de VLP de HPV, las bajas concentraciones de proteína y las manipulaciones físicas de la solución de HPV (tales como diálisis de la proteína) son también importantes contribuyentes de la agregación de VLP de HPV.

Ejemplo 5 Adsorción superficial de VLP de HPV11

Superficie de membrana de diálisis - Se incubó una solución 50 \mug/ml de la proteína en tampón MOPS 50 mM a pH 7,0 que contenía NaCl 0,18 M con diferentes áreas superficiales de la membrana de diálisis para examinar el efecto de la membrana de diálisis directamente sobre la agregación de HPV11. Se encontró que el Dh aumentaba al aumentar el área superficial de la membrana después de 96 horas de incubación a temperatura ambiente (Figura 3). Al mismo tiempo, se encontró que la concentración de proteína en solución se reducía al aumentar el área superficial de la membrana (Figura 3). Estas observaciones indican la adsorción de HPV11 sobre la superficie de la membrana y sugieren una correlación entre la adsorción a la superficie y la agregación. Estos datos muestran que una exposición prolongada de bajas concentraciones de HPV a una superficie de polipropileno y a una superficie de membrana de diálisis causa adsorción superficial y agregación. Ambos procesos son dependientes de la temperatura. Las muestras incubadas a 4ºC manifestaron una cinética más lenta para ambos procesos que las de 25ºC.

Comparación de la adsorción de HPV sobre diferentes superficies contenedoras - Se comparó la adsorción de HPV, a idénticas relaciones de superficie a volumen, en tubos de vidrio de borosilicato, polipropileno y poliestireno (dimensiones idénticas de 12 x 75 mm^{2}) a diversas concentraciones de HPV. Las muestras se incubaron en tampón MOPS 50 mM que contenía NaCl 1,25 M a pH 7,0 y se dejaron a temperatura ambiente durante 24 horas. La Figura 4 muestra que la adsorción superficial es significativa en vidrio de borosilicato por debajo de 100 \mug/ml. El polipropileno actúa mejor porque la adsorción se vuelve un problema significativo por debajo de 30 \mug/ml, pero no a concentraciones mayores en estas condiciones. El poliestireno actúa mejor y no muestra ninguna adsorción de proteína significativa hasta 10 \mug/ml.

La adsorción superficial de HPV se examinó adicionalmente disponiendo HPV11 (18 \mug/ml en tampón MOPS 50 mM que contiene NaCl 0,25 M) en tubos de polipropileno a dos relaciones de superficie a volumen diferentes (Figura 5). Después de un día a temperatura ambiente, esencialmente todo el HPV se adsorbió en la superficie a una relación de superficie a volumen de 6,0 cm^{-1}, mientras que se observó una adsorción de aproximadamente 15% cuando la relación de superficie a volumen era de 4,0 cm^{-1} (Figura 5).

Ejemplo 6 Excipientes que inhiben la adsorción superficial y la agregación de VLP de HPV11

Examen de tensioactivos en un experimento de estabilidad acelerada - En un experimento de examen preliminar, se incubaron muestras de HPV11 durante 20 horas en presencia y ausencia de 0,01% de diversos tensioactivos. La concentración de HPV era de 18 \mug/ml y el tampón contenía MOPS 50 mM, NaCl 0,15 M a pH 7,0. Diversos tensioactivos ofrecieron una protección parcial frente a la agregación en estas condiciones en comparación con la muestra de HPV no tratada con tensioactivo, como se determina por dispersión dinámica de luz (Figura 6A).

Se realizó un experimento de examen de tensioactivo en una condición más rigurosa. Se incubó HPV11 en ausencia o presencia de 0,01% de cada tensioactivo a 50ºC durante 30 minutos, y después a temperatura ambiente durante 2 días. La concentración de HPV fue de 18 \mug/ml y el tampón contenía MOPS 50 mM y NaCl 0,04 M a pH 7,0. En estas condiciones, la muestra de HPV control no tratada con tensioactivo agregaba en un grado mucho mayor en comparación con el experimento descrito anteriormente. De los tensioactivos ensayados, la Figura 6B muestra que los ésteres de ácido graso de polioxietilensorbitán (Tween 80®) y polioxietilenalquiléteres (Brij 58®) proporcionaban la mejor protección para la agregación de VLP de HPV11.

Efecto protector de sal y polisorbato 80 en combinación - La Figura 7A y la Figura 7B muestran que a concentraciones menores de HPV las altas concentraciones de sal no previenen por sí solas la adsorción superficial o la agregación de VLP de HPV por cloruro de sodio, sulfato de sodio y sulfato de amonio, cada uno a 0,1 M y 0,5 M. A la inversa, la Figura 7A y la Figura 7B muestran también que la adición de tensioactivo no iónico Tween 80® a un tampón que contiene sulfato de amonio 0,4 M da como resultado una protección casi completa frente a la adsorción y agregación incluso 6 días después a temperatura ambiente.

Se reconfirmó el efecto del polisorbato 80 (por ejemplo Tween 80®) y el NaCl sobre la adsorción superficial y agregación en un experimento separado. Se incubó VLP de L1 de HPV1 a una concentración de 18 \mug/ml en tubos de polipropileno en tampón MOPS 50 mM que contiene NaCl 250 mM a pH 7 con o sin Tween 80®. La Figura 8 muestra el porcentaje de proteína adsorbida y los valores de Dh en función del tiempo de incubación a temperatura ambiente. En ausencia de Tween 80®, tanto la pérdida adsortiva como la de agregación son muy significativas, mientras que 0,01% de Tween 80® proporciona protección frente a ambos problemas.

La Figura 9 muestra que es necesaria una concentración óptima de sal, además del polisorbato 80, para proteger bajas concentraciones de VLP de HPV11 (100 \mug/ml) de la agregación y adsorción. Además, puede observarse que un aumento de Tween 80® en las formulaciones con una baja fuerza iónica ofrece una protección parcial pero no total. La Figura 9 muestra que la agregación de HPV 11 (18 \mug/ml) estaba sólo parcialmente controlada por 0,01% de Tween 80® en un tampón que contenía MOPS 50 mM y NaCl 0,04 M, pero era casi totalmente protectora frente a la agregación de VLP durante 48 horas a temperatura ambiente cuando la concentración de NaCl aumentaba a 0,10 M.

La Figura 10 muestra el efecto de valorar polisorbato 80 sobre la agregación de VLP de HPV11 (18 \mug/ml) en tampón MOPS 50 mM que contiene NaCl 0,15 M a pH 7,0. Las muestras se incubaron con concentraciones de Tween 80® en el intervalo de 0 a 0,01% a 4ºC y a temperatura ambiente. A 4ºC, no se había observado una agregación significativa hasta después de 20 días en la muestra que contenía 0,01% de Tween, mientras que se observó una protección parcial frente a la agregación a temperatura ambiente.

La Figura 11 muestra la capacidad de tensioactivos no iónicos de proteger a VLP de HPV16 frente a la agregación. Los tensioactivos examinados incluyen polisorbato 80 (por ejemplo Tween 80), polisorbato 20 (por ejemplo Tween 20), NP-40, Triton X100, Triton X114, así como polioxietilenalquiléteres (por ejemplo Brij 35 y Brij 58). Las muestras de HPV16 a 20 \mug/ml de proteína se incubaron con 0,01% de diversos tensioactivos respectivamente a temperatura ambiente durante 50 días. El tampón de incubación contenía MOPS 50 mM, NaCl 0,15 M a pH 7. Todos los tensioactivos protegían a HPV16 frente a la agregación durante el almacenamiento en comparación con una muestra de HPV16 control sin tensioactivo, como se determina por DLS (Figura 11). El grado de protección a esta concentración de tensioactivo (0,01%) varía algo de tensioactivo a tensioactivo. Para ensayar la dependencia de la sal de la capacidad protectora de los tensioactivos no iónicos, se incubaron muestras de proteína de HPV16 a 30-60 \mug/ml durante 24 horas a 4ºC con 0,01-0,02% de Tween 80 y a una concentración de NaCl de 0,15-0,5 M. Se observó que concentraciones de NaCl de 0,2 M o superiores proporcionan una protección significativa frente a la agregación de VLP de HPV16 en combinación con tensioactivos no iónicos.

El efecto estabilizante de la concentración de sal frente a la agregación de HPV en presencia de tensioactivos no iónicos se examinó en términos de fuerza iónica total. La Figura 2 y la Figura 9 muestran que es necesaria una concentración mínima de NaCl para estabilizar VLP de HPV en presencia o ausencia de tensioactivos no iónicos. En el siguiente experimento, se examinó en diferentes sales su capacidad de estabilizar VLP de HPV16 a una fuerza iónica constante. Se incubaron 60 \mug/ml de HPV16 a 22ºC durante 24 horas, después se almacenó a 4ºC hasta el ensayo del tamaño hidrodinámico (Dh) mediante dispersión dinámica de luz y mediante antigenicidad in vitro (unión de anticuerpos) por análisis de núcleo EIA y BIA. La Tabla 1 muestra que cuando se utilizó una variedad de sales en lugar de NaCl, se observó una estabilidad de HPV similar a concentraciones menores de sal pero a la misma fuerza iónica. Como control, una solución de menor fuerza iónica dio como resultado la agregación de HPV y la pérdida parcial de la antigenicidad. Estos resultados sugieren que en el efecto estabilizante de la sal predomina la fuerza iónica en lugar del tipo de sal, en estas condiciones. Cuando se ensayaron los efectos estabilizantes de una sal similar en condiciones más rigurosas (37ºC), se observaron ciertas variaciones de la capacidad estabilizante entre las diferentes sales como se muestra en el ensayo de antigenicidad in vitro y el análisis de agregación. Por ejemplo, CaCl_{2} y MgCl_{2}, así como tampón fosfato, fueron menos eficaces en la estabilización de VLP de HPV a una fuerza iónica constante.

TABLA 1

6

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{150mm}*Respecto a la respuesta de
anticuerpo  in vitro , se normalizó a una muestra  de HPV16
control congelada a -70ºC. El control se descongeló inmediatamente
antes del ensayo. El diámetro hidrodinámico (Dh) de la muestra
control por dispersión dinámica de luz se midió como 73
nm.\end{minipage} \cr}

Por lo tanto, la presencia de polisorbato 80 a una concentración de tan sólo 0,01% protege a HPV11 y HPV16 de la adsorción a superficies contenedoras y de la agregación interpartículas a fuerza iónica casi fisiológica durante semanas a 4ºC. Estos datos muestran también que (1) la adsorción de HPV sobre superficies y la agregación están relacionadas y (2) podrían estar implicados tanto mecanismos electrostáticos como hidrófobos porque ni los detergentes por sí mismos ni una sal por sí misma pueden ofrecer una protección completa frente a adsorción o agregación.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE: MERCK & CO., INC.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: FORMULACIONES ESTABILIZADAS DE PAPILOMAVIRUS HUMANO

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 35

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(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Merck & Co., Inc.

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

CALLE: P.O. Box 2000, RY60-30

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Rahway

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

ESTADO: NJ

\vskip0.333000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.333000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 07065-0907

\vskip0.666000\baselineskip

(v)

FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

MEDIO: disquete

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: Compatible con PC de IBM

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN DE REPRESENTANTE/AGENTE:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Hand, J.Mark

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 36.545

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 19933Y

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 732/594-3905

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 732/594-4720

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 1:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 164 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

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(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAGATCTCA CAAAACAAAA TGTGGCGGCC TAGCGACAGC ACAGTATATG TGCCTCCTCC

\hfill

60

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\hskip-.1em\dddseqskip

TAACCCTGTA TCCAAAGTTG TTGCCACGGA TGCTTATGTT AAACGCACCA ACATATTTTA

\hfill

120

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCATGCCAGC AGTTCTAGAC TTCTTGCAGT GGGTCATCCT TATT

\hfill

164

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 2:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 156 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTCCATAAA AAAGGTTAAC AAAACTGTTG TGCCAAAGGT GTCAGGATAT CAATACAGAG

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATTTAAGGT GGTGTTACCA GATCCTAACA AATTTGCATT GCCTGACTCG TCTCTTTTTG

\hfill

120

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCCCACAAC ACAACGTTTG GTATGGGCAT GCATGT

\hfill

156

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 3:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 136 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACATGCATGC ACAGGCCTAG AGGTGGGCCG GGGACAGCCA TTAGGTGTGG GTGTAAGTGG

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACATCCTTTA CTAAATAAAT ATGATGATGT TGAAAATTCA GGGGGTTACG GTGGTAACCC

\hfill

120

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGACAGGAT AACAGG

\hfill

136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 4:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 127 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTAATGTAG GTATGGATTA TAAACAAACA CAATTATGCA TGGTTGGATG TGCCCCCCCT

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGGCGAGC ATTGGGGTAA AGGTACACAG TGTAGTAATA CATCTGTACA GAATGGTGAC

\hfill

120

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCCCGC

\hfill

127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 5:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 125 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 5:

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTTAGAACT TATTACCAGT GTTATACAGG ATGGCGATAT GGTTGACACA GGCTTTGGTG

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTATGAATTT TGCTGATTTG CAGACCAATA AATCAGATGT TCCTCTTGAC ATATGTGGCA

\hfill

120

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTGTA

\hfill

125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 6:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 116 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGTAAATATC CAGATTATTT ACAAATGGCT GCAGACCCAT ATGGTGATAG ATTATTTTTT

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TATCTACGGA AGGAACAAAT GTTTGCCAGA CATTTTTTTA ACAGGGCTGG TACCCC

\hfill

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 7:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 124 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGTACCGT GGGGGACCT GTGCCTGATG ATCTTTTAGT TAAGGGTGGT AACAATCGCT

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTCTGTAGC GAGTAGTATA TATGTTCACA CCCCAAGCGG CTCTTTGGTG TCCTCTGAGG

\hfill

120

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACA

\hfill

124

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 8:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 113 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTGTTTAAT AAGCCATATT GGCTACAAAA AGCCCAGGGA CATAACAATG GTATTTGTTG

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGTAATCAT CTGTTTGTTA CTGTGGTAGA TACCACACGC AGTACCAACA TGA

\hfill

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 9:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 113 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GATTATGTGC ATCCGTATCT AAATCTGCCA CATACACCAA TTCTGATTAT AAAGAGTACA

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCGTCATGT GGAAGAGTTT GATTTACAAT TTATTTTTCA ATTATGTAGC ATT

\hfill

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 10:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 105 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACATTGTCTG CTGAAGTAAT GGCCTATATT CACACAATGA ATCCCTCTCGT TCTCGAGGAC

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGAACTTTG GGTTATCGCC TCCCCCAAAT GGTACACTCG AGCGG

\hfill

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 11:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 155 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGCTCGAGG ATACCTATAG GTATGTGCAG TCACAGGCCA TTACCTGTCA AAAGCCCACT

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCTGAAAAGG AAAAGCAAGA TCCCTATAAG GACATGAGTT TTTGGGAGGT TAATTTAAAA

\hfill

120

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAAAGTTTT CTAGTGAATT GGATCAGTTT CCTTT

\hfill

155

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 12:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 134 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 12:

\newpage

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGACGCAAG TTTTTGTTAC AAAGTGGATA TAGGGGACGG ACCTCTGCTC GTACCGGTAT

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAAGCGCCCT GCTGTTTCCA AACCCTCTAC TGCCCCTAAA CGTAAGCGCA CCAAAACTAA

\hfill

120

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAGTAAGAT CTTC

\hfill

134

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 13:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 154 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAAGATCTTA CTTTTTAGTT TTGGTGCGCT TACGTTTAGG GGCAGTAGAG GGTTTGGAAA

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAGCAGGGCG CTTAATACCG GTACGAGCAG AGGTCCGTCC CCTATATCCA CTTTGTAACA

\hfill

120

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAACTTGCG TCCCAAAGGA AACTGATCCA ATTC

\hfill

154

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 14:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 135 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTAGAAAAC TTTTCTTTTA AATTAACCTC CCAAAAACTC ATGTCCTTAT AGGGATCTTG

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTTTCCTTT TCAGGAGTGG GCTTTTGACA GGTAATGGCC TGTGACTGCA CATACCTATA

\hfill

120

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTATCCTCG AGCGG

\hfill

135

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 15:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 125 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGCTCGAGT GTACCATTTG GGGGAGGCGA TAACCCAAAG TTCCAGTCCT CGAGAACAGA

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGATTCATT GTGTGAATAT AGGCCATTAC TTCAGCAGAC AATGTAATGC TACATAATTG

\hfill

120

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAAAA

\hfill

125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 16:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 113 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAAATTGTAA ATCAAACTCT TCCACATGAC GCATGTACTC TTTATAATCA GAATTGGTGT

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGTGGCAGA TTTAGATACG GATGCACATA ATGTCATGTT GGTACTGCGT GTG

\hfill

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 17:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 113 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATCTACCA CAGTAACAAA CAGATGATTA CCCCAACAAA TACCATTGTT ATGTCCCTGG

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTTTTTGTA GCCAATATGG CTTATTAAAC AATTGTGCCT CAGAGGACAC CAA

\hfill

113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 18:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 104 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAGCCGCTT GGGGTGTGAA CATATATACT ACTCGCTACA GACGAGCGAT TGTTACCACC

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTAACTAAA AGATCATCAG GCACAGGTTC CCCCACGGTA CCCC

\hfill

104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 19:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 136 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGTACCAG CCCTGTTAAA AAAATGTCTG GCAAACATTT GTTCCTTCCG TAGATAAAAA

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATAATCTAT CACCATATGG GTCTGCAGCC ATTTGTAAAT AATCTGGATA TTTACATACA

\hfill

120

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGCCACATA TGTCAA

\hfill

136

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 20:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 125 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGGAACATC TGATTTATTG GTCTGCAAAT CAGCAAAATT CATAGCACCA AAGCCTGTGT

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAACCATATC GCCATCCTGT ATAACACTGG TAATAAGTTC TAAGGGGGGG CAGTCACCAT

\hfill

120

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCTGT

\hfill

125

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 21:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 127 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACAGATGTAT TACTACACTG TGTACCTTTA CCCCAATGCT CGCCCAAAGG GGGGGCACT

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAACCATGC ATAATTGTGT TTGTTTATAA TGGATACCTA CATTAACCCT GTTATCCTGT

\hfill

120

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAGGGT

\hfill

127

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 22:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 116 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TACCACCGTA ACCCCCTGAA TTTTCAACAT CATCATATTT ATTTAGTAAA GGATGTCCAC

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTACACCCAC ACCTAATGGC TGTCCCCGGC CCACCTCTAG GCCTGTGCAT GCATGT

\hfill

116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 23:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 170 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACATGCATGC CCATACCAAA CGTTGTGTTG TGGGATCAAA AAGAGACGAG TCAGGCAATG

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CAAATTTGTT AGGATCTGGT AACACCACCT TAAATACTCT GTATTGATAT CCTGACACCT

\hfill

120

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGGCACAAC AGTTTTCTTA ACCTTTTTTA TGGAATAATA AGGATGACCC

\hfill

170

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 24:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 150 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACTGCAAGAA GTCTAGAACT GCTGGCATGA TAAAATATGT TGGTGCGTTT AACATAAGCA

\hfill

60

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCGTGGCAA CAACTTTGGA TACAGGGTTA GGAGGAGGCA CATATACTGT GCTGTCGCTA

\hfill

120

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCCGCCACA TTTTGTTTTG TGAGATCTTC

\hfill

150

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 25:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAATTCACA TGCATGCACA GGCCTAG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 26:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAATTCGGG GTACCAGCCC TGTTAA

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 27:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGAAGACTG GAACTTTGGG TTATCGCCTC CCCCAAATGG TACAC

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 28:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGAGCTGTAC CATTTGGGGG AGGCGATAAC CCAAAGTTCC AGTCT

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 29:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 45 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCAGATCTC ACAAACAAA ATGTGGCGGC CTAGCGACAG CACAG

\hfill

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 30:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 35 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGAGATCTT ACTTTTTGGT TTTGGTACGT TTTCG

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 31:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 34 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGAGATCTT ACCTTTTAGT TTTGGCGCGC TTAC

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 32:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTAAAGCTT ATGTCACTTT CTCTTGTATC G

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 33:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGATAAGCTT GCTCAATGGT TCTCTTCCTC

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 34:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGTCATCCC AAATCTTGAA A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.666000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 35:

\vskip0.666000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.333000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.333000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.666000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otros ácidos nucleicos

\vskip0.333000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc= "oligómero sintético de ADN"

\vskip0.666000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC Nº ID 35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACCGTAGTG TTTGGAAGCG A

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

Claims (14)

1. Una formulación de vacuna de antígeno de papilomavirus humano que está exenta de coadyuvantes que contienen alímina y que se estabiliza frente a la agregación de antígeno a temperaturas por encima de 0ºC, que comprende:

(a) un componente de vacuna que comprende partículas viroides de papilomavirus humano que comprenden proteína L1 o proteína L1 y L2;

(b) una sal seleccionada de cloruro de sodio, sulfato de sodio, sulfato de amonio, acetato de sodio, citrato de sodio y fosfato de sodio, que está presente a una concentración fisiológica aceptable; y

(c) un tensioactivo no iónico presente a una concentración fisiológicamente aceptable.

2. La formulación de antígeno de la reivindicación 1, en la que dichas partículas viroides de papilomavirus humano se seleccionan del grupo de tipos de papilomavirus humano constituido por 6a, 6b, 11, 16, 18 y cualquier combinación de los mismos.

3. La formulación de antígeno de la reivindicación 2, en la que dicha sal es cloruro de sodio.

4. La formulación de antígeno de la reivindicación 3, en la que el cloruro de sodio está presente a una concentración de 50 mM a 500 mM.

5. La formulación de antígeno de la reivindicación 3, en la que el cloruro de sodio está presente a una concentración de 150 mM a 300 mM.

6. La formulación de antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho tensioactivo no iónico se selecciona del grupo de tensioactivos no iónicos constituido por polisorbatos, polioxietilenalquiléteres, Triton X-100®, Triton 114®, NP40®, Span 85 y Pluronic 121.

7. La formulación de antígeno de la reivindicación 6, en la que dicho polisorbato es un polisorbato 80.

8. La formulación de antígeno de la reivindicación 7, en la que el polisorbato 80 está presente a una concentración de hasta 0,2% p/v.

9. La formulación de antígeno de la reivindicación 7, en la que el polisorbato 80 está presente a una concentración de hasta 0,01% p/v.

10. Una formulación de antígeno de papilomavirus humano según la reivindicación 1 que comprende:

(a) una población de partículas viroides de papilomavirus humano que comprende la proteína L1 de papilomavirus humano que se selecciona del grupo constituido por 6a, 6b, 11, 16 y 18;

(b) cloruro de sodio a una concentración de 150 mM a 300 mM; y

(c) polisorbato 80 a una concentración de hasta 0,1% p/v.

11. Un procedimiento de estabilización de una población de partículas viroides purificadas derivadas de proteína L1 o L1 y L2 de papilomavirus humanos a temperaturas superiores a 0ºC durante un periodo de tiempo de al menos un mes, que comprende disponer dichas partículas viroides purificadas en una formulación que contiene cloruro de sodio a una concentración de 50 mM a 500 mM y polisorbato 80 a una concentración de hasta 0,2% p/v.

12. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la formulación de vacuna comprende cloruro de sodio en un intervalo de concentración de 150 mM a 300 mM.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que el polisorbato 80 está presente a una concentración de hasta 0,1% p/v.

14. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicha formulación es estable a temperaturas de 2ºC a 8ºC durante un periodo de al menos un mes.