CN108201623A - 人乳头瘤病毒重组四价疫苗、其制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人乳头瘤病毒重组四价疫苗、其制备方法及其应用。本发明人应用毕赤酵母表达系统制备获得人乳头瘤病毒的病毒样颗粒，在此基础上制备四价的人乳头瘤病毒疫苗，所述的疫苗具有良好的免疫原性。

Description

人乳头瘤病毒重组四价疫苗、其制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术、重组新型疫苗领域，涉及人乳头瘤病毒重组四价疫苗、其制备方法及其应用。

背景技术

宫颈癌在世界范围内是排名第三的女性易发癌症，世界卫生组织曾公布全世界每年有超过47万新发宫颈癌病例，其中中国约占28％，且发病率有低龄化趋势。宫颈癌严重威胁我国各年龄段女性，尤其是育龄女性的生命健康，我国亟需有效的宫颈癌预防、筛查、治疗措施和体系。

然而，宫颈癌又是当前唯一病因明确的恶性肿瘤。多年的研究表明高危型人乳头瘤病毒的持续性感染与宫颈癌的发生密切相关，90％以上的宫颈癌伴有高危型HPV感染。

HPV属于Papillomaviridae病毒科，是一类无包膜的双链DNA病毒，病毒颗粒直径在50nm左右。依据病毒结构蛋白L1的序列差异性进行分类，可将HPV分为130余种基因型。不同型的HPV病毒有着严格的组织感染特异性及致病性，感染生殖道黏膜组织的HPV依据致病性不同分为黏膜高危型和黏膜低危型两类。临床上常见的黏膜高危型HPV有16、18、31、33、45、52、58等型，这些基因型HPV的持续性感染可诱发宫颈组织发生病理性增生及病变，组织细胞发生转化，最终发展为宫颈癌，其中16、18两型病毒的感染与90％以上的宫颈癌发生相关。黏膜低危型HPV的感染可在生殖道中形成生殖器疣或引发局部炎症反应，间接促进高危型HPV的感染，黏膜低危型HPV包括6、11、13、32、34等型。

因此，预防和控制高危型HPV病毒的持续性感染是预防宫颈癌发生的重要手段。超过半数的人在一生中被侵染黏膜的HPV病毒感染过，由于个人遗传因素、机体状态、感染环境等因素的不同，一部分HPV感染为一过性的，很快被机体清除，而另一部分感染可能发展为持续性的慢性感染。实验证明，针对某一基因型的中和抗体可有效防止该型病毒侵染细胞，因此能够激活体液免疫并产生中和保护抗体的特异性HPV疫苗可有效预防特定HPV感染，从而有效降低宫颈癌发生的风险。

原核表达产生的L1蛋白有错误折叠倾向，需要在纯化后进行变复性操作，才能获得病毒样颗粒，操作条件复杂、难控制。目前国内外已有使用毕赤酵母研发HPV病毒样颗粒疫苗的报道，但还未有基于毕赤酵母研制四价疫苗的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供毕赤酵母来源的人乳头瘤病毒(HPV)的病毒样颗粒多价疫苗的表达、纯化、免疫保护性检测及其应用等相关技术

在本发明的第一方面，提供一种制备人乳头瘤病毒的四价疫苗的方法，所述方法包括：

(1)提供表达载体，所述的表达载体分别包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4所示的DNA序列(较佳地形成4种重组表达载体)，能表达所述DNA序列所编码的蛋白；

(2)将步骤(1)的表达载体转入毕赤酵母中，进行表达，获得人乳头瘤病毒6的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒11的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒16的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒18的L1蛋白的病毒样颗粒；

(3)混合步骤(2)获得的人乳头瘤病毒6的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒11的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒16的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒18的L1蛋白的病毒样颗粒，获得人乳头瘤病毒的四价疫苗。

在一个优选例中，所述的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的DNA序列包含于表达盒中，也即它们分别与启动子以及终止子等表达元件操作性连接。

在另一优选例中，步骤(1)中，以pPink-HC为表达载体。

在另一优选例中，步骤(2)中，进行诱导表达；较佳地以甲醇进行诱导表达；更佳地，诱导表达的方法是：1％甲醇诱导24±4h，之后补充0.6-1％终浓度的甲醇后继续培养24±4小时

在另一优选例中，步骤(3)中，人乳头瘤病毒6的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒11的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒16的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒18的L1蛋白的病毒样颗粒以(0.5～2):(0.5～2):(0.5～2):(0.5～2)的比例混合。

在另一优选例中，步骤(3)中，病毒样颗粒的直径大小为50nm左右。

在另一优选例中，步骤(3)后，还包括纯化病毒样颗粒的步骤；较佳地，纯化方法包括：破碎菌体后，加入NP40(较佳地终浓度0.5-2％)搅拌混匀，之后加入PEG8000沉淀VLP，搅拌10-40小时，离心收集沉淀，PBS重溶、搅拌10-40小时，离心收集上清。

在本发明的另一方面，提供一种人乳头瘤病毒的四价疫苗组合物，该疫苗组合物包括以(0.5～2):(0.5～2):(0.5～2):(0.5～2)的比例混合的人乳头瘤病毒6的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒11的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒16的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒18的L1蛋白的病毒样颗粒。

在一个优选例中，所述的人乳头瘤病毒的四价疫苗以所述的方法制备获得。

在另一优选例中，所述的组合物还含有免疫佐剂，较佳地，所述的免疫佐剂是氢氧化铝佐剂。

在本发明的另一方面，提供所述的人乳头瘤病毒的四价疫苗组合物的用途，用于制备抑制人乳头瘤病毒的药物或药盒。

在本发明的另一方面，提供一种用于抑制人乳头瘤病毒的药盒，所述药盒含有所述的人乳头瘤病毒的四价疫苗组合物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、四种基因型HPV-L1表达载体的构建示意图。

图2、HPV16-L1转化菌株Western Blot检测结果。Lane A表示不电转pPink-HC空载体的毕赤酵母，Lane B表示电转pPink-HC空载体的毕赤酵母。Lane 1～22表示筛选到的HPV16-L1转化菌株，其中Lane6和Lane21表示筛选出的高拷贝高表达HPV16-L1转化菌株。

图3、HPV18-L1转化菌株的ELISA检测结果。对照为电转pPink-HC空载体的毕赤酵母，1～23表示筛选到的HPV18-L1转化菌株，5和7号表示筛选出的高拷贝高表达HPV18-L1转化菌株。

图4、在诱导表达后不同时间点收集菌样破碎处理，之后进行Western Blot检测的结果。

图5、HPV16-6号菌株VLP蔗糖梯度(F1-F12)考马斯亮蓝染色和Western-blot检测结果。蔗糖梯度为0％-60％。

图6、HPV18-7号菌株VLP蔗糖梯度(F1-F12)考马斯亮蓝染色和Western-blot检测结果。

图7、HPV6蔗糖梯度考马斯亮兰染色结果。

图8、HPV11蔗糖梯度考马斯亮兰染色结果。

图9、HPV16-VLP电镜结果，Bar值均为100nm。

图10、HPV18-VLP电镜结果，Bar值均为100nm。

图11、HPV6-VLP电镜结果，Bar值均为100nm。

图12、HPV11-VLP电镜结果，Bar值均为100nm。

图13、小鼠单次免疫后2周取血，分离血清，检测各型HPV特异性IgG反应，HPV-VLP抗原与抗血清ELISA检测实验结果。

图14、核苷酸序列如SEQ ID NO:1但其中第7-9位的Kozak序列被替换为GAAACG的HPV16-L1转化菌株Western blot检测结果；Lane A表示不电转pPink-HC空载体的毕赤酵母，Lane B表示电转pPink-HC空载体的毕赤酵母；Lane 1～22表示筛选到的HPV16-L1转化菌株。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，通过表达方法的优化，应用毕赤酵母表达系统，制备获得人乳头瘤病毒的病毒样颗粒，在此基础上制备四价的人乳头瘤病毒疫苗。所述的疫苗具有良好的免疫原性(抗原性)。

如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽(本发明中为到人乳头瘤病毒6、11、16、18的蛋白)所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。

如本文所用，所述的“可操作性连接”或“操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

传统的疫苗在免疫原性、安全性、生产效率等方面都存在不足，不能满足现代社会的需求。病毒样颗粒(Virus Like Particles，VLP)是病毒蛋白自发组装形成的生物纳米颗粒，能够忠实模拟天然病毒粒子的结构，诱导良好的B细胞和T细胞反应。此外，VLP不含有病原体的遗传物质，具有更佳的安全性。因此本发明人致力于开发新型的基于病毒样颗粒的人乳头瘤病毒疫苗。

酵母表达系统，特别是毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统，具有低成本、高表达量的优点，且能以接近高等真核细胞的方式进行糖基化修饰，是一种非常适宜于工业化生产的表达系统。然而本发明人在研究初期发现，应用酵母表达系统、在不经优化的情况下不能制备产量高形态好的人乳头瘤病毒的病毒样颗粒，需要加以优化；并且单价或两价的疫苗免疫效果尚不够理想。

本发明人在研究中发现，形态不好、颗粒过小或过大的人乳头瘤病毒的病毒样颗粒，应用于免疫时效果不理想，免疫原性低；这就需要选择良好的表达系统以及表达方法。经过深入的研究，本发明人提出了一种基于毕赤酵母表达系统制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，所述方法包括：(1)提供表达载体，所述的表达载体分别包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的DNA序列(较佳地形成4种重组表达载体)，能表达所述DNA序列所编码的蛋白；(2)将步骤(1)的表达载体转入毕赤酵母中，进行表达，获得人乳头瘤病毒6的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒11的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒16的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒18的L1蛋白的病毒样颗粒；(3)混合步骤(2)获得的人乳头瘤病毒6的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒11的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒16的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒18的L1蛋白的病毒样颗粒，获得人乳头瘤病毒的四价疫苗。

所述的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示DNA序列是经过密码子优化的序列，能够实现高效的表达。在密码子优化方面，本发明人遵循密码子在酵母细胞中的优势表达原则的基础上，还进行了个性化、独特的优化。经过综合考虑和特异性选择，使密码子优化后的重要参数与优化前对比达到最佳状态。并且，使用ACC作为HPV16-L1、HPV18-L1的Kozak序列。经过改造，有利于在表达过程中获得理想的加工、修饰，进而包装成理想的病毒样颗粒。

含有所述的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示DNA序列的表达盒通过酵母表达载体引入到毕赤酵母细胞中。所述的酵母表达载体优选地为pPink-HC为表达载体。pPink-HC为高拷贝质粒，携带Ade2基因作为营养缺陷筛选标记，相对于抗生素筛选在大规模培养时可保证转化菌株表达外源蛋白的稳定性。所述的表达盒可藉由同一个表达载体引入到酵母细胞中，或者可藉由不同的表达载体引入到毕赤酵母细胞中。较佳地形成4种重组表达载体，分别引入到毕赤酵母细胞中，分别表达病毒样颗粒，之后混合为四价的人乳头瘤病毒疫苗。

作为本发明的优选方式，所述的方法包括：分离(纯化)所获得的病毒样颗粒的步骤。较佳地，可采用离心的方法来纯化这些病毒样颗粒。更佳地，纯化病毒样颗粒的步骤包括：破碎菌体，加入NP40(较佳地终浓度0.5-2％)搅拌混匀，之后加入PEG8000沉淀VLP，搅拌10-40小时，离心收集沉淀，PBS重溶、搅拌10-40小时，离心收集上清。

作为本发明的优选方式，利用甲醇诱导表达人乳头瘤病毒6、11、16、18的病毒样颗粒。

作为本发明的优选方式，所述的表达盒是诱导型表达盒；较佳地，所述的诱导型表达盒是以甲醇为诱导表达试剂的表达盒。更佳地，所述的表达盒中，以甲醇诱导型启动子作为启动子。一种优选的启动子为AOX启动子。甲醇在培养基中的浓度可以为按照体积比0.2～2％；较佳地为0.3～1.5％；更佳地为0.6～1％。

在本发明的具体实施例中，本发明人通过将目的蛋白诱导表达后，在毕赤酵母中完成病毒样颗粒的包装。之后，纯化该病毒样颗粒，并通过透射电镜研究其结构。观察到成功包装获得重组的病毒样颗粒，该病毒样颗粒为直径50±10nm左右的颗粒。进一步地，本发明人还尝试不同诱导表达条件，优化病毒样颗粒的表达纯化条件。经免疫小鼠、检测体液免疫反应验证该新型疫苗的免疫原性。结果发现，1％甲醇诱导24±4h，之后补充0.6-1％终浓度的甲醇后继续培养24±4小时是最佳的诱导表达条件，该重组病毒颗粒疫苗可诱导良好的特异性免疫应答。

本发明优化的毕赤酵母表达系统拥有明显优势：可以进行高密度发酵，在表达产量上远高于应用酿酒酵母等其它酵母系统，并且病毒样颗粒的形态均匀、免疫原性高。与杆状病毒表达系统相比，杆状病毒表达系统在大规模生产时需要大量高滴度的重组杆状病毒，且产物中杆状病毒组分不易完全去除，因此本发明应用的毕赤酵母表达系统的生产成本远低于杆状病毒表达系统。

本发明还提供一种具有免疫原性的组合物(预防性或治疗性疫苗)，所述的组合物包含：以(0.5～2):(0.5～2):(0.5～2):(0.5～2)的比例混合的人乳头瘤病毒6的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒11的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒16的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒18的L1蛋白的病毒样颗粒，以及药学上可接受的载体。本发明的疫苗具有安全性好、免疫原性高、制备简单、价格便易等优点。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。

可将所述的组合物(四价疫苗组合物)制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂。

在使用时，是将安全有效量的本发明所述的四价疫苗施用于哺乳动物(如人)，其中该安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明获得的病毒样颗粒，拥有与病毒颗粒相似的免疫原性。本发明的四价疫苗可诱导机体产生针对人乳头瘤病毒6、11、16、18的中和抗体，可有效防止各型病毒侵染细胞。因此，本发明的四价疫苗能够激活体液免疫并产生中和保护抗体的特异性HPV疫苗可有效预防特定HPV感染，从而有效降低宫颈癌发生的风险。

基于本发明揭示的新产品，本发明还提供了一种用于抑制人乳头瘤病毒的药盒或试剂盒，所述药盒含有所述的人乳头瘤病毒的四价疫苗组合物。较佳地，所述的药盒或试剂盒中，还包括使用说明书，以便于本领域技术人员或临床医师方便地使用本发明的产品。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

I、实验材料

1.1菌株

大肠杆菌DH5α，获自Invitrogen；

毕赤酵母PichiaPink Strain1，获自Invitrogen。

1.2表达载体

pPink-HC，获自Invitrogen。

1.3分子生物学试剂及材料

限制性内切酶：KpnI、EcoRI、EcoNI、SpeI、BsaBI，获自New England Biolabs。

DNA连接酶：T4 DNA Ligase，获自TAKARA。

DNA序列合成：获自南京金斯瑞生物科技。

1.4培养基

Luria-Bertani(LB)液体培养基：1％(w/v)胰蛋白胨(OXIOD)，0.5％(w/v)酵母抽提物(OXIOD)，1％(w/v)氯化钠(国药)，pH7.0；对于其平板固体培养基，在液体培养基的基础成分中再加入1.5％(w/v)琼脂粉。含有氨苄青霉素(Amp)的培养基的抗生素工作浓度为100μg/ml。

YPD液体培养基：1％(w/v)酵母抽提物(OXIOD)，2％(w/v)细菌蛋白胨(BD)，2％(w/v)D-葡萄糖(Sigma)，pH6.0；对于其平板固体培养基，在液体培养基的基础成分中再加入2％(w/v)琼脂粉。

YPDA液体培养基：1％(w/v)酵母抽提物(OXIOD)，2％(w/v)细菌蛋白胨(BD)，2％(w/v)D-葡萄糖(Sigma)，0.2％(w/v)adenine hemisulfate，pH6.0；对于其平板固体培养基，在液体培养基的基础成分中再加入2％(w/v)琼脂粉。

BMGY液体培养基：1％(w/v)酵母抽提物(OXIOD)，2％(w/v)细菌蛋白胨(BD)，1％(v/v)甘油(国药)，0.34％(w/v)酵母氮源(生工生物)，1％(w/v)硫酸铵(国药)，0.00004％(w/v)生物素(Sigma),100mM磷酸氢二钾，磷酸二氢钾缓冲剂(国药)，pH6.0。

BMMY液体培养基：1％(w/v)酵母抽提物(OXIOD)，2％(w/v)细菌蛋白胨(BD)，0.5％(v/v)甲醇(国药)，0.34％(w/v)酵母氮源(生工生物)，1％(w/v)硫酸铵(国药)，0.00004％(w/v)生物素(Sigma)，100mM磷酸氢二钾，磷酸二氢钾缓冲剂(国药)，pH6.0。

菌种保存液：YPD液体培养基，25％甘油。

1.5酵母转化试剂

感受态制备Buffer1：YPD，0.2M HEPES(国药)，pH8.0，25mM DTT(Amresco)。

感受态制备Buffer2：12mM HEPES(国药)，pH8.0。

感受态制备Buffer3：1M山梨醇(国药)。

1.6纯化相关试剂

PBS溶液：137mM氯化钠(国药)，2.7mM氯化钾(国药)，10mM磷酸氢二钠(国药)，2mM磷酸二氢钾(国药)，pH7.4。

酵母小量裂解液：150mM氯化钠(国药)，5％(v/v)甘油(国药)，50mM磷酸氢二钠(国药)，pH7.4。

lysis buffer：400mM氯化钠(国药)，50mM磷酸氢二钠(国药)，1mM PMSF(Amresco)，pH7.0。

抗体：Anti-HPV16-L1单抗(Abcam30908)，Anti-HPV18-L1单抗(Abcam31492)，Anti-HPV-L1抗体(Dako M3528)，anti-mouse IgG-HRP(Sigma)。

1.7电镜实验相关试剂

铜网wash buffer：2mM EDTA(国药)。

醋酸双氧铀染色液：2％(w/v)醋酸双氧铀。

1.8免疫学实验相关试剂

PBST溶液：137mM氯化钠(国药)，2.7mM氯化钾(国药)，10mM磷酸氢二钠(国药)，2mM磷酸二氢钾(国药)，0.05％(v/v)Tween20，pH7.4。

封闭液：PBST溶液，2％(w/v)BSA(鼎国昌盛)。

稀释液：PBST溶液，0.2％(w/v)BSA(鼎国昌盛)。

佐剂：Imject Alum(Thermo)。

TMB显色液(Life Techologies)。

终止液：2M硫酸。

II、实施例

实施例1、重组表达菌株的制备

1、HPV6-L1、HPV11-L1、HPV16-L1、HPV18-L1表达载体的构建

分别获得HPV6-L1、HPV11-L1、HPV16-L1、HPV18-L1的基因序列，对这些序列分别进行独特的密码子优化，在优化时，本发明人按照酵母细胞表达的偏好性并结合表达比较及后续效果比较的结果，对DNA序列进行精细的调整，以期使得后续病毒样颗粒生产过程中表达结果稳定、表达量高，获得的病毒样颗粒符合要求。

本发明人还优化了Kozak序列，使用ACC作为HPV16-L1、HPV18-L1的Kozak序列，经比较分析，该Kozak序列较传统的Kozak序列GAAACG表达量更高。

经过广泛的研究比较，本发明人优化的序列如下：

HPV16-L1优化后的序列如SEQ ID NO:1所示(其中第7-9位的ACC为Kozak序列)；

HPV18-L1优化后的序列如SEQ ID NO:2所示(其中第7-9位的ACC为Kozak序列)；

HPV6-L1优化后的序列如SEQ ID NO:3(其中第7-12位的GAAACG为Kozak序列)；

HPV11-L1优化后的序列如SEQ ID NO:4(其中第7-12位的GAAACG为Kozak序列)。

载体质粒pPink-HC分别使用限制性内切酶EcoRI/KpnI进行双酶切，回收酶切产物，使用T4 DNA连接酶分别将SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4与载体pPink-HC进行连接。

将连接产物转化进入DH5α感受态细菌，涂布于氨苄抗性LB平板，37℃孵育过夜后，挑去单克隆菌落，使用氨苄抗性LB液体培养基摇菌并抽提质粒，进行酶切、测序鉴定。

结果，分别得到表达质粒pPink-HC-HPV16-L1、pPink-HC-HPV18-L1、pPink-HC-HPV6-L1和pPink-HC-HPV11-L1，这些重组表达载体的结构示意图如图1。筛选标记采用营养缺陷互补基因ADE2。

2、Pichia Strain1菌株感受态细胞的制备

将冻存的Strain1菌种划线活化于YPDA平板培养基，30℃孵育3-4天。挑去单克隆菌落接种于5ml液体YPDA培养基，30℃280rpm过夜培养，次日以OD600值为0.2的初始浓度接种于50ml液体YPDA培养基，30℃280rpm培养至OD600达到1至1.3。以1500g 4℃5min的离心条件收集菌体，重悬于5ml感受态制备Buffer1，30℃孵育15至20min，之后与30ml冰水混合，以1500g 4℃5min的离心条件收集菌体。菌体重悬于30ml预冷的感受态制备Buffer2，以1500g 4℃5min的离心条件收集菌体。菌体重悬于3ml预冷的感受态制备Buffer3，以1500g4℃5min的离心条件收集菌体。菌体重悬于0.2ml预冷的感受态制备Buffer3中，置于冰上待用。

3、HPV6-L1、HPV11-L1、HPV16-L1、HPV18-L1转化子表达菌株的制备

将分别经过内切酶EcoNI、SpeI线性化处理的pPink-HC-HPV16-L1、pPink-HC-HPV18-L1质粒DNA及经过内切酶BsaBI线性化处理的pPink-HC-HPV6-L1和pPink-HC-HPV11-L1表达质粒DNA 10至20μg分别与70μl上述Strain1感受态细胞混合，置于0.2cm BIORAD电击杯中，使用BIORAD micropulser电转仪进行转化，电击转化条件为2.0KV 1pulse，电击后加入1ml感受态制备Buffer3，30℃孵育2hour，收集菌体涂布于PAD平板培养基上，30℃孵育5天获得各型转化菌株若干。

挑取单克隆菌落若干分别接种于5ml YPD液体培养基中，30℃280rpm过夜培养，次日取200ul菌液与等体积的50％甘油混匀，液氮速冻后-80℃保存。

4、各基因型HPV-L1蛋白表达菌株的鉴定

取各型转化菌株于PAD平板划线活化，挑选单克隆于5ml BMGY液体培养基，30℃280rpm培养一天，次日离心去掉培养基，补加1ml BMMY(含1％甲醇)30℃280rpm诱导表达两天。离心得到各克隆菌体用150ul破碎缓冲液重悬，加等体积玻璃珠用组织匀浆器在60Hz条件下震荡240s破碎菌体。破碎后的样品经12000rpm 4℃10min离心后，取上清用于WesternBlot或ELISA检测。

在Western Blot实验中，以Anti-HPV16-L1单抗为HPV6-L1一抗，以Anti-HPV-L1抗体为HPV11-L1一抗。在ELISA实验中以Anti-HPV16-L1、Anti-HPV18-L1单抗为一抗，anti-mouse IgG-HRP作为二抗，化学发光法显色。实验结果用以确定各表达株表达量。

为检测表达株的最佳诱导时间，在诱导表达开始后在不同时间点取300ul菌液并加入终浓度0.6％的甲醇，样品菌体处理方法如上，Western Blot检测表达量。

依照上述方法获得的转化菌株破碎处理后，Western blot检测结果显示如图2，可见成功获得HPV16-L1表达株。

依照上述方法获得的转化菌株破碎处理后，HPV18-L1转化菌株的ELISA检测结果如图3。

如图14所示为Kozak序列为GAAACG的HPV16-L1转化菌株Western blot检测结果。Lane A表示不电转pPink-HC空载体的毕赤酵母，Lane B表示电转pPink-HC空载体的毕赤酵母。Lane 1～22表示筛选到的HPV16-L1转化菌株。与图2所示Kozak序列为ACC的HPV16-L1转化菌株Western blot检测结果比较，Kozak序列为ACC的菌株表达HPV16-L1蛋白大小更均一(应为58KDa)，在40～50KDa之间无多余条带，且表达量更高，说明优化后的序列更利于获得高产量更均一的人乳头瘤病毒样颗粒。

HPV18-L1的病毒样颗粒也如此，Kozak序列为ACC的菌株表达HPV18-L1蛋白大小更均一，无多余条带，且表达量高。

实施例2、获得病毒样颗粒

1、HPV-L1的诱导表达

以下方法适用于上述四种HPV-L1菌株的诱导表达。

将筛选得到的高表达毕赤酵母甘油菌在YPD平板上划线，30℃孵育4天。挑单菌落于5ml BMGY液体培养基，29℃290rpm培养过夜，次日转接入200ml BMGY液体培养基，此时初始OD600值约为0.2。

上述培养液29℃290rpm培养过夜，1500g室温离心15分钟，菌体重悬于200ml BMMY液体培养基(含1％甲醇)中28℃290rpm进行诱导表达。24小时后补充0.8％终浓度的甲醇，继续培养24小时后以3000g 4℃15min离心条件收集菌体，菌体可保存于-80℃冰箱。

在诱导表达后各时间点收集菌样破碎处理，Western Blot检测结果如图4。显示，虽然各基因型转化子菌株表达起始时间略有不同，但内含四种基因型的酵母菌株均能在各自的诱导周期内稳定表达特异性L1蛋白。

2、HPV-VLP的纯化

离心收集到的菌体用0.15M PBS清洗一遍，再用90ml 0.15M PBS重悬，使用高压破碎机破碎菌体，破碎条件为1300Bar 4℃4个循环。破碎后加入终浓度1％NP40，4℃搅拌1个小时。离心12000rpm 4℃15min，取上清。

上清中加入PEG8000沉淀VLP，4℃搅拌一天；次日离心4℃，12000rpm离心15min收集沉淀，沉淀再用90ml 0.15M PBS溶解，4℃搅拌一天，次日离心4℃，12000rpm离心15min收集上清。

使用Beckman SW28转头以27000rpm 4℃4hours的离心条件离心，离心管底部加入5ml 20％蔗糖垫(蔗糖溶液使用0.15M PBS配制)，弃上清，沉淀重悬于4ml 0.15M PBS。

4℃12000rpm离心10min收集上清，上清置于20％30％40％50％60％各2ml的蔗糖梯度上(蔗糖溶液使用0.15M PBS配制)，使用Beckman SW41转头以39000rpm 4℃3hours无刹车的离心条件离心。分管收集各梯度组分，运用SDS-PAGE实验鉴定VLP所在梯度组分。

收集含有VLP的组分使用Beckman SW28转头以27000rpm 4℃4hours的离心条件离心，离心管底部加入5ml 20％蔗糖垫，弃上清取沉淀，沉淀重悬于0.15M PBS。

SDS-PAGE检测纯度并使用BCA法或Bradford法定量蛋白质，分装保存于-80℃。

图5所示为HPV16-6号菌株VLP蔗糖梯度(F1-F12)考马斯亮蓝染色和Western-blot检测，图6所示为HPV18-7号菌株VLP蔗糖梯度(F1-F12)考马斯亮蓝染色和Western-blot检测。

图7、图8分别为HPV6、HPV11蔗糖梯度考马斯亮兰染色结果。

BCA定量HPV16-6号VLP产量为16mg/L，HPV6VLP产量为3.75mg/L,HPV11 VLP产量为5mg/L。Bradford定量HPV18-7号VLP产量为4.83mg/L。可见HPV的产量高，且这是远高于其它HPV表达系统的产量。

3、电镜实验

取10μl VLP(0.5-1.0mg/ml)加入终浓度0.01％的BSA，加样于200目铜网，使用2mMEDTA Na2溶液清洗铜网两次，使用醋酸双氧铀染色。使用120KV透射电镜观察样品。

图9～12分别为HPV16-VLP、HPV18-VLP、HPV6-VLP、HPV11-VLP电镜结果，Bar值均为100nm。

电镜结果表明，四种重组酵母菌株经诱导表达、纯化的L1蛋白都能组装成病毒样颗粒，状态完好，大小较为均匀，直径大小均为50nm左右，平均约为50nm。

本发明的方法获得的VLP较稳定，因为VLP大小比较均匀，直径均为50nm左右，而其它HPV表达系统获得的VLP大小一般在低于50nm的范围，如20-30nm，从而影响免疫原性。

实施例3、疫苗的免疫效果研究：小鼠免疫实验

6-8周龄BALB/C雌性小鼠，每组5只，经肌肉免疫各型HPV病毒样颗粒以及4价联合疫苗，即将5μg VLP与氢氧化铝佐剂等体积混合，4价联合免疫剂量为各型VLP各5μg与氢氧化铝佐剂等体积混合，分别在0、3、5周免疫，并在2、4、6周采血，分离血清用于抗体检测。

在ELISA抗体检测中，每孔用0.01M PBS包被300ng VLP作抗原，4℃过夜，加入封闭液37℃1小时。PBST冲洗4次后加入按一定比例稀释的血清，37℃孵育3小时，PBST冲洗4次，加入1:8000稀释的anti-mouse IgG-HRP，37℃1小时，PBST冲洗6次，加入50μl TMB显色液。5分钟后加入50μl终止液，酶标仪OD450读数。

所有小鼠单次免疫后2周取血，分离血清，检测各型HPV特异性IgG反应。HPV-VLP抗原与抗血清ELISA检测实验结果如图13。可见，各型HPV VLP疫苗单次免疫后就能诱导出高滴度的特异性免疫反应，四价疫苗免疫后则能诱导显著更高强度的免疫反应。

因此，本发明人制备的表达、纯化获得的各型HPV VLP疫苗以及四价联合疫苗具有良好的免疫原性。

实施例4、疫苗的免疫效果研究：红细胞凝集实验

HPV病毒具有凝聚血红细胞的特点，因此，本发明人利用红细胞凝聚实验来检验HPV VLP疫苗的抗原性。

取小鼠血液1ml于抗凝管中，加入9ml PBS 1000g 4℃5min，弃上清，加入10ml PBS重悬，1000g 4℃5min，重复三次后制成1％(v/v)红细胞悬液，将50μl红细胞与50μl VLP混匀置于V型板内，4℃静置3小时后观察结果。

HPV-VLP红细胞凝集实验结果显示：HPV6、11、16、18产生红细胞凝聚需要VLP的最低量分别为250ng、250ng、500ng和125ng。因此，各型HPV VLP都具有良好的抗原性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 无锡鑫连鑫生物医药科技有限公司

<120> 人乳头瘤病毒重组四价疫苗、其制备方法及其应用

<130> 168066

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1533

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> HPV16-L1优化后的序列

<400> 1

gaattcacca tgtcactttg gttgccatcc gaagctacag tctatttgcc tccagtccca 60

gtctctaagg ttgtcagtac cgacgagtat gttgctagaa ccaatatcta ctatcatgca 120

ggaacttcca gattgcttgc tgtcggtcac ccttactttc caattaagaa acctaacaac 180

aacaaaatct tggtcccaaa ggttagtgga cttcaataca gagtttttag aatccatttg 240

cctgatccaa acaagtttgg tttccctgat acatcattct acaacccaga cacccaaaga 300

ttggtctggg cttgtgttgg agtcgaagtt ggtagaggac agcctttggg tgttggaatt 360

tctggtcacc cattgcttaa caagttggat gacactgaaa acgcctccgc atacgctgcc 420

aatgctggtg ttgataacag agagtgcatc tcaatggact ataagcaaac ccagttgtgt 480

cttattggat gcaaaccacc tatcggtgaa cattggggta aaggatcacc ttgtacaaat 540

gtcgctgtta acccaggaga ttgcccacct ttggagctta ttaatacagt catccaagat 600

ggtgacatgg ttgataccgg ttttggagcc atggacttca ctacattgca ggcaaacaag 660

tcagaagtcc ctcttgatat ctgtactagt atctgcaagt accctgacta tattaagatg 720

gtttctgaac catacggaga ttccttgttt ttctatctta gaagagagca aatgttcgtt 780

agacatttgt tcaatagagc tggtgccgtc ggagagaacg ttcctgatga cttgtacatt 840

aaaggttcag gaagtactgc caatttggca tcttccaact attttcctac tccatctggt 900

tccatggtta catctgatgc tcaaattttc aataagccat actggttgca aagagcccag 960

ggtcacaata acggaatctg ttggggtaat cagttgtttg ttacagttgt cgacaccact 1020

agatcaacca acatgagttt gtgcgcagct atctcaacta gtgaaacaac ctacaagaac 1080

acaaacttca aggagtactt gagacatgga gaagagtatg atcttcaatt cattttccag 1140

ttgtgtaaga tcactcttac agctgacgtt atgacctaca ttcactctat gaactctact 1200

atcttggaag attggaactt tggtcttcaa ccacctccag gtggaacctt ggaggacact 1260

tatagattcg tcacttctca agcaattgct tgtcagaaac acacacctcc agctcctaag 1320

gaagatccat tgaagaaata cactttctgg gaagttaacc ttaaggagaa attctccgct 1380

gatttggacc aatttcctct tggaagaaag ttcttgcttc aggctggttt gaaggccaaa 1440

ccaaagttta ctcttggtaa aagaaaggcc actcctacta cctcatccac ctccactacc 1500

gccaaaagaa agaaaagaaa gttgtaaggt acc 1533

<210> 2

<211> 1539

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> HPV18-L1优化后的序列

<400> 2

gaattcacca tggccctttg gagaccttct gataacactg tttacttgcc acctccatcc 60

gtcgcaagag ttgtcaatac cgatgactac gttactagaa cctctatttt ctaccatgct 120

ggttcttcca gattgcttac tgttggaaac ccttatttca gagtcccagc aggtggaggt 180

aataagcaag atatcccaaa agtttccgct taccaatata gagtttttag agtccagctt 240

cctgatccaa acaagttcgg tttgcctgac acatcaatct acaacccaga aactcaaaga 300

ttggtttggg cctgtgcagg agtcgagatc ggacgtggtc agcctttggg agttggtctt 360

tctggtcatc cattttacaa caagttggat gacaccgaat caagtcacgc tgccacatca 420

aacgttagtg aggatgtcag agacaatgtt tccgtcgatt acaagcaaac acagttgtgt 480

atccttggat gcgctcctgc catcggtgaa cactgggcca agggaactgc atgtaaatca 540

agaccattga gtcaaggaga ttgccctcca ttggaactta agaatactgt tttggaggat 600

ggtgacatgg tcgacaccgg atacggtgct atggatttct caacccttca agacacaaag 660

tgtgaagttc ctttggatat ctgtcaatct atctgcaagt accctgacta tttgcagatg 720

tcagccgatc catatggtga cagtatgttt ttctgcttga gaagagagca actttttgct 780

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agtatcgtca cttctgattc ccaacttttt aataagccat actggttgca taaagctcaa 960

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ttggatcttg accaatatcc attgggtaga aagttccttg ttcaggctgg attgagaaga 1440

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<210> 3

<211> 1521

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> HPV6-L1优化后的序列

<400> 3

gaattcgaaa cgatgtggag accttccgat agtaccgttt atgttcctcc tcctaatcct 60

gtttcaaaag tcgtcgcaac cgatgcttac gttacaagaa caaatatttt ctaccatgcc 120

tcttcctcaa gattgcttgc agttggtcac ccttattttt caatcaagag agctaacaag 180

actgttgtcc caaaggtttc tggttaccaa tatagagtct tcaaggttgt cttgcctgat 240

ccaaacaaat tcgccttgcc tgatagttct ctttttgacc caactacaca aagattggtt 300

tgggcatgta ctggacttga ggtcggtaga ggacagcctt tgggtgttgg agtctctggt 360

catccatttt tgaataagta cgatgacgtt gaaaacagtg gatctggtgg aaatcctggt 420

caagataaca gagttaatgt cggtatggac tataaacaaa ctcagctttg tatggttgga 480

tgcgctccac ctttgggaga gcactggggt aaaggaaaac aatgtaccaa cactccagtt 540

caggccggag attgcccacc tttggaactt attacttccg ttatccaaga tggtgacatg 600

gtcgatacag gtttcggagc catgaacttt gcagacttgc agactaataa gtctgatgtt 660

cctattgaca tctgtggaac cacttgcaaa taccctgatt atttgcaaat ggctgccgat 720

ccatacggtg acagattgtt tttctttctt agaaaggagc agatgtttgc tagacatttc 780

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agttctgaag cacaactttt caacaagcca tattggttgc aaaaagctca gggtcacaac 960

aatggaatct gttggggtaa tcaattgttt gttactgttg tcgatacaac cagatccact 1020

aacatgacat tgtgcgcttc agtcactaca tcctcaacat acaccaactc tgattacaag 1080

gagtatatga gacatgttga agagtatgac ttgcaattca tttttcagtt gtgttccatc 1140

accctttcag ctgaggttat ggcctacatt cacactatga accctagtgt ccttgaagat 1200

tggaatttcg gattgtcccc acctccaaac ggtactttgg aagacactta cagatatgtt 1260

caatcccagg ctattacatg tcaaaagcct accccagaaa aggagaaacc tgatccatac 1320

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tacccacttg gaagaaaatt tttgcttcag tctggttata gaggaagatc ctcaattaga 1440

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aagaccaaaa gataaggtac c 1521

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<221> misc_feature

<223> HPV11-L1优化后的序列

<400> 4

gaattcgaaa cgatgtggag accaagtgat agtaccgttt atgtcccacc acctaatcct 60

gtttcaaaag tcgttgctac cgatgcttat gtcaaaagaa ctaacatttt ctaccatgca 120

tcttcctcaa gattgcttgc tgttggtcac ccttactatt ccatcaagaa agtcaacaag 180

acagttgtcc caaaagtttc aggttaccaa tatagagtct tcaaggttgt cttgcctgat 240

ccaaacaagt ttgccttgcc tgatagttct cttttcgacc caactacaca aagattggtt 300

tgggcttgta ctggacttga ggtcggtaga ggacagcctt tgggtgttgg agtctctggt 360

catccattgc ttaacaagta cgatgacgtt gaaaattccg gtggatatgg tggaaaccct 420

ggacaagata acagagttaa tgtcggtatg gactacaagc aaactcagct ttgtatggtt 480

ggatgcgctc cacctttggg agagcactgg ggtaaaggaa cccaatgttc aaacactagt 540

gttcagaatg gagattgccc acctttggaa cttattactt ctgttatcca agatggtgac 600

atggtcgata caggttttgg agcaatgaat ttcgctgact tgcagacaaa caagtctgat 660

gttccattgg acatttgtgg aaccgtctgc aaataccctg actatttgca aatggctgcc 720

gatccatacg gtgacagatt gtttttctat cttagaaagg agcaaatgtt cgccagacat 780

ttctttaaca gagcaggtac tgttggagaa cctgtcccag atgacttgct tgttaaaggt 840

ggaaacaata gatcctcagt tgctagttct atctacgtcc acactccttc cggttcattg 900

gtttcctcag aagcacaact ttttaataag ccatactggt tgcaaaaagc tcagggtcat 960

aacaatggaa tctgttgggg taaccacttg ttcgttactg ttgtcgatac cactagatca 1020

accaatatga ctttgtgcgc tagtgtctct aagtccgcca catacaccaa ctccgattac 1080

aaagagtata tgagacatgt tgaagagttt gacttgcaat tcattttcca gttgtgttca 1140

atcaccctta gtgccgaggt tatggcatat attcacacta tgaatccttc agtccttgaa 1200

gattggaact tcggattgag tccacctcca aatggtacat tggaagacac ctacagatat 1260

gttcaatctc aggctatcac atgtcaaaag cctaccccag aaaaggagaa acaggatcct 1320

tacaaagaca tgtctttctg ggaagttaat ttgaaggaga aattcagttc tgaattggat 1380

caatttccac ttggaagaaa gttcttgctt cagtctggtt atagaggaag aacttccgct 1440

agaacaggta ttaagagacc agctgtttct aaaccttcca ctgccccaaa gagaaaaaga 1500

actaaaacaa agaaataagg tacc 1524

Claims (10)

1.一种制备人乳头瘤病毒的四价疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括：

(1)提供表达载体，所述的表达载体分别包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示的DNA序列(较佳地形成4种重组表达载体)，能表达所述DNA序列所编码的蛋白；

(2)将步骤(1)的表达载体转入毕赤酵母中，进行表达，获得人乳头瘤病毒6的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒11的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒16的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒18的L1蛋白的病毒样颗粒；

(3)混合步骤(2)获得的人乳头瘤病毒6的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒11的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒16的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒18的L1蛋白的病毒样颗粒，获得人乳头瘤病毒的四价疫苗。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，以pPink-HC为表达载体。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，进行诱导表达；较佳地以甲醇进行诱导表达；更佳地，诱导表达的方法是：1％甲醇诱导24±4h，之后补充0.6-1％终浓度的甲醇后继续培养24±4小时

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，人乳头瘤病毒6的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒11的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒16的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒18的L1蛋白的病毒样颗粒以(0.5～2):(0.5～2):(0.5～2):(0.5～2)的比例混合。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)后，还包括纯化病毒样颗粒的步骤；较佳地，纯化方法包括：破碎菌体后，加入NP40搅拌混匀，之后加入PEG8000沉淀VLP，搅拌10-40小时，离心收集沉淀，PBS重溶、搅拌10-40小时，离心收集上清。

6.一种人乳头瘤病毒的四价疫苗组合物，其特征在于，该疫苗组合物包括以(0.5～2):(0.5～2):(0.5～2):(0.5～2)的比例混合的人乳头瘤病毒6的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒11的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒16的L1蛋白的病毒样颗粒、人乳头瘤病毒18的L1蛋白的病毒样颗粒。

7.如权利要求6所述的人乳头瘤病毒的四价疫苗组合物，其特征在于，所述的人乳头瘤病毒的四价疫苗以权利要求1-5任一所述的方法制备获得。

8.如权利要求6所述的人乳头瘤病毒的四价疫苗组合物，其特征在于，所述的组合物还含有免疫佐剂，较佳地，所述的免疫佐剂是氢氧化铝佐剂。

9.权利要求6-8任一所述的人乳头瘤病毒的四价疫苗组合物的用途，用于制备抑制人乳头瘤病毒的药物或药盒。

10.一种用于抑制人乳头瘤病毒的药盒，其特征在于，所述药盒含有权利要求6-8任一所述的人乳头瘤病毒的四价疫苗组合物。