CN105039269A - 一种用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗及其制备方法。所述病毒疫苗的制备方法包括以下步骤：1）MVA病毒载体构建；2）特异性递呈MAGE-3抗原DC细胞的获得。通过本发明所述方法制备得到的病毒疫苗，生物稳定性高，对人体不会产生任何不良反应，无任何致病危险；所述病毒抗体容易获得大量高纯度的病毒颗粒；所述病毒疫苗表达的MAGE-A3拥有更好的免疫原性，抗原表位多，并且不容易产生耐药性；所述病毒疫苗接种需要的病毒量比其他病毒少。

Description

一种用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术和肿瘤学诊断领域，尤其涉及一种用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗及其制备方法。

背景技术

公开统计资料显示，全世界肺癌发病率及死亡率占所有恶性肿瘤的第1位，每年全世界新诊断病例高达1，200，000例。根据卫生部统计资料（1992-1997），大城市中男性肺癌死亡率占所有恶性肿瘤的38%，女性占16%，均居首位，占所有肿瘤发病的约25%；因肺癌死亡约40/10万，占所有肿瘤死亡的约38%；我国每年因肺癌死亡的人数达50万人。近30年我国肺癌发病率及死亡率呈逐年上升趋势；其中非小细胞性肺癌约占80％，而且大多数患者在明确诊断时已是肿瘤晚期，预后往往很差；可手术的只占25%。所有NSCLC的5年生存率只有15%。即使可手术的患者，术后虽经各种治疗，ⅠA期患者的5年生存率也只有67%，ⅢA期患者5年生存率只有23%。

借助于不断进步的现代科学技术手段，人们对于肿瘤的认识已经深入到细胞、分子和基因水平，对于肿瘤诊断和治疗技术的掌握已经不再停留在部位和器官形态学阶段，而是结合形态和功能改变，逐渐向细胞学、分子生物学乃至基因组学分类诊断和治疗的方向纵深发展。与此同时，随着材料科学、计算机技术、数字成像技术的飞速发展，生物医学工程技术学与临床肿瘤学诊疗技术的结合越来越紧密，从而诞生了许多肿瘤细胞免疫疗法。

免疫系统是人体的防御体系，一方面发挥着清除细菌、病毒、外来异物的功能，另一方面消除体内衰老细胞以及发生突变的细胞（有的突变细胞会变成癌细胞）。机体免疫系统和癌细胞相互作用的结果可决定癌症的最终演变。对于健康的人来说，其免疫系统的强大足以及时清除突变的癌细胞。但对于癌细胞病人来说，普遍存在免疫系统低下，不能有效地识别、杀灭癌症细胞；另一方面，癌症细胞大量增殖，会进一步抑制患者的免疫功能，而且，癌症细胞有多种机制来逃脱免疫细胞的识别与杀伤。

肿瘤细胞免疫治疗就是借助分子生物学技术和细胞工程技术，提高癌症的免疫原性，给机体补充足够数量的功能正常的免疫细胞和相关分子，激发和增强机体抗瘤免疫应答，提高肿瘤细胞对机体抗癌症免疫效应的敏感性；或者在体内外诱导癌症特异性和非特异性效应细胞和分子的产生，最终达到清除癌细胞的目的。目前临床上应用的大多数生物细胞免疫疗法，其作用不是杀死全部癌症细胞，而是在通过手术、放疗、化疗等手段使得癌症细胞负荷明显降低后，促进机体免疫功能迅速恢复，并通过清除微小的残留病灶、抑制残留癌症细胞增殖的方式来治疗肿瘤。

美国FDA于2008年12月，我国卫生部也于2009年5月正式批准DC诱导的细胞免疫治疗应用于临床。2011年诺贝尔医学奖颁发给了DC以及DC诱导肿瘤免疫的发现者，蒙特利尔大学的RalphM.Steinman教授，以表彰他在肿瘤免疫治疗领域的巨大贡献。美国NIH报告应用TIL对恶黑进行治疗，总体有效率高达72%，令世界广泛关注。美国NIH预言，细胞治疗可能会成为"能够彻底治愈肿瘤的唯一手段"。

随着现代肿瘤学、免疫学理论和分子生物学技术的飞速发展，众多表位的发现和肿瘤相关抗原的研究成果为肿瘤的免疫治疗开创了一种全新的有希望的治疗方式，以适宜的肿瘤特异性抗原作为疫苗对恶性肿瘤进行免疫治疗的方法日益受到重视。参与机体抗肿瘤免疫排斥反应的主要角色是T细胞，而T细胞的活化依赖于对肿瘤特异性抗原的识别。在过去的几年里，有很多种人类的肿瘤相关抗原被鉴定出来，这些肿瘤抗原包括：（1）肿瘤睾丸抗原，如MAGE、BAGE和GAGE家族等；（2）分化抗原，如MART-1、gp100等；（3）过表达的癌基因和抑癌基因等，如ras和HER-2等；（4）病毒抗原，如HPV-E6等；（5）肿瘤独特性抗原，如CDK4和MUM-1等。这些肿瘤抗原在临床上的应用也取得了一定的效果，但是最终其治疗效果总是不能让人满意。

黑素瘤抗原（Melanomaantigen,MAGE）基因是最早被发现的一族人类肿瘤特异性抗原基因。MAGE基因家族编码的肿瘤排斥抗原，经加工产生抗原肽，再由抗原加工相关转运蛋白(TAP)转送至内质网，在此与HLA-I类分子结合形成复合物，再经高尔基体表达于细胞表面。CTL通过其表面的抗原受体识别抗原肽和HLA-I类分子复合体，引起其对相应肿瘤细胞的特异性免疫杀伤效应。鉴于MAGE的肿瘤特异性表达及其表达产物能被CTL识别的特性，人们逐渐认识到其在肿瘤特异性免疫治疗中的潜在价值，MAGE抗原肽是一种CTL介导的肿瘤特异性免疫治疗的理想靶分子。

MAGE基因的表达产物中MAGE-3蛋白的免疫原性较强，是肿瘤特异性抗原的典型代表。MAGE-3是广泛存在于多种肿瘤的肿瘤特异性抗原，在正常组织中除了胎盘和睾丸低水平表达外，在其他正常成熟组织均不表达，而睾丸是免疫豁免器官，所以，MAGE-3是一种理想的肿瘤相关抗原，可以作为多种肿瘤免疫治疗的靶点。近年来的有关研究表明，用MAGE-3蛋白作为疫苗对恶性黑素瘤进行免疫治疗，能够有效激活CTL杀伤表达该蛋白的肿瘤细胞，取得满意的治疗效果。而目前，并未见报道将MAGE-3蛋白作为疫苗用于治疗人类非小细胞肺癌。

目前国内外常规的病毒疫苗的构建方法包括以下三类：

1）使用慢病毒载体构建，缺点：生物安全性差，病毒可能恢复感染性、载体容量小，不能表达大片段蛋白、荷载大片段基因后，严重降低病毒滴度，并进一步影响病毒的感染效率。

2）使用MAGEA3抗原肽加佐剂辅助产生免疫反应，缺点：抗原肽的表位有限，不能包括所有的免疫位点、人工合成的抗原肽的空间结构可能与自然产生的抗原空间结构不同，妨碍产生正常的免疫反应，并且有可能产生副作用。

3）其他治疗方法：构建PD-1的RNAi表达质粒抑制PD-1表达，缺点是容易产生耐药性。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗及其制备方法。所述病毒疫苗为重组MVA-MAGE-3病毒，可用于治疗非小细胞肺癌，对MAGE-A3表达阳性的非小细胞肺癌细胞有特异性的杀伤效果，并且MAGE-A3在非小细胞肺癌细胞特异性表达，在其他组织器官基本没有表达，大大降低了所述病毒疫苗的副作用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：

一种用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗的制备方法，所述制备方法包括以下方法：

1）MVA病毒载体的构建

1.1穿梭质粒的构建：

将MAGE-3基因克隆到pIIIdHR-P7.5质粒中；

1.2重组MVA病毒的构建：

a.用MVA病毒感染细胞，培养90~120min，得到感染细胞；

b.在感染开始15~30min后，开始准备转染质粒，得到转染质粒混合液；

c.将所述转染质粒混合液加入上述感染细胞中，37℃培养24~48h，得到单层细胞；

d.反复冻融所述单层细胞2-3次，并将细胞破碎处理2-5次，得到rMVA溶液；

e.将所述rMVA溶液接种到细胞中，37℃培养48~72h；

f.挑取典型的rMVA感染的细胞聚集点到新的含培养基中，挑取5~15个所述聚集点；

g.重复上述步骤d至步骤f，2~4次，直到得到较纯的rMVA；

h.将所述rMVA培养于单层细胞中，筛选不含选择基因K1L的rMVA，重复步骤d至步骤g，2~4次，直至筛选得到rMVA-FS；

i.扩增分离得到的重组MVA-MAGE-3病毒，即为所述的用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗；

2）特异性递呈MAGE-3抗原DC细胞的获得

2.1将未成熟的DC细胞以1×10⁶/ml铺入6孔板；

2.2重组MVA-MAGE-3病毒以MOI=0.3感染未成熟DC，感染1~3h后，每孔加入含hTNF-α、IL-6和IL-1β的20%FBSAIMV培养基，继续培养24~48h，得到成熟特异性递呈MAGE-3抗原的DC细胞，所述成熟特异性递呈MAGE-3抗原的DC细胞也可作为用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗。

进一步的，步骤1.1中所述的MAGE-3基因来源于A549细胞RNA的逆转录。

进一步的，步骤1.2a和1.2h中所述的细胞为CEF细胞或BHK-21细胞。

进一步的，步骤1.2e中所述的细胞为RK-13细胞。

进一步的，所述A549细胞、BHK-21细胞和RK-13细胞，均使用含10%热灭活FBS的RPMI-1640培养基培养于37℃，5%CO₂条件下，病毒感染时，FBS浓度要降低到2%。

进一步的，所述CEF细胞取自11天龄SPF级鸡胚，培养于含10%热灭活FBS和25μg/mlamphothericinB，1%AB/AM。

进一步的，步骤1.1a中所述的MVA病毒感染细胞，以MOI=0.01-0.05感染MVA，培养基为RPMI-1640/2%FBS/1%AB/AM。

本发明相比现有技术的有益效果是：

1、本发明所述病毒疫苗为重组MVA-MAGE-3病毒，可用于治疗非小细胞肺癌，对MAGE-A3表达阳性的非小细胞肺癌细胞有特异性的杀伤效果，并且MAGE-A3在非小细胞肺癌细胞特异性表达，在其他组织器官基本没有表达，大大降低了所述病毒疫苗的副作用；

2、传统工艺疫苗只能通过胞外抗原途径HLA-2分子激活CD4⁺T细胞活性，抗肿瘤效果不理想，即便是通过慢病毒构建的抗原表达病毒也可以通过HLA-2分子激活CD4⁺T细胞，但是慢病毒存在插入突变的不确定性。本发明所述的病毒疫苗表达的MAGE-A3抗原不仅能通过HLA-1激活CD8⁺T细胞（CD8⁺T细胞是负责杀伤肿瘤细胞的主要效应细胞），此外，还能通过HLA-2激活CD4⁺T细胞，进一步增强CD8⁺T细胞清除肿瘤细胞的能力；

3、本发明所述的病毒疫苗生物稳定性高，对人体不会产生任何不良反应，无任何致病危险；

4、本发明所述的病毒疫苗容易获得大量高纯度病毒颗粒；

5、本发明所述的病毒疫苗表达的MAGE-A3拥有更好的免疫原性，抗原表位多，并且不容易产生耐药性；

6、本发明所述的病毒疫苗接种需要的病毒量比其他方法构建的病毒少。

附图说明

图1为感染rMVA-MAGE-3病毒的DC细胞诱导产生的CTL效应（靶细胞为NCI-H226细胞）；

图2为感染rMVA-MAGE-3病毒的DC细胞诱导产生的CTL效应（靶细胞为NCI-H358细胞）；

图3为rMVA-MAGE-3感染的小鼠DC细胞免疫C57/BL6小鼠的杀伤效果图。

具体实施方式

实施例1

一种用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗的制备方法，所述制备方法包括以下方法：

1.MVA病毒载体构建

1.1细胞和病毒株

A549(ATCCCRM-CCL-185)细胞、Babyhamsterkidney(BHK)-21细胞(ATCCCCL-10)和rabbitkidneyRK-13(ATCCCCL-37)细胞使用含10%热灭活FBS的RPMI-1640培养基培养于37℃，5%CO₂条件下。病毒感染时，FBS浓度要降低到2%；

新鲜的primarychickenembryofibroblasts(CEF)取自11天龄SPF级鸡胚。培养于含10%热灭活FBS和25ug/mlamphothericinB(1%AB/AM)；

病毒株为ModifiedvacciniavirusAnkara,MVA(IInew)。

1.2穿梭质粒的构建

MAGE-3基因(NCBIAcc.No.NM_005362)cDNA来源于A549细胞RNA逆转录。把MAGE-3基因cDNA克隆到pIIIdHR-P7.5质粒中。

1.3重组MVA病毒构建

1.3.1CEF细胞或者BHK-21细胞在6孔板中单层生长到80%覆盖率；

1.3.2以MOI=0.01-0.05感染MVA，培养基为RPMI-1640/2%FBS/1%AB/AM，培养90-120min；

1.3.3感染开始15-30min后，开始准备转染穿梭质粒，按照转染试剂供应商转染说明准备Lipofectamine2000CDReagent（Cat.No.12566-014,invitrogen），每孔转染1.5-10μg质粒；

1.3.4把上一步的质粒混合液直接加入到感染MVA的孔中，37℃培养48h；

1.3.5收获单层细胞并把细胞转移到1.5ml离心管中，-80℃或-20℃保存；

1.3.6反复冻融收获的单层细胞3次，并使用超声破碎细胞4次，每次15s，避免样品过热；

1.3.7由于wtMVA不能再RK-13细胞中生长，只有携带K1L基因和MAGE-3基因的rMVA病毒才能在RK-13细胞中生长。所以把上一步得到的rMVA溶液直接接种到RK-13细胞孔中，37℃培养48-72h；

1.3.8挑取典型的rMVA感染RK-13聚集点到新的含有500ul病毒生长培养基的1.5ml离心管中，挑取5-15个这种聚集点；

1.3.9反复冻融并超声破碎细胞如步骤1.3.6；

1.3.10重复步骤1.3.6-1.3.9，2-4次，直到得到较纯的rMVA，使用PCR方法检测样品中是否含有wtMVA；

1.3.11清除掉wtMVA后，再把rMVA培养于CEF或者BHK-21细胞单层中，筛选不含选择基因K1L的rMVA，重复步骤3.6-3.10，往往需要3轮筛选得到rMVA-FS(rMVA-foreignsequences)；

1.3.12扩增分离得到的重组MVA-MAGE-3病毒，即为所述的用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗；

2.特异性递呈MAGE-3抗原DC细胞的获得

2.1把得到的未成熟DC细胞以1×10⁶/ml铺入6孔板；

2.2重组MVA-MAGE-3病毒以MOI=0.3感染未成熟DC细胞，感染2h后，每孔加入2ml含10ng/mlhTNF-α、1000IU/mLIL-6和10ng/mLIL-1β的20%FBSAIMV培养基，继续培养48h，得到成熟特异性递呈MAGE-3抗原的DC细胞，所述成熟特异性递呈MAGE-3抗原的DC细胞也可作为用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗。

实施例2

本发明所制备得到的特异性递呈MAGE-3抗原的DC细胞，可以激发有效的CTL特异性杀伤效应。

在48孔板中使用感染rMVA-NT、rMVA-MAGE-3感染的DC细胞，以DC：CD8+T细胞=10:1的比例与CD8+T细胞共培养。第二天，在细胞培养基中加入30U/mlIL-2。培养10天后，收取CD8+T细胞。分别将非小细胞肺癌细胞株NCI-H226，NCI-H358以1×10⁵细胞/孔的密度铺于96孔板中，作为靶细胞（T:Targetcell）；将共培养10天的CD8+T细胞作为效应细胞(E:Effectorcell)，按照E:T=10:1、E:T=20:1和E:T=40:1的比例加入至各孔中。

图1、图2为感染rMVA-MAGE-3病毒的DC细胞诱导产生的CTL效应在不同效靶比（1:10/1:20/1:40）情况下均显著性高于感染阴性对照rMVA-NT病毒和空白对照Mock组。并且这种效果在MAGE-3阳性肺癌细胞系（NCI-H226和NCI-H358）中具有普适性。

LDH释放实验结果显示，感染rMVA-MAGE-3病毒的DC细胞诱导的CTL肿瘤细胞特异性杀伤效果显著高于感染rMVA-NT病毒DC细胞诱导的CTL肿瘤细胞特异性杀伤效应（图3）。说明，感染rMVA-MAGE-3病毒的DC细胞可以诱导出特异性杀伤MAGE-3阳性肺癌细胞的CTL效应。

回输特异性递呈MAGE-3抗原DC细胞给小鼠：

8周龄C57/BL6小鼠经rMVA-NT，rMVA-MAGE-3感染DCs，并回输免疫4周后，处死并收集脾淋巴细胞。分离的脾淋巴细胞培养于含有10%FBS，50IU/mlrmIL-2的RPMI-1640培养液中，体外培养3天。第四天，分别将肺癌细胞株NCI-H226，NCI-H358以1×10⁵细胞/孔的密度铺于96孔板中，作为靶细胞（T:Targetcell）；将体外培养3天的脾淋巴细胞，作为效应细胞(E:Effectorcell)，按照E:T=10:1的比例加入至各孔中。以只加入淋巴细胞组作为Eself-release组；向不含脾淋巴细胞的靶细胞中加入细胞裂解液（celllysisbuffer）设为Targetmaximumrelease组，于37℃CO₂培养箱中孵育6小时。经1,000rpm离心后收集各组分培养上清，利用LDH检测试剂盒(PromegaCat#G1780)测量LDH的释放，检测脾淋巴细胞对靶细胞的杀伤，杀伤活性的计算方法为Cytotoxicity%=(Experimentalrelease-Eself-release)/Targetmaximumrelease×100。

图3rMVA-MAGE-3感染的小鼠DC细胞免疫C57/BL6小鼠后，脾脏淋巴细胞对MAGE-3阳性肺癌细胞系NCI-H226、NCI-H358的杀伤效果显著高于rMVA-NT病毒感染免疫组和空白对照Mock组。

LDH释放实验结果显示，经rMVA-NT，rMVA-MAGE-3感染DCs回输免疫的小鼠脾淋巴细胞能够有效杀伤MAGE-3表达阳性的肺癌细胞系NCI-H226、NCI-H358，并且rMVA-MAGE-3组杀伤效率显著高于rMVA-NT组。

Claims (9)

1.一种用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

1.1穿梭质粒的构建：

将MAGE-3基因克隆到pIIIdHR-P7.5质粒中；

1.2重组MVA病毒的构建：

a.用MVA病毒感染细胞，培养90~120min，得到感染细胞；

b.在感染开始15~30min后，开始准备转染质粒，得到转染质粒混合液；

c.将所述转染质粒混合液加入上述感染细胞中，37℃培养24~48h，得到单层细胞；

d.反复冻融所述单层细胞2-3次，并将细胞破碎处理2-5次，得到rMVA溶液；

e.将所述rMVA溶液接种到细胞中，37℃培养48~72h；

f.挑取典型的rMVA感染的细胞聚集点到新的含培养基中，挑取5~15个所述聚集点；

g.重复上述步骤d至步骤f，2~4次，直到得到较纯的rMVA；

h.将所述rMVA培养于单层细胞中，筛选不含选择基因K1L的rMVA，重复步骤d至步骤g，2~4次，直至筛选得到rMVA-FS；

i.扩增分离得到的重组MVA-MAGE-3病毒，即为所述的用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗。

2.一种用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

1）按照权利要求1所述的方法制备得到重组MVA-MAGE-3病毒；

2）特异性递呈MAGE-3抗原DC细胞的获得；

2.1将未成熟的DC细胞以1×10⁶/ml铺入6孔板；

2.2重组MVA-MAGE-3病毒以MOI=0.3感染未成熟DC，感染1~3h后，每孔加入含hTNF-α、IL-6和IL-1β的20%FBSAIMV培养基，继续培养24~48h，得到成熟特异性递呈MAGE-3抗原的DC细胞，即为所述的用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗。

3.根据权利要求1所述的用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.1中所述的MAGE-3基因来源于A549细胞RNA的逆转录。

4.根据权利要求1所述的用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.2a和1.2h中所述的细胞为CEF细胞或BHK-21细胞。

5.根据权利要求1所述的用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.2e中所述的细胞为RK-13细胞。

6.根据权利要求3-5所述的用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述A549细胞、BHK-21细胞和RK-13细胞，均使用含10%热灭活FBS的RPMI-1640培养基培养于37℃，5%CO₂条件下，病毒感染时，FBS浓度要降低到2%。

7.根据权利要求4所述的用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗的制备方法，其特征在于，所述CEF细胞取自11天龄SPF级鸡胚，培养于含10%热灭活FBS和25μg/mlamphothericinB，1%AB/AM。

8.根据权利要求1所述的用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1.1a中所述的MVA病毒感染细胞，以MOI=0.01-0.05感染MVA，培养基为RPMI-1640/2%FBS/1%AB/AM。

9.一种用于治疗非小细胞肺癌的新型病毒疫苗，其制备方法如权利要求1~8所述。