CN105671083B - PD‑1基因重组病毒质粒及构建、重组逆转录病毒Lenti‑PD‑1‑Puro及包装与应用 - Google Patents

PD‑1基因重组病毒质粒及构建、重组逆转录病毒Lenti‑PD‑1‑Puro及包装与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105671083B
CN105671083B CN201610083007.3A CN201610083007A CN105671083B CN 105671083 B CN105671083 B CN 105671083B CN 201610083007 A CN201610083007 A CN 201610083007A CN 105671083 B CN105671083 B CN 105671083B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
lenti
puro
virus
plasmid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610083007.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105671083A (zh
Inventor
孙昌秀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Anhui Kedgene Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Anhui Kedgene Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Anhui Kedgene Biotechnology Co ltd filed Critical Anhui Kedgene Biotechnology Co ltd
Priority to CN201610083007.3A priority Critical patent/CN105671083B/zh
Publication of CN105671083A publication Critical patent/CN105671083A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105671083B publication Critical patent/CN105671083B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/76—Viruses; Subviral particles; Bacteriophages
    • A61K35/768—Oncolytic viruses not provided for in groups A61K35/761 - A61K35/766
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15032—Use of virus as therapeutic agent, other than vaccine, e.g. as cytolytic agent

Abstract

本发明公开了一种PD‑1基因重组病毒。该重组病毒Lenti‑PD‑1‑Puro保藏号为CCTCC No：V201601。本发明是通过将PD‑1gRNA序列克隆进逆转录病毒质粒Lenti‑CRISPR/Cas9‑Puro中,得到PD‑1重组病毒质粒Lenti‑CRISPR/Cas9‑PD‑1‑Puro，再将此病毒质粒与质粒pSPAX及pMD2.G共同转染293T细胞，完成重组病毒Lenti‑PD‑1‑Puro的包装。此PD‑1重组病毒感染肿瘤患者外周血的T细胞后成功敲除了T细胞上的PD‑1，解除肿瘤患者T细胞的抑制状态，从而使此种PD‑1重组病毒修饰后的T细胞恢复其攻击肿瘤细胞的能力，达到免疫细胞治疗的作用。

Description

PD-1基因重组病毒质粒及构建、重组逆转录病毒Lenti-PD-1- Puro及包装与应用
技术领域
本发明涉及生物技术及细胞治疗的技术工程领域，具体涉及一种PD-1基因重组病毒质粒，命名为病毒质粒KGEN-0626，于2016年1月27日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201601，本发明还涉及重组逆转录病毒Lenti-PD-1-Puro的包装及在利用该重组病毒对肿瘤细胞进行免疫治疗中的应用。
背景技术
癌症已超过心脏疾病，成为全球第一大死亡原因。癌症治疗在过去几十年中取得了可喜的进展。肿瘤治疗除了外科手术外，还包括化疗、放疗及靶向药物治疗。尽管这些方法在一定程度上控制了癌症的发展，但其缺乏特异性，会在杀死肿瘤细胞的同时杀死正常细胞，此外这些药物治疗毒性大，严重损伤了正常免疫系统，影响病人的生存质量。
PD-1(Programmed Death 1)程序性死亡受体-1：是一种重要的免疫抑制分子。最初是从小鼠T细胞杂交瘤2B4.11克隆出来。PD-1抑制疗法是通过解除肿瘤逃避免疫系统能力的新型免疫治疗方法。癌细胞逃避免疫杀伤的一种机制，是通过它的表面产生一种称为程序性死亡配体-1(PD-L1).当这种PD-L1联接到一类免疫细胞T细胞的PD-1蛋白上即引起T细胞失活。T细胞就不能够发现肿瘤向免疫系统发出攻击肿瘤的信号。
该免疫治疗方法的设计思路是，针对肿瘤患者T细胞上的PD-1基因锁定或基因敲除，将使患者T细胞上的PD-1与肿瘤细胞表面的PD-L1不产生联接，从而激活患者自身的T细胞功能，达到杀死肿瘤细胞的目的。
目前美国已经有抗PD-1药物的临床实验，证明了这种机理治疗癌症成效显著。2014年施贵宝公司研制的Opdivo(PD-1抑制剂Nivolumab)先后在日本和美国上市，而默沙东公司研制的Keytruda(PD-1抑制剂Pemboolizamab)则是第一个在美国上市的用于晚期转移皮肤黑色素瘤(Melanoma)的抑制剂，该PD-1抑制剂在这些皮肤黑色素瘤晚期转移病人的临床实验中，被发现持续性地抑制肿瘤，大大提高病人的存活时间和存活率(60％的病人存活超过两年)。更令人振奋的病例发生在纽约斯隆.凯特琳癌症纪念研究中心(MemorialSloan Kettering Cancer Center,MSK)的黑色素瘤病人的治疗反应。一位患有转移性黑色素瘤的49岁女患者，左胸下有一巨大有蒂的坏死性肿瘤。在进行一个剂量的试验性结合免疫治疗3周后，肿瘤消失了。此文发表在4月20号新英格兰杂志(NEJM)上。与此同时，MSK的Paul Chapman博士报道，其有效率达22％(74个病人中有16个治疗后未再发现肿瘤存在)。
另外，晚期非小细胞性肺癌(NSCLC)和肝癌(Hepatocellular Cancer)治疗中亦取得相当好的效果。在2015年第5届美国临床肿瘤年会(ASCO)中(5月29日至6月2日在美国芝加哥召开)，美国南加州大学Norris大学癌症中心Anthony B.EL-Khoueiry教授报导在一项I/II期研究成果表明Nivolamab治疗晚期肝癌是安全有效的。42名患者有8名患者(19％)肿瘤缩小30％，12个月总存活率为62％，最长达17个月，而目前市场上最新药物索拉菲尼(一种FDA批准的晚期肝癌治疗药物-多靶点酪氨酸激酶抑制剂)，客观肿瘤缓解率只有2％的患者有效，总生存率为10-11个月。施贵宝公司亦公布了Opdivo(Nivolumab)的试验数据，在对582位患者临床试验中，使用标准化疗法，四期肺癌患者生存期为9.4个月，而使用Nivolumab药物治疗，患者平均生存期提高到12.2个月，有的甚至到19.4个月。是常规标准化疗的近2倍。另外，默沙东的Keytruda(Pemboolizumab)是美国首个获批的抗PD-1药物，用于恶性黑色素瘤及非小细胞性肺癌。另外在临床试验中，对胃癌(Gastric Cancer)的有效率达53％的患者肿瘤缩小。食管癌(Esophageal Cancer)患者52％肿瘤缩小，头颈部肿瘤(Head and Neck Cancer)57％的肿瘤缩小。
综上所述，PD-1抗体药物治疗肿瘤疗效显著。然而目前国内尚无PD-1抗体，PD-1抗体治疗药物仍在研发之中，尚未进入临床试验。另外，PD-1抗体制备及纯化过程复杂，周期长，制造成本高，造成抗体药物昂贵，事实上普通百姓是难于承受这种高昂的治疗费用。
有鉴于此，我们发明了一个PD-1重组病毒的制备方法，并利用此重组病毒进行肿瘤的免疫细胞治疗。
发明内容
本发明通过构建PD-1重组病毒质粒，并通过包装得到重组逆转录病毒Lenti-PD-1-Puro，同时利用此重组病毒经体外感染T细胞从而敲除T细胞上PD-1受体，从而使此种基因修饰后的T细胞恢复在人体内攻击肿瘤细胞的能力，达到免疫细胞治疗的作用。
本发明提供了一种PD-1基因重组病毒质粒，属逆转录病毒质粒，命名为病毒质粒KGEN-0626，于2016年1月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201601，其序列为SEQ ID NO：1。
本发明还提供了上述所述PD-1基因重组病毒质粒的构建，其是通过选择PD-1基因序列中2859-2878共20个碱基序列即CACGAAGCTCTCCGATGTGT作为PD-1特异性引导RNA即gRNA，并在T4连接酶的作用下与其互补链ACACATCGGAGAGCTTCGTG结合形成双链互补DNA，最后将此双链DNA克隆进病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-Puro即得到重组PD-1病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro。
上述所述PD-1基因重组病毒质粒的构建，其具体包括下述步骤：
1)使用EcoR1和Age1核酸内切酶和磷酸酶37℃处理30分钟去磷酸化Lenti-CRISPR/Cas9质粒；
2)以PD-1基因序列中2859-2878位的共20个碱基序列作为PD-1特异性引导RNA也即PD-1gRNA，在T4连接酶的作用下将PD-1gRNA引物序列与其互补的链经37℃孵育30分钟，95℃孵育5分钟，再以每分钟5℃的速度降温至25℃的条件退火合成PD-1双链DNA；
3)使用快速核酸连接酶将PD-1双链DNA与Lenti-CRISPR/Cas9-Puro质粒连接，室温孵育10分钟即可得到重组病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro。
本发明还提供了一种重组逆转录病毒Lenti-PD-1-Puro，其包含有PD-1基因重组病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro。
上述所述重组逆转录病毒Lenti-PD-1-Puro的包装，包括下述步骤：
1)将重组病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro转入Stbl3细菌，经氨苄青霉素筛选，扩增，纯化，测序；
2)转染前一天种293T细胞到10cm培养皿，细胞密度以第二天长到细胞80％汇合为宜；培养基为DMEM，其中含10％胎牛血清、5000U的抗生素；抗生素可以为氨苄青霉素和/或链霉素；
3)转染前2小时换新鲜培养基，将PD-1重组病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro与质粒pSPAX、pMD2.G转染试剂混合到1.5ml离心管中；
4)将混合液轻轻混匀后室温放置10分钟后加入10ml细胞培养基中，轻摇混匀；
5)37℃，5％CO2细胞培养箱培养6小时后，更换新鲜培养基；
6)培养48小时后收集富含病毒的培养基，用0.45um的滤器过滤后分装保存于-80度，或直接用于感染T细胞。
上述步骤中所述培养基均指DMEM培养基，其中含10％胎牛血清、5000U的抗生素，抗生素可以为氨苄青霉素和/或链霉素；
本发明还提供了该重组逆转录病毒Lenti-PD-1-Puro在制备用于治疗肿瘤细胞的免疫系统中的应用。
本发明是通过将PD-1基因的一段特异性引导RNA(gRNA)序列克隆进逆转录病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-Puro中,从而得到PD-1重组病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro，再将此病毒质粒与另外两种逆转录病毒辅助质粒pSPAX及pMD2.G共同转染293T细胞后，最后包装成重组病毒Lentivirus PD-1-Puro(Lenti-PD-1-Puro)。此PD-1重组病毒感染T细胞后可在Cas9的作用下切割PD-1基因从而敲除T细胞上的PD-1，解除肿瘤患者T细胞的抑制状态并使其激活攻击肿瘤细胞。
目前与本发明最接近的现有技术是在欧美及日本等国开展的PD-1抗体治疗肿瘤技术。该抗体治疗技术存在以下几点明显不足之处：第一，很多正常的组织及细胞亦表达少量的PD-1配体，PD-L1或PD-L2,因此PD-1抗体也会结合到这些组织和细胞的配体而产生一些不同程度的副作用；第二，由于PD-1抗体不是仅仅针对肿瘤细胞表面的PD-L1或PD-L2配体(其他组织也表达该配体)，因此不可避免的降低抗体治疗的特异性；第三，抗体制备及纯化过程复杂，制造成本高，治疗费用昂贵，且疗程长。有的病人需要半年甚至一年以上的疗程。造成病人沉重的的经济负担。相较于PD-1抗体治疗，本发明具有明显的如下优点：
1.本发明使用的免疫细胞治疗特异性强，我们使用的技术是特异性敲除T细胞上的PD-1基因，阻碍其与肿瘤细胞表面PD-L1或PD-L2配体的结合，从而解除T细胞被抑制的状态，达到激活T细胞杀灭肿瘤细胞的目的；
2.本发明使用患者自身的T细胞在体外敲除PD-1基因，这些T细胞是病人自身的免疫细胞，无免疫排斥作用，细胞来源方便，易在体外培养扩增；
3.本发明方法采用的自身的T细胞，相较于抗体治疗费用低，具有安全性、针对性、持久性、全身性及彻底性。
附图说明
图1为PD-1基因重组病毒(Lentil-PD-1-Puro)质粒结构示意；
图2为利用PD-1基因重组病毒体外治疗肝癌细胞的应用结果图(应用前后T细胞流氏鉴定的结果)；肿瘤患者(肝癌志愿者)外周血T细胞，pd-1基因敲除效率(KOefficiency)：CD3:35.2％；CD4:26.5％；CD8:47.1％；
图3为利用PD-1基因重组病毒体外治疗肺癌细胞的应用结果图(应用前后T细胞流氏鉴定的结果)；肿瘤患者(非小细胞肺癌志愿者)外周血T细胞，pd-1基因敲除效率(KOefficiency)：CD3:81.1％；CD4:85.4％；CD8:88.6％。
具体实施方式
下述实施例是对于本发明内容的进一步说明以作为对本发明技术内容的阐释，但本发明的实质内容并不仅限于下述实施例所述，本领域的普通技术人员可以且应当知晓任何基于本发明实质精神的简单变化或替换均应属于本发明所要求的保护范围。
实施例1(PD-1基因重组病毒的制备)
1)采用EcoR1、Age1核酸内切酶和磷酸酶37℃处理30分钟使Lenti-CRISPR/Cas9质粒(Addgene 52961)去磷酸化，得到Lenti-CRISPR/Cas9-Puro质粒；
2)以PD-1基因序列中2859-2878位的共20个碱基序列作为PD-1特异性引导RNA也即PD-1gRNA，在T4连接酶(NEB M2200S)的作用下将PD-1gRNA引物序列与其互补的链经37℃孵育30分钟，95℃孵育5分钟，再以每分钟5℃的速度降温至25℃的条件退火合成PD-1双链DNA；
3)使用快速核酸连接酶即T4连接酶(NEB M2200S)将PD-1双链DNA与步骤1)所得Lenti-CRISPR/Cas9-Puro质粒连接，室温孵育10分钟即可得到重组病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro；
实施例2(重组逆转录病毒Lenti-PD-1-Puro的包装)
1)将重组病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro转入Stbl3细菌，经氨苄青霉素筛选，扩增，纯化，测序，具体如下：
筛选：将转入质粒的细菌种在含氨苄青霉素(100微克/毫升)的琼脂板上，37℃孵育12小时后长出10到20个菌落，选择3到5个的菌落进行扩增；
扩增：将上述选择的菌落放入300毫升LB细菌培养液(含氨苄青霉素，100微克/毫升)，37℃摇床孵育16小时，细菌大量扩增；
纯化：用美国Qiagen公司质粒大抽试剂盒(货号12162)进行提纯，得到1到2毫克病毒质粒；
测序：将提出的质粒送测序公司(美国Laragen公司)进行测序，选择100％序列正确匹配的病毒质粒作为后续使用。
2)转染前一天种293T细胞到10cm培养皿，细胞密度以第二天长到细胞80％汇合为宜；细胞培养基为DMEM，其中含10％胎牛血清、5000U/ml抗生素(3000U/ml氨苄青霉素和2000U/ml链霉素)；
3)转染前2小时换新鲜细胞培养基，将PD-1重组病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro与辅助包装质粒pSPAX、pMD2.G转染试剂混合到1.5ml离心管中；其中，Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro、pSPAX、pMD2.G的接种量比为4:3:1；
4)将混合液轻轻混匀后室温放置10分钟后加入10ml细胞培养基中，轻摇混匀；
5)37℃，5％CO2细胞培养箱培养6小时后，更换新鲜细胞培养基；
6)再培养48小时后收集富含病毒的培养基，用0.45um的滤器过滤后分装保存于-80℃，可直接用于感染T细胞。
应用例
利用PD-1基因重组病毒对肿瘤T细胞感染进行免疫细胞治疗
1.恶性肿瘤患者(实体瘤志愿者)外周血T细胞的分离与纯化(ficoll paque)
1)静脉取血30毫升加入30毫升的PBS含50u/毫升的肝素；
2)取2个50毫升离心管分别加入20毫升ficoll-paque plus(比重：1.077克/毫升)，
3)再将稀释后的静脉血30毫升加到Ficoll的上层，应注意保持两者界面清晰；
4)20℃，400g/分钟离心30分钟，后取中间层细胞到50毫升离心管中；
5)加入30毫升PBS悬浮细胞后，100g每分钟离心5分钟；
6)重复步骤4后，计数培养T细胞。
2.PD-1病毒感染T细胞
1)用重组白细胞介素-2(IL-2)，30纳克/毫升刺激活化T细胞72小时；
2)将以上收集的病毒培养基与T细胞培养基(RPMI1640含10％胎牛血清)按1:1(v/v)混合后感染T细胞同时加入polybrener 10微克/毫升增加感染效率；
3.T细胞的收集及鉴定
1)感染T细胞24小时后，收集并离心T细胞，并更换新鲜培养基(RPMI 1640含10％胎牛血清)培养48小时，收集并离心T细胞，经细胞记数后用生理盐水冲洗2-3次。
2)使用PD-1抗体试剂采用流式分析(Flow cytometry)鉴定：鉴定经重组病毒感染后肿瘤患者外周血中T细胞此时的PD-1的敲除率(CD3、CD4、CD8)。肿瘤细胞实施此种方法分别治疗肝癌、肺癌前后的结果分别见图2、图3。经鉴定，此时T细胞上的PD-1敲除率可在26-89％，我们称之为基因修饰过的T细胞，即完成了此种PD-1基因重组病毒体外治疗肿瘤细胞的应用。
由图2：提取肝癌病人外周血T细胞后分为两组，一组用PD-1病毒(Lenti-PD-1)感染，另一组用对照病毒(Lenti-PLJM)感染。经流式细胞分析，结果表明，CD3阳性T细胞中PD-1的表达由对照组的28.1％下降到PD-1病毒感染组的18.2％，敲除率为35.2％；CD4阳性T细胞中PD-1的表达由23.8％下降到17.5％，敲除率为26.5％；CD8阳性T细胞中PD-1的表达由23.8％下降到12.6％，敲除率为47.1％。
由图3：提取肺癌病人外周血T细胞后分为两组，一组用PD-1病毒(Lenti-PD-1)感染，另一组用对照病毒(Lenti-PLJM)感染。经流式细胞分析，结果表明，CD3阳性T细胞中PD-1的表达由对照组的60.53％下降到PD-1病毒感染组的11.40％，敲除率为81.1％；CD4阳性T细胞中PD-1的表达由52.93％下降7.75％，敲除率为85.4％；CD8阳性T细胞中PD-1的表达由41.54％下降到4.74％，敲除率为88.6％。

Claims (5)

1.一种PD-1基因重组病毒质粒，属逆转录病毒质粒，命名为慢病毒载体KGEN-0626，于2016年1月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：V201601，其序列为SEQ ID NO：1。
2.权利要求1所述PD-1基因重组病毒质粒的构建方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)使用EcoR1和Age1核酸内切酶和磷酸酶37℃处理30分钟去磷酸化Lenti-CRISPR/Cas9质粒；
2)以PD-1基因序列中2859-2878位的共20个碱基序列CACGAAGCTCTCCGATGTGT作为PD-1gRNA，在T4连接酶的作用下将PD-1gRNA引物序列与其互补的链经37℃孵育30分钟，95℃孵育5分钟，再以每分钟5℃的速度降温至25℃的条件退火合成PD-1双链DNA；
3)使用快速核酸连接酶将PD-1双链DNA与去磷酸化的Lenti-CRISPR/Cas9质粒连接，室温孵育10分钟即可得到重组病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro。
3.一种重组逆转录病毒Lenti-PD-1-Puro，其特征在于，包含有权利要求1所述的或者由权利要求2得到的PD-1基因重组病毒质粒。
4.权利要求3所述重组逆转录病毒Lenti-PD-1-Puro的包装方法，其特征在于，包括下述步骤：
1)将重组病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro转入Stbl3细菌，经氨苄青霉素筛选，扩增，纯化，测序；
2)转染前一天种293T细胞到10cm培养皿，细胞密度第二天长到细胞80％汇合；培养基为DMEM含10％胎牛血清、5000U的抗生素；
3)转染前2小时换新鲜培养基，将PD-1重组病毒质粒Lenti-CRISPR/Cas9-PD-1-Puro与质粒pSPAX、pMD2.G转染试剂混合到1.5ml离心管中；
4)将混合液轻轻混匀后室温放置10分钟后加入10ml细胞培养基中，轻摇混匀；
5)37℃，5％CO2细胞培养箱培养6小时后，更换新鲜培养基；
6)培养48小时后收集富含病毒的培养基，用0.45um的滤器过滤后分装保存于-80度，或直接用于感染T细胞。
5.权利要求3所述的或者由权利要求4得到的重组逆转录病毒Lenti-PD-1-Puro在制备用于治疗肿瘤细胞的免疫治疗体系中的应用。
CN201610083007.3A 2016-02-03 2016-02-03 PD‑1基因重组病毒质粒及构建、重组逆转录病毒Lenti‑PD‑1‑Puro及包装与应用 Active CN105671083B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610083007.3A CN105671083B (zh) 2016-02-03 2016-02-03 PD‑1基因重组病毒质粒及构建、重组逆转录病毒Lenti‑PD‑1‑Puro及包装与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610083007.3A CN105671083B (zh) 2016-02-03 2016-02-03 PD‑1基因重组病毒质粒及构建、重组逆转录病毒Lenti‑PD‑1‑Puro及包装与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105671083A CN105671083A (zh) 2016-06-15
CN105671083B true CN105671083B (zh) 2017-09-29

Family

ID=56304094

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610083007.3A Active CN105671083B (zh) 2016-02-03 2016-02-03 PD‑1基因重组病毒质粒及构建、重组逆转录病毒Lenti‑PD‑1‑Puro及包装与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105671083B (zh)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6261500B2 (ja) 2011-07-22 2018-01-17 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ ヌクレアーゼ切断特異性の評価および改善
US20150044192A1 (en) 2013-08-09 2015-02-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease
US9359599B2 (en) 2013-08-22 2016-06-07 President And Fellows Of Harvard College Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
US9526784B2 (en) 2013-09-06 2016-12-27 President And Fellows Of Harvard College Delivery system for functional nucleases
US9388430B2 (en) 2013-09-06 2016-07-12 President And Fellows Of Harvard College Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
US9840699B2 (en) 2013-12-12 2017-12-12 President And Fellows Of Harvard College Methods for nucleic acid editing
WO2016022363A2 (en) 2014-07-30 2016-02-11 President And Fellows Of Harvard College Cas9 proteins including ligand-dependent inteins
US20190225955A1 (en) 2015-10-23 2019-07-25 President And Fellows Of Harvard College Evolved cas9 proteins for gene editing
CN106191062B (zh) * 2016-07-18 2019-06-14 广东华南疫苗股份有限公司 一种tcr-/pd-1-双阴性t细胞及其构建方法
KR102547316B1 (ko) 2016-08-03 2023-06-23 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 아데노신 핵염기 편집제 및 그의 용도
AU2017308889B2 (en) 2016-08-09 2023-11-09 President And Fellows Of Harvard College Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof
CN106318911A (zh) * 2016-08-18 2017-01-11 安徽柯顿生物科技有限公司 一种用于大量扩增pd‑1基因重组活化t细胞的培养基、试剂盒及其应用
US11542509B2 (en) 2016-08-24 2023-01-03 President And Fellows Of Harvard College Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing
WO2018040537A1 (zh) * 2016-08-31 2018-03-08 南京凯地生物科技有限公司 人pd-1基因敲除的cldn18.2 特异性嵌合抗原受体t细胞的制备方法以及应用
CN106480027A (zh) * 2016-09-30 2017-03-08 重庆高圣生物医药有限责任公司 CRISPR/Cas9 靶向敲除人PD‑1基因及其特异性gRNA
KR20240007715A (ko) 2016-10-14 2024-01-16 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 핵염기 에디터의 aav 전달
US10745677B2 (en) 2016-12-23 2020-08-18 President And Fellows Of Harvard College Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection
US11898179B2 (en) 2017-03-09 2024-02-13 President And Fellows Of Harvard College Suppression of pain by gene editing
EP3592777A1 (en) 2017-03-10 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Cytosine to guanine base editor
US11268082B2 (en) 2017-03-23 2022-03-08 President And Fellows Of Harvard College Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable DNA binding proteins
CN107699591B (zh) * 2017-05-09 2020-06-09 山东兴瑞生物科技有限公司 一种敲除pd-1的t细胞制备方法及其应用
US11560566B2 (en) 2017-05-12 2023-01-24 President And Fellows Of Harvard College Aptazyme-embedded guide RNAs for use with CRISPR-Cas9 in genome editing and transcriptional activation
CN107354156B (zh) * 2017-07-19 2021-02-09 广州医科大学附属第五医院 一种敲除野生型T细胞TCR beta链的gRNA及方法
WO2019023680A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE)
WO2019139645A2 (en) 2017-08-30 2019-07-18 President And Fellows Of Harvard College High efficiency base editors comprising gam
US11795443B2 (en) 2017-10-16 2023-10-24 The Broad Institute, Inc. Uses of adenosine base editors
CA3130488A1 (en) 2019-03-19 2020-09-24 David R. Liu Methods and compositions for editing nucleotide sequences
GB2614813A (en) 2020-05-08 2023-07-19 Harvard College Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103820454B (zh) * 2014-03-04 2016-03-30 上海金卫生物技术有限公司 CRISPR-Cas9特异性敲除人PD1基因的方法以及用于特异性靶向PD1基因的sgRNA
US10280419B2 (en) * 2014-05-09 2019-05-07 UNIVERSITé LAVAL Reduction of amyloid beta peptide production via modification of the APP gene using the CRISPR/Cas system
CN104480144B (zh) * 2014-12-12 2017-04-12 武汉大学 用于艾滋病基因治疗的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及其慢病毒

Also Published As

Publication number Publication date
CN105671083A (zh) 2016-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105671083B (zh) PD‑1基因重组病毒质粒及构建、重组逆转录病毒Lenti‑PD‑1‑Puro及包装与应用
CN106191062B (zh) 一种tcr-/pd-1-双阴性t细胞及其构建方法
CN105296431B (zh) 肿瘤结合特异性γδTCR基因修饰的αβT细胞及其抑癌用途
CN109837306A (zh) 包载miRNA-204-5p的外泌体及其制备方法和应用
CN109678965A (zh) 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、cd22-cd19双靶向性的t细胞及其应用
CN106591363A (zh) 一种通用型异体car‑t细胞制备方法及应用
Alici et al. Anti-myeloma activity of endogenous and adoptively transferred activated natural killer cells in experimental multiple myeloma model
CN110325200B (zh) 治疗剂及其在治疗肿瘤和/或癌症的药物中的应用
CN107793482A (zh) 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、car133‑nkt 细胞及其制备方法和应用
CN107699591A (zh) 一种敲除pd‑1的t细胞制备方法及其应用
CN109293781A (zh) 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、cd19-cd20双靶向性的t细胞及其应用
CN109568351B (zh) 溶瘤病毒和car-t联合应用针对实体肿瘤的治疗
CN110016465A (zh) 一种包含b细胞及肿瘤双识别性t细胞的免疫细胞药物
Maleckar et al. Tumor-derived activated cells: culture conditions and characterization
US20150165007A1 (en) Therapeutic vaccine for treatment of diabetes type 1 in children, application of the cell sorter and the method of multiplying treg cells to produce therapeutic vaccine for treatment of diabetes type 1
WO2017079881A1 (zh) 增强对异常细胞杀伤力的方法和药物组合物
CN108395480A (zh) 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、carher2-nkt细胞及其制备方法和应用
KR20030081056A (ko) 종양, 감염증 및 자기면역질환의 예방/치료용ｈｌａ일치타인유래의 활성화림프구, 이 림프구를 사용한치료방법, 이 림프구를 주성분으로 하는 제제, 이 제제의제조방법 및 이 제제를 위한 조제용키트
US20220177839A1 (en) Composition, culture medium and method for inducing and/or amplifying tscm in vitro
JP3541950B2 (ja) 癌およびウイルス性疾患を治療するための改変化ｔａｌｌ−１０４細胞の使用
CN107475292A (zh) Pd‑1基因缺陷型t淋巴细胞制剂的制备方法
CN107708727A (zh) 一种用于治疗肝癌的肿瘤疫苗及其制备方法
CN115944650B (zh) 肿瘤浸润细胞在制备抗肿瘤药物中的应用及模型构建方法
CN105832769A (zh) 一种用于治疗肿瘤的免疫制剂及其制备方法
Marchand et al. Increased frequency of immunogenic variants obtained by repeated mutagen treatment of mouse mastocytoma P815

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant