CN104480144B

CN104480144B - 用于艾滋病基因治疗的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及其慢病毒

Info

Publication number: CN104480144B
Application number: CN201410770508.XA
Authority: CN
Inventors: 郭德银; 陈述亮; 侯盼盼; 陈宇
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2014-12-12
Filing date: 2014-12-12
Publication date: 2017-04-12
Anticipated expiration: 2034-12-12
Also published as: CN104480144A

Abstract

本发明属于医药及生物工程领域，涉及一种可用于艾滋病基因治疗的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及其慢病毒，该重组慢病毒载体由慢病毒载体lentiCRISPR用BsmBI酶切后，连入带BsmBI粘性末端的CXCR4特异靶序列重组而得，获得的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体能够在艾滋病毒辅助受体CXCR4的4个不同位点突变基因序列，且突变率高，达25%‑75%。经过重组慢病毒载体改造后的细胞不能被HIV感染。该方法较RNAi‑Knockdown、ZFN和TALEN技术具有更高的抑制艾滋病毒复制的效率，该系统构建快速、简单、廉价且能阻止HIV病毒入侵，适合用于艾滋病基因治疗。

Description

用于艾滋病基因治疗的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及其慢病毒

技术领域

本发明属于医药及基因工程领域，更具体地涉及可用于艾滋病基因治疗的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体系统的构建及应用。

背景技术

由艾滋病毒(HIV)感染引起的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)是全世界面临的主要健康威胁之一。据2013年11月11日发布的我国卫生部、联合国艾滋规划署和世界卫生组织联合对我国艾滋病的评估显示：截至2013年08月31日，中国现存的艾滋病病毒感染者和病人约428,867例，死亡127758例。艾滋病疫情严峻，而目前仍然没用有效的疫苗。尽管目前治疗艾滋病的药物(如“鸡尾酒”疗法HAART)能有效地延长患者生存时间，但因长期用药引起的抗药性及严重的副反应使得该疗法难以继续进行。因此，艾滋病新的治疗方法亟待研发。

研究表明艾滋病基因治疗是取代药物治疗的可行方式，患者无需依赖于长期的药物治疗。基于慢病毒载体的艾滋病基因治疗研究，国际上已有方案进入了临床Ⅰ/Ⅱ期阶段，其中一命名为“OZ1”的艾滋病基因治疗试验在临床Ⅱ期取得了较大成功(Mitsuyasu,Merigan et al.2009)；2014年，美国宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院经过5年的临床实验，将12位HIV患者的造血干细胞中CCR5基因分别敲除后再进行自体造血干细胞移植，大部分患者检测不到HIV病毒(Tebas,Stein et al.2014)；已有研究发现利用ZFN技术对CXCR4进行永久敲除后的CD4+T细胞可以建立稳定的HIV-1抗性且在外周血单核细胞移植后的NSG小鼠内实现更低的病毒滴度(Yuan,Wang et al.2012)。因此，基因治疗代表了一种新的、具有潜力的、长期有效的疾病控制方式，而近期基于CRISPR/Cas9基因治疗技术又为艾滋病治疗开辟了新的途径。

1987年，日本大阪大学(Osaka University)研究人员在对一种细菌编码的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)基因进行研究时，发现在这个基因编码区域的附近存在一小段不同寻常的DNA片段，这些片段是由简单的重复序列组成，而且在片段的两端还存在一段不太长的特有的序列，正是这个特有的序列以后被证明发挥了DNA的定向识别功能。CRISPR：(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是一个特殊的DNA重复序列家族，CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats)组成，重复序列长度通常21～48bp,重复序列之间被26～72bp间隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列(space)与靶基因进行识别。这些间隔重复序列首先转录成一个长的RNA前体，继而在重复序列中剪接加工成小的crRNA，crRNA特异性地识别靶位点。Cas(CRISPRassociated)存在于CRISPR位点附近，是一种双链DNA核酸酶。它与folk核酸内切酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体就能发挥作用。Cas在crRNA的指导下在特定的位点切割双链DNA。此过程还需要一个小的RNA tracrRNA(trans-activating crRNA)和RNAse III。CRISPR-Cas是很多细菌和大部分古生菌的获得性免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性识别，利用Cas蛋白进行切割，从而达到对自身的免疫保护(Wiedenheft,Sternberget al.2012)。

CRISPR/Cas9基本机制为：CRISPR序列首先转录并进一步被酶切加工成crRNA，crRNA指导Cas蛋白在靶位点进行切割。Cas9蛋白作为一个RNA指导的核酸内切酶，其运用双指导RNA包括crRNA和tracrRNA对靶位点进行识别和切割。Cas9具有两个不同的酶切活性位点分别切割双链DNA的一条链。Cas9–RNA首先结合PAM序列(5’-NGG-3’)进而搜索与sgRNA互补的靶位点。与PAM位点结合后导致靶位点的双链DNA变得不稳定继而解链，sgRNA就与互补链形成RNA–DNA杂合双链。正确地与靶位点结合后Cas9蛋白双酶切活性被激活从而在靶位点处引起双链断裂(double-stranded breaks DSB)，断裂的双链DNA通过非同源末端直接连接(nonhomologous end joining，NHEJ)或者同源重组(homology-directed repair，HDR)进行修复。修复后的DNA由于碱基的随机插入或删除引起移码突变从而抑制基因的表达，这就实现了在DNA水平上对基因进行定向敲除(Cong,Ran et al.2013)。

RNA指导的Cas9基因工程技术已在动物、植物以及微生物中得到广泛应用(Hsu,Lander et al.2014)。在艾滋病防治方面已有利用CRISPR/Cas9系统对艾滋病毒的另一辅助受体CCR5进行基因修饰(Cradick,Fine et al.2013,Ye,Wang et al.2014)，尽管对CD4⁺T细胞或者CD34⁺干细胞的CCR5基因进行修饰后可以在一定程度上阻止HIV-1病毒入侵，然而由于CCR5和CCR2高度同源性，使得针对CCR5基因设计的CRISPR/Cas9系统的脱靶率很高，且在病毒感染的急性期HIV-1病毒主要利用CCR5为辅助受体，一旦建立稳定感染HIV-1病毒转而利用CXCR4为辅助受体，因此在艾滋病患者体内通常(高达50％)存在既可以利用CCR5也可以利用CXCR4为辅助受体的双嗜型病毒，因此仅仅局限于敲除CCR5基因对艾滋病的彻底清除和防治有一定的限制。

参考文献：

1、Cong,L.,F.A.Ran,D.Cox,S.Lin,R.Barretto,N.Habib,P.D.Hsu,X.Wu,W.Jiang,L.A.Marraffini and F.Zhang(2013)."Multiplex genome engineering usingCRISPR/Cas systems."Science 339(6121):819-823.

2、Cradick,T.J.,E.J.Fine,C.J.Antico and G.Bao(2013)."CRISPR/Cas9systems targeting beta-globin and CCR5genes have substantial off-targetactivity."Nucleic Acids Res 41(20):9584-9592.

3、Hsu,P.D.,E.S.Lander and F.Zhang(2014)."Development and Applicationsof CRISPR-Cas9for Genome Engineering."Cell 157(6):1262-1278.

4、Kimata,J.T.,J.J.Gosink,V.N.KewalRamani,L.M.Rudensey,D.R.Littman andJ.Overbaugh(1999)."Coreceptor specificity of temporal variants of simianimmunodeficiency virus Mne."J Virol 73(2):1655-1660.

5、Mitsuyasu,R.T.,T.C.Merigan,A.Carr,J.A.Zack,M.A.Winters,C.Workman,M.Bloch,J.Lalezari,S.Becker,L.Thornton,B.Akil,H.Khanlou,R.Finlayson,R.McFarlane,D.E.Smith,R.Garsia,D.Ma,M.Law,J.M.Murray,C.von Kalle,J.A.Ely,S.M.Patino,A.E.Knop,P.Wong,A.V.Todd,M.Haughton,C.Fuery,J.L.Macpherson,G.P.Symonds,L.A.Evans,S.M.Pond and D.A.Cooper(2009)."Phase 2gene therapytrial of an anti-HIV ribozyme in autologous CD34+cells."Nat Med 15(3):285-292.

6、Morner,A.,A.Bjorndal,J.Albert,V.N.Kewalramani,D.R.Littman,R.Inoue,R.Thorstensson,E.M.Fenyo and E.Bjorling(1999)."Primary human immunodeficiencyvirus type 2(HIV-2)isolates,like HIV-1isolates,frequently use CCR5but showpromiscuity in coreceptor usage."J Virol 73(3):2343-2349.

7、Tebas,P.,D.Stein,W.W.Tang,I.Frank,S.Q.Wang,G.Lee,S.K.Spratt,R.T.Surosky,M.A.Giedlin,G.Nichol,M.C.Holmes,P.D.Gregory,D.G.Ando,M.Kalos,R.G.Collman,G.Binder-Scholl,G.Plesa,W.T.Hwang,B.L.Levine and C.H.June(2014)."Gene editing of CCR5in autologous CD4T cells of persons infected with HIV."N Engl J Med 370(10):901-910.

8、Wiedenheft,B.,S.H.Sternberg and J.A.Doudna(2012)."RNA-guidedgenetic silencing systems in bacteria and archaea."Nature 482(7385):331-338.

9、Ye,L.,J.Wang,A.I.Beyer,F.Teque,T.J.Cradick,Z.Qi,J.C.Chang,G.Bao,M.O.Muench,J.Yu,J.A.Levy and Y.W.Kan(2014)."Seamless modification of wild-type induced pluripotent stem cells to the natural CCR5Delta32mutationconfers resistance to HIV infection."Proc Natl Acad Sci USA.

10、Yuan,J.,J.Wang,K.Crain,C.Fearns,K.A.Kim,K.L.Hua,P.D.Gregory,M.C.Holmes and B.E.Torbett(2012)."Zinc-finger nuclease editing of humancxcr4promotes HIV-1CD4(+)T cell resistance and enrichment."Mol Ther 20(4):849-859.

发明内容

为了实现对双嗜型以及CXCR4单嗜型HIV-1病毒的抗性，抑制传播性感染，我们设计出针对艾滋病毒侵入相关的辅助受体CXCR4进行基因修饰的CRISPR/Cas9系统，阻断其表达，从而抑制病毒入侵，实现细胞内病毒的清除。

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供含有CXCR4基因的特异靶序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体；本发明的目的之二在于提供含CRISPR/Cas9重组慢病毒载体的慢病毒；本发明的目的之三在于提供该CRISPR/Cas9重组慢病毒载体在制备诱导CXCR4突变试剂中的应用；本发明的目的之四在于提供该CRISPR/Cas9重组慢病毒载体在制备HIV病毒抑制剂中的应用。

1、含有CXCR4的特异靶序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体，所述CRISPR/Cas9重组慢病毒载体由慢病毒载体lentiCRISPR用BsmBI酶切消化去除1.8Kb的间隔片段后，连入带BsmBI粘性末端的CXCR4特异靶序列重组而得。

优选的，CXCR4的特异靶序列如SEQ ID NO.1-4任意一项所示。

2、含CRISPR/Cas9重组慢病毒载体的慢病毒，由辅助质粒psPAX2和pMD2.G帮助含CXCR4的特异靶序列的重组慢病毒载体lentiCRISPR在细胞中包装成为慢病毒。

本发明的详细描述：

本发明选择了HIV-1病毒的辅助受体即宿主蛋白CXCR4作为靶标，筛选了多个人和恒河猴基因保守的靶位点(10个靶位点见表1)，构建了高效率的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体系统。构建方法如下：

1)、选择慢病毒载体lentiCRISPR

本申请选择的慢病毒载体是lentiCRISPR(Feng Zhang，Science，2013)，该载体含有一个U6启动子用来控制sgRNA的表达，在用BsmBI酶切消化去除1.8Kb的间隔片段后可以插入含BsmBI粘性末端和20bp sgRNA的片段。BsmBI位点后有85bp的crRNA序列为sgRNA提供骨架。之后是EFS的启动子位点来控制人类编码最优的SpCas9的表达。接着是称为P2A的自切割多肽，同时还含有筛选基因Puromycin的编码序列以便于细胞筛选。

表1、人和恒河猴CXCR4基因的保守靶位点

靶编号	靶序列5’-3’
		1	GAAGAAACTGAGAAGCATGA
2	GAAGCATGACGGACAAGTAC
		3	GCCGTGGCAAACTGGTACTT
4	GAAGCTGTTGGCTGAAAAGG
		5	GCTGAAAAGGTGGTCTATGT
6	GCTTCTACCCCAATGACTTG
		7	GTTCCAGTTTCAGCACATCA
8	CCATCTACTCCATCATCTTC
		9	TGTCATCTACACAGTCAACC
10	CTACAGCAGTGTCCTCATCC

2)、敲除CXCR4基因的重组慢病毒载体lentiCRISPR的构建

a、选择10个人与恒河猴的CXCR4基因保守靶位点，化学合成寡核苷酸链，格式如下：

反义链：与有义链互补，分别在有义链5’端添加CACC，在反义链5’端添加AAAC以产生BsmBI的粘性末端。(注：19N表示靶位点的19个碱基序列)

b、有义链、反义链退火，形成带BsmBI粘性末端的片段；

c、将以上片段连接至载体lentiCRISPR(由BsmBI进行酶切)；

d、转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞(Stbl3菌株购自ATCC)；

e、筛选阳性克隆，并测序鉴定。

3)、敲除CXCR4基因的重组慢病毒载体lentiCRISPR的有效性验证。

将所构建的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体转染Ghost CD4/CXCR4细胞(购买自ATCC)，48小时后收取细胞提取其基因组，PCR扩增CXCR4基因，产物经T7Endonuclease I(购买自BioLabs)酶切鉴定。结果表明：所设计的针对CXCR4基因的5个靶位点都有不同程度的突变。申请人进一步将PCR产物连接至T-easy载体(购买自Promega)后进行测序鉴定，结果证实CXCR4基因的4个靶位点具有不同程度的基因插入或缺失，甚至移码突变。具体结果如下所示：

CXCR4基因靶点	基因突变率
		靶点1GAAGAAACTGAGAAGCATGA	75％
靶点2GAAGCATGACGGACAAGTAC	0
		靶点6GCTTCTACCCCAATGACTTG	25％
靶点7GTTCCAGTTTCAGCACATCA	60％
		靶点8CCATCTACTCCATCATCTTC	50％

4)、敲除CXCR4基因的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体系统阻止HIV入侵的有效性验证。

为了进一步提高CRISPR/Cas9重组慢病毒载体的基因敲除效率，方便以后改造人和恒河猴造血干细胞，利用CRISPR/Cas9重组慢病毒载体在HEK-293T细胞中包装成慢病毒。慢病毒包装载体包括：不同靶点的重组lentiCRISPR载体，psPAX2包装质粒(购自Addgene)，pMD2.G包膜质粒(购自Addgene)。

为了检测CRISPR/Cas9重组慢病毒载体的基因敲除效率，用6号和7号靶点的lentiCRISPR载体包装的慢病毒建立了基于Ghost CD4/CXCR4细胞系(Kimata,Gosink etal.1999,Morner,Bjorndal et al.1999)的CXCR4基因缺失稳定细胞系：Ghost CD4+/CXCR4-细胞系。然后用PE标记的CXCR4抗体(购自BioLegend公司)对以上稳定细胞系进行了流式检测以测定CXCR4膜蛋白表达水平。同时检测了改造后的细胞中HIV的感染水平，结果表明CRISPR/Cas9重组慢病毒载体改造后的细胞中HIV水平显著降低。

3、所述CRISPR/Cas9重组慢病毒载体在制备诱导CXCR4突变试剂中的应用。

4、所述CRISPR/Cas9重组慢病毒载体在制备HIV病毒抑制剂中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明公开了一种含有CXCR4的特异靶序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及其慢病毒和应用，该CRISPR/Cas9重组慢病毒载体能够突变艾滋病毒侵入相关的宿主膜蛋白CXCR4的基因序列，且敲除率高达25％-75％，因此，能用于将来的艾滋病基因治疗，避免或延缓病毒的入侵，并抑制病毒的感染传播。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：

图1为含有CXCR4的特异靶序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体系统的构建流程图。

图2为Ghost CD4/CXCR4细胞转染含有CXCR4的特异靶序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体，48小时后收集细胞提取其基因组，PCR扩增CXCR4基因，产物经T7Endonuclease I酶切电泳检测结果图；

M为分子量标记，以Con为对照，1-10为所选择的CXCR4的靶点。PCR产物全长为783bp，T7Endonuclease I酶在不完全匹配的双链DNA处切割产生了大小不一的小DNA片段，例如靶点1就产生了613bp和170bp的小片段。

图3为针对CXCR4基因所设计的1、2、6、7、10靶点的PCR产物T克隆测序结果图；

括号中“，”前面的-和+分别代表突变的位置在PAM位点的上下游，数字表示具体的位置；括号中“，”后面的-和+表示碱基缺失或插入，数字代表缺失或插入的碱基数，分数代表野生型或突变型的比例)。举例：靶点1#sgRNA能够介导Cas9在1#PAM区上游第4个碱基前切割CXCR4基因，同时插入一个碱基(A)引起移码突变，即(-4，+1)；1#sgRNA也能够介导Cas9在1#PAM区前面切割CXCR4基因，缺失3个碱基，即(0，-3)；1#sgRNA还能够介导Cas9在1#PAM区下游第23位碱基前切割CXCR4基因，缺失18个碱基，即(+23，-18)。2#sgRNA介导Cas9切割效率较低，测序分析全为野生型CXCR4基因。6#sgRNA能够介导Cas9在6#PAM区上游第6个碱基前切割CXCR4基因，缺失110个碱基，即(-6，-110)。7#sgRNA能够介导Cas9在7#PAM区上游第8、11和18位进行突变，即(-8/-11/-18,mut)；7#sgRNA也能够介导Cas9在7#PAM区下游第1位和上游第15位前面分别进行切割，并分别缺失15个和3个碱基，即(+1/-15/,-15/-3)；7#sgRNA能够介导Cas9在7#PAM区上游第3个碱基前切割CXCR4基因，通过非同源末端连接的方式插入一个碱基(A)，即(-3，+1)。8#sgRNA能够介导Cas9在10#PAM区上游第17个碱基前切割CXCR4基因，同时插入一个碱基(T或者A)，即(-17，+1)；8#sgRNA也能够介导Cas9在8#PAM区上游第20个碱基突变，即(-20，mut)；8#sgRNA还能够介导Cas9在8#PAM区上游第17个碱基前切割CXCR4基因，缺失261个碱基，即(-17，-261)。

图4为含有CRISPR/Cas9重组慢病毒载体的慢病毒改造Ghost CD4/CXCR4细胞后用流式细胞仪检测改造效果图；Con为对照。

图5为免疫印迹实验检测Ghost CD4+/CXCR4^-稳定细胞系的CXCR4膜蛋白表达图；Con为对照。

图6为流式细胞仪检测Ghost CD4+/CXCR4^-稳定细胞系中PE-CXCR4阴性细胞率结果图。

图7为用HIV NL4-3病毒感染Ghost CD4/CXCR4细胞和改造成功的Ghost CD4+/CXCR4-细胞系，3天后流式细胞仪检测GFP阳性细胞结果图；

GFP代表HIV在细胞中的表达水平，(1)是阴性对照，(2)是未改造Ghost CD4/CXCR4细胞作为阳性对照，(3)和(4)分别是6号和7号靶点改造成功的Ghost CD4+/CXCR4-细胞系。

图8为用HIV NL4-3病毒感染Ghost CD4/CXCR4细胞和改造成功的Ghost CD4+/CXCR4-细胞系1天、2天、3天、4天、5天，分别取样，用ELISA法检测病毒P24的表达结果图；Con为对照。

图9为用HIV NL4-3病毒感染Ghost CD4/CXCR4细胞和改造成功的Ghost CD4+/CXCR4-细胞系1天、2天、3天、4天，收取细胞提取基因组定量检测gag基因的表达结果图；Con为对照。

具体实施方式

本发明的技术方案可以通过以下实施例加以说明，但不能以此限制本发明。具体实施例如下：

【实施例1】构建含有CXCR4的特异靶序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体1、靶向HIV辅助受体CXCR4基因的靶点序列保守性分析

为了明确申请人所选择的CXCR4靶点序列在人和猴中的保守性，申请人应用National Center For Biotechnology Information Database中的BLAST软件对人和恒河猴CXCR4基因的序列保守性进行了分析。在保守的外显子区域选择符合CRISPR-Cas9结合基因组的特征[5’-G(19N)-NGG3’或者5’-CCN(19N)C-3’]靶序列。我们设计了10个靶位点(表1)，所有靶点序列在人和猴中完全一致(100％)。2、重组lenti-CRISPR构建和基因编辑效果鉴定

被改造的慢病毒载体是pLentiCRISPR(Addgene plasmid ID:52961)，该载体含有一个U6启动子用来控制sgRNA的表达，同时还含有一个EFs启动子用来控制hCas9的表达。

a、化学合成寡核苷酸链，根据CRISPR-Cas9识别靶位点的原理，设计如下靶序列合成引物，格式如下(源于Addgene数据库)：

反义链：与有义链互补；

分别在有义链5’端添加CACC，在反义链5’端添加AAAC以产生BsmBI的粘性末端，注：19N表示靶位点的19个碱基序列。

b、有义链、反义链退火，形成带BsmBI粘性末端的片段；

退火体系：

退火程序：95℃5min，90℃5min，85℃5min，80℃5min，72℃10min，65℃5min，60℃5min，55℃5min，50℃5min，45℃5min，40℃5min，35℃5min，30℃5min，4℃保存。

c、将以上退火片段连接至由BsmBI进行酶切后的载体lentiCRISPR(参见图1)；

d、转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞(购自ATCC)；

e、筛选阳性克隆并测序鉴定；

转化12小时后挑单菌落做菌落PCR初步鉴定出阳性克隆，5'端引物为U6启动子正向引物(hU6-F:5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3')，3'端引物为不同靶点的反义链。

PCR体系如下：

挑初步鉴定的阳性克隆进一步做测序分析。

f、将所构建的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体转染Ghost CD4/CXCR4细胞(购买自ATCC)，48小时后收集细胞提取其基因组，PCR扩增CXCR4基因，CXCR4基因的5’引物为：TGGGCTCAGGGGACTATGACTCCATGAAGG；3’引物为CAAACTCACACCCTTGCTTGATGATTTCCA。

PCR体系如下：

PCR程序：95℃5min，95℃30s→56℃30s→68℃1min共进行30个循环，最后68℃10min，4℃保存。所有循环结束后，暂停反应，在反应体系中加0.5μl taq酶，72℃40min给PCR片段加A尾。

将上述PCR片段使用胶回收试剂盒回收(购买自OMEGA)，回收的10个PCR片段经T7Endonuclease I(购买自BioLabs)酶切鉴定。

酶切体系：

55℃反应30min，酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

结果表明(参见图2)：针对CXCR4基因的各个靶位点都有不同程度的突变，其中1、2、6、7、8号靶点具有一定的效果，6、7号效果最为明显，选取这五个靶点进行T克隆测序。

将PCR产物连接至T-easy载体(购买自Promega)并测序鉴定T克隆连接体系：

将上述连接产物转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞，筛选阳性克隆并测序鉴定。

结果显示(图3)1、6、7、8号靶点都有碱基的插入或缺失，1号效果最为明显，综合T7Endonuclease I酶切实验和T克隆测序选取6、7号靶点做进一步研究。

CXCR4基因靶点	基因突变率
		靶点1	75％
靶点2	0
		靶点6	25％
靶点7	60％
		靶点8	50％

【实施例2】CRISPR/Cas9慢病毒系统的包装

为了进一步提高CRISPR/Cas9重组慢病毒载体的基因敲除效率，利用CRISPR/Cas9重组慢病毒载体在HEK-293T细胞中包装成慢病毒。

慢病毒包装载体为：

不同靶点的lentiCRISPR载体

psPAX2慢病毒辅助包装质粒(购自Addgene)

pMD2.G慢病毒辅助包膜质粒(购自Addgene)

具体过程如下：

1)转染前24小时铺HEK-293T细胞(购自CCTCC)于一个直径10cm的细胞培养皿中。

2)转染时细胞汇合度以80～90％为宜，以标准的Lipofectamine2000转染试剂将上述质粒共转染细胞，转染后6小时换液。

转染体系：

先将三种不同量的质粒DNA加入500μl Opti-MEM中，再将Lipofectamine2000加入500μl Opti-MEM中，然后将稀释后的DNA加入到稀释后的转染试剂中，混匀静止放置5min后，加入到培养皿里，培养6小时后换液。

转染后60小时收集病毒上清(即细胞培养基)过滤分装，-80℃保存。

病毒滴度检测：将病毒上清以10倍梯度稀释，利用病毒计数仪(virocyt^TM2100)直接进行病毒滴度的测定，如病毒滴度为1.5x10⁷。为了检测活病毒含量，将病毒稀释150倍后(1.0x10⁴)，感染293T细胞(1.0x10⁴)，即m.o.i.＝1.0,48小时之后加入puromycin药物(终浓度2μg/ml)检测活细胞比率(没有病毒感染的细胞因不能表达puromycin抗性基因被药物杀死)，根据活细胞数量计算出病毒滴度。如活细胞数量为N，则病毒滴度为(N/1.0x10⁴)x1.5x10⁷。

【实施例3】利用CRISPR/Cas9重组慢病毒建立稳定敲除CXCR4基因的细胞系1)用实施例2中包装的慢病毒以m.o.i.为100(1ml病毒上清加到含4ml DMEM细胞中)感染GhostCD4/CXCR4细胞，48小时后流式检测CXCR4阳性细胞比率，未经改造的Con细胞其PE-CXCR4阳性细胞率为87.1％，而经lentiCRISPR6#和7#改造的细胞其PE-CXCR4阳性细胞率分别为23.5％和29.5％。相比于对照分别下调了73.02％和66.1％(图4)。

2)收集一小部分细胞进行Westernblot实验检测CXCR4的表达水平(图5)；

3)将其余的细胞用PE-CXCR4抗体进行流式分选，分选之后检测稳定细胞系的纯度，结果见图6，传代培养分选的细胞至适宜细胞数量。

【实施例4】CRISPR/Cas9重组慢病毒载体改造的细胞系Ghost CD4⁺/CXCR4-对HIV-1感染的抑制水平检测

利用NL4-3质粒在HEK-293T细胞中包装成HIV-1型病毒，

1)转染前24小时铺HEK-293T细胞(购自CCTCC)于一个直径10cm的细胞培养皿中；

2)转染时细胞汇合度以80～90％为宜，先将NL4-3质粒加入500μl Opti-MEM中，再将PEI转染试剂加入到500μl Opti-MEM中，然后将稀释后的DNA加入到稀释后的转染试剂中，混匀静止放置5min后将混合物加入到细胞中，培养6小时后换液。转染后48小时收集病毒上清(即细胞培养基)过滤分装，-80℃保存备用。

转染体系：

3)病毒滴度检测：将病毒上清以10倍梯度稀释，利用病毒计数仪进行病毒滴度的初步测定。用滴度测定的病毒感染Ghost CD4/CXCR4细胞，48小时之后流式检测GFP阳性细胞比率，并以比率在0.1-10％之间的稀释度进一步精确计算出病毒滴度。

4)用上述包装的HIV-1病毒以m.o.i.为1感染Ghost CD4/CXCR4细胞和改造成功的Ghost CD4⁺/CXCR4^-细胞系。利用流式检测GFP阳性实验(图7)以证实HIV病毒的入侵，3天后流式检测GFP阳性细胞，与con相比，6、7靶点修饰后的细胞(6#、7#)的感染率大大降低，GFP代表HIV在细胞中的表达水平；HIV-1病毒感染细胞1天、2天、3天、4天、5天分别取样检测病毒P24的表达量，P24ELISA实验表明，和con相比，改造后细胞中的病毒P24表达量在3天后显著降低(图8)；HIV-1病毒感染细胞1天、2天、3天、4天后收取细胞提取基因组，定量检测GAG基因的表达量，观察HIV-1病毒基因组复制水平，结果表明和con相比，经过改造的细胞中(6#、7#)GAG基因的相对表达量显著下调了(图9)。

以上实施例证实该发明方法能够成功地改造细胞，阻止HIV感染。今后可用于改造胚胎干细胞、造血干细胞等进行艾滋病的临床基因治疗。

序列表

<110> 武汉大学

<120> 用于艾滋病基因治疗的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及其慢病毒

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> CXCR4靶点1核苷酸序列

<400> 1

gaagaaactg agaagcatga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> CXCR4靶点6核苷酸序列

<400> 2

gcttctaccc caatgacttg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> CXCR4靶点7核苷酸序列

<400> 3

gttccagttt cagcacatca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> CXCR4靶点10核苷酸序列

<400> 4

ccatctactc catcatcttc 20

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> U6启动子正向引物

<400> 5

gagggcctat ttcccatgat t 21

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> CXCR4基因的5’引物

<400> 6

tgggctcagg ggactatgac tccatgaagg 30

<210> 7

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<223> CXCR4基因的3’引物

<400> 7

caaactcaca cccttgcttg atgatttcca 30

Claims

1.含有CXCR4的特异靶序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体，所述CRISPR/Cas9重组慢病毒载体由慢病毒载体lentiCRISPR用BsmBI酶切后，连入带BsmBI粘性末端的CXCR4特异靶序列重组而得，其特征在于：CXCR4的特异靶序列如SEQ ID NO.1-4任意一项所示，所有靶序列位于人和恒河猴基因保守区，并且在人和恒河猴中完全一致。

2.含有权利要求1所述的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体的慢病毒。

3.根据权利要求2所述的慢病毒，其特征在于：由辅助质粒psPAX2和pMD2.G帮助含CXCR4的特异靶序列的重组慢病毒载体lentiCRISPR在细胞中包装成为慢病毒。

4.权利要求1所述的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体在制备诱导CXCR4突变试剂中的应用。

5.权利要求1所述的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体在制备HIV病毒抑制剂中的应用。