CN107312798B

CN107312798B - 含特异靶向CCR5基因的gRNA序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及应用

Info

Publication number: CN107312798B
Application number: CN201710457591.9A
Authority: CN
Inventors: 郭德银; 陈宇; 刘杏; 陈述亮
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2017-06-16
Filing date: 2017-06-16
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2037-06-16
Also published as: CN107312798A

Abstract

本发明公开了含特异靶向CCR5基因的gRNA序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及应用。通过构建含有特异靶向CCR5基因Δ32区域的gRNA序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体获得的慢病毒能够将CCR5特异性的CRISPR/Cas9系统导入细胞，在CCR5基因的特异位点产生双链断裂，经过非同源重组末端结合的修复方式修复后在断裂位点引入随机突变，且突变率高达90%左右。由于gRNA是在CCR5和CCR2的非同源区，经检测，两条gRNA的脱靶效率低于0.2%。经过重组慢病毒改造后的细胞被HIV感染的效率明显下降。该系统构建快速、简单、廉价，适合用于艾滋病基因治疗。

Description

含特异靶向CCR5基因的gRNA序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，更具体地说涉及CRISPR/SaCas9特异性敲除人CCR5基因的方法以及用于特异性靶向CCR5基因的gRNA。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(HIV)属于慢病毒属逆转录病毒科，能引起HIV病毒感染和获得性免疫缺陷综合征(AIDS)。AIDS是人体免疫系统进行性失效的状态，从而引起威胁生命的机会感染和癌症等，如果不进行治疗，感染HIV后的平均存活时间大概只有9到11年，而且取决于感染的HIV亚型。自从1981年第一次临床发现AIDS，越来越多的人被检测出HIV感染，30多年过去了，HIV仍然是一个全球性的公共健康问题。目前有大概3400万人感染了HIV，在2014年，全球就有120万人死于HIV感染引起的疾病。虽然抗逆转录病毒药物的治疗可以控制病毒从而使患者可以享受健康和更长的寿命，但是目前还没有有效的方法可以治愈HIV感染。因此亟需研究新的艾滋病治疗方法，近期兴起的基因疗法有较好的前景，很多课题组都做过相关的研究。

HIV通常利用CCR5或CXCR4作为辅助受体进入靶细胞，但是CCR5是自然感染时更主要的辅助受体，而且CCR5嗜性的毒株在感染的早期比较普遍，而CXCR4嗜性的毒株出现在病毒感染的后期。CCR5-△32是基因的缺失突变，CCR5基因的32bp缺失对应它的第二个胞外环，这种缺失的基因不表达CCR5受体，因此可以阻止HIV的感染。1996年，缺失细胞表面的CCR5辅助受体第一次被考虑作为抵御HIV感染的方法，接着，有几种方法已经被用来以CCR5为靶标发展新的HIV治疗方法。下调或抑制CCR5基因表达的方法包括锌指核酶(Zinc-finger nuclease，ZFN)，转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator-likeeffector nucleases，TALEN),和CRISPR/Cas9等。Tebas等人在2014年的时候报道了他们使用ZFN修改自体CD4+T细胞来治疗HIV病人，Mock等人在2015年报道了用TALEN技术来敲除CCR5基因，这种技术可以保护细胞免受CCR5嗜性的HIV病毒感染，但是并不能完全地抑制HIV的复制。这两种已有的技术还很难满足需求，所以人们期待找到更高效的敲除CCR5基因的策略。

CRISPR/Cas系统是从细菌和古生菌对抗外来病毒或质粒的适应性免疫系统发展而来，包括三种不同的类型，其中TypeⅡ型的CRISPR/Cas系统的DNA内切酶Cas9只有一个亚基，结构最为简单，所以应用也最广泛。除了Cas9蛋白外，该系统还包括两条短的CRISPRRNAs(crRNAs)和trans-activating crRNAs(tracrRNA)。成熟的crRNA-tracrRNA复合体可以通过碱基互补配对指导Cas9蛋白到靶序列上，并在PAM(protospacer adjacent motif)附近特异性剪切DNA双链，形成DSB(double strand break)。DSB可以通过两种途径被修复，一种是非同源重组的末端接合(Non-Homologous End Joining NHEJ)DNA修复方式，另一种是同源重组修复(Homology Directed Repair HDR)方式。NHEJ修复方式可能产生碱基的插入或缺失，从而产生移码突变，或者也可能突变成终止密码子，这些突变形式都可以改变目的基因的开放阅读框；HDR方式需要一段与被剪切片段同源的模板片段来修复DSB，这种修复方式可以将被用来作为模板的同源片段的序列复制到目的基因中，所以可以利用这种修复方式将特定的基因片段引入到目的基因中。

由于CRISPR/Cas系统具有操作简单，切割效率更高等特点，这一系统被认为有更好的应用前景。开发出一些高效、靶向CCR5基因，并且具有较低脱靶效率的gRNA，对于CRISPR/Cas9系统充分发挥作用极为重要，并具有较大的应用价值。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种含有特异靶向CCR5基因的gRNA序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体，可以有效的突变CCR5基因并抑制其表达，从而抑制HIV对细胞的感染。

为达到以上目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种含有特异靶向CCR5基因的gRNA序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体，所述CRISPR/Cas9重组慢病毒载体由慢病毒载体lentilCRISPR v2(AddgeneID:52961)用BsmBI酶切后，连入带BsmBI粘性末端的特异靶向CCR5基因的gRNA序列重组而得，特异靶向CCR5基因的gRNA序列如SEQ ID NO.1或2所示，该靶序列位于CCR5基因Δ32区域，且在CCR5和CCR2的非同源区。

第二方面，本发明提供含第一方面所述CRISPR/Cas9重组慢病毒载体的慢病毒。

第三方面，本发明提供第一方面所述CRISPR/Cas9重组慢病毒载体在制备诱导CCR5突变试剂中的应用。

第四方面，本发明提供第一方面所述CRISPR/Cas9重组慢病毒载体在制备用于治疗和/或预防HIV感染的药物的应用。

本发明技术方案通过以下具体实施例实现：

一、靶向人基因组中CCR5基因的高效gRNA及其靶位点序列的设计及构建。

在Genebank中找到CCR5的基因序列，通过Crispr设计工具及gRNA的设计原则，评估CCR5序列上得分较高的靶位点设计gRNA，其评估原则包括：1)序列下游是否有PAM(NGG)，2)靶位点不能与人类基因组序列相同或相似，脱靶效率低(图1)；

根据设计的gRNA，在其5’末端加上CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5’末端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列，分别合成正向和反向寡核苷酸序列，然后将合成的序列变性、退火，得到具有BsmBI粘性末端的双链DNA片段，如下：

正向：5’-CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

反向：NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’

将双链DNA片段和用BsmBI酶切过的lentilCRISPR v2载体进行连接；将连接产物转化到大肠杆菌JM109感受态细胞中，涂布于带有氨苄青霉素抗性的LB平板上，筛选阳性菌落，提取阳性菌落质粒进行分析及测序，确定gRNA表达载体构建成功(命名为lentiCRISPRv2-CCR5gRNA)。

二、引导CRISPR/Cas9系统高效突变CCR5基因特定位点的gRNA的筛选及突变效率的测定。

在293T细胞系中分析检测gRNA对于CCR5基因的突变效率，筛选到2条有效的gRNA(分别命名为T7，T8)，其对应的DNA序列如SEQ ID NO.1或2所示。

将构建的lentiCRISPR v2-CCR5gRNA质粒分别与质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞包装慢病毒，并用特异靶向敲除绿色荧光蛋白的gRNA以及已经由武汉病毒所胡勤学研究团队发表的有效的CCR5-gRNA3(该序列的靶位点位于CCR5基因第3号外显子的第260-279位碱基处)与质粒psPAX2和pMD2.G共转作为对照。72小时后收集培养上清得到慢病毒，并用0.45μm滤膜过滤后分装，冻存与-80℃备用。

用慢病毒感染TZM-bl细胞，24小时后加入0.8μg/ml的puromycin杀死未感染的细胞，每24小时换一次液，72小时后提取细胞的基因组，通过T7E1实验检测gRNA引导下的CRISPR/Cas9系统对CCR5基因的突变效率。通过实验组与对照组的结果对比，可以看出筛选出的CCR5-gRNA7和CCR5-gRNA8对CCR5基因有不同的突变效果(图1B)。并且将PCR产物进行高通量测序，可以看到CCR5-gRNA7和CCR5-gRNA8分别对CCR5基因的特定位点有93.6％和88.8％的突变效率(图1C)。

三、为了检测设计、构建的gRNA对CCR5辅助受体表达的抑制，用APC标记的CCR5抗体孵育处理过的细胞，采用流式细胞术检测细胞表面CCR5辅助受体的表达水平，从结果中可以看到，经过由CCR5特异性的gRNA引导的CRISPR/Cas9系统处理过的细胞表面的CCR5表达水平明显低于阴性对照组(图2)。

四、为了进一步检测gRNA系统对HIV病毒感染细胞的影响，我们利用Ghost-R5细胞被HIV病毒感染后会被激活EGFP的表达的特性，通过流式细胞术检测系统对HIV病毒感染的抑制作用。这个实验中将阴性对照换成没有构建gRNA的lentiCRISPR v2空载体，经过CRISPR/Cas9系统处理后的细胞用MOI为1和0.1的HIV-1病毒(CCR5嗜性)感染细胞，然后通过流式细胞术检测细胞的EGFP表达率，可以看到CCR5特异性的CRISPR/Cas9系统处理过的细胞被HIV的感染效率明显低于对照组(图3)。

五、我们分别挑选了各条gRNA对应的最有可能的三个脱靶位点，从提出的细胞基因组中扩增出相应的目标片段，然后通过T7E1实验检测这些目的片段的突变效率，并用CCR5-gRNA7的突变位点作为阳性对照，从图4中可以看到，设计的gRNA在其脱靶位点上并没有引起突变。

本发明所构建的gRNA表达载体经测序验证表明构建成功。通过细胞试验和检测，筛选到全新、高效的gRNAT7和gRNAT8CRISPR/Cas9系统均可以有效的突变CCR5基因并抑制其表达，以及抑制HIV对细胞的感染。最终筛选到的2条gRNA如表1：

表1筛选到的gRNAT7和gRNAT8对应的靶序列

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、突变区在CCR5基因Δ32区域：本发明通过构建含有特异靶向CCR5基因Δ32区域的gRNA序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体获得的CRISPR/Cas9重组慢病毒能够将CCR5特异性的CRISPR/Cas9系统导入细胞，在设计的两条gRNA的引导下Cas9能在CCR5基因的特异位点产生双链断裂，经过非同源重组末端结合的修复方式修复后在断裂位点引入随机突变，且突变率高达90％左右。由于CCR5Δ32突变体是自然存在的一种突变形式，CCR5基因的32bp缺失的基因表达没有功能的CCR5蛋白，可以阻止HIV的感染，因此，经过重组慢病毒改造后的细胞被HIV感染的效率明显下降。该方法较RNAi一Knockdown、ZFN和TALEN技术具有更高的抑制艾滋病毒感染细胞的效率,该系统构建快速、简单、廉价，适合用于艾滋病基因治疗。

2、低脱靶率：由于CCR5和CCR2具有非常高的同源性，设计的gRNA非常容易产生脱靶，所以我们在设计特异性靶向CCR5的gRNA时，充分考虑了脱靶效率的问题，在CCR5和CCR2的非同源区设计gRNA，经检测，CCR5-gRNA7和CCR5-gRNA8的脱靶效率低于0.2％。

附图说明

图1为我们所构建的靶向CCR5基因特定位点的CRISPR/Cas9对该基因的突变效率。

结果显示我们设计的gRNA能够有效地引导Cas9在CCR5基因的特定位点产生突变。A：设计的gRNA在CCR5基因上的位置；B：在TZM-bl细胞中T7E1实验检测CCR5-gRNA7和CCR5-gRNA8诱导CCR5基因突变的能力；C深度测序检测CCR5-gRNA7和CCR5-gRNA8诱导产生的突变体类型。

图2为通过流式细胞术检测构建的CRISPR/Cas9系统对CCR5辅助受体表达的抑制。

结果显示在两种类型的细胞系(TZM-bl和Ghost-CCR5)中，构建的CRISPR/Cas9系统对CCR5的表达有不同程度的抑制。

图3为在Ghost-CCR5细胞中CCR5特异性的CRISPR/Cas9系统对HIV-1(CCR5嗜性)病毒感染的抑制效果。

结果显示，gRNA能够有效抑制HIV-1(CCR5嗜性)对Ghost-CCR5细胞的感染。

图4为用T7E1实验以及深度测序检测gRNA在TZM-bl细胞中的脱靶效率。

A：CCR5-gRNA7和CCR5-gRNA8在其最有可能的三个脱靶位点上检测不到脱靶效率，说明我们设计的gRNA的脱靶效率很低，低于T7E1实验检测水平；B：CCR5-gRNA7和CCR5-gRNA8在其最有可能的两个脱靶位点上，深度测序能检测到非常低的脱靶效率，低于0.2％。其中CCR5-gRNA8的第二个脱靶位点下游多聚T的序列段检测到较多的突变，这个很可能是由于十多个T连在一起导致的测不准。所以深度测序的结果也可以说明我们设计的两条gRNA脱靶效率很低。

图5为在Jurkat T细胞中检验我们设计的gRNA引导CRISPR/Cas9系统对CCR5基因产生突变及抑制其表达的效率。

结果显示我们设计的gRNA引导的CRISPR/Cas9系统可以有效地导致CCR5基因产生突变，并抑制CCR5蛋白的表达，最终抑制HIV-1(CCR5嗜性)对Jurkat T细胞的感染效率。A：在Jurkat T细胞中T7E1实验检测CCR5-gRNA7和CCR5-gRNA8诱导CCR5基因突变的能力；B：测序检测CCR5-gRNA7和CCR5-gRNA8诱导产生的突变体类型；C：Western blot实验检测gRNA7和gRNA8引导的CRISPR/Cas9系统抑制CCR5蛋白表达的效率；D：通过ELISA检测被我们构建的CRISPR/Cas9系统改造过的Jurkat T细胞对HIV-1(CCR5嗜性)病毒感染的抑制效果。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。【实施例1】靶向CCR5基因序列的gRNA序列的设计、合成以及真核表达载体构建

1、靶向CCR5基因序列的gRNA的选择和设计

以人的CCR5基因序列为参考序列，通过crispr.mit.edu上的Crispr design工具找到CCR5基因序列上打分较高的靶位点，靶位点序列的形式为5’-(20N)-NGG3’或者5’-CCN(20N)-3’。同时也对比了人体基因组序列，排除与人体基因组序列同源性高的gRNA，并且比对了CCR5和CCR2的基因组序列，排除靶向这两个基因同源区域的gRNA序列。考虑到自然存在的CCR5-Δ32突变体可以使HIV病毒感染T细胞失败，我们最终选取了靶向CCR5基因Δ32区域的两条从未报道的gRNA序列及靶点(图1)。

2、靶向CCR5基因序列的gRNA寡核苷酸序列的合成和真核表达载体的构建

根据选择的gRNA，在其5’端加上CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列，分别合成正向和反向寡核苷酸序列，然后将合成的序列变性、退火，得到具有BsmBI粘性末端的双链DNA片段，如下：

正向：5’-CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN

反向：NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’

变性、退火体系为：

2μl 正向寡核苷酸链(50μM)

2μl 反向寡核苷酸链(50μM)

46μl 1×NEB buffer 2

在PCR仪中按以下程序运行：90℃，4min；70℃，10min；37℃，20min；25℃，20min。

退火后的双链寡核苷酸链含有BsmBI的粘性末端，直接与被BsmBI(NEB)酶切过的lentiCRISPR v2载体进行连接，可以得lentiCRISPR v2-gRNA重组质粒。

酶切体系：

酶切后的质粒直接用胶回收试剂盒回收。

连接体系：

将上述步骤得到的连接产物转化JM109感受态细胞，涂布于Amp⁺的LB平板，挑取阳性克隆接菌，37℃摇床摇菌过夜，质粒抽提试剂盒提取质粒并进行测序鉴定，得到lentiCRISPR v2-gRNA质粒。

【实施例2】在TZM-bl细胞中验证本发明gRNA指导的CRISPR/Cas9系统对CCR5基因特定位点的突变。

首先，将构建的gRAN/Cas9共表达质粒和辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染293T细胞，24h后换成新鲜培养基，然后48h后收集培养上清，0.45μm滤膜过滤后冻存与-80℃备用。

为了验证本发明中设计的gRNA指导的CRISPR/Cas9系统是否能对CCR5的特定位点产生突变，用构建好的慢病毒感染TZM-bl细胞，感染12h后换成新鲜培养基，24h后加入0.8μg/ml的puromycin杀死未被感染的细胞，每24h换一次液，72h后提取细胞的基因组DNA。用CCR5的引物CCR5-Primer从提取的基因组中通过PCR扩增出目的片段，PCR产物经过变性退火后用T7核酸内切酶进行酶切，酶切后的产物再用1.5％的琼脂糖凝胶进行电泳。另外用相应的引物从基因组中扩增出突变位点处200bp左右的基因片段，通过深度测序检测PCR产物中的突变体类型。从实验结果中可以看到，我们设计两条gRNA(其对应的靶序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或2所示)对CCR5基因都有一定的突变效率(图1B)，深度测序的结果表明主要的突变类型是缺失突变(图1C)，并且突变效率分别高达93.6％和88.8％。说明我们设计的gRNA可以有效地在CCR5基因序列的目的位点产生突变。具体实验步骤如下：

1、包装慢病毒

a、293T细胞接种于DMEM培养基中，其中含10％FBS，penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)；

b、在转染前一天将细胞铺在10cm皿中，等到密度70％-80％时进行转染。

c、以lentiCRISPR v2-gRNA：psPAX2：pMD2.G＝2:1:1的比例将质粒DNA溶于opti-MEM中，混匀后加入Neofect^TM，轻柔混匀，室温静置15-30min，转染复合物制备完成；

d、将转染复合物加入细胞培养基中，轻柔混匀；

e、继续培养24小时后，换成新鲜培养基，48小时后收集上清；

f、用0.45μm的滤膜过滤上清后冻存于-80℃备用。

2、慢病毒感染TZM-bl细胞或Ghost-CCR5细胞

a、TZM-bl细胞接种于DMEM培养基中，其中含10％FBS，penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)；Ghost-CCR5细胞接种于DMEM培养基中，其中含10％FBS，penicillin(100U/ml)，streptomycin(100μg/ml)，G418(500μg/ml)和hygromycin(100μg/ml)；

b、在感染前一天将细胞铺在6孔板中，等到密度70％-80％时进行感染；

c、移除细胞培养基，加入备好的慢病毒(MOI＝1.0)，并加入0.8μg/ml的polybrene；

d、感染12小时后移除慢病毒，换成新鲜培养基培养24小时后，加入0.8μg/ml的puromycin杀死未被感染的细胞(Ghost-CCR5细胞省略此步骤)，每隔24小时换一次液；

3、T7E1实验检测CCR5基因的突变效率

a、72小时后，未被感染的细胞基本全部被杀死，提取细胞的基因组DNA，所用试剂盒为天根细胞血液组织基因组提取试剂盒(DP304)，方法按厂家说明书进行；

b、通过PCR扩增CCR5基因片段，CCR5的正向引物为：ATGGATTATCAAGTGTCAAGTCCAA，反向引物为：TCACAAGCCCACAGATATTTCCTGC；

PCR体系如下：

PCR反应循环

c、使用OMEGA公司胶回收试剂盒(D2500)回收PCR得到的目的片段。具体方法按照公司提供的试验方法进行。

d、目的片段退火。

向回收得到的目的片段中加入NEB buffer 2，按如下方式退火

e、T7E1酶切

向退火产物中加入0.5μl T7E1，37℃水浴50min。1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。

4、深度测序检测突变体类型

a、通过PCR扩增出靶位点附近200bp左右的DNA片段，CCR5-gRNA7和CCR5-gRNA8的靶位点对应的正向引物为：ATGATTGTTTATTTTCTCTTCTGGG，反向引物为：CGACAAAGGCATAGATGATGGGG；

b、PCR体系同上面3中所述；

c、使用OMEGA公司胶回收试剂盒(D2500)回收PCR得到的目的片段。具体方法按照公司提供的试验方法进行；

d、将回收的到的目的片段送公司测序(安诺基因)。

【实施例3】设计、构建的gRNA对CCR5辅助受体表达的抑制

病毒感染实验同实施例2，72小时后通过流式细胞术检测TZM-bl细胞和Ghost-CCR5细胞表面的CCR5辅助受体的表达情况，从图2可以看到，CRISPR/Cas9系统在我们设计的CCR5-gRNA7和CCR5-gRNA8的引导下可以有效地抑制CCR5辅助受体的表达，特别是在TZM-bl细胞中，具体步骤如下：

a、弃掉培养基，用PBS洗细胞一次；

b、加入200μl 0.25％胰酶消化细胞，之后加入300μl的含血清的培养基终止胰酶消化；

c、补加PBS至1ml，反复吹打细胞至分散成单个细胞；

d、转移细胞悬液至1.5ml EP管中，离心沉淀细胞(1,500g,5min)；用PBS再洗涤1-2次，重复上述离心步骤；

e、用PBS调整细胞浓度至约1×10⁷/ml；

f、取100μl细胞悬液(1×106个/100μl)转移至新的1.5ml EP管中，加入APC标记的CCR5抗体5μl，混匀，4℃避光孵育30min；

g、加入1ml PBS，1,500g离心5min，洗涤2次；

h、弃上清，加入0.5ml含1％多聚甲醛的PBS，重悬细胞；

i、将细胞悬液转移至流式检测管，上机检测。

【实施例4】检测本发明gRNA对于HIV-1(CCR5嗜性)病毒感染的抑制

慢病毒感染Ghost-CCR5细胞后，用不同滴度的HIV病毒感染处理过后的细胞，48小时后用流式检测细胞的GFP阳性率，结果显示CRISPR/Cas9系统处理后的细胞用HIV病毒感染后的GFP阳性率明显低于对照组(图3)，说明我们设计的gRNA引导的CRISPT/Cas9系统能显著的抑制HIV病毒对含CCR5辅助受体的细胞的感染。具体步骤如下：

1、侵染性HIV-1病毒的制备

a、铺293T细胞于10cm细胞培养皿，次日转染时细胞汇合度以70-80％为宜；

b、使用neofect转染10μg pYU2质粒(HIV-1侵染性克隆)，转染方法同实施例2；24小时后换液，再培养48小时收集上清(含病毒)。

c、病毒液经0.45μm滤膜过滤后，分装冻存于-80℃备用。

2、HIV-1(CCR5嗜性)病毒滴度测定

a、实验前一天铺Ghost-CCR5细胞于12孔细胞培养皿(2.5×10^4/孔)；

b、准备10倍浓度梯度病毒稀释液(以培养基作稀释液，终体积为0.5ml)，替换旧的培养基，并加入polybrene至终浓度8μg/ml，37℃培养4h后更换为1ml新鲜培养基；

c、感染48h后，用PBS洗涤细胞，然后用300μl胰酶消化细胞(37℃孵育，不超过5min)；加入1ml含血清的培养基终止胰酶消化反应，并吹打细胞至分散均匀；转移细胞悬液至1.5ml EP管中，离心沉淀细胞(1,500g，5min)；用PBS重悬细胞，再次离心；最后用1ml 4％多聚甲醛溶液(固定剂)重悬细胞；此时病毒已被多聚甲醛灭活；

d、将细胞悬液移出P3实验室，冰上(或4℃)放置至少1h；离心沉淀细胞(1,500g，5min)，弃上清；重悬细胞于200μl PBS；

e、流式检测GFP+细胞比率；

f、计算HIV病毒滴度(感染单位)：选择一孔GFP+阳性率在1％-10％之间的细胞来计算病毒感染单位。具体而言，假定含10μl病毒原液的感染样品之GFP阳性比率为p％，则HIV病毒滴度(IU/ml)＝p％x(2.5x10⁴)x(1000μl/10μl)。(注：1％<p％<10％)。

3、HIV-1(CCR5嗜性)病毒感染Ghost-CCR5细胞方法以及流式细胞术检测GFP+细胞率方法同实施例4的1和2步骤中所述。

【实施例5】检测本发明gRNA引导CRISPR/Cas9系统对非目的基因产生突变的效率(脱靶效率)

细胞处理方法同实施例2中的2所述，从提取出的TZM-bl细胞基因组中通过PCR扩增出CCR5-gRNA3、CCR5-gRNA7和CCR5-gRNA8对应的脱靶位点的基因片段，然后通过T7E1实验检测这些脱靶位点的突变效率，并用CCR5-gRNA7的靶位点做为阳性对照，另外CCR5-gRNA7和CCR5-gRNA8的前两个脱靶位点对应的基因片段PCR扩增后进行了深度测序，方法同实施例2。如图4A所示，阳性对照能被T7核酸内切酶切断，但是我们扩增出的脱靶位点的DNA片段不能被切断，说明我们设计的gRNA的脱靶效率低于T7E1实验的检测下限；深度测序检测到的脱靶效率低于0.2％(图4B)，CCR5-gRNA8的第二个脱靶位点下游由于有过多的T重复连在一起，所以导致了一定的测序错误，但是脱靶位点处的突变只有10个，所以可以认为CCR5-gRNA7和CCR5-gRNA8的脱靶效率低于0.2％。

表1 各条gRNA对应的脱靶位点序列

表2 各个脱靶位点对应的PCR引物

【实施例6】在Jurkat T细胞中检测我们设计的gRNAs对CCR5基因的突变效率、CCR5蛋白表达的抑制效率以及HIV-1对该细胞感染的抑制效率

Jurkat T细胞是悬浮细胞，不容易转染，所以我们将包装的慢病毒用PEG8000浓缩后来感染Jurkat T细胞，并用嘌呤霉素杀掉没有被感染的细胞。然后通过T7E1实验和测序来检测CRISPR/Cas9系统对CCR5基因的突变效率，结果显示在Jurkat T细胞中CCR5-gRNA7和CCR5-gRNA8能有效地引导CRISPR/Cas9系统靶向CCR5基因，并使其形成突变(图5A、B)；Western blot检测CRISPR/Cas9系统对CCR5蛋白表达的抑制效率，从图5C可以看到，与GFP-gRNA相比，CCR5-gRNA7和CCR5-gRNA8可以不同程度地抑制CCR5蛋白的表达；通过ELISA检测HIV-1(CCR5嗜性)p24抗原的量，从图5D可以看到，经CRISPR/Cas9系统改造过的Jurkat T细胞被HIV-1感染的效率降低了，所以我们设计的gRNAs可以在Jurkat T细胞中抑制HIV-1(CCR5嗜性)对细胞的感染。具体实施步骤如下：

1、慢病毒包装和浓缩

慢病毒包装方法同实施例2，浓缩方法如下：

a、配制5×PEG8000NaCl：NaCl 8.766g，PEG8000 50g，200ml MilliQ水，配好后121℃灭菌，4℃保存；

b、0.45μm的滤头过滤包装好的慢病毒上清，然后加入5×PEG8000NaCl母液；

c、每20-30分钟混合一次，共进行3-5次，4℃放置过夜；

d、4℃，4000g离心20分钟；

e、弃掉上清，静置管子1-2分钟，吸走残余液体，并加入适量RPMI 1640(含10％FBS，100U/ml penicillin和100μg/ml streptomycin)培养基溶解沉淀，分装到1.5ml EP管中放到-80℃保存备用。

2、慢病毒感染Jurkat T细胞

a、Jurkat T细胞接种于RPMI 1640培养基中，其中含10％FBS，penicillin(100U/ml)和streptomycin(100μg/ml)；

b、感染前一天将Jurkat T细胞接种到6孔板中，等细胞长到大概1×10⁵个/ml，加入100μl冻存的慢病毒，和8μg/ml的polybrene；

c、感染2天后，加入2μg/ml的嘌呤霉素，杀掉没有被感染的细胞，每天都要换一次液，换液时将细胞收集到15ml离心管中，800转离心5分钟，弃掉上清，加入新的含嘌呤霉素的培养基重悬细胞，3天后没有被感染的细胞基本杀死，可以进行后面的检测实验。

3、T7E1和测序检测CCR5基因的突变效率

取500μl慢病毒感染后的Jurkat T细胞，提取基因组DNA，用CCR5特异性的引物通过PCR扩增出大概1kb的基因片段，T7E1实验检测该片段的突变效率，具体方法同实施例2，或将扩增出来的基因片段连到PLB载体上，转化涂平板后挑取10个单克隆菌落送公司测序，具体实施步骤如下：

a、PCR引物及方法同T7E1实验；

b、PCR扩增产物和线性化的PLB载体(TIANGEN BIOTECH Beijing)连接，按照产品说明书进行具体操作；

连接体系：

c、连接的产物转化JM109感受态细胞，转化后的细胞涂氨苄抗性的LB平板，放37℃培养12小时后挑取单克隆菌落送公司测序。

4、Western blot检测Jurket T细胞中CCR5蛋白的表达量

a、取1ml慢病毒感染后的Jurkat T细胞，13200g离心1分钟，弃上清，加入100μlRIPA裂解液(含cocktail和PMSF)，涡旋振荡混匀，放在冰上；

b、每隔10分钟震荡一次，震荡后放冰上，如此震荡3次；

c、加入25μl 5×loading，混匀后放沸水中煮5分钟，制好的样品放-20℃保存；

d、制备浓度梯度连续的SDS胶，上样后，25mA跑1小时20分钟；

e、跑胶完成以后将胶上无样品的多余部分切掉，按照以下结构来安装转膜体系：负极-海绵-三层滤纸-胶-膜-两层滤纸-海绵-正极；

f、将转膜体系置于冰水混合物中，100V转1小时20分钟；

g、转好的膜用TBST洗一次，低速摇床摇5分钟；

h、用5％的脱脂牛奶(TBST配制)常温下封闭1-2个小时；

i、一抗孵育，置于常温孵育3个小时；

j、用TBST洗膜3次，每次10分钟；

k、常温下二抗孵育1-2个小时；

l、用TBST洗膜3次，每次10分钟；

m、用滤纸吸干膜上的TBST，并将预先混合好的ECL底物加到膜上，曝光。5、ELISA检测p24抗原的含量

用MOI 1.0的HIV-1(CCR5嗜性)病毒感染改造后的Jurkat T细胞，感染8小时后用PBS洗3次洗掉病毒，然后加新鲜的1640培养基培养感染后的细胞，3天后收集细胞培养上清，加1％的Triton-X 100，用ELISA试剂盒测上清中的p24抗原含量。

SEQUENCE LISTING

<110> 武汉大学

<120> 含特异靶向CCR5基因的gRNA序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体及应用

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttgcagtagc tctaacaggt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caggttggac caagctatgc 20

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggattatc aagtgtcaag tccaa 25

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tcacaagccc acagatattt cctgc 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atgattgttt attttctctt ctggg 25

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cgacaaaggc atagatgatg ggg 23

Claims

1. 一种含有特异靶向CCR5基因的gRNA序列的CRISPR/Cas9重组慢病毒载体，其特征在于，由慢病毒载体lentilCRISPR v2（Addgene ID: 52961）用BsmBI酶切后，连入带BsmBI粘性末端的特异靶向CCR5基因的gRNA序列重组而得，特异靶向CCR5基因的gRNA序列如SEQ IDNO.1或2所示，所述特异靶向CCR5基因的gRNA序列的靶序列位于CCR5基因Δ32区域，且在CCR5和CCR2的非同源区。

2.含权利要求1所述CRISPR/Cas9重组慢病毒载体的慢病毒。

3.含权利要求1所述CRISPR/Cas9重组慢病毒载体在制备诱导CCR5突变试剂中的应用。

4.含权利要求1所述CRISPR/Cas9重组慢病毒载体在制备用于治疗和/或预防HIV感染的药物的应用。