CN111349620A - 一种重组hiv缺陷病毒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种重组HIV缺陷病毒及其制备方法。本发明将感染者携带的HIV相同亚型病毒重组为缺陷病毒，删除env区大部分，插入带有三组四段+1段双链miRNA的内含子，除env外它与HIV基因序列完全一样，它可以自我复制，并借用HIV产生的env蛋白成为有感染力的缺陷病毒。它逆转录到细胞基因组成为原病毒后转录生成子病毒时，生成env的前mRNA，剪切除去内含子，生成大量双链miRNA，产生RNAi，杀死HIV子病毒和env的mRNA及侵入的新病毒，从而达到治疗艾滋病的效果。

Description

一种重组HIV缺陷病毒及其制备方法

技术领域

本发明涉及临床医学领域，尤其涉及一种重组HIV缺陷病毒及其制备方法。

背景技术

自1981年美国CDC首次报道HIV病毒到现在，三十八年来，艾滋病以惊人的速度传播，成为全球严重的公共卫生问题。世界卫生组织数据显示，目前全球约有3670万艾滋病毒感染者，每年新增感染者约200万人，死亡病例累计超过3500万人。据中国疾病预防控制中心、联合国艾滋病规划署、世界卫生组织联合评估，截至2018年底，中国估计存活艾滋病感染者约125万。截至2018年9月底全国报告存活感染者85.0万，死亡26.2万例。估计新发感染者每年8万例左右。全人群感染率约为9.0/万。每年全球投入大量经费用于抗击艾滋病毒，联合国艾滋病规划署数据显示，2018年有191亿美元资金用于艾滋病治疗和预防，到2031年，这一费用将达350亿美元。

截至2019年10月底，全球未见治愈艾滋病的新方法，主要科学研究如下：

1、疫苗：被艾滋病研究专家们寄予厚望的疫苗，是由美国默克制药公司组织开发的一种被称为“HIV-1”的整合酶抑制剂疫苗，这是一种通过遏制HIV病毒生存环境而控制其本身生长的全新治疗思路，在对猴子的试验中获得明显的成功。2004年默克公司联手美国国家过敏和传染性疾病研究所，开始全球范围内征集志愿者进行临床实验，这个实验项目被命名为“步伐”(Step)。1500名来自北美洲、南美洲、加勒比海地区和澳大利亚的志愿者参加了这项实验，最后2008年9月下旬，这项耗时经年、耗资过亿的实验被叫停，正式宣告失败。我国在疫苗的研究方面也做了大量工作，但是最后结果都不理想。

2、高效抗逆转录病毒治疗：目前阻断艾滋病进攻的最有效的办法是美籍华人何大一发明的“鸡尾酒”疗法(即“高效抗逆转录病毒治疗”HAART)，即针对艾滋病病毒感染人体的不同环节，将蛋白酶抑制剂药物和核苷类逆转录酶抑制剂及非核苷类逆转录酶抑制剂药物组合使用来提高治疗效果,最大限度地抑制病毒的逆转录。"鸡尾酒"疗法公布后，立即轰动了整个医学界。普遍使用鸡尾酒疗法的国家，延长了HIV感染者的寿命，艾滋病人的死亡率已经下降到了20％。"鸡尾酒"疗法虽然能显著改善患者病发症状，但是仍然存在很多问题。首先，患者终身用药易产生对治疗药物的耐受的病毒株，并且药物治疗只能抑制侵入细胞的新病毒的复制，对感染细胞基因组上原病毒新产生的子病毒没有作用。而且一旦药物治疗失效就会产生耐药性病毒株导致患者死亡，据中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心2011年12月发布的《全国艾滋病综合防治数据信息年报》显示，中国艾滋病抗病毒治疗总体耐药率约为12％。其次，长期用药产生较大毒副作用，能够破坏患者的心脑血管系统甚至产生肝脏衰竭现象；最后，高昂的治疗费用也会使普通患者难以承受。

3、基因治疗：相对药物治疗基因治疗是一种更彻底的治疗艾滋病的方法，免去长期用药的副作用和高昂的治疗费用。近年来，基因编辑[1]技术迅猛发展，正在革命性地改变整个生物技术领域。与传统基因治疗方法相比，基因编辑技术能在基因组水平上对DNA序列进行改造，从而修复遗传缺陷或者改变细胞功能，使得彻底治愈白血病、艾滋病和血友病等恶性疾病成为可能。基于锌指核酸酶(ZFN)基因编辑技术的两种抗艾滋病和一种B型血友病产品已经进入临床阶段。CRISPR/Cas9基因编辑技术对特定基因组DNA的定位更加精准，成本更加低廉，正在成为基础研究和临床应用的主流技术。

基因治疗的另一研究方向是RNA干扰(RNA interence，RNAi)技术，RNAi是与靶基因序列同源的双链RNA(double strunded RNA，dsRNA)所诱导的一种特异性基因沉默现象。它在进化上保守，是细胞内抵抗转基因或外来病毒侵犯的免疫机制，同时在生物发育过程中通过降解目标RNA、抑制翻译或修饰染色体等方式调控基因表达。RNAi是广泛存在于低等原核生物、植物、真菌、无脊椎动物、哺乳动物中的一种古老、保守而又极其重要的遗传行为。近年来，RNAi的研究成为热点。Fire等因为发现了双链dsRNA在机体内可以诱导特异基因沉默而获得了2006年诺贝尔生理学奖。

目前，RNAi技术抵御HIV感染已经取得了一定的进展，根据病毒目标序列设计siRNA：到目前已确认的HIV靶序列有结构基因gag、感染因子vif、nef、tat、rev、env及TARRNA。据统计，根据以上序列设计的siRNA可以抑制培养的感染细胞的HIV原病毒转录成新病毒及新侵入细胞HIV病毒的cDNA复制达3～4天。②依据感染目标细胞的靶序列没计siRNA[3]，目前已知可用于设计siRNA的细胞因子序列有CD4、CxCR4、CCR-5、细胞周期调节蛋白T1、CDK2、CDK9等。以上这些研究都是在体外细胞层面，尚未用于临床。siRNAs仅可以以盐的形式局域性地运送到浅表的靶组织器官。如何将siRNAs运输到人体内深层组织指定位点仍是生物制药领域研究的重点及难点问题。

综上所述基因治疗是HIV最有希望的治疗方法，基因编辑是目前的研究热点。主要是两个方向：

1、增加人体细胞抗感染的能力：三种基因编辑技术锌指核糖核酸酶(ZFNs)、和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)和CRISPR/Cas9通过改造人体造血干细胞产生CCR5Δ32突变型干细胞，实现阻断HIV病毒侵染人体细胞。由于HIV可以感染人体多种细胞，如：感染CD4细胞(主要有T4淋巴细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等)、骨髓单核－吞噬细胞的祖细胞、肠淋巴结中的T-CD8淋巴细胞、神经细胞(脑和整个神经系统)、记忆T细胞等。因此，只改造人体造血干细胞的治疗不可能治愈HIV病毒感染。尤其是神经细胞不能改造，因此，要想治愈HIV病毒感染这个方向是不可取的。

2、杀死被感染的细胞中HIV原病毒：三种基因编辑技术ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9都可以杀死被感染T细胞中HIV原病毒，但不能杀死所有被感染的人体细胞中HIV原病毒，如神经细胞。而且所用的载体都是一次性的，需要多次注射治疗，容易产生免疫反应，这个方向也不可能治愈HIV病毒感染。

综上所述，目前全世界没有彻底治愈HIV病毒感染的科学研究，更没有治愈HIV病毒感染的临床治疗方法。

发明内容

发明要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种活的重组HIV缺陷病毒，用于在全部被感染的细胞内彻底杀死HIV病毒，治愈HIV病毒感染。

用于解决技术问题的方法

针对上述问题，本发明提出了一种重组HIV缺陷病毒及其制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以HIV病毒携带者同种亚型的病毒株为模板，使用TOPO-TA克隆制备该亚型的全基因序列感染性克隆及质粒。

一种实施方式为，其中，包括以下步骤：

在HIV病毒携带者同种亚型的病毒株在env区选择中间酶切位点，分析37条基因24个亚型中有20条基因16亚型在6500-7650处可以使用有限制内切酶Afl III(acatgt)酶切位点；把HIV病毒分为前后两段，分别设计引物，以该病毒为模板，使用长片段PCR扩增前后半段，TOPO-TA克隆后，酶切后再互相连接成为TOPO全基因序列感染性克隆及质粒。

本发明的第二方面，提供一种根据前述制备方法制得的全基因序列感染性克隆及质粒。

本发明的第三方面，提供一种内含子感染性重组缺陷病毒质粒的制备方法，其包括以下步骤：删除该亚型的全基因序列感染性质粒中env区大部分碱基，插入带有miRNA的内含子生成感染性重组缺陷病毒质粒。

一种实施方式为，其中，包括以下步骤：

miRNA的内含子是使用第1阅读框的tat蛋白的内含子起始区、分枝点和结束区作为第3阅读框的内含子插入env基因删除大部分碱基的区域；

在内含子起始区和分枝点之间插入2个限制内切酶Afl III(ACATGT)和Asc I(GGCGCGCC)位点。

本发明的第四方面，提供一种根据前述制备方法制得的内含子感染性重组缺陷病毒质粒。

本发明的第五方面，提供一种感染性重组缺陷病毒的制备方法，其包括以下步骤：

使用二质粒包装系统模式，用细胞核转染系统把有效治疗HIV亚型重组缺陷病毒质粒导入带有表达env蛋白质粒的293T细胞，培养该细胞，培养液中含有感染性重组缺陷病毒。

一种实施方式为，其中，包括以下步骤：

感染性重组缺陷病毒质粒中内含子含有三组四段+1段miRNA，其中三组四段miRNA是由一段相同的转录为线性RNA的DNA连接的三组相同的四段产生带有loop的发卡状dsRNA的DNA即：miRNA-env-1、miRNA-env-2、miRNA-env-3、miRNA-env-4，它们都是env区最保守碱基片段；三组四段+1段miRNA中的+1段是miRNA-env-5，用于降解感染性重组缺陷病毒env基因转录的前RNA除去内含子后生成的部分gp120和部分gp41融合蛋白的mRNA，使之不产生任何env蛋白片段；

在三组四段+1段miRNA的两端含有限制内切酶Afl III和Asc I，用这两个酶切后得到三组四段+1段miRNA的片段，与用Afl III和Asc I双酶切的权利要求6中内含子的起始区后面，分枝点前面插入2个限制内切酶Afl III和Asc I感染性重组缺陷病毒TOPO开口质粒混合连接成为治疗用感染性重组缺陷病毒质粒。

本发明的第六方面，提供一种根据前述制备方法制得感染性重组缺陷病毒。

本发明的第七方面，提供一种前述的全基因序列感染性克隆及质粒、前述的内含子感染性重组缺陷病毒质粒、前述的感染性重组缺陷病毒在制备治疗艾滋病药物中的应用。

本发明的有益效果

⑴、使用活的重组HIV缺陷病毒治疗HIV病毒感染。

目前世界上用活病毒治疗疾病，主要是溶瘤病毒和基因修饰的溶瘤病毒治疗恶性肿瘤，未见用活的重组缺陷病毒治疗病毒感染性疾病的报道。本发明使用活的重组HIV缺陷病毒治疗HIV病毒感染开创了人类用基因重组的缺陷病毒治疗病毒感染性疾病的新方向，为人类战胜病毒感染性疾病提供新方法。重组HIV缺陷活病毒有自我复制的能力，使用它治疗HIV病毒感染可以一次注射，终身受益，效应时间长，治疗费用低。

⑵、使用重组HIV缺陷病毒为载体用RNAi技术杀死HIV子病毒和env蛋白及杀死入侵细胞的新病毒。解决了RNAi技术的重点及难点问题：“如何将siRNAs/miRNA运输到指定位点”。本发明使用重组HIV缺陷病毒为载体，安全、高效、可遗传、直接作用于HIV感染的各种靶细胞中HIV复制、转录区域。它与HIV病毒有相同的感染细胞。人体中凡是能够感染HIV病毒的细胞，都能被重组HIV缺陷病毒感染，可以实现在人体能够感染HIV病毒的细胞内全部杀死HIV病毒的目的。活的重组HIV缺陷病毒是全方位人体各种细胞同时治疗。突破一般基因编辑，使用假病毒对单一细胞治疗；假病毒是一次性的，没有复制能力，需要多次注射、容易产生免疫问题，并且单一细胞治疗不可能治愈艾滋病。

⑶、使用以三组四段+1段miRNA重组内含子的形式插入重组HIV缺陷病毒的env区。重组HIV缺陷病毒是改造与感染者相同亚型的HIV病毒，它是在病毒外显子env基因区删除大部分碱基，在删除碱基的位置插入内含子，病毒利用细胞内部的机制转录env基因生成内含子带发卡结构的pre-miRNA的前mRNA，剪辑切除内含子，内含子含有三组四段+1段发卡结构的pre-miRNA，随后被剪切为21-23nt的双链miRNA，起到RNAi的作用。env蛋白是HIV表达量很大的蛋白。HIV病毒有72个刺突，每个刺突由gp120和gp41三聚体组成，即共需要216条gp160蛋白，若每条mRNA产生十几条蛋白，原病毒转录生成一个新病毒将有20多条gp160的mRNA，即产生20多条三组四段+1段重组内含子，可以产生20*3*4＝240段双链miRNA，并且每一段双链miRNA都可以独立杀死HIV病毒，突破以往一个载体只带一段双链miRNA的局限大大提高RNAi的效率。

⑷、重组HIV缺陷病毒可以有效地阻止HIV病毒的传播，大大减少新发感染者。凡是HIV能感染的途径重组HIV缺陷病毒具有同样感染的途径。目前经性传播是主要感染途径，感染隐蔽、难以预防。一个用重组HIV缺陷病毒治疗后的HIV感染者，同时具有重组HIV缺陷病毒，他的性同伴可能同时感染HIV病毒和重组HIV缺陷病毒，重组HIV缺陷病毒可以起到在细胞内治疗和预防HIV感染的作用。他的性同伴可以保持健康，一直不发病。重组HIV缺陷病毒治疗后的患者病毒载量为阴性。世界公认：病毒载量为阴性的患者没有传染性，可以过正常人的生活。用重组HIV缺陷病毒治疗可以遏制新发病人增长的势头。

⑸、用重组HIV缺陷病毒治疗不会增加新的毒副作用。重组HIV缺陷病毒是改造与感染者相同亚型的HIV病毒，不会生成不同亚型重组HIV病毒。重组HIV缺陷病毒利用感染者细胞自己内部机制剪切内含子产生miRNA实现RNAi，不增加启动子等任何外源基因片段，不会重组产生新病毒。不生成gp120和gp41(HIV-2的env蛋白gp105和gp36),没有它们对感染细胞的6种损害。不使用药物，免去"鸡尾酒"疗法患者终身用药，易产生对治疗药物的耐受病毒株、产生较大毒副作用并能够破坏患者的心脑血管系统甚至产生肝脏衰竭的问题。

⑹、使用重组HIV缺陷病毒治疗的患者不会产生HIV耐受治疗的病毒株。HIV的变异发生在其进入细胞后RNA逆转录为DNA的过程中。双链DNA生成后，插入细胞基因组成为原病毒，原病毒靠细胞RNA聚合酶II转录为HIV病毒基因组RNA和env的mRNA时变异非常少。"鸡尾酒"疗法是最大限度地抑制病毒的逆转录。对原病毒转录为子病毒没有作用，即不影响子病毒的产生和感染新的细胞。有一些子代病毒通过选择压力逐渐成为耐药病毒株。重组HIV缺陷病毒在env段产生大量的miRNA可以有效地杀死子代病毒及其env蛋白，同时杀死进入细胞的新病毒，不给病毒留下变异的机会。重组HIV缺陷病毒使用的三组四段miRNA是选择HIV病毒env段中最保守的区段，该四段miRNA在所做的37株24个亚型的ClutalX2.1对比分析结果中显示四段中的每一段都可以使所有24个亚型产生RNAi，四段联合作用即可以杀死侵入细胞的所有亚型的新HIV病毒和杀死所有变异的子病毒株，所以使用重组HIV缺陷病毒可以同时治疗携带多种HIV亚型病毒的患者，而且不会产生耐miRNA病毒株。

⑺、重组HIV缺陷病毒是自限性病毒：当重组HIV缺陷病毒感染未被HIV感染的细胞时，重组HIV缺陷病毒的双链DNA插入细胞染色体成为原病毒，当它转录时，没有env基因不能形成带有gp120和gp41的外膜成为有感染力的病毒。不稳定的病毒核心长时间地存在于细胞内，将被细胞蛋白酶降解。重组HIV缺陷病毒的原病毒与细胞长期共存，不影响细胞正常功能。它转录时可以在细胞内产生大量双链miRNA杀死入侵的HIV病毒，起到在细胞内预防HIV病毒感染的作用。当重组HIV缺陷病毒感染已被HIV感染的细胞时，它可以杀死HIV子病毒和env蛋白，并且借用HIV病毒以前表达的gp120和gp41的外膜成为有感染力的病毒，随着病毒可用的gp120和gp41的外膜越来越少，重组HIV缺陷病毒将自限性的存留在细胞内，产生大量多段miRNA，杀死细胞基因组中HIV原病毒产生子病毒和降解env的mRNA,不产生gp120和gp41，杀死入侵细胞的新病毒。细胞内激烈斗争，细胞外风平浪静，细胞膜完好如初，细胞可以正常生存。随着这些细胞的死亡，HIV原病毒将被移除到体外。HIV携带者体内的HIV原病毒会越来越少。

⑻、保护被感染的细胞，延长其寿命和发挥正常功能。疫苗和中和抗体等体液和细胞免疫方法都是杀死被HIV感染的细胞，削弱了这类细胞的功能。重组HIV缺陷病毒治疗是杀死细胞内HIV病毒，去掉细胞膜上gp120和gp41，使细胞不受gp120和gp41的6种毒害保护了被感染的细胞，延长其寿命、发挥其正常功能，改善免疫缺损状态，恢复正常免疫系统，保护人体健康。特别是杀死脑和神经系统细胞内HIV病毒去掉细胞膜上gp120和gp41，保护了被感染的细胞，延长其寿命、保护神经细胞正常功能，是其它方法无法做到的。

从以下示例性实施方案的描述中，本发明的进一步特征将变得显而易见。

附图说明

图1、全序列HIV病毒感染性质粒的构建。

图2、env区带有2个酶切位点内含子的缺陷病毒的构建。

图3：三组四段+1段3*miRNA-env-1-4+5TOPO质粒生成过程，三份一组四段miRNA-env-1-4的TOPO质粒，通过两次双酶切，两次TOPO连接，生成三组四段3*miRNA-env-1-4TOPO质粒。再经过双酶切，加入miRNA-env-5，TOPO连接，生成三组四段+1段3*miRNA-env-1-4+5TOPO质粒。

图4：全序列HIV缺陷病毒TOPO质粒的构建，由全序列HIV带有2个酶切位点内含子的缺陷病毒TOPO质粒和三组四段+1段3*miRNA-env-1-4+5TOPO质粒，经过Afl III和Asc I双酶切，琼脂糖凝胶电泳，条带切胶纯化，得到HIV带有2个酶切位点内含子的缺陷病毒TOPO缺口质粒和三组四段+1段3*miRNA-env-1-4+5片段，用TOPO克隆程序操作连接，得到在env区内含子中带有三组四段+1段3*miRNA-env-1-4+5全基因HIV缺陷病毒的TOPO克隆，抽提，得到质粒。

图5、HIV-1全基因图。

图6：HIV-1缺陷病毒全基因图，是对比图，由图可见HIV-1病毒与HIV-1缺陷病毒除env区不同外，其它完全一样，这样的设计有利于制备感染性HIV-1缺陷病毒。

图7：一组四段miRNA-env-1-4上链转录为线性RNA连接的四段发卡状±miRNA的结构示意图。

具体实施方式

现在将对于各种实施例进行详细说明，这些实施例的一或更多个实例分别绘示于图中。各个实例以解释的方式来提供，而非意味作为限制。例如，作为一个实施例的一部分而被绘示或描述的特征，能够被使用于或结合任一其他实施例，以产生再一实施例。本发明意在包含这类修改和变化。

本发明采用细胞内免疫的RNAi技术，以重组HIV缺陷病毒为载体，将其产生的杀死目标是HIV基因组中env区和env的mRNA的miRNA运送到人体内可能被HIV感染的各种细胞中彻底杀死HIV病毒，达到治愈HIV病毒感染的目的。

本发明提出的全基因序列感染性克隆及质粒的制备方法，其包括以下步骤：以HIV病毒携带者同种亚型的病毒株为模板，使用TOPO-TA克隆制备该亚型的全基因序列感染性克隆及质粒。其中，包括以下步骤：由于HIV病毒携带者淋巴细胞基因组中HIV原病毒比较少，直接扩增难以得到全序列的HIV，采用分两段，分别扩增，然后拼接，可以降低合成全序列的难度。在HIV病毒携带者同种亚型的病毒株的env区选择中间酶切位点，用clustalX2.1软件分析37条基因24个亚型中有20条基因16亚型在6500-7650处有可以使用的限制内切酶Afl III(acatgt)酶切位点；对于其它基因要从env基因序列分析后确定采用什么方法。以Afl III(acatgt)酶切位点把HIV病毒分为前后两段，分别设计引物，以HIV病毒携带者淋巴细胞基因组中HIV原病毒为模板，使用长片段PCR扩增前后半段，分别TOPO-TA克隆后，酶切后互相连接成为TOPO全基因序列感染性克隆及质粒。

本发明提供的内含子感染性重组缺陷病毒质粒的制备方法，其包括以下步骤：删除该亚型的全基因序列感染性质粒中env区大部分碱基，插入带有2个限制内切酶的内含子生成内含子感染性重组缺陷病毒质粒。其中，包括以下步骤：使用第1阅读框的tat蛋白的内含子起始区、分枝点和结束区作为第3阅读框的内含子插入env基因删除大部分碱基的区域；在内含子起始区和分枝点之间插入2个限制内切酶Afl III(ACATGT)和Asc I(GGCGCGCC)位点。

本发明提供的感染性重组缺陷病毒质粒的制备方法，其包括以下步骤：在带有2个限制内切酶内含子的感染性重组缺陷病毒质粒的2个限制内切酶位点之间插入三组四段+1段miRNA生成感染性重组缺陷病毒质粒。其中，包括以下步骤：内含子含有三组四段+1段miRNA中，其中三组四段miRNA是由一段相同的转录为线性RNA的DNA连接的三组相同的四段产生带有loop的发卡状dsRNA的DNA组成即：miRNA-env-1、miRNA-env-2、miRNA-env-3、miRNA-env-4，它们都是env区最保守碱基片段；用于产生各种双链miRNA杀死HIV子病毒和env蛋白及新入侵细胞的HIV病毒。三组四段+1段miRNA中的+1段是miRNA-env-5，用于降解感染性重组缺陷病毒env基因转录的前RNA除去内含子后生成部分gp120和部分gp41融合蛋白的mRNA，使感染性重组缺陷病毒不产生任何env蛋白片段。在三组四段+1段miRNA的两端含有限制内切酶Afl III和Asc I，用这两个酶切后得到三组四段+1段miRNA的片段，与内含子的起始区后面，分枝点前面插入2个限制内切酶Afl III和Asc I感染性重组缺陷病毒双酶切后TOPO开口质粒混合连接成为治疗用感染性重组缺陷病毒质粒。

本发明提供的感染性重组缺陷病毒的制备方法，其包括以下步骤：使用二质粒包装系统模式，用细胞核转染系统把有效治疗HIV亚型重组缺陷病毒质粒导入带有表达env蛋白质粒的293T细胞，培养该细胞，培养液中含有感染性重组缺陷病毒。

⑴、构建感染性HIV各种亚型野生株全序列质粒

①、中间酶切位点的选择

一般来讲，临床标本淋巴细胞中前病毒DNA量均较低[5]，直接进行体外扩增难于得到全长基因的片段。已有研究认为，PCR反应体系中前病毒DNA少于300个拷贝时无法得到阳性结果。采用分段扩增，可以降低难度。本发明采用分别扩增HIV前半段和后半段，中间有相互重叠的区域，然后拼成全长。

中间位点的选择：为了提高全长基因克隆的感染性保住除env基因以外的所有其它基因的完整性，中间位点选在env基因上，由于env基因使用第三阅读框选用内切酶也要用第三阅读框。以EF036533[HIV-1CRF01-AE Fj064 from China 2006为例，从230个限制内切酶中本发明选用Afl III(acatgt)位于6523，它是限制内切酶Afl III在全基因序列中唯一酶切位点,使用第三阅读框ttt aac atg tgg为FNMW(苯丙氨酸、天冬酰胺、甲硫氨酸、色氨酸)。当然，Afl III还有另一个酶切位点(acgcgt)在全基因里没有它酶切位点。所以AflIII是全基因序列中唯一酶切位点。用clustalX2.1软件分析在24个亚型37条基因在EF036533的Afl III(acatgt)的位点6523处有两种序列aac atg tgg和aat atg tgg其中aac和aat都编码为天冬酰胺，可以用一种aac atg tgg代替。它很保守,用clustalX2.1软件分析37条基因24个亚型中有20条基因16亚型在6500-7650处可以使用限制内切酶Afl III(acatgt)酶切位点；对于其它基因要从env基因序列分析后确定采用什么方法。

②、前后半段两对引物的确定

A)、确定患者携带的HIV病毒的亚型

取患者新鲜静脉血，使用人淋巴细胞分离液(天津LTS10771)，按操作方法提取淋巴细胞，用Roche′s High Pure Template Preparation Kit试剂盒按操作方法提取淋巴细胞基因组DNA，以基因组DNA为模板扩增env基因，其引物：上链(6457-6478)22bp 5’-atgcctgtgtacccacagaccc-3’，该引物可以用于14个亚型的23条基因(依据用ClutalX2.1对全基因序列37条基因24个亚型的比对结果)，下链(7849-7831)19bp：5’-ctggcctgtaccgtcagcg-3’该引物可以用于20个亚型的29条基因，

使用Expand long template PCR system(Roche)试剂盒，按试剂盒操作程序扩增env基因片段(6457-7849)，电泳，条带切胶纯化，按下面零背景TOPO-TA克隆步骤操作克隆，取菌斑测序，测序引物序列如下：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：CAGGAAACAGCTATGACC

通过NCBI下载HIV的各种亚型env基因序列用Blast程序对得到的env基因序列比对然后利用MEGA 5.0软件包中Neighber-joining方法构建系统进化树。经过系统进化树分析得出该患者感染的HIV的亚型。

B)、前后半段两对引物的设计

例如：基因库中HIV_1CRF01-AE Fj064 from China 2006参考其序列设计两对前后半段引物。

a)、前半段引物设计

根据患者感染的HIV的亚型在基因库中找出该亚型的全基因序列。根据5’-LTR序列和3’-LTR序列设计5’前末端上链引物和3’后末端下链引物。根据中间位点6523前后的序列设计下链中间-前引物和上链中间-后引物。

由于CRF01_AE全基因没有限制内切酶EcoR I(GAATTC)和Kpn I(GGTACC)酶切位点，使用EcoR I，在其上链5’末端引物序列前面加上5’…GAATTC…..3’EcoR I位点,考虑整合酶N端NTD部分特异识别3’端TGAC，在EcoR I位点后加上AC使之与基因头TG一起在下链3’端形成TGAC,以便整合酶识别。前半段5’末端引物：5'-LTR(5'-GGAATTCACTGGATGGGCTAATTTACTCCAAGAAAAGACAAG-3')。

前半段3’端引物要加上Afl III(acatgt)的酶切位点ACATGT,为了以后克隆方便在其后加上酶切位点Kpn I GGTACC，下链前半段3’端中间-前引物(5’-GGGGTACCAATCCACATGTTA AAATTTTGAC TTACATTGTC-3’)，上下链扩增区域为5’LTR到env 6523为前半段,含酶切位点长度为6551pb。

b)、后半段引物设计

后半段上链5’端中间-后引物加上Afl III(acatgt)的酶切位点ACATGT,(5'-TCCCACATGTGGAAAAATAACATGGTAGAGCA-3')，设计后半段3’末端引物时加上酶切位点Kpn IGGTACC，考虑整合酶N端NTD部分特异识别3’端TGAC，下链在Kpn I位点后加上AC使之与基因头TG一起使上链3’端形成TGAC,以便整合酶识别。后半段3’-末端的下链引物：5’-GGGGTACCACTGCTAGAGATTTTTACTCAGTCTAGAGTGGTC-3’，其扩增区域为env 6523到3’LTR末尾9732为后半段，长度3209bp,含酶切位点长度为3229bp。

③、前后半段PCR扩增和零背景TOPO-TA克隆及筛选鉴定

A)、前后半段PCR片段的制备

取患者新鲜静脉血1ml，使用人淋巴细胞分离液(天津LTS10771)，按操作方法提取淋巴细胞，用Roche′s High Pure Template Preparation Kit试剂盒按操作方法提取淋巴细胞基因组DNA。使用Expand long template PCR system(Roche)试剂盒PCR扩增前后半段。该试剂盒使用混合的DNA聚合酶：TagDNA聚合酶和TgoDNA聚合酶,Tgo具有3’—5’外切酶活性的矫正功能，使PCR产物的精确度为使用Tag酶的3倍，可以扩增细胞基因组DNA，片段长度可以到20kb。

以淋巴细胞基因组DNA为模板，使用前半段上链5’-末端引物及下链中间-前引物按照Expand long template PCR system(Roche)试剂盒操作程序PCR扩增前半段，其上下链的3’均以A结尾。同样，使用后半段上链中间-后引物和后半段下链3’-末端引物PCR扩增后半段，其上下链的3’均以A结尾。将前后半段PCR产物，电泳，条带切胶纯化，得到前后半段PCR片段。

B)、前后半段零背景TOPO-TA克隆

使用零背景TOPO-TA载体优点：

快速：使用DNA拓扑异构酶，室温5分钟连接；

简单：DNA拓扑异构酶已偶连在载体上，只需加入片段即可；

高效：采用先进的自杀基因筛选技术，无需繁琐的蓝白斑筛选，阳性克隆率接近100％；

连接片段长：载体pESI-T很小只有1.865kb，但是可以连接长达10kb目的产物。

DNA片段的零背景TOPO-TA克隆步骤：(DNA片段3’端必须为A)

a)按照下表1配制连接体系(以10μL为例)

不同的插入片段所用量参考下表2：

插入片段大小	推荐用量
		0.1-1kb	20-50ng
1-2kb	50-100ng
		2-5kb	100-200ng

b)混匀上述体系。于室温(20-30℃)反应5min。反应时间不要超过5min，一般1-2min即可完成连接反应，得到足够的重组子。

c)全量10μL加入100μL感受态细胞，或取5μL连接液，加入50μL感受态细胞中(加入体积不超过感受态细胞体积的1/10)。轻轻混匀，室温放置5min。便可获得足够多转化子，若感受态细胞效率较低可以按照冰浴热激的标准程序进行。

d)加300-500μL LB培养基(不含抗生素)，插入片段≤2kb，37℃180rpm复苏振荡培养10min可以得到足够多转化子。前半段6.5kb，后半段3.2kb需要延长复苏时间到30min，以得到更多的转化子。

e)取200μL菌液涂板(含氨苄青霉素的LB固体培养基)，培养过夜。如果预计转化子少，为得到较多克隆，可以4000rpm离心1min，吸弃掉部分上清，保留100μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板。由于零背景TOPO-TA克隆采用先进的自杀基因筛选技术转染大肠杆菌的阳性率接近100％。

C)、阳性克隆的鉴定

挑选生长良好的转化子菌斑做筛选鉴定：

a)菌落/菌液PCR鉴定：用各自引物扩增的PCR产物电泳条带前半段6.5kb,后半段3.2kb。

b)质粒大小鉴定：挑取单克隆，抽提质粒后，零背景TOPO-TA载体pESI-T为1865bp，电泳，前半段质粒8416bp，后半段质粒4965bp。

c)酶切鉴定：根据实验设计，前半段质粒用限制性内切酶EcoRI和Afl III酶切得6.5kb,后半段质粒用限制性内切酶Afl III和Kpn I酶切得3.2kb。分别电泳，查看条带的大小，确定符合设计的克隆。

d)测序分析：通过a)、b)、c)鉴定的合格的克隆，进一步做测序分析，选择测序引物序列如下：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R：CAGGAAACAGCTATGACC

e)对前后半长基因序列进行筛选鉴定：分析前后半长的序列，在前后半长env重叠区域找出Afl III单一酶切位点，得到正确基因序列的5’端前半段克隆和3’端后半段克隆。分别增菌，提取质粒，得到5’端前半段质粒和3’端后半段质粒。

④、构建全序列质粒

见附图1、全序列HIV病毒感染性质粒的构建。

将5’端前半段质粒用Afl III和Kpn l双酶切得到5’端前半段基因的开环质粒；将3’端后半段质粒用Afl III和Kpn l双酶切得到3’端后半段基因片段，分别用琼脂糖凝胶电泳，条带切胶纯化，将前半段基因开环质粒与双酶切得到3’端后半段基因片段混合，按下面TOPO-TA克隆组分、用量和操作步骤克隆。

因为DNA拓扑异构酶已偶连在pESI-T质粒上所以不用另外加连接酶。由于采用先进的自杀基因筛选技术，那些未转入pESI-T质粒或转入开环pESI-T质粒的大肠杆菌都被杀死，存活的近100％阳性克隆，只要使用pESI-T质粒就可以使用表TOPO-TA克隆组分、用量和操作步骤连接。

表3：TOPO-TA克隆组分、用量和操作步骤

操作步骤：混匀上述体系。于室温(20-30℃)反应5min。全量10μL加入100μL感受态细胞，轻轻混匀，室温放置5min。加300-500μL LB培养基(不含抗生素)，37℃180rpm复苏振荡培养30min,取200μL菌液涂板(含氨苄青霉素的LB固体培养基)，培养过夜,挑取生长良好的转化子菌斑进行筛选鉴定：通过PCR鉴定，质粒大小鉴定，酶切鉴定得到5’端有限制内切酶EcoR I，3’端有限制内切酶Kpn l全序列基因克隆，长度9751bp。提取pESI-T质粒得到表达HIV全基因序列的感染性质粒。

⑤、感染性质粒的筛选

A)、HIV全基因序列质粒感染活性的鉴定

使用LONZA 4D-Nucleofector细胞核转染系统，即原德国Amaxa 4D-Nucleofector核转系统，该系统结合电穿孔技术和细胞特异性转染液，通过系统内置优化的转染程序，将外源基因高效导入目标细胞的细胞质中，并可直接入核，整合到细胞染色体中。

Nucleofector核转系统可用于免疫细胞、干细胞、神经细胞、内皮细胞等较难转染的原代细胞和各类细胞系中，其不依赖于病毒感染、不依赖于细胞有丝分裂，可加快基因表达，已成功转染1200余种细胞系、130余种原代细胞，多数细胞系转染效率可高达50-70％，部分原代细胞转染效率可超过90％。

使用该系统直接将HIV全基因序列的质粒转入正常人淋巴细胞，转染效率可达60％。转染后培养72小时，取转染上清(即衍生病毒)经0.45μm滤膜过滤后用p24定量检测试剂盒定量至80ng/ml病毒，用1.5ml的病毒上清感染3x10⁶经PHA刺激活化的正常淋巴细胞，孵育4-5h，离心弃上清，细胞用10ml Hank's洗两次后吸干上清，即细胞中已经去除残留的p24抗原。用8ml新鲜的T淋巴细胞生长液重悬细胞后置37℃，5％CO2条件下培养12天，每隔3天移去4ml培养上清液，随之补充4ml新鲜的培养液，其中在第6天补充3x10⁶个经PHA(植物血凝素)激活了的正常的PBMCs。收集感染上清进行p24抗原检测鉴定衍生病毒对淋巴细胞的感染性。以上转染及感染实验在同等条件下做双份，同时设PNL4-3阳性和阴性对照。

转染上清p24抗原呈强阳性(OD>3.0)，说明这些克隆株能在淋巴细胞细胞内进行有效地病毒复制，并产生衍生病毒。转染上清经0.45μm滤膜过滤后感染经PHA刺激活化的淋巴细胞，通过观察细胞病变产生多核巨细胞的情况并检测感染上清中的p24抗原来鉴定其感染活性。P24抗原检测结果表明全长序列克隆具有的感染程度。检测OD值越高，表明该克隆在淋巴细胞的感染能力越强；在一定培养周期P24抗原检测OD值越高表明在淋巴细胞内进行有效复制的能力越强。所选全长克隆与PNL4-3阳性对照相比，应该优于阳性对照的感染性和复制的能力。转染上清p24抗原呈强阳性(OD>3.0)和淋巴细胞病变产生多核巨细胞的为HIV全长序列感染性克隆，其质粒为HIV全长序列感染性质粒。对感染性质粒做序列分析得出感染性HIV全基因序列。测序引物序列：

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT M13R：CAGGAAACAGCTATGACC

⑵、用HIV全基因序列感染性的质粒构建感染性带有pre-miRNA的HIV缺陷病毒质粒

1986年，HIV病毒的名称被统一为“人类免疫缺陷病毒”(Human ImmunodeficiencyVirus,HIV)，以更明确的反映出该病毒导致免疫缺陷而不是直接导致癌症的性质。也就是它所产生所有蛋白不致癌，所以使用HIV缺陷病毒作为载体不会增加更多患癌症的风险。

重组HIV缺陷病毒是在HIV病毒基因组中删除env区的绝大部分，作为内含子插入三组四段+1段(每组四段：miRNA-env-1、miRNA-env-2、miRNA-env-3、miRNA-env-4；三组四段构建后加入1段miRNA-env-5)能产生pre-miRNA的双链DNA。重组gp160转录后生成前mRNA，前mRNA带有三组四段带发卡状的内含子，前mRNA剪切除去内含子，内含子被RNA酶剪切生成三组不同的四段双链miRNA，每一段双链miRNA都可以独立地杀死HIV子病毒和gp160的mRNA及新入侵细胞的HIV病毒。当重组HIV缺陷原病毒从细胞DNA转录生成子病毒时将生成近20条pre-miRNA，三组四段剪切后生成近240段双链miRNA，经过细胞内扩增系统miRNA效率是反义RNA的10-100倍。所以，生成一个重组HIV缺陷病毒的子病毒将杀死上百个HIV子代病毒。有实验证明miRNA可以在细胞内存留3-4天，除了杀死子病毒外，还可以阻止新感染病毒复制成cDNA。大量存在的miRNA将更高效、更快速降低患者体内病毒载量，是使用化学药物无法比拟的。三组不同的四段双链miRNA都可以分别独立地降解HIV的RNA，有效地降低感染细胞的HIV对RNAi介导的降解出现的抵抗性，有效地防止HIV病毒的变异而使miRNA失效的可能性。重组gp160转录后生成前mRNA，前mRNA剪切除去内含子，生成成熟的mRNA，它含有一小段gp120和一段gp41，翻译后为gp120和gp41的融合蛋白(共243aa)，融合蛋白性质不可知，必须去掉。miRNA-env-5专门降解融合蛋白mRNA,它是在融合点前gp120取三个氨基酸残基,融合点后gp41取三个氨基酸残基组成：cct gtg tgg cag acc cct ttcc 22bp，其中cag为内含子遗留。由于miRNA-env-5由gp120和gp41两部分组成,(其中融合点前后gp120序列：cctgtgtggagagatgcagata与miRNA-env-5碱基相同率41％，融合点前后gp41序列：ttgtctttccagacccctttcc与miRNA-env-5碱基相同率59％都远低于80％)只能降解融合蛋白mRNA，不能降解重组HIV缺陷病毒的基因组RNA。保证重组HIV缺陷病毒转录为稳定的子病毒，同时不产生任何env蛋白片段。

①、在HIV全基因序列感染性质粒的env区插入含有2个酶切位点的内含子的设计

重组HIV缺陷病毒是在HIV全基因感染性的pESI-T质粒中重组gp160，即删除gp160的绝大部分，作为内含子插入2个酶切位点。内含子中三组四段miRNA应该选择env区最保守的区域。

对24个亚型37条全基因序列进行ClustalX2.1比对，寻找env区最保守的区域。使用的37条基因的亚型分布如下表4：

表4 24个亚型37条全基因的分布

亚型基因	条数	亚型基因	条数	亚型基因	条数
						B	4	D	2	C	3
G	2	H	1	J	1
						U	1	F1	2	CRF04-cpx	1
A1	1	CRF03-AB	1	CRF08-BC	2
						CRF02-AG	3	CRF07-BC	2	CRF12-BF	1
CRF06-cpx	1	CRF11-cpx	1	CRF45_cpx	1
						CRF09-cpx	1	CRF27-cpx	1
CRF26-A5U	1	CRF69_01B	1
						CRF60_BC	1	CRF01-AE	2	共24	37

pre-miRNA作为内含子插入序列必须具有内含子特征剪切位置，动物中典型的剪切位置一致顺序为5’-AGGURAGU--------YNYURAY—Y10-20—YAG—3’,即内含子起始区可以有两种形式：AGGUAAGU和AGGUGAGU HIV-1的内含子起始区基本符合上述规律：在24个亚型中有17个亚型为ca gtaagt,有7个亚型为ca gtgagt.在gt前面aaagca比较保守可能对内含子起始剪切有作用。为稳妥，本发明在gp160中插入的内含子起始区aag agg taa gt，即在vpu(6083-6328)6328后面env区插入第三阅读框的内含子起始区aag agg taa gt。

以EF036533HIV-1CRF01-AE FJ064 from China的tat蛋白为例：tat蛋白本身就是两个外显子中间加一个内含子，tat 5845-6059—内含子---8379-8469，内含子起始区6059是aag acg taa gt,在gt前面aag ag为稳妥，本发明在gp160中插入动物中典型内含子起始区aag agg taa gt，即在vpu(6083-6328)6328后面比较保守的区段6345插入内含子起始区aag agg taa gt。

前半段上链5’端引物5'-LTR(5'-GGAATTCACTGGATGGGCTAATTTACTCCAAGAAAAGACAAG-3')

内含子-前引物：下链5’-Kpn I+Afl III+起始区+6377—6345--3’

5’-GGGGTACCCCCCACATGTGGATACTTACCTCCCACACAGGAACCCCATAATAAACTGTAACCCA-3’。内含子-后引物：

由于限制内切酶AscI(GGCGCGCC)在HIV-1CRF01-AE FJ064 from China全基因序列中没有酶切位点，可以在内含子-后引物中加入AscI(GGCGCGCC)。

内含子-后引物：Afl III(ACATGT)+AscI(GGCGCGCC)+8232-8252。

内含子-后引物：上链5’-CCACATGTGGTACATTGGCGCGCCTGGAATTGGTTTGACATATCA-3’

后半段3’端引物：下链5’-GGGGTACCACTGCTAGAGATTTTTACTCAGTCTAGAGTGGTC-3’

②、env区带有内含子(含2酶切位点)的缺陷病毒的构建

A)、在env区带有内含子的前后半段构建

以HIV全长基因序列感染性质粒为模板用前半段5’端引物和内含子-前引物及Expand long template PCR system(Roche)试剂盒按照试剂盒操作程序PCR扩增前半段。琼脂糖凝胶电泳，条带切胶纯化，得其上下链的3’均以A结尾的前半段

5’-EcoR I-LTR----6345-6377+起始子+Afl III+Kpn I的PCR片段，长度6420bp。

以HIV全基因序列感染性质粒为模板、用内含子-后引物和后半段3’末端引物及Expand long template PCR system(Roche)试剂盒按照试剂盒操作程序PCR扩增后半段，其上下链的3’均以A结尾的后半段5’-Afl III+Asc I+8232—8252-----Kpn I-LTR-3’的PCR片段。琼脂糖凝胶电泳，条带切胶纯化，得到后半段PCR片段，长度1532bp。将前后半段PCR片段分别按零背景TOPO-TA克隆步骤操作，得到前后半段克隆。取菌斑置于含有氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养，用菌液提取质粒，得到含有内含子的前后半段pESI-T质粒。

B)、env区带有2个酶切位点内含子的缺陷病毒的构建

见附图2、env区带有2个酶切位点内含子的缺陷病毒的构建。

将5’端前半段质粒用Afl III和Kpn l双酶切得到5’端前半段基因的开环质粒(8267pb)；将3’端后半段质粒用Afl III和Kpn l双酶切得到3’端后半段基因片段(1521pb)，分别用琼脂糖凝胶电泳，条带切胶纯化，将前半段基因开环质粒与双酶切得到3’端后半段基因片段混合一起，按上面TOPO-TA克隆组分、用量和操作步骤克隆，得到env区带有2个酶切位点内含子的缺陷病毒克隆，取菌斑，用带氨苄青霉素的LB培养基37℃培养过夜，提取质粒，得到全序列在env区带有2个酶切位点内含子的缺陷病毒质粒，长度7922bp；其质粒长度9787bp。结构如下：5’-LTR-EcoR I---6345-6377+起始区+Afl III+Asc I+8232—8252---Kpn I-LTR-3’

其中：起始区+Afl III+Asc I的序列：GAGGTAAGTATCCACATGTGGTACATTGG CGCGCC35bp，可以插入pre-miRNA 6406—8232长度1826bp。

酶切鉴定：质粒用EcoR I、Afl III、Kpn l酶切得到前半段6391bp、后半段1521bp和空质粒1.865kb三条带；质粒用EcoR I、AscI、Kpn l酶切得到前半段6402bp、后半段1506bp和空质粒1.865kb三条带。证明全序列在env区带有2酶切位点正确。

③、pre-miRNA的构建

A)、pre-miRNA的选择

选择原则：miRNA选在env基因中最保守的区段，最好一种序列可以使所选的24个亚型都能产生RNAi。所选序列应该尽量避免ccc，ggg，以利于双链miRNA的解离，最好不含有cccc、gggg的片段。

采用一般siRNA构建方法中的Loop TTCAAGAGA作为miRNA-env-1+和miRNA-env-1-之间的连接，转录RNA后形成miRNA-env-1±的双链和茎环Loop。

a)、miRNA-env-1的选择

选择miRNA-env-1 6894-6914(比对图中7529-7549)21bp,用ClutalX 2.1对37条基因24亚型全基因序列对比分析结果如下表5。

表5：37条基因24亚型全基因序列对比分析结果

组号	miRNA-env-1 6894-6914 21bp
		1	ccaattcccatacattattgt 19条13亚型
2	ccaattcctatacactattgc 2条1亚型
		3	ccaattcctatacattattgc 1条1亚型
4	ccaattcctatacattattgt 10条7亚型
		5	ccaattcccatacactattgt 1条1亚型
6	ccaattcccatccattattgt 1条1亚型
		7	cccattcccatacattattgt 1条1亚型
8	ccaattcccatacatttttgt 1条1亚型

已有数据显示^[6]同一家族的基因在核苷酸水平上达到80％的相同时可以产生特异性的RNAi，并不会出现非特异性的RNAi。由表可见：miRNA-env-1选择6894-6914(7529-7549)21bp,37条基因分为8组，第1组ccaattcccatacattattgt 19条基因13亚型。4、5、6、7、8组共14条基因11亚型与第1组只差1个碱基，碱基相同率95.2％。第3组1条基因1个亚型与第1组只有2个碱基不同，碱基相同率90.5％，第2组2条1亚型与第1组相差3个碱基，碱基相同率85.7％，大于80％，原则上第1组：ccaattcccatacattattgt可以用于所列的全部24亚型。

b)、miRNA-env-2的选择env中部7657-7678处，长度为22bp，见下表6。

env基因的miRNA-env-2的选择env中部7657-7678(比对图中：8460-8481)22bp,37条基因分为7组。第1组aattggagaagtgaattatata 25条基因16亚型。第2、3、4、5、7组共11条基因9亚型与第1组只差1个碱基碱基相同率95.4％；第6组1条基因1亚型与第1组只差2个碱基，碱基相同率90.9％，远大于80％，原则上第1组：aattggagaagtgaattatata可以用于所列的全部24亚型。

c)miRNA-env-3选择在env基因的7795-7816(比对图中8622-8643)22bp

表8：miRNA-env-3选在env基因的7795-7816(比对图中8622-8643)22bp

组号	miRNA-env-3 7795-7816(图中8622-8643)22bp
		1	ggagcagcaggaagcactatgg 25条19亚型
2	ggagcagcaggaagcacgatgg 1条1亚型
		3	ggaacagcaggaagcacgatgg 1条1亚型
4	agcgcagcaggaagcactatgg 1条1亚型
		5	ggagctgcaggaagcactatgg 3条2亚型
6	ggagtagcaggaagcactatgg 1条1亚型
		7	ggagcggcaggaagcactatgg 1条1亚型
8	ggagcagccggaagcactatgg 1条1亚型
		9	ggagcagcaggaggcactatgg 1条1亚型
10	ggaacagcaggaagcactatgg 1条1亚型
		11	ggagcagcaggaagtactatgg 1条1亚型

由表可见：env基因的miRNA-env-3在7795-7816(图中8622-8643)22bp可分为11组，第1组有25条基因19个亚型，第2、5、6、7、8、9、10、11组共10条基因9个亚型，与第1组只差1个碱基，相同率95.4％。第3、4组共2条基因2个亚型与第1组相差2个碱基相同率90.9％，原则上第1组序列ggagcagcaggaagcactatgg用于所列的24个亚型都可以产生RNAi。

d)、选择miRNA-env-4在env基因的7859-7879 21bp

表9：miRNA-env-4序列在7859-7879处长度21bp

组号	miRNA env-4序列7859-7879处长度为21bp
		1	gtctggtatagtgcaacagca 20条16亚型
2	gtctggtatagtgcagcagca 5条5亚型
		3	gtctggaatagtgcaacagca 3条3亚型
4	gtctggtgtagtgcaacagca 1条1亚型
		5	gtctggcatagtgcagcagca 1条1亚型
6	gtctggcatagtgcaacagca 5条5亚型
		7	gtatggcatagtgcaacagca 1条1亚型
8	gtttggcatagtgcaacagca 1条1亚型

由表可见：miRNA-env-4在7859-7879处，长度为21bp，可分为8组，第1组有20条基因16个亚型，第2、3、4、6组共14条基因14个亚型，与第1组只差1个碱基，相同率95.2％。第5、7、8组共3条基因3个亚型与第1组相差2个碱基，相同率90.5％，远大于80％，原则上第1组序列gtctggtatagtgcaacagca用于所列24个亚型都可以产生RNAi。

B)、env基因的一组四段pre-miRNA的构建

由于miRNA-env-1、miRNA-env-2、miRNA-env-3、miRNA-env-4每一段都不是单一的，可以根据所选的亚型选择最优的组合。本发明以以下选择为例：miRNA-env-1、miRNA-env-2、miRNA-env-3、miRNA-env-4都选第1组，它们之间以一段相同的以转录为线性RNA的DNA间隔。

a)、env基因的miRNA-env-1选择6894-6914长度21bp，取第1组(ccaattcccatacattattgt)(SEQ ID NO：1)(组成：外插DNA 45bp+miRNA-env-1+第1组正链ccaattcccatacattattgt21bp+loop ttcaagaga 9bp+miRNA-env-1-第1组互补链acaataatgtatgggaattgg21bp+外插DNA 45bp)

b)、env基因的miRNA-env-2选择7657-7678长度22bp，取第1组(aattggagaagtgaattatata)(SEQ ID NO：2)(组成：外插DNA 45bp+miRNA-env-2+第1组正链aattggagaagtgaattatata22bp+loop ttcaagaga 9bp+miRNA-env-2-第1组互补链tatataattcacttctccaatt22bp+外插DNA 45bp)

c)、env基因的miRNA-env-3选择7795-7816长度22bp，取第1组(ggagcagcaggaagcactatgg)(SEQ ID NO：3)(组成：外插DNA 45bp+miRNA-env-3+第1组正链ggagcagcaggaagcactatgg22bp+loop ttcaagaga9bp+miRNA-env-3-第1组互补链ccatagtgcttcctgctgctcc22bp+外插DNA 45bp)

d)、env基因的miRNA-env-4选择在7859-7879长度为21bp，取第1组(gtctggtatagtgcaacagca)(SEQ ID NO：4)(组成：外插DNA 45bp+miRNA-env-4+第1组正链gtctggtatagtgcaacagca21bp+loop ttcaagaga9bp+miRNA-env-4-第1组互补链tgctgttgcactataccagac21bp+外插DNA 45bp)

e)、env基因的miRNA-env-5选择在重组缺陷病毒gp120和gp41融合蛋白的融合点两侧各三个氨基酸残基，长度为22bp，cctgtgtgg cag acccctttcc(SEQ ID NO：5)(组成：Afl III+Spe I+外插DNA 45bp+miRNA-env-5+正链cctgtgtggcagacccctttcc22bp+loopttcaagaga9bp+miRNA-env-5-互补链ggaaaggggtctgccacacagg22bp+外插DNA 45bp+Avr II+Asc I)

f)、env基因的一组四段miRNA-env-1-4(SEQ ID NO：6)化学合成一组四段miRNA-env-1-4的双链DNA 604bp(组成：Afl III+Spe I+miRNA-env-1-4+Avr II+Asc I)。

C)、三组四段pre-miRNA的构建

a)、一组四段pre-miRNA的设计:全序列在env区带有2个酶切位点内含子的缺陷病毒质粒为5’-LTR-EcoR I----6345-6377+起始区+Afl III+Asc I+8232—8252----Kpn I-LTR-3’

其中：起始区+Afl III+ASC I的序列GAGGTAAGTATCCACATGTGGTACATTGGCGCGCC35bp。

在内含子2酶切位点Afl III+Asc I中可以插入miRNA 6406—8232长度1826bp。使用同尾酶Spe I(GACTAGTC)和Avr II(CCTAGG)在内含子2酶切位点Afl III+Asc I中插入Spe I(GACTAGTC)和Avr II(CCTAGG)得到一组四段miRNA-env-1-4结构：Afl III+SpeI----miRNA-env-1-4----Avr II+Asc I即：CCACATGTGGGACTAGTC----miRNA-env-1-4----CCTAGGAATAGGCGCGCC

b)、一组四段miRNA-env-1-4的构建：

化学合成(SEQ ID NO：6)(miRNA-env-1-4)长度604bp，在3’增加a以便TOPO克隆。一组四段miRNA-env-1-4双链DNA序列，每一段由一段转录为线性RNA的双链DNA间隔。

一组四段miRNA-env-1-4双链DNA序列上链转录为RNA:604nt(SEQ ID NO：7)。

一组四段miRNA-env-1-4上链转录为线性RNA连接的四段发卡状±miRNA的结构示意图如附图7。

c)、一组四段miRNA-env-1-4的TOPO-TA克隆构建

将化学合成的双链3’端有a的一组四段miRNA-env-1-4片段与TOPO-TA克隆的组分混合，按照上面TOPO-TA克隆操作规程进行，得到一组四段miRNA-env-1-4的克隆，做质粒大小鉴定：质粒为2.469kb，酶切鉴定：用限制内切酶Afl III和Asc I双酶切，得到0.595kb和空质粒1.865kb片段。测序，得到序列正确的一组四段Pre-miRNA1-4的质粒。

d)、三组四段+1段3*miRNA-env-1-4+5的TOPO-TA克隆构建

见附图3：3*miRNA-env-1-4+5的TOPO质粒生成过程。

先构建三组四段miRNA-env-1-4，取一组四段miRNA-env-1-4(序列图中简写为miRNA1-4)质粒三份，每份质粒:604bp，第1份质粒：

pESI-T----CCACATGTGGGACTAGTC----miRNA1-4----CCTAGGAATAGGCGCGCC---pESI-T上链

pESI-T--GGTGTACACCCTGATCAG----miRNA1-4-----GGATCCTTATCCGCGCGG---pESI-T下链

用限制内切酶Avr II和Asc I双酶切得到带粘末端缺口的质粒：

pESI-T----CCACATGTGGGACTAGTC----miRNA1-4----C CGCGCC----pESI-T

pESI-T--GGTGTACACCCTGATCAG----miRNA1-4-----GGATC GG---pESI-T

第2份质粒：

上链pESI-T----CCACATGTGGGACTAGTC----miRNA1-4----CCTAGGAATAGGCGCGCC----pESI-T

下链pESI-T--GGTGTACACCCTGATCAG----miRNA1-4-----GGATCCTTATCCGCGCGG---pESI-T

用限制内切酶Spe I和Asc I双酶切得到带粘末端片段:

上链CTAGTC----miRNA1-4----CCTAGGAATAGG

下链AG----miRNA1-4-----GGATCCTTATCCGCGC

第1份带粘末端片段缺口质粒和第2份带粘末端片段按TOPO-AT克隆操作程序操作得到：

第1-2质粒：1179bp(miRNA1-4序列图中简写为1-4)

pESI-T---CCACATGTGGGACTAGTC---1-4---CCTAGTC---1-4---CCTAGGAATAGGCGCGCC----pESI-T

pESI-T--GGTGTACACCCTGATCAG---1-4---GGATCAG---1-4----GGATCCTTATCCGCGCGG----pESI-T

Spe I和Avr II同尾酶粘末端连接后CCTAGTC不会再被Spe I和Avr II酶切。同样的方法：用限制内切酶Avr II和Asc I双酶切得到带粘末端缺口的第1-2质粒：

pESI-T---CCACATGTGGGACTAGTC---1-4---CCTAGTC---1-4---C CGCGCC----pESI-T

pESI-T--GGTGTACACCCTGATCAG---1-4---GGATCAG---1-4----GGATC GG----pESI-T

第3份质粒用限制内切酶Spe I和Asc I双酶切得到带粘末端片段:

CTAGTC----miRNA1-4----CCTAGGAATAGG

AG----miRNA1-4-----GGATCCTTATCCGCGC

第1-2份带粘末端片段缺口质粒和第3份带粘末端片段按TOPO-AT克隆操作程序操作得到：

第1-2-3质粒即三组四段质粒：长度为1754bp

pESI-T-CCACATGTGGGACTAGTC--1-4--CCTAGTC--1-4--CCTAGTC--1-4—CCTAGGAATAGGCGCGCCpESI-T

pESI-T-GGTGTACACCCTGATCAG--1-4--GGATCAG--1-4---GGATCAG--1-4--GGATCCTTATCCGCGCGGpESI-T

三组四段+1段3*miRNA-env-1-4+5的TOPO-TA克隆构建：

第1-2-3质粒用限制内切酶Avr II和Asc I双酶切得到带粘末端缺口质粒：

pESI-T-CCACATGTGGGACTAGTC--1-4--CCTAGTC--1-4--CCTAGTC--1-4—C CGCGCC-pESI-T

pESI-T-GGTGTACACCCTGATCAG--1-4--GGATCAG--1-4---GGATCAG--1-4—GGATCGG-pESI-T

miRNA-env-5的质粒为：

pESI-T----CCACATGTGGGACTAGTC--miRNA-env-5--CCTAGGAATAGGCGCGCC---pESI-T上链

pESI-T--GGTGTACACCCTGATCAG--miRNA-env-5--GGATCCTTATCCGCGCGG---pESI-T下链

用限制内切酶Spe I和Asc I双酶切得到带粘末端片段:

上链CTAGTC----miRNA-env-5----CCTAGGAATAGG

下链AG----miRNA-env-5-----GGATCCTTATCCGCGC

第1-2-3份带粘末端缺口质粒和miRNA-env-5带粘末端片段按TOPO-AT克隆操作程序操作得到：三组四段+1段质粒：长度为1904bp

上链pESI-T-CCACATGTGGGACTAGTC--1-4--CCTAGTC--1-4--CCTAGTC--1-4—CCTAGTC--miRNA-env-5—CCTAGGAATAGGCGCGCC-pESI-T

下链pESI-T-GGTGTACACCCTGATCAG--1-4--GGATCAG--1-4---GGATCAG--1-4--GGATCAG--miRNA-env-5—GGATCCTTATCCGCGCGG-pESI-T

D)、env基因内含子的三组四段+1段pre-miRNA的全基因序列缺陷病毒的构建

见附图4：全序列HIV缺陷病毒TOPO质粒的构建。

取全序列在env区带有2个酶切位点内含子的缺陷病毒,长度7912bp，其质粒长度9777bp。

(5’-LTR-EcoR I----6345-6377+起始区+Afl III+Asc I+8232—8252----Kpn I-LTR-3’)即：

5’-LTR-EcoR I--6345-6377+起始区CCACATGTGGTACATTGGCGCGCC8232—8252--Kpn I-LTR-3’

用限制内切酶Afl III和Asc I双酶切得到带缺口的pESI-T质粒。双链结构如下：

5’-LTR-EcoR I--6345-6377+起始区CCA CGCGCC8232—8252--Kpn I-LTR-3’

3’-LTR-EcoR I--6345-6377+起始区GGTGTAC GG8232—8252--Kpn I-LTR-5’

用限制内切酶Afl III和Asc I双酶切三组四段+1段质粒得到带粘末端的三组四段+1段片段：

CATGTGGGACTAGTC--1-4--CCTAGTC--1-4--CCTAGTC--1-4--CCTAGTC--miRNA-env-5-CCTAGGAATAGGACCCTGATCAG--1-4--GGATCAG--1-4--GGATCAG--1-4--CCTAGTC--miRNA-env-5--GGATCCTTATCCGCGC

将Afl III和Asc I双酶切带有2个酶切位点内含子的缺陷病毒得到带缺口的pESI-T质粒与带Afl III和Asc I双酶切粘末端的三组四段+1段片段混合按TOPO-AT克隆操作程序操作得到全序列缺陷病毒克隆。其质粒上链结构：5’-LTR-EcoRI--6345-6377+起始区CCACATGTGGGACTAGTC---1-4---CCTAGTC---1-4---CCTAGTC----1-4--CCTAGTC--miRNA-env-5--CCTAGGAATAGGCGCGCC8232—8252--Kpn I--LTR-3’。Env区内含子三组四段+1段miRNA的全长基因9.792kb,加两段酶切位点全长9811bp，其质粒长度11.676kb。提取质粒做鉴定：质粒鉴定：Env区内含子三组四段+1段miRNA的全长基因质粒11.676kb，Env区内含子含2酶切位点的全长基因质粒9.777kb质粒。酶切鉴定：用限制内切酶Afl III和Asc I双酶切三组四段+1段miRNA的全长基因质粒，得到三组四段+1段miRNA片段1.904kb和缺口质粒9.772bp。测序：Env区内含子三组四段+1段miRNA的全长基因质粒送测序，基因序列正确的是全序列重组缺陷病毒质粒。

见附图5：HIV-1全基因图和附图6：HIV-1缺陷病毒全基因图，两图对比，可见HIV-1病毒与HIV-1缺陷病毒除env区不同外，其它完全一样，有利于制备感染性HIV-1缺陷病毒。

⑶、各种亚型HIV-1重组缺陷病毒库的建立

a)、制备有效治疗各种亚型重组缺陷病毒(以HIV-1CRF01_AE亚型为例)

采用二质粒包装系统的模式，用env蛋白表达质粒和重组缺陷病毒质粒在293T细胞中产生有感染力的重组缺陷病毒的活病毒。具体操作如下：

培养携带过表达env蛋白质粒的293T细胞100mL，细胞密度在1*10⁶-1*10⁷。取10mL用LONZA 4D-Nucleofector细胞核转染系统导入有效治疗HIV-1CRF01_AE亚型重组缺陷病毒质粒，得到含有过表达env蛋白质粒和有效治疗HIV-1CRF01_AE亚型重组缺陷病毒质粒的293T阳性细胞，把该细胞放回到原携带过表达env蛋白质粒293T细胞100mL，继续培养，在培养液中含有有效治疗HIV-1CRF01_AE亚型重组缺陷病毒。每过7天更换培养携带过表达env蛋白质粒293T细胞(细胞密度在1*10⁶-1*10⁷)30mL，使培养液中保持1*10⁶-1*10⁷/mL的有效治疗HIV-1CRF01_AE亚型重组缺陷病毒。作为临床使用HIV-1CRF01_AE亚型重组缺陷病毒。用相同的方法制备其它各种有效治疗亚型重组缺陷病毒，成为有效治疗各种亚型重组缺陷病毒库。

b)、有效治疗各种亚型重组缺陷病毒的细胞鉴定(以HIV-1CRF01_AE亚型为例)取HIV-1CRF01_AE亚型携带者的静脉血1mL，使用人淋巴细胞分离液(天津LTS10771)，按操作方法提取淋巴细胞，分三瓶(每瓶20ml)加入5ml淋巴细胞培养液，(其中含：RPMI1640 4ml、灭活小牛血清1ml、青霉素500U、链霉素500ug)加入PHA 2.5mg、37℃、5％CO₂培养淋巴细胞PHA刺激培养6天，观察是否有融合巨细胞出现，如果有说明淋巴细胞已经充分被HIV-1感染，用人包膜蛋白gp120酶联免疫ELISA试剂盒(上海研谨生物科技有限公司)测定培养液中gp120含量，应该OD值大于3.0。离心弃上清，细胞用10ml Hank's洗两次后吸干上清，即细胞中已经去除残留的gp120抗原。用5ml新鲜的淋巴细胞生长液重悬细胞后加入含有有效治疗HIV-1 CRF01_AE亚型重组缺陷病毒的培养液0.2mL，置37℃、5％CO2条件下培养9天，每隔3天移去4ml培养上清液，随之补充4ml新鲜的培养液，收集感染上清经0.45μm滤膜过滤后进行gp120抗原检测鉴定缺陷病毒对淋巴细胞的治疗有效性。测定培养液中gp120含量，OD值逐渐降低到0.3以下。观察是否已经生成的多核巨细胞溶解，及其它细胞病态有所改善，并且培养液的gp120含量大幅度减少，证明该重组缺陷病毒是有效治疗HIV-1CRF01_AE亚型的重组缺陷病毒。同样的方法用于鉴定各种亚型有效治疗的重组缺陷病毒。

细胞鉴定的具体实验：

到目前为止HIV-1病毒感染没有理想的动物模型，本发明用HIV-1病毒感染者淋巴细胞体外实验证明HIV-1缺陷病毒对被HIV-1病毒感染的淋巴细胞的治疗效果。

HIV-1缺陷病毒不表达gp120和gp41。淋巴细胞感染HIV-1病毒时大量产生gp120和gp41,此时，加入HIV-1缺陷病毒，它感染已被HIV-1感染的淋巴细胞时在淋巴细胞细胞内产生大量的miRNA杀死HIV-1的子病毒和env产生的mRNA，使之不能产生gp120和gp41。培养液中gp120水平迅速降低，说明HIV-1缺陷病毒起到杀死HIV-1病毒和env蛋白的作用，并能借用HIV-1以前产生的包膜蛋白gp120和gp41生成有感染能力的HIV-1缺陷病毒。定量测定培养液中gp120的水平是否降低，说明HIV-1缺陷病毒是否起作用。本实验使用人包膜蛋白gp120酶联免疫ELISA试剂盒(上海研谨生物科技有限公司)定量测定淋巴细胞培养液中gp120的水平。

HIV-1缺陷病毒与HIV-1病毒体内和体外有同样感染淋巴细胞的能力，体外实验成功标志着HIV-1缺陷病毒在体内能够感染淋巴细胞起到杀死HIV-1病毒和env蛋白的作用。

在全国13个省(市)的研究发现，男男同性恋中CRF01_AE的比例2014年为43.5％在北京男男同性恋中HIV感染者有60％是CRF01_AE亚型,它的毒力较强，高病毒载量，进展速度快，从感染至艾滋病期平均4.8年，研究CRF01_AE亚型有较强的现实意义。本次体外实验研究CRF01_AE亚型。

体外淋巴细胞实验：

1.材料方法

1.1材料

人的外周血淋巴细胞。有效治疗HIV-1CRF01_AE亚型重组缺陷病毒的培养液(病毒滴度1*10⁶-1*10⁷/mL)

1.2器具及仪器

带有肝素抗凝的真空采血管、20mL培养瓶、显微镜、细胞培养箱、酶标仪、离心机、电子天平、分析天平、精密PH试纸、移液管、烧杯、酒精灯、移液枪

1.3药品

1.3.1RPMI“1640”培养基

称取“1640”粉末1.05g，用100mL的双蒸水溶解，溶解后pH值调至6.0。每1000毫升溶液加NaHCO₃ 1.0克，校正PH到7.1。

1.3.2植物凝血素(PHA)

是淋巴细胞有丝分裂刺激剂，本实验采用的是市面上购买的PHA粉末，将1瓶粉末(25mg)溶在2mL的蒸馏水中，0.45μ滤膜过滤除菌。一个针剂为0.2mL。

1.3.3抗菌素

青霉素(以每瓶80万单位为例)：将1瓶青霉素溶在8mL生理盐水中，则每毫升含10万单位。取0.025mL注入5mL的培养物中，则最终浓度为500单位/mL。

链霉素(以每瓶100万单位为例)：以4毫升生理盐水稀释，则每毫升含25万单位，取0.01mL注入5mL的培养物中，则最终浓度为500单位/mL。

1.3.4 3.5％NaHCO₃溶液

称取NaHCO₃(A.R.)3.5g溶于100ml蒸馏水，0.45μ滤膜过滤除菌。

2方法步骤

2.1分装培养液

用移液管将培养液和其他各试剂分装入培养瓶中，每瓶量为：

RPMI“1640”培养基 4mL

小牛血清 1mL

双抗(青霉素加链霉素) 0.035mL

用3.5％NaHCO₃溶液调pH到7.3，分装到20mL的培养瓶中，盖好盖子，置于-20℃冰柜中保存。用前从冰柜内取出，放入37℃恒温锅中温育10min。

2.2采血与提取淋巴细胞

用带有肝素抗凝的真空采血管采取HIV-1CRF01_AE亚型病毒感染者静脉血1ml，使用人淋巴细胞分离液(天津LTS10771)，按操作方法提取淋巴细胞，分四个20ml瓶，加入5ml培养液，加入PHA 0.2ml，盖好盖子，直立置于37℃、5％CO2条件下细胞培养箱内培养。

2.3淋巴细胞培养和HIV-1病毒感染

1960年Nowell和Morhead验证，植物凝集素(phytohaemagglutinin，PHA)是人和其他动物淋巴细胞的有丝分裂的刺激剂。在PHA的作用下，原来处于G0期的淋巴细胞转换为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。置37℃温箱内培养7天(72小时是白细胞分裂的两个周期)。

感染者淋巴细胞中有HIV-1CRF01_AE亚型病毒，淋巴细胞培养扩增，病毒感染新生细胞，病毒载量增加，培养液中gp120的含量增加。

2.4镜检

观察是否有融合巨细胞出现，如果有说明淋巴细胞充分被HIV-1感染，收集细胞。

2.5gp120含量检测

培养液经0.45μm滤膜过滤，用人包膜蛋白gp120酶联免疫ELISA试剂盒(上海研谨生物科技有限公司)测定gp120含量。

2.6HIV-1缺陷病毒感染携带HIV-1病毒的淋巴细胞

收集4瓶充分被HIV-1感染的淋巴细胞分别于15ml离心管，3000rpm/min离心，弃上清，用8ml Hank's洗两次后吸干上清，加入5ml新鲜的培养液，悬浮细胞，装入20ml培养瓶，1和2号加入HIV-1缺陷病毒培养液0.2ml，3和4号为阴性,不加HIV-1缺陷病毒培养液，盖好瓶塞，直立置于37℃、5％CO2条件下细胞培养箱内培养9天。每3天取出培养液4ml，0.45μm滤膜过滤，测定gp120的含量。加入4ml新鲜的培养液继续培养。

3结果

表5：gp120测定值

每3天取出培养液4ml，0.45μm滤膜过滤，测定gp120的含量。加入4ml新鲜的培养液继续培养。即每3天更换培养液80％。所测定的gp120，包括：培养液中的病毒外膜上gp120，病毒进入细胞时脱掉的病毒外膜的gp120和细胞产生的游离gp120。由表可见，1和2号加入HIV-1缺陷病毒培养液0.2ml，其后3,6,9天培养液中gp120含量急剧下降，说明HIV-1缺陷病毒进入淋巴细胞杀死HIV-1病毒和env蛋白，没有HIV-1病毒和gp120产生，但是更换培养液时遗留的20％及产生少量的HIV-1缺陷病毒，使得3天时gp120含量相对比较高，随后逐渐降低。3和4号为阴性,未加HIV-1缺陷病毒培养液，随着培养时间的延长HIV-1病毒破坏杀死淋巴细胞，培养液中gp120的含量降低。从细胞形态上看：1号和2号随着培养时间延长除已经产生的多核巨细胞溶解外，没有新产生的多核巨细胞，细胞病态逐渐变好。3号和4号随着培养时间延长已经产生的多核巨细胞溶解，又产生新的多核巨细胞继续溶解，细胞病态加剧，大量细胞死亡。

实验证明：HIV-1缺陷病毒对已经感染HIV-1病毒的淋巴细胞有保护和挽救作用，能够在细胞内杀死HIV-1病毒和env蛋白。

此实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims (10)

1.一种重组HIV缺陷病毒及其制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以HIV病毒携带者同种亚型的病毒株为模板，使用TOPO-TA克隆制备该亚型的全基因序列感染性克隆及质粒。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，包括以下步骤：

在HIV病毒携带者同种亚型的病毒株在env区选择中间酶切位点，分析37条基因24个亚型中有20条基因16亚型在6500-7650处可以使用有限制内切酶Afl III(acatgt)酶切位点；把HIV病毒分为前后两段，分别设计引物，以该病毒为模板，使用长片段PCR扩增前后半段，TOPO-TA克隆后，酶切后再互相连接成为TOPO全基因序列感染性克隆及质粒。

3.根据权利要求1或2所述制备方法制得的全基因序列感染性克隆及质粒。

4.一种内含子感染性重组缺陷病毒质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：删除该亚型的全基因序列感染性质粒中env区大部分碱基，插入带有miRNA的内含子生成感染性重组缺陷病毒质粒。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，包括以下步骤：

miRNA的内含子是使用第1阅读框的tat蛋白的内含子起始区、分枝点和结束区作为第3阅读框的内含子插入env基因删除大部分碱基的区域；

在内含子起始区和分枝点之间插入2个限制内切酶Afl III(ACATGT)和Asc I(GGCGCGCC)位点。

6.根据权利要求4或5所述制备方法制得的内含子感染性重组缺陷病毒质粒。

7.一种感染性重组缺陷病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

使用二质粒包装系统模式，用细胞核转染系统把有效治疗HIV亚型重组缺陷病毒质粒导入带有表达env蛋白质粒的293T细胞，培养该细胞，培养液中含有感染性重组缺陷病毒。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其中，包括以下步骤：

感染性重组缺陷病毒质粒中内含子含有三组四段+1段miRNA，其中三组四段miRNA是由一段相同的转录为线性RNA的DNA连接的三组相同的四段产生带有loop的发卡状dsRNA的DNA即：miRNA-env-1、miRNA-env-2、miRNA-env-3、miRNA-env-4，它们都是env区最保守碱基片段；三组四段+1段miRNA中的+1段是miRNA-env-5，用于降解感染性重组缺陷病毒env基因转录的前RNA除去内含子后生成的部分gp120和部分gp41融合蛋白的mRNA，使之不产生任何env蛋白片段；

在三组四段+1段miRNA的两端含有限制内切酶Afl III和Asc I，用这两个酶切后得到三组四段+1段miRNA的片段，与用Afl III和Asc I双酶切的权利要求6中内含子的起始区后面，分枝点前面插入2个限制内切酶Afl III和Asc I感染性重组缺陷病毒TOPO开口质粒混合连接成为治疗用感染性重组缺陷病毒质粒。

9.根据权利要求7或8所述制备方法制得感染性重组缺陷病毒。

10.权利要求3的全基因序列感染性克隆及质粒、权利要求6的内含子感染性重组缺陷病毒质粒、权利要求9所述的感染性重组缺陷病毒在制备治疗艾滋病药物中的应用。

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