CN107129999A - 利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及通过稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行编辑从而改变其遗传特性的方法。针对现有的病毒基因组编辑技术的不足，本发明提供一种利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行编辑的方法，包括如下步骤：首先构建用于靶向编辑病毒基因组的特异性载体，然后包装慢病毒，再用慢病毒侵染ST细胞与293T细胞获得稳转CRISPR/Cas9系统的ST细胞与293T细胞，最后用病毒侵染这种稳转细胞，并纯化出基因组被编辑的病毒。利用稳转CRISPR/Cas9系统编辑病毒的基因组操作简单、效率高、成本低、适用范围广，能在短时间内获得基因改良型的病毒株。

Description

利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的 方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及通过稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行编辑从而改变其遗传特性的方法。

背景技术

基因编辑技术是指可以根据人们的意愿对目的基因进碱基的插入或者缺失，以改变物种遗传特性为目的的技术手段。早期的基因编辑技术主要包括以ZFN(zinc-fingernucleases)和TALEN(transcription activator-like effector nucleases)为代表的序列特异性核酸酶技术，其能够高效率地进行定点基因组编辑，在基础研究、基因治疗和遗传改良等方面展示出了巨大的潜力。CRISPR/Cas9系统是继“锌指核酸内切酶(ZFN)”、“类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)”之后出现的第三代“基因组定点编辑技术”。其在sgRNA的引导下能对目的基因进行切割，被切割的基因在进行修复时可能会引起碱基的缺失或者插入从而使目的基因突变。CRISPR/Cas9技术源于细菌的一种获得性免疫系统。在细菌的基因组上，存在着串联间隔排列的“重复序列”，这些重复序列相对保守，我们称之为CRISPR序列(Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats-成簇的规律间隔的短回文重复序列)。细菌在抵抗病毒或外源核酸入侵时，会产生相应的“记忆”，来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵，而这种获得性免疫正是由细菌的CRISPR/Cas系统实现的。与前两代技术相比，其成本低、制作简便、快捷高效的优点，让它迅速风靡于世界各地的实验室，成为科研、医疗等领域的有效工具。

目前，获得基因改良的病毒株的方法主要有以下几种：第一，通过将病毒在体外培养进行反复传代的方法。这种方法可以获得自然突变的病毒，但是这种突变的位点是未知的；而且突变对病毒的致病能力的改变是不确定的，可以是增强也可以是减弱。这种方法分离的突变型病毒其回复突变能力强而且耗时极少人会采用。第二，利用反向遗传学技术手段获得改良型病毒。使用该方法的前提是对病毒的基因组每个基因的功能以及其碱基序列的了解。其主要过程是在体外将病毒的关键性基因连接到特定的载体上，再将这些载体共转染到特定的细胞中进行共表达。在细胞中表达的病毒蛋白可以自行包装成病毒颗粒。这种方法可以特异性的删除病毒的基因或者引入外源基因，其局限性在于只能对遗传特性已知的病毒进行改良，对未知病毒不具有编辑能力且步骤繁琐成功率不高。第三，借助CRISPR/Cas9系统对病毒基因进行编辑。利用CRISPR/Cas9系统编辑基因，通常是将CRISPR/Cas9系统通过一个质粒载体瞬转到细胞中以达到编辑细胞中特定的基因，该基因也可以是细胞内病毒的基因组。这种瞬转的方法操作最为简单，但是编辑细胞内病毒基因组的效率不高，往往在试验中要进行多次瞬转才能达到比较好的效果且价格昂贵。另一个利用稳转CRISPR/Cas9系统编辑基因是通过慢病毒介导的，首先包装慢病毒，将包装好的慢病毒去侵染特定的细胞。慢病毒侵染细胞后会将自己的基因组完全整合到宿主细胞的基因组中，而慢病毒的基因组中就包含有CRISPR/Cas9系统。这样CRISPR/Cas9系统就整合到宿主细胞中并且永不丢失。将要编辑的病毒感染稳转了CRISPR/Cas9系统的细胞，这样该病毒就会被编辑。

利用稳转CRISPR/Cas9系统编辑病毒的基因组操作简单、效率高、成本低、适用范围广，能在短时间内获得基因改良型的病毒株。现在国内外利用稳转CRISPR/Cas9系统编辑病毒基因组的研究还比较少。

发明内容

本发明针对现有的病毒基因组编辑技术的不足，提供一种稳转CRISPR/Cas9系统编辑病毒基因组的方法。

本发明所获得的稳转CRISPR/Cas9系统的293T细胞株与ST细胞株。

本发明获得一株gE基因缺失的伪狂犬病毒(PRV-GE^-)与一株gE、TK基因双缺失的伪狂犬病毒(PRV-GE^-/TK^-)。

本发明采用如下技术方案：

一种稳转CRISPR/Cas9系统编辑病毒基因组的方法，包括以下步骤：

(1)构建用于靶向编辑病毒基因组的特异性载体；

(2)包装慢病毒并利用慢病毒侵染293T细胞与ST细胞，最后通过Puromycin进行筛选获得稳转细胞株；

(3)用病毒侵染稳转细胞株；

(4)纯化出基因组被编辑的病毒。

其中步骤(1)所述构建用于靶向编辑病毒基因组的特异性载体的方法为：设计用于起特异性靶向作用的sgRNA并将其连接到经BsmBI酶切后的载体Lenti CRISPR V2上，得到Lenti CRISPR V2-sgRNA。

步骤(2)所述包装慢病毒并利用慢病毒侵染293T细胞与ST细胞，最后通过Puromycin进行筛选获得稳转细胞株的具体方法如下：

将靶向编辑病毒基因组的特异性载体与pCMV-VSV-G、pSPAX2质粒共转染到293T细胞进行慢病毒的包装并收获慢病毒，将收获的慢病毒侵染ST细胞与293T细胞，最终通过Puromycin进行筛选获得稳转CRISPR/Cas9系统的细胞株。

步骤(3)所述用病毒侵染稳转细胞株的具体方法为：

首先将野生型病毒扩大培养并测其滴度，然后加入到培养的稳转细胞株中；待细胞病变达到80％以上时收获病毒并将该次病毒液作为下一次侵染稳转细胞的毒液；每收获一次都进行测序用于判定突变病毒与野生型病毒的比例以及是否需要进行下一次侵染。

更具体地，其中野生型病毒毒量为10⁷TCID₅₀。

步骤(4)所述纯化出基因组被编辑的病毒是采用病毒噬斑法，具体方法如下：

取ST细胞进行铺板待细胞汇合度达到80％以上时加入步骤(3)得到的被修饰过的病毒，加入病毒后继续培养并观察噬斑的形成，挑取噬斑并扩大培养以及测序鉴定。

更具体地，被修饰过的病毒滴度为10⁵TCID₅₀。

所述病毒为伪狂犬病毒PRV；所述特异性靶向作用的sgRNA为用于靶向伪狂犬病毒PRV gE基因的sgRNA和靶向伪狂犬病毒PRV TK基因的sgRNA。

其中用于靶向PRV gE基因的sgRNA：GCCGGCGACGATGACCTCGA，靶向PRV TK基因的sgRNA：TGCCCGAGCCGATGGCGTAC。

根据以上方法纯化出一株gE基因缺失的伪狂犬病毒(PRV-GE^-)与一株gE、TK基因双缺失的伪狂犬病毒(PRV-GE^-/TK^-)，毒力下降，可用于制备疫苗。

本发明的优点在于：

1、利用慢病毒侵染细胞可以获得稳转CRISPR/Cas9系统的细胞株。该细胞能够稳定持续表达Cas9蛋白以及转录sgRNA。用该细胞株编辑病毒的基因组避免了瞬转效率不高，以及瞬转后随着细胞的增值、质粒的降解所造成质粒丢失的现象。

2、用稳转细胞株编辑病毒的基因组，相对于瞬转其避免了多次的转染操作从而能达降低成本的目的。

3、相对于反向遗传学技术利用CRISPR/Cas9系统编辑病毒的基因组，不需要知道该病毒的所有序列，只需要知道其中一小段序列就可以实现对病毒基因组的编辑。

4、用稳转细胞株编辑病毒的基因组操作简单能在短时间内获得基因被修饰的病毒株。

附图说明

图1为Lenti CRISPR V2载体的酶切产物电泳结果。

图2为连接敲除TK基因sgRNA的测序结果。

图3为连接敲除gE基因sgRNA的测序结果。

图4为慢病毒培养细胞发荧光情况。

图5为稳转细胞验证电泳结果。

图6为ST-TKsgRNA测序结果。

图7为293T-TKsgRNA测序结果。

图8为ST-GEsgRNA测序结果。

图9为验证病毒基因组电泳结果。

图10为修饰后的PRV-GE测序结果。

图11为修饰后的PRV-TK测序结果。

图12为病毒噬斑法纯化观察噬斑大小。

图13为噬斑测序结果。

图14为存活曲线。

图15为伪狂犬病毒抗体滴度。

具体实施方式

实施例1

1、构建用于靶向编辑病毒基因组的特异性载体的方法为：

(1)设计相应的sgRNA:根据NCBI网站所提供的相关基因的序列在http://crispr.mit.edu网站进行设计相应的sgRNA并送往公司合成。用于靶向PRV gE基因的sgRNA：GCCGGCGACGATGACCTCGA，靶向PRV TK基因的sgRNA：TGCCCGAGCCGATGGCGTAC。

(2)sgRNA退火：

退火条件：95℃加热10min。95℃降到85℃，每秒降2℃。85℃降到25℃，每秒降0.25℃。25℃，1min。

(3)Lenti CRISPR V2载体的酶切:Lenti CRISPR V2源于Addgene公司，LentiCRISPR V2质粒上连接sgRNA的位点固定，用核酸内切酶Esp3I(BsmBI)进行切割，Esp3I(BsmBI)从Thermo Fisher Scientific购得，货号为ER0451规格为200units(10U/μL)。酶切位点：CGTCTC(1/5)^。

混匀后放置于37℃水浴锅中，酶切时间是16h。酶切产物电泳结果见图1。

(4)酶切产物的回收：使用TAKARA公司的胶回收试剂盒进行回收。(TaKaRaMiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0，货号：9762。)

(5)退火产物与切好的载体连接：连接酶使用TAKARA公司的T4DNA Ligase，货号为：D2011A。

连接条件：16℃连接20h。

(6)连接产物转化、挑取单一菌落扩大培养。

(7)测序验证：取1ml菌液送往测序公司从测序。测序引物为hU6-F(5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3')。

连接敲除TK基因sgRNA的测序结果见图2。

连接敲除gE基因sgRNA的测序结果见图3。

根据结果可以判定用于靶向TK与GE的sgRNA与载体连接成功。

2、包装慢病毒并利用慢病毒侵染293T细胞与ST细胞，最后通过Puromycin进行筛选获得稳转细胞株的方法为：(1)Lenti CRISPR V2-sgRNA、pCMV-VSV-G、pSPAX2三种质粒共转染到293T细胞，待293T细胞汇合度达到70％左右时开始进行转染。首先将DMEM培养液换成OPTI-MEM培养液，OPTI-MEM培养液购于Gibco公司货号为31985-070。在1.5ml离心管中将质粒与PEI漩涡混匀，其质量比为PEI︰质粒＝3︰1。10cm培养皿转染质粒总量22.5μg，PEI为67.5μg。Lenti CRISPR V2-gRNA、pCMV-VSV-G、pSPAX2三种质粒质量比为，Lenti CRISPRV2-gRNA︰pSPAX2︰pCMV-VSV-G＝4︰3︰2。对照组以PNL替换Lenti CRISPR V2-gRNA其他条件相同。混匀后静置10min将混合液均匀滴加到细胞培养液中，滴加完毕轻轻晃动培养皿使PEI与质粒的混合液均匀分布在培养皿中。

(2)培养并收获慢病毒：转染结束后放置于细胞培养箱中培养，培养条件是37℃、5％CO2、湿度100％。培养24h后换液，将OPTI-MEM培养液换成DMEM培养液继续培养。培养24h后收获其细胞培养液上清，上清中含有慢病毒。收获上清后再加入新鲜培养液继续培养，共收获2-3次4℃放置24h后3700rpm/min离心10min。离心后用0.45μm的滤膜过滤上清液，过滤后放置于4℃待用。

(3)验证慢病毒是否包装成功：待293T细胞汇合度达到70％时将对照组收获的慢病毒1ml加入到细胞培养液中，继续培养3天观察细胞发荧光的情况。

细胞发荧光情况如图4所示，说明慢病毒包装成功。

(4)用慢病毒侵染ST细胞及293T细胞：待ST细胞与293T细胞的汇合度达到70％左右时加入1ml慢病毒(10cm培养皿)，加入慢病毒后继续培养当汇合度达到90％以上时进行传代。按1传2进行传代，传代后再次加入1ml慢病毒并进行培养，当汇合度达到90％以上时再次进行传代。重复传代6-8次进行筛选。每次传代都加入一次慢病毒。

(5)用Puromycin进行筛选并扩大培养：最后一次加入慢病毒后待细胞汇合度达到90％以上时进行传代并加入Puromycin(3.5μg/ml)，24h后进行换液继续培养。待细胞汇合度达到90％以上时进行传代并加入Puromycin(3.5μg/ml)24h后进行换液继续培养。重复以上步骤3-4次即可获得纯的稳转细胞株。

(6)稳转细胞的验证：用Primer Premier 5设计验证引物，上游引物为：GTGAATAGAGTTAGGCAGGGAT，下游引物为：CCAACTTCTCGGGGACTG。取约5×10⁶个细胞提取基因组，使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0进行提取，货号为：9765。

基因组PCR、体系及程序：使用的酶是Max DNA Polymerase，货号：R045A。

PCR程序：

98℃预变性5min，(98℃10s)→(55℃5s)→(72℃8s)35个循环→72℃7min。

电泳结果见图5。

ST-TKsgRNA测序结果见图6。

293T-TKsgRNA测序结果见图7。

ST-GEsgRNA测序结果见图8。

根据测序结果显示成功构建了稳转的细胞株，包括稳转修饰PRV GE基因的ST细胞以及修饰PRV TK基因的ST细胞与293T细胞。

3、用伪狂犬病毒(PRV-FA)(程晓霞；陈少莺；胡奇林等，鉴别伪狂犬病病毒强、弱毒株单克隆抗体的制备，福建农业学报.2005.)侵染稳转细胞株方法为：

(1)取稳转细胞约1×10⁶个于直径为6cm的培养皿中进行培养，待汇合度达到80％左右时加入野生型病毒毒量为10⁷TCID₅₀。

(2)加入病毒后继续培养并观察细胞病变，待细胞病变达到80％以上时收获细胞培养液，培养液中含有被修饰的病毒。

(3)取1μl含有被修饰的病毒的培养液替代野生型病毒，重复第一与第二步，重复4-6次。每一次重复都用最近一次收获的培养液替代上一次收获的培养液。将最后一次收获的培养液以3700rpm/min离心10min后用0.45μm的滤膜过滤，过滤后放置于4℃待用。

(4)验证病毒基因组是否被修饰：用Primer Premier 5设计验证引物，GE上游引物为：AAAAGGTGGTGTTTGCATAATT，下游引物为：TCGGTGGTGATGTAGAACG。TK上游引物为：TCGTAGAAGCGGTTGTGG下游引物为：CGACCAGGACGAACAGG。使用TaKaRa MiniBEST UniversalGenomic DNA Extraction Kit Ver.5.0提取病毒基因组，货号为：9765。

PCR程序：

98℃预变性5min，(98℃30s)→(55℃30s)→(72℃30s)35个循环→72℃7min。

电泳结果见图9。

修饰后的PRV-GE测序结果见图10。

修饰后的PRV-TK测序结果见图11。

从测序结果可以看出GE、TK基因在sgRNA后方都出现了双峰，说明PRV的GE基因与TK基因都有被修饰。

4、通过病毒噬斑法纯化出基因组被编辑的病毒的方法为：

(1)取约1×10⁶个细胞进行铺板(10cm培养皿)待ST细胞汇合度达到80％左右时加入10⁵TCID₅₀的被编辑后的病毒，加入病毒后继续进行培养并观察噬斑大小。待噬斑直径达到0.1-1mm时进行挑取，噬斑如图12所示。

(2)噬斑扩大培养：在12孔板中取约2×10⁵个细胞进行铺板，将挑取的噬斑置于12孔板中培养，每孔接一个噬斑。待细胞病变达到80％以上时收获培养液，4℃保存待用。

(3)噬斑测序：提取病毒基因组进行PCR后送往公司进行测序。使用TaKaRaMiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0提取病毒基因组，货号为：9765。

PCR程序：

98℃预变性5min，(98℃30s)→(55℃30s)→(72℃30s)35个循环→72℃7min。

测序结果如图13所示。

测序结果显示PRV的GE、TK基因都有被修饰，而且纯化出了GE基因被修饰的伪狂犬病毒(PRV-GE^-)以及GE、TK双基因被修饰的伪狂犬病毒(PRV-GE^-/TK^-)。

(4)病毒毒力检测：将野生型病毒以及突变后的病毒扩大培养并测定其滴度，并将病毒液稀释到10⁵TCID₅₀/0.1ml。购买60只(雌雄各30只)ICR小鼠(7周龄30g)将其分为6组每组10只(雌雄各5只)，适应性喂养7天后做以下处理。

第一组：正常饲养不做处理

第二组：注射0.1mlDMEM培养液

第三组：注射0.1ml野生型伪狂犬病毒(PRV-FA)

第四组：注射0.1mlGE基因被修饰的病毒(PRV-GE^-)

第五组：注射0.1mlGE、TK双基因被修饰的病毒(PRV-GE^-/TK^-)

第六组：注射相同滴度的商品化伪狂犬疫苗

存活曲线如图14所示。第一、二、五、六组无死亡。

结果显示GE基因被修饰后小鼠的存活率显著提高，当GE、TK双基因都被修饰后注射10⁵TCID₅₀的病毒后不具有致死能力。后续实验中注射10⁸TCID₅₀的病毒小鼠同样都存活下来。该结果说明当GE基因被修饰后PRV的毒力下降，当GE、TK双基因被修饰后毒力进一步下降。

将存活的小鼠继续饲养7天后取其血清测定伪狂犬病毒抗体滴度。滴度如图15所示。

通过抗体滴度测定，注射PRV-GE^-以及PRV-GE^-/TK^-的小鼠其产生的抗体滴度均高于商品化疫苗，说明所得的GE基因被修饰的PRV以及GE、TK双基因被修饰的PRV都可以用作研发新的商品化疫苗。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

附：

LB液态培养液的配制：每1升LB培养液含酵母提取物5g、胰化蛋白胨10g、氯化钠10g、NaOH调pH至7.0，121℃、20min高压灭菌。灭菌结束将培养液放置于4℃保存备用。

LB固态培养基的配制：1.每1升LB固态培养基含20g琼脂粉、酵母提取物5g、胰化蛋白胨10g、氯化钠10g、NaOH调pH至7.0，121℃、20min高压灭菌。2.氨苄青霉素(Ampicillin)的配制：由于以上3种质粒都携带有Ampicillin抗性所以配制氨苄青霉素，配制的浓度为100mg/ml，称取1g氨苄青霉素溶解在10ml的去离子水中保存在负20℃待用。3.抗生素的加入：LB固态培养基高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时(手可触摸)加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。抗生素的工作浓度为100μg/ml所以每升培养基加入浓度为100mg/ml的抗生素1ml。4.倒板：一般每5ml倒1个板子，板子直径为6cm。培养基倒入培养皿后盖上盖子让其静置20min左右冷却到室温。5.保存：待培养基冷却至室温后用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。

转化：1.预先准备适量冰块，从负80℃冰箱中取出感受态放置于冰块中解冻。将感受态在超净工作台中分装在1.5ml无菌的离心管中每50μl一管并在管盖上做好标记。2.在超净工作台中在相应的离心管中加入性对应的质粒，每一管感受态中加入100ng的质粒并用移液器吹打混匀，对照组不加入任何质粒。3.混匀后将离心管插入到冰块中冰浴30min。4.冰浴结束后将其取出放置于42℃的水浴锅中热激70S。5.热激结束后再次将离心管插入冰块中冰浴3min。6.在超净工作台中取出离心管在每管中加入不含Ampicillin的LB液态培养液700μl。7.加入培养液后将其置于恒温摇床中培养2h。培养条件为37℃，200rpm/min。8.培养结束后取50μl的菌液进行涂板待菌液干燥后放置在恒温培养箱中培养，培养条件为37℃培养24小时。9.培养24h后取出平板并用75％的酒精消毒后放置于超净工作台中，在无菌的试管中加入含有100μg/ml Ampicillin的LB液态培养液6ml，用无菌镊子夹取无菌的10μl规格的移液器吸头挑取单一菌落，挑取结束后连同吸头一并放置于含有100μg/mlAmpicillin的LB液态培养液的试管中。将试管置于恒温培养箱培养16h，培养条件是37℃，200rpm/min。若对照组平板上出现了菌落则转化失败要重新转化。

菌种保藏：1.配制50％的甘油，取50ml的甘油与50ml的去离子水混匀后121℃、20min高压灭菌，灭菌结束后待其冷却到室温放置于4℃待用。2.用移液器吸取700μl的菌液加入到1.5ml的无菌离心管中，再加入300μl的50％的无菌甘油并吹打混匀。混匀后将其放置于负80℃保存。

质粒提取：用康为世纪的无内毒素质粒小提试剂盒Endo Free Plasmid MiniKit，货号：CW2106S。

DMEM培养液的配制：培养基粉末购于gibco公司，13.5g粉末中加入3.7g碳酸氢钠配制成1L溶液用浓盐酸调节pH为7.3再加入2ml双抗(青霉素的工作浓度为100U/ml,链霉素的工作浓度为0.1mg/ml)，用0.22μm的滤膜过滤过滤结束后加入100ml胎牛血清。

0.25％胰蛋白酶的配制：购于SIGMA公司Trypsin from porcine pancreas。货号：T4799。称取2.5g胰蛋白酶粉末溶解与1L的PBS溶液中调节pH值到7.2，用0.22μm的滤膜过滤过滤4℃保存。

293T细胞及ST细胞的复苏与培养：从液氮中取出细胞，将细胞迅速置于37℃水浴锅中解冻。解冻后以1000rpm离心5min，离心结束后弃冻存液用1ml DMED培养液轻轻吹打细胞使其形成细胞悬液。将细胞悬液吸到培养皿中与培养皿中培养液混匀后放置于细胞培养箱中培养，培养条件是37℃、5％CO2、湿度100％。

293T细胞与ST细胞的传代：待细胞汇合度达到80％以上时进行传代。首先弃去培养液再用2ml胰蛋白酶进行清洗，目的是去除剩余的细胞培养液。清洗后弃去胰蛋白酶再加入1ml胰蛋白酶37℃消化1min。消化结束后弃去胰蛋白酶加入2ml细胞培养液进行吹打，细胞吹打混匀后吸取1ml到新的细胞培养皿中，在每个细胞培养皿中分别加入6ml的细胞培养液并吹打混匀。混匀后放置细胞培养箱中进行培养。

配制25KDa 1μg/μl的PEI溶液：称取10mg的PEI加入到ddH₂O中70℃加热溶解调节pH值到7.2，用0.22μm的滤膜过滤过滤4℃保存。

病毒滴度的测定：待细胞汇合度达到80％时以上时收获细胞，在96孔板中按每孔20000个细胞铺板，共8×12个孔，每孔含90μl培养基；随后加入病毒原液10μl并混匀，用排枪在第一个梯度孔中吸取10μl至下一个稀释梯度，孔以此类推直至第12个孔，最后一个梯度吸取的10μl病毒稀释液弃去。每个稀释梯度设8个复孔。

病毒滴度计算方法观察细胞病变的孔的数目及其所在病毒液浓度，使用Karber法计算病毒滴度。

lgTCID₅₀＝L-d(s-0.5)

L＝最高稀释度的对数

d＝稀释对数之间的差

s＝阳性管比率总和。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的方法

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gccggcgacg atgacctcga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgcccgagcc gatggcgtac 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtgaatagag ttaggcaggg at 22

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccaacttctc ggggactg 18

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaaaggtggt gtttgcataa tt 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcggtggtga tgtagaacg 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcgtagaagc ggttgtgg 18

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgaccaggac gaacagg 17

Claims (9)

1.利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的方法，其特征在于：所述方法包括的步骤如下：

(1)构建用于靶向编辑病毒基因组的特异性载体；

(2)包装慢病毒并利用慢病毒侵染293T细胞与ST细胞，最后通过Puromycin进行筛选获得稳转细胞株；

(3)用病毒侵染稳转细胞株；

(4)纯化出基因组被编辑的病毒。

2.根据权利要求1所述的利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的方法，其特征在于：步骤(1)所述构建用于靶向编辑病毒基因组的特异性载体的方法为：

设计用于起特异性靶向作用的sgRNA并将其连接到经BsmBI酶切后的载体LentiCRISPR V2上，得到Lenti CRISPR V2-sgRNA。

3.根据权利要求1所述的利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的方法，其特征在于：步骤(2)所述包装慢病毒并利用慢病毒侵染293T细胞与ST细胞，最后通过Puromycin进行筛选获得稳转细胞株的具体方法如下：

将靶向编辑病毒基因组的特异性载体与pCMV-VSV-G、pSPAX2质粒共转染到293T细胞进行慢病毒的包装并收获慢病毒，将收获的慢病毒侵染ST细胞与293T细胞，最终通过Puromycin进行筛选获得稳转CRISPR/Cas9系统的细胞株。

4.如权利要求3所述方法获得的稳转细胞株，其特征在于：所述稳转细胞株为稳转CRISPR/Cas9系统的293T细胞株与ST细胞株。

5.根据权利要求1所述的利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的方法，其特征在于：步骤(3)所述用病毒侵染稳转细胞株的具体方法为：

首先将野生型病毒扩大培养并测其滴度，然后加入到培养的稳转细胞株中；待细胞病变达到80％以上时收获病毒并将该次病毒液作为下一次侵染稳转细胞的毒液；每收获一次都进行测序用于判定突变病毒与野生型病毒的比例以及是否需要进行下一次侵染。

6.根据权利要求1所述的利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的方法，其特征在于：步骤(4)所述纯化出基因组被编辑的病毒是采用病毒噬斑法，具体方法如下：

取ST细胞进行铺板待细胞汇合度达到80％以上时加入步骤(3)得到的被修饰过的病毒，加入病毒后继续培养并观察噬斑的形成，挑取噬斑并扩大培养以及测序鉴定。

7.根据权利要求2所述的利用稳转CRISPR/Cas9系统对病毒基因组进行靶向编辑的方法，其特征在于：所述病毒为伪狂犬病病毒PRV；所述特异性靶向作用的sgRNA为用于靶向PRV gE基因的sgRNA和靶向PRV TK基因的sgRNA。

8.由权利要求7所述方法纯化出的基因组被编辑的病毒，其特征在于：所述基因组被编辑的病毒为GE基因被修饰的伪狂犬病病毒PRV-GE^-以及GE、TK双基因被修饰的伪狂犬病病毒PRV-GE^-/TK^-。

9.如权利要求8所述的基因组被编辑的病毒在制备疫苗中的应用。