CN113564165A - 一种胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株及其构建方法和应用，属于动物基因工程技术领域，其中所述sgRNA的核苷酸序列如序列表SEQID NO.1‑2所示。本发明通过对sgRNA进行优选，构建相应载体，将其与包含cas9基因的载体一同转入PK‑15细胞中，经筛选得到了可同时稳定表达cas9基因和如SEQ ID NO.1‑2所示的sgRNA的阳性细胞即cas9‑B2PK15细胞株，经测定该细胞株对伪狂犬病毒的基因具有显著敲除能力，因此可显著耐受伪狂犬病毒感染，这对动物生产过程中抗伪狂犬病毒感染具有重要意义；并且基于该细胞株可制备得到抗伪狂犬病毒感染的细胞或动物模型，在伪狂犬病毒的临床和实验室研究中具有广阔的应用价值。

Description

一种胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株及其构建方法和 应用

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株及其构建方法和应用。

背景技术

抗病毒是医学与生物技术界一个永恒的研究课题，几乎所有的病毒的关键生命活动都只能在细胞(包括细菌、真菌等)内进行，因此，理论上抗病毒的主战场应该在细胞内，但由于细胞膜的特殊性，对病毒有杀灭作用的胞外大分子药物很难突破细胞膜进入细胞内，这些药物(包括机体免疫细胞所产生的抗体)只能守候在带毒细胞外，等病毒从这些被感染细胞中释放出来后才能针对病毒发挥作用，这也是到目前为止几乎所有的抗病毒药物无法在体内实际发挥治疗病毒病作用的主要原因，也是某些寄生于“长命”细胞中而且又不会立即导致细胞死亡的病毒无法用免疫的方法阻止其传播的主要原因。

伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)又称猪疱疹病毒Ⅰ型，传染性延髓麻痹病毒、奇痒症病毒、奥叶兹基氏病病毒。是引起牛、羊、猪、犬和猫等多种家畜和野生动物发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的疱疹病毒。由于本病的临床症状类似狂犬病，故用了“伪狂犬病”这一病名，该病毒是疱疹病毒中抵抗力较强的一种，其对乙醚、氯仿等脂溶剂、福尔马林和紫外线照射等敏感；在pH 4～9之间稳定；对热抵抗力较强，能在多种组织细胞内增殖。其中以兔肾和猪肾细胞(包括原代细胞或传代细胞等)最适于病毒的培养，目前用于防治该疾病的疫苗主要包括灭活疫苗和弱毒疫苗。

2008年，人们发现了CRISPR/Cas系统，该系统是一套细菌对侵入体内的病毒(噬菌体)的免疫机制，其作用机理是：细菌自身的CRISPRs和CRISPR相关基因cas一起组成了CRISPR/Cas免疫系统。当噬菌体侵入细菌体内后，这个免疫系统首先是将外源入侵DNA片段整合到CRISPR位点，紧接着CRISPR转录成为小RNA指引多功能蛋白复合物来识别以及切除外源基因。哺乳动物细胞内可能亦存在类似机制，但目前人们对此知之甚少，在此情况下，给哺乳动物细胞人为安装一套CRISPR/Cas系统，使其能够对侵入细胞内的病毒基因的关键序列进行特异性编辑，使病毒丧失扩增、感染或致病等生命活动能力，则有可能达到胞内抗病毒目的，这对动物生产和抗病将具有十分重大的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株及其构建方法和应用，通过对特异性识别并敲除的sgRNA进行优选，使sgRNA与cas9基因在PK-15细胞株中稳定表达，得到一株对伪狂犬病毒关键基因具有显著敲除能力，进而有效耐受伪狂犬病毒感染的细胞株，基于该细胞株可制备得到抗伪狂犬病毒感染的细胞或动物模型，在动物生产、临床和实验室研究中具有广阔的应用价值。

本发明的目的之一在于提供了一种胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1-2所示。

进一步地，所述关键基因为伪狂犬病毒的UL27基因。

本发明的目的之二在于提供了一种载体，所述载体中包含上述sgRNA。

进一步地，所述载体为AAV-ITR-U6-B2sgRNA。

本发明的目的之三在于提供了上述载体的构建方法，所述方法包括：

步骤1、酶切并回收获得线性化AVV-ITR-U6载体；

步骤2、将如序列表SEQ ID NO.1-2所示的sgRNA引物进行变性退火，形成具有黏性末端的双链sgRNA；

步骤3、将步骤1得到的线性化AVV-ITR-U6载体与步骤2得到的双链sgRNA连接，转化至感受态细胞中，筛选阳性菌后提取质粒，经测序比对后得到载体AAV-ITR-U6-B2sgRNA。

本发明的目的之四在于提供了上述载体在制备胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株中的应用。

本发明的目的之五在于提供了一种胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株，所述细胞株中包括：cas9基因和上述sgRNA。

进一步地，所述细胞株为同时稳定表达cas9基因和上述sgRNA的PK-15细胞株。

本发明的目的之六在于提供了一种胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：

步骤S1、将包含cas9基因的载体转染至PK-15细胞中并筛选阳性细胞，获得稳定表达cas9基因的PK-15-Cas9细胞；

步骤S2、将上述包含如序列表SEQ ID NO.1-2所示的sgRNA的载体转染PK-15-Cas9细胞，筛选阳性细胞并进行单克隆培养，得到同时稳定表达cas9基因和如SEQ ID NO.1-2所示的sgRNA的PK-15细胞株。

进一步地，所述步骤S1中，利用DNA琼脂糖凝胶电泳检测和蛋白质免疫印迹检测的方法，筛选并获得表达cas9基因的PK-15-Cas9阳性细胞。

进一步地，采用如SEQ ID NO.3-4所示的引物对cas9基因进行扩增和琼脂糖凝胶电泳检测。

进一步地，所述步骤S2中，利用荧光显微镜观察转染细胞，筛选并挑取其中呈红色荧光的细胞，即为阳性细胞。

本发明的目的之七在于提供了上述胞内编辑伪狂犬病毒细胞株在制备抗伪狂犬病毒感染细胞或动物模型中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过对sgRNA进行优选，构建相应载体，将其与包含cas9基因的载体一同转入PK-15细胞中，经筛选得到了可同时稳定表达cas9基因和如SEQ ID NO.1-2所示的sgRNA的阳性细胞即cas9-B2PK15细胞株，经测定该细胞株对伪狂犬病毒的关键基因UL27基因具有显著敲除能力，因此可显著耐受伪狂犬病毒感染，这对动物生产过程中抗伪狂犬病毒感染具有重要意义；并且基于该细胞株可制备得到抗伪狂犬病毒感染的细胞或动物模型，在伪狂犬病毒的临床和实验室研究中具有广阔的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中阳性细胞PK-15-Cas9中cas9基因的DNA电泳检测结果图；

图2为本发明实施例1中阳性细胞PK-15-Cas9中CAS9蛋白的Western Blot检测结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1胞内编辑伪狂犬病毒细胞株的构建

1、稳转cas9表达基因的PK-15细胞株构建

(1)PK-15细胞准备：培养约48小时的PK-15细胞，胰蛋白酶消化并充分吹散后，调细胞密度至约-1×10^-5个/ml，排枪均匀接种于96孔板，8小时后开始观察细胞密度，当细胞铺满60％以上的培养孔底面时可用于转染；

(2)转染：转染前将细胞用D-PBS清洗2次，换OPTI-MEM培养基继续培养，按照每10孔细胞250μl的OPTI-MEM溶解2μg PX459-cas9质粒(包含cas9表达基因的PX459质粒)，250μl的OPTI-MEM溶解10μl的linp2000脂质体的比例分别配制质粒溶液和脂质体溶液，2种溶液同时配好后静置5分钟，将2种溶液混合均匀，培养箱中放置25分钟，将细胞从培养箱中拿出，吸干其中的培养基，将上述质粒与脂质体的混匀液分装入细胞孔中，每孔50ml混合液，然后再补加OPTI-MEM培养基50μl/孔，放入培养箱培养6小时，将培养基更换为含10％胎牛血清的DMEM培养基，继续培养12小时。

(3)阳性细胞筛选：将转染后的细胞按1：2的比例传一代，同时设未转染的PK-15细胞对照组，传代培养24小时后将培养基全部更换为含4μg/ml嘌呤霉素的培养基，48小时后更换培养基为含2μg/ml嘌呤霉素的培养基，以后每24小时更换一次培养基，均为含2μg/ml嘌呤霉素的培养基，直至对照组细胞全部死亡，转染组存活下来的细胞可初步定为转染阳性细胞。

(4)阳性细胞单克隆培养与阳性细胞株建立：将经嘌呤霉素筛选后存活下来的转染细胞消化吹散，调细胞密度至5个/ml以下，接种于96孔培养板中，每孔200μl细胞液，培养3天后开始观察每个细胞孔，在有单个细胞克隆生长的细胞孔上打上标签，如细胞克隆数较少，可将有2个以上且界限分明的细胞克隆的细胞孔用胰蛋白酶消化，轻轻滴加1-2滴培养基到孔中然后用拉细的毛细玻璃管分别将不同的克隆移入不同的培养孔中继续培养。当细胞长满孔底1/3时，可原孔传代一次，加快细胞生长。待细胞长满孔底后，1：3比例传代一次。

传代长满后，取其中一孔细胞进行DNA、RNA水平检测cas9基因是否存在，其中用于鉴定cas9基因的引物如表1所示：

表1cas9基因鉴定引物序列信息

另一孔细胞继续培养，直至培养到10个克氏瓶以上，取其中3个用于WB测CAS9蛋白是否存在。只有DNA、RNA和WB三种检测均证明其为CAS9阳性的细胞株才保存下来，其余细胞克隆均可丢弃。

经检测筛选得到了三种检测均呈较强阳性反应的细胞株1株，命名为c10细胞株，其DNA的电泳检测结果图如图1所示，CAS9蛋白的WB检测结果如图2所示，结果显示，cas9基因在PK-15细胞中稳定存在并表达，即成功得到了阳性细胞PK-15-Cas9，可用于后续实验。

2、sgRNA设计及其表达载体构建

(1)sgRNA设计：根据NCBI数据库所公布的prv基因组序列(GenBank:KM189912.1)，选择其中的关键基因，包括：IE180基因、LLT基因、UL27基因等作为敲除对象，共设计了6对sgRNA，共12对sgRNA，其序列信息如表2所示：

表2靶向目标基因的sgRNA引物序列信息

(2)AAV-ITR-U6-sgRNA重组载体构建

1)AAV-ITR-U6母载体线性化

在addgene上查找AAV-ITR-U6载体的酶切位点BbsI进行线性化。酶切体系如下表所示：

配好的体系在37℃孵育1-2h后，用1.5％的琼脂糖凝胶检测酶切产物，吸取产物20μL，以20μL的标准分子量DNA Marker DL 5000作为参照。电泳仪电压设置为220V，电流220mA，电泳结束后，凝胶成像系统观察电泳结果并拍照。

2)胶回收

上述酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，参照Omega胶回收试剂盒说明书进行回收，具体步骤如下：

①20μL的产物加入1.5％的琼脂糖凝胶，待出现目的条带后，紫外灯下快速切下含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖，置于干净的1.5mL离心管中，称量；

②按每100mg琼脂糖加入300-600μL溶胶液的比例加入溶胶；

③置于55℃-65℃热水中水浴7min，使琼脂糖块完全融化，期间每2min颠倒混匀一次促溶；

④胶完全溶解后，将液体转移至吸附柱中，室温12000r/min离心1min；

⑤弃收集管中的废液，向吸附柱中加入300μL溶胶液，室温12000r/min离心1min；

⑥弃收集管中的废液，向吸附柱中加入700μL Wash Buffer清洗，室温12000r/min离心1min；

⑦重复⑥操作；

⑧弃收集管中的废液，12000r/min空转2min以完全甩掉吸附柱中的残液；

⑨将吸附柱置于一新的1.5mL离心管中，向吸附柱的中央位置加入30-50μL的ddH₂O中，室温放置2min，继而12000r/min离心1min，将所得液体重新加入吸附柱12000r/min离心l min，离心管中液体即为所需的产物，置于-20℃保存备用。

3)sgRNA双链形成

分别将上述设计的12对sgRNA的两条单链加ddH₂O稀释到10μmol(用做引物是要稀释至100μmol)。将sgRNA进行变性退火形成具有黏性末端的双链序列。退火体系如下表所示：

反应条件为：37℃30min，95℃10min，缓慢降至4℃10min，沉降系数为0.1℃/s。

4)sgRNA退火产物与AAV-ITR-U6线性化载体连接

将每对sgRNA退火产物分别与线性化载体进行连接，反应体系如下表所示：

将16℃孵育过夜连接的重组质粒转化DH5α感受态细胞，并筛选阳性菌测序，具体操作过程如下：

①转化所用感受态为DH5α感受态细胞，从-80℃冰箱取出分装保存的DH5α感受态，让其在冰上缓慢融化，待感受态融化后，于超净工作台上吸取10μL的连接产物加入50μL的DH5a感受态细胞中，充分混匀，冰浴30min；

②42℃热激90s，置于冰上2min；

③冰浴后在无菌超净台中往上述转化产物的EP管中加入800μL液体LB培养基，37℃，220r/min摇床恒温摇晃45min左右。

④以4000r/min室温离心3min之后倒掉部分上清，用剩余100μL左右的上清重悬管底沉淀，将此混合液均匀地涂于固体LB平板(氨苄抗性)，平板先正放于37℃保温箱30min，再倒置过夜。

⑤在无菌超净台中往提前高压灭菌过的LB培养基，以1:1000的比例往培养基里加入氨苄，再将过夜孵育的平板取出，用枪头挑取平板固体培养基中长出的单克隆菌落，将粘附有单克隆菌落的枪头置于含有氨苄青霉素的400μL LB液体培基的摇菌管中，将摇菌管倾斜放于37℃摇床中扩大培养4-6h。

⑥取培养后的菌液5μL为模板，以U6启动子通用引物上游和sgRNA下游为引物扩增，琼脂糖凝胶电泳检测，确定阳性克隆后送公司测序，利用NCBI网站中的Blast比对测序结果，鉴定序列是否正确。

⑦将序列正确的单克隆扩大培养，取100μL加入到50mL LB液体培养基(含Amp)中扩大培养37℃，220r/min摇晃培养12-16h。

5)质粒抽提与测序

将序列正确的单克隆扩大培养后，使用Omeg公司去内毒质粒小提试剂盒进行质粒提取，具体操作步骤如下：

①收集25mL菌液至50mL离心管中，5000r/min，室温25℃离心10min，弃上清；

②加500μL Solution I/RNase A于沉淀中，涡旋或枪头吹打以混匀，再转移至1.5mL离心管中，做好标记；

③加入500μL 42℃预热的Solution II，轻轻颠倒并旋转7-10次至得到澄清的裂解液，冰上静置3min；(避免剧烈振荡，否则弄断染色体DNA，降低质粒的纯度)；

④加入250μL冰预冷的N3 Buffer，轻轻颠倒混匀直至出现絮状沉淀，12000r/min，4℃离心10min；

⑤吸取上清，转移到新的1.5mL离心管中，加入0.1倍体积的ETR Solution，轻轻颠倒旋转混匀7-10次，冰浴放置10min，孵育过程中间断颠倒离心管数次；

⑥42℃水浴5min，溶液重新变为浑浊，12000r/min，25℃离心3min，ERT Solution分层于离心管底部(注意：如果有ETR溶液悬浮于上清中，则于室温静置5-10min)；

⑦取上清于新的2mL离心管中，加入0.5体积的无水乙醇，轻轻颠倒旋转混匀5-6次，室温孵育2min；

⑨将⑦中的液体转移到已经激活的吸附柱中(加入200μL GPS，12000r/min，25℃离心1min，倒掉滤液)，一次加700μL，10000r/min，25℃离心1min，倒掉滤过液并重新放回收集管；

⑨重复⑧，直至全部吸完；

⑩加入500μL HBC Buffer至柱子中，10000r/min，25℃离心1min，倒掉滤过液并重新放回收集管；

加入700μL DNA Wash buffer至柱子中，10000r/min，25℃离心1min，倒掉滤过液并重新放回收集管；

重复；

空柱子最高转速离心3min，以干燥柱子；

将柱子套在新的1.5mL离心管中，加入80-100μL DNA Endotoxin-Free EutionBuffer至柱子的基质，室温放置2-3min，最高转速离心5min洗脱质粒；

测序：送商业化测序公司测序并与aav母载体以及sgRNA序列进行比对，经测序，其测序结果与设计序列完全一致，即质粒载体构建成功。

3、sgRNA和cas9双组分转基因PK-15细胞株建立：

分别用上述构建成功的12个含不同sgRNA的表达载体转染cas9稳转PK-15细胞株PK-15-Cas9，由于AAV-ITR-U6载体上含有红色荧光蛋白标记基因，因此转染成功的阳性细胞将会在荧光显微镜下呈现红色荧光。

转染24小时后，用自制的拉细的毛细玻璃管在荧光显微镜下挑取有红色荧光的单个细胞进行单克隆培养，培养过程中会有阳性细胞转为阴性，但总有部分细胞始终保持阳性，经反复培养筛选阳性细胞，直至细胞全部为荧光阳性并不再转阴，最终获得cas9和sgRNA双稳转的PK-15细胞株。

4、病毒培养与prv病毒耐受性检测：

根据上述方法共得到了12个cas9和sgRNA双稳转的PK-15细胞株，测定不同gRNA稳转的细胞株对prv耐受能力，具体为：

将各个sgRNA稳转细胞株分别铺96孔板，以PK-15细胞株和稳转cas9的PK-15-cas9细胞作为对照。将新鲜培养的prv病毒作10倍倍比稀释，取10^-3到10^-17共15个稀释度的病毒稀释液对各个细胞株接种培养，每个细胞株每个稀释度接种6孔细胞，选取12h、24h、36h、48h、60h、72h等6个时间点观察每个细胞株的病变死亡细胞孔数，进行差异性分析。测定不同的细胞株被prv致死的临界prv稀释度，结果如表3所示。

表3不同细胞株对prv的耐受程度测定结果

根据表3的结果显示，不同的sgRNA稳转细胞株，其对于prv病毒的耐受程度有所差异，其中仅有稳转B2对应的sgRNA的细胞株，其对prv的耐受浓度极显著高于其他细胞株，同时极显著高于PK15细胞株和PK-15-cas9细胞株，因此将其确定为敲除prv关键基因UL27基因的目标细胞株。

实施例2目标细胞株cas9-B2PK15培养prv效价测定

采用TCID₅₀法测定培养病毒效价，将目标细胞株cas9-B2PK15培养于不同稀释度的prv病毒中，并分别于培养后的36h，48h和72h测定，lgTCID₅₀值的测定结果如表4-6所示。

表4培养后36h的prv病毒效价测定结果

表5培养后48h的prv病毒效价测定结果

表6培养后72h的prv病毒效价测定结果

结果显示，本发明通过对sgRNA进行优选，构建得到的一个目标细胞株cas9-B2PK15，其可实现在胞内对prv病毒的关键基因UL27基因进行敲除，从而显著提高了细胞对于prv病毒的耐受能力，这对动物生产过程中抗伪狂犬病毒感染具有重要意义；并且基于该细胞株及其构建的动物模型，在伪狂犬病毒的临床和实验室研究中具有广阔的应用价值。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 武汉市工程科学技术研究院

武汉市农业科学院

<120> 一种胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株及其构建方法和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caccggtcaa ggtggaccac aacg 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaaccgttgt ggtccacctt gacc 24

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacctgcggc tgatctatct ggc 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tggtggtgct cgtcgtatct ctt 23

Claims (10)

1.一种胞内编辑伪狂犬病毒基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1-2所示。

2.一种载体，其特征在于，所述载体中包含如权利要求1所述的sgRNA。

3.如权利要求2所述的载体的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤1、酶切并回收获得线性化AVV-ITR-U6载体；

步骤2、将如序列表SEQ ID NO.1-2所示的sgRNA引物进行变性退火，形成具有黏性末端的双链sgRNA；

步骤3、将步骤1得到的线性化AVV-ITR-U6载体与步骤2得到的双链sgRNA连接，转化至感受态细胞中，筛选阳性菌后提取质粒，经测序比对后得到载体AAV-ITR-U6-B2sgRNA。

4.如权利要求2所述的载体在制备胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株中的应用。

5.一种胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株，其特征在于，所述细胞株中包括：cas9基因和如权利要求1所述的sgRNA。

6.根据权利要求5所述的细胞株，其特征在于，所述细胞株为同时稳定表达cas9基因和如权利要求1所述的sgRNA的PK-15细胞株。

7.如权利要求5所述的胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

步骤S1、将包含cas9基因的载体转染至PK-15细胞中并筛选阳性细胞，获得稳定表达cas9基因的PK-15-Cas9细胞；

步骤S2、将如权利要求2所述的载体转染PK-15-Cas9细胞，筛选阳性细胞并进行单克隆培养，得到同时稳定表达cas9基因和如SEQ ID NO.1-2所示的sgRNA的PK-15细胞株。

8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S1中，利用DNA琼脂糖凝胶电泳检测和蛋白质免疫印迹检测的方法，筛选并获得表达cas9基因的PK-15-Cas9阳性细胞。

9.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述步骤S2中，利用荧光显微镜观察转染细胞，筛选并挑取其中呈红色荧光的细胞，即为阳性细胞。

10.如权利要求5所述的胞内编辑伪狂犬病毒关键基因的细胞株在制备抗伪狂犬病毒感染细胞或动物模型中的应用。

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