CN114181973A - 一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因及其制备方法 - Google Patents

一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114181973A
CN114181973A CN202111509941.4A CN202111509941A CN114181973A CN 114181973 A CN114181973 A CN 114181973A CN 202111509941 A CN202111509941 A CN 202111509941A CN 114181973 A CN114181973 A CN 114181973A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
sla
cell
tube
culture medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202111509941.4A
Other languages
English (en)
Inventor
高凤山
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dalian University
Original Assignee
Dalian University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dalian University filed Critical Dalian University
Priority to CN202111509941.4A priority Critical patent/CN114181973A/zh
Publication of CN114181973A publication Critical patent/CN114181973A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA‑2基因及其制备方法。我们构建了SLA‑2‑HB01、SLA‑2‑HB01‑Flag和SLA‑2‑HB01‑3×Flag真核表达载体，并经过无内毒素质粒的提取获得纯度较高的目的基因质粒，通过与psPAX2和pMD2.G混合瞬时转染293T细胞获得高滴度的慢病毒颗粒。分别收获SLA‑2‑HB01、SLA‑2‑HB01‑Flag和SLA‑2‑HB01‑3×Flag病毒，分别感染sT2细胞，经过筛选和Western blotting检测，证实成功构建SLA‑2‑HB01/sT2、SLA‑2‑HB01‑Flag/sT2和SLA‑2‑HB01‑3×Flag/sT2细胞系，并均优势表达SLA‑2‑HB01。另外，Western blotting实验也证实PK15细胞、sT2细胞和已转染sT2细胞中β2m蛋白表达量基本一致，说保守的轻链β2m在细胞内表达量稳定；上述数据为后续表位筛选奠定基础。

Description

一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因及其制备方法。
背景技术
MHC是集中于某一染色体，编码与免疫应答直接相关的一类细胞膜糖蛋白基因簇，呈高度多态性，是目前已知最丰富的基因系统。MHC分子在调节和启动机体免疫应答中发挥重要作用，如动物的免疫识别、对疾病的抵抗能力、免疫系统的调节等，很大程度上均依赖于MHC基因，其生物学功能与物种的生存息息相关，是免疫学研究最活跃的领域之一。
猪是用于研究MHC功能的重要动物模型。编码猪MHC的基因，又称为猪白细胞抗原(swine leukocyte antigen,SLA)，而关于SLA基因区域的表达调节研究非常少。SLA位于猪第7号染色体短臂着丝粒两端7p1.1位置，大多数SLA基因组区域分布有三个典型的基因簇：SLA I类，II类和III类，且基因组大小共约2Mb，是迄今为止检测到哺乳动物MHC中最短且是唯一已知的跨着丝粒的MHC。
SLAI类基因簇的长度约1.1Mb，主要包括经典I类基因(Ia)、I类相关基因(Ib)和I类相关诱生性抗性基因(Ic)。已经有超过100个经典的SLAI类等位基因被确定。SLAI包括重链和轻链，其中重链包括SLA-1，SLA-2和SLA-33个功能性基因，具有表达完整的SLA I类基因结构的功能，并具有多态性；而轻链β2m非常保守，在抗原表位存在下，与重链以非共价键结合，维持SLAI的稳定。SLA-1和SLA-3的基因序列具有高度相似性，所编码的前导链均包含21个氨基酸，5′和3′端非翻译区也高度同源。SLA-2基因编码的前导链则由24个氨基酸组成，5′和3′端非翻译区与SLA-1、SLA-3存在区别。已发现SLA-2基因座具有较高的表达水平，这意味着SLA-2分子在免疫过程中发挥主导地位。SLA-2是SLAI类分子的功能基因，能表达完整的SLAI类分子，具有递呈抗原肽的功能。
在构建猪SLA-2真核表达载体时，eGFP可以作为报告基因，因为eGFP可以在宿主细胞内高效表达，且荧光强度也便于在荧光显微镜下观察慢病毒包装及感染宿主细胞的情况。但如果eGFP与MHC I类分子融合表达时，影响目的基因的定位与功能，原因为：1、eGFP太大，影响天然蛋白的构象；2、也可能与定位相关的信号肽刚好在N端或C端，从而影响目的基因的定位；3、也可能目的蛋白过表达，过表达后可能没有递呈肽类的功能。前期研究发现在MHC I蛋白分子的N端均存在一段由21个氨基酸残基组成的信号肽，所以为了避免ER腔面上的信号肽酶将荧光蛋白切除，在真核细胞分泌型蛋白及细胞膜蛋白质的N端一般都有16～26个氨基酸组成的信号肽，可引导蛋白质的跨膜转移或定位。慢病毒真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)为双启动子载体，CMV启动子驱动目的基因的高水平表达，EF1α启动子驱动eGFP报告基因和抗性基因转录为双顺反子，这样避免eGFP与SLA-2融合表达，且表达的外源蛋白结构较贴近天然构象的蛋白，保留信号肽在细胞中的定位功能。
T2细胞是一种TAP缺陷型细胞，细胞表面未结合肽的HLA-A*0201分子表达极不稳定且易被降解，但当外源性抗原多肽与之结合后，HLA-A*0201表达稳定性增强，而且抗原多肽与HLA-A*0201的结合力越强，其表达就越稳定，所以T2细胞表面HLA-A*0201分子表达量的变化可以直观地反映出抗原多肽与HLA-A0201的亲合力大小。
T2细胞可作为APCs有效发挥诱导MHC I类分子递呈结合病毒抗原肽的能力，激活细胞的免疫应答机制。Siegel S等人(2003)通过T2细胞结合实验，验证了计算机预测的肽类中改变锚定氨基酸残基，可以提高HLA与肽结合的亲和力。Barfoed等(2006)利用TAP缺陷的小鼠模型，证明了小鼠H-2Kd限制性来源于FMDV非结构蛋白2C的CTL表位能在小鼠体内引起CTL反应。Yoshikawa等人(2011)利用T2细胞系对HLA-A2限制性磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)肽类进行筛选，GPC3144-152肽鉴定为HLA-A2限制性肽，证明GPC3144-152肽疫苗能够诱导高亲和力CTLs杀死人肝癌细胞表达的GPC3。
利用T2细胞的特性，借助T2细胞肽亲合实验及结合稳定性实验，在细胞水平上进行抗原多肽表位的筛选，达到快速、方便筛选表位的目的。T2细胞系已经广泛用于MHC I类抗原加工和T细胞识别的研究，可对筛选得到的各种候选肽类与HLA-A*0201分子亲合性进行了初步的体外鉴定。目前通过T2细胞系来建立直接筛选相应表位的方法已经相当成熟，但至今没有关于猪SLAI类分子直接递呈CTL表位的报道。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明采用pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)慢病毒载体作为目的基因转移载体，能够使eGFP和SLA-2分别表达。PCR扩增SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag全基因编码序列，将目的基因与慢病毒载体连接，构建SLA-2-HB01-pCDH、SLA-2-HB01-Flag-pCDH和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH三种真核表达载体，在T2细胞和交叉递呈机制的基础上，本发明利用CRISPR/Cas9技术构建TAP基因敲除的sT2细胞系，依赖TAP非依赖性抗原肽类递呈机制，阻断抗原肽在ER上的加工修饰，使抗原肽表位直接与SLAI类分子结合，在细胞水平上筛选计算机预测的CTL表位，为筛选多种猪源病毒CTL表位建立了细胞模型，同时也为外源抗原的交叉递呈机制的研究提供了细胞模型。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤S1：引物设计与合成
根据引物设计原则，参考GeneBank(AB602431.1)上猪SLA-2-HB01全基因序列，采用Vector NTI 11.2和Primer6.0软件相结合设计引物，设计含有相同酶切位点但无标签、Flag标签和3×Flag标签的引物；根据载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro的结构特点，选择的限制性内切酶为：Xba I和Not I，设计的引物序列及酶切位点见表1，由上海生工生物工程有限公司定制合成；
表1引物序列及扩增长度
Figure BDA0003404857760000021
注：下划线斜体表示酶切位点，加粗字体表示Flag和3×Flag序列。
步骤S2：SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag表达载体的构建
(1)PCR扩增基因序列
用SLA-2-HB01-F/SLA-2-HB01-R引物对时，以SLA-2-HB01-pMD 18-T重组质粒为模板扩增SLA-2-HB01编码区序列，PCR产物5'端带有Xba I限制性内切酶位点，3'端带有Not I限制性内切酶位点，PCR反应体系见表2：
表2 SLA-2-HB01 PCR反应体系
Figure BDA0003404857760000031
PCR反应条件：
Figure BDA0003404857760000032
用SLA-2-HB01-Flag-F/SLA-2-HB01-Flag-R引物对时，以SLA-2-HB01-pMD 18-T重组质粒为模板扩增SLA-2-HB01编码区序列，PCR产物5′端带有Xba I限制性内切酶位点，3′端带有Flag标签和NotI限制性内切酶位点，PCR反应体系见表3：
表3 SLA-2-HB01-Flag PCR反应体系
Figure BDA0003404857760000033
PCR反应条件：
Figure BDA0003404857760000034
用SLA-2-HB01-3×Flag-F/SLA-2-HB01-3×Flag-R引物对时，以SLA-2-HB01-pMD18-T重组质粒为模板扩增SLA-2-HB01编码区序列，PCR产物5′端带有Xba I限制性内切酶位点，3′端带有3×Flag标签和Not I限制性内切酶位点，反应体系见表4：
表4 SLA-2-HB01-3×Flag PCR反应体系
Figure BDA0003404857760000041
PCR反应条件：
Figure BDA0003404857760000042
(2)PCR扩增产物检测
①制备1％的琼脂糖凝胶，按1:10000体积比加入核酸染料；
②PCR产物与10×loading buffer按照9:1体积比例混合；
③第一个胶孔中加入3μL DL 2000DNA marker，然后依次加入5μL SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag PCR混合产物，100V，50mA电泳30min；
④将凝胶小心放置于凝胶成像仪中，在波长为254nm长波下观察，DNA存在的地方有肉眼可辨的橘红色荧光条带，观察电泳结果并拍照；
(3)DNA产物回收与纯化
按照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒说明书分别对SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag PCR扩增产物进行胶回收与纯化，方法如下：
①配制大孔1.0％琼脂糖凝胶，分别在三个50μLPCR产物管中加入5μL 10×loading buffer混匀；将混匀PCR产物全部依次加入胶孔中，100V，电泳30min；
②用75％酒精擦洗三个刀片，并放置在超净工作台中紫外照射，用于切目的条带时防止DNA污染及其他杂质，并准备3个1.5mLEP管进行称重，并标记；
③在凝胶成像系统的紫外灯下，用刀片从琼脂糖凝胶中分别切下含有目的片段的凝胶，切割尽量快，胶尽量薄且小，按照标记分别放入事先准备的EP管中，再次称量并计算胶条的重量，操作过程带手套；
④加入3倍胶块重量的B2 buffer，放入60℃水浴锅中水浴3-5min至胶块完全溶解，应轻微颠倒混匀；
⑤将胶块溶液转入2mL收集管的SanPrep吸附柱中，室温静置2min,8000rpm室温离心1min，取出SanPrep吸附柱并倒掉收集管中的液体；
⑥将SanPrep吸附柱重新装回收集管，加入500μL已加入无水乙醇Wash Solution，12000rpm室温离心1min，倒掉废液；
⑦重复步骤⑥一次；
⑧倒掉废液后将SanPrep吸附柱放回收集管，12000rpm室温离心1min，打开SanPrep吸附柱的盖子，室温放置10min或50℃烘箱中放置5min，以彻底除去WashSolution；
⑨将SanPrep吸附柱重新放置于一个新的1.5mLEP管中，向吸附柱膜中央加入30μL无菌水，50℃烘箱中放置2min，12000rpm室温离心1min，1.5ml EP管中液体即为包含目的DNA片段的溶液；
⑩1％琼脂糖凝胶电泳检测是否回收成功，测定核酸浓度后-20℃保存备用；
步骤S3：猪SLA-2真核表达载体的构建与鉴定
(1)PCR产物与pMD 19-T simple载体的连接
SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag胶回收后，核酸浓度分别为22.9ng/μL，17.6ng/μL和23.4ng/μL，分别与pMD 19-T simple载体进行连接，反应体系如下：
表5 PCR产物与pMD 19-T simple连接反应体系
Figure BDA0003404857760000051
16℃水浴反应2h。
(2)质粒转化
将构建好的重组SLA-2-HB01-pMD 19-T、SLA-2-HB01-Flag-pMD 19-T和SLA-2-HB01-3×Flag-pMD 19-T质粒分别转化到TOP10感受态中，方法如下：
①从-80℃冰箱中快速取出100μL TOP 10感受态细胞，用手瞬时溶解(或室温解冻)，立即放在冰上2min；
②将连接产物全部缓慢加入到TOP 10感受态细胞中，用移液器轻轻吹吸混匀，不能产生气泡，冰上孵育30min；
③42℃准确热击90s，此期间不要晃动，立即放置冰上2min。为了提高转化效率，可重复此操作1-2次；
④向管中加入900μL无抗性LB液体培养基，轻轻吹吸混匀，不要产生气泡，37℃180rpm振荡培养60min，使菌体恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗性基因；
⑤将培养后的感受态细胞3000rpm离心1min，超净工作台中用枪吸出一部分上清液弃掉，剩余的上清重悬菌体，取100μL菌悬液用无菌涂布棒均匀涂布于Amp+LB筛选平板上，37℃正面放置15-30min，待菌液被培养基完全吸收后倒置培养皿，37℃培养12-16h；
⑥剩余的转化物可放置在4℃用于以后涂板，一周之内均可；
(3)菌落PCR鉴定
分别用10μL枪头挑取SLA-2-HB01-pMD 19-T、SLA-2-HB01-Flag-pMD 19-T和SLA-2-HB01-3×Flag-pMD 19-T Amp+LB平板上的单克隆菌落放置于5mL LB(Amp+)液体培养基中,每个平板挑取6个单菌落，标记后将试管放置摇床中37℃ 180r/min，培养过夜，取适量菌液进行PCR鉴定，PCR反应体系及反应条件分别与步骤S2(1)中条件一致；
(4)小量双酶切检测目的基因
表6目的基因检测酶切体系
Figure BDA0003404857760000061
37℃水浴反应30min，1％琼脂糖凝胶电泳检测；
取1mL阳性克隆菌液送至上海生工测序，将序列正确的阳性重组质粒和甘油菌液均保存于-80℃，用于后续实验；
(5)质粒小量提取
将测序验证的SLA-2-HB01-pMD 19-T、SLA-2-HB01-Flag-pMD 19-T和SLA-2-HB01-3×Flag-pMD 19-T重组克隆质粒的过夜培养菌液按照SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒的方法分别进行质粒提取，方法如下：
①吸取1.5mL过夜培养菌液，8000rpm离心3min收集菌体，弃尽LB培养基；
②向菌体沉淀中加入250μL BufferP1，用移液器彻底悬浮菌体沉淀；
③向悬浮菌体中加入250μL Buffer P2，快速温和颠倒离心管10次，使菌体充分裂解形成清亮粘稠溶液，室温静置2min；
④向离心管中加入350μL Buffer P3，快速温和颠倒混匀10次，此时溶液中出现白色絮状物，12000rpm离心10min，将上清液转入SanPrep柱式吸附柱中，8000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体；
⑤向吸附柱中加入500μL Buffer DW1，9000rpm离心1min，弃掉收集管中的液体；
⑥向吸附柱中加入500μL wash solution缓冲液，10000rpm离心1min，弃掉收集管中的液体；
⑦重复⑥步骤一次；
⑧空SanPrep柱式吸附柱1000rpm离心1min；
⑨将SanPrep柱式吸附柱重新放置于一个新的1.5mL EP管中，向吸附柱膜中央加入30μL无菌水，50℃烘箱中放置2min，12000rpm室温离心1min，然后再加入20μL无菌水，50℃烘箱中放置2min,12000rpm室温离心1min，测定核酸浓度后-20℃保存备用；
(6)目的片段与pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)限制性内切酶反应
将提取的SLA-2-HB01-pMD 19-T、SLA-2-HB01-Flag-pMD 19-T和SLA-2-HB01-3×Flag-pMD 19-T重组质粒以及真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)分别通过Xba I和NotI限制性快速内切酶进行双酶切鉴定，反应体系见表7：
表7重组质粒及pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)酶切反应体系
Figure BDA0003404857760000071
37℃水浴30min，1％琼脂糖凝胶电泳检测，按照步骤S1(3)中的方法分别切下相对应的目的基因片段，并进行酶切产物胶回收；
(7)目的基因与载体连接
经过Xba I和Not I双酶切后胶回收的线性目的基因SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag的浓度分别为17ng/μL、16.9ng/μL和8.8ng/μL，真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)经Xba I、Not I双酶切胶回收的浓度为14.2ng/μL，在此基础上，根据T4 DNA连接酶的反应条件如下：
表8 SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag连接反应体系
Figure BDA0003404857760000072
16℃水浴5h。
表9 SLA-2-HB01-3×Flag连接反应体系
Figure BDA0003404857760000073
16℃水浴5h。
(8)连接产物转化Stbl3感受态细胞
将SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag与真核表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)的连接产物分别转化到Stbl3感受态细胞中，方法如下：
①从-80℃冰箱中快速取出100μL Stbl3感受态细胞，用手瞬时溶解(或室温解冻)，立即放在冰上2min；
②将连接产物全部缓慢加入到Stbl3感受态细胞中，用移液器轻轻吹吸混匀，不能产生气泡，冰上孵育30min；
③42℃准确热击90s，此期间不要晃动，立即放置冰上2min。为了提高转化效率，可重复此操作1-2次；
④向管中加入900μL不加Amp的LB液体培养基，轻轻吹吸混匀，不要产生气泡，37℃200rpm振荡培养45min，使菌体恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗性基因；
⑤将培养后的感受态细胞3000rpm离心1min，超净工作台中用枪吸出一部分上清液弃掉，剩余的上清重悬菌体，取100μL菌悬液用无菌涂布棒均匀涂布于Amp+LB筛选平板上，37℃正面放置15-30min，待菌液被培养基完全吸收后倒置培养皿，37℃培养12-16h；
⑥剩余的转化物可放置在4℃用于以后涂板，一周之内均可；
(9)重组真核表达载体鉴定
分别用10μL枪头挑取SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag重组质粒Amp/LB平板上的单克隆菌落放置于5mL LB(Amp+)液体培养基中,每个平板挑取8个单菌落，标记后将试管放置摇床中37℃，180r/min，培养过夜，取适量菌液进行PCR鉴定，PCR反应体系及反应条件分别与步骤S2(1)中条件一致，取菌落PCR后的菌液进行小量双酶切鉴定，反应条件与步骤S7(4)中条件一致，取1mL阳性克隆菌液送至上海生工测序。将序列正确的阳性重组质粒同甘油菌液保存于-80℃。
步骤S4：无内毒素质粒大量提取
(1)从-80℃冰箱中取出保存的空载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)菌种和构建的荷包猪真核表达载体SLA-2-HB01-pCDH、SLA-2-HB01-Flag-pCDH、SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH的菌种以及慢病毒包装时所需的psPAX2、pMD2.G两个辅助质粒的菌种，分别用接种环“#”字划线法到Amp+抗性的LB固体培养基中，37℃正面放置15-30min，待菌液被培养基完全吸收后倒置培养皿，37℃培养12-16h；待长出单菌落后，分别用10μL的枪头挑取单菌落接种到5mL Amp+LB液体培养基中，标记后放置于摇床中，37℃200rpm震荡培养8h；
(2)按照10％的比例将预先培养好的6种菌液分别再次接种到50mL Amp+LB液体培养基中,标记后放置于摇床中，37℃ 200rpm震荡培养16-18h；
(3)提取质粒之前，首先进行柱平衡：将CP4吸附柱放入2mL收集管中，加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min弃掉收集管中废液，吸附柱重新装回；
(4)取15mL过夜培养的菌液放入15mL离心管中，12000rpm 1min离心后，将菌体沉淀转移到1.5mL EP管中，尽量去除上清液；
(5)取500μL含RNaseA的溶液P1加入菌体沉淀中，用枪吹打彻底使菌体悬浮；
(6)加入500μL溶液P2，快速温和颠倒离心管8次，使菌体充分裂解形成清亮粘稠溶液，此过程不能超过5min；
(7)缓慢加入500μL溶液P4，立即缓慢温和颠倒离心管8次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀，室温静置10min，12000rpm离心10min，若上清中还有沉淀，可再次离心；
(8)过滤柱CS放置在新的收集管中，加入上清液于柱中，12000rpm离心3min，将收集管中的过滤液收集；
(9)滤液中加入0.3倍体积的异丙醇，上下混匀颠倒后，转移到先前已平衡的吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的液体；
(10)吸附柱CP4中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的液体；
(11)吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW，加入无水乙醇，室温静置5min后12000rpm离心1min，弃掉收集管中的液体，此步骤重复两次；
(12)将吸附柱CP4放入空收集管中，12000rpm离心2min，目的是除去吸附柱中残留的漂洗液；
(13)将吸附柱CP4重新放置在一个灭菌1.5mL EP管中，向吸附膜中间加入60μL去离子水，50℃烘箱中放置2min，12000rpm离心2min将质粒收集到EP管中，取1μL进行浓度测量后，分装保存于-20℃，测定浓度结果如下表10：
表10无内毒素法提取质粒浓度
Figure BDA0003404857760000091
从A260/A280值可以看出所有质粒浓度要求范围内，无蛋白质污染，证明所提取的质粒可以进行后续的慢病毒包装细胞实验。
步骤S5：293T细胞培养
(1)293T细胞的复苏：
①提前打开细胞间水浴锅加热到37℃，打开超净工作台灭菌，并把枪头、试管架、移液器、培养瓶等一并灭菌；
②在超净工作台中配置好含有10％FBS DMEM培养基，取9mL完全培养基放入15mL无菌离心管中；
③从液氮罐中取出293T细胞冻存管，立即放入37℃水浴锅里快速晃动解冻；
④用酒精棉球擦拭冻存管进行消毒，放置于超净工作台中，用枪吹吸管底使沉淀的细胞悬浮，然后转移到存有9mL完全培养基的离心管中，可以反复吹打几次以彻底去除DMSO，1000rpm离心5min；
⑤取1mL完全培养基重悬细胞，然后转移到25cm2细胞培养瓶中，添加3mL完全培养基并轻轻摇匀，然后放置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(2)293T细胞传代：
①提前打开细胞间37℃水浴锅，对完全培养基和1×PBS进行预热，打开超净工作台灭菌，并把枪头、试管架、移液器、培养瓶等一并灭菌；
②选择生长状态良好且细胞密度为80％培养瓶中的细胞进行消化传代处理；
③弃掉原培养基，缓慢加入3-4mL 1×PBS洗两遍除去瓶中残留的培养基，因293T细胞易漂浮，贴壁性弱，所以此操作过程应小心缓慢；
④取500μL 0.1％胰酶滴加到培养瓶中，让蛋白酶均匀铺满整个细胞容器，37℃消化30s，倒置显微镜下可观察到细胞变圆且透亮，大部分漂浮起来时加入3mL完全培养基终止消化，因培养基中有10％血清能使蛋白酶失活；
⑤反复吹打细胞贴壁的一侧，使细胞彻底从容器中脱落且分散为单个细胞，放入5mL灭菌离心管中，1000rpm离心5min；
⑥取1mL完全培养基重悬细胞，取100μL细胞悬液放入25cm2细胞培养瓶中，添加3mL完全培养基并轻轻摇匀，然后放置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(3)293T细胞的冻存：
①提前打开细胞间水浴锅加热到37℃，对完全培养基和1×PBS进行预热，打开超净工作台灭菌，并把枪头、试管架、移液器、培养瓶等一并灭菌；
②选择生长状态良好且细胞密度为90％培养瓶中的细胞进行冻存；
③弃掉原培养基，缓慢加入3-4mL 1×PBS洗两遍除去瓶中残留的培养基，因293T细胞易漂浮，贴壁性弱，所以此操作过程应小心缓慢；
④取500μL 0.1％胰酶滴加到培养瓶中，让蛋白酶均匀铺满整个细胞容器，37℃消化30s，倒置显微镜下可观察到细胞变圆且透亮，大部分漂浮起来时加入3mL完全培养基终止消化，因培养基中有10％血清能使蛋白酶失活；
⑤反复吹打细胞贴壁的一侧，使细胞彻底从容器中脱落且分散为单个细胞，放入5mL灭菌离心管中，1000rpm离心5min；
⑥取1mL无血清细胞冻存液进行细胞重悬，然后放入细胞冻存管中，进行名称、时间标记后立即放入-80℃，24h后可放置于液氮罐中进行长期保存。
步骤S6：慢病毒包装
(1)将生长状态较好的293T细胞进行传代，接种1.5×106个细胞于60mm细胞培养皿中(培养基中不含抗生素)，培养12-18h后使细胞密度达到80％左右，共接种4板细胞(每种病毒用一个培养皿)；
(2)转染开始，用枪吸出每个皿中的培养液，用1×PBS洗一遍，此过程要快且轻缓，避免293T细胞漂浮；
(3)吸出PBS，每个皿中加入3mL Opti-MEM I培养基，放置于37℃CO2培养箱中培养，使细胞处于饥饿状态达到较高的转染率；
(4)准备转染样品，将各种质粒与Opti-MEM I培养基按照下面比例(目的质粒：pMD2.G：psPAX2＝4:3:2)加入到1.5mL EP管中，轻轻混匀，室温静置5min：
Figure BDA0003404857760000101
Figure BDA0003404857760000111
Figure BDA0003404857760000112
Figure BDA0003404857760000113
(5)提前取出转染试剂Lipofectamine 2000使其恢复室温，取出64μL转染试剂稀释于2mLOpti-MEM I培养基中，室温静置5min；
(6)静置5min后，分别取500μL Lipofectamine 2000稀释液轻轻滴加到混合DNA中，Lipofectamine 2000稀释液和混合DNA稀释液共1mL轻轻混匀然后室温静置20min，溶液看上去可能有些浑浊；
(7)将混合液体分别逐滴加入相应的60mm细胞培养皿中，轻轻前后晃动细胞皿与皿中Opti-MEM I培养基混匀，37℃CO2培养箱中培养6h；
(8)6h后去除含有转染试剂的培养基，更换4mL新鲜的完全培养基；
(9)转染24h后，取出293T细胞，倒置荧光显微镜下观察转染结果并拍照；
(10)转染48h和72h后，分别在倒置荧光显微镜下观察转染结果并拍照，并收集病毒上清；
(11)将收集到的病毒上清在4℃条件下，5000rpm离心15min以除去细胞及细胞碎片，用10mL注射器吸取上清，用0.22μm PVDF滤膜过滤至新的EP管中，分装标记后于-80℃保存。
步骤S7：慢病毒感染sT2细胞及筛选
(1)sT2细胞的复苏
从液氮罐中取出sT2细胞，复苏方法与步骤S2：293T细胞培养(1)中293T复苏方法一样。
(2)sT2细胞消化、传代
①提前打开细胞间37℃水浴锅，对完全培养基和1×PBS进行预热，打开超净工作台灭菌，并把枪头、试管架、移液器、培养瓶等一并灭菌；
②选择生长状态良好且细胞密度为80％培养瓶中的细胞进行消化处理；
③弃掉原培养液，加入3mL 1×PBS洗两遍除去瓶中残留的培养基；
④取1mL 0.1％胰酶滴加到培养瓶中，让蛋白酶均匀铺满整个细胞容器，37℃消化3min，倒置显微镜下可观察到细胞变圆且透亮，大部分漂浮起来时加入3mL完全培养基终止消化，因培养基中有10％血清能使蛋白酶失活；
⑤反复吹打细胞贴壁的一侧，使细胞彻底从容器中脱落且分散为单个细胞，放入5mL灭菌离心管中，1000rpm离心5min；
⑥取1mL完全培养基重悬细胞，取100μL细胞悬液放入25cm2细胞培养瓶中，添加3mL完全培养基并轻轻摇匀，然后放置于37℃，5％CO2培养箱中培养。
(3)sT2细胞准备
将状态良好的sT2细胞接种到6孔板中，每孔1×104，37℃，5％CO2培养箱中培养12-14h，保证第二天进行病毒感染时细胞密度达到30～50％。
(4)病毒感染
①感染前，从-80℃冰箱中取出pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)、SLA-2-HB01-pCDH、SLA-2-HB01-Flag-pCDH和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH四种慢病毒上清，在冰上缓慢融化；
②将6孔板中原培养液弃掉，用1×PBS洗2遍去除细胞碎片，给每孔中分别加入1.5mL病毒上清及500μL DMEM完全培养基，并加入6μg/mL polybrene充分混匀以促进病毒感染sT2细胞，37℃，5％CO2培养箱中培养；
③病毒感染24h后，弃掉含病毒的培养基，换上新鲜的完全培养基，继续37℃，5％CO2培养箱中培养；
④换新鲜培养基6-8h后，加入终浓度为1.5μg/mL嘌呤霉素抗生素筛选，待抗性细胞长满后收获一半细胞进行验证，另一半利用有限稀释法稀释挑取单克隆细胞继续培养，最终获得感染的单克隆细胞系，冻存保种已感染的sT2细胞系。
步骤S8：Western blotting检测目的基因质粒表达
(1)全蛋白提取
从液氮罐中取出sT2细胞和已转染SLA-2-HB01-pCDH、SLA-2-HB01-Flag-pCDH和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH的sT2细胞，复苏方法与步骤S2：293T细胞培养(1)中293T复苏方法一样，复苏成功后传代两次。细胞生长状态稳定后，收集各种细胞于灭菌EP管中，利用1×PBS洗两遍后，加入配制好的蛋白裂解液，根据细胞量加入裂解液100-500μL，用枪吹打5-8次后，放在冰上并用摇床摇晃15min，中间弹动2次，使细胞充分裂解。裂解完毕后，利用4℃离心机，12000rpm，离心10min，使细胞碎片等全部沉到离心管底部。将上清吸入到新的离心管中。
(2)蛋白浓度的测定：将全蛋白进行10倍稀释后，利用BCA法进行测定。
①在六孔板底部加入25μL不同浓度的标准蛋白，0、25、125、250、500、750、1000、1500μg/mL，同样将稀释好的蛋白每孔25μL加入到六孔板底部，每个样品做三个复孔；计算好反应液的体积，并配制好预混液；
②在每孔中加入200μL预混好的工作液，注意最好不要产生气泡，将孔板放到37℃培养箱中反应20min，利用分光光度计进行测定；
③以标准蛋白浓度为纵坐标，吸光度值为纵坐标，利用标准蛋白浓度计算所测细胞蛋白浓度，得到相应浓度后乘以稀释倍数，得到原液浓度；
④将蛋白进行分装保存，防止反复冻融。
(3)蛋白免疫印迹：
①制备分离胶，选取孔胶厚为1mm的玻璃板，清洗干净固定后，用去离子水检漏7min，将水倒出，用吸水纸将玻璃板内的水吸干净。制取所需浓度的分离胶5mL，混匀后用移液枪沿一侧缓缓加入，防止气泡，从另一侧缓缓加水压平，静止30min；
②配制蛋白样品，取出裂解好的细胞蛋白液样品，用1×PBS进行稀释，并加入适当5×5×SDS-PAGE Loading Buffer；将样品在100℃，加热5min使蛋白变性，变性后低速离心，使离心管壁的蒸汽等落入管底，减少体系差异。离心后，将样品放置在冰上；
③制备浓缩胶，提前准备好梳子，将分离胶上的水轻轻倒出，用吸水纸吸干，制备5％的浓缩胶2mL，混匀后用移液枪加入，缓缓插入梳子，不要产生气泡，计时30min。待浓缩胶凝结好后，将夹胶的夹子取出放入电泳槽中，在两块玻璃板中加满电泳液，用力均匀缓缓的将梳子拔出。将剩余电泳缓冲液加入电泳槽中，用吸管吹走气泡；
④上样，测完蛋白含量后，计算含10μL蛋白质量的溶液体积即为上样量。将准备好的样品轻弹混匀，用移液枪吸取10μL，缓缓加入到上样孔中；
⑤电泳，将电压调到100V，即电流大约在稳定后为30mA，根据不同的仪器，一般会调到不同的电压，但尽量保持足够小的电流，电泳1.5-2h；
⑥切胶，转膜活化。切胶时要注意标记，并量取胶块的大小，将胶块和滤纸浸泡在转膜缓冲液中；根据胶块大小剪取PVDF膜，也进行标记，在甲醇中活化2min，后也浸泡在转膜缓冲液中30min；
⑦转膜，用滴管吸取适量转膜缓冲液滴加在半干转膜仪底部，先铺三层滤纸，将胶块放好，将PVDF膜放在胶块上，再盖上三层滤纸，铺好后用试管赶一下气泡，盖好，调电压为300V，稳定后为3-6V，尽量保持电压足够小，计时30-60min。转完后，将PVDF膜继续进行下面的操作；
⑧封闭，用TBS冲洗1min，利用5％BSA封闭液，室温封闭1h；
⑨染一抗，用TBST稀释抗体，稀释倍数实验所需，在室温下摇晃0.5h后放到4℃中过夜孵育；染二抗，洗膜，用TBST清洗5次，6min/次，洗完后加入稀释的抗小鼠IgG二抗，室温摇晃1h；
⑩显影，洗膜，用TBST清洗5次，6min/次，显影液A和B各200μL，显影前混匀放在暗处，用滤纸将PVDF膜上的液体轻轻吸掉，利用提前做好的标记，确定好蛋白面多的那一面朝上，用移液枪吸取混匀的显影液将其打在膜上，利用仪器进行相应的设定，进行显影。
一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因，按步骤S1-S8所述方法制备。
本发明与现有技术相比的有益效果是：
(1)关于克隆载体的选择
PCR产物进行双酶切后可直接与慢病毒真核表达载体连接，但连接效率往往不高。为增强连接效率，本申请先将PCR扩增产物连接至高效克隆载体pMDTM19-T simple Vector上，以获得高拷贝量的目的基因。pMDTM19-T simple Vector又称TA克隆载体，该载体是在pUC19载体的基础上改建而成的，在pUC19载体的多克隆酶切位点处添加了EcoR V酶切位点，使用EcoR V进行酶切反应后，在两侧的3′端添加“T”；因实验中使用的大多数DNA聚合酶有在PCR产物3′末端添加一个“A”的特性，所以使用该载体可以大大提高PCR产物连接、克隆的效率。由于载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后PCR产物无法使用pMDTM19-T simpleVector上酶切位点酶切，所以需要在设计PCR扩增的引物上添加限制性酶切位点。因此，本申请在设计上游引物时添加了Xba I酶切位点，下游引物添加Not I酶切位点，可以提高酶切效率，增加亚克隆成功率。PCR产物经凝胶电泳回收后连接至pMD-19T simple克隆载体上，要保证目的基因的摩尔量是载体摩尔量的3-5倍，以最大限度降低出现载体自连造成的假阳性结果的概率。
(2)关于SLA-2-HB01基因C-末端添加Flag标签的设计
外源的SLA-2基因转染细胞系，需要证实该基因是否在细胞系表达。在检测手段上，一方面可以利用载体上表达的GFP判定，另外可以利用SLA-2分子的抗体，但二者都有不足。前者不能排除空载体在细胞中的表达，后者不能排除细胞系本身表达的少量SLA I分子。为了进一步丰富检测手段，本申请选择将Flag标签添加在SLA-2-HB01分子C-末端，构建真核表达载体。由于Flag具有商品化的单抗，这样可以很方便地通过检测Flag的表达情况而间接判定转染的外源SLA-2基因是否在细胞系表达，这样就丰富了检测细胞系表达外源基因的手段。另外，为了探究Flag标签是否对细胞系表达的外源SLA-2抗原递呈功能干扰，在多大程度上产生干扰，本发明分别设计了1×Flag和3×Flag标签，有利于在后续的多肽表位递呈实验中进行判定，为今后调整外源基因真核表达载体的设计提供资料。在前期研究中，已经有MHC I类分子重链C-末端添加Flag标签的报道。Hickman等人(2000)通过Edman测序和质谱测序两者结合的研究数据表明肽类分别与无标签、6-His标签和Flag标签的HLAI类分子结合没有显著差异，表明某特定重链分子末端添加一个Flag标签不影响HLAI类分子递呈抗原多肽的功能。但该发现是否适用于其他MHC I类分子，如SLA-2功能基因，需要进行进一步的研究。另外，将SLA-2转染细胞系进行表达，产生的表达蛋白在细胞内经过了加工和修饰，产生的蛋白必然具有较好的活性。今后，如果从转染细胞中大量提取SLA-2蛋白，那么其C-末端添加Flag标签，有利于对蛋白进行纯化。
(3)猪SLA-2真核表达载体的构建
本发明选用较为常用的慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)，以人类免疫缺陷病毒HIV为基础发展起来的基因治疗载体，属于逆转录病毒retrovirus的一种，它对分裂期细胞和非分裂期细胞均有感染能力，可将外源基因有效地整合到宿主细胞染色体上并随细胞基因组的分裂而分裂，从而持久稳定表达。该慢病毒载体为“自杀”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染其他细胞，也不会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。
本发明选择的载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)为双启动子载体，CMV启动子驱动目的基因的高水平表达，EF1α启动子驱动eGFP报告基因和抗性基因转录为双顺反子，这样避免eGFP与SLA-2融合表达，且表达的外源蛋白结构较贴近天然构象的蛋白，保留信号肽在细胞中的定位功能。两者之间含有一段T2A肽，能够在翻译后水平上自我剪切，保证目的基因与抗性基因翻译水平相同。此外，该载体还携带嘌呤霉素抗性，有助于表达载体在宿主细胞中筛选。
(4)重组慢病毒颗粒包装
为突破依赖于质粒载体转染的局限，本发明采用慢病毒载体来表达SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag基因，大大扩展了SLA-2-HB01表达的细胞类型，克服了转染效率低的障碍。在重组慢病毒构建过程中，病毒颗粒包装是非常重要的过程。本发明使用第二代包装系统，该系统能兼容第三代Transfer质粒，反之则不可以，该系统的病毒颗粒产量不会受到体外感染的影响。病毒滴度是影响HIV-1载体感染目的细胞效率的一个重要因素，制备高滴度载体与包装细胞状态密切相关。目前293T细胞是已经被广泛使用的包装细胞以制备慢病毒载体。影响病毒颗粒的另一重要因素为转染方法，本研究采用快速、操作简单的脂质体转染法，成本较低且转化效率可以达到70％以上。脂质体转染法转染细胞时，处于生长期的细胞及合适的密度对提高病毒滴度也非常重要，本研究在转染前24h内进行293T细胞传代，调整细胞密度以获得更好的转染效率及更高滴度的慢病毒颗粒。本发明中，我们成功构建SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag真核表达载体，并经过无内毒素质粒的提取获得纯度较高的目的基因质粒，通过与psPAX2和pMD2.G混合瞬时转染293T细胞获得高滴度的慢病毒颗粒。
(5)Western blotting的检测
Western blotting结果表明，SLA-2-HB01、Flag和3×Flag均有效表达，说明包装产生的重组慢病毒SLA-2-HB01-pCDH、SLA-2-HB01-Flag-pCDH和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH转染细胞后能稳定表达SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag蛋白。也进一步验证了MHC I类分子C-末端标签的添加，不会影响SLA I类分子的表达，同时也表明SLA-2-HB01-Flag、SLA-2-HB01-3×Flag与抗Flag单克隆抗体可有效特异性结合。SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag与实验室制备的SLA-2-HB01单克隆抗体相结合，说明表达的SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag蛋白具有良好的特异性和反应原性。与正常PK15细胞相比，sT2细胞中的SLA-2-HB01蛋白表达量显著下降，可能由于sT2细胞内缺乏TAP基因，内源性抗原肽不能与细胞内SLA I类分子有效结合，使SLA I类分子的结构不稳定易发生解离。而在SLA-2-HB01-pCDH、SLA-2-HB01-Flag-pCDH和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH转染细胞中SLA-2-HB01蛋白可以大量表达，而sT2细胞中的蛋白条带可能是细胞中其他与SLA-2同源性较高的SLA I类分子，此检测结果说明转染细胞系在后续表位筛选的功能检测实验中，预测的表位是与SLA-2-HB01分子特异性结合，而不是其他SLA I类分子。PK15细胞、sT2细胞和已转染sT2细胞中β2m与实验室制备的猪β2m单克隆抗体可有效结合，且蛋白表达量基本一致，说明转染SLA I类分子在无任何刺激时，细胞内β2m表达量没有变化，此数据为后续表位筛选奠定基础。
附图说明
图1为pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)质粒图谱；
图2为SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag构建结果图，其中，A，SLA-2-HB01添加Flag及3×Flag标签结构示意图；B，猪SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag PCR扩增产物；M：DL 2000DNA marker；1：SLA-2-HB01 PCR产物；2：SLA-2-HBO1-Flag PCR产物；3：SLA-2-HB01-3×Flag PCR产物；
图3为重组克隆菌的菌落PCR鉴定结果图，其中，A，SLA-2-HB01-pMD 19-T菌落PCR鉴定结果，1-6号代表6个克隆，其中4号、5号菌进行测序；B，SLA-2-HB01-Flag-pMD 19-T菌落PCR鉴定结果，1-6号代表6个克隆，其中5号、6号菌进行测序；图C SLA-2-HB01-3×Flag-pMD 19-T菌落PCR鉴定结果，1-6号代表6个克隆，1号菌进行测序；M：DL 2000DNA marker；
图4为重组克隆质粒限制性双酶切鉴定结果图，其中，1：Xba I和Not I限制性双酶切鉴定SLA-2-HB01插入片段，大小为1095bp(去掉酶切位点)；2：Xba I和Not I限制性双酶切鉴定SLA-2-HB01-Flag插入片段，大小为1119bp(去掉酶切位点)；3：Xba I和Not I限制性双酶切鉴定SLA-2-HB01-3×Flag插入片段，大小为1161bp(去掉酶切位点)；M：DL 2000DNAmarker；
图5为重组克隆质粒双酶切胶回收结果图，其中，A，SLA-2-HB01-pMD 19-T重组克隆质粒限制性双酶切胶回收结果图；B，SLA-2-HB01-Flag-pMD 19-T重组克隆质粒限制性双酶切胶回收结果图；C，SLA-2-HB01-3×Flag-pMD 19-T重组克隆质粒限制性双酶切胶回收结果图；M：DL 2000DNA marker；
图6为真核表达载体限制性双酶切鉴定及胶回收，其中，A，pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)真核表达载体经Xba I和Not I限制性双酶切结果图；B，pCDH经XbaI和Not I限制性双酶切胶回收图；M：DL 10000DNA marker；
图7为重组表达菌落PCR鉴定，其中，1-2：SLA-2-HB01-pCDH菌落PCR鉴定结果；3-4：SLA-2-HB01-Flag-pCDH菌落PCR鉴定结果；5-6：SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH菌落PCR鉴定结果；M：DL 2000DNA marker；
图8为重组真核表达载体限制性双酶切鉴定结果图，其中，M：DL 10000DNAMarker；1：Xba I和Not I限制性双酶切鉴定SLA-2-HB01插入片段，大小为1095bp(去掉酶切位点)；2：Xba I和Not I限制性双酶切鉴定SLA-2-HB01-Flag插入片段，大小为1119bp(去掉酶切位点)；3：Xba I和Not I限制性双酶切鉴定SLA-2-HB01-3×Flag插入片段，大小为1161bp(去掉酶切位点)；
图9为SLA-2-HB01-pCDH重组真核表达载体测序结果图；
图10为SLA-2-HB01-Flag-pCDH重组真核表达载体测序结果图；
图11为SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH重组真核表达载体测序结果图；
图12为重组表达质粒鉴定图；
图13为psPAX2质粒图谱；
图14为pMD2.G质粒图谱；
图15为293T细胞中绿色荧光蛋白的表达情况(400×)，其中，A，pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)病毒包装293T细胞在不同时间荧光表达情况；B，SLA-2-HB01-pCDH病毒包装293T细胞在不同时间荧光表达情况；C，SLA-2-HB01-Flag-pCDH病毒包装293T细胞在不同时间荧光表达情况；D，SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH病毒包装293T细胞在不同时间荧光表达情况；
图16为感染sT2细胞不同时间段荧光强度，其中，A，pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)感染sT2细胞不同时间段荧光强度；B，SLA-2-HB01-pCDH感染sT2细胞不同时间段荧光强度；C，SLA-2-HB01-Flag-pCDH感染sT2细胞不同时间段荧光强度；D，SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH感染sT2细胞不同时间段荧光强度；
图17为有限稀释法将感染sT2细胞单克隆扩大培养示意图；
图18为感染sT2细胞系分别在明视野和荧光视野下图片，其中，A和B为pCDH/sT2细胞系分别在明视野和荧光视野下细胞状态；图C和D为SLA-2-HB01-pCDH/sT2细胞系分别在明视野和荧光视野下细胞状态；图E和图F为SLA-2-HB01-Flag-pCDH/sT2细胞系分别在明视野和荧光视野下细胞状态；图G和图H为SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH/sT2细胞系分别在明视野和荧光视野下细胞状态；
图19为Western blotting检测不同细胞系重链和轻链表达结果，其中，A，Monoclonal ANTI-
Figure BDA0003404857760000161
M2检测，稀释度：1:1000；二抗：Goat Anti-Mouse，稀释度1:8000；B，Monoclonal SLA-2检测，稀释度：1:1000；二抗：Goat Anti-Mouse，稀释度1:8000；C，Monoclonalβ2m检测，稀释度：1:1000；二抗：Goat Anti-Mouse，稀释度1:8000；D，内参GAPDH检测，稀释度：1:8000；二抗：Goat Anti-Mouse，稀释度1:8000。
具体实施方式
下面通过具体实施例详述本发明，但不限制本发明的保护范围。如无特殊说明，本发明所采用的实验方法均为常规方法，所用实验器材、材料、试剂等均可从商业途径获得。
1.本发明采用的质粒与菌株来源如下：
(1)质粒：荷包猪SLA-2-pMD 18-T全基因(Gene Bank编号：AB602431.1)质粒由大连大学生命科学与技术学院实验室保存。
psPAX2质粒：慢病毒包装的结构蛋白编码质粒，具有高拷贝数，通常会表达Gag，Pol，Rev和Tat等基因，载体具体信息如图1。购自Invitrogen公司。
pMD2.G质粒：慢病毒蛋白质外壳编码的质粒，是质粒包装系统的信封质粒。购自ADDGENE公司，载体具体信息如图14：
293T细胞：人胚上皮细胞系细胞，由大连医科大学李文哲课题组馈赠。
PK15细胞：猪肾上皮细胞(Porcine Kidney15,PK15)由本实验室保存。
sT2细胞：由本实验室构建保存。
(2)载体与菌株：pMD 19-Tsimple Vector，E.coli DH5ɑ和E.coli Stbl3购自大连宝生物有限公司。pMD 19-Tsimple Vector用于SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag基因的高效克隆。E.coli Top10感受态细胞用于扩增含有目的基因的重组质粒，以便进一步进行目的基因的克隆改造。E.coli Stbl3感受态细胞用于表达重组目的基因，保证质粒稳定遗传。pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)菌种来自于中国上海思享生物有限责任公司，载体具体信息如图1。
2.主要试剂如下：
(1)胰蛋白胨Tryptone以及酵母提取物Yeast extract、氯化钠NaCl、Tris、琼脂糖、SanPrep柱式吸附柱小量质粒提取试剂盒、SanPrep柱式吸附柱DNA胶回收试剂盒等，离心管、枪头等实验耗材购自上海生工生物工程有限公司；
(2)
Figure BDA0003404857760000173
Super-Fidelity DNA Polymerase、核酸染料Ultra Gelred NucleicAcid Stain 10000x，购自诺唯赞有限公司；
(3)T4 DNA连接酶、DL 2000 DNA Marker、DL 10000DNA Marker、Xba I限制性快速内切酶、Not I限制性快速内切酶、10×上样缓冲液loading buffer均购自TAKARA有限公司；
(4)其他常见的分子生物学试剂以及化学试剂都来自天津化学试剂有限公司和北京化学试剂有限公司。
3.实验仪器如下：
Figure BDA0003404857760000171
实施例1溶液、试剂的配制
(1)培养基
①LB液体培养基(100mL)：
胰蛋白胨(Tryptone) 1g 1％(w/v)
酵母提取物(Yeast Extract) 0.5g 0.5％(w/v)
NaCl 1g 1％(w/v)
加入超纯水至完全溶解后，用5mol/L NaOH调节培养基pH到7.0，定容后121℃高压灭菌15min。
②LB固体培养基(100mL)：
Figure BDA0003404857760000172
Figure BDA0003404857760000181
加入超纯水至完全溶解后，用5mol/L NaOH调节培养基pH到7.0，定容后121℃高压灭菌15min，待培养基温度恢复至50-60℃时加入一定比例抗生素，在超净工作台将其倒入高压灭菌的平板中，平板冷却后标记放置于4℃保存。
③50％LB+甘油培养基(100mL)：
按照体积比50％向50mL液体LB培养基中加入50mL甘油，混匀后121℃ 15min灭菌。
(2)琼脂糖电泳试剂
①50×TAE(Tris-乙酸)溶液配制方法(1L)：
Tris 242g
Na2EDTA·2H2O 37.2g
缓慢加入超纯水800mL，充分溶解后加入57.1mL冰乙酸，5mol/L NaOH调节pH到8.0，定容到1L，室温保存。用超纯水稀释至1×TAE用于工作浓度。
②1％琼脂糖凝胶：
称取0.5g琼脂糖加入50mL 1×TAE中，高温加热使琼脂糖完全溶解，待温度恢复至60-70℃加入5μLEB溶液，轻轻摇匀倒入制胶槽中完全凝固后使用。
(3)感受态制备溶液
①0.1mol/L CaCl2溶液：称1.11g无水CaCl2加入80mL超纯水中，待完全溶解定容至100mL，121℃高压灭菌15min，4℃保存。
②0.1mol/L CaCl2+20％甘油：取1.11g CaCl2加到80mL的超纯水中，完全溶解后加入20mL甘油，121℃15min高温灭菌，4℃保存备用。
(4)TOP10、Stbl3感受态细胞制备：
①将TOP10、Stbl3菌种在无抗性的LB固体培养基平板上划线，各挑取两个单克隆菌落，接种到含有5mL无抗性LB液体培养基中，37℃，200rpm/min，摇14h；
②吸取1mL培养过后的TOP10、Stbl3菌液接种到50mL无抗性LB液体培养基中，37℃，200rpm/min，摇2h；
③将50mL摇荡后的菌液放置冰上30min，分装到两个无菌的50mL离心管中，使每个离心管含25mL菌液，4℃，4000rpm/min，10min，倒掉上清；
④向50mL离心管中加入20mL预冷的0.1mol/L CaCl2溶液使菌体重悬，冰上放置30min；
⑤将放置完的菌液4℃，4000rpm/min离心10min，弃掉上清；
⑥向离心管中加入10mL预冷的20％甘油0.1mol/L CaCl2溶液轻轻地重悬细胞，分装细胞每管100μL，放置-80℃保存备用；
(5)氨苄青霉素钠盐(Amp+)(贮存液浓度100mg/mL)：称取1g氨苄青霉素溶解于10mL灭菌去离子水中，0.22μm微孔滤膜过滤，分装成每管1mL，-20℃保存。使用时培养基中Amp+终浓度为100μg/mL。
(6)DAB显色液pH 7.6Tris-HCl+DAB+0.01％H2O2(0.6mg DAB+1mL 50mmol/L pH7.6Tris-HCl+1μL 30％H2O2)
(7)1.0mol/L Tris-HCL(pH 6.8)：Tris 121.1g，加水溶解，用浓盐酸调pH至6.8后，定容至1L，高压冷却后再调pH，室温保存。
(8)1.5mol/L Tris-HCL(pH 8.8)：Tris 181.7g，加水溶解，用浓盐酸调pH至8.8后，定容至1L，高压冷却后再调pH，室温保存。
(9)30％Acrylamide-Bis：称取丙烯酰胺(Acryl amide)58g，N，N'-亚甲基双丙烯酰胺(Bis-Acrylamide)2g，加水溶解后，定容至200mL，用0.45μm滤膜过滤至棕色瓶中，4℃避光保存。
(10)10％SDS(十二烷基磺酸钠)：称取SDS 10g，加水溶解，65℃水浴至充分溶解，用浓盐酸调pH至7.2，定容至100mL，用棕色瓶室温保存。
(11)10％AP(过硫酸铵)：称1gAP粉末，加10mL单蒸水溶解后分装保存，4℃可保存两周，-20℃可保存一个半月。
(12)5×SDS-PAGE Loading Buffer(蛋白上样缓冲液)：称BPB(溴酚蓝)50mg，SDS1g，加入1.0mol/LTris-HCl(pH 6.8)2.5mL，甘油5mL，后加水溶解后定容10mL，充分溶解后，500μL分装保存。使用前向500μL分装缓冲液加入25μLβ-巯基乙醇。
(13)5×Tris-Glycine Buffer(电泳缓冲液)：称取甘氨酸(Glycine)47g，Tris7.55g，SDS 2.5g，加水溶解完全，定容至500mL，4℃保存。
(14)膜转移缓冲液：称Tris 5.8g，Glycine 2.9g，SDS 0.37g，加水溶解后，定容至800mL，然后加入200mL甲醇，4℃保存。
(15)TBST Buffer(洗膜液)：称NaCl 8.8g，1.0mol/L Tris-HCl(pH 8.0)20mL，加水溶解，定容至1L，4℃保存，使用前加入0.5-1mLTween-20混匀，用完后4℃保存。
(16)1.0mol/L Tris-HCL(pH 8.0):Tris 151.5g，加水溶解，用浓盐酸调pH至8.0后，定容至1L，高压冷却后再调pH，室温保存。
(17)10％Triton X-100：1mL Triton X-100，加9mL水溶解均匀，4℃分装保存。
(18)5mol/L NaCl：2.9gNaCl，加8mL水充分溶解，定容至10mL，高压灭菌后，室温保存。
(19)0.5mol/L EDTA(pH 8.0)：称9.305g EDTA，加水充分溶解，用NaOH调节pH至8.0后，定容至50mL，高压后室温保存。
(20)1mol/L NaF：称0.42g NaF，加水搅拌溶解，定容至10mL，-20℃分装保存，用前4℃或冰上溶解。
(21)0.5mol/L Na3VO4：称1g Na3VO4·12H2O，溶于10mL蒸馏水中，溶解后分装-20℃保存。
(22)细胞裂解液的配制：(以配制10mL为例)
表11细胞裂解缓冲液配制表
Figure BDA0003404857760000191
实施例2猪SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag PCR扩增
用上述设计的上下游引物分别扩增出荷包猪SLA-2-HB01的C末端不带标签及带有Flag、3×Flag基因序列，结构示意图如图2A，分别标记为SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag，它们的理论值含酶切位点大小为1119bp、含酶切位点与Flag标签大小为1133bp及含酶切位点与3×Flag标签大小为1175bp。PCR产物如图2B所示，大小约1100bp左右，与理论设计值一致。
实施例3SLA-2-HB01-pMD 19-T、SLA-2-HBO1-Flag-pMD 19-T g和SLA-2-HBO1-3×Flag-pMD 19-T的构建与鉴定
SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag的PCR产物经胶回收后，分别与pMD 19-T simple载体连接形成SLA-2-HB01-pMD 19-T、SLA-2-HB01-Flag-pMD 19-T和SLA-2-HB01-3×Flag-pMD 19-T重组克隆质粒，分别转化到TOP10感受态细胞中，进行菌落PCR鉴定，测序后将阳性重组克隆质粒进行双酶切胶回收。图3A为SLA-2-HB01-pMD 19-T菌落PCR鉴定结果，所选六个单菌落中5个都鉴定出含有目的条带，选取编号为4号、5号菌进行测序鉴定。图3B为SLA-2-HB01-Flag-pMD 19-T菌落PCR鉴定结果，所选六个单菌落均鉴定出含有目的条带，选取编号为5号、6号菌进行测序鉴定。图3C为SLA-2-HB01-3×Flag-pMD 19-T菌落PCR鉴定结果，所选六个单菌落中5个都鉴定出含有目的条带，选取编号为1的菌进行测序鉴定。将测序验证正确的SLA-2-HB01-pMD 19-T、SLA-2-HB01-Flag-pMD 19-T和SLA-2-HB01-3×Flag-pMD 19-T重组克隆质粒进行Xba I、NotI双酶切，结果如图4所示，胶回收结果如图5所示，结果显示检测到插入目的基因片段的大小分别为1095bp，1119bp及去掉酶切位点大小为1161bp，与设计片段理论值一致。
实施例4猪SLA-2真核表达载体的构建与鉴定
pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro真核表达载体经Xba I和NotI限制性双酶切后，1％琼脂糖凝胶鉴定结果中可看到8000bp左右有一条明显的条带，与理论值8168bp大小基本一致，如图6A所示；并将此条带进行胶回收，如图6B所示。将上述胶回收的SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag目的条带分别插入双酶切后的真核表达载体中，组成重组表达质粒分别命名为SLA-2-HB01-pCDH、SLA-2-HB01-Flag-pCDH和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH，菌落PCR鉴定结果如图7，编号1和2为SLA-2-HB01-pCDH单克隆重组表达菌，结果可看到在1000bp左右有明显单一条带，可看出在真核表达载体pCDH中成功插入SLA-2-HB01目的基因。编号3和编号4为SLA-2-HB01-Flag-pCDH单克隆重组表达菌，编号5和编号6为SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH单克隆重组表达菌，结果可看到在1100bp左右有明显单一条带，初步可以鉴定已成功构建真核表达重组菌SLA-2-HB01-Flag-pCDH和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH。选取编号1、编号3和编号5的菌落进行小量双酶切鉴定，电泳结果显示SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag成功插入pCDH真核表达载体中，其中载体条带大小为8168bp，目的条带大小分别为1095bp，1119bp和1161bp，见图8。将这3个阳性克隆菌分别进行测序，测序比对结果说明测序结果与目标序列完全一致，见图9，结果说明重组表达载体构建成功。对测序正确SLA-2-HB01-pCDH、SLA-2-HB01-Flag-pCDH和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH进行质粒提取后1％的琼脂糖凝胶电泳检测，见图10，空载体pCDH泳道中可看到在8200bp处有单一清晰的条带，与理论值8201bp大小基本一致；SLA-2-HB01-pCDH泳道中可看到在9100bp有单一清晰的条带，与理论值9263bp大小基本一致；SLA-2-HB01-Flag-pCDH和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH的泳道中可看到9200bp左右都有单一条带，分别与理论值9287bp和9329bp基本一致，进一步表明SLA-2-HB01-pCDH、SLA-2-HB01-Flag-pCDH和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH真核表达载体构建成功。
实施例5重组目的基因质粒慢病毒包装
利用第二代慢病毒包装系统分别对pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)和SLA-2-HB01-pCDH、SLA-2-HB01-Flag-pCDH、SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH四种质粒进行病毒液包装，将其分别与psPAX2和pMD2.G按照4:3:2比例进行混合转染到293T细胞中，利用倒置荧光显微镜的荧光视野分别在24h、48h和72h观察细胞如图15所示，可以观察到细胞表面呈雪花样，表示病毒颗粒转染很成功，且产生四种病毒的细胞可以看到很强的荧光强度且融合度达到70％以上。
实施例6重组质粒病毒感染ST2细胞结果
用收集到的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)、SLA-2-HB01-pCDH、SLA-2-HB01-Flag-pCDH和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH重组慢病毒上清液转染293T细胞，用嘌呤霉素筛选1周后，经甲醛固定，Giemsa染色，测定病毒各个病毒滴度基本上都为1×107TU/mL。然后将病毒上清液离心和PVDF微膜过滤除去细胞碎片后，分别感染sT2细胞48h，1.5μg/mL Puro抗性杀伤筛选24h，5天和15天结果图，见图16。随着1.5μg/mL Puro抗性杀伤时间延长，细胞状态及形态越来越好。
实施例7有限稀释法单克隆细胞培养
将感染15天后的sT2细胞利用有限稀释法稀释，7-8cell/mL，每孔100μL接种到96孔细胞培养板中，用含1.5μg/mL Puro DMEM培养基进行培养，8-10天后96孔细胞板中单克隆细胞生长成团，将荧光强度较强和细胞状态较好的细胞转移至24孔板培养7-10天后，最终转移6孔板中生长5天，直至长满，如图17所示。经倒置显微镜观察细胞生长状态良好，分别命名为pCDH/sT2、SLA-2-HB01-pCDH/sT2、SLA-2-HB01-Flag-pCDH/sT2和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH/sT2细胞系如图18所示，可以看到细胞生长状态良好，且具有很强的荧光强度。结果表明，空载pCDH和真核重组表达载体SLA-2-HB01-pCDH、SLA-2-HB01-Flag-pCDH和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH的慢病毒颗粒已成功整合到sT2细胞内染色体上，并且形成了可以遗传的且对Puro产生抗性的细胞株。
实施例8Western blotting检测
通过Western blotting检测感染sT2细胞的样品，用Flag单克隆抗体检测时，Flag和3×Flag标签与SLA-2-HB01分子为融合表达，图19A中可以观察到在46kDa、48kDa处有特异性条带，大小与预期结果45.9kDa、47.6kDa相吻合。用SLA-2-HB01单克隆抗体检测时，如图19B结果显示与正常PK15细胞相比，sT2细胞中的SLA-2-HB01蛋白表达量较低。而构建的SLA-2-HB01-pCDH/sT2、SLA-2-HB01-Flag-pCDH/sT2和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH/sT2细胞系中可以大量表达外源性SLA-2-HB01蛋白，C-末端Flag标签的添加没有影响SLA-2-HB01目的蛋白的表达。用猪β2m单克隆抗体检测时，可以看到各个细胞系中都表达β2m蛋白而且表达量基本一致，见图19C。
Western blotting检测结果表明，构建的SLA-2-HB01-Flag-pCDH/sT2和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH/sT2细胞系不仅保留了Flag标签蛋白的特性，表达的目的蛋白具有良好的生物活性；构建的SLA-2-HB01-pCDH/sT2、SLA-2-HB01-Flag-pCDH/sT2和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH/sT2细胞系与PK15、sT2细胞相比，SLA-2-HB01分子大量表达；构建的重组真核表达细胞中轻链β2m表达量与PK15、sT2细胞相比，表达量基本一致且稳定表达。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的全部实施例。对于本领域一般技术人员而言，在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动，都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。

Claims (7)

1.一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因的制备方法，其特征是，具体包括以下步骤：
步骤S1：引物设计与合成；
步骤S2：SLA-2-HB01、SLA-2-HB01-Flag和SLA-2-HB01-3×Flag表达载体的构建；
步骤S3：猪SLA-2真核表达载体的构建与鉴定；
步骤S4：无内毒素质粒大量提取；
步骤S5：293T细胞培养；
步骤S6：慢病毒包装，四种质粒与Opti-MEM I培养基按照以下比例：
Figure FDA0003404857750000011
Figure FDA0003404857750000012
Figure FDA0003404857750000013
Figure FDA0003404857750000014
步骤S7：慢病毒感染sT2细胞及筛选；
步骤S8：Western blotting检测目的基因质粒表达。
2.如权利要求1所述的一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因的制备方法，其特征是，步骤S4具体包括：
(1)从-80℃冰箱中取出保存的空载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)菌种和构建的荷包猪真核表达载体SLA-2-HB01-pCDH、SLA-2-HB01-Flag-pCDH、SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH的菌种以及慢病毒包装时所需的psPAX2、pMD2.G两个辅助质粒的菌种，分别用接种环“#”字划线法到Amp+抗性的LB固体培养基中，37℃正面放置15-30min，待菌液被培养基完全吸收后倒置培养皿，37℃培养12-16h；待长出单菌落后，分别用10μL的枪头挑取单菌落接种到5mL Amp+LB液体培养基中，标记后放置于摇床中，37℃200rpm震荡培养8h；
(2)按照10％的比例将预先培养好的6种菌液分别再次接种到50mL Amp+LB液体培养基中,标记后放置于摇床中，37℃200rpm震荡培养16-18h；
(3)提取质粒之前，首先进行柱平衡：将CP4吸附柱放入2mL收集管中，加入500μL平衡液BL，12000rpm离心1min弃掉收集管中废液，吸附柱重新装回；
(4)取15mL过夜培养的菌液放入15mL离心管中，12000rpm 1min离心后，将菌体沉淀转移到1.5mL EP管中，尽量去除上清液；
(5)取500μL含RNaseA的溶液P1加入菌体沉淀中，用枪吹打彻底使菌体悬浮；
(6)加入500μL溶液P2，快速温和颠倒离心管8次，使菌体充分裂解形成清亮粘稠溶液，此过程不能超过5min；
(7)缓慢加入500μL溶液P4，立即缓慢温和颠倒离心管8次充分混匀，此时出现白色絮状沉淀，室温静置10min，12000rpm离心10min，若上清中还有沉淀，再次离心至无沉淀；
(8)过滤柱CS放置在新的收集管中，加入上清液于柱中，12000rpm离心3min，将收集管中的过滤液收集；
(9)滤液中加入0.3倍体积的异丙醇，上下混匀颠倒后，转移到先前已平衡的吸附柱CP4中，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的液体；
(10)吸附柱CP4中加入500μL去蛋白液PD，12000rpm离心1min，弃掉收集管中的液体；
(11)吸附柱CP4中加入600μL漂洗液PW，加入无水乙醇，室温静置5min后12000rpm离心1min，弃掉收集管中的液体，此步骤重复两次；
(12)将吸附柱CP4放入空收集管中，12000rpm离心2min，目的是除去吸附柱中残留的漂洗液；
(13)将吸附柱CP4重新放置在一个灭菌1.5mL EP管中，向吸附膜中间加入60μL去离子水，50℃烘箱中放置2min，12000rpm离心2min将质粒收集到EP管中，取1μL进行浓度测量后，分装保存于-20℃，测定浓度，无蛋白质污染后进行下一步骤。
3.如权利要求1所述的一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因的制备方法，其特征是，步骤S5具体包括：
(1)293T细胞的复苏：
①提前打开细胞间水浴锅加热到37℃，打开超净工作台灭菌，并把枪头、试管架、移液器、培养瓶一并灭菌；
②在超净工作台中配置好含有10％FBSDMEM培养基，取9mL完全培养基放入15mL无菌离心管中；
③从液氮罐中取出293T细胞冻存管，立即放入37℃水浴锅里快速晃动解冻；
④用酒精棉球擦拭冻存管进行消毒，放置于超净工作台中，用枪吹吸管底使沉淀的细胞悬浮，然后转移到存有9mL完全培养基的离心管中，反复吹打几次以彻底去除DMSO，1000rpm离心5min；
⑤取1mL完全培养基重悬细胞，然后转移到25cm2细胞培养瓶中，添加3mL完全培养基并轻轻摇匀，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养；
(2)293T细胞传代：
①提前打开细胞间37℃水浴锅，对完全培养基和1×PBS进行预热，打开超净工作台灭菌，并把枪头、试管架、移液器、培养瓶一并灭菌；
②选择生长状态良好且细胞密度为80％培养瓶中的细胞进行消化传代处理；
③弃掉原培养基，缓慢加入3-4mL 1×PBS洗两遍除去瓶中残留的培养基；
④取500μL 0.1％胰酶滴加到培养瓶中，让蛋白酶均匀铺满整个细胞容器，37℃消化30s，倒置显微镜下可观察到细胞变圆且透亮，大部分漂浮起来时加入3mL完全培养基终止消化；
⑤反复吹打细胞贴壁的一侧，使细胞彻底从容器中脱落且分散为单个细胞，放入5mL灭菌离心管中，1000rpm离心5min；
⑥取1mL完全培养基重悬细胞，取100μL细胞悬液放入25cm2细胞培养瓶中，添加3mL完全培养基并轻轻摇匀，然后放置于37℃，5％CO2培养箱中培养；
(3)293T细胞的冻存：
①提前打开细胞间水浴锅加热到37℃，对完全培养基和1×PBS进行预热，打开超净工作台灭菌，并把枪头、试管架、移液器、培养瓶一并灭菌；
②选择生长状态良好且细胞密度为90％培养瓶中的细胞进行冻存；
③弃掉原培养基，缓慢加入3-4mL 1×PBS洗两遍除去瓶中残留的培养基；
④取500μL 0.1％胰酶滴加到培养瓶中，让蛋白酶均匀铺满整个细胞容器，37℃消化30s，倒置显微镜下可观察到细胞变圆且透亮，大部分漂浮起来时加入3mL完全培养基终止消化；
⑤反复吹打细胞贴壁的一侧，使细胞彻底从容器中脱落且分散为单个细胞，放入5mL灭菌离心管中，1000rpm离心5min；
⑥取1mL无血清细胞冻存液进行细胞重悬，然后放入细胞冻存管中，进行名称、时间标记后立即放入-80℃，24h后可放置于液氮罐中进行长期保存。
4.如权利要求1所述的一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因的制备方法，其特征是，步骤S6具体包括：
(1)将生长状态较好的293T细胞进行传代，接种1.5×106个细胞于60mm细胞培养皿中，培养12-18h后使细胞密度达到80％左右，每种病毒用一个培养皿，共接种4板细胞；
(2)转染开始，用枪吸出每个皿中的培养液，用1×PBS洗一遍；
(3)吸出PBS，每个皿中加入3mL Opti-MEM I培养基，放置于37℃CO2培养箱中培养，使细胞处于饥饿状态达到较高的转染率；
(4)准备转染样品，将质粒与Opti-MEM I培养基按照目的质粒：pMD2.G：psPAX2＝4:3:2加入到1.5mL EP管中，轻轻混匀，室温静置5min，具体四种质粒与Opti-MEM I培养基的配比如下：
Figure FDA0003404857750000031
Figure FDA0003404857750000032
Figure FDA0003404857750000041
Figure FDA0003404857750000042
(5)提前取出转染试剂Lipofectamine 2000使其恢复室温，取出64μL转染试剂稀释于2mLOpti-MEM I培养基中，室温静置5min；
(6)静置5min后，分别取500μL Lipofectamine 2000稀释液轻轻滴加到混合DNA中，Lipofectamine 2000稀释液和混合DNA稀释液共1mL轻轻混匀然后室温静置20min；
(7)将混合液体分别逐滴加入相应的60mm细胞培养皿中，轻轻前后晃动细胞皿与皿中Opti-MEM I培养基混匀，37℃CO2培养箱中培养6h；
(8)6h后去除含有转染试剂的培养基，更换4mL新鲜的完全培养基；
(9)转染24h后，取出293T细胞，倒置荧光显微镜下观察转染结果并拍照；
(10)转染48h和72h后，分别在倒置荧光显微镜下观察转染结果并拍照，并收集病毒上清；
(11)将收集到的病毒上清在4℃条件下，5000rpm离心15min以除去细胞及细胞碎片，用10mL注射器吸取上清，用0.22μm PVDF滤膜过滤至新的EP管中，分装标记后于-80℃保存。
5.如权利要求1所述的一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因的制备方法，其特征是，步骤S7具体包括：
(1)sT2细胞的复苏
从液氮罐中取出sT2细胞，复苏方法与步骤S2：293T细胞培养(1)中293T复苏方法一样；
(2)sT2细胞消化、传代
①提前打开细胞间37℃水浴锅，对完全培养基和1×PBS进行预热，打开超净工作台灭菌，并把枪头、试管架、移液器、培养瓶一并灭菌；
②选择生长状态良好且细胞密度为80％培养瓶中的细胞进行消化处理；
③弃掉原培养液，加入3mL 1×PBS洗两遍除去瓶中残留的培养基；
④取1mL 0.1％胰酶滴加到培养瓶中，让蛋白酶均匀铺满整个细胞容器，37℃消化3min，倒置显微镜下可观察到细胞变圆且透亮，大部分漂浮起来时加入3mL完全培养基终止消化；
⑤反复吹打细胞贴壁的一侧，使细胞彻底从容器中脱落且分散为单个细胞，放入5mL灭菌离心管中，1000rpm离心5min；
⑥取1mL完全培养基重悬细胞，取100μL细胞悬液放入25cm2细胞培养瓶中，添加3mL完全培养基并轻轻摇匀，然后放置于37℃，5％CO2培养箱中培养；
(3)sT2细胞准备
将状态良好的sT2细胞接种到6孔板中，每孔1×104，37℃，5％CO2培养箱中培养12-14h，保证第二天进行病毒感染时细胞密度达到30～50％；
(4)病毒感染
①感染前，从-80℃冰箱中取出pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro(pCDH)、SLA-2-HB01-pCDH、SLA-2-HB01-Flag-pCDH和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH四种慢病毒上清，在冰上缓慢融化；
②将6孔板中原培养液弃掉，用1×PBS洗2遍去除细胞碎片，给每孔中分别加入1.5mL病毒上清及500μL DMEM完全培养基，并加入6μg/mL polybrene充分混匀以促进病毒感染sT2细胞，37℃，5％CO2培养箱中培养；
③病毒感染24h后，弃掉含病毒的培养基，换上新鲜的完全培养基，继续37℃，5％CO2培养箱中培养；
④换新鲜培养基6-8h后，加入终浓度为1.5μg/mL嘌呤霉素抗生素筛选，待抗性细胞长满后收获一半细胞进行验证，另一半利用有限稀释法稀释挑取单克隆细胞继续培养，最终获得感染的单克隆细胞系，冻存保种已感染的sT2细胞系。
6.如权利要求1所述的一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因的制备方法，其特征是，步骤S8具体包括：
(1)全蛋白提取
从液氮罐中取出sT2细胞和已转染SLA-2-HB01-pCDH、SLA-2-HB01-Flag-pCDH和SLA-2-HB01-3×Flag-pCDH的sT2细胞，复苏方法与步骤S2：293T细胞培养(1)中293T复苏方法一样，复苏成功后传代两次，细胞生长状态稳定后，收集各种细胞于灭菌EP管中，利用1×PBS洗两遍后，加入配制好的蛋白裂解液，根据细胞量加入裂解液100-500μL，用枪吹打5-8次后，放在冰上并用摇床摇晃15min，中间弹动2次，使细胞充分裂解，裂解完毕后，利用4℃离心机，12000rpm，离心10min，使细胞碎片等全部沉到离心管底部，将上清吸入到新的离心管中；
(2)蛋白浓度的测定：将全蛋白进行10倍稀释后，利用BCA法进行测定：
①在六孔板底部加入25μL不同浓度的标准蛋白，0、25、125、250、500、750、1000、1500μg/mL，同样将稀释好的蛋白每孔25μL加入到六孔板底部，每个样品做三个复孔；计算好反应液的体积，并配制好预混液；
②在每孔中加入200μL预混好的工作液，将孔板放到37℃培养箱中反应20min，利用分光光度计进行测定；
③以标准蛋白浓度为纵坐标，吸光度值为纵坐标，利用标准蛋白浓度计算所测细胞蛋白浓度，得到相应浓度后乘以稀释倍数，得到原液浓度；
④将蛋白进行分装保存，防止反复冻融；
(3)蛋白免疫印迹：
①制备分离胶，选取孔胶厚为1mm的玻璃板，清洗干净固定后，用去离子水检漏7min，将水倒出，用吸水纸将玻璃板内的水吸干净，制取所需浓度的分离胶5mL，混匀后用移液枪沿一侧缓缓加入，防止气泡，从另一侧缓缓加水压平，静止30min；
②配制蛋白样品，取出裂解好的细胞蛋白液样品，用1×PBS进行稀释，并加入适当5×5×SDS-PAGE Loading Buffer；将样品在100℃，加热5min使蛋白变性，变性后低速离心，使离心管壁的蒸汽等落入管底，减少体系差异，离心后，将样品放置在冰上；
③制备浓缩胶，提前准备好梳子，将分离胶上的水轻轻倒出，用吸水纸吸干，制备5％的浓缩胶2mL，混匀后用移液枪加入，缓缓插入梳子，不要产生气泡，计时30min，待浓缩胶凝结好后，将夹胶的夹子取出放入电泳槽中，在两块玻璃板中加满电泳液，用力均匀缓缓的将梳子拔出，将剩余电泳缓冲液加入电泳槽中，用吸管吹走气泡；
④上样，测完蛋白含量后，计算含10μL蛋白质量的溶液体积即为上样量，将准备好的样品轻弹混匀，用移液枪吸取10μL，缓缓加入到上样孔中；
⑤电泳，将电压调到100V，即电流大约在稳定后为30mA，电泳1.5-2h；
⑥切胶，转膜活化，根据胶块大小剪取PVDF膜，也进行标记，在甲醇中活化2min，后也浸泡在转膜缓冲液中30min；
⑦转膜，用滴管吸取适量转膜缓冲液滴加在半干转膜仪底部，先铺三层滤纸，将胶块放好，将PVDF膜放在胶块上，再盖上三层滤纸，铺好后用试管赶一下气泡，盖好，调电压为300V，稳定后为3-6V，计时30-60min，转完后，将PVDF膜继续进行下面的操作；
⑧封闭，用TBS冲洗1min，利用5％BSA封闭液，室温封闭1h；
⑨染一抗，用TBST稀释抗体，在室温下摇晃0.5h后放到4℃中过夜孵育；染二抗，洗膜，用TBST清洗5次，6min/次，洗完后加入稀释的抗小鼠IgG二抗，室温摇晃1h；
⑩显影，洗膜，用TBST清洗5次，6min/次，显影液A和B各200μL，显影前混匀放在暗处，用滤纸将PVDF膜上的液体轻轻吸掉，利用提前做好的标记，确定好蛋白面多的那一面朝上，用移液枪吸取混匀的显影液将其打在膜上，利用仪器进行相应的设定，进行显影。
7.一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因，其特征是，按步骤S1-S8所述方法制备。
CN202111509941.4A 2021-12-10 2021-12-10 一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因及其制备方法 Pending CN114181973A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111509941.4A CN114181973A (zh) 2021-12-10 2021-12-10 一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111509941.4A CN114181973A (zh) 2021-12-10 2021-12-10 一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因及其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN114181973A true CN114181973A (zh) 2022-03-15

Family

ID=80604481

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111509941.4A Pending CN114181973A (zh) 2021-12-10 2021-12-10 一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114181973A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116026625A (zh) * 2023-02-20 2023-04-28 天津市鹰泰利安康医疗科技有限责任公司 一种利用高频双向脉冲的电穿孔消融性能检测装置与方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101984058A (zh) * 2010-11-16 2011-03-09 大连大学 荷包猪sla-2基因及其应用
CN105884869A (zh) * 2016-01-25 2016-08-24 大连大学 一种亚洲i型口蹄疫病毒多肽制备四聚体的方法
CN111979243A (zh) * 2020-08-24 2020-11-24 大连大学 利用CRISPR/Cas9系统构建TAP基因缺失的猪T2细胞的方法
CN112480238A (zh) * 2020-12-03 2021-03-12 大连大学 烟台黑猪sla-2基因真核表达细胞系的构建及表达
CN113265426A (zh) * 2021-05-24 2021-08-17 龙岩学院 一种稳定表达猪圆环病毒2型orf3蛋白细胞株的构建及应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101984058A (zh) * 2010-11-16 2011-03-09 大连大学 荷包猪sla-2基因及其应用
CN105884869A (zh) * 2016-01-25 2016-08-24 大连大学 一种亚洲i型口蹄疫病毒多肽制备四聚体的方法
CN111979243A (zh) * 2020-08-24 2020-11-24 大连大学 利用CRISPR/Cas9系统构建TAP基因缺失的猪T2细胞的方法
CN112480238A (zh) * 2020-12-03 2021-03-12 大连大学 烟台黑猪sla-2基因真核表达细胞系的构建及表达
CN113265426A (zh) * 2021-05-24 2021-08-17 龙岩学院 一种稳定表达猪圆环病毒2型orf3蛋白细胞株的构建及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
翟晓鑫等: "荷包猪SLA-2-HB01 真核表达载体的构建及在PK15 细胞中的表达", 生物技术通报, vol. 34, no. 12, pages 132 - 139 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116026625A (zh) * 2023-02-20 2023-04-28 天津市鹰泰利安康医疗科技有限责任公司 一种利用高频双向脉冲的电穿孔消融性能检测装置与方法
CN116026625B (zh) * 2023-02-20 2023-08-18 天津市鹰泰利安康医疗科技有限责任公司 一种利用高频双向脉冲的电穿孔消融性能检测装置与方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111234036B (zh) 非洲猪瘟病毒p72融合蛋白及其制备方法和应用
JPS6255088A (ja) 組換えｄｎａ技術によるｂ型肝炎表面抗原
CN107630024B (zh) 编码h5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的基因及其应用
CN113943375B (zh) 一类来源于新型冠状病毒s2蛋白hr区域的重组融合蛋白及其应用
CN107227311B (zh) 重组猪细小病毒样粒子及其制备方法和应用
CN111172114A (zh) 一种人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系、构建方法及其应用
CN112724208A (zh) 一种SADS-CoV重组S蛋白胞外段及其制备方法与应用
CN110981968B (zh) 含有狂犬病病毒g蛋白的融合蛋白及其制备方法、应用和疫苗
CN111154778B (zh) 禽新城疫病毒新型基因工程亚单位疫苗
CN114181973A (zh) 一种自主构建sT2细胞表达外源性SLA-2基因及其制备方法
CN111040998A (zh) 一种稳定表达狂犬病毒糖蛋白细胞株的构建及其应用
CN114560915A (zh) 一种改造的高滴度SARS-CoV-2假病毒
CN110257339A (zh) 表达抗新城疫病毒融合蛋白的细胞系及其构建方法和应用
CN113249408A (zh) 一种靶向激活体液免疫和细胞免疫的核酸疫苗载体构建及应用
WO2024051150A1 (zh) 一种人巨细胞病毒重组载体及其制备方法和应用
CN102899293A (zh) 促血管生成素1基因修饰的间充质干细胞、及其构建方法与应用
CN113698466B (zh) Ccnd1在制备禽反转录病毒生产增强剂中的应用
CN112941020B (zh) 一种鸡环状rna在促进成肌细胞的增殖的应用
CN113248577B (zh) 一种以腺病毒为载体的冠状病毒疫苗及其制备方法
CN104450781B (zh) 一种过表达ciapin1蛋白的细胞系及其制备方法和应用
CN111925449B (zh) 一种表达鸡vp2和鸡gal-1融合蛋白的重组cho细胞株及其构建方法和应用
CN105274089B (zh) 一种表达绿色荧光囊膜融合蛋白的rev病毒传染性克隆的构建方法
CN114107176A (zh) 一种稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系及其构建方法和应用
CN107018955A (zh) 一种抗猪圆环病毒2型的转基因猪
CN114134165A (zh) 一种新型hpv治疗性核酸疫苗

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination