CN111172114A - 一种人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系、构建方法及其应用 - Google Patents

一种人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系、构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系、构建方法及其应用，其构建方法为：首先用SV40过表达慢病毒载体转染原代分离的人结直肠腺瘤性息肉上皮细胞，然后用嘌呤霉素筛选，最后将筛选后的细胞扩增得到人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系。本发明构建的人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系克服了以往常规腺瘤性息肉在体外不能进行传代、细胞增殖慢、细胞活性差、达不到细胞传代要求的问题。本发明首次建立人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系，为开展肠癌前病变的体外实验提供重要的细胞实验工具，也便于开展新药筛选、药效组分等临床前研究。

Description

一种人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系、构建方法及其 应用
技术领域
本发明涉及细胞工程技术领域，具体地说，是一种人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系、构建方法及其应用。
背景技术
永生化细胞(immortalized cells)具有无限增殖能力。永生化细胞能够提供稳定均一、性状一致的细胞来源，便于广泛使用，且可以降低细胞材料成本以及便于标准化等。该技术目前在视网膜细胞、肝脏细胞、肺泡上皮细胞等方面都有应用，该技术要求细胞无污染，肝脏、肺部组织、视网膜组织属于实质脏器，无接触细菌污染可能，较为容易建立永生化细胞株。
原代人肠腺瘤性息肉细胞为良性病变，属肠癌前病变，因增殖慢，无法进行传代，5-7 天就停止分裂增殖，无法实现肠息肉的体外细胞实验。此外人体肠道内真菌和细菌都非常丰富，肠道菌群在肠道内能发挥重要作用，因此消化道内的组织建立永生化细胞难度较大。目前无相关技术成功建立肠腺瘤性息肉的体外细胞株，该领域尚属空白。
目前结直肠息肉的研究只能在动物体内进行，无体外成熟的细胞系，这限制了结直肠癌前病变的机制和药效研究。针对现有技术的缺陷，发明人首次构建人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系，为进一步研究结直肠癌前病变机制提供重要的实验依据。关于本发明一种人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系、构建方法及其应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系。
本发明的第二个目的是针对现有技术的不足，提供一种人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系的构建方法。
本发明的第三个目的是针对现有技术的不足，提供一种如上人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系的鉴定方法。
本发明的第四个目的是针对现有技术的不足，提供如上所述人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系的用途。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系，其保藏号为：CCTCC NO:C2019307。
作为本发明的一个优选实施方案，其构建方法为：首先用SV40过表达慢病毒载体转染原代分离的人结直肠腺瘤性息肉上皮细胞，然后用嘌呤霉素筛选，最后将筛选后的细胞扩增得到人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系的构建方法，包括如下步骤：
(1)原代人结直肠腺瘤性息肉上皮细胞的分离：用75％酒精浸泡原代人结直肠腺瘤性息肉上皮组织1-3min，置于含有P/S的PBS中，将组织块剪切、清洗后弃上清，置于含有完全培养基的培养皿中，37℃孵育30-60min得到组织块；
(2)原代人结直肠腺瘤性息肉上皮细胞的培养：将步骤(1)得到的组织块置于培养瓶中，并倒置于5％CO2培养箱中孵育，然后加入上皮细胞完全培养基，浸润组织块，置于5％CO2培养箱中；
(3)将步骤(2)培养得到的原代人结直肠腺瘤性息肉上皮细胞进行免疫荧光鉴定；
(4)用SV40过表达慢病毒转染步骤(2)培养的原代人结直肠腺瘤性息肉上皮细胞，并进行嘌呤霉素筛选；
(5)用流式细胞仪单细胞模板分选，纯化步骤(4)筛选得到的人结直肠腺瘤性息肉上皮细胞。
作为本发明一个优选实施方案，步骤(4)中在进行嘌呤霉素筛选前先确定嘌呤霉素的使用浓度。
作为本发明一个优选实施方案，步骤(4)具体为：
制备SV40过表达慢病毒载体，将SV40过表达慢病毒转入纯化的原代人结直肠腺瘤性息肉上皮细胞，并加入嘌呤霉素，筛选出阳性细胞并继续传代培养；用实时定量PCR仪检测转染细胞中的SV40基因表达，确认SV40已整合到靶细胞的基因组里。
作为本发明一个优选实施方案，步骤(5)之后还包括：传代培养、冻存、复苏。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系的鉴定方法，包括如下步骤：
(1)人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系形态学和表型分析；
(2)人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系功能检测。
为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系在作为人结直肠腺瘤性息肉发生、人结直肠腺瘤性息肉发展或人结直肠腺瘤性息肉癌变的细胞模型中的应用。
如上所述的人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系在研究人结直肠腺瘤性息肉发生机理和/或治疗人结直肠腺瘤性息肉药物中的应用。
如上所述的人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系在建立永生化结直肠腺瘤性息肉动物模型中的应用。
本发明优点在于：
1、制备的永生化人结直肠腺瘤性息肉上皮细胞保留了原代人结直肠腺瘤性息肉上皮细胞的主要特性、主要功能。
2、制备的永生化人结直肠腺瘤性息肉上皮细胞可以在体外进行无限制的体外扩增培养，具有明显的体外增殖活性，此细胞经过多代培养，其增值活性没有明显改变。
3、将本发明的人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系联合微载体培养技术，可以作为人结直肠腺瘤性息肉发生、人结直肠腺瘤性息肉发展或人结直肠腺瘤性息肉癌变的细胞模型，为降低肠腺瘤癌变等高复发率提供了治疗方案，且解决了以往常规腺瘤性息肉在体外不能进行传代、细胞增殖慢、细胞活性差、达不到细胞传代的要求的问题，为开展肠癌前病变的体外实验提供重要的细胞实验工具，也便于开展新药筛选、药效组分等临床前研究，为结直肠腺瘤性息肉患者提供了新的治疗方案，提高了该类患者的生存率，具有很好的应用前景。
生物材料样品的保藏信息：
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
地址：中国湖北省武汉市武汉大学；
申请人(保藏人)：上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院；
收到日(保藏日)：2019.12.4；
培养物名称(分类命名)：人源化肠腺瘤性息肉永生化上皮细胞系IH-CRA-CELL；
保藏编号：CCTCC NO:C2019307。
附图说明
附图1是细胞培养图片。
附图2是永生化细胞和原代细胞免疫荧光鉴定结果，其中图a是永生化细胞免疫荧光鉴定结果，b是原代细胞免疫荧光鉴定结果。
附图3是转染后P3代细胞。
附图4是SV40过表达慢病毒载体图谱。
附图5是目的基因PCR扩增产物回收琼脂糖胶鉴定。
附图6是载体回收琼脂糖胶鉴定。
附图7是pLVX-EF1α-SV40LT-IRES-Puro进行扩增，无内毒素提取质粒，琼脂糖鉴定结果，目的质粒约11500bp。
附图8是无内毒素质粒电泳图，图中从左至右分别为Marker、pLVX-EF1α-IRES-Puro、 pLVX-EF1α-SV40LT-IRES-Puro；上样量：500ng。
附图9是pLVX-EF1α-IRES-Puro、pLVX-EF1α-SV40LT-IRES-Puro扩增曲线。
附图10是pLVX-EF1α-IRES-Puro、pLVX-EF1α-SV40LT-IRES-Puro溶解曲线。
附图11是pLVX-EF1α-SV40LT-IRES-Puro慢病毒过表达情况。
附图12是质粒标准品及两种慢病毒扩增曲线。
附图13是质粒标准品及两种慢病毒溶解曲线。
附图14是绝对定量检测并计算慢病毒颗粒数。
附图15是扩增曲线图。
附图16是SV40 mRNA的相对表达量，左边为未转染的，右侧为转染后。
附图17是细胞STR检测结果。
附图18是STR阳性对照结果图。
附图19是永生化细胞图，其中包括100×和200×各两张图。
附图20是转染细胞图，其中包括100×和200×各两张图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1慢病毒过表达载体构建
实验目的：将SV40LT基因构建到pLVX-EF1α-IRES-Puro载体上。
1.材料与仪器
主要试剂与仪器
表1
Figure BDA0002311689000000051
2实验方法
2.1引物设计
设计SV40LT基因一对特异性引物。扩增出目的基因5’端和3’端带有与克隆载体pLVX-EF1α-IRES-Puro两端具有同源序列的目的片段，引物序列如表2所示：
表2
Figure BDA0002311689000000052
2.2目的基因PCR扩增
2.2.1将引物离心至Ep管底，用水重悬引物至100μM母液浓度。
2.2.2以pBABE-Puro-SV40 LT为模板按照表3所示体系进行PCR扩增：
表3
10×PCR buffer#1 5μL
2mM dNTPs 5μL
SV40LT-F(10μM) 1μL
SV40LT-R(10μM) 1μL
质粒模板 50ng
KOD DNA Polymerase 2.5U
蒸馏水 up to 50μL
2.2.3PCR程序设定如下：
Figure 1
2.2.4琼脂糖胶回收，并测定回收产物浓度。
2.2.4.1载体pLVX-EF1α-IRES-Puro用NotI和BamHI进行双酶切处理，37℃，酶切1.5h，琼脂糖胶回收，并测定回收产物浓度。
2.2.4.2.Gibson连接
按表4所示体系进行Gibson连接：
表4
pLVX-puro酶切产物 50ng
目的基因PCR扩增产物 30ng
Gibson组装预混液 15μL
ddH<sub>2</sub>O补齐至 10μL
将体系置于50℃水浴25min，冰浴5min后，转化DH5α化学感受态细胞。
2.2.4.3转化后，挑取单克隆菌落，摇菌培养，菌液PCR鉴定阳性后送测序。
2.2.4.4将测序比对正确的克隆分别命名为pLVX-EF1α-SV40LT-IRES-Puro。
2.2.4.5质粒无内毒素提取
按照试剂盒说明书进行提取。
2.2.4.5.1实验结果
(1)克隆构建
图4为过表达图谱，图5为目的基因PCR产物回收琼脂糖胶鉴定，图6为载体回收琼脂糖胶鉴定，如图所示：载体片段大小约8300bp。
(2)质粒扩增鉴定
pLVX-EF1α-SV40LT-IRES-Puro。进行扩增，无内毒素提取质粒，琼脂糖鉴定结果如图 7所示，目的质粒约11500bp。
实施例2慢病毒包装
1.实验目的
利用磷酸钙转染法将目的质粒和慢病毒包装质粒共同转染至HEK293T细胞以包装慢病毒、并浓缩至成品慢病毒。
2.材料与仪器
2.1样本情况
pLVX-EF1α-IRES-Puro、pLVX-EF1α-SV40LT-IRES-Puro高浓度无内毒素质粒由之前构建完成；
Lenti-Mix(pMDLg/pRRE、pVSV-G和pRSV-Rev)；
HEK293T细胞株、大肠杆菌DH5α感受态。
2.2试剂和仪器
表5
Figure BDA0002311689000000071
Figure BDA0002311689000000081
3.实验方法
3.1慢病毒包装、浓缩
3.1.1HEK293T细胞分盘：当10cm细胞培养盘中HEK293T细胞生长至约80％-90％密度时，用10％胰酶(胰酶原液0.25％trypsin EDTA)消化、收集HEK293T并将细胞以6×106至7×106细胞量平铺于含15mL完全培养基的10cm细胞培养盘上。于5％CO2的37℃细胞培养箱中培养24h左右，待细胞贴壁生长至约70％-90％密度后即可开始慢病毒包装实验。
3.1.2更换培养基：预热完全培养基于37℃水浴锅，包装实验前1h更换15mL完全培养基。
3.1.3制备Lenti-Mix-DNA转染体系：
表6
体系成分 含量
慢病毒质粒 12μg
Lenti-Mix 12μg
0.25M Cacl<sub>2</sub> 1000μL
2×HBS 1000μL
合计 约2000μL
将四种质粒DNA(12μg慢病毒质粒+12μg Lenti-Mix＝24μg Total，其中Lenti-Mix由 pMDLg/pRRE：pVSV-G：pRSV-Rev＝0.5:0.3:0.2比例配成)加至5mL EP管内，随后加入1000μL 0.25M Cacl2，用枪轻柔吹匀，随后继续加入1000μL 2×HBS，用枪轻柔吹匀后于室温静置10min。最后将Lenti-Mix-DNA转染体系液逐滴加入待转染的HEK293T细胞培养盘内，轻轻摇动培养皿混匀，置于含5％CO2的37℃细胞培养箱培养。
3.1.4转染后更换完全培养基：转染8h-10h后更换预热好的20mL完全培养基，继续培养，转染后24h进行荧光观察和拍照。
3.1.5取上清、过滤、浓缩慢病毒颗粒：转染72h后收集细胞培养液上清，在3000×g，4℃条件下离心10min，后取上清用0.45μM过滤器过滤，过滤后上清与5mL的5× PEG8000慢病毒浓缩液充分混合并4℃过夜处理。
3.1.6离心浓缩：浓缩液处理第二天，在4℃，10000×g，20min条件下离心，用1mL无血清DMEM重悬离心后慢病毒颗粒，短时间内使用可存于4℃，长时间内保存可分装后冻于-80℃，避免反复冻融。
注意：第3.1.4步开始细胞上清中开始产生慢病毒颗粒，所有与含有慢病毒的细胞上清接触的枪尖、EP管及细胞板都要装在特定的密闭容器中，最后高压灭菌后丢弃。
3.2慢病毒感染Hela验证SV40T过表达
3.2.1Hela细胞准备：通过胰酶(0.25％trypsin EDTA)消化、收集Hela细胞，1200rpm， 3min离心，用适当的完全培养基重悬离心后细胞沉淀，细胞计数后，将Hela接种到12孔板内，以24h后细胞生长至40％-60％为宜。于5％CO2的37℃细胞培养箱中培养过夜，待细胞贴壁完全后即可开始感染。
3.3.2取出慢病毒，置于冰上，每一种慢病毒准备1个干净的1.5mL EP管，各EP管加入950μL无血清DMEM，再加入50μL的pLVX-EF1α-SV40LT-IRES-Puro、或pLVX-EF1 α-IRES-Puro慢病毒，最后加入终浓度为10μg/mL的polybrene，充分轻柔混匀。
3.3.3吸去原培养孔中1000μL的培养基，加入1000μL含慢病毒的混合液，再置于37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。
3.3.4 24h后，每孔更换1000μL完全培养基，继续培养。
3.3.5第48h后，收取Hela细胞，并提取细胞总RNA，反转录成cDNA后进行qPCR 检测SV40T表达情况。
3.4qPCR绝对定量验证慢病毒上清中慢病毒颗粒数
3.4.1针对慢病毒核酸内特定LTR区设计引物，通过qPCR绝对定量检测慢病毒上清中慢病毒颗粒数。
3.4.2将730ng/μL的慢病毒质粒作为标准品，用干净灭菌水稀释10^2、10^4、10^5、10^6、10^7、10^8、10^9倍，各取8μL做模板进行qPCR绝对定量检测。
3.4.3将pLVX-EF1α-IRES-Puro、pLVX-EF1α-SV40LT-IRES-Puro慢病毒用干净灭菌水稀释8倍后，取8μL做模板一同进行qPCR绝对定量检测。
3.4.4通过不同稀释倍数的质粒标准品与qPCR扩增的Cq值，建立“稀释倍数”(为方便计算，真实稀释倍数为10^“稀释倍数”倍)与Cq值之间的线性关系，再通过标准品质粒浓度、质粒DNA相对分子量建立拷贝数与“稀释倍数”之间关系，最终求得Cq值对应拷贝数。
3.4.5通过拷贝数与Cq值之间的关系，再结合慢病毒样品的Cq值，求得慢病毒上清中慢病毒颗粒的拷贝数。
4.实验结果
4.1质粒中量去内毒素提取
将构建好的质粒转化，经过转化DH5α后涂板(Amp抗性)，第二天挑取单克隆进行扩大培养(Amp抗性)，第三天再采用天根《无内毒素质粒小提中量试剂盒》进行去内毒素提取，获得高质量、无内毒素质粒，质粒信息及电泳表如下：
表7
Figure BDA0002311689000000101
(备注：质粒的浓度、A260//A280、内毒素信息表)
4.2慢病毒包装、浓缩
将两个质粒分别与Lenti-Mix混匀后配制成Lenti-Mix-DNA转染体系，共同转染HEK293T细胞，包装慢病毒。转染后8h-10h更换20mL完全培养液，转染后72h收集慢病毒上清，离心去细胞后，再经过0.45μM孔径过滤器过滤细胞碎片后，添加5mL 5× PEG8000慢病毒浓缩液，充分混匀后置于4℃过夜处理，第二天经过低温高速离心浓缩慢病毒颗粒，最后用1mL DMEM重悬颗粒，分装200μL每管后冻存于-80℃。
4.3慢病毒感染Hela细胞检测SV40T表达变化
将pLVX-EF1α-IRES-Puro、pLVX-EF1α-SV40LT-IRES-Puro慢病毒感染12-孔Hela细胞，第48h后观察感染情况，经过显微镜镜检表明：细胞表面、间隙均无细菌颗粒或丝状异物，无任何细菌、真菌污染现象。收取Hela细胞，并采用《动物总RNA快速提取试剂盒》提取细胞总RNA，采用《RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit》进行反转录成cDNA，检测SV40T过表达情况，通过图9及10可知，pLVX-EF1α-SV40LT-IRES-Puro慢病毒感染Hela细胞后能极大的过表达SV40T。
表8
组别 Ct Ct Ct
PlVX-EF1α-IRES-Puro-GAPDH 15.988 16.161 16.184
PlVX-EF1α-IRES-Puro-SV40 31.719 31.907 31.996
PlVX-EF1α-SV40LT-IRES-Puro-GAPDH 16.165 16.363 16.542
PlVX-EF1α-SV40LT-IRES-Puro-SV40 17.335 17.366 17.372
4.4qPCR绝对定量验证慢病毒上清中慢病毒颗粒数
qPCR绝对定量的扩增曲线图显示，慢病毒pLVX-EF1α-IRES-Puro、pLVX-EF1α -SV40LT-IRES-Puro的扩增状态介于质粒标准品稀释10^5倍与10^6之间，根据质粒DNA 相对分子量(4662754.74Da)与质粒浓度(730ng/μL)，计算得质粒标准品原液拷贝数为94249006114copies/μL，根据质粒标准品稀释倍数与Cq值之间线性方程式： Y＝0.2163X+2.0403(Y：“稀释倍数”，X：样品Cq值，R2＝0.9944)及慢病毒样品Cq值求得其对应“稀释倍数”YpLVX-EF1α-IRES-Puro、YpLVX-EF1α-SV40LT-IRES-Puro，再求得质粒标准品在YpLVX-EF1α-IRES-Puro、YpLVX-EF1α-SV40LT-IRES-Puro“稀释倍数”下的拷贝数，即得慢病毒样品中慢病毒颗粒数。如图所示，pLVX-EF1α-IRES-Puro的 Cq值带入线性方程求得其对应“稀释倍数”为5.379986418，将质粒标准品原液稀释 10^5.379986418倍后，求得pLVX-EF1α-IRES-Puro慢病毒样品拷贝数为392907.5384 copies/μL，即浓缩后pLVX-EF1α-IRES-Puro慢病毒上清中病毒颗粒数为3143260307 copies/mL；同理，可得浓缩后pLVX-EF1α-SV40LT-IRES-Puro慢病毒上清中病毒颗粒数为 2750325972copies/mL。
式一：
“稀释倍数”-Cq值线性关系式
Y＝0.2163X+2.0403(Y：“稀释倍数”，X：样品Cq值，R2＝0.9944)
YpLVX-EF1α-IRES-Puro＝5.379986418
YpLVX-EF1α-SV40LT-IRES-Puro＝5.437982596
式二：
标准品质粒原液拷贝数(copies/μL)
＝(标准品质粒浓度/DNA相对分子量)×6.02×10^14
＝(730/4662754.74)×6.02×10^14
＝94249006114(copies/μL)
式三：
慢病毒样品颗粒数＝标准品质粒原液拷贝数(copies/μL)/10^(“稀释倍数”)
NpLVX-EF1α-IRES-Puro＝94249006114/10^5.379986418
＝3143260307(copies/mL)
NpLVX-EF1α-SV40LT-IRES-Puro＝94249006114/10^5.437982596
＝2750325972(copies/mL)
实施例3人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系的建立与测试
1.试验所需仪器设备及试剂
(1)仪器见表9。
表9
Figure BDA0002311689000000121
(2)试剂耗材件表10。
表10
Figure BDA0002311689000000122
Figure BDA0002311689000000131
2.构建方法
2.1人息肉细胞的分离培养
1)将手术中取出的息肉组织置于无菌PBS缓冲液中低温运输；
2)在超净工作台内取出组织，用75％酒精浸泡2min左右，置于含有P/S的PBS中；
3)将组织块剪成边长约为0.1cm的正方形，反复清洗后弃上清，置于含有完全培养基的培养皿中，37℃孵育30～60min；
4)用镊子夹入培养瓶中，倒置于5％CO2培养箱中孵育2h；
5)加入2ml上皮细胞完全培养基，浸润组织块，但不能使组织块漂浮，置于5％CO2细胞培养箱中；
6)每隔3天换液，待组织块周围生长的细胞融合成片，即可去除组织块，用胰蛋白酶消化细胞，重新铺瓶。
2.2.免疫荧光鉴定
2.2.1实验步骤
(1)细胞爬片
取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL，加入细胞0.02million个/孔。置培养箱2h或过夜；
(2)固定
细胞爬片后，吸出培养基，用PBS洗1遍，加入4％PFA于4℃固定30min。用PBS洗 3×5min/次。也可最后一次不吸出PBS，放4℃过夜；
(3)破膜封闭
将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上；
玻璃片封闭液配置：按照以下重量份配比：0.5％TritionX-100：PBS＝1:1混合，再加10％血清；
取50uL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h；
(4)一抗孵育
一抗配制：抗体与PBS1:100(200)稀释；
破膜封闭后，取50uL一抗于防水膜上(湿盒中)，将玻片(有细胞的一面)盖上置于4℃(最多可放置一周)；
(5)二抗孵育
室温避光孵育二抗(二抗:PBS＝1:500)2h后，PBS洗3×5min/次，染DAPI (DAPI:PBS＝1:1000)5min，PBS洗3×5min/次。
(6)包埋
玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。
注：鉴定细胞为P1代细胞；
一抗为CK19。
2.3转染
2.3.1SV40过表达慢病毒基本信息见表11。
表11
Figure BDA0002311689000000141
Figure BDA0002311689000000151
atggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatg agaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaaatgaagaaaatgaatactctgtacaagaa aatggaagatggagtaaaatatgctcatcaacctgactttggaggcttctgggatgcaactgagattccaacctatggaactgatgaatgggag cagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaacattctact cctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactctt gcttgctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataac agttataatcataacatactgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatt tgtaaaggggttaataaggaatatttgatgtatagtgccttgactagagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagc atgattttaatccagaagaagcagaggaaactaaacaagtgtcctggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatgtgtt gttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtgtttaaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagtaccatgaa aagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaaaaaccatatgccaacaggctgttgatactgttttagctaaaaagcgggt tgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagatttaatgatcttttggataggatggatataatgtttggttctacaggctctgctg acatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttgcccaaaatggattcagtggtgtatgactttttaaaatgcatggtgtacaa cattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcagctgctttgcttgaattatgtggggggaaag ctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagctaggagtagctattgaccagtttttagtagtttttgaggatgtaaagggcactgga ggggagtccagagatttgccttcaggtcagggaattaataacctggacaatttaagggattatttggatggcagtgttaaggtaaacttagaaaa gaaacacctaaataaaagaactcaaatatttccccctggaatagtcaccatgaatgagtacagtgtgcctaaaacactgcaggccagatttgta aaacaaatagattttaggcccaaagattatttaaagcattgcctggaacgcagtgagtttttgttagaaaagagaataattcaaagtggcattgctttgcttcttatgttaatttggtacagacctgtggctgagtttgctcaaagtattcagagcagaattgtggagtggaaagagagattggacaaagagt ttagtttgtcagtgtatcaaaaaatgaagtttaatgtggctatgggaattggagttttagattggctaagaaacagtgatgatgatgatgaagaca gccaggaaaatgctgataaaaatgaagatggtggggagaagaacatggaagactcagggcatgaaacaggcattgattcacagtcccaag gctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccaca cctccccctgaacctgaaacagagcaaaagctcatttctgaagaggacttgtaa(SEQ ID NO:2)
慢病毒表达载体名称：pLVX-EF1α-IRES-Puro Vector
品牌：Clontech
Code No.631988
酶切位点是NotI和BamHI
2.3.2转染
(1)将细胞接种6孔板，每孔细胞数约为1×105个；
(2)第二天，待细胞贴壁后，换液；
(3)加入1mL完全培养基，再加20μL SV40过表达慢病毒；
(4)混匀后继续培养；
(5)12h后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基；
(6)当细胞长满板底后，传代至T25培养瓶中。
2.4.筛选
2.4.1杀灭曲线的确定
(1)将未转染的干细胞按每孔0.05million铺入24孔板，孵育过夜；
(2)第二天，除去24孔板中旧的培养基；
(3)将含不同浓度嘌呤霉素(1ug/mL，2ug/mL，3ug/mL，4ug/mL，5ug/mL，6ug/mL，7ug/mL)的新鲜培养基加入已铺有细胞的24孔板；
(4)每2天更换新鲜的筛选培养基；
(5)每天观察细胞的存活比例；
(6)最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1-4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度。
结果：嘌呤霉素的使用浓度为2ug/mL，作用时间为3d。
2.4.2嘌呤霉素筛选转染细胞
(1)第一天，将转染的细胞按每孔0.05million铺入24孔板，孵育过夜；
(2)第二天，除去24孔板中旧的培养基；
(3)加入含嘌呤霉素(2ug/mL)的筛选培养基，孵育；
(4)每2天更换新鲜的筛选培养基；
(5)每天观察细胞的存活比例；
(6)在同一时间点(3d)存活的细胞，即为转染成功的细胞；
(7)对筛选后的细胞进行扩增。
2.5.定期检测不同代数(保藏号CCTCC NO:C2019307)细胞表达SV40基因情况，确保转染的稳定性。参照实时定量PCR相对定量实验指南，按其常规检测转染细胞中SV40 基因表达水平。
2.6细胞扩增
将筛选后的细胞进行扩增，筛选后的细胞为P1代，扩增至少到12代。
3实验结果
3.1细胞培养见图1。
3.2免疫荧光鉴定结果见图2。
3.3转染阳性细胞的SV40基因表达结果，与空载比较，结果证明(保藏号CCTCC NO:C2019307)细胞已含有SV40基因。
qPCR相对定量检测结果如下：
扩增曲线图见图15。
SV40mRNA的相对表达量见图16，左边为未转染的，右侧为转染后的
相对表达量的计算表格件表12。
表12
Figure BDA0002311689000000181
从检测结果可以看出，未转染的control组几乎不表达SV40，Trans组转染后的细胞SV40 的显著表达SV40。
3.4转染后P3代细胞见图3。
3.5STR筛选结果见表13。
表13
Figure BDA0002311689000000182
A graphical presentation is shown at the bottom of this page.
Figure BDA0002311689000000183
Figure BDA0002311689000000191
Figure BDA0002311689000000201
Figure BDA0002311689000000211
Figure BDA0002311689000000221
Figure BDA0002311689000000231
after changing the EV
Figure BDA0002311689000000232
Figure BDA0002311689000000241
4结论
本发明一方面利用SV40过表达慢病毒有很强的侵入真核细胞(如人原代培养细胞)及其所携带的SV40基因容易整合到细胞的基因组，并且有无限复制的功能，另一方面进行单细胞分选纯化，从腺瘤性息肉患者组织里分离提取人息肉细胞，经过上述慢病毒转染后进一步作单细胞分离培养，对单克隆进行多方面的验证，最终结果显示：本发明的CCTCCNO:C2019307细胞是一株纯化的、稳定的而且有无限繁殖传代趋势的永生化人结直肠腺瘤性息肉上皮细胞，其生物学特性与原代的保持高度一致。
本发明构建的人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系为降低肠腺瘤癌变等高复发率提供了解决方案，且克服了以往常规腺瘤性息肉在体外不能进行传代、细胞增殖慢、细胞活性差、达不到细胞传代要求的缺陷。本发明首次建立人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系，为开展肠癌前病变的体外实验提供重要的细胞实验工具，也便于开展新药筛选、药效组分等临床前研究，具有很好的应用前景。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院
<120> 一种人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系、构建方法及其应用
<130> /
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 2277
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtggttcaaa gtttttttct tccatttcag gtgtcgtgag gatctatttc cggtgaattc 60
atggataaag ttttaaacag agaggaatct ttgcagctaa tggaccttct aggtcttgaa 120
aggagtgcct gggggaatat tcctctgatg agaaaggcat atttaaaaaa atgcaaggag 180
tttcatcctg ataaaggagg agatgaagaa aaaatgaaga aaatgaatac tctgtacaag 240
aaaatggaag atggagtaaa atatgctcat caacctgact ttggaggctt ctgggatgca 300
actgagattc caacctatgg aactgatgaa tgggagcagt ggtggaatgc ctttaatgag 360
gaaaacctgt tttgctcaga agaaatgcca tctagtgatg atgaggctac tgctgactct 420
caacattcta ctcctccaaa aaagaagaga aaggtagaag accccaagga ctttccttca 480
gaattgctaa gttttttgag tcatgctgtg tttagtaata gaactcttgc ttgctttgct 540
atttacacca caaaggaaaa agctgcactg ctatacaaga aaattatgga aaaatattct 600
gtaaccttta taagtaggca taacagttat aatcataaca tactgttttt tcttactcca 660
cacaggcata gagtgtctgc tattaataac tatgctcaaa aattgtgtac ctttagcttt 720
ttaatttgta aaggggttaa taaggaatat ttgatgtata gtgccttgac tagagatcca 780
ttttctgtta ttgaggaaag tttgccaggt gggttaaagg agcatgattt taatccagaa 840
gaagcagagg aaactaaaca agtgtcctgg aagcttgtaa cagagtatgc aatggaaaca 900
aaatgtgatg atgtgttgtt attgcttggg atgtacttgg aatttcagta cagttttgaa 960
atgtgtttaa aatgtattaa aaaagaacag cccagccact ataagtacca tgaaaagcat 1020
tatgcaaatg ctgctatatt tgctgacagc aaaaaccaaa aaaccatatg ccaacaggct 1080
gttgatactg ttttagctaa aaagcgggtt gatagcctac aattaactag agaacaaatg 1140
ttaacaaaca gatttaatga tcttttggat aggatggata taatgtttgg ttctacaggc 1200
tctgctgaca tagaagaatg gatggctgga gttgcttggc tacactgttt gttgcccaaa 1260
atggattcag tggtgtatga ctttttaaaa tgcatggtgt acaacattcc taaaaaaaga 1320
tactggctgt ttaaaggacc aattgatagt ggtaaaacta cattagcagc tgctttgctt 1380
gaattatgtg gggggaaagc tttaaatgtt aatttgccct tggacaggct gaactttgag 1440
ctaggagtag ctattgacca gtttttagta gtttttgagg atgtaaaggg cactggaggg 1500
gagtccagag atttgccttc aggtcaggga attaataacc tggacaattt aagggattat 1560
ttggatggca gtgttaaggt aaacttagaa aagaaacacc taaataaaag aactcaaata 1620
tttccccctg gaatagtcac catgaatgag tacagtgtgc ctaaaacact gcaggccaga 1680
tttgtaaaac aaatagattt taggcccaaa gattatttaa agcattgcct ggaacgcagt 1740
gagtttttgt tagaaaagag aataattcaa agtggcattg ctttgcttct tatgttaatt 1800
tggtacagac ctgtggctga gtttgctcaa agtattcaga gcagaattgt ggagtggaaa 1860
gagagattgg acaaagagtt tagtttgtca gtgtatcaaa aaatgaagtt taatgtggct 1920
atgggaattg gagttttaga ttggctaaga aacagtgatg atgatgatga agacagccag 1980
gaaaatgctg ataaaaatga agatggtggg gagaagaaca tggaagactc agggcatgaa 2040
acaggcattg attcacagtc ccaaggctca tttcaggccc ctcagtcctc acagtctgtt 2100
catgatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc 2160
acacctcccc ctgaacctga aacagagcaa aagctcattt ctgaagagga cttgtaatct 2220
agacacagtg cagcactctc aacgttcaag gacactacgc gtctggaaca atcaacc 2277
<210> 2
<211> 2157
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
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aggagtgcct gggggaatat tcctctgatg agaaaggcat atttaaaaaa atgcaaggag 120
tttcatcctg ataaaggagg agatgaagaa aaaatgaaga aaatgaatac tctgtacaag 180
aaaatggaag atggagtaaa atatgctcat caacctgact ttggaggctt ctgggatgca 240
actgagattc caacctatgg aactgatgaa tgggagcagt ggtggaatgc ctttaatgag 300
gaaaacctgt tttgctcaga agaaatgcca tctagtgatg atgaggctac tgctgactct 360
caacattcta ctcctccaaa aaagaagaga aaggtagaag accccaagga ctttccttca 420
gaattgctaa gttttttgag tcatgctgtg tttagtaata gaactcttgc ttgctttgct 480
atttacacca caaaggaaaa agctgcactg ctatacaaga aaattatgga aaaatattct 540
gtaaccttta taagtaggca taacagttat aatcataaca tactgttttt tcttactcca 600
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ttaatttgta aaggggttaa taaggaatat ttgatgtata gtgccttgac tagagatcca 720
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aaatgtgatg atgtgttgtt attgcttggg atgtacttgg aatttcagta cagttttgaa 900
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tatgcaaatg ctgctatatt tgctgacagc aaaaaccaaa aaaccatatg ccaacaggct 1020
gttgatactg ttttagctaa aaagcgggtt gatagcctac aattaactag agaacaaatg 1080
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tctgctgaca tagaagaatg gatggctgga gttgcttggc tacactgttt gttgcccaaa 1200
atggattcag tggtgtatga ctttttaaaa tgcatggtgt acaacattcc taaaaaaaga 1260
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gaattatgtg gggggaaagc tttaaatgtt aatttgccct tggacaggct gaactttgag 1380
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gagagattgg acaaagagtt tagtttgtca gtgtatcaaa aaatgaagtt taatgtggct 1860
atgggaattg gagttttaga ttggctaaga aacagtgatg atgatgatga agacagccag 1920
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acaggcattg attcacagtc ccaaggctca tttcaggccc ctcagtcctc acagtctgtt 2040
catgatcata atcagccata ccacatttgt agaggtttta cttgctttaa aaaacctccc 2100
acacctcccc ctgaacctga aacagagcaa aagctcattt ctgaagagga cttgtaa 2157
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggatctattt ccggtgaatt catggataaa gttttaaaca g 41
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gagtgctgca ctgtgtctag attacaagtc ctcttcagaa a 41

Claims (10)

1.一种人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系，其特征在于，其保藏号为：CCTCC NO:C2019307。
2.根据权利要求1所述的人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系，其特征在于，其构建方法为：首先用SV40过表达慢病毒载体转染原代分离的人结直肠腺瘤性息肉上皮细胞，然后用嘌呤霉素筛选，最后将筛选后的细胞扩增得到人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系。
3.权利要求1所述的人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)原代人结直肠腺瘤性息肉上皮细胞的分离：用75％酒精浸泡原代人结直肠腺瘤性息肉上皮组织1-3min，置于含有P/S的PBS中，将组织块剪切、清洗后弃上清，置于含有完全培养基的培养皿中，37℃孵育30-60min得到组织块；
(2)原代人结直肠腺瘤性息肉上皮细胞的培养：将步骤(1)得到的组织块置于培养瓶中，并倒置于5％CO2培养箱中孵育，然后加入上皮细胞完全培养基，浸润组织块，置于5％CO2培养箱中；
(3)将步骤(2)培养得到的原代人结直肠腺瘤性息肉上皮细胞进行免疫荧光鉴定；
(4)用SV40过表达慢病毒转染步骤(2)培养的原代人结直肠腺瘤性息肉上皮细胞，并进行嘌呤霉素筛选；
(5)用流式细胞仪单细胞模板分选，纯化步骤(4)筛选得到的人结直肠腺瘤性息肉上皮细胞。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中在进行嘌呤霉素筛选前先确定嘌呤霉素的使用浓度。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)具体为：
制备SV40过表达慢病毒载体，将SV40过表达慢病毒转入纯化的原代人结直肠腺瘤性息肉上皮细胞，并加入嘌呤霉素，筛选出阳性细胞并继续传代培养；用实时定量PCR仪检测转染细胞中的SV40基因表达，确认SV40基因已整合到靶细胞的基因组里。
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤(5)之后还包括：传代培养、冻存、复苏。
7.权利要求1所述的人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系的鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系形态学和表型分析；
(2)人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系功能检测。
8.权利要求1所述的人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系在作为人结直肠腺瘤性息肉发生、人结直肠腺瘤性息肉发展或人结直肠腺瘤性息肉转移的细胞模型中的应用。
9.权利要求1所述的人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系在研究人结直肠腺瘤性息肉发生机理和/或治疗人结直肠腺瘤性息肉药物中的应用。
10.权利要求1所述的人源化肠癌前病变永生化上皮细胞系在建立永生化结直肠腺瘤性息肉动物模型中的应用。
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