CN117384856A - 一种永生化copd人支气管上皮细胞株及其构建方法和应用 - Google Patents
一种永生化copd人支气管上皮细胞株及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种永生化COPD人支气管上皮细胞株，所述永生化COPD人支气管上皮细胞株于2023年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2023236。所述永生化COPD人支气管上皮细胞株传代次数相比于原代细胞极大程度上增加，提高了COPD人支气管上皮细胞培养的可控性和稳定性，在培养过程中，永生化COPD人支气管上皮细胞的抗污染能力增强，且生长速度由每代的10～15天缩短至2～3天，极大程度缩短体外培养时间。本发明提供的永生化COPD人支气管上皮细胞株，为进行COPD相关研究提供了稳定的体外细胞模型，一定程度上解决了临床样品中个体异质性的问题。
Description
技术领域
本发明涉及细胞技术领域，具体地，涉及一种永生化COPD人支气管上皮细胞株及其构建方法和应用。
背景技术
慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种严重危害人类健康常见的慢性呼吸系统疾病，也是全球第三大死亡原因。COPD主要以持续性呼吸道症状和气流受限为特征的疾病，好发于小气道，即细支气管和终末细支气管。作为以上结构的主要细胞群，人支气管上皮细胞不仅是病原体及炎症介质作用的靶细胞，自身也可通过分泌促炎因子和趋化因子等活性分子，参与COPD发生发展过程中如慢性气道炎性、气道重塑等重要病理改变，因此是COPD病因学和进展机制探讨的主要细胞。然而，目前的研究中，在COPD病因学及进展机制探索中严重缺乏COPD人支气管上皮细胞，制约相关研究领域的发展。虽然目前已有成熟的永生化人正常支气管上皮细胞系(如16HBE和BEAS-2B)，但由于COPD和正常人来源的人支气管上皮细胞在发育过程中所处的微环境不同，导致这两种细胞特定基因的表达存在差异性，且特定基因的改变使原癌基因激活或抑癌基因失活的程度不一致，及影响药物代谢酶的活性不同，导致两种细胞在肿瘤易感性及药物敏感性方面存在差异。故在COPD恶性进展机制探讨及靶向药物研发中，需要COPD特征性支气管上皮细胞开展体外研究。
目前开展以上相关研究所采用的COPD人支气管上皮细胞主要由临床上COPD患者肺组织分离而获得。虽然该方法极大的解决了缺少COPD特征性人支气管上皮细胞的瓶颈问题，但仍存在以下不足：(1)细胞量少：原代支气管上皮细胞从COPD肺组织获得，单次组织分离获取的原代支气管上皮细胞的数量较少。(2)传代次数有限：该技术获得的原代细胞只能进行有限的细胞分裂，一旦达到其生长极限(一般在7～8代)，就会停止分裂并最终死亡。(3)培养稳定性差：该原代细胞在培养过程中，抗污染能力较弱而导致容易被污染，同时原代细胞的生长速度较慢，长满一代需要10～15天。因此，原代细胞培养过程中存在不稳定性。(4)个体异质性：现有技术从不同患者组织中分离出的原代细胞之间存在较大差异，可导致原代细胞在重复实验中较难获得统一的结果。
由于COPD是一种长病程的慢性呼吸系统疾病，且需要长期服用药物以控制病情，因此无论在COPD进展分析评估中，还是靶向新药物开发中，都迫切需要一种能稳定多次传代的COPD人支气管上皮细胞，以用于机制探讨和药物毒性效应评价。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种永生化COPD人支气管上皮细胞株。
本发明的第二个目的在于提供所述永生化COPD人支气管上皮细胞株的构建方法。
本发明的第三个目的在于提供永生化COPD人支气管上皮细胞株的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
本发明提供一种永生化COPD人支气管上皮细胞株(Homo sapiens)，所述细胞株于2023年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉·武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2023236。
本发明通过将携带猿猴病毒40的大T抗原片段(SV40-LT)逆转录病毒载体感染原代COPD人支气管上皮细胞，导入SV40-LT，通过抗生素筛选并进行稳定传代，获得一种永生化COPD人支气管上皮细胞株，并于2023年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2023236，可为COPD发展规律机制探索及靶向药物研发等提供稳定的细胞模型。
本发明还提供一种永生化COPD人支气管上皮细胞株的构建方法，包括以下步骤：COPD原代支气管上皮细胞的培养、构建过表达SV40-LT的慢病毒载体并感染COPD原代支气管上皮细胞、永生化细胞筛选、鉴定。
进一步地，所述COPD原代支气管上皮细胞的培养为用含有2％胎牛血清、1％双抗，1％表皮生长因子的专用上皮基础培养基进行培养。
进一步地，所述COPD原代支气管上皮细胞的培养为在培养箱中培养至细胞融合度达到90％以上进行传代。
优选地，所述COPD原代支气管上皮细胞需要进行支原体检测，其步骤为提取DNA样品、PCR仪进行扩增、扩增产物进行电泳检测。支原体检测目的在于防止原代细胞中出现支原体污染，从而影响细胞永生化的进程。
优选地，所述COPD原代支气管上皮细胞需要进行CK19蛋白免疫荧光检测，其步骤为细胞爬片、固定、破膜封闭、一抗孵育、二抗孵育，最后进行包埋。在原代COPD人支气管上皮细胞检测CK19蛋白的免疫荧光的意义在于该原代细胞是否属于支气管上皮类细胞及有无其他细胞污染。
进一步地，所述慢病毒载体为含有过表达SV40-LT的pBobi-Large T-puro载体。
进一步地，所述永生化细胞筛选为使用嘌呤霉素进行筛选，每隔2天换一次新鲜培养基。
进一步地，所述嘌呤霉素浓度为1μg/mL。
优选地，所述永生化细胞筛选中，存活的细胞即为转染成功的永生化细胞，对筛选所得永生化细胞进行细胞扩增。
优选地，采用qRT-PCR法检测SV40-LT的表达水平，确认SV40-LT导入宿主细胞的情况。其步骤为：提取细胞RNA，逆转录成cDNA，上机进行qPCR检测。
优选地，对导入SV40-LT基因的宿主细胞进行连续7天的细胞活力检测。
进一步地，所述鉴定为STR基因型鉴定。
优选地，STR基因型鉴定首先需要提取细胞基因组DNA，PCR扩增DNA样品的STR序列，经过STR基因分析，最后进行数据库对比。STR即短串联重复序列(Short TandemRepeats)，是一段包含1-6bp的重复DNA序列。通过STR信息建立细胞系的遗传特性来检测细胞是否发生交叉污染或者误认的情况。
优选地，在永生化前后均需要对细胞进行STR基因型鉴定，其目的是鉴定永生化前后是否为同一株细胞以及有无其他杂细胞交叉污染。
优选地，对永生化细胞进行支原体检测、CK19蛋白免疫荧光检测，以确认永生化细胞属于支气管上皮类细胞，永生化过程中未被支原体及其它细胞污染。
经过所述构建方法筛选获得的永生化COPD人支气管上皮细胞数量明显增多，且细胞状态较原代细胞相比较为良好。永生化COPD人支气管上皮细胞传代次数相比于原代细胞极大程度上增加，在培养至30代以上仍然保持稳定的状态，尚未出现衰老。提高了COPD人支气管上皮细胞培养的可控性和稳定性。在培养过程中，永生化COPD人支气管上皮细胞的抗污染能力增强，且生长速度由每代的10～15天缩短至2～3天，极大程度缩短体外培养时间。
因此，本发明提供永生化COPD人支气管上皮细胞在以下方面的应用：
(1)COPD病因形成及进展的分析评估。
(2)构建COPD细胞模型。
(3)开发COPD诊断产品。
(4)开发COPD药物靶点。
(5)筛选和/或评价/制备COPD治疗药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种永生化COPD人支气管上皮细胞株，所述永生化COPD人支气管上皮细胞株于2023年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2023236。本发明的永生化COPD人支气管上皮细胞株细胞数量明显增多，且细胞状态较原代细胞相比较为良好；传代次数相比于原代细胞极大程度上增加，永生化COPD人支气管上皮细胞株已培养至30代以上仍然保持稳定的状态，尚未出现衰老，提高了COPD人支气管上皮细胞培养的可控性和稳定性；在培养过程中，永生化COPD人支气管上皮细胞的抗污染能力增强，且生长速度比原代细胞每代的10-15天缩短至2-3天，极大程度缩短体外培养时间。本发明的永生化COPD人支气管上皮细胞株，为进行COPD相关研究提供了稳定的体外细胞模型，一定程度上解决了临床样品中个体异质性的问题。
附图说明
图1为光镜下原代及永生化后的COPD人支气管上皮细胞形态图。A为原代COPD人支气管上皮细胞；B为永生化COPD人支气管上皮细胞(P12)。
图2为原代及永生化COPD人支气管上皮细胞的支原体检测图。A为原代COPD人支气管上皮细胞支原体检测；B为永生化COPD人支气管上皮细胞支原体检测。
图3为原代及永生化COPD人支气管上皮细胞的CK19蛋白免疫荧光图。
图4为慢病毒载体图谱。
图5为细胞活力曲线图。
图6为SV40-LT的相对表达量。
图7为STR结果分析图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
原代COPD人支气管上皮细胞(购自美国，ATCC)。
实施例1COPD人支气管上皮细胞培养与传代
细胞培养：原代COPD人支气管上皮细胞在细胞培养皿或者T25细胞培养瓶中进行培养，使用上皮细胞专用的完全培养基，完全培养基配制：上皮细胞专用基础培养基+2％胎牛血清+1％生长因子+1％双抗。复苏时，待水浴锅升温至37℃后，将细胞在水浴锅中摇晃，直至无细胞团块，再加入2mL培养基到15mL离心管中，将细胞加到离心管中，在1000rpm，5min的条件下进行离心。弃上清，向离心管中加入培养基对细胞进行重悬，再将其接种到培养皿或者培养瓶中。
细胞传代：待原代COPD人支气管上皮细胞融合度达到90％以上即可进行传代。先用PBS清洗两次，向T25培养瓶加入2mL胰酶，放入37℃培养箱消化1min后，在显微镜下查看细胞之间是否开始分离，待细胞之间出现距离并且细胞开始变圆，立马加入2mL中和液(DMED培养基+10％胎牛血清+1％双抗)进行终止反应。随后用移液枪轻轻吹打细胞，使得细胞脱落至瓶底，收集至15mL离心管中，1000rpm，离心5min。再加入培养基重悬，最后按1传2进行接种。
实施例2COPD原代支气管上皮细胞永生化
(1)形态学观察
原代细胞：体外培养细胞时，如图1A所示，细胞状态多为卵圆形。
(2)原代细胞支原体检测
样品准备：将细胞培养上清液1000rpm离心5min，离心后的上清或分离培养后的上清液置于1.5mL带盖的微量离心管中，在4℃条件下，12000g离心10min。仔细除去上清液，并将沉淀悬浮于25μL双蒸水中。将置于离心管中的内容物隔水煮沸10min，然后冰浴10min，12000g离心10min，上清液为DNA模板。
PCR体系及程序如表1、表2所示：
表1PCR体系
表2PCR程序
PCR产物检测：配制1.5％琼脂糖凝胶，加热后加入适量GELRED用于紫外灯下显色。吸取5μLPCR反应后的样品进行上样，DNA marker上样量为5μL。电泳条件：电压为120V，20min左右。电泳结束后，置于凝胶成像仪上拍照并保存结果。
结果如图2A所示，原代COPD人支气管上皮细胞支原体检测结果为阴性，提示细胞无支原体污染。
(3)慢病毒转染
慢病毒载体构建：将过表达的SV40-LT插入pBobi-Large T-puro载体内，慢病毒载体图谱如图4所示，构建得到过表达的SV40-LT的慢病毒。
转染：将细胞接种6孔板，每孔细胞数约为1×105个。24h后，待细胞贴壁后换培养基，加入1mL完全培养基，再加20μL过表达的SV40-LT的慢病毒，预匀后继续培养，12h后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基。当细胞长满后，传代至T25培养瓶中。
杀灭曲线的确定：将细胞按每孔5万铺入24孔板，第二天，更换新鲜的完全培养基。将含有不同浓度嘌呤霉素(1μg/mL，2μg/mL，3μg/mL，4μg/mL，5μg/mL，6μg/mL，7μg/mL)的新鲜培养基加入已铺有细胞的24孔板中。每隔2天更换新鲜的含有嘌呤霉素培养基，每天观察细胞的存活比例，最小的嘌呤霉素浓度为嘌呤霉素筛选开始第1-4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度。
嘌呤霉素筛选转染细胞：第1d，将转染的细胞按每孔5万铺至24孔板。24h小时后，除去24孔板中旧的培养基，加入含嘌呤霉素(1μg/mL)的筛选培养基，孵育，每隔2天更换新鲜的筛选培养基，每天观察细胞的存活比例，存活的细胞即为转染成功的细胞，对筛选后的细胞进行扩增。
细胞扩增：将筛选后的细胞进行扩增，待细胞融合度达到90％以上可进行传代扩增，嘌呤素筛选后的细胞为第1代，扩增到第12代(P12)，则代表COPD人支气管上细胞永生化成功，成功筛选获得一株永生化COPD人支气管上皮细胞株。
所述永生化COPD人支气管上皮细胞株的形态学如图1B所示，永生化后的COPD人支气管上皮细胞以梭形或卵圆形为主，随着代数的增加，可变为长梭形。
所述永生化COPD人支气管上皮细胞株的支原体检查结果如图2B所示，永生化后的COPD人支气管上皮细胞支原体检测结果为阴性，提示细胞无支原体污染。
实施例3永生化COPD人支气管上皮细胞鉴定
(1)特征性蛋白CK19免疫荧光鉴定
CK19蛋白是人支气管上皮细胞特异性表达的分子阴志物，为了进一步确认该细胞是人支气管上皮细胞，以及鉴定在永生化前后有无其他细胞交叉污染的情况，以辨别永生化前后是否均为同一种细胞。因此，采用免疫荧光法检测人支气管上皮细胞阴志性蛋白CK19在原代及永生化COPD人支气管上皮细胞的表达情况。
具体步骤如下：取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入培养基1mL，加入2万个细胞/孔。放置37℃，5％CO2培养箱过夜。细胞爬片后，吸出培养基，用PBS清洗1次，再加入4％多聚甲醛PFA于4℃固定30min，用PBS清洗3次，5min/次。PBS的最后一次清洗可以不吸出，放4℃冰箱过夜。再将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，取50μL破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。玻璃片封闭液配置：0.5％Trition X-100与PBS按1:1预合，再加入10％山羊血清。破膜封闭后，取50μL一抗(抗体与PBS按1:100或1：200稀释)于防水膜上(湿盒中)，将玻片带有细胞的一面盖上并置于4℃冰箱中(最多可放置一周)。取50μL二抗(二抗与PBS按1:500稀释)滴加于防水膜上，将玻片带有细胞的一面盖上，室温避光孵育2h后，PBS清洗3次，5min/次。再用DAPI染色液(DAPI与PBS按1:1000进行稀释)染色5min后，PBS清洗3次，5min/次。PBS清洗后，在玻片上各滴1滴Fluoromount-G，将有细胞的一面盖上。
检测结果如图3所示，COPD原代人支气管上皮细胞的CK19蛋白有表达。在永生化结束后，检测了CK19蛋白的表达情况，实验结果显示永生化后的COPD人支气管上皮细胞也有表达，提示原代及永生化后的COPD人支气管上皮细胞均属于人支气管上皮细胞类型。
(2)细胞活力的测定
取生长良好的细胞，用胰酶消化细胞40s-60s，然后离心(1000rpm，5min)，再用培养基对细胞进行重悬，并计数。将细胞以1000个细胞/孔分别接种到7块96孔板中，每孔加入100μL完全培养基，设置3个平行，然后放入5％ CO2，37℃培养箱中。每隔24h后取出一块96孔板，弃旧液，PBS清洗1次，每孔加入100μL完全培养基与CCK8的预合液，37℃孵育2h。450nm处测OD值，再连续6d分别进行OD值检测。
检测结果如图5所示，SV40-LT导入COPD的支气管上皮细胞第1d，细胞活力较差。培养至第2-4d，COPD的支气管上皮细胞活力处于快速上升期，细胞的增殖能力最强。第4-7d时，细胞活力基本趋于稳定状态。
(3)鉴定SV40-LT在永生化后的COPD人支气管上皮细胞内的表达
提取细胞RNA：实验材料的准备与样品的裂解：收集50-100万左右的细胞，1000-2000rpm离心1min后弃上清，加入300μL裂解液，轻轻吹打8-10次至固悬物溶解、溶液澄清。加入300μL结合液I至裂解液中，轻轻颠倒预匀3-5次。此时可能会有沉淀物产生，属于正常现象。将预合物(包括沉淀物)转移至纯化柱内，12000rpm离心30s，回收收集管内液体至一个新的1.5mL离心管。向回收的液体中加入700μL结合液II，预匀后，将预合物分两次通过上一步的纯化柱，每次12000rpm离心30s后倒弃收集管内液体。加入600μL洗涤液I，12000rpm离心30s，倒弃收集管内液体。加入600μL洗涤液II，12000rpm离心30s，倒弃收集管内液体，再重复一次该步骤。以最高速(约14000-16000rpm)离心2min，去除残留的液体。将RNA纯化柱置于本试剂盒提供的RNA洗脱管中，加入30-50μL洗脱液，室温放置2-3min，离心30s，所得溶液即为纯化的总RNA。
逆转录步骤如下：
(1)去除RNA样品中的基因组DNA：
反应体系为：5XgDNA Eraser Buffer(2μL)、Total RNA(5μL)、DEPC-treatedWater(3μL)，总体积为10μL。反应条件为37℃孵育2min。迅速置于冰上。
(2)逆转录反应：5XRT Buffer(4μL)、10XRT Primer Mix(2μL)、BeyoRTTMII M-MLV反转录酶(2μL)、DEPC-treated water(2μL)，总体积为10μL。反应条件：42℃孵育60min以进行反转录反应，随后80℃孵育10min失活反转录酶后放于冰上。
qRT-PCR程序如表3、表4所示：
表3引物序列
| 名名 | 序列(5’-3’) |
| SV40-LT-F | TTCAGAGCAGAATTGTGGAGTG |
| SV40-LT-R | CCTGGCTGTCTTCATCATCATC |
| GAPDH-F | AGTCCACTGGCGTCTTCA |
| GAPDH-R | AGGCTGTTGTCATACTCAT |
反应体系：2XS2BR Permix Ex TaqTMⅡ(10μL)、PrimerF(0.8μL)、PrimerR(0.8μL)、cDNA样品(2μL)、ddH2O(6μL)，总反应体积为20μL。
表4反应温度
结果如图6所示，经qPCR检测永生化COPD人支气管上皮细胞内的SV40-LT的表达水平。结果显示，永生化后COPD人支气管上皮细胞的SV40-LT的表达量远远高于原代COPD人支气管上皮细胞，证明SV40-LT已成功导入COPD人支气管上皮细胞内。
(4)STR基因型鉴定
本实验交由第三方机构(上海翼和应用生物技术有限公司)进行检测。用Axygen的基因组抽提试剂盒提取DNA，采用21-STR扩增方案扩增，在ABI 3730XL型遗传分析仪上对STR位点和性别基因Amelogenin进行检测。
具体步骤为：提取干细胞基因组DNA：细胞悬液于4000rpm离心10min，弃上清；取400μL裂解液、10μL蛋白酶K加入管中颠倒预匀，于65℃烘箱中孵育过夜。管中加入400μL结合液，颠倒预匀，1000rpm离心1min，将管中液体全部倒入硅胶离心柱中，此时离心柱应套上管套，室温孵育5min。在12000rpm，1min的条件下离心，丢弃废液。加入漂洗液700μL，12000rpm离心1min，丢弃废液。加入漂洗液350μL，12000rpm离心3min，丢弃管套，将离心柱置于一个新的1.5mL离心管中，于室温中开盖放置5-10min，充分蒸干漂洗液。取100μL洗脱液滴加在硅胶膜上，室温孵育5min，12000rpm离心2min。
PCR体系配制：使用前将2.5XPCR Mix及21PlexPrimers融化,再涡旋震荡10s并短暂离心。反应体系如下：2.5XPCR Mix(10μL)、21PlexPrimers(5μL)、Taq DNA聚合酶(1μL)、提纯的人基因组DNA(0.5ng-2ngDNA)、PCR Grade Water(加至总体积25μL)，反应总体积为25μL。
上机体系：8.85μL甲酰胺+0.15μLOrange-500(分子量内阴)+1μLPCR产物(21PlexAllelic Ladder加量为1μL)；
电泳参数设置：(1)3130/3130xL：在Run Module中设置，Run Time设置为1400s，Injection Voltage为3kV，Injection Time为10s，其余参数为默认值；(2)3500/3500xL：在Instrument Protocol中设置，Run Time设置为1400s；3500型号的Injection Time为15s(3500xL型号为24s)，其余参数为默认值。
STR基因型鉴定采用20条已知的STR位点和1条性别基因Amelogenin进行检测分析，其结果见表5和图7。结果显示，原代及永生化COPD人支气管上皮细胞在各基因座均未出现三等位基因现象，提示未存在其他细胞交叉污染。以及该细胞系与收录于ATCC、DSMZ、JCRB和RIKEN数据库的细胞系STR数据进行比对，并未找到匹配的细胞系，说明该细胞为独一无二的细胞株。此外，该细胞在永生化前后各进行了一次STR鉴定，结果显示原代细胞与永生化细胞的匹配度几乎一致，代表永生化前后均为同一株细胞。因此，将获得的该永生化COPD人支气管上皮细胞株于2023年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：C2023236。进一步培养观察发现，所述永生化COPD人支气管上皮细胞株相较于原代细胞细胞数量明显增多，且细胞状态较原代细胞相比较为良好；传代次数相比于原代细胞极大程度上增加，永生化COPD人支气管上皮细胞株已培养至30代以上仍然保持稳定的状态，尚未出现衰老，提高了COPD人支气管上皮细胞培养的可控性和稳定性；在培养过程中，永生化COPD人支气管上皮细胞的抗污染能力增强，且生长速度比原代细胞每代的10-15天缩短至2-3天，极大程度缩短体外培养时间。
表5原代及永生化COPD人支气管上皮细胞STR基因型鉴定
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种永生化COPD人支气管上皮细胞株，其特征在于，所述永生化COPD人支气管上皮细胞株于2023年8月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2023236。
2.一种构建权利要求1所述永生化COPD人支气管上皮细胞株的方法，其特征在于，包括以下步骤：COPD原代支气管上皮细胞培养，构建过表达SV40-LT的慢病毒载体并感染COPD原代支气管上皮细胞，永生化细胞筛选、鉴定。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述慢病毒载体为含有过表达SV40-LT的pBobi-Large T-puro载体。
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述永生化细胞筛选为使用嘌呤霉素筛选。
5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述鉴定为STR基因型鉴定。
6.权利要求1所述的永生化COPD人支气管上皮细胞株在COPD病因形成及进展的分析评估中的应用。
7.权利要求1所述的永生化COPD人支气管上皮细胞株在构建COPD细胞模型中的应用。
8.权利要求1所述的永生化COPD人支气管上皮细胞株在开发COPD诊断产品中的应用。
9.权利要求1所述的永生化COPD人支气管上皮细胞株在开发COPD药物靶点中的应用。
10.权利要求1所述的永生化COPD人支气管上皮细胞株在筛选和/或评价/制备COPD治疗药物中的应用。
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