CN111575306B - 一种激活红细胞中γ珠蛋白基因表达的方法 - Google Patents

一种激活红细胞中γ珠蛋白基因表达的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种激活红细胞中γ珠蛋白基因表达的方法，公开了转录因子ERF及其相关元件在提高红细胞中γ珠蛋白基因HBG表达中的应用。通过对造血干细胞中转录因子ERF基因启动子区域的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸位点甲基化修饰、敲除HBG2上游ERF的结合位点或者敲除HBG1下游ERF的结合位点，能够提高由此干细胞分化而来的红细胞中HBG表达，提高HbF的含量，从而降低α与非α‑珠蛋白链比例或改善α‑与非α‑珠蛋白链比例失衡状态。这些新的靶点并对其编辑，对于β‑地中海贫血的诊断和深层次的分子机制研究具有意义。

Description

一种激活红细胞中γ珠蛋白基因表达的方法
技术领域
本发明属于生命科技技术领域，特别涉及一种激活红细胞中γ珠蛋白基因表达的方法。
背景技术
β-地中海贫血(thalassemia，简称β-地贫)是世界上最常见的孟德尔遗传病之一，其特征是基因突变使组成血红蛋白的β-珠蛋白肽链合成减少(或缺乏)，导致严重致死性溶血病。β-地贫患儿出生后二周岁内发病，需终生输血治疗，而不接受输血等治疗的患儿期望寿命5岁，严重影响到生命质量。β-地贫的表型特征之一是α-与非α-珠蛋白链(含β-、γ-和δ-链)的比例失衡，由于β-地贫的主要病因是β-珠蛋白基因突变使β珠蛋白合成下降，必然会造成Hb四聚体(HbA:α2β2)合成中α-珠蛋白链的过剩，即α-与非α-珠蛋白链比例增高，这是导致β-地贫红细胞损伤及一系列红系造血病理变化的基础。现有技术中，学者致力于通过降低α与非α-珠蛋白链比例或改善α-与非α-珠蛋白链比例失衡状态从而缓解β-地贫病情的治疗方案。
自上世纪50年代以来，虽然本发明已经深入了解人体Hb三个不同发育阶段(胚胎、胎儿和成人)的β类珠蛋白链合成的成分和表达规律，如组成HbF的γ-链在胎儿出生时段会迅速下降(γ-链合成关闭)，代之以成人血红蛋白(adult hemoglobin，HbA)的β-链快速合成(β-链合成打开)。近年来通过GWAS、遗传家系和基因功能研究，首先发现了调节这一“转换开关”效应的关键基因BCL11A，随后又逐步阐明了参与这一代谢途径调节的二个重要基因—MYB和KLF1,这三个基因作为这一事件的主要遗传因素已被迅速应用于临床作为β-地贫精确诊断的评价指标。新靶点特别是BCL11A是借助DNA Editing等技术用于β-地贫干细胞/基因治疗潜在的重要应用靶点。现有技术中，重新激活γ珠蛋白的表达主要以BCL11A、MYB和KLF1作为靶点，对靶点进行修饰或编辑来实现。
因此，寻求一种新的β-地贫干细胞/基因治疗潜在的重要应用靶点成为亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供造血干细胞中转录因子ERF基因启动子区域的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸、HBG2上游或HBG1下游的结合位点的应用。
本发明的另一目的提供一种激活红细胞中γ珠蛋白基因(HBG)表达的方法。
现有技术中，未有HBG和ERF之间的作用关系的报道，本发明首次发现ERF可以调节HBF的表达，并且探讨了其作用机理，即通过对其启动子甲基化的方式进行调节。为此，本发明研究了ERF的作用靶点，对UEBS和DEBS这两个靶点分别进行了敲除处理，证实同样可以调节HGB表达。
通过对造血干细胞中转录因子ERF(ETS2-repressor factor)基因启动子区域进行甲基化修饰和/或对转录因子ERF在HBG2上游和/或HBG1下游的结合位点进行基因编辑，激活HBG的表达，提高HbF的含量，以解决上述背景技术中提出的问题。
为达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明第一方面提供了一种提高红细胞中γ珠蛋白基因HBG表达的方法，包括：
对造血干细胞的转录因子ERF基因启动子区域甲基化修饰；
和/或，通过基因编辑对对HBG2上游ERF的结合位点进行编辑；
和/或，通过基因编辑对对HBG1下游ERF的结合位点进行编辑；
以上方法适用于非疾病诊断与治疗方法。
本发明对位点进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定其在提高红细胞中γ珠蛋白基因HBG表达的用途。通过对造血干细胞中转录因子ERF(ETS2-repressor factor)基因启动子区域进行甲基化修饰和/或对转录因子ERF在HBG2上游和/或HBG1下游的结合位点进行基因编辑，能够激活干细胞分化而来的红细胞中HBG的表达，提高HbF的含量。
根据本发明的实施例，所述造血干细胞中转录因子ERF基因启动子区域的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸中的胞嘧啶进行甲基化修饰，所述胞嘧啶在人类基因组hg19版本上的位置为：chr19:42760664、chr19:42760707、chr19:42760743、chr19:42760757、chr19:42760764、chr19:42760789。能够激活干细胞分化而来的红细胞中HBG的表达，提高HbF的含量。
根据本发明的实施例，所述利用DNA甲基化转移酶对转录因子ERF基因启动子区域的6个胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的胞嘧啶5’碳位进行甲基化修饰。
根据本发明的实施例，所述通过基因编辑方法对HBG2上游ERF的结合位点SEQ IDNO:1进行敲除，所述基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术。能够激活干细胞分化而来的红细胞中HBG的表达，提高HbF的含量。
根据本发明的实施例，所述通过基因编辑方法对HBG1下游ERF的结合位点SEQ IDNO:2进行敲除，所述基因编辑技术为基于锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术。能够激活干细胞分化而来的红细胞中HBG的表达，提高HbF的含量。
本发明第二方面提供了转录因子ERF及其相关元件在提高红细胞中γ珠蛋白基因HBG表达中的应用。
根据本发明的实施例，所述转录因子ERF及其相关元件选自以下至少一种：
造血干细胞中转录因子ERF基因启动子区域的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸中的胞嘧啶在人类基因组hg19版本上的位置为：chr19:42760664、chr19:42760707、chr19:42760743、chr19:42760757、chr19:42760764、chr19:42760789。
HBG2上游ERF的结合位点；
HBG1下游ERF的结合位点。通过对基因序列进行编辑，能够诱导其向红细胞系分化，得到表达HBG的红细胞。也能够激活干细胞分化而来的红细胞中HBG的表达，提高HBG的含量。
根据本发明的实施例，对造血干细胞的转录因子ERF基因启动子区域的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸进行甲基化修饰；
和/或，通过基因方法对HBG2上游ERF的结合位点进行编辑；
和/或，通过基因方法对HBG1下游ERF的结合位点进行编辑。
发明人发现，在造血干细胞中，利用DNA甲基化转移酶，对转录因子ERF基因启动子区域的6个胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的胞嘧啶5'碳位进行修饰，使共价键结合一个甲基基团，抑制ERF的表达，激活HBG表达，提高HbF的含量。本实施例采用了定点甲基化技术，即在造血干细胞上对ERF启动子区CG位点进行定点甲基化。定点甲基化技术的原理是：利用dCas9没有切割活性只有结合活性的特性，将dCas9与甲基化转移酶MQ1融合，在sgRNA的引导下，dCas9可以结合在靶序列上，使得MQ1可以对靶序列进行甲基化。敲除造血干细胞的HBG2上游ERF结合位点或者HBG1下游ERF的结合位点后，提高了干细胞分化而来的红细胞中HBG表达，提高HbF的含量。
根据本发明的实施例，通过基因编辑对HBG2上游ERF的结合位点SEQ ID NO.1进行敲除。
根据本发明的实施例，通过CRISPR/Cas9技术对HBG2上游ERF的结合位点SEQ IDNO.1进行敲除。
根据本发明的实施例，通过基因编辑对HBG1下游ERF的结合位点SEQ ID NO.2进行敲除。
根据本发明的实施例，通过CRISPR/Cas9技术对HBG1下游ERF的结合位点SEQ IDNO.2进行敲除。
根据本发明的实施例，所述甲基化修饰用的sgRNA为：
ERF1：Cccctcgttgggattttgtg，ERF2：atgaagatgattattattgc。
根据本发明的实施例，所述对HBG2上游ERF的结合位点敲除用的sgRNA为UEBS KO：GATACAACCACCTGCTCCAA。
根据本发明的实施例，所述对HBG1下游ERF的结合位点敲除用的sgRNA为DEBSKO1：GGAACAACCAGCGGCCCTCG，DEBS KO2：TGTGCCAAATTCTGAGGCTG。
本发明第三方面提供了前面任一所述sgRNA在提高红细胞中γ珠蛋白基因HBG表达中的应用。
本发明第四方面提供了一种提高红细胞中γ珠蛋白基因HBG表达的组合物，包括前面任一转录因子ERF。
根据本发明的实施例，还包括：药学上可接受的载体和/或辅料；提高红细胞中γ珠蛋白基因HBG表达的其它活性成分。
根据本发明的实施例，药学上可接受的载体和/或辅料包括但不限于缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、生理食盐、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂、消泡剂。
根据本发明的实施例，所述提高红细胞中γ珠蛋白基因HBG表达其他活性成分包括：化疗剂、放疗剂或抗体药物。
根据本发明的实施例，所述组合物可以选自固体、液体、凝胶、半流质、气雾任一形式。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明公开一种激活红细胞中γ珠蛋白基因表达的方法，同时也公开了三个靶点，通过对造血干细胞中转录因子ERF基因启动子区域的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸进行甲基化修饰、敲除HBG2上游ERF的结合位点或者敲除HBG1下游ERF的结合位点，能够提高由此干细胞分化而来的红细胞中HBG表达，提高HbF的含量，从而降低α与非α-珠蛋白链比例或改善α-与非α-珠蛋白链比例失衡状态。本发明找出新的靶点，对其基因编辑，这种方法可以为提高HBG表达的研究拓宽思路，对于β-地中海贫血的诊断和深层次的分子机制研究具有意义。
附图说明
图1为构建的pCDH-U6-sgRNA-EF1α-dCas9-MQ1-T2A-GFP载体。
图2为本发明定点甲基化水平以及ERF的表达，其中A是甲基化水平曲线图，B是HbF表达柱形图。Methylation：甲基化；Control:对照组；dCas9-MQ1+sgRNA:甲基化组。
图3为基因敲除验证结果，其中A是HUDEP-2中UEBS敲除的插入缺失分布规律。黑色矩形框显示sgRNA的位置。红色矩形框显示PAM。虚线显示的是sgRNA的切割点。B是敲除DEBS后的HUDEP-2的测序图谱。本发明使用两条sgRNAs来定位DEBS片段。黑色虚线表示切割位点。C是CD34+造血干细胞中UEBS敲除的插入缺失分布规律。D是敲除DEBS的CD34+造血干细胞的测序图谱。WT:野生型；DEBS:下游ERF结合位点；UEBS:上游ERF结合位点。
图4为细胞诱导分化后流式细胞结果，A是HUDEP-2细胞，B是CD34+细胞。Ctrl:空白对照；DEBS:下游ERF结合位点；UEBS:上游ERF结合位点敲除；KO:基因敲除。
图5为敲除结合位点UEBS和DEBS后QPCR和HPLC结果，A是HUDEP-2细胞的QPCR；B是HUDEP-2细胞的HPLC；C是CD34+细胞的QPCR；D是CD34+细胞的HPLC结果。Ctrl:空白对照；DEBS:下游ERF结合位点；UEBS:上游ERF结合位点；KO:基因敲除。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。
实施例1
发明人通过研究，发现了造血干细胞的转录因子ERF(ETS2-repressor factor)基因启动子区域、转录因子ERF在HBG2上游结合位点、转录因子ERF在HBG1下游结合位点进行基因编辑，能够提高造血干细胞分化的红细胞中HBG的表达，提高HbF的含量。
造血干细胞中转录因子ERF(ETS2-repressor factor)基因启动子区域的6个胞嘧啶脱氧核糖核苷酸进行甲基化修饰，可以提高干细胞分化而来的红细胞中HBG的表达，提高HbF的含量。ERF基因启动子区域甲基化靶点位置如表1(基因组版本：hg19，染色体序列NCBI编号：NC_000019.9)。
表1胞嘧啶位置
Figure BDA0002441122140000051
转录因子ERF及其相关元件：
HBG2上游的ERF结合位点(UEBS)位置(基因组版本：hg19，染色体序列NCBI编号：NC_000011.9)：chr11:5280188-5280375；
HBG2上游的ERF结合位点(UEBS)核苷酸序列：gacaaagggcatatattcttgggagttctagggtgccccagcccccccagccaccaccacctgactgcctctgctgatgctttctagaaagtgccacctcctggcaggaggccaaccagcacaaaaatagtgcattgaacaaccaaaagtaaggaccctcacagagtccatttcatcctctgccacct(SEQ ID NO.1)。
HBG1下游的ERF结合位点(DEBS)位置(基因组版本：hg19，染色体序列NCBI编号：NC_000011.9)：chr11:5267799-5268033；
HBG1下游的ERF结合位点(DEBS)核苷酸序列：
aaaacaaaaaacaaaaaagaaagaaagtgcatattctgaaacggtagtgactgcatttgaagtgggacctttatgatatgatggagccaggcagagatgttggagaagtt(SEQ ID NO.2)。
根据sgRNA靶序列基本原则，设计、合成siRNA序列。造血干细胞的转录因子ERF基因启动子区域的6个胞嘧啶脱氧核糖核苷酸位点(CG位点)进行设计sgRNA，因为定点甲基化的作用窗口是sgRNA结合位点上下游50bp，为了囊括这6个CG位点，设计了两条sgRNA，定点甲基化sgRNA序列如下(表2)：
表2
sgRNA 序列(5’-3’)
ERF1 Cccctcgttgggattttgtg(SEQ ID NO.3)
ERF2 atgaagatgattattattgc(SEQ ID NO.4)
实施例2定点甲基化
一、细胞培养
为了研究人造血干细胞中转录因子ERF基因甲基化对HBG表达的影响，采用了与造血干细胞特性相似的永生化红系祖细胞(HUDEP-2)进行甲基化实验。永生化红系祖细胞，悬浮生长，用StemSpan SFEM基础培养基加上50ng/ml SCF(stem cell factor,干细胞生长因子)，3U/ml EPO(Erythropoietin,促红细胞生成素)，1μg/ml DOX(Doxycycline,多西环素)和10-6M DEX(Dexamethasone,地塞米松)培养。置于37℃恒温培养箱中进行培养，2-3天后进行换液和传代培养。
二、定点甲基化
1.设计sgRNA：发明人针对实施例1的ERF启动子上的6个CG位点设计了sgRNA，因为定点甲基化的作用窗口是sgRNA结合位点上下游50bp，为了囊括这6个CG位点，发明人设计了两条sgRNA(ERF1和ERF2)SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4。
2.载体构建：sgRNA退火之后，通过BsmBI酶切位点连接到lentiCRISPR载体上，然后将连带U6启动子和sgRNA scaffold一起切下，连接到pCDH-EF1α-dCas9-MQ1-T2A-GFP上，形成pCDH-U6-sgRNA-EF1α-dCas9-MQ1-T2A-GFP质粒(图1)。
3.病毒包装：病毒包装操作与上述基因编辑一样，目的质粒与包装质粒pMD2.G和psPA X2以6:4:6的比例，使用PEI进行转染到HEK-293T细胞中，60小时后收集病毒。
4.病毒感染：吸取50μl病毒滴加到10万个HUDEP-2细胞中，24小时后换液，换成新鲜培养基继续培养3天。
收集本发明定点甲基化的红细胞，提取细胞的DNA和RNA，DNA用于检测ERF启动子区甲基化测序，RNA用于检测ERF表达变化。
结果：相对于对照组(图2)，本发明定点甲基化之后，激活细胞中HBG的表达，提高HbF的表达量。
实施例3结合位点UEBS和DEBS敲除
本发明的ERF结合位点UEBS和DEBS敲除实验是在HUDEP-2细胞和健康人来源的造血干细胞(CD34+)上进行。
1.设计sgRNA：
为了敲除ERF在β珠蛋白基因簇上的结合位点UEBS和DEBS，本发明使用张锋实验室网站(https://zlab.bio/guide-design-resources)在线设计sgRNA。针对UEBS，由于PAM(NGG)的限制，本发明在核心区域设计了sgRNA(UEBS KO)SEQ ID NO.5。针对DEBS，本发明在核心区域上下游设计了一对sgRNA(DEBS KO1和DEBS KO2)SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7。序列如下(表3)：
表3
sgRNA 序列(5’-3’)
UEBS KO GATACAACCACCTGCTCCAA(SEQ ID NO.5)
DEBS KO1 GGAACAACCAGCGGCCCTCG(SEQ ID NO.6)
DEBS KO2 TGTGCCAAATTCTGAGGCTG(SEQ ID NO.7)
2.基因敲除
(1)载体构建、慢病毒包装和感染HUDEP-2细胞
将上述UEBS KO退火后将其通过BsmBI克隆进慢病毒载体lentiCRISPR(addgeneID:52961)，实行了UEBS敲除。DEBS KO1和DEBS KO2一同退火通过BsmBI克隆进慢病毒载体lentiCRISPR(addgene ID:52961)，实行DEBS的敲除。
以上包含sgRNA的慢病毒载体分别与慢病毒包装载体pMD2.G和psPAX2以6:4:6的比例，使用PEI(人工合成的含有极高密度正电荷的有机大分子阳离子聚合物。PEI与DNA通过正负电荷的相互吸引形成复合物，当复合物接近细胞膜时被细胞内吞，成为内体进入细胞质，随后DNA复合物被释放进入细胞核内)共转染HEK-293T细胞。转染60h后收集上清，4℃环境下10000g离心10min后将上清通过0.22μm的滤膜进行过滤，于超高速离心机中4℃环境下20000rpm离心2h。离心完成后丢弃上清，用DMEM重新悬浮并感染HUDEP-2细胞。感染病毒3天后用1μg/mL的嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株，完成基因敲除。
(2)sgRNA电转入CD34+细胞
对于健康人来源的CD34+细胞，本发明采用的是电转的方法，将3pmol sgRNA与20μg Cas9蛋白一起共转到1×105CD34+细胞中，完成基因敲除。
3.基因敲除效果验证
用测序的方法对HUDEP2细胞和CD34+细胞的UEBS和DEBS基因敲除结果进行验证。
结果：图3为基因敲除验证结果。本发明成功对HUDEP-2细胞和CD34+细胞UEBS以及DEBS进行敲除。
4.诱导分化
(1)HUDEP2细胞诱导分化
采用两阶段分化法：第一阶段，使用SFEM作为基础培养基，添加10％胎牛血清，3U/ml EPO，100ng/ml SCF和1μg/ml DOX培养4天；第二阶段，从第5天开始，SFEM作为基础培养基再添加30％胎牛血清，3U/ml EPO，100ng/ml SCF和1μg/ml DOX培养7天，每两天进行一次换液，细胞密度长至80％时传代培养。
(2)CD34+细胞诱导分化
第1天-第6天：StemSpan SFEM基础培养基+10％胎牛血清+50ng/ml SCF+1U/mlEPO+10ng/ml IL-3(白介素3)；第6天-第14天：StemSpan SFEM基础培养基+30％胎牛血清+3U/ml EPO。
5.流式分析法验证目的基因的编辑对细胞分化的影响
有核红细胞表面会特异性表达CD235A和CD71表面抗原分子，所以本发明使用耦合了FITC的CD235A流式抗体和耦合了PE的CD71流式抗体来检测HUDEP-2细胞和CD34+细胞的分化情况。
操作如下：收集大约1×105细胞于1.5ml干净离心管，300g离心5分钟，弃上清，PBS洗一次，离心后弃上清。各加入5μl的FITC-CD235A抗体和PE-CD71抗体，4℃避光孵育30分钟，随后加入1ml PBS 300g离心5分钟，弃上清，用PBS洗两次，最后用300μl PBS重悬细胞，上机检测。
结果：图4为细胞诱导分化后流式细胞结果，对UEBS以及DEBS进行敲除后，从中发现基因敲除不影响HUDEP-2细胞和CD34+细胞的分化。
6.QPCR和高效液相色谱(HPLC)检测HBG表达水平
(1)QPCR:提取细胞总RNA，并使用PrimeScript RT reagent kit with gDNAEraser(Takara)逆转录成cDNA，并用SYBR Premix Ex Taq II(Takara)于ABI Prism 7900或BIO-RAD CFX manager采用两步法进行qPCR检测。具体过程如下。
基因组DNA去除：按照表4中“去基因组DNA”的体系配置并于42℃反应2min。反应结束后立即转移至冰上保存。
表4逆转录反应体系
Figure BDA0002441122140000091
逆转录RNA成cDNA：按照表4中“逆转录”的体系配置并于37℃反应15min，85℃5秒后立即转移至冰上保存。
qPCR反应：使用表5qPCR引物按照表6配置qPCR反应体系后，采用表7中的扩增条件进行qPCR扩增。
表5 qPCR引物序列
Figure BDA0002441122140000092
Figure BDA0002441122140000101
表6 qPCR反应体系
Figure BDA0002441122140000102
表7 qPCR扩增反应条件
Figure BDA0002441122140000103
(2)HPLC:收集1×107个诱导分化后的细胞，PBS清洗后尽量去上清，加50-100μl超纯水裂解细胞，然后在干冰和37℃水浴之间进行3次反复冻融循环。使用高效液相色谱Bio-Rad VARIANTβ-thalassemia Short Program分析胎儿血红蛋白(HbF)(图5B)和成人血红蛋白(HbA)(图5C)组成比例。
结果：图5为敲除结合位点UEBS和DEBS后QPCR和HPLC结果，A是HUDEP-2细胞的QPCR；B是HUDEP-2细胞的HPLC；C是CD34+细胞的QPCR；D是CD34+细胞的HPLC结果。综合显示敲除结合位点UEBS和DEBS，能够提高由HUDEP-2细胞和CD34+细胞分化而来的细胞中胎儿血红蛋白(HbF)比例。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学
<120> 一种激活红细胞中γ珠蛋白基因表达的方法
<130>
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 188
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gacaaagggc atatattctt gggagttcta gggtgcccca gcccccccag ccaccaccac 60
ctgactgcct ctgctgatgc tttctagaaa gtgccacctc ctggcaggag gccaaccagc 120
acaaaaatag tgcattgaac aaccaaaagt aaggaccctc acagagtcca tttcatcctc 180
tgccacct 188
<210> 2
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aaaacaaaaa acaaaaaaga aagaaagtgc atattctgaa acggtagtga ctgcatttga 60
agtgggacct ttatgatatg atggagccag gcagagatgt tggagaagtt 110
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cccctcgttg ggattttgtg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atgaagatga ttattattgc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gatacaacca cctgctccaa 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ggaacaacca gcggccctcg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tgtgccaaat tctgaggctg 20
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggtcatttca cagaggagga caag 24
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ccaaagctgt caaagaacct ctg 23
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggccctgcgc tattactata 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ccagccaacc ccacatcaa 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gggaaatcgt gcgtgacatt 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggagttgaag gtagtttcgt g 21
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gcacgtggat cctgagaact 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
cactggtggg gtgaattctt 20

Claims (4)

1.（a）～（c）中至少一种在提高造血干细胞分化得到的红细胞中γ珠蛋白基因HBG表达中的应用：
（a）对造血干细胞的转录因子ERF基因启动子区域的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸进行甲基化修饰；
（b）通过基因编辑对造血干细胞的HBG2上游ERF结合位点进行敲除；
（c）通过基因编辑对造血干细胞的HBG1下游ERF结合位点进行敲除；
所述造血干细胞中转录因子ERF基因启动子区域的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的位置包括：chr19: 42760664、chr19: 42760707、chr19: 42760743、chr19: 42760757、chr19:42760764和chr19: 42760789；
所述HBG2上游ERF结合位点的序列如SEQ ID NO.1所示；所述HBG1下游ERF结合位点的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述应用适用于非疾病诊断与治疗目的。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述甲基化修饰用的sgRNA为
ERF1：Cccctcgttgggattttgtg和
ERF2：atgaagatgattattattgc。
3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述通过基因编辑对造血干细胞的HBG2上游ERF结合位点进行敲除为通过sgRNA对HBG2上游ERF结合位点进行敲除，所述sgRNA为UEBSKO：GATACAACCACCTGCTCCAA。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述通过基因编辑对造血干细胞的HBG1下游ERF结合位点进行敲除为通过sgRNA对HBG1下游ERF结合位点进行敲除，所述sgRNA为DEBSKO1：GGAACAACCAGCGGCCCTCG和
DEBS KO2：TGTGCCAAATTCTGAGGCTG。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN116790593B (zh) * 2023-06-28 2024-05-10 贵州医科大学 一种激活γ珠蛋白表达的sgRNA及其CRISPR/Cas9复合体与应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US11345895B2 (en) * 2016-11-18 2022-05-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Induction of arterial-type of hemogenic endothelium (AHE) and enhancement of T cell production from PSCs through overexpression of ETS factors or modulating MAPK/ERK signalling pathways

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DNA甲基化修饰与内源性miRNA对珠蛋白基因表达调控的研究;严忠海;《中国博士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20111215;A006-53，参见全文 *
The Ets2 Repressor Factor (Erf) Is Required for Effective Primitive and Definitive Hematopoiesis;Ioanna Peraki等;《Molecular and Cellular Biology》;20170912;e00183-17，参见全文 *

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