CN116904517A - 增强肝细胞增殖能力或培养肝细胞的方法及其应用 - Google Patents

增强肝细胞增殖能力或培养肝细胞的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供增强肝细胞增殖能力的方法或培养肝细胞的方法及其应用。所述方法包括：将肝细胞中Ubr5基因编码的蛋白表达下调或活性抑制，所述肝细胞是非癌肝细胞。利用该方法可有效诱导并增强肝细胞的增殖能力，肝细胞的扩增数量和传代次数显著提高，并且获得的肝细胞仍保持肝实质细胞的特征；利用该方法可实现体外人肝原代细胞高效、快速、长期扩增，具有广阔的应用前景。

Description

增强肝细胞增殖能力或培养肝细胞的方法及其应用
技术领域
本发明涉及细胞培养领域，特别涉及一种增强肝细胞增殖能力的方法或培养肝细胞的方法及其应用。
背景技术
人的肝脏拥有强大的再生能力，例如肝损伤导致肝质量的损失时，肝脏细胞将代偿性增生以恢复原始肝/体重比。动物实验表明，部分肝脏切除肝脏重量的70％后，剩余肝脏可以短时间内再生以达到其原来的重量(GaubandIversen,1984)。但是，一旦人或者动物的原代肝细胞在体外进行培养，就会迅速失去肝脏的代谢能力(Marchetal.,2015)，并且原代肝细胞的扩增能力也十分有限。长久以来，对于肝脏失能(肝炎、酒精、胆汁积淤性肝硬化等)患者，整肝移植成为唯一治疗手段。然而肝脏供体来源严重不足，获得大量的具有功能的肝实质细胞是再生医学亟待解决的难题。
亟需开发高效、快速、长期的体外人肝原代细胞扩增方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供一种增强肝细胞增殖能力的方法或培养肝细胞的方法及其应用，利用该方法可有效诱导并增强肝细胞的增殖能力，肝细胞的扩增数量和传代次数显著提高，并且获得的肝细胞仍保持肝实质细胞的特征，利用该方法可实现体外人肝原代细胞高效、快速、长期扩增，具有广阔的应用前景。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
发明人创造性地发现，在非癌肝细胞中，抑制其Ubr5蛋白的表达和活性，进一步通过基因工程手段改造得到的肝细胞(比如人原代肝细胞)，其增殖能力显著增强。具体地，细胞扩增数量和传代次数显著提高，可实现高效、快速、长期的体外肝细胞(比如人原代肝细胞)扩增。
进一步的试验结果表明：经本发明的方法获得的肝细胞，其可在体内或体外传代至少10代，且每次传代扩增的细胞数量可提高至10倍左右。
因此，在本发明的第一方面，本发明提供了一种增强肝细胞增殖能力的方法或培养肝细胞的方法。所述方法包括：将肝细胞中Ubr5基因编码的蛋白表达下调或活性抑制，所述肝细胞是非癌肝细胞。利用该方法可有效诱导肝细胞的增殖能力，肝细胞的扩增数量和传代次数显著提高，并且所得肝细胞仍保持肝实质细胞的特征。由此，实现了体外人肝原代细胞高效、快速、长期扩增。
示例性地，本发明Ubr5蛋白表达下调或活性抑制的方法，包括不限于：基因沉默或敲除、使用本领域已知的抑制Ubr5蛋白表达或活性的其他方法或试剂处理肝细胞(例如原代肝细胞)。由此，实现有效诱导并增强肝细胞增殖能力、培养收获肝细胞的目的。
根据本发明的实施例，将所述肝细胞中的Ubr5基因沉默或敲除。
根据本发明的实施例，将具有沉默或敲除肝细胞Ubr5基因活性的作用的核酸或包含其的核酸构建物引入所述肝细胞，所述核酸靶向Ubr5基因。
示例性地，本发明将所述核酸引入细胞的方法，包括不限于：磷酸钙沉淀法、脂质转染法、粒子轰击法、微注射法、电穿孔法，或使用DNA和RNA载体的方法，或使用胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠，或基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。
根据本发明的实施例，所述核酸包含：shRNA、siRNA和sgRNA中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述shRNA具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有沉默Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述siRNA具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有沉默Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述sgRNA具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有敲除Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述shRNA具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述siRNA具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述sgRNA具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述核酸构建物是病毒载体。
根据本发明的实施例，所述病毒载体是非致病性病毒载体。
根据本发明的实施例，所述非致病性病毒载体任选自逆转录病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒I载体、慢性毒载体、腺病毒载体和腺病毒相关病毒载体之一。
根据本发明的实施例，所述非致病性病毒载体是慢病毒载体。
根据本发明的实施例，所述肝细胞扩增数量和/或传代次数增加。
根据本发明的实施例，所述肝细胞是哺乳动物肝细胞。
根据本发明的实施例，所述肝细胞是非成熟肝细胞。
根据本发明的实施例，所述肝细胞是原代肝细胞或其衍生细胞。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种分离的核酸。所述核酸靶向Ubr5基因，具有沉默或敲除肝细胞Ubr5基因活性的作用，所述肝细胞是非癌肝细胞。
根据本发明的实施例，所述核酸包含：shRNA、siRNA和sgRNA中的至少之一。
根据本发明的实施例，所述shRNA具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有沉默Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述siRNA具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有沉默Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述sgRNA具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有敲除Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列。
包含该核酸的核酸构建物可对Ubr5基因进行沉默或敲除，通过该基因工程手段改造得到的肝细胞，其Ubr5基因编码的蛋白表达下调或活性抑制。由此，细胞增殖能力显著增强，细胞扩增数量和传代次数显著提升，实现高效、快速、长期的体外人肝原代细胞扩增。
根据本发明的实施例，所述shRNA具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述siRNA具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述sgRNA具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
根据本发明的实施例，所述肝细胞是哺乳动物肝细胞。
根据本发明的实施例，所述肝细胞是非成熟肝细胞。
根据本发明的实施例，所述肝细胞是原代肝细胞或其衍生细胞。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种核酸构建物。所述核酸构建物包含本发明第二方面的核酸。所述核酸构建物携带本发明第二方面的核酸，利用该核酸构建物对细胞中的Ubr5基因进行沉默或敲除，获得Ubr5基因编码的蛋白表达下调或活性抑制的工程细胞。
根据本发明的实施例，所述核酸构建物是病毒载体。由此，构建得到的病毒载体可以用于Ubr5基因的沉默或敲除。
根据本发明的实施例，所述病毒载体是非致病性病毒载体。
根据本发明的实施例，所述非致病性病毒载体任选自逆转录病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒I载体、慢性毒载体、腺病毒载体和腺病毒相关病毒载体之一。
根据本发明的实施例，所述非致病性病毒载体是慢病毒载体。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种慢病毒。所述慢病毒包含本发明第二方面的核酸。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种肝细胞。所述肝细胞的Ubr5基因编码的蛋白表达下调或活性抑制，所述肝细胞是非癌肝细胞。
根据本发明的实施例，所述肝细胞通过本发明第一方面的方法获得。
根据本发明的实施例，所述肝细胞包含本发明第二方面的核酸或携带本发明第三方面的核酸构建物或携带本发明第四方面的慢病毒。
根据本发明的实施例，所述肝细胞是哺乳动物肝细胞。在一个或多个实施方案中，经本发明第一方面的方法改造或培养的肝细胞，其Ubr5蛋白表达或活性下调。
根据本发明的实施例，所述肝细胞是非成熟肝细胞。
根据本发明的实施例，所述肝细胞是原代肝细胞或其衍生细胞。
在一些具体的实施方案中，所述原代肝细胞衍生细胞是原代肝细胞经培养例如1-8代后的肝细胞。在一些更具体的实施方案中，优选培养5或7代的肝细胞。
示例性地，所述培养包括使用含HM和/或HIM培养基的培养基孵育。
根据本发明的实施例，所述肝细胞在体内或体外具有成熟能力。由此，成熟的肝细胞表达肝细胞特征标记物或其表达提高。示例性的，所述肝细胞特征标记物包括不限于：自ALB、CYP3A4、SULT1A1、ALDH1A、TTR、MUP。
根据本发明的实施例，本发明的细胞在体内或体外具有增殖性。由此，所述肝细胞的扩增数量和传代次数显著提高。本发明的肝细胞可在体内或体外传代至少10代；所述肝细胞每次传代的细胞数量与所述蛋白的表达或活性未下调的肝细胞相比增加至少10倍。
在一些具体的实施方案中，本发明的肝细胞还可以表达其他蛋白。示例性的，本发明的肝细胞表达Albumin。由此，获得的肝细胞仍保持肝实质细胞的特征。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种细胞制品。所述细胞制品包括：本发明第五方面的细胞及其提取物或根据本发明第一方面的方法获得的细胞及其提取物。
在本发明的第七方面，本发明提供了一种药物组合物。所述药物组合物，包括：本发明第二方面的核酸、本发明第三方面的核酸构建物、本发明第四方面的慢病毒、本发明第五方面的肝细胞、本发明的第六方面的细胞制品或根据本发明第一方面的方法获得的肝细胞或细胞制品。
根据本发明的实施例，进一步包括：药学上可接受的辅料。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对方法、核酸、核酸构建体、细胞、细胞制品等所描述的特征和优点，同样适用于该药物组合物，在此不再赘述。
在本发明的第八方面，本发明提供了一种试剂盒。所述试剂盒，包括：本发明第二方面的核酸、本发明第三方面的核酸构建物、本发明第四方面的慢病毒、本发明第五方面的肝细胞、本发明的第六方面的细胞制品或根据本发明第一方面的方法获得的肝细胞或细胞制品。
根据本发明的实施例，进一步包括：操作手册。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对方法、核酸、核酸构建体、细胞、细胞制品等所描述的特征和优点，同样适用于该试剂盒，在此不再赘述。
在本发明的第九方面，本发明提供了本发明第二方面的核酸、本发明第三方面的核酸构建物、本发明第四方面的慢病毒、本发明第五方面的肝细胞、本发明的第六方面的细胞制品或根据本发明第一方面的方法获得的肝细胞或细胞制品、本发明第七方面的药物组合物或本发明第八方面的试剂盒在制备药物中的用途、在支持肝辅助装置的细胞制品中的应用或在肝脏再生医学中的应用，所述药物用于预防或治疗肝脏疾病。
在本发明的第十方面，本发明提供了本发明第二方面的核酸、本发明第三方面的核酸构建物、本发明第四方面的慢病毒、本发明第五方面的肝细胞、本发明的第六方面的细胞制品或根据本发明第一方面的方法获得的肝细胞或细胞制品、本发明第七方面的药物组合物或本发明第八方面的试剂盒在药物筛选和/或药物检测中的应用。
根据本发明的实施例，所述药物检测是药物清除率检测。
根据本发明的实施例，所述药物检测是药物肝毒性检测。
在一些具体的实施方案中，使候选药物与本发明的细胞、细胞制品或包含其的药物组合物或试剂盒制品接触，以检测细胞和/或细胞制品的变化，并进一步将检测结果作为药物筛选的评价指标。
在一些具体方的实施方案中，使候选药物与本发明的细胞、细胞制品或包含其的药物组合物或试剂盒制品接触，以检测细胞和/或细胞制品药物清除率或药物肝毒性相关考察指标的变化，并进一步将检测结果作为药物研发或质量控制的参考。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为本发明实施例1的转染了lenti-Ubr5-shRNA后的ProliHH细胞，其Ubr5转录及表达水平考察结果图，其中，A图表示采用ProliHH细胞感染表达Ubr5-shRNA的慢病毒后，检测Ubr5的mRNA水平；B图表示采用ProliHH细胞感染表达Ubr5-shRNA的慢病毒后，检测Ubr5的蛋白水平；C图表示采用ProliHH细胞感染表达Ubr5-shRNA的慢病毒后各代细胞计数；
图2为本发明实施例2的肝原代细胞增殖能力和传代数考察结果图，其中，上图：在ProliHH细胞中过表达感染表达Ubr5-shRNA的慢病毒后，第16代的细胞明场图，比例尺：200μm；中图：在ProliHH细胞中过表达感染表达Ubr5-shRNA的慢病毒后，免疫荧光检测Ki67表达情况，比例尺：200μm；下图：在ProliHH细胞中过表达感染表达Ubr5-shRNA的慢病毒后，免疫荧光检测Albumin表达情况，比例尺：200μm；
图3为本发明实施例3的ProliHH细胞药物代谢功能考察结果图，其中，具体包括通过实时定量PCR检测了Ubr5敲降后的肝细胞在给予利福平处理后，对与肝毒性相关的8个基因(CYP3A4、CYP3A7、CYP1B1、CYP2E1、FBXO32、G6PD、RGCC、SULT1C2)的表达水平变化考察结果，n＝3，***p<0.001；
图4为本发明实施例4的ProliHH细胞敲除Ubr5后，Ubr5敲除效率和肝原代细胞增殖能力及传代数考察结果图，其中，A图表示采用ProliHH细胞感染表达Ubr5-sgRNA的慢病毒后，Ubr5蛋白表达水平Western blot检测结果；B图表示采用ProliHH细胞感染表达Ubr5-sgRNA的慢病毒后各代细胞计数。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
术语及定义
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
在本文中，术语“Ubr5”具有本领域常规定义，它们可以是人源蛋白或任何物种的同源蛋白，只要其在人肝细胞中保留蛋白功能即可。
发明人通过抑制非癌肝细胞中Ubr5蛋白的表达和活性，诱导并增强了所述肝细胞的增殖能力。进一步实验证明，通过基因工程手段改造得到的本发明的肝细胞(比如人原代肝细胞)，保持肝实质细胞特征，并且其在体内或体外传代至少10代，且每次传代扩增的细胞数量可提高至10倍左右，可实现高效、快速、长期的体外肝细胞(比如人原代肝细胞)扩增。因此，通过本发明的方法可批量获得具备增殖性能的肝细胞。
根据本发明的实施例，本发明的肝细胞在移植后以与原代肝细胞以相当的水平种植到受伤的小鼠肝脏中，在体内移植或体外分化后会成熟，可以进一步用于药物代谢研究(比如药物清除率研究、药物肝毒性研究)、肝病毒感染和肝脏疾病的预防或治疗、支持肝辅助装置的细胞制品的开发以及大规模扩展可移植肝细胞等肝再生医学方案等。因此，本发明的方法具有巨大的临床治疗价值及广阔的应用前景。在本发明的一些实施方案中，Ubr5的表达下调通过在细胞中导入具体核酸构建物实现。所述核酸构建物包含靶向Ubr5基因的、具有沉默或敲除肝细胞Ubr5基因活性的作用的核酸。
根据本发明的实施例，核酸构建物可以是：Ubr5 shRNA；更具体的地，包含SEQ IDNO:1或与其具有至少90％序列相同性的同源物或变体。
根据本发明的实施例，核酸构建物可以是：Ubr5siRNA；更具体的地，包含SEQ IDNO:2或与其具有至少90％序列相同性同源物或变体。
根据本发明的实施例，核酸构建物可以是：Ubr5sgRNA；更具体的地，包含SEQ IDNO:3或与其具有至少90％序列相同性同源物或变体。
本文所述的多核苷酸或分离的核酸可以用合成的方法获得。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀法、脂质转染法、粒子轰击法、微注射法、电穿孔法等等。将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。
将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用病毒载体，特别是逆转录病毒载体。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。可利用本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多反转录病毒系统在本领域中是已知的。慢病毒是逆转录病毒科下的属。慢病毒载体是一种较复杂的逆转录病毒载体。用于慢病毒包装的试剂为本领域所周知，如常规的慢病毒载体系统包括pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G和目的干扰质粒。在本发明的一个实施方案中，使用Lentiv慢病毒载体(Lentiviral vectors)。
除了基因沉默或敲除之外，本发明还包括使用本领域已知的抑制Ubr5蛋白表达或活性的方法或试剂处理原代肝细胞以及如此获得的增殖性肝细胞。本领域技术人员知晓现有技术中可以抑制Ubr5蛋白表达或活性的方法或试剂。
适用于本发明的肝细胞可以是各种来源的各种类型的肝细胞，包括但不限于，肝祖细胞、肝实质细胞、肝非实质细胞(例如肝的内皮细胞、星状细胞、巨噬细胞和淋巴细胞)、胆管细胞、中央静脉旁肝细胞、门静脉旁肝细胞。在某些实施方案中，适用于本发明的肝细胞是获自肝组织的原代肝细胞或其衍生细胞。在某些实施方案中，获得原代细胞后，可先在HIM或HM培养基中进行培养从而获得衍生细胞。本文中，培养了1-8代的原代肝细胞衍生细胞也称为ProliHH细胞。
本文的Ubr5活性下调的肝细胞具有诱导增强的增殖性，并且在体内或体外具有成熟能力。所述肝细胞可传代至少10代。所述肝细胞每次传代的细胞数量与所述蛋白的表达或活性未下调的肝细胞相比增加至少3倍。
本文所述的Ubr5的表达或活性下调的肝细胞在成熟后表达肝细胞特征标记物，与未成熟的肝细胞相比表达增加至少2倍。
根据本发明的实施例，本发所述的肝细胞表达Albumin。
本文中，肝细胞“成熟”表示肝细胞增殖功能减弱、发生肝脏分化、成为高度功能化的细胞。相比于未成熟的肝细胞，成熟的肝细胞的许多功能更强，例如合成与贮存作用、分泌胆汁、解毒、防御、清除外源抗原或病原体、造血等。
本文的Ubr5的表达或活性下调的肝细胞可以响应毒性刺激(例如利福平)而表达肝毒性相关基因。本领域熟知常见的肝毒性相关基因，包括但不限于CYP3A4、CYP3A7、CYP1B1、CYP2E1、FBXO32、G6PD、RGCC、SULT1C2、TUBB2B。检测这些基因的表达方法也是本领域已知的，例如通过检测mRNA来分析表达水平分析。
所述细胞制品还可以是试剂盒，所述试剂盒含有本文所述的肝细胞或其提取物。试剂盒还可含有适用于操作(例如培养、移植、纯化、基因工程、成熟化等)所述肝细胞的各种试剂，以及任选的指导本领域技术人员操作的说明书。
本发明所涉及的序列说明详见表1。
表1核苷酸序列说明表
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。实施例或测试例中，未注明具体条件的实验方法的，均按照常规条件进行。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
需要说明的是，以下实施中所述的“质粒”与“载体”具有相同的意义，可互换使用。
实施例1细胞的制备
在该实施例中，采用如下细胞和培养基制备本发明的细胞。
1)人原代肝细胞购自BiorecalmationIVT，货号JFC、MRW。
2)HIM培养基参考Zhangetal.,2018,CellStemCell23,1–14，自制或外购。
在该实施例中，按照下列方法制备本发明的细胞。
1.1载体构建
设计针对Ubr5基因的shRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)质粒、siRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)和sgRNA(核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示)质粒的构建引物。具体引物序列信息如表2所示。
表2引物序列信息
shRNA质粒采取环形PCR(TOYOBOKOD-plus)的方式构建。PCR完成后加入DpnI酶进行消化，消化完成后直接转化大肠杆菌，挑取单克隆，质粒抽提，测序。sgRNA质粒采取Oligo退火的方式，将两段合成的引物直接通过PCR仪退火形成双链DNA，直接通过T4连接酶连入事先酶切好的载体(这里使用pX330)，转化大肠杆菌，挑取单克隆，质粒抽提，测序。
1.2转染细胞
采用PEI将上述质粒及PMDLg、REV、VSVG质粒在293T细胞中进行慢病毒的包装，收集慢病毒用于感染ProliHH细胞。
细胞构建后Ubr5基因表达考察结果如图1、图4A所示。结果显示：(1)ProliHH细胞感染lentiv-Ubr5-shRNA后，Ubr5表达水平明显下降(图1)。(2)ProliHH细胞感染Ubr5-sgRNA以后，通过Westernblot检测Ubr5敲除效率，Ubr5基因被有效敲除(图4A)。
实施例2敲降Ubr5后，肝原代细胞增殖能力考察
在人肝细胞ProliHH(HH)细胞中敲降了Ubr5基因，构建了shUbr5细胞系。shUbr5细胞以2×104个/cm2的密度接种在胶原I包被的6孔板中用HM培养基单层(2D)培养。细胞置于37℃，低氧(5％O2、5％CO2)培养箱中培养，每2天更换一次培养基，培养6天后，进行细胞计数。
细胞明场图和生长曲线分别如图2(上)和图1C所示。
结果表明：
(1)在ProliHH细胞中敲降Ubr5后有效诱导了ProliHH细胞的增殖能力，将原来ProliHH细胞单层培养的可传代数由5-8代扩展至17代以上，且每次传代扩增的细胞数量由原有的3-4倍增至10倍左右。
(2)采用免疫荧光染色法检测细胞增殖标志物Ki67，如图2(中)所示，相对于对照shRNA，感染了Ubr5shRNA慢病毒的ProliHH细胞中的Ki67染色明显增加。采用免疫荧光染色法检测肝细胞标记物Albumin的表达情况，如图2(下)所示，结果显示感染了Ubr5shRNA慢病毒的ProliHH细胞中的Albumin仍与对照shRNA表达相当，表明感染了Ubr5shRNA慢病毒的ProliHH细胞仍保持肝实质细胞的特征。
实施例3敲降Ubr5后，ProLiHH细胞药物代谢功能考察
评估肝细胞在体内药物代谢功能的主要指标之一是肝毒性相关基因的活性。据此，发明人进一步考察了本发明的肝细胞是否具备药物代谢功能。
感染了Ubr5shRNA慢病毒的ProliHH细胞以2×104个/cm2的密度于胶原I包被的12孔板中单层培养。细胞置于37℃，低氧(5％O2、5％CO2)培养箱中培养，每2天更换一次培养基，培养6天后，采用利福平进行给药处理48小时。给药组利福平浓度为10μM(其中DMSO终浓度≤0.1％)；溶剂对照组为含0.1％DMSO的培养液。
收集上述给药处理后的培养物，采用实时定量PCR进行肝毒性相关基因(CYP3A4、CYP3A7、CYP1B1、CYP2E1、FBXO32、G6PD、RGCC、SULT1C2、TUBB2B)的mRNA表达水平分析。个体基因表达采用基因GAPDH为内参，相对表达量使用比较Ct法(2-ΔΔCt)计算。
结果如图3所示。
结果表明：通过qPCR检测了与人肝毒性相关的9个基因，2D培养的Ubr5-shRNA细胞在给予利福平48小时后，8个肝毒性相关基因(CYP3A4、CYP3A7、CYP1B1、CYP2E1、FBXO32、G6PD、RGCC、SULT1C2)的表达水平与溶剂组相比均显著升高。
上述实验结果显示，本发明的肝细胞具备药物代谢功能，可以进一步作为药物肝毒性相关研究的模型。
实施例4敲除Ubr5后，肝原代细胞增殖能力考察
在该实施例中，发明人敲除了肝细胞中的Ubr5基因，并进一步对其增殖能力进行了考察。
在人肝细胞ProliHH(HH)细胞中感染Ubr5-sgRNA慢病毒，进而敲除了Ubr5基因，构建了Ubr5-KO细胞系。Ubr5-KO细胞以2×104个/cm2的密度接种在胶原I包被的6孔板中用HM培养基单层(2D)培养。细胞置于37℃，低氧(5％O2、5％CO2)培养箱中培养，每2天更换一次培养基，培养6天后，进行细胞计数。
生长曲线如图4B所示。
结果表明：在ProliHH细胞中敲除Ubr5后有效诱导了ProliHH细胞的增殖能力，将原来ProliHH细胞单层培养的可传代数由5-8代扩展至17代以上，且每次传代扩增的细胞数量由原有的3-4倍增至10倍左右。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种增强肝细胞增殖能力的方法或培养肝细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：将肝细胞中Ubr5基因编码的蛋白表达下调或活性抑制，所述肝细胞是非癌肝细胞；
任选地，将所述肝细胞中的Ubr5基因沉默或敲除；
任选地，将具有沉默或敲除肝细胞Ubr5基因活性的作用的核酸或包含其的核酸构建物引入所述肝细胞，所述核酸靶向Ubr5基因；
任选地，所述核酸包含：shRNA、siRNA和sgRNA中的至少之一；
任选地，所述shRNA具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有沉默Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列；
任选地，所述siRNA具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有沉默Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列；
任选地，所述sgRNA具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有敲除Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列；
任选地，所述shRNA具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
任选地，所述siRNA具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
任选地，所述sgRNA具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
任选地，所述核酸构建物是病毒载体；
任选地，所述病毒载体是非致病性病毒载体；
任选地，所述非致病性病毒载体任选自逆转录病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒I载体、慢性毒载体、腺病毒载体和腺病毒相关病毒载体之一；
任选地，所述非致病性病毒载体是慢病毒载体；
任选地，所述肝细胞扩增数量和/或传代次数增加；
任选地，所述肝细胞是哺乳动物肝细胞；
任选地，所述肝细胞是非成熟肝细胞；
任选地，所述肝细胞是原代肝细胞或其衍生细胞。
2.一种分离的核酸，所述核酸靶向Ubr5基因，具有沉默或敲除肝细胞Ubr5基因活性的作用，所述肝细胞是非癌肝细胞；
任选地，所述核酸包含：shRNA、siRNA和sgRNA中的至少之一；
任选地，所述shRNA具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有沉默Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列；
任选地，所述siRNA具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有沉默Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列；
任选地，所述sgRNA具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列或与其具有至少90％序列同源性的、具有敲除Ubr5基因活性的作用的核苷酸序列；
任选地，所述shRNA具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；
任选地，所述siRNA具有如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
任选地，所述sgRNA具有如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；
任选地，所述肝细胞是哺乳动物肝细胞；
任选地，所述肝细胞是非成熟肝细胞；
任选地，所述肝细胞是原代肝细胞或其衍生细胞。
3.一种核酸构建物，其包含：权利要求2所述的核酸；
任选地，所述核酸构建物是病毒载体；
任选地，所述病毒载体是非致病性病毒载体；
任选地，所述非致病性病毒载体任选自逆转录病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒I载体、慢性毒载体、腺病毒载体和腺病毒相关病毒载体之一；
任选地，所述非致病性病毒载体是慢病毒载体。
4.一种慢病毒，其包含：权利要求2所述的核酸。
5.一种肝细胞，其Ubr5基因编码的蛋白表达下调或活性抑制，所述肝细胞是非癌肝细胞；
任选地，所述肝细胞通过权利要求1所述的方法得到；
任选地，所述肝细胞包含权利要求2所述的核酸或携带权利要求3所述的核酸构建物或携带权利要求4所述的慢病毒；
任选地，所述肝细胞是哺乳动物肝细胞；
任选地，所述肝细胞是非成熟肝细胞；
任选地，所述肝细胞是原代肝细胞或其衍生细胞。
6.一种细胞制品，包括：
权利要求5所述的细胞及其提取物或根据权利要求1所述的方法得到的细胞及其提取物。
7.一种药物组合物，其特征在于，包括：
权利要求2所述的核酸、权利要求3所述的核酸构建物、权利要求4所述的慢病毒、权利要求5所述的肝细胞、权利要求6所述的细胞制品或根据权利要求1所述的方法得到的肝细胞或细胞制品；
任选地，进一步包括：药学上可接受的辅料。
8.一种试剂盒，其特征在于，包括：
权利要求2所述的核酸、权利要求3所述的核酸构建物、权利要求4所述的慢病毒、权利要求5所述的肝细胞、权利要求6所述的细胞制品或根据权利要求1所述的方法得到的肝细胞或细胞制品；
任选地，进一步包括：操作手册。
9.权利要求2任一项所述的核酸、权利要求3所述的核酸构建物、权利要求4所述的慢病毒、权利要求5所述的肝细胞、权利要求6所述的细胞制品或根据权利要求1所述的方法得到的肝细胞或细胞制品、权利要求7所述的药物组合物或权利要求8所述的试剂盒在制备药物中的用途、在支持肝辅助装置的细胞制品中的应用或在肝脏再生医学中的应用，所述药物用于预防或治疗肝脏疾病。
10.权利要求2任一项所述的核酸、权利要求3所述的核酸构建物、权利要求4所述的慢病毒、权利要求5所述的肝细胞、权利要求6所述的细胞制品或根据权利要求1所述的方法得到的肝细胞或细胞制品、权利要求7所述的药物组合物或权利要求8所述的试剂盒在药物筛选和/或药物检测中的应用；
任选地，所述药物检测是药物清除率检测；
任选地，所述药物检测是药物肝毒性检测。
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