CN111041001B

CN111041001B - 治疗kras突变型肿瘤的安全型柯萨奇病毒及其药物组合物

Info

Publication number: CN111041001B
Application number: CN201811198654.4A
Authority: CN
Inventors: 吴可行
Original assignee: Shanghai Xingshen Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Xingshen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-10-15
Filing date: 2018-10-15
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2038-10-15
Also published as: CN111041001A

Abstract

本发明提供了治疗KRAS突变型肿瘤的安全型柯萨奇病毒及其药物组合物。本发明提供了一种特异性感染肿瘤细胞的柯萨奇病毒，所述的柯萨奇病毒特异性感染肿瘤细胞，并且所述柯萨奇病毒对正常心肌细胞的感染率F1为野生型柯萨奇病毒3亚型对正常心肌细胞的感染率F0之比R1(F1/F0)≤1/500。本发明的柯萨奇病毒不仅高特异性地感染肿瘤细胞，而对正常细胞几乎无感染，从而大幅降低甚至消除了柯萨奇病毒的心脏毒性。

Description

治疗KRAS突变型肿瘤的安全型柯萨奇病毒及其药物组合物

技术领域

本发明涉及医药领域，更具体地，涉及治疗KRAS突变型肿瘤的安全型柯萨奇病毒及其药物组合物。

背景技术

随着生命科学和医学研究的不断深入，基因治疗已成为癌症靶向治疗的一个重要发展方向，而溶瘤病毒介导的基因治疗则是癌症靶向治疗的一个有效策略。在自然界中，仅少数病毒为自发性溶瘤病毒，而大多数病毒则需进行基因改造方能实现对肿瘤细胞的靶向感染。研究表明：腺病毒、单纯疱疹病毒、肠道病毒和麻疹病毒等已成功通过分子生物学手段改造成具有溶瘤特性的条件复制型病毒，即溶瘤病毒。溶瘤病毒是指选择性感染并杀死肿瘤细胞的一类治疗性病毒。病毒感染初期，部分肿瘤细胞被溶瘤病毒特异性感染而破坏。随后，溶瘤病毒在肿瘤细胞内进行自我复制和增殖，产生并通过溶细胞作用释放大量感染性病毒颗粒，从而起到感染和破坏其他肿瘤细胞的作用。目前，共识认为溶瘤病毒主要通过2种机制破坏肿瘤细胞，其一：病毒直接溶解肿瘤细胞，其二：病毒刺激宿主产生抗肿瘤免疫反应，二者来发挥协同溶瘤功效。

目前对于无法手术的肿瘤的主要治疗方式是系统性化疗以及靶向药物治疗。然而系统性化疗对机体伤害大。靶向治疗较化疗更为安全，效果也高，但仅仅适用于少部分特殊类型的肿瘤。更重要的是，无论是系统性化疗还是靶向药物治疗，均会引发患者肿瘤细胞产生耐药性从而导致失效。

溶瘤病毒疗法是一种新型的针对恶性肿瘤的治疗方法，利用病毒感染并破坏肿瘤细胞，进而起到杀死肿瘤细胞的目的。这种方法在有效的消灭病毒的同时，不会伤及正常的机体细胞，也不易引发耐药性的产生。溶瘤病毒作为一种新兴的抗肿瘤治疗药物，虽然目前无法取代传统治疗方法，但是其为肿瘤治疗提供了一种新兴的治疗方法。溶瘤病毒对肿瘤细胞杀伤效率高、靶向性好、安全性高、副作用小和成本低廉，使得其成为未来最具有潜力和应用前景的恶性肿瘤治疗手段之一。相比于同样新兴的免疫治疗，溶瘤病毒适应症更广；相比于单抗靶向药物，溶瘤病毒价格更低廉。

中国第一个溶瘤病毒药物H101于2005年被中国药监局批准上市，用于治疗头颈部癌、肝癌、胰腺癌、肺癌和恶性胸腹水。Amgen(安进)公司的溶瘤病毒产品T-Vec，于2015年10月取得美国FDA批准，同年12月取得欧盟CHMP的许可，用于治疗病灶在皮肤和淋巴结的黑色素瘤。预计T-Vec销售额为3.88亿美元/年。除去T-Vec，现在有另外三个溶瘤病毒产品进入了三期临床，分别为：治疗头颈部癌症的Reolysin、治疗膀胱癌的CG0070、治疗前列腺癌的ProstAtak^TM和治疗肝癌的PexaVec。

癌症药物市场巨大，其中肺癌将是最近几年的主要市场。国家癌症中心公布的最新数字显示，全国恶性肿瘤发病率为270.59/10万，死亡率为163.83/10万。全国恶性肿瘤发病及死亡第1位的是肺癌，每年约59.1万人死于肺癌。随着我国城市人口老龄化的进展以及生活水平提高，这一数字在可以预期的将来会一直上升。

然而，一些肿瘤药物体现出一些明显的副作用，尤其是某些候选的治疗剂(如野生型柯萨奇病毒)表现出具有一定的或严重的心脏毒性，这导致这类治疗剂无法安全施用。

因此，本领域迫切需要开发对高效、安全的肿瘤治疗药物。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效、安全的肿瘤治疗药物及其制法和应用。

在本发明的第一方面，提供了一种特异性感染肿瘤细胞的柯萨奇病毒，所述的柯萨奇病毒特异性感染肿瘤细胞，并且所述柯萨奇病毒对正常心肌细胞的感染率F1为野生型柯萨奇病毒3亚型对正常心肌细胞的感染率F0之比R1(F1/F0)≤1/500。

在另一优选例中，所述的R1≤1/1000，更佳地≤1/5000，最佳地≤1/10000。

在另一优选例中，所述的R1为1/1000000～1/500，较佳地1/100000～1/10000。

在另一优选例中，对正常心肌细胞感染率F为柯萨奇病毒导致所述心肌细胞死亡时的最低MOI的倒数，即F＝1/MOI。

在另一优选例中，所述的肿瘤为具有Kras突变的肿瘤。

在另一优选例中，所述的Kras突变的肿瘤选自下组：肺癌、胰腺癌、肠癌、卵巢癌、和宫颈癌。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括肺癌，优选非小细胞肺癌(NSCLC)。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括KRAS突变型NSCLC。

在另一优选例中，所述肿瘤细胞和所述的心肌细胞来自同一种哺乳动物。

在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物包括啮齿动物、和非人灵长动物。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞为人肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞为人肺癌细胞，优选NSCLC的肺癌细胞。

在另一优选例中，所述的心肌细胞为人的心肌细胞。

在另一优选例中，所述的柯萨奇病毒为B组3亚型。

在另一优选例中，所述的柯萨奇病毒为柯萨奇病毒B组3亚型Woodruff株。

在另一优选例中，所述的柯萨奇病毒通过结合于肿瘤细胞表面的受体(例如CAR受体)进入肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述的柯萨奇病毒包括原代和传代的柯萨奇病毒。

在另一优选例中，所述的传代包括传代次数为1-200的传代。

在另一优选例中，所述的柯萨奇病毒的基因组中整合有一个或多个心肌miRNA靶向序列。

在另一优选例中，所述的心肌miRNA靶向序列位于柯萨奇病毒基因组的3'-UTR、5’-UTR、或其组合。

在另一优选例中，所述的柯萨奇病毒基因组中整合有多个心肌miRNA靶向序列。

在另一优选例中，在所述基因组中，至少两个心肌miRNA靶向序列是相邻排列的。

在另一优选例中，所述的相邻排列指在两个心肌miRNA靶向序列之间没有结构蛋白的编码序列。

在另一优选例中，在所述基因组中，当含有两个或多个心肌miRNA靶向序列时，两个心肌miRNA靶向序列之间的间隔区域为0-200nt，较佳地0-100nt，更佳地1-50nt。

在另一优选例中，所述的心肌miRNA靶向序列(单链序列)位于柯萨奇病毒的+链基因组序列中，和/或位于所述基因组序列的RNA转录本(即位于“-链RNA”)上。

在另一优选例中，所述的柯萨奇病毒的基因组中整合有一个或多个心肌miRNA靶向序列的互补序列。

在另一优选例中，当所述的柯萨奇病毒的基因组(即“+链基因组”)经转录形成一转录的RNA(即即“-链RNA”)时，则在所述转录的RNA上，形成对应的所述的miRNA靶向序列。

在另一优选例中，所述的心肌miRNA靶向序列和/或其互补序列位于柯萨奇病毒基因组的3'-UTR、5’-UTR、或其组合。

在另一优选例中，(a)所述的心肌miRNA靶向序列(或第一miRNA靶向序列)所针对的第一miRNA，与(b)源自心肌miRNA靶向序列的互补序列的心肌miRNA靶向序列(或第二miRNA靶向序列)所针对的第二miRNA，是不同的。

在另一优选例中，(a)所述的心肌miRNA靶向序列(或第一miRNA靶向序列)所针对的第一miRNA，与(b)源自心肌miRNA靶向序列的互补序列的心肌miRNA靶向序列(或第二miRNA靶向序列)所针对的第二miRNA，是相同或部分相同的。

在另一优选例中，与所述的心肌miRNA靶向序列互补结合的miRNA是心肌细胞特有的miRNA。

在另一优选例中，所述的“心肌细胞特有”指所述miRNA在心肌细胞中的数量A1与所述miRNA在癌症细胞或组织(如肺癌细胞)中的数量A0之比(即A1/A0)≥5，较佳地≥10，更佳地≥50。

在另一优选例中，所述的“心肌细胞特有”是心肌细胞存在的但肺癌细胞中低表达或不存在的miRNA。

在另一优选例中，与所述的心肌miRNA靶向序列互补结合的miRNA是心肌细胞高表达的miRNA。

在另一优选例中，所述的“心肌细胞高表达”指所述miRNA在一个心肌细胞中拷贝数≥50，较佳地≥500，更佳地≥1000，最佳地≥5000。

在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述的药物组合物含有本发明第一方面所述的特异性感染肿瘤细胞的柯萨奇病毒以及药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为液态或固态。

在另一优选例中，所述的药物组合物为冻干制剂。

在另一优选例中，所述的冻干制剂可重构为液体制剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物(或重构的液体制剂)中，所述柯萨奇病毒的含量为1×10³～1×10¹⁰个/ml，较佳地1×10⁴～1×10⁹个/ml，更佳地1×10⁵～1×10⁸个/ml。

在另一优选例中，所述的药物组合物中含有缓冲液和辅料。

在另一优选例中，所述的缓冲液包括：磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、氨基酸盐缓冲液。

在另一优选例中，所述的药物组合物还含有额外的肿瘤治疗剂。

在另一优选例中，所述的额外的肿瘤治疗剂选自下组：化疗药物、靶向药物、单抗药物、生物制品、免疫治疗药物、细胞治疗药物(如CAR-T细胞)。

在另一优选例中，所述肿瘤治疗剂选自下组：CTLA-4单抗、PD-1单抗或PDL-1单抗、TIM3单抗、CD47抑制剂、LAG3抑制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤治疗剂选自下组：PD-1单抗或PDL-1单抗。

在本发明第三方面，提供了一种药盒，包括：

(a)第一容器，所述的第一容器中含有第一药物组合物，所述的第一药物组合物含有本发明第一方面所述的特异性感染肿瘤细胞的柯萨奇病毒以及药学上可接受的载体；和

(b)任选的第二容器，所述的第二容器中含有第二药物组合物，所述的第二药物组合物含有额外的肿瘤治疗剂以及药学上可接受的载体。

在本发明第四方面，提供了本发明第一方面所述的特异性感染肿瘤细胞的柯萨奇病毒的用途，用于制备治疗肿瘤的药物。

在另一优选例中，所述的肿瘤是具有Kras突变的肿瘤。

在另一优选例中，所述的肿瘤包括KRAS突变型NSCLC。

在本发明第五方面，提供了一种治疗肿瘤的方法，包括步骤：给需要治疗的对象施用本发明第一方面所述的特异性感染肿瘤细胞的柯萨奇病毒。

在另一优选例中，所述的对象为人。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

无

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种结构新颖的柯萨奇病毒，本发明的柯萨奇病毒可以高特异性地感染肿瘤细胞，而对正常细胞几乎无感染，尤其是对于心肌细胞的几乎无感染，从而大幅降低甚至消除了柯萨奇病毒的心脏毒性。此外，本发明的柯萨奇病毒对于KRAS基因突变型的肿瘤细胞具有出乎意料的优异治疗效果，不仅可以大幅缩小肿瘤体积，甚至可以取得完全响应(CR)的治疗效果。在此基础上完成了本发明。

实验表明，在NSCLC模型中，本发明柯萨奇病毒在KRAS突变型肿瘤细胞组中的治疗效果远远优于在非KRAS突变型(如EGFR突变型)肿瘤细胞组中的治疗效果，且安全性非常高。

柯萨奇病毒

柯萨奇病毒(Coxsackievirus)是一种肠病毒(enterovirus)，分为A和B两类，是一类常见的经呼吸道和消化道感染人体的病毒，感染后人会出现发热、打喷嚏、咳嗽等感冒症状。病毒为单股正链小RNA病毒，基因长度7.4kb，其中碱基(G+C)含量约为47％。两端为保守的非编码区，中间为编码区。5'端共价结合一小分子蛋白质Vpg(约7kDa)，与病毒RNA合成和基因组装配有关；3'端带有polyA尾。编码区编码的病毒结构蛋白VP1～VP4中，VP1、VP2和VP3均暴露在病毒衣壳的表面，有中和抗原位点；VP4位于衣壳内部，一旦病毒VP1与受体结合后，VP4即被释出，衣壳松动，病毒基因组脱壳穿入。

在本发明中，改造柯萨奇B3病毒(coxsackievirus group B type 3,CVB3)在动物模型试验中对肺癌展示了很好的疗效。

柯萨奇病毒的基因组序列是已知的，可参见登录号U57056.1。在柯萨奇病毒的基因组序列中，在约第7100位至第7200位的区域为优选地适合插入一个或多个心肌miRNA靶向序列的3'非翻译区。

典型地，本发明提供了一种对柯萨奇病毒B3进行改造，从而制备本发明柯萨奇病毒的方法，包括：通过在野生型柯萨奇病毒(如B组3型Woodruff株)3'端非翻译区内插入特定的核酸构建物(如抑制性RNA或非编码RNA互补序列)，从而显著降低对心肌细胞的心脏毒性。

在本发明中，一种优选的柯萨奇病毒是基于Woodruff株进行基因改造的。Woodruff株的基因组序列可市售获得，也可通过从头合成的方法制备。

Kras突变

KRas致癌基因编码KRas致癌蛋白，其在促进细胞生长中发挥重要作用。KRas蛋白活性被严格控制，在特定的时间“打开”和“关闭”。如果KRas蛋白一直被“打开”，则细胞生长就会失去控制，从而引起肿瘤。

一种代表性的Kras突变是KRas基因密码子12/13突变。研究表明，KRas基因密码子12和密码子13的突变可以导致KRas蛋白的组成型(constitutive)激活，即，KRas蛋白现在被锁定在“持续打开”的状态(Yamamoto，F.and M.Perucho，人c-K-ras致癌基因的激活，核酸研究杂志Nucleic Acids Res，1984年，12(23)：第8873-85页，通过参照并入本文)。KRas基因密码子12/13突变已经被认为至少是人类癌症的致病因素之一，经常在胰腺癌、结直肠癌(CRC)和其他一些癌症中被检测到(Bos，JL，ras致癌癌基因与人类癌症：综述。癌症研究Cancer Res，1989年。49(17)：第4682-9页，通过参照并入本文)。

心肌miRNA靶向序列

如本文所用，术语“心肌特异保护性序列”、“心肌细胞特异保护性序列”、“心脏特异保护性序列”可互换使用，指本发明中的心肌miRNA靶向序列。应理解，所述术语也包括可以产生心肌miRNA靶向序列的互补序列，因为一旦发生转录，则对应于所述的互补序列会形成一相应的心肌miRNA靶向序列。

在本发明中，所述的心肌miRNA靶向序列为核酸序列，优选为RNA序列。

在本发明中，由于心肌miRNA靶向序列位于柯萨奇病毒的基因组上，因此，一旦柯萨奇病毒进入心肌细胞，那么柯萨奇病毒基因组(或转录后的RNA)上的心肌miRNA靶向序列就会与心肌细胞中已存在的相应miRNA发生互补结合，从而引发RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex,RISC)对柯萨奇病毒RNA的切割效应，从而显著降低或消除心肌毒性。

在本发明的一个优选例中，本发明将心肌miRNA靶向序列整合入柯萨奇病毒基因组3'端非翻译区内。

miRNA及其与心肌miRNA靶向序列的结合

miRNAs是一类小的非编码RNA，通过翻译抑制或mRNA降解负调控特定mRNA的蛋白表达。一般来说，miRNA在正常组织和癌症中差异表达，因为这些miRNA的靶标显着富集于肿瘤抑制因子和癌基因。因此，miRNA在肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。

在本发明中，利用预先存在于正常细胞(尤其是心肌细胞)中的miRNA作为引发的抗病毒防御调节剂。

在本发明中，利用病毒的自我复制过程，将心肌特异保护性序列导入肿瘤细胞，从而显著限制或消除柯萨奇病毒在心肌细胞中的复制能力。此外，本发明还可进一步降低或消除柯萨奇病毒在其他一些正常组织中的瘤外复制能力，从而进一步保护正常组织免受病毒攻击。不仅显著提高了柯萨奇病毒治疗的靶向性，更显著降低或消除了针对心脏的副作用。

实验结果表明，本发明的改造型病毒具有安全性高和抗肿瘤效果明显的优势，是临床治疗非小细胞型肺癌的理想药物。

在本发明中，在基因组中含有特定的心肌miRNA靶向序列(和/或其互补序列)的溶瘤病毒(OV)，可以被选择性地限制在肿瘤细胞中进行复制，从而提高疗效并显著降低心肌毒性。

典型地，在本发明的一个实例中，将心肌miRNA靶向序列整合到CVB3基因组中，可以在特异性表达同源miRNA的正常组织(尤其是心肌组织)中根除这些病毒，而在期望的靶细胞(如肿瘤细胞，尤其是肺癌细胞)中保留了病毒的复制能力。本发明结果表明，本发明的柯萨奇病毒可以非常有效地靶向肿瘤细胞而不靶向正常组织(尤其是心脏组织)。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明的柯萨奇病毒不仅靶向肿瘤细胞，而且可高效地杀灭肿瘤细胞，尤其是非小细胞肺癌细胞。

(b)本发明的柯萨奇病毒具有非常高的安全性，不靶向或基本上不靶向正常组织。

(c)本发明的柯萨奇病毒具有显著降低的或基本上无心脏毒性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1

柯萨奇病毒的制备

1.1序列合成和质粒构建：

采用人工合成方法合成对应于表1所示的心肌miRNA靶向序列的DNA序列：

表1心肌miRNA靶向序列的DNA序列

采用含有Sfi I位点，人工3C^pro/3CD^pro切割位点和编码CVB3(Wodrolf株)的全长cDNA的pMKS1质粒(可获知J.Lindsay Whitton(The Scripps Research Institute，LaJolla，California))。该质粒中SfiI位点用作接受克隆位点，用于插入合适的寡核苷酸序列。

通过PCR产生获得含三个miRNA(分别记为miR-A，miR-B和miR-C)互补序列(即心肌miRNA靶向序列)，将其连续地并入pMKS1的3'UTR，产生质粒pMKS1-A-B-C(CVB3-miRNA)。将对所得质粒进行完全测序，测序结果表明质粒序列与预期结果相符。

在本实施例中，分别制备了柯萨奇病毒No.1、No.2、No.3、No.4。

表2柯萨奇病毒

其中，在柯萨奇病毒基因组中，含整合的心肌miRNA靶向序列的序列区域结构如下：

GAGAGGTTAAAACATTACAATTCATTGTTAAATTGAATACAACAAAATGGGGGCCGGAGGGGCC-X1- X2-X3-GGCCGGAGGGGCCGGAGGGGGTGGAGCTTTATTTCAAGGAGCTCAAGTA(SEQ ID No.:7)

其中，“-X1-X2-X3-”表示串联的“miR-A，miR-B和miR-C”。

1.2转染和制备重组CVB3

获得质粒用于HeLa细胞转染，获得初代病毒。HeLa传代铺于6-孔板中，利用DMEM+10％FBS胎牛血清进行细胞培养，待细胞密度达到80％后可用于质粒转染实验。

转染前先用PBS对细胞进行洗涤，再加入Opti-MEM转染试剂。

质粒转染浓度选用4ug/孔，Lipofectamine2000浓度选用4ul/孔。质粒与转染试剂分别加入含50ul Opti-MEM的EP管内，在常温下静置5分钟，随后将分别含有病毒质粒的Opti-MEM与含有Lipofectamine2000转染试剂的Opti-MEM进行混合。在常温下静置20分钟。然后将混合液100ul/孔加入6-孔板中。将细胞移回细胞培养箱进行孵育。4小时后，弃去Opti-MEM溶液，更换为DMEM+10％FBS，继续细胞培养箱内进行孵化。24小时后观察细胞形态，等到细胞全部悬浮或变成细胞碎片，收集上清液进行低速离心，去除细胞碎片。所得病毒进行二轮扩增，6孔板中每孔加入5ul，24小时孵育后按以上步骤进行病毒收集。

使用10PFU/细胞的MOI在HeLa细胞上纯化和扩增病毒以产生工作原种。

1.3病毒纯化与滴度测定

将病毒溶液进行梯度稀释(10倍)共设10个梯度，将不同浓度的病毒溶液加入细胞密度为100％的HeLa细胞中，细胞孵育箱中孵育1小时后，去除病毒溶液，并在每孔中加入琼脂糖凝胶DMEM溶液2ml，并继续于细胞培养箱中孵育72小时，待噬菌斑出现后，收集大小约为5mm的噬菌斑，并将该菌斑所覆盖的琼脂转移至密度为100％的HeLa细胞中，进行病毒扩增。待48小时后，细胞全部死亡后，收集细胞上清液，低速离心后，获得纯化后病毒。病毒序列进行测序，确保所获得病毒的正确性。

病毒滴度测试如下进行：将纯化后的病毒进行Plaque assay检测，确定病毒滴度。

1.4体外细胞实验

分别选用10种细胞系(包括2种正常细胞系作为阴性对照，以及8种肺癌细胞系)，细胞予6孔盘中生长，待细胞密度达90％后，分别按3种病毒滴度加入病毒(MOI 0.1，MOI1和MOI10)，分别予24小时和48小时观察细胞形态，并利用光镜显微镜进行照片拍摄。48小时后，收集细胞上清液，进行MTS检测，利用酶标记录仪检于波长490nm处检测吸收光值，计算细胞存活率。对于尚贴壁的肿瘤细胞，进行结晶紫染色，计算紫染区域面积。

结果如表3所示。本发明的柯萨奇病毒对于肿瘤细胞有一定杀伤，尤其是对于KRAS突变型NSCLC有非常优异的杀伤力，几乎可以全部杀灭。

此外，针对肿瘤细胞的杀伤效果呈现剂量依赖性。

表3

细胞系	类型	结果(MOI＝0.1)
			HPL1D	正常肺细胞	病毒无复制，细胞存活
BEAS2B	正常肺细胞	病毒无复制，细胞存活
			A549	KRAS突变型NSCLC	病毒有复制，细胞存活率≤1％
H2030	KRAS突变型NSCLC	病毒有复制，细胞存活率≤1％
			H23	KRAS突变型NSCLC	病毒有复制，细胞存活率≤1％
H1299	肺癌细胞	病毒有复制，细胞存活率≤5％
			H3255	EGFR突变型NSCLC	病毒有复制，细胞存活率为约40-50％
H1975	EGFR突变型NSCLC	病毒有复制，细胞存活率为约40-50％
			PC9	EGFR突变型NSCLC	病毒有复制，细胞存活率为约40-50％
HCC4006	EGFR突变型NSCLC	病毒有复制，细胞存活率为约40-50％

实施例2

病毒的表征

2.1病毒的生长特性

对于病毒一步生长曲线，按照如下方法进行测定：

a)接种HeLa细胞形成单层后，用实施例1得到的病毒CVB3感染HeLa细胞；

b)病毒感染细胞放置于37℃5％CO₂孵育箱中，于不同时间点，收集细胞上清液，对病毒滴度进行检测；

c)绘制病毒梯度随培养时间的变化曲线，即一步生长曲线。

CVB3为溶细胞病毒，在细胞培养上清中其子代病毒出现的越早，滴度上升越快，滴度越高，说明敏感细胞存活率越低，相应的柯萨奇病毒变异株溶细胞能力越高。

2.2细胞毒性试验

将不同种肿瘤细胞接种于12孔板中，待细胞密度达90％时，于上清液中加入重组型病毒CVB3，于不同时间点通过光镜对细胞形态进行观察。待细胞形态发生病理化改变时，注意时间点，增加观测频率。收集细胞上清液，对上清液中的病毒进行滴度测试；

细胞培养皿中尚存活细胞经PBS洗涤后，加入MTS，于37℃5％CO₂孵育箱中孵育2小时，取上清液加入96-孔酶标板中，于490波长处进行酶标测定，根据获得结果，计算细胞存活率，细胞存活率直接反应溶瘤细胞杀肿瘤特性；

对附着于细胞培养皿底部的活细胞进行龙胆紫染色，评估染色区面积。

2.3在动物中评价对肿瘤的疗效和对心脏的安全性

免疫缺陷裸鼠构建，于免疫缺陷小鼠后背两侧皮下注射肿瘤细胞，待肿瘤细胞长至合适大小，于瘤体内注射重组CVB3，观察小鼠负载肿瘤大小，评估小鼠全身症状，利用动物心脏评估系统，评估小鼠心脏功能与心脏大小，绘制肿瘤大小随时间变化曲线；

按设定试验终点结束试验，收集小鼠后背两侧的肿瘤移植物进行病毒滴度测定，对肿瘤移植物行原位(in situ)染色，确定重组病毒RNA，利用ki67和cleaved caspase-3对肿瘤移植物进行IHC染色，评估阳性细胞数目。Ki67和cleaved caspase-3作为细胞增殖与凋亡的重要分子标记，可反映肿瘤移植物对于重组病毒的易感程度。

此外，收集小鼠心脏，评估重组CVB3对心脏的细胞毒性。评估心脏的心腔面积，评估是否存在器质性改变；

此外，对小鼠心脏匀浆，并进行病毒滴度测定；

此外，对心脏切片进行原位(in situ)检测，确定CVB3-RNA。

2.4结果

本发明的柯萨奇病毒No.1至No.4在正常心肌细胞中几乎无感染，其中，柯萨奇病毒No.1最佳，柯萨奇病毒No.4次优。

实施例3

柯萨奇病毒的性能测试

3.1蛋白质印迹法：

为了进一步评估本发明柯萨奇病毒是否能够抑制正常细胞系中的病毒蛋白质合成，同时不限制PC细胞中的病毒复制，通过蛋白质印迹分析确定病毒蛋白1(VP1)和切割的caspase-3(细胞死亡一种标记物)的蛋白质表达水平。将收集CVB3-miRNA感染的细胞并裂解。简言之，等量的蛋白质将经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转移到硝酸纤维素膜上。所产生的膜将与VP1、切割的Caspase-3和β-actin的一级抗体一起孵育。VP1和切割的caspase-3的蛋白质水平将通过使用NIH ImageJ的光密度分析来定量，然后归一化为β-actin。

结果表明，本发明柯萨奇病毒对心肌细胞几乎无感染。

3.2裸鼠皮下肿瘤异种移植模型：

将肺癌细胞A549(5×10⁶)皮下(s.c.)单侧或双侧植入裸鼠的侧腹。在单侧异种移植实验中，肿瘤将在第2,4,6,8和10天接种实施例1制备的柯萨奇病毒No.1(5×10⁵PFU)。在双侧异种移植实验中，小鼠将每隔一天仅在右侧接受一系列多次瘤内注射柯萨奇病毒No.1(5×10⁵PFU)，持续20天。等量的UV照射的CVB3或野生型CVB3将用作对照。通过确定肿瘤的最长直径和宽度去计算肿瘤体积(V＝0.5L*W²)，每隔一天测量肿瘤的大小。所有实验动物的状况将每天监测和记录两次。

结果表明，本发明柯萨奇病毒可以在体内有效抑制肺癌细胞的生长,抑瘤率均≥90％，部分小鼠表现出完全缓解(CR)。

3.3对正常组织的感染

考虑到CVB3的组织易感性，需要测试CVB3-miRNA是否能够在心脏、胰腺和脑内有效复制，分别导致心肌炎、胰腺炎和脑膜炎。实验结束时，将收集包括胰腺、心脏、肝脏、脾脏、肺脏和大脑在内的器官和肿瘤。将固定的组织与地高辛标记的病毒链特异性核糖体(反义链，核苷酸888至7127)杂交，然后用碱性磷酸酶偶联的抗地高辛抗体和彩色底物VectorRed检测杂交核糖体。ImagePro Plus软件将用于定量染色，结果将表示为阳性染色占整个截面积的百分比。

结果表明，本发明的柯萨奇病毒No.1至4在正常心肌细胞中几乎感染，其中，所述柯萨奇病毒对正常心肌细胞的感染率F1为野生型柯萨奇病毒3亚型对正常心肌细胞的感染率F0之比R1(F1/F0)均小于1/5000。

此外，在胰腺和脑组织等正常中也几乎检测不到柯萨奇病毒感染。这提示，本发明柯萨奇病毒具有极高的安全性，尤其是具有显著降低的心脏毒性。

实施例4

心肌毒性测定

在本实施例中，进一步比较野生型柯萨奇病毒3亚型和本发明柯萨奇病毒的心肌毒性差异。

方法：将常规的心肌细胞HL1种植于12孔板中，待细胞密度达到80％以上，在细胞培养液中加入野生型的柯萨奇病毒3亚型Woodruff株以及实施例1中制备的柯萨奇病毒No.1。按时间点获取细胞，利用光镜观察细胞形态变化，并按时间点收集上清液留做噬斑实验。并选用MTS实验检验细胞存活效率。细胞在实验终点收集，裂解细胞，获取细胞蛋白质进行免疫电泳实验。获取与凋亡相关蛋白的蛋白条带，确定病毒对心肌的毒副作用。

实验结果如表4所示。结果表明，本发明的柯萨奇病毒具有极低的心脏毒性。

表4心肌细胞的存活率

MOI	野生型柯萨奇病毒3亚型	柯萨奇病毒No.1
			0.01	≤20％	≥95％
0.1	≤20％	≥95％
			1	≤20％	≥95％
10	≤20％	≥95％

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 吴, 可行

<120> 治疗KRAS突变型肿瘤的安全型柯萨奇病毒及其药物组合物

<130> P2018-1633

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 93

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgctggcgac gggacattat tacttttggt acgcgctgtg acacttcaaa ctcgtaccgt 60

gagtaataat gcgccgtcca cggcattagc ctc 93

<210> 2

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccgggaccca gttcaagtaa ttcaggatag gttgtgtgct gtccagcctg ttctccatta 60

cttggctcgg ggaccggcag caat 84

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgggaaacat acttctttat atgcccatat ggacctgcta agctatggaa cgta 54

<210> 4

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caccttgtcc tcacggtcca gttttcccag gaatccctta gatgctaaga tggggattcc 60

tggaaatact gttct 75

<210> 5

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtgtattcta cagtgcacgt gtctccagtg tggctcggag gctggagacg cgg 53

<210> 6

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgtgatcact gtctccagcc tgctgaagct cagagggctc tgattcagaa agatcatcgg 60

atccgtctga gcttggctgg tcggaagtct catcatcagt acctc 105

<210> 7

<211> 116

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (65)..(67)

<223> 3个n为串联的miR-A，miR-B和miR-C

<400> 7

gagaggttaa aacattacaa ttcattgtta aattgaatac aacaaaatgg gggccggagg 60

ggccnnnggc cggaggggcc ggagggggtg gagctttatt tcaaggagct caagta 116

Claims

1.一种特异性感染肿瘤细胞的柯萨奇病毒，其特征在于，所述的柯萨奇病毒特异性感染肺癌细胞，并且所述柯萨奇病毒对正常心肌细胞的感染率F1为野生型柯萨奇病毒3亚型对正常心肌细胞的感染率F0之比R1(F1/F0)≤1/500，

其中，所述柯萨奇病毒基因组中整合有心肌miRNA靶向序列，所述心肌miRNA靶向序列选自直接连接的：

1）SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3；

2）SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；

3）SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；或

4）SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.5。

2.如权利要求1所述的柯萨奇病毒，其特征在于，所述的R1≤1/1000。

3.如权利要求1所述的柯萨奇病毒，其特征在于，所述的R1≤1/5000。

4.如权利要求1所述的柯萨奇病毒，其特征在于，所述的R1≤1/10000。

5.如权利要求1所述的柯萨奇病毒，其特征在于，所述的肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)。

6.如权利要求1所述的柯萨奇病毒，其特征在于，所述的肺癌为Kras突变型NSCLC。

7.如权利要求1所述的柯萨奇病毒，其特征在于，所述的柯萨奇病毒为B组3亚型。

8.如权利要求1所述的柯萨奇病毒，其特征在于，所述的柯萨奇病毒为柯萨奇病毒B组3亚型Woodruff株。

9.如权利要求6所述的柯萨奇病毒，其特征在于，所述的心肌miRNA靶向序列或互补序列位于柯萨奇病毒基因组的3'-UTR、5’-UTR、或其组合。

10.如权利要求1所述的柯萨奇病毒，其特征在于，与所述的心肌miRNA靶向序列互补结合的miRNA是心肌细胞特有的miRNA，所述的“心肌细胞特有”指所述miRNA在心肌细胞中的数量A1与所述miRNA在肺癌细胞中的数量A0之比(即A1/A0)≥5。

11.如权利要求10所述的柯萨奇病毒，其特征在于，所述A1/A0≥10。

12.如权利要求10所述的柯萨奇病毒，其特征在于，所述A1/A0≥50。

13.如权利要求1所述的柯萨奇病毒，其特征在于，与所述的心肌miRNA靶向序列互补结合的miRNA是心肌细胞高表达的miRNA，所述的“心肌细胞高表达”指所述miRNA在一个心肌细胞中拷贝数≥50。

14.如权利要求13所述的柯萨奇病毒，其特征在于，所述的“心肌细胞高表达”指所述miRNA在一个心肌细胞中拷贝数≥500。

15.如权利要求13所述的柯萨奇病毒，其特征在于，所述的“心肌细胞高表达”指所述miRNA在一个心肌细胞中拷贝数≥1000。

16.如权利要求13所述的柯萨奇病毒，其特征在于，所述的“心肌细胞高表达”指所述miRNA在一个心肌细胞中拷贝数≥5000。

17.一种药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有权利要求1所述的特异性感染肿瘤细胞的柯萨奇病毒以及药学上可接受的载体。

18. 一种药盒，其特征在于，包括：

(a) 第一容器，所述的第一容器中含有第一药物组合物，所述的第一药物组合物含有权利要求1所述的特异性感染肿瘤细胞的柯萨奇病毒以及药学上可接受的载体；和

(b) 第二容器，所述的第二容器中含有第二药物组合物，所述的第二药物组合物含有额外的肿瘤治疗剂以及药学上可接受的载体。

19.一种权利要求1所述的特异性感染肺癌细胞的柯萨奇病毒的用途，其特征在于，用于制备治疗肺癌的药物。

20.如权利要求19所述的用途，其特征在于，所述的肺癌是Kras突变的肺癌。