CN102827846A - 重组柯萨奇病毒b3型病毒样颗粒的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了重组柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法。本发明所提供的方法包括如下步骤：1）将柯萨奇病毒B3型的P1基因和3CD基因克隆到目的质粒中，得到重组表达载体；2）用步骤1）得到的重组表达载体转化目的酵母细胞，得到表达所述P1基因和所述3CD基因的重组酵母细胞；3）裂解步骤2）得到的重组酵母细胞，分离得到重组的柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒。实验证明，利用本发明所提供的方法，在酵母表达系统中成功的制备了柯萨奇病毒B3型的病毒样颗粒，可将其进一步用于病毒性心肌炎与I型糖尿病候选预防性疫苗和药物组合物。

Description

重组柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及重组柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法，特别涉及利用经过密码子优化的柯萨奇病毒B3型P1基因和3CD基因，通过酵母表达系统制备重组柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的方法。

背景技术

病毒性心肌炎（vital myocarditis，VMC）是由多种病毒引起心肌的非特异性炎症病变，病程较长，数月可康复，其中少数病人会转变成慢性。能引起病毒性心肌炎的病毒中，最普遍的是肠道病毒与腺病毒（Yajima T，Knowlton KU.Viral myocarditis:fromthe perspective ofthe virus.Circulation.2009,119(19):2615-2624.），而肠道病毒中的柯萨奇病毒B3（Coxsackievirus B3，CVB3）是其主要病原体（Yuan J,Yu M,Lin QW et al.Th17cells contribute to viral replication in coxsackievirus B3-induced acute viralmyocarditis.J Immunol.2010,185(7):4004-4010.）。在心肌炎与其晚期即扩张型心肌病病例中，有5-50%是由CVB3感染引起的（Maisch B,Ristic AD,Hufnagel G，PankuweitS.Pathophysiology of viral myocarditis:the role of humoral immune response.CardiovascPathol.2002;11:112-22.）。

另外，柯萨奇病毒B3型与很多人类其它疾病相关，无菌性脑炎与胰腺炎，并且调查显示CVB或许与胰岛素依赖型糖尿病的发病相关（Andreas Henke,Nadine Jaraschand Peter Wutzler.Coxsackievirus B3vaccines:use as an expression vector for preventionof myocarditis.Expert Rev.Vaccines.2008,7(10),1557-1567.）。

柯萨奇病毒B3型属小RNA病毒，其毒粒为二十面体形，立体对称，呈球形状，是裸露的核衣壳，直径约为23-30nm，无包膜。病毒基因组为约7kb的单链RNA，其组成从5’端到3’端的方向依次为5’端非编码区，P1区、P2区、P3区和一段3’端非编码区。P1区编码病毒的主要结构蛋白，即衣壳蛋白（capsule protein），其转录及翻译产物经蛋白酶水解后，最终得到4个蛋白产物，分别为VP4(1A)，VP2(1B)，VP3（1C）及VP1(1D)。主要的中和抗原位点就在P1区的VP1上，VP2和VP3上也含有一些中和型的抗原决定簇，但它们存在的区域是在非保守序列中。VP4序列呈高度保守，不暴露在衣壳的外表面，所以不具有中和性抗原决定簇。P2区呈现P2A、P2B和P2C三个部分。P2A蛋白的这一区域是起抑制宿主细胞mRNA转录作用的。P2B的功能与转膜作用有关，而P2C蛋白据推测其参与病毒RNA基因组的复制。P3区中，VPg（P3A）前体通过加工成为成熟的VPg。P3C是一个蛋白酶，可以自动催化自我剪切释放。3D是一个RNA合成酶，是在RNA复制过程中的依赖RNA的RNA多聚酶，它可以复制合成病毒的RNA。

研究人员已采用多种方法研究相关疫苗，并且利用动物模型证明了其预防急性感染或心肌炎的潜能，其中包括亚单位疫苗，灭活病毒疫苗，减毒活疫苗或DNA疫苗。然而，这些方法存在危险性，甚至存在不能刺激机体产生理想的免疫反应的可能。例如，减毒或灭活病毒疫苗存在逆转成有毒力的形式的危险或者不完全灭活，将导致接种者患病。目前，还没有预防感染CVB3的特效药或疫苗上市，因此，研制CVB3预防性疫苗对于控制病毒性心肌炎的流行具有重要意义。而病毒样颗粒在形态上和真实的病毒类似，并且不含有潜在的致病病毒基因组，所以病毒样颗粒为抗病毒预防性疫苗的开发提供了理想的备选方案。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法。并且本方法可应用于柯萨奇B型病毒（B1-B6）的病毒样颗粒制备。

本发明所提供的柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法包括如下步骤：

1）将柯萨奇病毒B3型的P1基因和3CD基因克隆到目的质粒中，得到重组表达载体；

2）用步骤1）得到的重组表达载体转化目的酵母细胞，得到表达所述P1基因和所述3CD基因的重组酵母细胞；

3）裂解步骤2）得到的重组酵母细胞，分离得到重组的柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒。

上述步骤1）中，所述P1基因和所述3CD基因均为经过密码子优化的基因；所述优化为在不改变野生型柯萨奇病毒B3型P1蛋白和野生型柯萨奇病毒B3型3CD蛋白氨基酸序列的前提下，将野生型柯萨奇病毒B3型P1基因和野生型柯萨奇病毒B3型3CD基因的密码子替换为酵母细胞偏好（高频使用）的密码子。所述优化还包括对P1基因序列和3CD基因序列的其他改造，以适合在酵母细胞中表达。本发明中使用的术语“偏好的密码子”具有本领域公知的含义，也称为密码子的偏好性（CodonPreference），是指某些生物体更偏爱使用某些同义三联密码子（即编码相同氨基酸的密码子）。

在本发明的一个实施例中，上述步骤1）中所述P1基因（经过密码子优化的基因，命名为CVB3P1Y）的核苷酸序列为序列表中序列1所示；所述3CD基因（经过密码子优化的基因，命名为CVB33CDY）的核苷酸序列为序列表中序列2所示。为适合在酵母细胞中表达，根据本发明描述的方法对柯萨奇病毒B3型的P1基因或3CD基因进行改造获得的其他基因序列也属于本发明的保护范围。

上述步骤2）中，所述目的酵母细胞可为酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。在本发明的一个实施例中，所述目的酵母细胞具体为酿酒酵母INVSC1。

所述P1基因和3CD基因在所述重组表达载体中各由一个启动子驱动转录，驱动所述P1基因的启动子方向和驱动所述3CD基因的启动子方向相反。在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体为将所述P1基因和所述3CD基因分别插入到pESC-URA的两个多克隆位点处。具体可将所述P1基因插入到所述pESC-URA的多克隆位点1（MCS1/FLAG）的SpeI和Pac I之间，得到中间质粒，同时将所述3CD基因插入到所述中间质粒的多克隆位点2（MCS2/myc）的BamH I和Xho I之间，得到所述的重组表达载体。

利用本发明所提供的方法制备得到的柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的P1基因或3CD基因。

本发明所提供的密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的P1基因（CVB3P1Y基因）的核苷酸序列为序列表中序列1所示；本发明所提供的密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的3CD基因（CVB33CDY基因）的核苷酸序列为序列表中序列2所示。为适合在酵母细胞中表达，根据本发明描述的方法对柯萨奇病毒B3型的P1基因或3CD基因进行改造获得的其他基因序列也属于本发明的保护范围。

其中，序列1由2565个核苷酸组成，为优化后柯萨奇病毒B3型P1基因的编码序列，其编码所得的蛋白为序列表中序列5所示的蛋白，序列5由854个氨基酸组成；序列2由1941个核苷酸组成，为优化后的柯萨奇病毒B3型3CD基因的编码序列，其编码所得的蛋白为序列表中序列6所示的蛋白，序列6由646个氨基酸组成。

含有上述密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的所述P1基因和/或所述3CD基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体可为将所述P1基因和所述3CD基因分别插入到pESC-URA质粒的两个多克隆位点处，得到的重组质粒。所述重组菌可为携带有上述密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的P1基因或3CD基因的重组酵母细胞。所述酵母细胞可为酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。在本发明的一个实施例中，所述酵母细胞具体为酿酒酵母INVSC1。

所述表达盒由能够启动所述密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的所述P1基因和/或所述3CD基因表达的启动子，所述密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的所述P1基因和/或所述3CD基因，以及转录终止子组成。在本发明的一个实施例中，所述启动子具体为酿酒酵母GAL1和GAL10启动子，当然也可以使用其他公知的酵母启动子的任何一种，如GAL7、ADH1、ADH3和PGK启动子，或者其他真核基因启动子。在本发明的一个实施例中，所述转录终止子具体为ADH1和CYC1终止子。

上述密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的所述P1基因和/或3CD基因在制备下述a）或b）中的应用也属于本发明的保护范围：

a）柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒；

b）以柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒为活性成分的预防性疫苗。

本发明还涉及并提供了在重组宿主细胞中同时表达CVB3P1蛋白和CVB33CD蛋白的方法，该方法包括：（1）将含有编码所述CVB3P1蛋白和所述CVB33CD蛋白的编码基因的重组表达载体导入重组宿主细胞，如重组的酵母细胞（酿酒酵母INVSC1）。（2）在允许所述CVB3P1蛋白和所述CVB33CD蛋白同时表达的条件下培养重组宿主细胞，如重组的酵母细胞（酿酒酵母INVSC1）。

本发明对野生型的柯萨奇病毒B3型（Coxsackievirus B3，CVB3）的P1基因或3CD基因进行了酵母细胞偏好型密码子优化，从而提高了CVB3P1蛋白和CVB33CD蛋白在酵母细胞中的表达水平。在本发明中，CVB3P1蛋白和CVB33CD蛋白在酵母细胞中同时表达，CVB33CD蛋白对CVB3P1蛋白进行酶切后得到VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白（3CD是3C的前体，由3CD蛋白产生的3C蛋白为一种蛋白酶，可将P1蛋白水解为VP1、VP2、VP3、VP4四种结构蛋白）。这四种结构蛋白进而自行组装成柯萨奇病毒B3型的病毒样颗粒（CVB3VLPs）。

实验证明，利用本发明所提供的方法，在酵母表达系统（酿酒酵母INVSC1）中成功的制备了CVB3VLPs。所述CVB3VLPs可以用于制备基于VLP的CVB3预防性疫苗。

附图说明

图1为pESC-P1Y质粒的琼脂糖凝胶电泳图。其中，用泳道A为15000bp DNAMarker；泳道B为pESC-URA质粒对照；泳道C为pESC-P1Y质粒。

图2为pESC-P1Y质粒的Hind III酶切鉴定结果。其中，用泳道A为15000bp DNAMarker；泳道B为pESC-P1Y质粒的Hind III酶切鉴定结果。

图3为pESC-P1Y-3CDY质粒的琼脂糖凝胶电泳图。其中，用泳道A为15000bpDNA Marker；泳道B为pESC-P1Y质粒对照；泳道C为pESC-P1Y-3CDY质粒。

图4为pESC-P1Y-3CDY质粒的BamHI及Xho I酶切鉴定结果。其中，用泳道A为15000bp DNA Marker；泳道B为pESC-P1Y-3CDY质粒的BamH I及Xho I酶切鉴定结果。

图5为Western Blot鉴定重组CVB3衣壳蛋白的表达。其中，泳道A为蛋白分子量对照；泳道B为INVSC1/pESC-P1Y-3CDY蛋白提取物；泳道C为INVSC1/pESC-URA酵母蛋白提取物；泳道D为CVB3病毒阳性对照。

图6为通过透射电镜技术显现的CVB3病毒样颗粒（VLPs）的代表样品。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、CVB3P1基因和CVB33CD基因的密码子优化及全基因合成(公司合成)

以下按分步骤详细描述CVB3P1基因和CVB33CD基因的密码子优化及全基因合成的流程。

1、CVB3P1基因和CVB33CD基因的密码子优化

根据野生型CVB3P1基因序列（如序列表中序列3所示）和野生型CVB33CD基因序列（如序列表中序列4所示），经过设计和反复验证得到适合于在酵母细胞中表达的优化型CVB3P1基因序列和优化型CVB33CD基因序列，即将CVB3病毒的P1基因序列和3CD基因序列在不改变氨基酸序列的前提下转变成含有如Sharp PM等（Sharp PM,Cowe E.Synonymous Codon Usage in Saccharomyces cerevisiae.Yeast,1991,7(7):657-678.）所描述的酵母优选密码子的优化序列，从而提高CVB3P1蛋白和CVB33CD蛋白在酵母细胞培养环境中的表达水平。

根据上述方法，最终获得按酵母密码子偏好设计的优化型CVB3P1基因和CVB33CD基因，分别命名为CVB3P1Y和CVB33CDY，其基因序列分别为序列表中序列1和序列2。CVB3P1Y基因（序列1）编码的蛋白与序列3所示野生型CVB3P1基因编码的蛋白一致，均为序列表中序列5所示氨基酸序列组成的蛋白；CVB33CDY基因（序列2）编码的蛋白与序列4所示野生型CVB33CD基因编码的蛋白一致，均为序列表中序列6所示氨基酸序列组成的蛋白。

2、密码子优化型CVB3P1基因和CVB33CD基因的全基因合成

使用序列重叠延伸PCR法全基因合成CVB3P1Y基因和CVB33CDY基因，具体方法如下：根据优化CVB3P1Y基因和CVB33CDY基因的序列合成多条100bp的上下游片段，两片段间3’端互补重叠15bp，所述上下游片段互为模板、引物进行PCR扩增，使用凝胶回收试剂盒回收扩增片段，再以此相邻的回收片段互为引物、模板进行下一轮PCR扩增，得到拼接序列，再以相邻拼接序列互为模板、引物进行PCR拼接，回收拼接序列片段，在依此序列互为模板、引物进行PCR拼接，依此类推最终合成全长的密码子优化型CVB3P1基因和CVB33CD基因，即CVB3P1Y基因和CVB33CDY基因。

本实验中CVB3P1Y基因与CVB33CDY基因由公司（北京博迈德科技发展有限公司）进行全基因合成并构建到pGH质粒载体上交付保存使用。

实施例2、携带CVB3P1Y和CVB33CD Y的酵母重组表达载体的构建

1、大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备

从37℃培养16~20h的新鲜平板上挑取DH5α单菌落（Takara公司，产品目录号为D9057S），接种于5ml不含抗菌素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜（12~16h）。次日从上述培养物中吸取0.5ml按体积比1:100转入50ml LB培养基中继续培养约3h，至菌液的OD600值为3时，在无菌条件下将细菌转移到一无菌、用冰预冷的50ml离心管中，冰浴30min。在4℃条件下，4000rpm离心10min，弃上清，将管倒置1min，使残留培养液流尽，以10ml用冰预冷的100mM的CaCl₂溶液重悬细菌沉淀，冰浴30min。4℃，4000rpm离心10min，弃上清，每50ml初始培养物用2ml预冷的含15％甘油的100mM的CaCl₂溶液重悬细菌沉淀，分装成200μl每管，-80℃保存备用。

2、pESC-URA质粒的转化

用无菌吸头分别吸取1μg pESC-URA质粒（一种具有双向启动子的酵母表达质粒，购自Angilent technologies，产品目录号为217454）加入200μl上述步骤1制备的DH5α感受态细胞中，轻轻旋转混匀，冰浴30min。将管移入42℃水浴箱中水浴90s，然后将管快速转移到冰浴中，使细胞冷却1～2min。每管加入800μl不含抗生素的LB培养基（蛋白胨、酵母提取物、氨苄青霉素购自北京欣经科公司，NaCl购自国药化学试剂有限公司），将管转移至37℃摇床上，温育45min（转速<150rpm）。取50μl已转化的感受态细胞，用一无菌的弯头玻棒轻轻涂到含相应抗生素的LB平板表面，将平板置于室温至液体被吸收，倒置平皿，于37℃培养12～16h。

3、pESC-URA质粒的小量制备

挑取经上述步骤2转化培养所得的单菌落接种于5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜。将培养物移入1.5ml Eppendorf管中，12000rpm离心30-60s，倒去培养液，倒置离心管，使上清流尽，用100μl预冷的溶液Ⅰ（终浓度为50mmol/L的葡萄糖，终浓度为25mmol/L的Tris-HCl，终浓度为10mmol/L的EDTA，pH8.0）重悬菌体，剧烈振荡混匀；加入200μl新鲜配制的溶液II（终浓度为0.2mol/L的NaOH，终浓度为质量百分含量1%的SDS），温和混匀，冰浴3min，至液体清亮；加入150μl预冷的溶液III（配制100ml溶液III：5mol/L KAc 60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml）温和混匀，冰浴10min,12000rpm离心10min,小心吸取上清，将上清转移至另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇室温沉淀30min，12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用70%乙醇洗一次，室温晾干后，用30μl含RNaseA（100μg/ml）的TE（pH 8.0）溶解沉淀，37℃水浴30~60min后置-20℃保存备用。

4、酵母重组表达载体pESC-P1Y的构建

将实施例1得到的CVB3P1Y基因克隆到pESC-URA质粒的多克隆位点1（MCS1/FLAG）的SpeI和Pac I之间，得到酵母重组表达载体pESC-P1Y。具体按照如下步骤进行：

1）在实施例1得到的CVB3P1Y基因（如序列表中序列1所示）的5’端和3’端分别引入限制性内切酶SpeI和Pac I（限制性内切酶SpeI及Pac I购自大连宝生物工程有限公司）的酶切位点。

具体操作如下：以实施例1得到的CVB3P1Y基因（如序列表中序列1所示）为模板，用引物P1-UP和P1-DOWN进行PCR扩增得到5’端和3’端分别引入限制性内切酶SpeI和Pac I酶切位点的CVB3P1Y基因片段。

P1-UP：5’-GGACTAGTACCATGGGTGCTCAAGTTTCTACTC-3’（下划线处为限制性内切酶SpeI酶切位点的序列，该序列的第12-33位为序列1的第1-22位）；

P1-DOWN：5’-CCTTAATTAATTAGAAAGCACCAGTATTAGTCATAGC-3’（下划线处为限制性内切酶Pac I酶切位点的序列，其后的序列为序列1的第2539-2565位的反向互补序列）。

2）使用限制性内切酶SpeI和Pac I酶切上述步骤3制备的pESC-URA质粒，回收骨架载体（大片段，由于小片段大小仅约为45bp，琼脂糖凝胶电泳时经常无法显示）与经同样酶切的CVB3P1Y基因片段按摩尔比1：4比例混合，依次加入10×T4DNA连接酶缓冲液和T4DNA连接酶（T4DNA连接酶及10×T4DNA连接酶缓冲液购自大连宝生物工程有限公司），反应体积为20μl，16℃连接过夜，取10μl连接反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从接种转化产物的LB琼脂平板上挑取若干个单菌落，接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜，按步骤3所述质粒的快速小量制备方法提取重组质粒（图1）。并用内切酶Hind III对重组质粒进行酶切鉴定，CVB3P1Y基因含有两个Hind III酶切位点，pESC-URA骨架载体含有一个Hind III酶切位点，鉴定结果如图2所示，得到三个条带，与预期结果相符，进一步经酶切鉴定后的重组质粒送公司测序，将测序证实含有CVB3P1Y基因（序列1）的重组质粒命名为pESC-P1Y。其中，序列1编码序列表中序列5所示的蛋白。

5、酵母重组表达载体pESC-P1Y-3CDY的构建

将实施例1制备的所述CVB33CDY基因克隆到上述步骤4制备的酵母重组表达载体pESC-P1Y的多克隆位点2（即为pESC-URA质粒的多克隆位点2，MCS2/myc）的BamH I和Xho I之间，得到酵母重组表达载体pESC-P1Y-3CDY。具体按照如下步骤进行：

1）在实施例1得到的CVB33CDY基因（如序列表中序列2所示）的5’端和3’端分别引入限制性内切酶BamHI和Xho I（限制性内切酶BamHI及Xho I购自大连宝生物工程有限公司）的酶切位点。

具体操作如下：以实施例1得到的CVB33CDY基因（如序列表中序列2所示）为模板，用引物3CD-UP和3CD-DOWN进行PCR扩增得到5’端和3’端分别引入BamHI和Xho I酶切位点的CVB33CDY基因片段。

3CD-UP：5’-CGGGATCCACCATGGGTCCAGCTTTTGAATTTG-3’（下划线处为限制性内切酶BamHI酶切位点的序列，该序列的第12-33位为序列2的第1-22位）；

3CD-DOWN：5’-CCGCTCGAGTTAAAAAGAATCCAACCATTTTC-3’（下划线处为限制性内切酶Xho I酶切位点的序列，其后的序列为序列2的第1919-1941位的反向互补序列）。

2）使用限制性内切酶BamH I和Xho I酶切上述步骤4制备的酵母重组表达载体pESC-P1Y，回收骨架载体（大片段）与经同样酶切的CVB33CDY基因片段按摩尔比1：4比例混合（DNA Marker和DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒购自大连宝生物工程有限公司），依次加入10×T4DNA连接酶缓冲液和T4DNA连接酶，反应体积为20μl，16℃连接过夜，取10μl连接反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从接种转化产物的LB琼脂平板上挑取若干个单菌落，接种到5ml含相应抗生素的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜，按步骤3所述质粒的快速小量制备方法提取重组质粒（图3）。并用内切酶BamHI和Xho I对重组质粒进行酶切鉴定，鉴定结果如图4所示，得到大小约为9200bp和2000bp的两个条带，与预期结果相符，进一步经酶切鉴定后的重组质粒送公司测序，将测序证实含有CVB33CDY基因（序列2）的重组质粒命名为pESC-P1Y-3CDY。其中，序列2编码序列表中序列6所示的蛋白。酵母重组表达载体pESC-P1Y-3CDY中，启动所述CVB3P1Y基因转录的启动子为酿酒酵母GAL10启动子，转录终止子为ADH1终止子；启动所述CVB33CDY基因转录的启动子为酿酒酵母GAL1启动子，转录终止子为CYC1终止子。

实施例3、重组CVB3病毒样颗粒在酵母细胞中的大量表达及纯化

1、酿酒酵母感受态细胞的制备

在酿酒酵母平板中挑取单克隆菌落INVSc 1（Saccharomyces cerevisiae，产品目录号：C81000，购自Invitrogen）接种于10ml YPD培养液（购自北京欣经科公司）中，30℃振摇培养16h，取合适体积的培养物加入48ml YPD培养液中混匀，使其OD600值为0.5，30℃振摇培养1h后OD600值为0.7，继续培养30min后，将培养物转入50ml无菌的离心管中，室温1500rpm离心5min，弃上清，用10ml Sc EasyComp transformationkit（购自Invitrogen）中的溶液I（试剂盒自带）重悬沉淀，室温1500rpm离心5min，小心弃上清，用1ml溶液II（试剂盒自带）重悬沉淀，50μl/管分装灭菌的1.5ml离心管中，置-70℃保存。

2、酵母重组表达载体pESC-P1Y-3CDY转化酵母感受态细胞

将3μl实施例2制备的酵母重组表达载体pESC-P1Y-3CDY加入到上述步骤1制备的酵母INVSC1感受态细胞中，加入500μl Sc EasyComp transformation kit（购自Invitrogen）中的溶液III，在涡旋振荡器上剧烈振荡混匀，得到DNA/酵母混合物。将DNA/酵母混合物置30℃水浴中孵育1h，每隔15min在涡旋振荡器上剧烈振荡混匀。取100μl涂布URA选择平板（选择性培养液(Ura-)：YNB 6.7g，酵母Ura营养缺陷培养基粉末(Sigma公司，Y1501)1.92g，如制平板加入20g琼脂粉，溶于900ml去离子水中，高压灭菌，冷却至50℃，加入100ml无菌的20％葡萄糖。），置30℃孵箱中倒置培养2-4天。随机挑取5个单克隆菌落分别接种于10ml URA选择培养液中，30℃振摇培养24h。将经过鉴定表明成功转入重组表达载体pESC-P1Y-3CDY的酵母INVSC1细胞命名为INVSC1/pESC-P1Y-3CDY。同时设置转入pESC-URA空载体的酵母INVSC1细胞的对照，将该酵母细胞命名为INVSC1/pESC-URA。

3、重组CVB3病毒样颗粒在酵母细胞中的大量表达及纯化

1）重组CVB3病毒样颗粒在酵母细胞中的大量表达：将经过上述步骤2获得的INVSC1/pESC-P1Y-3CDY（实验组）和INVSC1/pESC-URA（阴性对照组）取5ml酵母细胞培养液分别接种于100ml URA选择培养液（选择性培养液（Ura-）：YNB 6.7g，酵母Ura营养缺陷培养基粉末(Sigma公司，Y1501)1.92g，溶于900ml去离子水中，高压灭菌，冷却至50℃，加入100ml无菌的20％(20g/100ml)葡萄糖。）中，30℃振摇培养8h，取合适体积的培养液接种于500ml URA选择培养液中，使OD600值为0.4，30℃振摇培养4h，取合适体积的培养液接种3L URA诱导培养液（YNB 6.7g，酵母Ura营养缺陷培养基粉末(Sigma公司，Y1501)1.92g，溶于800ml去离子水中，高压灭菌，冷却至50℃，加入100ml无菌的20％(20g/100ml)半乳糖），使OD600值为0.4，30℃振摇培养48h，8000g离心15min收集菌体沉淀，用PBS缓冲液重悬，APV高压均质仪以1500bar循环破碎3次，4℃12000g离心30min，收集上清（破碎菌液上清），置-70℃保存。将1倍体积的50%PEG溶液（50%PEG溶液：50gPEG6000(Ameresco公司)溶于100ml ddH2O）缓慢加入到4倍体积的上述破碎菌液上清中，4℃搅拌过夜。第二日，4℃12000rpm，30min离心，去除上清，收集沉淀。用无菌PBS重悬沉淀，浓缩至样品原体积的1/10，得到浓缩样品（实验组浓缩样品和阴性对照组浓缩样品）。

2）重组CVB3病毒样颗粒的纯化：在离心管中由下至上依次小心加入1.4g/ml、1.34g/ml和1.25g/ml的CsCl溶液各7ml，取酵母破碎上清液（上述步骤1）中得到的浓缩样品）置CsCl不连续密度梯度（CsCl购自北京欣经科公司），4℃用BeckmanSW32Ti转头100000g离心21h，小心收集目标位置条带。将收集样品加入到100000MWCO超滤管中，4℃6000g离心20min，收集浓缩后样品，待后续检测（实验组待测样品和阴性对照组待测样品）。

实施例4、重组CVB3病毒样颗粒的鉴定及电镜观察

对实施例3制备的待测样品（实验组待测样品和阴性对照组待测样品）进行Western Blot鉴定和电镜观察。

1、Westerr Blot鉴定重组CVB3衣壳蛋白的表达：利用碧云天公司的BCA蛋白定量试剂盒（增强型）（P0010S），按照说明书操作步骤，对实施例3得到的纯化后的待测样品（实验组待测样品和阴性对照）进行蛋白定量。根据定量结果，对两种待测样品各取适量的悬液（保证两种样品的上样蛋白总量相等）进行12%SDS-PAGE电泳。用识别CVB5VP1的鼠单克隆抗体为一抗（一抗购自Dako公司，产品编号为M7064）（由于CVB病毒的VP1蛋白具有高度的保守性，故此处使用CVB5VP1单抗验证，参见CVB5VP1的鼠单克隆抗体说明书），荧光标记羊抗鼠抗体为二抗（二抗购自KPL，产品目录号为072-07-18-06）进行Western Blot分析（蛋白Marker购自Fermentas公司）。同时设置CVB3病毒（柯萨奇病毒B3北京株0811，GENEBANK：GQ141875.1）作为阳性对照。

结果如图5所示，实验组待测样品与CVB3病毒阳性对照均检测到大小约为34KD（VP1）的CVB3特异性条带；而阴性对照组待测样品未检测到CVB3的特异性条带。

2、重组CVB3病毒样颗粒的电镜观察：将实施例3得到的纯化后的两个待测样品（实验组待测样品和阴性对照）调整蛋白浓度一致，各取10μl悬液滴加在覆盖镀碳支持膜上静止1min，吸干镀碳支持膜（购自中镜科仪，编号：BZ110223）表面残余液体，用2%磷钨酸（购自中镜科仪，编号：GZ02536）染色1min，吸干镀碳支持膜表面残液，室温放置干燥后用透射电子显微镜观察其形态结构。

结果显示，实验组待测样品（图6）在电镜下均可见直径约30nm左右的病毒样颗粒的存在，而阴性对照组（空载体）测样品则没有在电镜下观察到病毒样颗粒的存在。

本实施例的结果表明，携带有密码子优化后的CVB3P1基因和CVB33CD基因的重组表达载体在酵母系统中，成功的包装出CVB3的病毒样颗粒。

Claims (10)

1.柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：

1）将柯萨奇病毒B3型的P1基因和3CD基因克隆到目的质粒中，得到重组表达载体；

2）用步骤1）得到的重组表达载体转化目的酵母细胞，得到表达所述P1基因和所述3CD基因的重组酵母细胞；

3）裂解步骤2）得到的重组酵母细胞，分离得到重组的柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述P1基因和所述3CD基因均为经过密码子优化的基因；所述优化为在不改变野生型柯萨奇病毒B3型P1蛋白和野生型柯萨奇病毒B3型3CD蛋白氨基酸序列的前提下，将野生型柯萨奇病毒B3型P1基因和野生型柯萨奇病毒B3型3CD基因的密码子替换为酵母细胞偏好的密码子。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述P1基因的核苷酸序列为序列表中序列1所示；所述3CD基因的核苷酸序列为序列表中序列2所示。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述目的酵母细胞为酿酒酵母、多形汉逊酵母、巴斯德毕赤酵母、胞壁克鲁维氏酵母、乳克鲁维氏酵母或粟酒裂殖糖酵母。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述P1基因和所述3CD基因在所述重组表达载体中各由一个启动子驱动转录，驱动所述P1基因的启动子方向和驱动所述3CD基因的启动子方向相反。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体为将所述P1基因和所述3CD基因分别插入到pESC-URA的两个多克隆位点处各由一个启动子驱动转录得到的重组质粒。

7.利用权利要求1-6中任一所述方法制备得到的柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒。

8.密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的P1基因，其特征在于：所述P1基因的核苷酸序列为序列表中序列1所示；或

密码子优化型的柯萨奇病毒B3型的3CD基因，其特征在于：所述3CD基因的核苷酸序列为序列表中序列2所示。

9.含有权利要求8所述P1基因和/或3CD基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

10.权利要求8所述P1基因和/或3CD基因在制备下述a）或b）产品中的应用：

a）柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒；

b）以柯萨奇病毒B3型病毒样颗粒为活性成分的预防性疫苗。

Images