CN102337248B - 表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的重组BHK细胞系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稳定表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的重组幼仓鼠肾细胞系(BHK21)，更具体地，表达PrM/M-E蛋白重组细胞系为BHK-JEV-ME，该细胞系保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.5263。本发明还公开了制备所述重组细胞系的方法和该重组细胞系在制备预防乙型脑炎的疫苗中的应用。

Description

表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的重组BHK细胞系及其应用

技术领域

本发明涉及重组哺乳动物表达细胞系，具体地，本发明涉及一种表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白重组BHK细胞系，更具体地，重组BHK细胞系是BHK-JEV-ME，其菌种保藏编号为：CGMCC No.5263。本发明还公开了制备所述重组BHK细胞系的方法和该重组细胞系在制备预防乙型脑炎疫苗中的应用。属于生物医药基因工程与免疫学领域。

背景技术

乙型脑炎又称流行性乙型脑炎或日本乙型脑炎，是由乙型脑炎病毒引起的，侵害中枢神经系统的病毒性人兽共患性传染病。

流行性乙型脑炎(Epidemic Encephalitis B)又称日本乙型脑炎(Japanese BEncephalitis)，简称乙型脑炎。乙型脑炎是由乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis virus，JEV)引起的一种重要蚊媒性人兽共患传染病。多种动物易感，但通常只有人、马和猪感染后会呈现临床症状。人尤其是儿童对乙脑病毒易感，感染后临床症状主要表现为发烧、剧烈头痛、恶心、呕吐、嗜睡不醒等，重者可出现抽搐、昏迷，甚至出现呼吸衰竭而死亡。马属动物特别是幼驹易感，但多数呈隐性感染，少数出现神经症状，死亡率低，是终末宿主。猪是乙型脑炎病毒在自然界最重要的扩增动物。怀孕母猪感染可导致死产和其他繁殖障碍，感染的公猪显示睾丸急性炎症。此病的地理分布主要在亚洲东部和亚洲南部，俄罗斯东部和太平洋岛屿等诸国也有报道。在世界范围内，每年约有35,000至50,000人感染发病，约有10,000例死亡病例。对人畜的健康造成严重的威胁。由于疫苗的成功应用，乙型脑炎在我国已经得到较好的控制，但近年来发病率有所上升，少数地区还有重要的疫情流行发生，如2006年山西运城市发生严重的乙脑疫情。

采用疫苗进行预防接种是控制该病流行的有效措施。目前国际上认可的乙型脑炎疫苗有乙型脑炎病毒中山株的鼠脑组织灭活疫苗，该疫苗价格较贵，免疫持续期不稳定，且有免疫接种副反应，安全性不是很好。其它疫苗还有包括用Vero细胞生产的灭活疫苗，我国科研人员培育的乙型脑炎病毒减毒株(SA14-14-2株)制成的乙型脑炎病毒减毒活疫苗，但该疫苗的生物安全性和生产工艺等还没有得到国际标准的认可，从而限制了该疫苗在乙脑流行的其它国家的应用。所以研制新型乙型脑炎疫苗势在必行。基因工程疫苗是乙型脑炎疫苗新的发展方向。乙型脑炎病毒表面囊膜糖蛋白E蛋白是该病毒诱导保护性免疫反应的主要蛋白。M蛋白在病毒诱导机体产生免疫保护中也起着得要作用。病毒样颗粒(VLP)疫苗是新型基因工程疫苗，VLP具有与病毒粒子本身一样的空间结构，能产生与真实病毒一样的免疫保护效果，但VLP为复制缺陷型，不含核酸，所以不存在毒力与致病等风险。VLP与常规疫苗相比较更为有效，安全，是今后基因工程疫苗发展的重要方向。

乙型脑炎病毒属黄病毒科黄病毒属，为单链正义RNA病毒，病毒基因组长约11kb。整个基因组由5’端非编码区(5’-NCR)、一个大的开放阅读框(ORF)及3’端非编码区(3’-NCR)构成，无亚基因组结构。ORF大小约为10.3kb，编码一个多聚蛋白前体，经切割加工，产生3个结构蛋白：核心蛋白(C)、膜蛋白(prM/M)和囊膜糖蛋白(E)；7个非结构蛋白(NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b，NS5)。不同毒株的JEV常在毒力与血凝特性上有明显的差异，但没有明显的抗原性差异，即抗原变异不显著。而且JEV感染或免疫可产生坚强的持久免疫力，迄今没有见到临床病例在痊愈后第二次感染发病的报道。这些特点为乙型脑炎的免疫预防提供了良好的基础。在JEV编码的3个结构蛋白和7个非结构蛋白中，与机体的免疫保护反应相关的蛋白主要是E蛋白和NS1蛋白。其中E蛋白的免疫保护机制主要是诱导机体产生病毒中和抗体。

E蛋白是病毒粒子表面最重要的结构蛋白，其表面的抗原决定簇，具有血凝活性和中和活性。E蛋白与病毒的毒力、宿主范围、组织嗜性、膜融合、保护性免疫、血凝反应和血清特异性有关。E蛋白是乙型脑炎病毒最重要的免疫保护性抗原，它能诱导机体产生病毒中和活性抗体。研究表明，基因工程表达的E蛋白，重组病毒表达的E蛋白以及包含E蛋白基因的DNA疫苗都具有很好的免疫保护作用。而且这种免疫保护作用主要是通过诱导产生病毒中和抗体而发挥作用的。

PrM蛋白为M蛋白的前体蛋白，它与基因组多聚蛋白一起翻译后以蛋白酶剪切形成。PrM蛋白在E蛋白折叠形成其天然的空间结构中起重要作用。在内质网与高耳基体内膜系统内与E蛋白形成PrM-E二聚体，进一步与细胞膜组分形成病毒颗粒。后通过分泌通路分泌至细胞外，在从细胞内分泌至细胞外的过程中，PrM蛋白发生剪切，去掉Pr部分，形成成熟的病毒粒子。成熟的病毒粒子表达为M蛋白。在哺乳动物细胞中表达JEV病毒PrMM-E蛋白能形成JEV病毒样颗粒。但至目前为止还没有利用幼仓鼠肾细胞(BHK21细胞)进行表达乙型脑炎PrM/M-E蛋白的研究报道。BHK21细胞在动物生物制品如培养病毒疫苗方面已经得到了广泛应用，其质量标准以及生物安全性等方面均符合生物制品要求。BHK21细胞有遗传稳定，生长快，可以进行高密度发酵培养等优点。是生物制品生产中优选细胞系，特别是在中国目前已经有很多病毒疫苗均采用BHK细胞进行培养病毒抗原，如口蹄疫细胞培养灭活疫苗等。虽然国外已有利用哺乳动物细胞系统表达JEV结构蛋白抗原，但目前的报道中以在RK13细胞中表达效果较好(Journal of Virology，August 2003，p.8745-8755，Vol.77，No.16)，但是RK13细胞是兔肾细胞，该细胞为贴壁细胞，不易进行悬浮高密度发酵培养，而且ATCC资料显示该细胞还存在BVDV病毒污染，而BVDV污染是生物制品生物中细胞培养中严格控制的。

生物遗传密码子有64种，某些氨基酸是由多个不同的密码子编码，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。也是就不同生物的遗传密码有一定的偏嗜性或偏好性。利用不同的表达系统表达抗原蛋白时，采用表达系统所偏好的密码子编译抗原蛋白基因通常会提高蛋白在该表达系统中的表达效率。根据不同表达系统密码子偏好性对需要表达的蛋白基因进行密码子优化也是现代基因工程技术中的一项新的优化措施。本发明即采取了这一新的优化技术对乙型脑炎PrM/M-E蛋白的基因序列进行了密码子优化。

本发明即以BHK21细胞为表达细胞，同时优化了抗原基因密码子，构建JEV结构蛋白表达细胞系，筛选稳定表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的真核表达细胞系。进一步制备乙型脑炎基因工程亚单位疫苗，进行免疫动物实验，结果表明通过本发明建立的细胞系制备的乙型脑炎基因工程疫苗可以产生很好的免疫保护效果。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种稳定表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的重组BHK细胞系，其特征在于由以下方法构建得到：

(1)构建真核表达质粒，该真核表达质粒包括其中插入编码乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的基因的序列；

(2)将所述真核表达质粒转染BHK21细胞；

(3)经质粒转染的细胞以添加了G418的培养液选择培养；

(4)将经选择培养的细胞进行稀释克隆，收获克隆细胞培养上清液与细胞，检测并比较乙型脑炎病毒PrM/M与E蛋白的表达量，获得稳定表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的重组BHK细胞系。

在本发明的具体实施例中，步骤(3)中所述培养液中G418的浓度优选为1000μg/mL。

在本发明的具体实施例中，所述编码乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

在本发明的具体实施例中，所述编码乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的基因的序列如SEQ ID No.2所示。

本发明的一种稳定表达编码乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白基因的重组BHK细胞系，其为BHK-JEV-ME，分类命名为：幼仓鼠肾细胞，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.5263，保藏日期为2011年9月15日。

本发明的目的之二是将所述的表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的重组BHK细胞系应用于制备疫苗以预防乙型脑炎，或者将其用于制备成诊断或检测乙型脑炎的试剂。

本发明的目的之三是提供一种预防乙型脑炎的疫苗组合物，其特征在于由有效剂量的本发明所述的重组BHK细胞系和佐剂组成。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

1)以哺乳动物细胞偏嗜性密码子优化乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的基因序列，人工合成密码子优化的编码乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的基因opti-JEV-ME，将基因克隆进入真核细胞表达质粒pCAG-neo中，构建表达质粒pCAGneo-opti-JEV-ME。

2)将重组质粒转染BHK21细胞，转染48h后换含G418的培养基，10d后通过有限稀释法获得克隆化细胞。

3)单克隆化细胞经IFA，Western blot，ELISA，电镜观察等方法检测，筛选获得稳定表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的重组细胞系。

本发明制备的表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的重组细胞系，容易培养，增殖快速，可无限扩大，性质稳定，蛋白表达量高，表达蛋白经细胞自身加工修饰后能形成病毒样颗粒，表达蛋白免疫小鼠与猪后能诱导动物机体产生病毒中和抗体，可抵抗病毒感染。细胞培养液中的表达蛋白经纯化后可以用检测乙型脑炎病毒抗体。

本发明的有益效果如下：

1.将本发明的表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的重组细胞培养物制备疫苗可以诱导动物机体产生针对JEV的中和抗体，并能够在体内或体外中和JEV，阻止病毒感染动物机体。

2.本发明所选用的表达系统为BHK21细胞，重组细胞系抗原表位量高，可以悬浮培养高密度发酵培养，易于大量生产。

3.本发明的重组表达细胞系可以利用无血清培养基或低血清培养基进行培养表达，可以降低抗原或疫苗生产成本。

4.本发明对抗原蛋白基因进行了基因密码子优化，有利于提高抗原表达量。

5.利用本发明的重组表达细胞系细胞培养物制备的油佐剂疫苗和磷酸铝佐剂疫苗均能诱导动物机体产生较高效价的病毒中和抗体。

附图说明

图1为真核细胞表达质粒构建示意图；

图2为转染后不同克隆细胞表达蛋白Western blot检测；

1-6，1-6号克隆细胞(本发明所筛选的细胞克隆为3号克隆)培养上清液；7，感染JEV病毒BHK21细胞裂解物对照

图3为筛选克隆细胞系不同代次表达蛋白Western blot检测；

1，克隆细胞第5代培养上清液；2，克隆细胞第10代培养上清液；3，克隆细胞第20代培养上清液；4，BHK细胞感染病毒上清液对照

图4为表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的重组细胞IFA检测；

A，克隆细胞第5代；B，克隆细胞第25代；C，正常BHK21细胞对照

图5为重组细胞系表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白形成病毒样颗粒电镜观察结果；箭头所示为细胞表达PrM/M-E蛋白在细胞内所形成的JEV病毒样颗粒。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本发明的保护范围之内。

实施例1稳定表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的重组细胞系的构建及检测

1材料与方法

1.1质粒，菌株与细胞

表达载体质粒pCAG-neo、DH5α感受态细胞和BHK21细胞由哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室保存，质粒中提试剂盒和RNA提取试剂盒由QIAGEN公司生产，胶回收试剂盒购自上海华舜生物技术有限公司，G418购自Gibco公司，胰酶购自Hyclone公司，Reverse Transcriptase M-MLV、PrimeSTARTM HS DNA Polymerase、Sac I、Xho I、BamH I、T4 DNA连接酶购自TaKaRa公司，抗JEV PrM蛋白与抗JEV E蛋白的单克隆抗体由本研究组制备，红外荧光染料标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自KPL公司，FITC标记山羊抗小鼠IgG购自中杉金桥生物公司，LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司。

1.2重组表达质粒的构建

opti-JEV-ME基因为经真核细胞偏嗜性密码子优化的编码JEV PrM/M-E蛋白的基因。JEV PrM/M-E蛋白的氨基酸序列参考JEV SA14-14-2株的蛋白序列(GenBank：AAK11279.1)，在蛋白的N端加入一个Met和JEV C蛋白C末端22个氨基酸残基序列作为信号肽。在设计该基因时，在起始密码子前加有Kozak序列与SacI酶切位点与保护性碱基；在的E蛋白基因编码末端加有终止子与Xho I酶切位点与保护性碱基。opti-JEV-ME基因以及该基因特异性扩增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的基因opti-JEV-ME大小为2070bp，两端含有Sac I、Xho I酶切位点，合成基因克隆在pUC57质粒中。真核表达载体pCAG-neo用Sac I、Xho I双酶切处理，然后与经Sac I与Xho I双切回收的opti-JEV-ME基因在T4 DNA连接酶作用下连接，转化DH5α感受态细胞后涂布含氨苄的LB平板，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，用Sac I、Xho I双酶切对其进行鉴定；酶切鉴定阳性质粒命名为pCAGneo-opti-JEV-ME，同时送生物公司进行测序验证。质粒构建示意图见图1。

1.3 G418工作浓度的确定

为确定G418筛选稳定转染NS1基因的细胞最适用量，本试验通过制备含不同浓度梯度的G418(含200～1400μg/mL培养基，以200μg/mL递增)的培养基，对培养在24孔板中的、长至90％满的BHK21细胞进行加压处理。在培养的3～14d内，逐日观察细胞病变和死亡情况。

1.4细胞转染与筛选

选生长状态良好的BHK21细胞消化传代至24孔板中，待BHK21细胞长至90％满时，按照Lipofectamine^TM 2000转染试剂操作说明用重组质粒pCAGneo-opti-JEV-ME转染细胞。转染48h后加入含G418(1000μg/mL)选择性培养基进行加压培养，4d后将细胞用胰酶消化，以有限稀释法传代于96孔板中继续培养，7d后在倒置显微镜下观察每孔细胞的克隆数目。挑选含有1个细胞集落(即1个细胞团块)的孔相继在24孔板、6孔板、细胞培养瓶中扩大培养，同时对各细胞进行IFA鉴定。筛选IFA信号较强的细胞克隆。

1.5克隆细胞表达目的蛋白的Western blot鉴定

克隆细胞在24孔板中培养2d后，收集上清液，10倍浓缩后加入电泳上样缓冲液制样电泳；检测细胞内蛋白时去掉细胞培养液，用PBS将细胞洗两遍，加入培养液1/10体积的细胞裂解液，收集细胞裂解液，加入蛋白电泳上样缓冲液。沸水中煮10min。SDS-PAGE电泳后转印至硝酸纤维素膜，含5％脱脂乳PBS中4℃封闭过夜。然后加入500倍稀释的鼠抗E蛋白单克隆抗体，37℃作用1h，PBST洗涤3次，每次5min，再加入5000倍稀释的红外染料标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃作用45min，PBST洗5次，最后用Odyssey扫描仪扫描结果。

1.6间接免疫荧光试验检测目的蛋白在转染细胞中的表达

将克隆细胞接种至24孔或12孔板中，24h后去除培养液，用PBS洗3次，4％多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，用含0.1％Triton X100的PBS作用细胞10min，PBS洗3次，用含4％BSA的PBS封闭2h，PBS洗1次，加入1∶500稀释的抗E蛋白单克隆抗体，4℃孵育过夜，PBS洗3次，加入按1∶200稀释的FITC标记山羊抗小鼠IgG，室温孵育2h，PBS洗3次，在荧光显微镜下观察结果。

1.7克隆细胞的RT-PCR鉴定

用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，取10μL进行反转录，加入Oligo dT1μL，RNase抑制剂1μL，M-MLV 5×Buffer 5μL，M-MLV转录酶1μL，dNTP(10m M)2.5μL，补加双蒸水至25μL，混合，42℃加热60min，95℃ 5min终止反应。然后利用opti-JEV-ME基因特异性引物，PCR扩增目的基因。

1.8重组细胞系表达蛋白形成病毒样颗粒的电镜观察

将经IFA与Western blot检测能稳定表达目的蛋白的细胞传代培养，换细胞维持液后再培养4天后，将培养细胞送电镜室进行固定，超薄细胞切片，透射电镜观察细胞内乙型脑炎病毒样颗粒。

2结果

2.1重组表达质粒的构建

构建的重组表达质粒pCAGneo-opti-JEV-ME的结构图见图1。提取的重组质粒经Xho I、Sac I双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分析，发现有两条带，较小条带大约为2070bp，表明酶切结果与预期结果一致，同时测序结果表明重组质粒中Sac I、Xho I酶切位点间的序列和设计的编码PrM/M-E蛋白的基因完全一致，序列如SEQ ID NO：2所示。

2.2 NS1基因稳定表达细胞系的建立

2.2.1 G418工作浓度的确定

在第14d时，G418浓度为1000μg/mL的孔内的BHK21细胞全部死亡，而小于此浓度的孔内还有存活细胞，所以最终确定G418的最适工作质量浓度为1000μg/mL。

2.2.2转染细胞株的筛选

细胞转染48h后，加入G418选择培养基，以有限稀释法传代于96孔板中继续培养，7d后在倒置显微镜下挑选出含单个细胞集落的克隆并经IFA鉴定，筛选出6个阳性细胞克隆。

2.2.2克隆细胞的RT-PCR鉴定

利用RT-PCR对IFA鉴定阳性细胞克隆进行目的基因的扩增后，结果表明，对所筛选出的细胞克隆的不同代次的细胞均能扩增出与理论大小一至的目的条带。表明目的基因已稳定融合于细胞基因组中，且遗传稳定。

2.3.3表达细胞系的Western blot鉴定

对6个克隆细胞培养上清液进行10倍浓缩后，经SDS-PAGE电泳后进行Westernblot鉴定结果表明经IFA筛选出的6个克隆中3号克隆蛋白表达量最高(图2)，选取3克细胞克隆进行传代培养与进一步特性分析。3号克隆细胞经过不同代次传代后对培养上清液进行JEV E蛋白Western blot检测，结果表明筛选出的克隆细胞系在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平(图3)。结果表明构建的重组细胞系能稳定表达目的基因，将3号克隆命名为BHK-JEV-ME，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.5263，保藏日期为2011年9月15日。

2.3.4间接免疫荧光试验检测E蛋白在转染细胞中的表达

间接免疫荧光试验显示，细胞克隆在克隆后第一代即能呈现较强的黄绿色荧光信号，而对照细胞不呈现荧光信号。且该细胞克隆经传代至第25代时，仍能稳定表达目的蛋白(图4)。

2.3.5重组细胞系表达蛋白形成病毒样颗粒的电镜观察

重组细胞系经细胞切片电镜观察表明，在细胞的内膜系统内质网中可以观察到JEV病毒样粒子，直径约为40nm(图5)。

实施例2细胞系表达重组蛋白对BALB/c小鼠的免疫试验

疫苗制备：将实施例1所构建筛选的重组细胞系BHK-JEV-ME(3号)细胞正常传代后长至90％满时，换无血清培养基继续培养4-6d，收获细胞培养物于-20℃冻融三次，反复冻融三次后的含细胞的培养物原液(所含有的JEVE蛋白含量大于3μg/ml)中加入终浓度为0.02％硫柳汞后做为疫苗抗原液。油佐剂疫苗制备法为疫苗抗原液与法国SEPPIC公司ISA 50 V2油佐剂按体积比为1∶1进行混合并充分乳化后存于4℃备用。铝胶佐剂疫苗制备法为：佐剂为美国Reheis公司磷酸铝佐剂与疫苗抗原液按体积比为1∶3混合后于摇床上摇30min，以充分混匀后存于4℃备用。对照组弱毒疫苗为乙型脑炎弱毒疫苗株SA14-14-2细胞培养物，含JEV为10^6.5TCID₅₀/0.1ml。

动物分组与免疫：实验动物SPF级Balb/c小鼠为中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供，6周龄Balb/c鼠20只随机分为4组，每组5只。第一组为弱毒疫苗免疫对照组，免疫JEV弱毒0.2ml/只，只免疫一次；第二组为油佐剂疫苗组，免疫疫苗0.2ml/只，第一次免疫四周后进行加强免疫一次；第三组铝胶佐剂疫苗组，免疫疫苗0.2ml/只，第一次免疫四周后进行加强免疫一次；第四组为进行疫苗免疫，为空白对照组。

血清中和抗体检测：各试验组小鼠在第一次免疫后4周和6周分别采血分离血清。实验动物血清均进行JEV病毒中和抗体检测，检测中和抗体方法为噬斑半数减少法。具体方法为：各组猪血清56℃灭活30min后，开始用DMEM进行10倍稀释，以后再依次进行2倍稀释。将稀释好的血清与等体积JEV病毒(200TCID₅₀/0.1ml)混合。37℃孵育1h，然后取100μL加入到过夜生长的24孔板中的BHK21细胞上，37℃作用90min后去除培养液，加入含1％牛血清与1.5％甲基纤维素的DMEM液。每个血清稀释度样品进行4个重复。同时设立病毒对照。于37℃培养3-4天后去除培养基，PBS洗两次后用福尔马林室温固定30min，再用0.1％结晶紫室温染色30min后观察判定结果。

结果：血清中和抗体检测结果表明，本发明所构建制备的表达乙型脑炎PrM/M-E蛋白重组BHK细胞系所表达的抗原制备的疫苗免疫小鼠后能诱导小鼠产生JEV病毒中和抗体。二免后二周中和抗体最高能达160倍，与弱毒疫苗免疫组中和抗体水平相当。二免后四周重组亚单位疫苗能诱导中和抗体效价为320倍。具体实验数据如表1所示。

表1重组亚单位疫苗免疫小鼠血清病毒中和抗体检测结果

实施例3细胞系表达重组蛋白对猪的免疫试验

疫苗制备：将实施例1所构建筛选的重组细胞系BHK-JEV-ME(3号)细胞正常传代后长至90％满时，换无血清培养基继续培养4-6d，收获细胞培养上清液或将全部细胞培养物冻存于-20℃，细胞上清液经截留分子量为30kD超滤10倍体积浓缩或反复冻融三次的含细胞的培养物原液(所含有的JEV E蛋白含量大于3μg/ml。)中加入终浓度为0.02％硫柳汞后做为疫苗抗原液。疫苗抗原液与白油佐剂按体积比为1∶1.5进行混合并充分乳化，得到重组细胞系全细胞培养物油苗。对照组弱毒疫苗为乙型脑炎弱毒疫苗株SA14-14-2细胞培养物，含JEV为10^6.5TCID₅₀/0.1ml。

动物分组与免疫：实验用猪在免疫前均进行采血分离血清进行JEV抗体检测为阴性猪。选取日龄相近断奶长白仔猪15头，随机分为3组：第一组猪5只为弱毒疫苗免疫对照组，免疫JEV弱毒疫苗2ml，只免疫一次；第二组猪5只为重组细胞系全细胞培养物油苗组，免疫疫苗2ml，第一次免疫四周后进行加强免疫一次；第三组猪5只不进行疫苗免疫，为空白对照组。

血清中和抗体检测：实验猪在免疫前采血一次，经ELISA检测所有猪血清为JEV抗体阴性。在一免后四周油苗免疫组进行加强免疫一次。在第一次免疫后6周和8周分别采血分离血清。实验动物血清均进行JEV病毒中和抗体检测，检测中和抗体方法为噬斑半数减少法。具体方法为：各组猪血清56℃灭活30min后，开始用DMEM进行10倍稀释，以后再依次进行2倍稀释。将稀释好的血清与等体积JEV病毒(200TCID₅₀/0.1ml)混合。37℃孵育1h，然后取100μL加入到过夜生长的24孔板中的BHK21细胞上，37℃作用90min后去除培养液，加入含1％牛血清与1.5％甲基纤维素的DMEM液。每个血清稀释度样品进行4个重复。同时设立病毒对照。于37℃培养3-4天后去除培养基，PBS洗两次后用福尔马林室温固定30min，再用0.1％结晶紫室温染色30min后观察判定结果。

结果：血清中和抗体检测结果表明，本发明所构建制备的表达乙型脑炎PrM/M-E蛋白重组BHK细胞系所表达的抗原制备的疫苗免疫猪后能诱导猪产生JEV病毒中和抗体。二免后二周(初免后6周)中和抗体最高能达160倍，与弱毒疫苗免疫组中和抗体水平相当。二免后四周(初免后8周)重组亚单位疫苗能诱导中和抗体效价为320倍。具体实验数据如表2所示。

表2重组亚单位疫苗免疫猪血清病毒中和抗体检测结果

Claims (7)

1.一种稳定表达编码乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白基因的重组BHK细胞系，其特征在于由以下方法构建得到：

(1)构建真核表达质粒，该真核表达质粒包括其中插入编码乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的基因的序列，所述编码乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的基因的序列如SEQ IDNo.2所示；

(2)将所述真核表达质粒转染BHK21细胞；

(3)经质粒转染的细胞以添加了G418的培养液选择培养；

(4)将经选择培养的细胞进行稀释克隆，收获克隆细胞培养上清液与细胞，检测并比较乙型脑炎病毒PrM/M与E蛋白的表达量，获得稳定表达乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的重组BHK细胞系。

2.根据权利要求1所述的重组BHK细胞系，其特征在于步骤（3）中所述培养液中G418的浓度是1000μg/mL。

3.根据权利要求1所述的重组BHK细胞系，其特征在于所述编码乙型脑炎病毒PrM/M-E蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.根据权利要求1所述的的重组BHK细胞系，其特征在于所述重组BHK细胞系为BHK-JEV-ME，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：CGMCC No.5263。

5.根据权利要求1-4中任何一项所述的重组BHK细胞系在制备预防乙型脑炎疫苗药物中的应用。

6.根据权利要求1-4中任何一项所述的重组BHK细胞系在制备检测乙型脑炎病毒抗体试剂中的应用。

7.一种预防乙型脑炎的疫苗组合物，其特征在于由有效剂量的权利要求1-4任何一项所述的重组BHK细胞系和佐剂组成。

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