CN102229915B - Ev71病毒单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种EV71病毒单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用。该杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为杂交瘤细胞A7-E3，保藏号为CCTCC No：C201123。本发明给EV71病毒抗原检测以及捕获法进行抗EV71病毒IgG、IgM的检测提供一种高特异性、高灵敏度的优质的抗体。

Description

EV71病毒单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体、分泌该抗体的细胞株及其应用。具体涉及一种可中和EV71病毒A、B、C三种基因型病毒的广谱性单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的细胞株及该单克隆抗体的用途。

背景技术

手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)是由肠道病毒引起的一种急性传染病。该病自1957年首次报道以来，曾多次流行，世界卫生组织于2006年曾将本病列为第四位引起死亡的的疾病。美国、澳大利亚、意大利、法国、荷兰、西班牙、罗马尼亚、巴西、加拿大、德国等国家经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和肠道病毒71型(EV71)引起的手足口病。20世纪90年代后期，EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势。1998年，台湾地区暴发EV71的大流行，约有12万以上的人被感染，死亡78人。1998-2001年手足口病在新加坡的流行以及2007年该病在中国发生了大规模的疾病暴发。手足口病是全球性传染病，近年来手足口病已经成为越来越威胁国内外儿童健康的广泛流行性疾病之一。为指导全国各地做好手足口病的预防控制，2008年卫生部发布《手足口病预防控制指南》；规定自2008年5月2日起，手足口病纳入丙类传染病管理。

研究发现，引发手足口病的病毒有一个共同特点，均为肠道病毒科，为单股正链小RNA病毒。这些病毒有20多种(型)，包括肠道病毒71型(EV 71)、柯萨奇病毒A组的16型(Cox A16)、埃可病毒以及其它柯萨奇病毒。目前国内爆发的手足口病主要是由EV71和Cox A16引起的。由柯萨奇病毒引起的手足口病一般症状较轻，而EV71则相对较重，20％的患者可以伴有引起无菌性或病毒性脑炎，心肌炎和脑麻痹后遗症的患者。因此，有关EV71的病毒生物学特性、致病机理、诊断和预防等的研究日益受到人们的重视。

肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科(Picornaradae)肠道病毒属(Enterovirus)的成员，归属于人类肠道病毒A。EV71病毒的基因组为7408核苷酸的单股正链RNA。该基因组仅含有一个开放阅读框(编码含有约2194个氨基酸的多聚蛋白)。所编码的多聚蛋白可进一步水解成P1、P2和P3三个前体蛋白，P1前体蛋白被进一步活化为1A(多肽VP1)、1B(多肽VP2)、1C(多肽VP3)和1D(多肽VP4)四个病毒结构蛋白；四种结构蛋白拼接成五聚体结构；五聚体形成亚单位结构，60个亚单位构成病毒粒子。P2和P3前体蛋白主要编码7个非结构蛋白，编码蛋白水解酶及RNA聚合酶，P3区在进化过程中高度保守。VP1作为主要的衣壳蛋白，具有最多的型特异性中和位点，其基因序列与病毒血清型具有较高的相关性。

EV71病毒衣壳蛋白VP1是该病毒主要的中和决定因子，它直接决定病毒的抗原性。VP1基因具有与病毒血清型完全对应的遗传多样性，VP1基因序列不仅可作为肠道病毒属内不同血清型分类的依据。并可作为小RNA病毒科内不同属的分类参考，因此VP1基因成了EV71基因分型和遗传进化分析的最重要的对象。目前基于VP1核苷酸序列的差异，可将EV71分为A、B、C等三个基因型，A型仅包括原型株BrCr-CA-70；B型和C型又可进一步分为B1、B2、B3、B4以及C1、C2、C3和C4亚型。Brown等曾对113株世界各地的EV71分离株的VP1基因的核苷酸序列进行同源性分析，显示同一型内毒株间序列同源性大于92％，而不同型间毒株的同源性为78％～83％。自1997-2001年期间在马来西亚、新加坡、中国台湾和澳大利亚西部等地流行期间分离到2个新亚型，即B3和B4亚型，其中B3亚型为东南亚地区的流行株。B4亚型曾在新加坡(1997-1998年)和中国台湾(1998年)小规模流行，但2000年在马来西亚和新加坡大规模流行，成为流行株。B基因型主要包括美国、澳大利亚、哥伦比亚、新加坡、部分中国大陆与中国台湾地区、部分马来西亚的毒株；而C基因型主要包括美国、澳大利亚、中国大陆与中国台湾、加拿大和部分马来西亚的毒株。B和C基因型在系统发生树上遗传距离较远。中国台湾1998年EV71大爆发是由2个基因型，即B和C2同时引起的，但Shih等比较了其流行期间从死亡病例中分离的18株毒株。结果表明，有17株分离毒株为C2亚型，仅1株为B型。近年来在中国上海、重庆、浙江和深圳等多个地区分离的EV71病毒有较高的同源性，均属于C4亚型，提示该C4亚型EV71病毒在中国大陆可能有较广泛的分布和传播。EV71病毒衣壳蛋白VP2和VP4是肠道病毒外壳蛋白的主要组成部分，它们与病毒的抗原性密切相关，基于VP1与VP4的基因分型具有很高的相关性。

目前针对EV71引起疾病的疫苗、特异性治疗药物等防控手段尚在研制中。EV71病毒疫苗的抗原含量检测、保护性表位研究、治疗性单克隆抗体的制备，具有广泛的应用范围和社会需求。高质量的EV71单克隆抗体(mAb)有可能用于研制治疗性mAb、EV71患者血清学诊断以及EV71病毒疫苗的抗原含量的检测，因此具有重要的应用价值。鉴于EV71的危害性以及国内血清型的特点，本实验室以EV71病毒的C4亚型为基础，选取与其他亚型保守的序列制备重组抗原用于免疫小鼠。当然筛选单克隆抗体时，同时用A、B、C三类病毒亚型进行筛选，得到能同时与A、B、C三类病毒亚型结合的单克隆抗体。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供EV71病毒单克隆抗体、杂交瘤细胞株及应用。为此，本发明的解决方案是：

提出一种EV71病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为杂交瘤细胞A7-E3，保藏号为CCTCC No：C201123。保藏日期为2011年4月12日，经检测为存活。(中国典型培养物保藏中心地址：中国湖北省武汉市武昌珞珈山，邮编：430072)。

本发明所述EV71病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，其保藏名称为杂交瘤细胞A7-E3，名称有所不同的原因是：前者为通用名，后者是根据保藏中心的要求命名的。其中杂交瘤细胞为细胞类别，A7-E3为筛选时产生的特定的克隆编号。

进一步地，本发明提出由前述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体或其保守性突变体或其活性片段。

进一步地，本发明提出用于检测EV71抗原或EV71的IgG或IgM的试剂盒、试剂或药剂，包含前述的单克隆抗体、其保守性突变体或其活性片段。

本发明的试剂盒、试剂或药剂中，EV71病毒选自A、B、C三种基因型的EV71病毒；优选地，所述B型EV71病毒选自B1、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，以及C型EV71病毒选自C1、C2、C3、C4和C5型EV71病毒。

本发明的试剂盒、试剂或药剂中，其所述的单克隆抗体、其保守性突变体或其活性片段是生物标记或化学标记的。

本发明的试剂盒、试剂或药剂中，其中所述的标记是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶标记，或是荧光标记，例如荧光素标记。

进一步地，本发明提出了前述的单克隆抗体、其保守性突变体或其活性片段在制备用于预防或治疗EV71感染的人源化抗体中的用途。

进一步地，本发明提出了检测EV71病毒抗原的方法，是采用双抗体夹心法进行EV71病毒抗原的检测，其中使用了权利要求2所述的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体，或标记的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体(例如酶标记(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶)的或荧光标记的，例如荧光素标记的)。

进一步地，本发明提出了检测EV71相关抗体的方法，是采用捕获法进行抗EV71病毒IgG、IgM的检测，其中使用了权利要求2所述的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体或标记的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体(例如酶标记(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶)的或荧光标记的，例如荧光素标记的)。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：给EV71病毒抗原检测以及捕获法进行抗EV71病毒IgG、IgM的检测提供一种高特异性、高灵敏度的优质的抗体。

附图说明

图1为EV71抗原检测标准曲线。

具体实施方式

本发明采用重组EV71 VP1抗原，利用杂交瘤技术制备单克隆抗体，然后通过EV71病毒A、B、C三种基因型的间接ELISA法筛选，获得了能分泌中和EV71三种基因型病毒并能特异性结合EV71病毒的细胞系及由所属细胞系产生的单克隆抗体。因此，本发明一方面提供了一种对EV71病毒各种基因型均有高结合效价的杂交瘤细胞株。对于本发明的上述杂交瘤细胞株，申请人于2010年12月31日在中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)(湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学，保藏中心)对其进行了保藏，保藏号为CCTCC No：C201123。

本发明另一方面提供了由上述的杂交瘤细胞系所产生的单克隆抗体，或其活性片段或其保守性突变体。进一步地，本发明的抗体可根据其抗原结合区域(例如重链和轻链可变区)发展出的各种衍生抗体，可以用于被动免疫治疗或者预防EV71病毒感染，如人源化抗体。

由于本发明的单克隆抗体对于EV71病毒A、B、C三种基因型均有高水平的中和效果，所以本发明提供了本发明的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体，或其任意组合在制备用于检测EV71病毒A、B、C三种基因型的抗原的试剂、药剂或试剂盒中的应用。

本发明的再一方面提供了试剂或试剂盒，其包括本发明所述的单克隆抗体或其活性片段或保守性变异体，或其任意组合。所述试剂或试剂盒可用于检测EV71病毒抗原或EV71的IgG、IgM，从而可进一步用于诊断EV71病毒感染。

在本发明的又一方面，本发明的试剂或试剂盒，优选的，包括标记的本发明的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体。

对于本发明所述的标记，其是指生物标记或化学标记。例如酶标记的或荧光标记的(例如荧光素标记)。优选的，所述酶标记为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶标记。

本发明还提供了用于检测EV71病毒抗原的方法，其中使用了本发明所述的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体，或标记的本发明的单克隆抗体或其活性片段或其保守性突变体。优选的，采用双抗体夹心法进行检测EV71病毒抗原。

本发明还提供了EV71相关抗体的检测方法，检测EV71相关抗体的方法，优选的，采用捕获法进行抗EV71病毒IgG、IgM的检测。即以抗人IgG或IgM抗体作为固相抗体，当加入血清标本时，其中的IgG或IgM类抗体(特异的和非特异的)即可被固相抗体捕获，再加入EV71特异性抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标(或荧光标记)的抗EV71单克隆抗体，最后加入底物显色。

为更清楚地说明本发明，现结合如下实施例进行详细说明，但这些实施例仅仅是对本发明的示例性描述，并不能解释为对本申请的限制。

实施例1：杂交瘤细胞系的获得、单克隆抗体的制备

1、免疫原的制备：选取了当前流行的肠道病毒71型C4亚型，采用人工化学合成的方法合成了编码肠道病毒71型VP1蛋白的核苷酸序列，具体是根据基因片段人工合成的需要，将设计的基因分段合成，体外拼接成完整的序列，构建了重组表达质粒。然后由工程菌大肠杆菌进行发酵生产，发酵结束后发酵液离心收集菌体，破碎菌体，离心收集包涵体，包涵体蛋白经过稀释复性后，经过亲和层析纯化。

2、动物免疫：采用重组VP1蛋白进行BALB/c小鼠免疫。免疫程序：首次免疫取重组VP1蛋白与弗氏完全佐剂混合乳化，免疫BALB/c小鼠，50μg/只，腹腔注射；间隔14天后进行第二次免疚：取重组VP1蛋白与弗氏不完全佐剂混合乳化，50μg/只，腹腔注射；7天后采血，采用间接ELISA法测定抗体的抗EV71活性。对检测抗体效价最高的小鼠不加佐剂，用重组VP1蛋白进行静脉注射加强免疫。

3、细胞融合：取免疫鼠脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤按比例融合，铺96孔细胞培养板，采用HAT选择培养基培养杂交瘤细胞，第七天采用间接ELISA法检测细胞上清以筛选阳性细胞。间接法采用A、B、C三种基因型病毒纯化液分别单独包被，筛选同时呈阳性的细胞孔。间接ELISA法如下：将A、B、C三种基因型EV71病毒纯化液包被酶标板，加入阳性血清对照、阴性血清对照，同时设置空白对照孔，37℃反应后洗涤酶标板，加入羊抗小鼠IgG-HRP；反应45分钟后洗涤酶标板，加入TMB显色液37℃显色5分钟，用2M硫酸终止反应，仪器上读取OD450的吸光度。

结果，阳性血清对照的OD值为1.2以上，阴性血清对照的OD值为0.05以下。经过筛选，所获得的目的细胞株所对应的OD值如表1所示。

表1初筛所得5细胞株所对应的OD值

细胞株	在A型病毒板上	在B型病毒板上	在C型病毒板上
				1A7	1.929	1.837	2.402
1B11	1.787	1.845	2.091
				2D6	1.991	1.864	2.151
4F8	1.648	1.659	1.869
				5C1	1.553	1.373	2.616

4、克隆：采用有限稀释法对上述5细胞孔进行克隆。

5、检测：七天之后采用EV71病毒A、B、C三种基因型病毒纯化液包被酶标板，检测克隆板内的细胞上清，发现仅1A7克隆板对EV71病毒A、B、C三基因型均仍为阳性，其余四株细胞互有阴阳。

6、选取1A7克隆进行二次克隆化。采用间接ELISA法将第二次克隆的细胞上清进行针对EV71病毒A、B、C三基因型的阳性检测，选择A7-E3、A7-G2单细胞阳性孔进行扩大培养。收集细胞培养上清。

7、纯化：Protein A亲和层析柱纯化单克隆抗体。取细胞培养上清50ml，上GE HiTraprProteinA FF预装柱。在AKTA仪器上用预设的程序纯化A7-E3、A7-G2两株单克隆抗体。

8、对第一次筛选的5株单克隆抗体细胞株和第二次筛选的2株单克隆抗体细胞株液氮保存。

实施例2：单克隆抗体中和效价检测

将实施例1中所获得的细胞培养上清由1∶8起始进行2倍系列稀释，每份样品平行稀释2孔。将稀释的细胞培养上清分别与100CCID50/0.05ml病毒液(A7-E3、A7-G2)混匀，置37℃下CO2培养箱中孵育后，每孔加入细胞悬液(细胞浓度控制在1.5-2.0×10⁵个/ml)100μl，置37℃下CO₂培养箱中培养，进行细胞病变观察。同时设立阴性血清对照、阳性血清对照、空白样品对照及正常细胞对照。根据病变观察结果确定待测单克隆抗体样品的中和抗体滴度。筛选对EV71病毒A、B、C三种基因型均高效中和的单克隆抗体细胞培养上清及其对应细胞株。EV71单克隆抗体中和效价检测结果如表2所示：

表2两生产EV71单克隆抗体中和效价检测结果

样品	EV71病毒A型	EV71病毒B型	EV71病毒C型
				单克隆抗体A7-E3	256	256	1024
病毒回滴A7-E3	133	75	75

单克隆抗体A7-G2	512	256	512
				病毒回滴A7-G2	75	178	75
阴性对照	＜1∶8	＜1∶8	＜1∶8

结果：

1、两株抗体在EV71病毒A、B、C三种基因型的病毒回滴实验结果中，满足中和试验病毒回滴32-320的要求，试验成立。

2、两株抗体对于A、B、C三种基因型病毒均有中和效果，说明其具有广谱性中和活性。

3、两株单克隆抗体对EV71病毒A、B、C三种基因型的中和效价＞256，大于公认的1∶8作为判断血清是否具有中和保护效果的标准，说明两株单克隆抗体对于EV71病毒具有高效中和效果。由于单克隆抗体所识别的完整病毒颗粒的表位能够与其结合，失去对细胞的感染能力，说明病毒所对应的表位位于EV71病毒的表面。

实施例3：在双抗体夹心ELISA法检测EV71抗原中的应用

1.双抗体夹心ELISA法检测EV71抗原试剂盒的制备

1.1抗EV71多克隆抗体制备：用本实验室制备的EV71 VP1抗原(见实施例1)免疫兔子，背部多点皮下注射；每一次100μg；每隔21天免疫一次，共三次。第3次加强免疫后1周，杀死取血，得血清。用Protein A柱子在AKTA纯化系统上纯化得到抗EV71多克隆抗体。

1.2酶标抗体的制备：经纯化的单克隆抗体(纯化方法见实施例1)，采用经典过碘酸钠法进行辣根过氧化酶标记，标记后抗体加等量甘油后-70℃保存。

1.3双抗体夹心ELISA方法的建立：通过对ELISA试验条件的优化，建立了EV71双抗体夹心ELISA定量检测方法，流程如下：

采用0.05mol/L碳酸盐缓冲液1∶1000稀释抗EV71多克隆抗体，加入酶标板，100μl/孔，4℃包被过夜；洗板3次，加入封闭液(含10％小牛血清，10％蔗糖，0.01mol/L PBS)，250μl/孔，4℃封闭过夜；加入适当稀释的待测样品，100μl/孔，37℃孵育60min；洗板3次，加入1∶1000稀释的酶标单抗，100μl/孔(稀释液含10％小牛血清，0.01mol/L PBST-Tween20)，37℃反应60min；TMB显色，2mol/L H₂SO₄终止反应。读取OD450值，绘制EV71抗原含量与OD450均值的标准曲线，得到标准品的线性公式，代入OD450均值，计算EV71抗原含量。标准曲线如附图1，计算公式为：EV71抗原浓度(ng/ml)＝93.5×OD450-15.2。

2.双抗体夹心ELISA试剂盒检测EV71重组抗原浓度

按照1.3的方法检测杆状病毒表达的重组VP1抗原纯化过程样品的结果如下，其中工序1和5为超滤浓缩，2、3、4分别为离子交换层析、疏水层析和凝胶过滤层析。检测时样本尽量稀释至抗原浓度为5-200ng/ml范围内，通过1.3的标准曲线计算出原样品中的抗原浓度，如表3所示。

表3重组VP1抗原纯化过程中的抗原浓度检测结果

纯化工序	蛋白浓度(μg/ml)	抗原含量(μg/ml)	抗原/蛋白
				原液	127	5.2	0.041
1	980	51	0.052
				2	331	116	0.35
3	270	139	0.51
				4	185	198	0.93
5	1208	1140	0.94

3.双抗体夹心ELISA试剂盒检测病人样本

用病人粪便浸出液作为样本，按照上述建立定量检测方法检测抗原浓度，并与江苏默乐生物科技有限公司的肠道病毒核酸试剂盒(荧光PCR法)对比，结果如表4所示：

表4双抗体夹心ELISA法与荧光PCR法检测病毒结果的比较

样本编号	ELISA OD450	ELISA判定结果	PCR Ct值	PCR判定结果
					1	1.625	阳性	25.89	阳性
2	1.331	阳性	28.13	阳性
					3	1.894	阳性	24.77	阳性
4	0.736	阳性	31.05	阳性
					5	0.438	阳性	33.56	阳性
6	0.919	阳性	29.26	阳性
					7	0.201	阴性	35.64	阳性
8	0.563	阳性	32.17	阳性
					9	1.142	阳性	27.92	阳性
10	0.365	阳性	34.51	阳性
					11	0.098	阴性	阴性	阴性
12	0.045	阴性	阴性	阴性

13	0.104	阴性	阴性	阴性
					14	0.187	阴性	阴性	阴性
15	0.076	阴性	阴性	阴性

计算符合率结果为93.3％。

4.双抗体夹心ELISA试剂盒检测CoxA16病毒阳性样本8份，均表现阴性。说明本单克隆抗体是针对EV71病毒的，与CoxA16病毒无交叉反应。

实例4：在捕获法检测病人血清中的EV71型IgM抗体中的应用

建立捕获法检测病人血清中的EV71 IgM型抗体，方法如下：

1.首先将抗人IgM(抗人u链)抗体于碳酸盐缓冲液中4℃下包被过夜，形成固相抗体，洗涤去除未与固相结合或结合不紧的抗体后，用小牛血清或牛血清白蛋白等封闭，洗涤去除未结合的部分及杂质。

2.加入含待测IgM抗体的临床样本如血清等，37℃温育30分钟后洗板；此时，待测样本中的IgM抗体就会与固相上的抗u链抗体反应而吸附于固相上。

3.加入EV71抗原，加入酶标记的抗EV71单克隆抗体，37℃温育30分钟后洗板；此时，在固相上即形成相应的抗原抗体复合物。

4.加入酶底物，37℃温育15分钟显色测定。

用上述方法检测了68份病人血清，其中EV71病人阳性血清31份，阴性血清37份。检测结果见下表5所示。

表5 EV71型IgM抗体检测结果

	EV71 IgM阳性	EV71 IgM阴性	总计
				检测阳性	29	3	32
检测阴性	2	34	36
				总计	31	37	68

据此测算灵敏度为93.5％，特异性为91.9％。

还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种EV71病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏名称为杂交瘤细胞A7-E3，保藏号为CCTCC No：C201123。

2.一种由权利要求1所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。

3.一种用于检测EV71抗原或EV71的IgG或IgM的试剂盒、试剂或药剂，包含权利要求2所述的单克隆抗体。

4.根据权利要求3所述的试剂盒、试剂或药剂，其中所述的EV71选自A、B、C三种基因型的EV71病毒；其中，所述B型EV71病毒选自B1、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，以及C型EV71病毒选自C1、C2、C3、C4和C5型EV71病毒。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒、试剂或药剂，其所述的单克隆抗体是生物标记或化学标记的。

6.根据权利要求5所述的试剂盒、试剂或药剂，其中所述的标记是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、丙酮酸激酶或葡萄糖氧化酶标记，或是荧光标记。

7.权利要求2所述的单克隆抗体在制备用于预防或治疗EV71感染的人源化抗体中的用途，其中EV71是指A、B、C三种基因型的EV71病毒；其中，B型EV71病毒选自B1、B2、B3、B4和B5型EV71病毒，C型EV71病毒选自C1、C2、C3、C4和C5型EV71病毒。

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