CN102559603A

CN102559603A - 分泌抗番茄黄化曲叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

Info

Publication number: CN102559603A
Application number: CN2012100041977A
Authority: CN
Inventors: 周雪平; 吴建祥; 刘欢; 谢艳; 尚海丽
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2012-01-09
Filing date: 2012-01-09
Publication date: 2012-07-11
Anticipated expiration: 2032-01-09
Also published as: CN102559603B

Abstract

本发明公开了一种分泌抗番茄黄化曲叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。克隆了番茄黄化曲叶病毒上海分离物（TYLCV-SH2）的外壳蛋白基因，利用原核表达系统表达了该病毒的外壳蛋白，用表达纯化的蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，经细胞融合、筛选、克隆，获得1株能稳定传代并分泌抗TYLCV单抗的杂交瘤细胞株D10，其保藏号为CGMCCNo.5538。D10单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-6以上，抗体类型及亚类为IgG1，kappa链。利用D10单抗建立的检测番茄中TYLCV的dot-ELISA检测方法，当病叶1:320倍稀释(w/v,g/mL)时仍能检测到病毒。建立的dot-ELISA和Tissue-blotELISA方法能准确、特异、灵敏地检测田间番茄样品中的TYLCV病毒。抗TYLCV单抗的制备及其检测方法的建立为该番茄病毒病的诊断、预测预报及科学防控提供技术和物质支撑。

Description

分泌抗番茄黄化曲叶病毒单抗杂交瘤细胞株及其单抗应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种分泌抗番茄黄化曲叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗的应用。

背景技术

番茄是全球重要的蔬菜作物，它品种多，适应性广，营养丰富，是全世界总产量最高的30 种农作物之一。双生病毒对番茄的危害是番茄生产的重要制约因素之一，尤其是近几十年来双生病毒病在全球范围的扩展蔓延导致其在番茄上的危害日趋严重。在所有侵染番茄的双生病毒中，番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）危害最为严重。TYLCV最早于1964 年在以色列被发现并正式命名，之后的30 年间该病害迅速扩散到中东、地中海沿岸、东南亚地区、美国、日本、澳大利亚、印度、墨西哥等众多国家和地区。20 世纪90 年代中期，随着双生病毒的传毒介体—B 型烟粉虱入侵我国，导致烟粉虱传番茄双生病毒在我国由东向西、由南向北急速蔓延，严重威胁我国产值近千亿元的番茄产业。2005 年秋，TYLCV首次在广西番茄主产区百色市田阳镇大面积爆发， 2006 年在上海、江苏和浙江等地相继被发现，之后迅速扩展至安徽、山东、河南、河北、广东、重庆、云南、福建、辽宁和北京等地。目前全国已有15 个省（自治区、直辖市）发现该病毒的危害现象，已造成严重损失的地区有浙江、江苏、安徽、山东、河南和河北等省。番茄黄化曲叶病由番茄黄化曲叶病毒（TYLCV）引起，该病毒隶属于双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus），具有典型的双生病毒孪生颗粒形态，病毒粒子的大小约为20×30 nm。其基因组结构组成因不同分离物而分为单组份或双组份。病毒链上的AV1基因编码病毒的外壳蛋白（Coat protein，CP），与病毒粒子的包装、介体传毒、系统侵染及与寄主的互作相关。感染TYLCV的植株发病症状与病毒分离物、寄主的遗传背景、生长阶段以及环境条件有关，症状的表现会有所差异。发病植株的典型症状为顶部叶片变小、皱缩卷曲黄化，节间缩短，植株明显矮化，开花延迟，花朵减少，坐果少而小，成熟期果实不能正常转色，且成熟不均匀。该病在番茄生长各阶段均可发生。若在开花前感病，果实产量和商品价值均大幅度下降，严重时造成的损失可达100 %。番茄黄化曲叶病毒主要通过B 型烟粉虱传播，烟粉虱获毒后可终生传毒，但不经卵传，研究表明嫁接也可导致病毒的传播，但不能经机械摩擦或种子传毒。TYLCV寄主很广，据报道能够侵染包括栽培作物以及杂草在内的12 个科的30 多种植物，一些无症带毒的杂草和野生植物往往成为下茬番茄作物的侵染源，同时传播介体烟粉虱也具有很广的寄主范围。加上各地区气候条件、品种和栽培方式有所不同，单凭一种方法很难达到有效防治效果，因而对TYLCV的防治应采用因地制宜的综合防治措施，为此建立一套灵敏、快速的病毒检测方法对该病毒的监控和防治具有重要的意义。而目前仅用低效率的电镜观察、RT-PCR方法和核酸杂交等方法对小样本进行病毒检测。本发明以原核表达的TYLCV衣壳蛋白（CP）为抗原通过杂交瘤技术制备了1株抗TYLCV的特异性单克隆抗体，以制备的单抗为核心建立了检测TYLCV的高通量的血清学方法，并成功应用于田间TYLCV的检测，从而为我国番茄黄花病毒病早期监测和预警，防控策略提供物质和技术支持。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种分泌抗番茄黄花曲叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其单抗应用。

分泌抗番茄黄化曲叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCC No.5538，它能分泌抗番茄黄化曲叶病毒的单克隆抗体。

杂交瘤细胞株分泌的抗番茄黄化曲叶病毒的单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-6以上，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与番茄黄化曲叶病毒的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反应。

抗番茄黄化曲叶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用是以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。

本发明与现有技术相比具有的有益效果：1）提供的杂交瘤细胞株能分泌抗番茄黄化曲叶病毒的特异性单克隆抗体，以该单抗为核心建立的dot-ELISA、ACP-ELISA、Tissue-ELISA、和TAS-ELISA等免疫学方法及用这些方法建立的试剂盒能高度特异、准确、灵敏的检测番茄黄化曲叶病毒；2）利用本发明所制备的单克隆抗体检测番茄黄化曲叶病毒，不需要昂贵的电子显微镜、PCR仪等设备；3）利用本发明所制备的单克隆抗体，可有效地用于田间作物中番茄黄化曲叶病毒的检测。

附图说明

图1是dot-ELISA方法检测番茄TYLCV的灵敏度分析；

图2是Tissue-blot ELISA方法检测番茄样品中TYLCV的结果。

具体实施方式

分泌抗番茄黄化曲叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，于2011年11月 28日，保藏于中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.5538，它能分泌抗番茄黄化曲叶病毒的单克隆抗体。

本发明提供的杂交瘤细胞株能大量分泌抗番茄黄化曲叶病毒单抗，且该单抗特异性强、效价高、稳定性好。以该单抗为核心建立了检测TYLCV的高通量的血清学方法，并成功应用于田间TYLCV的检测，从而为我国番茄黄化曲叶病的早期监测和预警、科学防控提供物质和技术支持。

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

一、杂交瘤细胞获得及其单克隆抗体的制备

1.免疫原的制备

根据已报道的TYLCV-SH2编码外壳蛋白基因序列（登录号：AM282874）设计一对特异引物：CP-F（5’-AATGGATCCATGTCGAAGCGACC-3’，划线部分为BamHI酶切位点）和CP-R（5’-CCCAAGCTTTTAATTTGATATTG-3’，划线部分为HindIII酶切位点），并由上海英骏生物技术有限公司合成。利用CTAB法提取番茄病样的基因组总DNA，以总DNA为模板，进行常规PCR扩增，即模板1μl ，5×PrimeSTARTM Buffer（含Mg2+）10μl，dNTP Mix4μl，PrimeSTARTM DNA Polymerase（2.5 U/μL）0.5μl，上下游引物各1μl，最后双蒸无菌水补足反应终体积为50μl。PCR反应体系如下：预变性94℃ 2 min，变性94℃ 30 s，退火52℃ 45 s，延伸72℃ 1 min，循环扩增35次，最后延伸72℃ 10 min。扩增产物于0.8% 琼脂糖凝胶进行电泳分析，并用PCR凝胶回收试剂盒(AxyGEN)回收DNA片段，具体操作参考试剂盒说明书进行。将纯化的PCR产物末端加A与克隆载体pMD-18T vector连接，重组质粒命名为pMD18-T-CP，并转化到大肠杆菌DH 5α的感受态细胞中，用质粒提取试剂盒(AxyGEN)提取重组质粒，对提取的重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，并通过测序验证重组克隆载体pMD18-T-CP中所携带的CP基因序列及读码框的正确性，序列分析软件为DNAstar、NCBI-BLAST，所用的数据库为GeneBank等。重组质粒pMD18-T-CP中CP基因片段经BamH I和HindIII双酶切后定向插入经同样酶切的pET-32a表达载体中。PCR、酶切筛选阳性克隆，并通过测序验证重组原核表达载体pET-32a-CP中所携带CP基因序列未突变且读码框正确。并把原核表达质粒pET-32a-CP 42℃热击转化入大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中，挑取单菌落接种到含氨卞青霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养过夜，按1﹕100的比例将培养物接种于含氨卞青霉素抗性的新鲜LB培养基中，振荡培养至OD600≈0.5,加入终浓度为1 mmol﹒L-1 IPTG诱导表达4 h，离心收集菌体。部分菌体加入1×SDS-PAGE上样缓冲液悬浮，沸水中处理5-l0 min,12 000 rpm离心后取上清10 μ1进行12.5％SDS-PAGE电泳分析，其余菌体经超声波破碎，收集上清按照产品说明书进行用Ni²⁺-NTA亲和层析柱纯化目的蛋白。以纯化的重组CP蛋白作为免疫原及检测抗原。

2.免疫动物

用纯化的TYLCV-CP蛋白免疫四周龄体重18-20g BALB/C 雌性小鼠：纯化的CP蛋白以生理盐水稀释与等体积福氏完全佐剂混合，充分乳化后，经背腹部皮下多点注射0.2ml每只，间隔3周，取与一免等量抗原和等体积的福氏不完全佐剂充分乳化后，第二次腹腔注射0.2ml每只，过3周后用加倍剂量的抗原进行腹腔注射，3天后取脾细胞进行融合。

3.细胞融合

取上述免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）按5-10：1的比例，在无血清的RPMI-1640（Gibco）培养基中混匀，1500rpm离心5min，去除培养基，用50 % PEG（Sigma，分子量1500）作为融合剂，在37℃下水浴下加入1ml，使其融合2min，用无血清的RPMI-1640培养基终止融合后1500rpm离心5min，沉淀用HAT培养基悬浮，分装到96孔细胞培养板中，37℃，5 % CO2的细胞培养箱中培养。

4.杂交瘤细胞、阳性孔的筛选及其克隆

细胞培养箱中培养5天后，用HAT培养基换液一次，第10天用HT培养基换液，等到融合细胞覆盖孔底5%-50%时，以表达纯化的TYLCV-CP为包被抗原用常规间接ELISA方法筛选阳性孔，共获60多个阳性孔。选择5个呈强阳性反应的细胞孔，进行有限稀释法克隆，获得1株能分泌抗TYLCV的特异性单抗的杂交瘤细胞株D10。经6个月以上体外传代和多次冻存复苏后，细胞株均能良好生长，并稳定分泌抗体。经扩大培养后，用于腹水制备和液氮保存。

5. 单克隆抗体的特异性检测

用感染中国番木瓜曲叶病毒（PaLCuCNV）、烟草曲茎病毒（TbCSV）、中国胜红蓟黄脉病毒（AYVCNV）、台湾番茄曲叶病毒（ToLCTWV）和中国番茄黄化曲叶病毒（TYLCCNV）的组织提取液包被ELISA反应板，以相应的健叶提取液作阴性对照，以感染番茄黄化曲叶病毒的番茄病汁叶为阳性对照，用间接ELISA法测定单抗的特异性反应。间接ELISA方法具体为上述病毒感染的病叶用液氮研磨成粉末，按1: 30（w/v, g /mL）加入ELISA包被液研磨后100ul/孔包被ELISA板，4℃过夜或37℃2小时，使其吸附于聚苯乙烯板孔；PBST洗涤三次后用1-10％的脱脂奶粉或1-3％ BSA或3-6％牛血清封闭30-60min;加入单抗100ul/孔，37℃ 1-2 小时；PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的碱性磷酸脂酶(AP)标记羊抗鼠IgG二抗（Sigma公司）100ul/孔，37℃ 1-2小时，PBST洗涤四次后，用PNPP底物显色，2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用酶标仪读取OD₄₀₅的值，以与阴性OD值比值大于2.1为阳性。结果发现，D10单抗对TYLCV有特异性反应，而与PaLCuCNV、TbCSV、AYVCNV、ToLCTWV和TYLCCNV其他病毒均无特异性反应。

6.单克隆抗体腹水制备及纯化

取8周龄左右BALB/C小鼠，腹腔注射0.3-0.5ml降植烷（Sigma），7-10天后腹腔注入5-10×10⁵个杂交瘤细胞，注射后7-10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，3000rpm离心3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水。取1倍体积腹水加2倍体积0.06M PH4.8醋酸缓冲液稀释，加辛酸（30ul/ml腹水），室温下边加边搅拌，4℃澄清1小时，12000rpm离心20min，收集上清，再用50%饱和硫酸铵沉淀免疫球蛋白，4℃放置2小时，3000rpm离心20min，沉淀用2倍体积的PBS溶液溶解，在4℃流动透析24小时后即获纯化的腹水抗体，-70℃保存。

7.单克隆抗体的亚类鉴定和腹水效价测定

将纯化的单抗腹水与Sigma公司的标准抗BALB/C小鼠IgG₁、 IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、IgM抗体作双向琼脂扩散试验，结果为D10单抗亚类为IgG1、kappa链。用常规间接ELISA方法检测单抗腹水效价，结果为上述单抗腹水效价在10^－6以上。

二、病毒检测免疫学方法及其试剂盒

1.用单抗建立的抗原包被ELISA（ACP-ELISA）方法检测病毒

ACP-ELISA方法的操作步骤

（1）用0.05M碳酸盐缓冲液（pH9.6）按1: 20（w/v, g /mL）倍稀释的病叶汁液进行包被，即100 μL每孔加至酶标板，TYLCV病叶为阳性对照，相应健叶为阴性对照，37℃ 2h，或4℃过夜；

（2）PBST洗涤后用5%脱脂奶粉封闭30min；

（3）单抗腹水5000倍稀释后100ul/孔，37℃ 1h；

（4）PBST洗涤后加入5000倍稀释的碱性磷酸脂酶（AP）标记的羊抗鼠IgG二抗（Sigma），100ul/孔，37℃，1h；

（5）用PBST洗涤后加入硝基磷酸盐底物100ul/孔，室温30min；

（6）用肉眼观察，底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，或用2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用酶联免疫检测仪测OD405值，以P/N> 2.1作为阳性判断标准。

ACP-ELISA方法检测灵敏度检测：

单抗腹水工作浓度为5000倍稀释，对病叶从1：10至5120作倍比稀释，以相应稀释度的健叶汁液作阴性对照，进行上述ACP-ELISA方法检测。结果表明ACP-ELISA方法对1：10～640倍稀释的病叶汁液呈阳性反应，即对检测病叶的灵敏度可达到1：640，表明ACP-ELISA方法具有高度的灵敏性和可靠性。

2. 检测TYLCV的TAS-ELISA检测方法

2.1. TAS-ELISA 方法的操作流程：

（1)抗TYLCV-CP的兔抗血清1:3000倍稀释后（由纯化的原核表达TYLCV-CP免疫兔子制备）100ul/孔包被聚苯乙烯板，37℃，2-4h或4℃，过夜；

（2)PBST洗涤三次后加1-10％的脱脂奶粉或1-3％ BSA或3-6％牛血清封闭200ul/孔于37℃封闭30-60min；

（3)加入检测样品100ul/孔。以TYLCV病叶为阳性对照，以相应的健康样品作阴性对照，37℃ 1-2h；

（4)洗涤后用封闭液5000倍稀释单抗腹水，100ul/孔，37℃ 1-2h；

（5)PBST洗涤后加入10000倍稀释的AP标记羊抗鼠IgG二抗（Sigma）100ul/孔，37℃ 1-2h；

（6)PBST洗涤后拍干，加PNPP底物于室温显色5-30min，肉眼观察底物颜色变成黄绿色的孔为阳性，2mol/L 氢氧化钠终止反应后，用680型酶联免疫检测仪测405nm的OD值，以P/N> 2.1作为阳性判断标准。

2.2.TAS-ELISA 检测方法最适条件的确定：

采用TAS-ELISA 方阵试验进行，即横向加用包被缓冲液从1﹕100至1﹕128000倍比稀释的兔抗TYLCV血清；TYLCV 病叶汁匀浆液；纵向加用封闭液从1﹕1000至1﹕512000倍比稀释单抗腹水；AP标记的羊抗鼠IgG二抗按Sigma公司说明书稀释，1﹕10000倍；按TAS-ELISA方法流程进行操作。结果为TYLCV的兔抗血清及单抗的最适稀释度分别为1﹕3000、1﹕5000。

2.3.TAS-ELISA 方法检测灵敏度的确定

在兔抗血清和单抗腹水最适工作浓度下，将TYLCV病叶汁用含3％ BSA 的PBS倍比稀释后进行TAS-ELISA测定，结果为：TAS-ELISA 检测病叶的灵敏度达到1:2560倍稀释（w/v, g /mL），说明本方法具有很好的灵敏度。

3. dot-ELISA方法的建立及田间检测应用

将番茄叶片称重后用液氮研磨成粉末，按1:10～30（w/v, g /mL）加入0.01 mol/L PBS（pH7.4）后研磨；病汁液 5000 rpm离心3 min; 取3 μl上清点到NC膜上，同时设置健康和感病番茄叶汁分别作为阴性和阳性对照；室温干燥10-20 min; NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min； NC膜放入1:5000倍稀释的单抗中室温孵育30-60 min；用PBST洗膜3～4次，每次3 min； NC膜放入1:8000倍稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30~60 min; PBST洗膜4～5次，每次3 min; 66 μL NBT和33 μL BCIP底物加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris Cl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果。待阳性对照显色明显，而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

用方阵试验确定dot-ELISA单抗和酶标二抗的最适工作浓度，试验表明D10单抗及酶标二抗的最适工作浓度分别为1:5000和1:8000倍稀释。以上述抗体的最适工作浓度建立检测TYLCV病叶的dot-ELISA方法。灵敏度分析表明，当番茄叶片稀释到1:320倍（w/v, g/mL）时，以D10单抗建立的dot-ELISA 检测仍呈现紫色的阳性斑点，即其检测病叶的灵敏度达到1:320倍稀释（图1）。

4. Tissue-blot ELISA（组织印迹ELISA）检测番茄黄化曲叶病毒方法及其试剂盒

4.1 Tissue-blot ELISA检测方法

Tissue-blot ELISA检测方法中将硝酸纤维素膜剪成适当大小，铺垫在三层干净的吸水纸上。将植物组织用刀片迅速横切，将横切面在膜上压印3~5 s，其中叶片需紧卷成筒后用刀片横切。其后膜干燥、单抗孵育、二抗孵育、显色步骤与dot-ELISA检测番茄中TYLCV方法相同。

用建立的Tissue-blot ELISA方法对2011年采自番茄发病田间或大棚的疑似带毒样品进行检测。结果发现，82个水稻检测样品中有54个样品产生紫色的阳性斑点（图2），阳性样品进一步用RT-PCR分析，结果表明所有的Tissue-blot阳性样品均检测到TYLCV特异性的PCR产物，PCR产物核酸测序表明阳性样品感染TYLCV。说明该Tissue-blot方法能准确、可靠地用于番茄样品中番茄黄化曲叶病毒的检测。

4.2 检测番茄黄化曲叶病毒Tissue-blot ELISA试剂盒

1）试剂盒主要成分：

TYLCV 单克隆抗体1管 0.2 ml

AP标记羊抗鼠IgG二抗 1管 0.1 ml

NBT/BCIP底物各1瓶分别为2 ml和1ml

阳性对照1 （TYLCV番茄组织） 1管 2 ml

阴性对照1（健康番茄组织） 1管 2 ml

抗体稀释液（10X） 1瓶 80ml

以上试剂均保存于4℃下

硝酸纤维素膜(NC)10张

2）操作步骤：

a.将硝酸纤维素膜放在吸水纸上；

b. 将植物组织用刀片迅速横切，将横切面在膜上压印3～5 s，其中叶片需紧卷成筒后用刀片横切；

c.同时设置健康和感病番茄分别作为阴性和阳性对照，膜室温干燥10～20 min;

d. NC膜浸入到含5%脱脂奶粉的PBST(含0.05% Tween-20的0.01 mol/L PBS)封闭液中室温封闭30 min；

e. NC膜放入1:5000倍稀释的单抗中室温孵育30～60 min；

f. 用PBST洗膜3～4次，每次3 min； NC膜放入1:8000稀释的AP酶标记羊抗鼠IgG二抗中室温孵育30～60 min;

g. PBST洗膜4～5次，每次3 min; 66 μL NBT和33 μL BCIP底物加入到10 ml底物缓冲液(0.1 mol/L Tris Cl、0.1 mol/L NaCl、0.025 mol/L MgCl、pH9.5)混匀，膜放入底物液中反应，肉眼观察结果；

h. 待阳性对照显色明显（紫色），而阴性没有任何显色时自来水漂洗终止反应，拍照记录结果。

3）保存及有效期于2～8℃避光保存，有效期12个月。

4）缓冲液配方：

磷酸盐缓冲液（PBS，0.01 mol/L，pH7.4）：

NaCl 8 g

KCl 0.2 g

KH₂PO₄ 0.2 g

Na₂HPO₄·12H₂O 3g

叠氮化钠 0.2 g

加蒸馏水950溶解后调pH至7.4，定容至1000 ml

洗涤液（0.01 mol/L PBST）：

1000 ml 0.01mol/L PBS中加0.5 ml Tween-20

封闭液：

0.01 mol/L PBST中加入脱脂奶粉至终浓度5%（W/V）。

Claims

1.一种分泌抗番茄黄化曲叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏号为CGMCC No.5538，其特征在于能分泌抗番茄黄化曲叶病毒的单克隆抗体。

2.一种如权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的抗番茄黄化曲叶病毒单克隆抗体，其特征在于该单克隆抗体腹水间接ELISA效价达10^-6以上，抗体类型及亚类为IgG1、kappa链，该单克隆抗体能与番茄黄化曲叶病毒的外壳蛋白亚基有特异性免疫结合反应。

3.一种如权利要求2所述的抗番茄黄化曲叶病毒单克隆抗体在该病毒检测上的应用，其特征在于以单克隆抗体为核心建立的各种免疫学检测方法和免疫学试剂盒。